CN117025497A - 催化制备1,5-戊二醇的基因工程菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及催化制备1,5‑戊二醇的基因工程菌及其应用。本发明以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主，使用合成1,5‑戊二醇的关键酶赖氨酸脱羧酶CadA、4‑氨基丁酸转氨酶GabT及醛酮还原酶YahK，分别构建重组质粒pRSFDuet‑CadA‑GabT和pTrc99a‑YahK，获得重组菌株BL21(DE3)‑pRSFDuet‑CadA‑GabT‑pTrc99a‑YahK。以重组菌株蛋白表达纯化后重选的细胞液、赖氨酸、葡萄糖、α‑酮戊二酸以及Mg2+，进行全细胞催化反应产1,5‑戊二醇。进一步的，通过构建pRSFDuet‑CadA‑SP‑GabT和pTrc99a‑CP‑YahK重组质粒对GabT和YahK进行蛋白组装，显著提高了1,5‑戊二醇产量。本发明首次通过全细胞催化对1,5戊二胺的连续转氨生产戊二醛，再由戊二醛经醛酮还原酶生产1,5‑戊二醇，并利用噬菌体P22的SP和CP蛋白对关键酶进行组装，反应体系简单、条件温和、周期短、副产物少，而且清洁无污染，是一条简单、快速的生产途径。

Description

催化制备1,5-戊二醇的基因工程菌及其应用
技术领域
本发明属于1,5-戊二醇生物制备领域，具体涉及催化制备1,5-戊二醇的基因工程菌及其应用。
背景技术
1,5-戊二醇(1,5-Pentanediol，缩写1,5-PDO)是一种含有奇数个亚甲基的直链二元醇，是合成聚酯、不饱和聚酯、聚氨酯的重要原料，可用于塑料、纤维、弹性体、涂料、胶黏剂等的生产。
1,5-PDO是高附加值的二醇，它的两端羟基可与羧基发生酯化反应，因此1,5-PDO的柔韧性和粘合性能很有价值。另一方面，1,5-PDO也用于生产涂料，其有助于在硬度和柔韧性、附着力、耐候性和耐水解性之间取得良好平衡。由于1,5-PDO高化学和热稳定性，它作为生产用于各种涂料和塑料的聚酯和醇酸树脂的基础材料证明了它的重要性。使用1,5-PDO的增塑剂与低分子量的增塑剂相比，具有耐挥发性、耐喷油喷霜性耐迁移性和耐低温性等优良性能。
目前，1,5-PDO的制备方法主要包括以下两种：1)化学合成法；2)生物发酵法。其中，化学合成法具有成本较高且生产产品分离困难的缺点；生物发酵法存在大量的副产物且有手性问题。目前制备NMN的生物发酵法一般是以葡萄糖为底物，通过合成赖氨酸，进而生产1,5-PDO。但是，从赖氨酸到1,5-PDO的过程中，存在代谢路径长，酶活不高等限制因素，严重制约了其应用和发展。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种催化制备1,5-戊二醇的基因工程菌。
本发明还要解决的技术问题是提供上述基因工程菌的制备方法及应用。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种催化制备1,5-戊二醇的基因工程菌，所述的基因工程菌是以大肠杆菌为宿主，过表达赖氨酸脱羧酶CadA、4-氨基丁酸转氨酶GabT和醛酮还原酶YahK得到的。
进一步的，一种催化制备1,5-戊二醇的基因工程菌，所述的基因工程菌是以大肠杆菌为宿主，过表达所述的赖氨酸脱羧酶CadA、4-氨基丁酸转氨酶GabT和醛酮还原酶YahK的同时，表达SP蛋白和CP蛋白得到的。
其中，所述的大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)。
其中，所述的赖氨酸脱羧酶CadA来源于Escherichia coli MG1655，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
具体的，以具有赖氨酸脱羧酶CadA的细菌基因组为模板，通过常规PCR扩增复制赖氨酸脱羧酶的核苷酸编码序列。其中，所用上下游引物带有同源臂，其核苷酸序列分别如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示。
其中，所述的4-氨基丁酸转氨酶GabT来源于Escherichia coli MG1655，其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
