CN117701483A - 一种共利用五碳糖和六碳糖生产1,5-戊二胺的重组大肠杆菌及其构建方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种共利用五碳糖和六碳糖生产1,5‑戊二胺的重组大肠杆菌及其构建方法与应用。本发明以大肠杆菌KA30为出发菌株，通过过表达赖氨酸脱羧酶基因CadA、木糖异构酶基因XylA、木酮糖激酶基因XylB，并敲除葡萄糖特异性转运膜透性酶基因PtsG，构建得到重组大肠杆菌NT1003‑△PtsG‑xylAB‑cadA。本发明以发酵培养基中葡萄糖与木糖碳摩尔量比2:1与1:1为例，该重组大肠杆菌与出发菌株相比，可实现对葡萄糖与木糖的同步消耗。以混合碳源为底物发酵36h，至少可生产4.2g/L的1,5‑戊二胺。现阶段，资源枯竭和环境污染问题日益严重，木质纤维素原料中含有大量的葡萄糖和木糖，该方法有利于木质纤维素生物炼制且具有一定经济效益，为能源紧缺提供了一条可持续发展道路。

Description

一种共利用五碳糖和六碳糖生产1,5-戊二胺的重组大肠杆菌 及其构建方法与应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种共利用五碳糖和六碳糖生产1,5-戊二胺的重组大肠杆菌及其构建方法与应用。
背景技术
1,5-戊二胺(简称戊二胺，Diaminopentane)，又被称为尸胺，是一种五碳二胺，可用作合成聚酰胺、聚氨酯或螯合剂的单体。作为重要的化学中间体，戊二胺在材料领域中可用作多种新型材料及高聚物的制备，在尼龙、涂料、粘合剂等方面具有广泛的应用前景。同时，由于戊二胺的生物特性，戊二胺在食品、农业及医药领域也有着重要的应用价值。
目前生物法生产戊二胺主要有两条途径：一种是酶法生产戊二胺，即用赖氨酸脱羧酶或含有赖氨酸脱羧酶的细胞来催化L赖氨酸生成戊二胺；另一种是选择合适的微生物，以葡萄糖为原料，直接发酵生产戊二胺。酶法生产戊二胺条件复杂，需要添加多种辅因子，而利用微生物直接发酵生产戊二胺成本低廉，有利于大规模生产。利用生物法转化可再生资源或废弃资源来生产戊二胺具有污染小、环境友好、可持续发展等优点。木质纤维素原料充足而廉价，如果能将之利用，不仅减少了农作物废物燃烧对大气的环境污染，也提高了农作物废弃物的经济价值，同时为能源紧缺提供一条可持续发展道路。
目前，微生物发酵生产戊二胺都以通过单一碳源为原料实现，葡萄糖与木糖的共利用技术还未发展全面。木糖是木质纤维素原料中含量仅次于葡萄糖的单糖。常见的木糖代谢途径主要是XR/XI/WBG以及Dahms四种。EMP作为基因工程菌株构建葡萄糖代谢模块的常用途径，常常与以上木糖代谢途径组合，构建木糖-葡萄糖共利用工程菌株。高效共利用木糖及葡萄糖的天然菌株较少，且其底物偏好性会影响共利用发酵性能，因此构建底物谱更广、混合糖利用率更高的木糖-葡萄糖共利用工程菌株，是实现以木质纤维素为原料产业化制备二元胺的必要条件。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种共利用五碳糖和六碳糖生产1,5-戊二胺的重组大肠杆菌，以解决葡萄糖分解代谢阻遏的问题，实现大肠杆菌对葡萄糖与木糖的同步利用发酵生产戊二胺，降低发酵成本，具有经济环保效益。
本发明还要解决的技术问题是提供上述重组大肠杆菌的构建方法。
本发明最后要解决的技术问题是提供上述重组大肠杆菌在生产1,5-戊二胺中的应用。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种共利用五碳糖和六碳糖生产1,5-戊二胺的重组大肠杆菌，以大肠杆菌KA30为出发菌株，通过过表达赖氨酸脱羧酶基因CadA、木糖异构酶基因XylA、木酮糖激酶基因XylB，并敲除葡萄糖特异性转运膜透性酶基因PtsG，构建得到重组大肠杆菌NT1003-△PtsG-xylAB-cadA。
其中，所述的出发菌株——大肠杆菌KA30即为分类命名为大肠杆菌(Escherichiacoli)的菌株，菌株号：NT1003△Met△Thr，已于2013年5月30日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号：CCTCC NO：M 2013239。该菌株的详细信息已公开在专利CN103361289B中。
其中，所述的赖氨酸脱羧酶基因CadA来源于大肠杆菌MG1655，其Gene ID：948643，对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述的木糖异构酶基因XylA来源于大肠杆菌MG1655，其Gene ID：948141，对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述的木酮糖激酶基因XylB来源于大肠杆菌MG1655，其Gene ID：948133，对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
一种生产1,5-戊二胺的重组大肠杆菌的构建方法，包括如下步骤：
(1)将赖氨酸脱羧酶基因CadA通过同源重组的方式，以NcoI和HindIII为酶切位点，克隆到表达载体pCDFtrc中，并验证，得到重组质粒pCDFtrc-cadA；
(2)将木糖异构酶基因XylA通过同源重组的方式，以EcoRI和BamHI为酶切位点，克隆到表达载体pTrc99a中，并验证，得到重组质粒pTrc99a-xylA；然后将木酮糖激酶基因XylB通过同源重组的方式，以BamHI为酶切位点，克隆到重组质粒pTrc99a-xylA中，并验证，得到重组质粒pTrc99a-xylA-xylB；
(3)敲除大肠杆菌KA30的葡萄糖特异性转运膜透性酶基因PtsG，获得表达宿主即敲除PtsG基因的大肠杆菌NT1003-△PtsG；
(4)将步骤(1)获得的重组质粒pCDFtrc-cadA和步骤(2)获得的重组质粒pTrc99a-xylA-xylB共同转化至步骤(3)获得的大肠杆菌NT1003-△PtsG中，得到重组大肠杆菌，即1,5-戊二胺生产菌株NT1003-△PtsG-xylAB-cadA。
