CN108060203B

CN108060203B - 一种全细胞混合转化甘油生产1,3-丙二醇的方法

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Publication number: CN108060203B
Application number: CN201810005295.XA
Authority: CN
Inventors: 齐向辉; 员君华; 杨苗苗; 苏本; 胡克; 田纳; 张国艳; 石坡
Original assignee: Jiangsu University
Current assignee: Zhenjiang Baitai Biotechnology Co ltd
Priority date: 2018-01-03
Filing date: 2018-01-03
Publication date: 2020-03-31
Anticipated expiration: 2038-01-03
Also published as: CN108060203A

Abstract

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种全细胞混合转化甘油生产1,3‑丙二醇的方法。本发明利用全细胞混合转化甘油生产1,3‑丙二醇的方法具体如下：首先制备酪酸梭菌XYB11菌体和E.coli‑Cb‑dhaT菌体，再将上述两种菌体按一定比例混合得到混合全细胞，最后将混合全细胞加入到含有甘油的转化液中，一定条件下振荡转化得到1,3‑丙二醇。本发明利用混合全细胞转化甘油生产1,3‑丙二醇，减少了代谢途径中3‑HPA的累积，提高了甘油的利用率，增加1,3‑PD的产量；其中，E.coli‑Cb‑dhaT中1,3‑丙二醇氧化还原酶的酶活可达98 U/mg；甘油的转化率达84.9%。本发明全细胞制备方法简单，只需重悬洗涤菌体，避免了繁琐的酶分离及纯化过程，酶固定在胞内，反应条件温和，降低了生产成本，具有广阔的工业应用前景。

Description

一种全细胞混合转化甘油生产1,3-丙二醇的方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种全细胞混合转化甘油生产1,3-丙二醇的方法，特别涉及一种1,3-丙二醇基因工程菌与酪酸梭菌XYB11的全细胞混合转化甘油生成1,3-丙二醇的方法。

背景技术

1,3-丙二醇(1,3-PD)作为一种重要的化工原料，可以用于合成聚醚、聚酯和聚亚安酯等缩聚物，在食品、医药、化工领域有重要的应用。1,3-PD因其广阔的应用领域而显示其巨大的商业价值。目前1,3-PD的生产方法有化学合成法和微生物发酵法。因化学合成法生产成本高，需在高温、高压、以及昂贵的催化剂下进行，分离纯化困难等缺点，所以绿色环保的微生物发酵法越来越受到人们的关注。利用可再生资源生物柴油的主要副产物粗甘油来生产高附加值的产品1,3-PD是目前研究的热点。

微生物代谢粗甘油等廉价的可再生资源生产1,3-PD是一个耦合的氧化还原过程。在还原途径中，甘油首先经依赖辅酶B₁₂的甘油脱水酶（GDHt）的催化下生成中间产物3-羟基丙醛（3-HPA），然后在NADH依赖的1,3-PD氧化还原酶（PDOR）的作用下将3-HPA还原为目标产物1,3-PD。目前，制约微生物发酵法发展的主要几个因素有：生产菌种对底物甘油的低耐受性，甘油到1,3-PD的低转化率，代谢途径中有毒的中间产物3-HPA的累积以及甘油脱水酶的辅酶B₁₂依赖性。而增加关键酶PDOR的活力从而减少代谢途径中3-HPA的累积是提高1,3-PD产量的一种途径。