具体的，以具有4-氨基丁酸转氨酶GabT的细菌基因组为模板，通过常规PCR扩增复制4-氨基丁酸转氨酶的核苷酸编码序列。其中，所用上下游引物带有同源臂，其核苷酸序列分别如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示。
其中，所述的醛酮还原酶YahK来源于Escherichia coli MG1655，其核苷酸序列如SEQ ID No.7所示。
具体的，以具有醛酮还原酶YahK的细菌基因组为模板，通过常规PCR扩增复制醛酮还原酶的核苷酸编码序列。其中，所用上下游引物带有同源臂，其序列分别如SEQ IDNo.8和SEQ ID No.9所示。
其中，所述的SP蛋白来源于噬菌体P22，其核苷酸序列如SEQ ID No.10所示；所述的CP蛋白来源于噬菌体P22，其核苷酸序列如SEQ ID No.14所示。
具体的，以具有SP蛋白、CP蛋白的噬菌体P22基因组为模板，通过常规PCR分别扩增复制SP蛋白和CP蛋白的核苷酸编码序列。其中，SP蛋白所用上下游引物带有同源臂，其核苷酸序列分别如SEQ ID No.11和SEQ ID No.12所示；CP蛋白所用上下游引物带有同源臂，其核苷酸序列分别如SEQ ID No.15和SEQ ID No.16所示。
上述基因工程菌的制备方法，包括如下步骤：
(1)构建重组质粒：将赖氨酸脱羧酶基因CadA导入表达载体pRSFDuet后，转化入大肠杆菌Trans1-T1中，再经提取获得重组质粒pRSFDuet-CadA；再将4-氨基丁酸转氨酶基因GabT导入重组质粒pRSFDuet-CadA中，转化入大肠杆菌Trans1-T1中，再经提取获得重组质粒pRSFDuet-CadA-GabT；将醛酮还原酶基因YahK导入表达载体pTrc99a后，转化入大肠杆菌Trans1-T1中，再提取获得重组质粒pTrc99a-YahK；
(2)将步骤(1)获得的重组质粒pRSFDuet-CadA-GabT和pTrc99a-YahK共转化入宿主大肠杆菌BL21(DE3)中，得到重组大肠杆菌BL21(DE3)-pRSFDuet-CadA-GabT-pTrc99a-YahK，即为所述的基因工程菌。
进一步的，上述基因工程菌的制备方法，包括如下步骤：
(a)构建重组质粒：将SP蛋白基因SP和4-氨基丁酸转氨酶基因GabT通过overlabPCR扩增再回收得到SP-GabT基因片段，以上述步骤(1)获得的重组质粒pRSFDuet-CadA为表达载体，将SP-GabT基因片段导入其中后，转化入大肠杆菌Trans1-T1中，再经提取获得重组质粒pRSFDuet-CadA-SP-GabT；将CP蛋白基因CP和醛酮还原酶基因YahK通过overlab PCR扩增再回收得到CP-YahK基因片段，以pTrc99a为表达载体，将CP-YahK基因片段导入其中后，转化入大肠杆菌Trans1-T1中，再经提取获得重组质粒pTrc99a-CP-YahK；
(b)将步骤(a)获得的重组质粒pRSFDuet-CadA-SP-GabT和pTrc99a-CP-YahK共转化入宿主大肠杆菌BL21(DE3)中，得到重组大肠杆菌BL21(DE3)-pRSFDuet-CadA-SP-GabT-pTrc99a-CP-Yahk，即为所述的基因工程菌。
上述两种基因工程菌在生产制备1,5-戊二醇中的应用也在本发明所保护的范围之内。
将所述的基因工程菌诱导表达纯化后的菌体再重悬得到的细胞液作为催化剂，全细胞催化赖氨酸和/或赖氨酸盐生物转化为1,5-戊二醇。
其中，所述的生物转化，其路径为：
(Ⅰ)将赖氨酸和/或赖氨酸盐转化为1,5戊二胺；
(Ⅱ)将步骤(Ⅰ)所述的1,5戊二胺转化为戊二醛；
(Ⅲ)将步骤(Ⅰ)所述的戊二醛转化为1,5-戊二醇。
具体的，所述的诱导表达纯化，是将基因工程菌的菌液按照5-15％v/v的接种量接种于含有终浓度50mg/L KanR和Amp的LB液体培养基中，培养至OD600为0.5-0.8后，加入IPTG，18-37℃、100-200rpm条件下振荡培养12-24h，离心，最后收集菌体。优选的接种量为10％v/v，优选的培养条件为：18℃、200rpm条件下振荡培养18h。
其中，所述的诱导表达纯化，其过程中加入了终浓度为0.025-1mM的IPTG，优选终浓度为0.5mM的IPTG；