其中，步骤(1)中，所述的表达载体pCDFtrc为利用环化PCR将表达载体pCDFduet上的T7启动子更换为trc启动子，同时删除T7启动子后的操纵基因lacO获得的改造载体。
其中，步骤(2)中，所述的表达载体pTrc99a为利用环化PCR删除pTrc99a启动子后的操纵基因lacO获得的改造载体。
其中，所述的步骤(3)具体操作为：将Cas9质粒导入目的菌株大肠杆菌KA30中，构建含有待敲除基因PtsG的N20序列的突变SgRNA质粒、取待敲除基因PtsG两端序列作为基因敲除上下同源臂构建Donor DNA。然后将突变SgRNA质粒、Donor DNA加至含有Cas9质粒的目的菌株大肠杆菌KA30感受态细胞中，利用CRISPR-Cas9基因编辑系统敲除基因PtsG，选取阳性转化子进行PCR验证成功后，将阳性菌株送测，再将测序正确的菌株于LB固体培养基连续传代培养直至其无法在有KanR以及SmR抗性的固体LB培养基上生长，则敲除质粒脱除成功，最终获得敲除了PtsG基因的大肠杆菌NT1003-△PtsG；
上述重组大肠杆菌在生产1,5-戊二胺中的应用也在本发明所保护的范围之内。
其中，所述的应用，包括如下步骤：
(Ⅰ)将活化后的重组大肠杆菌接种到种子培养基中进行种子培养，获得种子液；
(Ⅱ)将步骤(Ⅰ)将种子液直接接种于发酵培养基进行发酵培养。
其中，步骤(Ⅰ)中，所述的种子培养，其培养条件为：37℃，180～250rpm培养至OD600＝1.5～2，优选的其培养条件为：37℃，200rpm培养至OD600＝1.5。
其中，步骤(Ⅱ)，所述的接种，其接种量为2～5％v/v，优选的接种量为3％v/v；所述的发酵培养，其培养条件为：控制初始OD600＝0.05～1，37℃下发酵30～36h，优选的培养条件为：控制初始OD600＝0.05，37℃下发酵30～36h。
其中，步骤(Ⅱ)，所述的发酵培养基，其碳源为葡萄糖和木糖的组合。
其中，步骤(Ⅱ)，所述的发酵培养基，其配方为：碳源22～23g/L、硫酸铵10g/L、蛋白胨5g/L、酵母粉2g/L、氯化钾0.5g/L、七水合硫酸镁2g/L、MoPOSNa 100mM、碳酸钙10g/L、维生素b1 0.08g/L、烟酰胺0.01g/L、七水合硫酸亚铁0.032g/L、七水合硫酸锌0.086g/L、硫酸铜0.077g/L、硫酸锰0.032g/L、生物素45μg/L。
具体的，所述的葡萄糖和木糖，其碳摩尔量比例为1～2:1，优选的比例为2:1或1:1。当葡萄糖和木糖的碳摩尔量比例为2:1时，发酵培养基中葡萄糖浓度为16g/L、木糖浓度为6.7g/L；当葡萄糖和木糖的碳摩尔量比例为1:1时，发酵培养基中葡萄糖浓度为12g/L、木糖浓度为10g/L。其中，碳源的总碳摩尔浓度为0.053mol/L。
有益效果：
(1)本发明解决了葡萄糖分解代谢阻遏的问题，实现了大肠杆菌对葡萄糖与木糖的同步利用。
(2)本发明以混合碳源为原料发酵生产1,5-戊二胺，无需添加诱导剂，降低了发酵成本具有环境效益。
(3)现阶段资源枯竭和环境污染问题日益严重，本发明以葡萄糖与木糖为碳源，而木质纤维素原料中含有大量的葡萄糖和木糖，该方法有利于木质纤维素生物炼制且具有一定经济效益，为能源紧缺提供了一条可持续发展道路。
(4)本发明直接以葡萄糖与木糖为混合碳源，至少可生产4.2g/L的1,5-戊二胺。
(5)本发明发酵反应过程较为温和，对环境、设备及操作人员均无害。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。
图1为重组大肠杆菌在葡萄糖与木糖碳摩尔量比例为2:1的培养基中对碳源的消耗情况。
图2为重组大肠杆菌在葡萄糖与木糖碳摩尔量比为例1:1的培养基中对碳源的消耗情况。
图3为碳代谢阻遏解除后的混糖发酵生产1,5-戊二胺的产量。
具体实施方式
以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得，实施例中未提及到的技术均为本领域常规技术。
下述实施例中，所述的大肠杆菌KA30即为分类命名为大肠杆菌(Escherichiacoli)的菌株，菌株号：NT1003△Met△Thr，已于2013年5月30日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号：CCTCC NO：M 2013239。该菌株的详细信息已公开在专利CN103361289B中。
实施例1：构建重组大肠杆菌NT1003-△PtsG-xylAB-cadA
1、pCDFtrc-cadA重组质粒的构建
合成赖氨酸脱羧酶基因cadA，核苷酸编码序列如SEQ ID NO.1所示：
ATGAACGTTATTGCAATATTGAATCACATGGGGGTTTATTTTAAAGAAGAACCCATCCGTGAACTTCATCGCGCGCTTGAACGTCTGAACTTCCAGATTGTTTACCCGAACGACCGTGACGACTTATTAAAACTGATCGAAAACAATGCGCGTCTGTGCGGCGTTATTTTTGACTGGGATAAATATAATCTCGAGCTGTGCGAAGAAATTAGCAAAATGAACGAGAACCTGCCGTTGTACGCGTTCGCTAATACGTATTCCACTCTCGATGTAAGCCTGAATGACCTGCGTTTACAGATTAGCTTCTTTGAATATGCGCTGGGTGCTGCTGAAGATATTGCTAATAAGATCAAGCAGACCACTGACGAATATATCAACACTATTCTGCCTCCGCTGACTAAAGCACTGTTTAAATATGTTCGTGAAGGTAAATATACTTTCTGTACTCCTGGTCACATGGGCGGTACTGCATTCCAGAAAAGCCCGGTAGGTAGCCTGTTCTATGATTTCTTTGGTCCGAATACCATGAAATCTGATATTTCCATTTCAGTATCTGAACTGGGTTCTCTGCTGGATCACAGTGGTCCACACAAAGAAGCAGAACAGTATATCGCTCGCGTCTTTAACGCAGACCGCAGCTACATGGTGACCAACGGTACTTCCACTGCGAACAAAATTGTTGGTATGTACTCTGCTCCAGCAGGCAGCACCATTCTGATTGACCGTAACTGCCACAAATCGCTGACCCACCTGATGATGATGAGCGATGTTACGCCAATCTATTTCCGCCCGACCCGTAACGCTTACGGTATTCTTGGTGGTATCCCACAGAGTGAATTCCAGCACGCTACCATTGCTAAGCGCGTGAAAGAAACACCAAACGCAACCTGGCCGGTACATGCTGTAATTACCAACTCTACCTATGATGGTCTGCTGTACAACACCGACTTCATCAAGAAAACACTGGATGTGAAATCCATCCACTTTGACTCCGCGTGGGTGCCTTACACCAACTTCTCACCGATTTACGAAGGTAAATGCGGTATGAGCGGTGGCCGTGTAGAAGGGAAAGTGATTTACGAAACCCAGTCCACTCACAAACTGCTGGCGGCGTTCTCTCAGGCTTCCATGATCCACGTTAAAGGTGACGTAAACGAAGAAACCTTTAACGAAGCCTACATGATGCACACCACCACTTCTCCGCACTACGGTATCGTGGCGTCCACTGAAACCGCTGCGGCGATGATGAAAGGCAATGCAGGTAAGCGTCTGATCAACGGTTCTATTGAACGTGCGATCAAATTCCGTAAAGAGATCAAACGTCTGAGAACGGAATCTGATGGCTGGTTCTTTGATGTATGGCAGCCGGATCATATCGATACGACTGAATGCTGGCCGCTGCGTTCTGACAGCACCTGGCACGGCTTCAAAAACATCGATAACGAGCACATGTATCTTGACCCGATCAAAGTCACCCTGCTGACTCCGGGGATGGAAAAAGACGGCACCATGAGCGACTTTGGTATTCCGGCCAGCATCGTGGCGAAATACCTCGACGAACATGGCATCGTTGTTGAGAAAACCGGTCCGTATAACCTGCTGTTCCTGTTCAGCATCGGTATCGATAAGACCAAAGCACTGAGCCTGCTGCGTGCTCTGACTGACTTTAAACGTGCGTTCGACCTGAACCTGCGTGTGAAAAACATGCTGCCGTCTCTGTATCGTGAAGATCCTGAATTCTATGAAAACATGCGTATTCAGGAACTGGCTCAGAATATCCACAAACTGATTGTTCACCACAATCTGCCGGATCTGATGTATCGCGCATTTGAAGTGCTGCCGACGATGGTAATGACTCCGTATGCTGCATTCCAGAAAGAGCTGCACGGTATGACCGAAGAAGTTTACCTCGACGAAATGGTAGGTCGTATTAACGCCAATATGATCCTTCCGTACCCGCCGGGAGTTCCTCTGGTAATGCCGGGTGAAATGATCACCGAAGAAAGCCGTCCGGTTCTGGAGTTCCTGCAGATGCTGTGTGAAATCGGCGCTCACTATCCGGGCTTTGAAACCGATATTCACGGTGCATACCGTCAGGCTGATGGCCGCTATACCGTTAAGGTATTGAAAGAAGAAAGCAAAAAATAA
所用上游引物带有同源臂，序列如SEQ ID NO.2所示：
AGGAGATATACCATGATGAACGTTATTGCAATATTGAATCACATGGG
下游引物带有同源臂，序列如SEQ ID NO.3所示：
ATGCGGCCGCAAGCTTTTATTTTTTGCTTTCTTCTTTCAATACCTTAACGG
反应条件为：95℃3min，95℃15s，55℃15s，72℃90s，共30个循环；72℃5min；反应体系为(50μL)：2×Phanta max master mix 25μL，上游引物2μL，下游引物2μL，扩增模板2μL，ddH2O 19μL。其中扩增模板为大肠杆菌KA30基因组，可按照细菌基因组提取试剂盒的(购于天根生化科技(北京)有限公司)操作说明提取。核酸胶验证为目的条带后通过胶回收试剂盒(购于天根生化科技(北京)有限公司)回收目的基因片段cadA。
通过环化PCR将载体pCDFduet上的T7启动子更换为大肠杆菌KA30可识别的trc启动子，同时删除操纵基因lacO，所用引物序列如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示：
TTGACAATTAATCATCCGGCTCGTATAATGCCTGTAGAAATAATTTTGTTTAAC TTTAATAAGGAGAT(SEQ ID NO.4)
CATTATACGAGCCGGATGATTAATTGTCAAATTTCCTAATGCAGGAGTCGCA
(SEQ ID NO.5)
反应条件为：95℃3min，95℃15s，55℃15s，72℃90s，共30个循环；72℃5min，反应体系为：2×Phanta max master mix 10μL，上游引物1μL，下游引物1μL，pCDFDuet 0.5μL，ddH2O 7.5μL。PCR结束后，对产物进行消化(37℃、2h)，消化体系为：PCR产物16μL，DpnI 2μL，10×Q.Cut Buffer 2μL。将消化产物转入大肠杆菌E.coli Trans1-T1中培养。挑取转化平板上单菌落接至含40μg/ml SmR的5ml LB液体培养基，于37℃、200rpm条件下振荡培养过夜。12h后按照天根质粒提取试剂盒操作说明提取质粒并送测，获得改造载体pCDFtrc。