利用构建工程菌通过生物转化法有希望实现1,3-PD大规模工业化生产。2009年有研究人员克隆了来源于Klebsiella pneumoniae（K. pneumoniae）编码PDOR的基因dhaT并连接至质粒pUC18K，成功构建K. pneumoniae/pUC18 K-dhaT工程菌，在K. pneumoniae中实现PDOR的过表达，提高了PDOR的活力，其最高酶的比活力达到91U/mg，在3.7L的摇瓶中进行批发酵，其结果显示，过表达PDOR对1,3-PD的浓度并没有影响，甘油转化为1,3-丙二醇的转化率从50.6提高到64.0%，接着研究人员利用工程菌K. pneumoniae/pUC18 K-dhaT，通过全细胞的方法使1,3-PD的产量提高了20.4%，并且转化率从50.8%提高到59.8%。2011年有专利报道通过构建基因工程菌在发酵过程过表达苹果酸酶促进三羧酸循环，从而产生更多的NADH与ATP提高PDOR活性，最终提高了甘油的转化率与1,3-PD的产量。但是，以上研究1,3-PD的转化率均比较低，影响到底物到1,3-PD的产量，也不适合于1,3-PD的大规模工业化生产。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷，如：化学合成法生产成本高、分离纯化困难，生产菌种对底物甘油的低耐受性，甘油到1,3-PD的转化率低等问题，本发明提供一种全细胞混合转化甘油生产1,3-PD的方法，利用酪酸梭菌XYB11和dhaT基因工程菌的全细胞进行混合转化甘油生产1,3-PD，减少代谢途径中3-HPA的累积，增加1,3-PD的产量。

本发明提供一种全细胞混合转化甘油生产1,3-PD的方法，本发明按以下步骤进行：

（1）将酪酸梭菌XYB11于37℃静置厌氧培养，8000rpm，4℃离心10min，将收集的酪酸梭菌XYB11菌泥，用pH 7.4的磷酸钾缓冲液洗涤，得到酪酸梭菌XYB11菌体待用；

（2）将基因工程菌E.coli-Cb-dhaT在LB-Kan培养基中37℃振荡培养至菌体光密度值为0.6时，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度0.1mmol/L进行诱导表达；将上述得到的基因工程菌E.coli-Cb-dhaT菌液4℃离心10min，收集E.coli-Cb-dhaT菌泥，用pH7.4的磷酸钾缓冲液洗涤，得到E.coli-Cb-dhaT菌体待用；

（3）将步骤（1）和（2）分别得到的酪酸梭菌XYB11菌体和E.coli-Cb-dhaT菌体按质量比1-2:1-2混合，得到混合全细胞；将混合全细胞加入细胞转化液中，得到混合转化液；细胞转化液组成为：甘油20-80g/L，100mM pH 7.4的磷酸钾缓冲液。

（4）将步骤（3）的混合液置于30-37℃，100-160rpm振荡转化16-48h，得到含有1,3-丙二醇的溶液。用高效液相色谱检测转化液成分计算甘油的转化率。

上述生产过程中，所述全细胞混合为酪酸梭菌XYB11和基因工程菌E.coli-Cb- dhaT的混合；所述基因工程菌E.coli-Cb-dhaT中含有1,3-丙二醇氧化还原酶。

本发明制备的酪酸梭菌XYB11和基因工程菌E.coli-Cb-dhaT混合全细胞，甘油的转化率达84.9%；其中基因工程菌E.coli-Cb-dhaT的1,3-丙二醇氧化还原酶酶活可达98 U/mg。

与现有技术相比较，本发明的有益效果体现如下：

（1）本发明利用酪酸梭菌XYB11将甘油氧化还原为1,3-PD，该菌同时具有不依赖辅酶B₁₂的GDHt。另外，利用基因工程技术克隆来自酪酸梭菌XYB11中编码PDOR的dhaT基因，构建dhaT的基因工程菌，利用酪酸梭菌XYB11和dhaT基因工程菌的全细胞进行混合转化甘油生产1,3-PD，提高甘油的利用率，减少代谢途径中3-HPA的累积，增加1,3-PD的产量。

（2）本发明所有的酪酸梭菌对底物甘油有较高的耐受性，达到80g/L，采用全细胞转化甘油的优势主要在于高效，简单的转化方式。同时本发明提供一种具有较高1,3-丙二醇氧化还原酶的基因工程菌E.coli-Cb-dhaT，该工程菌中涉及的编码1,3-丙二醇氧化还原酶的基因来源于酪酸梭菌XYB11，测定其最高酶活可达98 U/mg。

（3）本发明全细胞制备方法工艺简单成本低，只需简单重悬洗涤菌体，避免了繁琐的酶的分离及纯化过程，使酶固定在胞内，不需要添加额外的辅酶，具有反应条件温和，酶活性高等优点，降低了生产工艺的成本，大大提高了转化率。