其中，所述的重悬，其缓冲液为PBS缓冲液，pH7.0-8.0。
其中，所述的全细胞催化，其催化反应体系为5-50mM赖氨酸、5-50mM葡萄糖、10-100mMα-酮戊二酸、5-50mM Mg2+和OD600为40的细胞液；其反应条件为pH 7.0-8.0，30℃反应8-12h。优选的，所述的Mg2+为MgCl2。
有益效果：
(1)与现有的1,5-PDO的生物制备方法相比，本发明首次通过连续转氨作用，将1,5戊二胺转化为戊二醛，后经过醛酮还原酶作用生产1,5-PDO。
(2)所选的4-氨基丁酸转氨酶对中间产物戊二胺有比较高转化率。
(3)选择α-酮戊二酸作为氨基受体，使其转变为谷氨酸，后可通过胞内自身代谢系统进行循环，极大地节约成本。
(4)通过噬菌体P22的SP和CP蛋白将关键酶组装，极大地增加了酶之间的接触，与胞内游离酶相比，提高了相互之间的物质传递效率。
(5)通过组装后的重组细胞拥有较高的1,5-PDO的产出。
(6)全细胞催化反应的反应过程较为温和，对环境、设备及操作人员均无害。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。
图1为本发明中重组质粒构建的图谱，其中，(a)为实施例1中的pRSFDuet-CadA；(b)为实施例2中的pRSFDuet-CadA-GabT；(c)为实施例3中的pTrc99a-YahK；
图2为本发明催化制备1,5-戊二醇的合成路径之一；
图3为本发明中HPLC检测催化1,5-PDO的生成，其中，(a)为1,5-PDO标准品的液相色谱峰；(b)为实施例6中1,5-PDO的液相色谱峰；
图4为组装前后1,5-PDO产量情况对比。
具体实施方式
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
下述实施例中，所使用的大肠杆菌Trans1-T1、pRSFDuet、pTrc99a、大肠杆菌BL21(DE3)等材料都是商业化产品，可直接购买。
下述实施例中，所述的赖氨酸、葡萄糖、α-酮戊二酸以及MgCl2的浓度均指的是该体系中的终浓度。
下述实施例中，所述的1,5-PDO测定方法：Aminex HPX-87H色谱柱(300×7.88mm)，流动相为8mM硫酸，流速0.6mL·min-1，检测波长为260nm，柱温为60℃。
实施例1pRSFDuet-CadA重组质粒的构建
以具有Escherichia coli MG1655的赖氨酸脱羧酶CadA的细菌基因组为模板，通过常规PCR扩增复制赖氨酸脱羧酶的核苷酸编码序列，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
其中，所用上游引物带有同源臂，序列为：SEQ ID No.2
GCCAGGATCCGAATTCATGAACGTTATTGCAATATTGAATCACATGG。
下游引物带有同源臂，序列为：SEQ ID No.3
ATGCGGCCGCAAGCTTAATACCTTAACGGTATAGCGGCCA。
反应条件为：95℃2min，95℃20s，55℃90s，72℃30s，共30个循环；72℃5min。将扩增得到的CadA基因序列经1％琼脂糖凝胶电泳后回收相应片段。将表达载体pRSFDuet用Takara公司的EcoR I和Hind III酶切，酶切反应体系为：10×buffer 1μL，EcoR I 1μL，Hind III 1μL，pRSFDuet载体7μL。酶切体系于37℃条件下反应1小时。将酶切后线性化载体末端15-20bp序列作为同源臂，并将其分别添加到CadA基因特异性上下游引物序列的5'端。重组反应体系为：使用Vazyme公司的5X CE II buffer 4μL，Exnase II 2μL，CadA基因片段10μL，酶切载体2μL进行连接。连接于37℃下反应30min得到重组产物。将重组产物转化至大肠杆菌Trans1-T1中。PCR筛选阳性菌株Trans1-T1-pRSFDuet-CadA并进行DNA测序，验证重组质粒构建正确。将阳性菌株接种至含有终浓度50mg/L KanR的5mL LB液体培养基，LB液体培养基组成为蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠5g/L，于37℃、200rpm条件下振荡培养过夜。12小时后按照天根质粒提试剂盒操作说明提取重组质粒pRSFDuet-CadA(图1a)。