将改造载体pCDFtrc用Takara公司的NcoI和HindIII酶切，酶切反应体系为：10×Q.Cut Buffer 5μL，NcoI 2μL，HindIII 2μL，改造载体pCDFtrc 25μL，ddH2O 11μL，反应条件为：37℃，1h。随后将酶切后的改造载体与目的片段cadA进行同源重组，同源重组反应体系为(20μL)：5×CE II Bufer 4μL，Exnase 2μL，改造载体4μL，基因片段cadA10μL；反应条件为：37℃，30min。得到重组质粒pCDFtrc-cadA。然后再将连接产物转化至大肠杆菌E.coliTrans1-T1中。PCR筛选阳性菌株E.coli Trans1-T1-pCDFtrc-cadA并进行DNA测序，验证重组质粒构建正确。重组质粒的抗性为链霉，cadA的启动子为Trc，终止密码子为rrnB。
将阳性菌株E.coli Trans1-T1-pCDFtrc-cadA接种至含40μg/ml SmR的5ml LB液体培养基，LB液体培养基组成为蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠5g/L，于37℃、200rpm条件下振荡培养过夜。12h后按照质粒提取试剂盒(购于天根生化科技(北京)有限公司)操作说明提取重组质粒pCDFtrc-cadA。
2、pTRC99a-xylA-xylB重组质粒的构建
合成木糖异构酶基因xylA，核苷酸编码序列如SEQ ID NO.6所示：
ATGCAAGCCTATTTTGACCAGCTCGATCGCGTTCGTTATGAAGGCTCAAAATCCTCAAACCCGTTAGCATTCCGTCACTACAATCCCGACGAACTGGTGTTGGGTAAGCGTATGGAAGAGCACTTGCGTTTTGCCGCCTGCTACTGGCACACCTTCTGCTGGAACGGGGCGGATATGTTTGGTGTGGGGGCGTTTAATCGTCCGTGGCAGCAGCCTGGTGAGGCACTGGCGTTGGCGAAGCGTAAAGCAGATGTCGCATTTGAGTTTTTCCACAAGTTACATGTGCCATTTTATTGCTTCCACGATGTGGATGTTTCCCCTGAGGGCGCGTCGTTAAAAGAGTACATCAATAATTTTGCGCAAATGGTTGATGTCCTGGCAGGCAAGCAAGAAGAGAGCGGCGTGAAGCTGCTGTGGGGAACGGCCAACTGCTTTACAAACCCTCGCTACGGCGCGGGTGCGGCGACGAACCCAGATCCTGAAGTCTTCAGCTGGGCGGCAACGCAAGTTGTTACAGCGATGGAAGCAACCCATAAATTGGGCGGTGAAAACTATGTCCTGTGGGGCGGTCGTGAAGGTTACGAAACGCTGTTAAATACCGACTTGCGTCAGGAGCGTGAACAACTGGGCCGCTTTATGCAGATGGTGGTTGAGCATAAACATAAAATCGGTTTCCAGGGCACGTTGCTTATCGAACCGAAACCGCAAGAACCGACCAAACATCAATATGATTACGATGCCGCGACGGTCTATGGCTTCCTGAAACAGTTTGGTCTGGAAAAAGAGATTAAACTGAACATTGAAGCTAACCACGCGACGCTGGCAGGTCACTCTTTCCATCATGAAATAGCCACCGCCATTGCGCTTGGCCTGTTCGGTTCTGTCGACGCCAACCGTGGCGATGCGCAACTGGGCTGGGACACCGACCAGTTCCCGAACAGTGTGGAAGAGAATGCGCTGGTGATGTATGAAATTCTCAAAGCAGGCGGTTTCACCACCGGTGGTCTGAACTTCGATGCCAAAGTACGTCGTCAAAGTACTGATAAATATGATCTGTTTTACGGTCATATCGGCGCGATGGATACGATGGCACTGGCGCTGAAAATTGCAGCGCGCATGATTGAAGATGGCGAGCTGGATAAACGCATCGCGCAGCGTTATTCCGGCTGGAATAGCGAATTGGGCCAGCAAATCCTGAAAGGCCAAATGTCACTGGCAGATTTAGCCAAATATGCTCAGGAACATCATTTGTCTCCGGTGCATCAGAGTGGTCGCCAGGAACAACTGGAAAATCTGGTAAACCATTATCTGTTCGACAAATAA
所用上游引物带有同源臂，序列如SEQ ID NO.7所示：
GAAACAGACCATGGAATTCATGGAGTTCAATATGCAAGCCTATTTTGAC
下游引物带有同源臂，序列如SEQ ID NO.8所示：
GGTCGACTCTAGAGGATCCTTATTTGTCGAACAGATAATGGTTTACCAGATTT TCC
反应条件为：95℃3min，95℃15s，55℃15s，72℃60s，共30个循环；72℃5min，反应体系为(50μL)：2×Phanta max master mix 25μL，上游引物2μL，下游引物2μL，扩增模板2μL，ddH2O 19μL。其中扩增模板为大肠杆菌KA30基因组，可按照细菌基因组提取试剂盒(购于天根生化科技(北京)有限公司)的操作说明提取。核酸胶验证为目的条带后按照胶回收试剂盒(购于天根生化科技(北京)有限公司)操作说明回收目的基因片段xylA。
通过环化PCR删除pTrc99a启动子后的操纵基因lacO以获得改造载体，所用引物序列如SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10所示：
CCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTTCACACAGGAAACA(SEQ ID NO.9)
CCCATGGTCTGTTTCCTGTGTGAAATTCCACACATTATACGA(SEQ ID NO.10)