（4）重组基因工程菌培养条件简单，所需营养低，易于培养。与化学合成法相比，不需要高温高压等严苛的环境，只需将底物直接投入到全细胞反应液中即可进行反应，大大减少了副产物的产生，利用构建的工程菌E.coli-Cb-dhaT和酪酸梭菌XYB11的全细胞混合转化20g/L的甘油生产1,3-PD，具有很高的转化率可达84.9 %。

具体实施方式

本发明的酪酸梭菌XYB11（Yan-bo XUE, et al., Isolation andIdentification of a New Clostridium butyricum XYB11 Strain Producing 1, 3-Propandiol from Soil. Advances in Biological Sciences Research, 2017,4:178-182）由本实验室筛选分离鉴定并保藏。本发明所述dhaT基因与GenBank中酪酸梭菌DSM2478的dhaT序列的相似性为100%，其GenBank接收号为DQ901407。本发明通过常规基因工程技术将1,3-丙二醇氧化还原酶编码基因导入大肠杆菌得到含有dhaT基因的大肠杆菌基因工程菌。本发明的基因工程菌具有较高的1,3-丙二醇氧化还原酶活力，还原活力可达98 U/mg，其还原活力相较原始菌株提高了19倍。包括以下步骤：

1、培养酪酸梭菌XYB11，提取菌株的总DNA，通过PCR扩增出目的片段。

2、目的片段和表达载体通过酶切用无缝克隆试剂盒连接构建重组质粒，将重组质粒导入宿主菌E.coLi BL21。

3、提取大肠杆菌质粒，通过PCR和SDS-PAGE进行表达验证，证明重组菌构建成功。

4、测定基因工程菌的1,3-丙二醇氧化还原酶酶活力。

5、培养E.coli-Cb-dhaT和酪酸梭菌XYB11重悬洗涤菌体，制备混合全细胞。

6、将混合全细胞加入反应液中，转化制得1,3-PD；其中反应液组成如下：甘油 20-80g/L，100mM pH 7.4的磷酸钾缓冲液。

7、测定转化率。

实施例1：

具有高1,3-丙二醇氧化还原酶活力的基因工程菌构建

（1）根据1,3-丙二醇氧化还原酶基因序列和表达载体pET-28a多克隆位点的特征，利用生物信息学软件设计合成引物：primer1：5- ACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGAATTTTAAATTAAAAGGAGAA-3，primer2：5’-GGTGGTGGTGGTGCTCGAGT TTGAATTCTTTAAATATTAT-3’，primer1和primer2下划线部分与经过NheI和HindIII线性化后的pET-28a序列互补。

（2）以酪酸梭菌基因组DNA为模板，PCR扩增目的基因。

（3）PCR反应参数：预变性，95℃ 5min；变性， 94℃ 2min；退火，55℃ 30sec；延伸：72℃ 90sec；循环：30个；终止延伸：72℃ 10min。

（4）所得的PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测，得到大小约为1.2Kb的电泳条带，用普通DNA产物纯化试剂盒或琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒对扩增片段进行纯化。

（5）载体pET-28a用NheⅠ和HindIIⅠ双酶切，凝胶回收酶切产物，严格按照无缝克隆试剂盒说明书进行重组反应，获得重组质粒pET-dhaT，随后将该重组质粒转化至E. coliBL21感受态细胞。

（6）重组质粒通过PCR及测序验证。结果表明，重组菌构建成功，命名为E. coli-Cb-dhaT。

（7）基因工程菌接种于3 mL LB-Kan培养基中，37 ℃振荡培养过夜，OD为3.0，次日以1 %的接种量将种子液转接至新鲜LB-Kan培养基中，37 ℃培养至菌体光密度值（A600）约为0.6时，加入IPTG至终浓度0.1 mmol/L进行诱导表达10 h左右。采用SDS-PAGE观察目的蛋白的表达。结果表明：外源蛋白获得高效表达。LB-Kan培养基：胰化蛋白胨 10g/L，酵母提取物 5g/L，NaCl 10g/L，kan 50μg/L(终浓度)。