实施例2pRSFDuet-CadA-GabT重组质粒的构建
以具有Escherichia coli MG1655的4-氨基丁酸转氨酶GabT的细菌基因组为模板，通过常规PCR扩增复制4-氨基丁酸转氨酶的核苷酸编码序列，其核苷酸序列如SEQIDNo.4所示。
其中，所用上游引物带有同源臂，序列为：SEQ ID No.5
AAGGAGATATACATATGATGAACAGCAATAAAGAGTTAATGCAGC。
下游引物带有同源臂，序列为：SEQ ID No.6
TTACCAGACTCGAGGGTACCCTACTGCTTCGCCTCATCAAAACAC。
反应条件为：95℃2min，95℃20s，55℃1min，72℃30s，共30个循环；72℃5min。将扩增得到的GabT基因序列经1％琼脂糖凝胶电泳后回收相应片段。将实施例1构建的重组质粒pRSFDuet-CadA作为表达载体用Takara公司的Nde I和Kpn I酶切，酶切反应体系为：10×buffer 1μL，Nde I 1μL，Kpn I 1μL，pRSFDuet-CadA载体7μL。酶切体系于37℃条件下反应1小时。将酶切后线性化载体末端15-20bp序列作为同源臂，并将其分别添加到GabT基因特异性上下游引物序列的5'端。重组反应体系为：使用Vazyme公司的5X CE II buffer 4μL，Exnase II 2μL，GabT基因片段10μL，酶切载体2μL。连接于37℃下反应30min得到重组产物。将重组产物转化至大肠杆菌Trans1-T1中。PCR筛选阳性菌株Trans1-T1-pRSFDuet-CadA-GabT并进行DNA测序，验证重组质粒构建正确。将阳性菌株接种至含有终浓度50mg/L KanR的5mL LB液体培养基，LB液体培养基组成为蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠5g/L，于37℃、200rpm条件下振荡培养过夜。12小时后按照天根质粒提试剂盒操作说明提取重组质粒pRSFDuet-CadA-GabT(图1b)。
实施例3pTrc99a-YahK重组质粒的构建
以Escherichia coli MG1655醛酮还原酶YahK的细菌基因组为模板，通过常规PCR扩增复制醛酮还原酶的核苷酸编码序列，其核苷酸序列如SEQ ID No.7所示。
其中，所用上游引物带有同源臂，序列为：SEQ ID No.8
AGGAAACAGACCATGATGAAGATCAAAGCTGTTGGTGCA。
下游引物带有同源臂，序列为：SEQ ID No.9
CTAGAGGATCCCCGGTCAGTCTGTTAGTGTGCGATTATCGATAACAAAAC。
反应条件为：95℃2min，95℃20s，55℃1min，72℃30s，共30个循环；72℃5min。将扩增得到的YahK基因序列经1％琼脂糖凝胶电泳后回收相应片段。将表达载体pTrc99a用Takara公司的Nco I和Kpn I酶切，酶切反应体系为：10×buffer 1μL，Nco I1μL，Kpn I 1μL，pTrc99a载体7μL。酶切体系于37℃条件下反应1小时。将酶切后线性化载体末端15-20bp序列作为同源臂，并将其分别添加到YahK基因特异性上下游引物序列的5'端。重组反应体系为：使用Vazyme公司的5X CE II buffer 4μL，Exnase II 2μL，YahK基因片段10μL，载体2μL。连接于37℃下反应30min得到重组产物。将重组产物转化至大肠杆菌Trans1-T1中。PCR筛选阳性菌株Trans1-T1-pTrc99a-YahK并进行DNA测序，验证重组质粒构建正确。将阳性菌株接种至含有终浓度50mg/L Amp的5mL LB液体培养基，LB液体培养基组成为蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠5g/L，于37℃、200rpm条件下振荡培养过夜。12小时后按照天根质粒提试剂盒操作说明提取重组质粒pTrc99a-YahK(图1c)。
实施例4BL21(DE3)-pRSFDuet-CadA-GabT-pTrc99a-YahK重组菌株构建