反应条件为：95℃3min，95℃15s，55℃15s，72℃120s，共30个循环；72℃5min，反应体系为：2×Phanta max master mix 10μL，上游引物1μL，下游引物1μL，pTrc99a 0.5μL，ddH2O 7.5μL。PCR结束后，对产物进行消化(37℃、2h)，消化体系为：PCR产物16μl，DpnI 2μl，10×Q.Cut Buffer 2μl。将消化产物转入大肠杆菌E.coli Trans1-T1中培养。挑取转化平板上单菌落接至含50μg/ml Amp的5ml LB液体培养基，于37℃、200rpm条件下振荡培养过夜。12h后按照天根质粒提取试剂盒操作说明提取质粒并送测，获得改造载体。
将改造载体用Takara公司的EcoRI和BamHI酶切，酶切反应体系为：10×Q.CutBuffer5μL，EcoRI 2μL，BamHI 2μL，改造载体pTrc99a 25μL，ddH2O 16μL，反应条件为：37℃，1h。随后将酶切后的改造载体与目的片段xylA进行同源重组，同源重组反应体系为(20μL)：5×CE II Bufer 4μL，Exnase 2μL，改造载体4μL，基因片段xylA 10μL；反应条件为：37℃，30min，得到重组质粒pTrc99a-xylA。
合成木酮糖激酶基因xylB，核苷酸编码序列如SEQ ID NO.11所示：
ATGTATATCGGGATAGATCTTGGCACCTCGGGCGTAAAAGTTATTTTGCTCAACGAGCAGGGTGAGGTGGTTGCTGCGCAAACGGAAAAGCTGACCGTTTCGCGCCCGCATCCACTCTGGTCGGAACAAGACCCGGAACAGTGGTGGCAGGCAACTGATCGCGCAATGAAAGCTCTGGGCGATCAGCATTCTCTGCAGGACGTTAAAGCATTGGGTATTGCCGGCCAGATGCACGGAGCAACCTTGCTGGATGCTCAGCAACGGGTGTTACGCCCTGCCATTTTGTGGAACGACGGGCGCTGTGCGCAAGAGTGCACTTTGCTGGAAGCGCGAGTTCCGCAATCGCGGGTGATTACCGGCAACCTGATGATGCCCGGATTTACTGCGCCTAAATTGCTATGGGTTCAGCGGCATGAGCCGGAGATATTCCGTCAAATCGACAAAGTATTATTACCGAAAGATTACTTGCGTCTGCGTATGACGGGGGAGTTTGCCAGCGATATGTCTGACGCAGCTGGCACCATGTGGCTGGATGTCGCAAAGCGTGACTGGAGTGACGTCATGCTGCAGGCTTGCGACTTATCTCGTGACCAGATGCCCGCATTATACGAAGGCAGCGAAATTACTGGTGCTTTGTTACCTGAAGTTGCGAAAGCGTGGGGTATGGCGACGGTGCCAGTTGTCGCAGGCGGTGGCGACAATGCAGCTGGTGCAGTTGGTGTGGGAATGGTTGATGCTAATCAGGCAATGTTATCGCTGGGGACGTCGGGGGTCTATTTTGCTGTCAGCGAAGGGTTCTTAAGCAAGCCAGAAAGCGCCGTACATAGCTTTTGCCATGCGCTACCGCAACGTTGGCATTTAATGTCTGTGATGCTGAGTGCAGCGTCGTGTCTGGATTGGGCCGCGAAATTAACCGGCCTGAGCAATGTCCCAGCTTTAATCGCTGCAGCTCAACAGGCTGATGAAAGTGCCGAGCCAGTTTGGTTTCTGCCTTATCTTTCCGGCGAGCGTACGCCACACAATAATCCCCAGGCGAAGGGGGTTTTCTTTGGTTTGACTCATCAACATGGCCCCAATGAACTGGCGCGAGCAGTGCTGGAAGGCGTGGGTTATGCGCTGGCAGATGGCATGGATGTCGTGCATGCCTGCGGTATTAAACCGCAAAGTGTTACGTTGATTGGGGGCGGGGCGCGTAGTGAGTACTGGCGTCAGATGCTGGCGGATATCAGCGGTCAGCAGCTCGATTACCGTACGGGGGGGGATGTGGGGCCAGCACTGGGCGCAGCAAGGCTGGCGCAGATCGCGGCGAATCCAGAGAAATCGCTCATTGAATTGTTGCCGCAACTACCGTTAGAACAGTCGCATCTACCAGATGCGCAGCGTTATGCCGCTTATCAGCCACGACGAGAAACGTTCCGTCGCCTCTATCAGCAACTTCTGCCATTAATGGCGTAA
所用上游引物带有RBS序列与同源臂，序列如SEQ ID NO.12所示：
CGACAAATAAGGATCTTCACACAGGAAACAGACCATTGGAATTATG
下游引物带有同源臂，序列如SEQ ID NO.13所示：
CGACTCTAGAGGATCTTACGCCATTAA
反应条件为：95℃3min，95℃15s，55℃15s，72℃60s，共30个循环；72℃5min，反应体系为(50μL)：2×Phanta max master mix 25μL，上游引物2μL，下游引物2μL，扩增模板2μL，ddH2O 19μL，其中扩增模板为大肠杆菌KA30基因组，可按照细菌基因组提取试剂盒购于天根生化科技(北京)有限公司)操作说明提取。核酸胶验证为目的条带后按照胶回收试剂盒(购于天根生化科技(北京)有限公司)操作说明回收目的基因片段xylB。