将实施例2构建的重组质粒pRSFDuet-CadA-GabT和实施例3构建的重组质粒pTrc99a-YahK共转至大肠杆菌BL21(DE3)中。转化体系为：pRSFDuet-CadA-GabT重组质粒1μL，pTrc99a-YahK重组质粒1μL，BL21(DE3)感受态20μL。混合均匀后置于冰上冰浴20min，再在42℃水浴锅中热激45s，再次置于冰上2min，加入1mL LB，于37℃、200rpm条件下振荡培养45min-1h后，4500rpm浓缩至200μL，再涂布于含有终浓度50mg/L KanR和Amp的LB固体培养基中，放在37℃培养箱内过夜培养，筛选阳性转化子，挑选阳性转化子进行菌落PCR验证，最终得到重组菌株BL21(DE3)-pRSFDuet-CadA-GabT-pTrc99a-YahK。
实施例5重组菌株BL21(DE3)-pRSFDuet-CadA-GabT-pTrc99a-YahK的诱导表达
将实施例4构建的重组菌株BL21(DE3)-pRSFDuet-CadA-GabT-pTrc99a-YahK按照10％v/v的接种量接种至含有终浓度50mg/L KanR和Amp的5mL LB液体培养基，37℃、200rpm条件下振荡培养至OD600≈0.6。再将培养后的菌液均按3:100的体积比分别接种于100mL新鲜的LB液体培养基，37℃、200rpm条件下振荡培养至OD600≈0.5～0.8，加入IPTG至终浓度0.5mM，在18℃、200rpm条件下振荡培养18h。6000rpm离心10min，收集菌体。
实施例6全细胞催化合成1,5-PDO
5mL反应体系中：在2.5mL 50mM PBS缓冲液加入浓度为50mM赖氨酸、50mM葡萄糖、50mMα-酮戊二酸、10mM MgCl2，搅拌均匀调至pH 8.0，加入2.5mL PBS缓冲液(pH 7.0-8.0)重悬的菌体细胞液，使得细胞终浓度为OD600＝40。30℃条件下反应8-12h，完成全细胞催化反应合成1,5-PDO。图2为催化制备1,5-戊二醇的合成路径。经高效液相色谱检测，1,5-PDO产量为1.2mM，即0.09g/L(图3a、图3b)。
但1,5-PDO产量偏低，因此在下述实施例中通过胞内组装的方式来进一步提高1,5-PDO的产量。
实施例7pRSFDuet-CadA-SP-GabT重组质粒的构建
以具有SP蛋白的噬菌体P22基因组为模板，通过常规PCR扩增复制SP蛋白的核苷酸编码序列，其核苷酸序列如SEQ ID No.10所示
其中，所用上游引物带有同源臂，序列为：SEQ ID No.11
ACAGACCATGGAATTATGTGCCGTTCGAACGCG。
下游引物带有同源臂，序列为：SEQ ID No.12
TGATTCGCCACCTCCGGACCCGCCTCCACCTCTAATTCCTTTCAGTTTTGCTTT CAG。
反应条件为：95℃2min，95℃20s，55℃30s，72℃30s，共30个循环；72℃5min。将扩增得到的SP蛋白的基因序列经1％琼脂糖凝胶电泳后回收相应SP基因片段。将所回收的SP基因片段与实施例2中得到的GabT基因片段进行overlab PCR。
其中，所用上游引物带有同源臂，序列为：SEQ ID No.11
ACAGACCATGGAATTATGTGCCGTTCGAACGCG。
下游引物带有同源臂，序列为：SEQ ID No.13
CTAGAGGATCCCCGGCTACTGCTTCGCCTCATCAAAACAC。
反应条件为：95℃2min，95℃20s，55℃1min，72℃30s，共30个循环；72℃5min。将扩增得到的SP-GabT基因序列经1％琼脂糖凝胶电泳后回收相应SP-GabT基因片段。将实施例1构建的表达载体pRSFDuet-CadA用Takara公司的Nde I和Kpn I酶切，酶切反应体系为：10×buffer 1μL，Nde I 1μL，Kpn I 1μL，pRSFDuet-CadA载体7μL。酶切体系于37℃条件下反应1小时。将酶切后线性化载体末端15-20bp序列作为同源臂，并将其分别添加到SP-GabT基因特异性上下游引物序列的5'端。重组反应体系为：使用Vazyme公司的5X CE II buffer 4μL，Exnase II 2μL，SP-GabT基因片段10μL，酶切载体2μL。连接于37℃下反应30min得到重组产物。将重组产物转化至大肠杆菌Trans1-T1中。PCR筛选阳性菌株Trans1-T1-pRSFDuet-CadA-SP-GabT并进行DNA测序，验证重组质粒构建正确。将阳性菌株接种至含有终浓度为50mg/L KanR的5mL LB液体培养基，LB液体培养基组成为蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠5g/L，于37℃、200rpm条件下振荡培养过夜。12小时后按照天根质粒提试剂盒操作说明提取重组质粒pRSFDuet-CadA-SP-GabT。
实施例8pTrc99a-CP-YahK重组质粒的构建
以具有CP蛋白的噬菌体P22基因组为模板，通过常规PCR扩增复制CP蛋白的核苷酸编码序列，其核苷酸序列如SEQ ID No.14所示。
其中，所用上游引物带有同源臂，序列为：SEQ ID No.15
AGGAAACAGACCATGATGGCGTTGAACGAGGGC。
下游引物带有同源臂，序列为：SEQ ID No.16
TGATTCGCCACCTCCGGACCCGCCTCCACCTGCAGTCTGACCCGGTAAGC。
反应条件为：95℃2min，95℃20s，55℃1min，72℃30s，共30个循环；72℃5min。将扩增得到的CP蛋白的基因序列经1％琼脂糖凝胶电泳后回收相应CP基因片段。将所回收的CP基因片段与实施例3中得到的YahK基因片段进行overlab PCR。
其中，所用上游引物带有同源臂，序列为：SEQ ID No.15
AGGAAACAGACCATGATGGCGTTGAACGAGGGC。
下游引物带有同源臂，序列为：SEQ ID No.17
CTAGAGGATCCCCGGTCAGTCTGTTAGTGTGCGATTATCGATAACAAAAC。
反应条件为：95℃2min，95℃20s，55℃3min，72℃30s，共30个循环；72℃5min。将扩增得到的CP-YahK基因序列经1％琼脂糖凝胶电泳后回收相应CP-YahK基因片段。将表达载体pTrc99a用Takara公司的Nde I和Kpn I酶切，酶切反应体系为：10×buffer1μL，Nde I 1μL，Kpn I 1μL，pTrc99a载体7μL。酶切体系于37℃条件下反应1小时。将酶切后线性化载体末端15-20bp序列作为同源臂，并将其分别添加到CP-YahK基因特异性上下游引物序列的5'端。重组反应体系为：使用Vazyme公司的5X CE II buffer4μL，Exnase II 2μL，CP-YahK基因片段10μL，酶切载体2μL。连接于37℃下反应30min得到重组产物。将重组产物转化至大肠杆菌Trans1-T1中。PCR筛选阳性菌株Trans1-T1-pTrc99a-CP-YahK并进行DNA测序，验证重组质粒构建正确。将阳性菌株接种至含有终浓度为50mg/L Amp的5mL LB液体培养基，LB液体培养基组成为蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠5g/L，于37℃、200rpm条件下振荡培养过夜。12小时后按照天根质粒提试剂盒操作说明提取重组质粒pTrc99a-CP-YahK。
实施例9胞内组装重组菌株BL21(DE3)-pRSFDuet-CadA-SP-GabT-pTrc99a-CP-YahK的构建
将实施例7构建的重组质粒pRSFDuet-CadA-SP-GabT和实施例8构建的重组质粒pTrc99a-CP-YahK共转至大肠杆菌BL21(DE3)中，转化、构建方法同实施例4，最终获得胞内组装重组菌株BL21(DE3)-pRSFDuet-CadA-SP-GabT-pTrc99a-CP-YahK。
实施例10胞内组装后全细胞催化合成1,5-PDO
将实施例9构建的胞内组装重组菌株
BL21(DE3)-pRSFDuet-CadA-SP-GabT-pTrc99a-CP-YahK进行诱导表达，获得蛋白菌体，方法同实施例5。
胞内组装后全细胞催化合成1,5-PDO方法同实施例6，其中α-酮戊二酸浓度提高至100mM，30℃条件下反应8-12h，完成全细胞催化反应合成1,5-PDO，经高效液相色谱检测，1,5-PDO产量达到3.5mM，即0.36g/L，远高于实施例6的1,5-PDO产量(图4)。