以重组质粒pTrc99a-xylA为载体，用Takara公司的BamHI单酶切，酶切反应体系为：10×Q.Cut Buffer 5μL，BamHI 2μL，质粒pTrc99a-xylA 25μL，ddH2O 18μL，反应条件为：37℃，1h。随后与目的片段xylB进行同源重组，同源重组反应体系为(20μL)：5×CE IIBufer 4μL，Exnase 2μL，质粒pTrc99a-xylA 4μL，基因片段xylB 10μL；反应条件为：37℃，30min，得到重组质粒pTRC99a-xylA-xylB。将连接产物转化至大肠杆菌E.coli Trans1-T1中。PCR筛选阳性菌株E.coli Trans1-T1-pTRC99a-xylA-xylB并进行DNA测序，验证重组质粒构建正确。重组质粒的抗性为氨苄，xylA、xylB的启动子为Trc，终止密码子为rrnB。
将阳性菌株E.coli Trans1-T1-pTRC99a-xylA-xylB接种至含50μg/ml Amp的5mlLB液体培养基，LB液体培养基组成为蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠5g/L，于37℃、200rpm条件下振荡培养过夜。12h后按照质粒提取试剂盒(购于天根生化科技(北京)有限公司)操作说明提取重组质粒pTRC99a-xylA-xylB。
3、PtsG基因的敲除
(1)制备含有Cas9质粒目的菌株的感受态。将Cas9质粒通过化学法导入到目的菌株KA30中，并涂布在含25μg/ml Kan的LB固体培养基上。挑取单菌落富集后接种于5mL含25μg/ml Kan的LB液体培养基，30℃，200rpm培养18h后，按5％v/v接种量接种于50mL含25μg/mlKan的LB液体培养基，30℃，200rpm培养至OD600约为0.2后，加入终浓度为30mM/L L-阿拉伯糖(115℃，15min高温灭菌)，继续培养至OD600至0.4～0.6后，将培养液转移至50ml离心管中，冰上预冷20min。4℃下4000rpm离心10min，收集细胞；弃上清，用40ml预冷的无菌水重悬细胞；重复上述步骤；弃上清，用20ml预冷的10％(v/v)甘油重悬细胞；4℃下4000rpm离心10min；弃上清，用初始菌液体积的3‰预冷10％(v/v)甘油重悬，以每管50μl分装于预冷的1.5ml离心管中，-80℃保存。
(2)构建突变SgRNA质粒。找出待敲除基因PtsG的N20序列，合成含有N20序列的引物，对SgRNA(购买于淼灵生物公司)进行环化PCR，所用引物序列如SEQ ID NO.14、15所示。
GGGCGGTATTATGATCTCCGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGC(SEQ ID NO.14)
CGGAGATCATAATACCGCCCACTAGTATTATACCTAGGACTGAGCTAGCTGTC(SEQ ID NO.15)
反应条件为：95℃3min，95℃15s，55℃15s，72℃90s，共30个循环；72℃5min，反应体系为：2×Phanta max master mix 10μL，上游引物1μL，下游引物1μL，sgRNA0.5μL，ddH2O7.5μL。PCR结束后，对产物进行消化(37℃、2h)，消化体系为：PCR产物16μL，DpnI 2μL，10×Q.Cut Buffer 2μL。将消化产物转入大肠杆菌E.coli Trans1-T1中培养。挑取转化平板上单菌落接至含40μg/ml SmR的5ml LB液体培养基，于37℃、200rpm条件下振荡培养过夜。12h后按照天根质粒提取试剂盒操作说明提取质粒并送测，获得构建成功的突变SgRNA质粒。
(3)构建Donor DNA。选取待敲除基因PtsG两端序列作为基因敲除上下同源臂(不少于500bp，中间剩余的部分即为待敲除的基因)，先合成上下游同源臂，核苷酸编码序列如SEQ ID NO.16、17所示。合成上下游同源臂所用引物序列如SEQ ID NO.18～21所示。
基因敲除上游同源臂，序列如SEQ ID NO.16所示：
TGCGGAGCAACTGCGCGATGCTGCGCGTTATGTCCCCCTGGATCGGTTACTGGTGGAAACTGACTCACCTTACCTTGCGCCGGTACCGCATCGAGGAAAAGAGAATCAACCTGCGATGGTTCGTGACGTTGCAGAATACATGGCTGTGTTGAAAGGTGTTGCCGTTGAAGAACTGGCGCAGGTAACCACCGATAACTTCGCCCGTCTGTTTCACATCGACGCTTCCCGCCTTCAATCCATCCGTTGAATGAGTTTTTTTAAAGCTCGTAATTAATGGCTAAAACGAGTAAAGTTCACCGCCGAAAATTGGGCGGTGAATAACCACGTTTGAAATATTGTGACATATGTTTTGTCAAAATGTGCAACTTCTCCAATGATCTGAAGTTGAAACGTGATAGCCGTCAAACAAATTGGCACTGAATTATTTTACTCTGTGTAATAAATAAAGGGCGCTTAGATGCCCTGTACACGGCGAGGCTCTCCCCCCTTGCCACGCGTGAGAACGTAAAAAAAGCACCCATACTCAGGAGCACTCTCAATTATGTTTAAGAATGCATTTGCTAACCTGCAAAAGGTCGGTAAATCGCTGATGCTGCCGGTATCCGTACTGCC
基因敲除下游同源臂，序列如SEQ ID NO.17所示：
AAACCGAGATGGATGAGTACATCCGTAACCACTAATCCGTAAGACGTTGGGGAGACTAAGGCAGCCAGATGGCTGCCTTTTTTACAGGTGTTATTCAGAATTGATACGTGCCGGTAATGCTGAAATTACGCGGTGTGCCGTAGACGATAGAACCTTCCACGTTGGTATCGTAGGTTTTGTCGAACAGGTTATTGACGTTCCCCTGTAACGAGAAGTTTTTCGTCACCTGGTAGCGGGTGAAGAGATCCACCAGCGCGTAGCTACCTTGCTCGGCGCGGAAGGTGCCATACGGCGTCACGGTGTCGGTATACACGCGATTTTGCCAGTTAACACCACCGCCGACCGTCAACTCTGGCATGACAGGCAACCGATAGCTGGTGAACATTTTAACCGTGGTGCGTGGCAGATTAGGATTAACGGCGTTTCCTTCGTTATCCTCTGCAATATAGCGCGTTGCGCCAAATGTCAGCTGCCAGTTGTCGGTAATTGCGCCGTTGAGTTCAAATTCCACCCCTTTACTGACTGTCCCATCCACCGCTTTATAGGCGGTTTCGCCGTTGCTGCCGGGGATAGGTGTACCGGTGGACTGAGCGACATTA