本发明提供了一种催化制备1,5-戊二醇的基因工程菌及其应用的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。

Claims (11)

1.一种催化制备1,5-戊二醇的基因工程菌，其特征在于，所述的基因工程菌是以大肠杆菌为宿主，过表达赖氨酸脱羧酶CadA、4-氨基丁酸转氨酶GabT和醛酮还原酶YahK得到的。
2.一种催化制备1,5-戊二醇的基因工程菌，其特征在于，所述的基因工程菌是以大肠杆菌为宿主，过表达权利要求1所述的赖氨酸脱羧酶CadA、4-氨基丁酸转氨酶GabT和醛酮还原酶YahK的同时，表达SP蛋白和CP蛋白得到的。
3.根据权利要求1或2任意一项所述的基因工程菌，其特征在于，所述的大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)。
4.根据权利要求1或2任意一项所述的基因工程菌，其特征在于，所述的赖氨酸脱羧酶CadA，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述的4-氨基丁酸转氨酶GabT，其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；所述的醛酮还原酶YahK，其核苷酸序列如SEQ ID No.7所示。
5.根据权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，所述的SP蛋白，其核苷酸序列如SEQID No.10所示；所述的CP蛋白，其核苷酸序列如SEQ ID No.14所示。
6.权利要求1所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)构建重组质粒：将赖氨酸脱羧酶基因CadA导入表达载体pRSFDuet中，获得重组质粒pRSFDuet-CadA，再将4-氨基丁酸转氨酶基因GabT导入重组质粒pRSFDuet-CadA中，获得重组质粒pRSFDuet-CadA-GabT；将醛酮还原酶基因YahK导入表达载体pTrc99a中，获得重组质粒pTrc99a-YahK；
(2)将步骤(1)获得的重组质粒pRSFDuet-CadA-GabT和pTrc99a-YahK共转化入宿主大肠杆菌中，得到重组大肠杆菌，即为所述的基因工程菌。
7.权利要求2所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(a)构建重组质粒：将SP蛋白基因SP和4-氨基丁酸转氨酶基因GabT扩增得到SP-GabT基因片段，以上述权利要求6步骤(1)获得的重组质粒pRSFDuet-CadA为表达载体，将SP-GabT基因片段导入其中，获得重组质粒pRSFDuet-CadA-SP-GabT；将CP蛋白基因CP和醛酮还原酶基因YahK扩增得到CP-YahK基因片段，以pTrc99a为表达载体，将CP-YahK基因片段导入其中，获得重组质粒pTrc99a-CP-YahK；
(b)将步骤(a)获得的重组质粒pRSFDuet-CadA-SP-GabT和pTrc99a-CP-YahK共转化入宿主大肠杆菌中，得到重组大肠杆菌，即为所述的基因工程菌。
8.权利要求1或2任意一项所述的基因工程菌在生产制备1,5-戊二醇中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，将所述的基因工程菌诱导表达纯化后的菌体再重悬得到的细胞液作为催化剂，全细胞催化赖氨酸和/或赖氨酸盐生物转化为1,5-戊二醇。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的诱导表达纯化，其过程中加入了终浓度为0.025-1mM的IPTG，优选终浓度为0.5mM的IPTG；所述的重悬，其缓冲液为PBS缓冲液，pH7.0-8.0。
11.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的全细胞催化，其催化反应体系为5-50mM赖氨酸、5-25mM葡萄糖、10-100mMα-酮戊二酸、5-50mM Mg2+和OD600为40的细胞液；其反应条件为pH 7.0-8.0，30℃反应8-12h。
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