合成上下游同源臂所用引物序列：
上游同源臂引物：
TGCGGAGCAACTGCGC(SEQ ID NO.18)
CATCTCGGTTTGGCAGTACGGATACCGGCA(SEQ ID NO.19)
下游同源臂引物：
TCCGTACTGCCAAACCGAGATGGATGAGTACATCCG(SEQ ID NO.20)
TAATGTCGCTCAGTCCACCGG(SEQ ID NO.21)
PCR反应条件为：95℃3min，95℃15s，55℃15s，72℃45s，共30个循环；72℃5min，PCR反应体系为(50μL)：2×Phanta max master mix 25μL，上游引物2μL，下游引物2μL，扩增模板2μL，ddH2O 19μL。核酸胶验证为目的条带后通过胶回收试剂盒(购于天根生化科技(北京)有限公司)回收基因敲除上、下游同源臂基因片段，然后利用重叠PCR将上下同源臂重叠拼接即为Donor DNA。反应结束后用琼脂糖凝胶电泳检测产物，并用试剂盒回收目的DNA片段。其中，重叠PCR反应条件为：95℃3min，95℃15s，55℃15s，72℃60s，共30个循环；72℃5min，重叠PCR反应体系为：2×Phanta max master mix 25μL，上同源臂2μL，下同源臂2μL，引物(SEQ ID NO.18、21)各2μL，ddH2O 17μL。
(4)PtsG基因敲除。取一管步骤(1)制备的含有Cas9质粒目的菌株KA30的感受态细胞，置于冰上融化；取10～15μL质粒(Donor DNA：SgRNA＝5:1，SgRNA＝100ng/μL)加至上述感受态细胞中，轻轻混匀，置于冰上1min；将上述样品放到预冷的2mm电转杯中，置于冰上5min；将电转仪电压设定为2500V，电击5～6ms，迅速加入1ml LB培养基，在30℃、200rpm条件下培养2h后，涂布至含25μg/ml Kan和40μg/ml SmR抗性的固体LB培养基并于30℃过夜培养。
(5)敲除验证。从平板上挑取单菌落，进行菌落PCR验证，验证上下引物序列如SEQID NO.22、23所示。
上游引物：AGTGACGGATTGCGGTGG(SEQ ID NO.22)
下游引物：GCTACGCGCTGGTGGAT(SEQ ID NO.23)
显示PtsG基因敲除成功，出现大小正确的条带，再将阳性菌株送测。
(6)敲除质粒的脱除。将测序正确的菌株于LB固体培养基连续传代培养直至其无法在有KanR以及SmR抗性的固体LB培养基上生长则敲除质粒脱除成功，最终获得敲除了PtsG基因的大肠杆菌NT1003-△PtsG。
4、重组大肠杆菌的构建
将重组质粒pCDFtrc-cadA和pTRC99a-xylA-xylB通过电穿孔法转化入表达宿主敲除了PtsG基因的大肠杆菌NT1003-△PtsG中。具体步骤如下：将步骤1构建的重组质粒pCDFtrc-cadA(2μL)、步骤2构建的重组质粒pTRC99a-xylA-xylB(2μL)与步骤3中敲除了PtsG基因的大肠杆菌NT1003-△PtsG的感受态细胞(50μL)混合并置于冰上2min。将上述样品放到预冷的2mm电转杯中，置于冰上5min；将电转仪电压设定为2500V，电击5～6ms，迅速加入1ml LB培养基，在37℃、200rpm条件下培养2h后，离心机4000rpm离心4min后吸去上清(800μL)，将菌泥重悬后涂布至氨苄、链霉双抗LB平板。置于37℃的培养箱中培养36h，得到重组大肠杆菌NT1003-△PtsG-xylAB-cadA。
实施例2重组大肠杆菌共利用五碳糖和六碳糖一步发酵生产1,5-戊二胺
挑取实施例1中构建的重组大肠杆菌NT1003-△PtsG-xylAB-cadA的阳性菌落，接入5mL种子培养基(配方：硫酸铵10g/L、谷氨酸钠5g/L、蛋白胨5g/L、酵母粉10g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、蔗糖5g/L、七水合硫酸镁1g/L、一水合硫酸锰0.077g/L、七水合硫酸亚铁0.032g/L、丙酮酸钠0.55g/L)中，37℃，200rpm培养至OD600至1～1.5时即为种子液。再按照3％体积比的接种量转接至发酵培养基中。控制初始OD600为0.05，37℃下发酵30～36h获得发酵产物，同时观察发酵对碳源的消耗情况。
其中，发酵培养基的碳源为葡萄糖和木糖的组合，其配方为：碳源22～23g/L、硫酸铵10g/L、蛋白胨5g/L、酵母粉2g/L、氯化钾0.5g/L、七水合硫酸镁2g/L、MoPOSNa100mM、碳酸钙10g/L、维生素b1 0.08g/L、烟酰胺0.01g/L、七水合硫酸亚铁0.032g/L、七水合硫酸锌0.086g/L、硫酸铜0.077g/L、硫酸锰0.032g/L、生物素45μg/L。以葡萄糖和木糖的碳摩尔量比例为2:1与1:1为例，当葡萄糖和木糖的碳摩尔量比例为2:1时，发酵培养基中葡萄糖浓度为16g/L、木糖浓度为6.7g/L；当葡萄糖和木糖的碳摩尔量比例为1:1时，发酵培养基中葡萄糖浓度为12g/L、木糖浓度为10g/L。其中，碳源总碳摩尔浓度为0.053mol/L。
检测方法：葡萄糖检测方法为采用SBA生物传感分析仪，进样量：25μL。
木糖检测方法为DNS(3,5-二硝基水杨酸)还原法检测：取200μL DNS溶液与200μL超纯水混合，煮沸5min，冷却后加水定容至2mL，作为空白对照。取待测样品200μL与200μLDNS混合，煮沸5min，冷却后加水定容至2mL。以空白对照为参照，于540nm处测定吸光值，根据还原糖标准曲线计算还原糖浓度。木糖浓度即为还原糖总浓度减去葡萄糖浓度的差值。
1,5-戊二胺检测方法为高效液相色谱(HPLC)，检测条件为：Agilgent1260Infinity System；示差检测器；色谱柱：YMC Carotenoid色谱柱，250×4.6mmL.D.-5μm(产品货号：CT99S05-2546WT)；流动相成分：50mL乙腈+5mL三氟乙酸加水定容到1L；流速：0.6mL/min；进样量：10μL，柱温：35℃。
将实施例2的发酵产物按照上述方法进行检测，实验结果如图1-3所示。其中，葡萄糖与木糖的消耗情况如图1和图2所示，结果发现，该两种碳源比例下，重组大肠杆菌NT1003-△PtsG-xylAB-cadA均可同步消耗葡萄糖与木糖，解决了葡萄糖碳分解代谢阻遏的问题。1,5-戊二胺产量如图3所示，从图3可以看出，本发明实现了直接以葡萄糖与木糖为混合碳源发酵生产1,5戊二胺，当葡萄糖和木糖的碳摩尔量比例为2:1时，产量为4.49g/L产率为0.198g/g；当葡萄糖和木糖的碳摩尔量比例为1:1时，产量为4.28g/L产率为0.195g/g。
本发明提供了一种共利用五碳糖和六碳糖生产1,5-戊二胺的重组大肠杆菌及其构建方法与应用的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。

Claims (10)

1.一种共利用五碳糖和六碳糖生产1,5-戊二胺的重组大肠杆菌，其特征在于，以大肠杆菌KA30为出发菌株，通过过表达赖氨酸脱羧酶基因CadA、木糖异构酶基因XylA、木酮糖激酶基因XylB，并敲除葡萄糖特异性转运膜透性酶基因PtsG，构建得到重组大肠杆菌NT1003-△PtsG-xylAB-cadA。
2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述的赖氨酸脱羧酶基因CadA来源于大肠杆菌MG1655，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述的木糖异构酶基因XylA来源于大肠杆菌MG1655，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述的木酮糖激酶基因XylB来源于大肠杆菌MG1655，其核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
3.一种生产1,5-戊二胺的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将赖氨酸脱羧酶基因CadA通过同源重组的方式，以NcoI和HindIII为酶切位点，克隆到表达载体pCDFtrc中，并验证，得到重组质粒pCDFtrc-cadA；
(2)将木糖异构酶基因XylA通过同源重组的方式，以EcoRI和BamHI为酶切位点，克隆到表达载体pTrc99a中，并验证，得到重组质粒pTrc99a-xylA；然后将木酮糖激酶基因XylB通过同源重组的方式，以BamHI为酶切位点，克隆到重组质粒pTrc99a-xylA中，并验证，得到重组质粒pTrc99a-xylA-xylB；
(3)敲除大肠杆菌KA30的葡萄糖特异性转运膜透性酶基因PtsG，获得表达宿主即敲除PtsG基因的大肠杆菌NT1003-△PtsG；
(4)将步骤(1)获得的重组质粒pCDFtrc-cadA和步骤(2)获得的重组质粒pTrc99a-xylA-xylB共同转化至步骤(3)获得的大肠杆菌NT1003-△PtsG中，得到重组大肠杆菌，即1,5-戊二胺生产菌株NT1003-△PtsG-xylAB-cadA。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的表达载体pCDFtrc为利用环化PCR将表达载体pCDFduet上的T7启动子更换为trc启动子，同时删除T7启动子后的操纵基因lacO获得的改造载体；步骤(2)中，所述的表达载体pTrc99a为利用环化PCR删除pTrc99a启动子后的操纵基因lacO获得的改造载体。
5.权利要求1或2所述的重组大肠杆菌在生产1,5-戊二胺中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：
(Ⅰ)将活化后的重组大肠杆菌接种到种子培养基中进行种子培养，获得种子液；
(Ⅱ)将步骤(Ⅰ)将种子液直接接种于发酵培养基进行发酵培养。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤(Ⅰ)中，所述的种子培养，其培养条件为：37℃，180～250rpm培养至OD600＝1.5～2。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤(Ⅱ)，所述的接种，其接种量为2～5％v/v；所述的发酵培养，其培养条件为：控制初始OD600＝0.05～0.1，37℃下发酵30～36h。
9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤(Ⅱ)，所述的发酵培养基，其碳源为葡萄糖和木糖的组合；其中，所述的葡萄糖和木糖，其碳摩尔量比例为1～2:1。
10.根据权利要求6或9所述的应用，其特征在于，步骤(Ⅱ)，所述的发酵培养基，其配方为：碳源22～23g/L，硫酸铵10g/L、蛋白胨5g/L、酵母粉2g/L、氯化钾0.5g/L、七水合硫酸镁2g/L、MoPOSNa 100mM、碳酸钙10g/L、维生素b1 0.08g/L、烟酰胺0.01g/L、七水合硫酸亚铁0.032g/L、七水合硫酸锌0.086g/L、硫酸铜0.077g/L、硫酸锰0.032g/L、生物素45μg/L。
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