（8）基因工程菌接种于3 mL LB-kan培养基中，37 ℃振荡培养过夜，次日以1 %的接种量将种子液转接至新鲜LB-Kan培养基中，37 ℃培养至菌体光密度值（A600）约为0.6时，加入IPTG至终浓度0.1 mmol/L进行诱导表达10 h左右。取适量菌液8000 rpm，4℃离心10 min，收集菌泥，用0.1 mol/L pH 7.4的磷酸钾缓冲液洗涤两次，离心后用适量的磷酸钾缓冲液重悬菌体，冰浴中超声破碎。10000 rpm，4 ℃离心10 min，上清即为粗酶液。

（9）利用粗酶液测定1,3-丙二醇氧化还原酶的酶活力，结果表明：重组菌具有供体菌酪酸梭菌的1,3-丙二醇氧化还原酶活力，还原反应的比活为98 U/mg，而且重组菌的1,3-丙二醇氧化还原酶活力约为酪酸梭菌的19倍。获得具有1,3-丙二醇氧化还原酶高酶活的基因工程菌E.coli-Cb-dhaT。

其中PDOR还原活力测定方法：1.0mL的总体积中按终浓度混合以下成分：27mmol/L丙醛，0.37mmol/L NADH，35mmol/L Fe/(NH₄)₂(SO₄)₂，100mmol/L碳酸钾缓冲液(pH9.0)，适量酶液，立即测定340nm的OD变化。在最适温度及最适pH条件下，按上述反应，每分钟生成1μmoL 1,3-PD所需的酶量定义为一个酶活单位。

实施例2：

全细胞混合转化制备1,3-丙二醇

（1）取保存于-80℃酪酸梭菌XYB11于5mL种子培养基，37℃静置厌氧培养12h，得到酪酸梭菌XYB11种子液。种子培养基包括：酵母浸膏3g/L，牛肉浸膏10g/L，胰蛋白胨10g/L，葡萄糖5g/L，可溶性淀粉1g/L，氯化钠5g/L，三水合乙酸钠3g/L，半胱氨酸盐酸盐0.15g/L。

（2）将步骤（1）得到的酪酸梭菌XYB11种子液，以10 %的接种量接种到扩大培养基，37℃静置厌氧培养12h，得到酪酸梭菌XYB11菌液。扩大培养基包括：酵母浸膏3g/L，牛肉浸膏10g/L，胰蛋白胨10g/L，葡萄糖5g/L，可溶性淀粉1g/L，氯化钠5g/L，三水合乙酸钠3g/L，半胱氨酸盐酸盐0.15g/L。

（3）将步骤（2）中得到的酪酸梭菌XYB11菌液8000 rpm， 4℃离心10min，收集酪酸梭菌XYB11菌泥，用0.1 moL/L pH 7.4的磷酸钾缓冲液洗涤两次，酪酸梭菌XYB11菌体待用。

（4）基因工程菌E.coli-Cb-dhaT接种于LB-Kan培养基中，37 ℃振荡培养过夜，次日以2%的接种量将种子液转接至新鲜LB-Kan培养基中，37℃培养至菌体光密度值约为0.6时，加入IPTG至终浓度0.1 mmol/L进行诱导表达10 h左右。取一定体积基因工程菌E.coli-Cb-dhaT菌液8000 rpm，4℃离心10 min，收集E.coli-Cb-dhaT菌泥，用0.1 moL/L pH 7.4的磷酸钾缓冲液洗涤两次，E.coli-Cb-dhaT菌体待用；其中，LB-Kan培养基：胰化蛋白胨 10g/L，酵母提取物 5g/L，NaCL 10g/L，Kan 50μg/L(终浓度)。

（5）将步骤（3）和（4）分别离心得到的酪酸梭菌XYB11菌体和E.coli-Cb-dhaT菌体，按质量比1:1混合，得到混合全细胞，用适量的细胞转化液重悬混合全细胞菌体，得到混合转化液；其中细胞转化液成分为：甘油65 g/L，100mM pH 7.4的磷酸钾缓冲液。

（6）将混合转化液置于转化温度为37℃，160 rpm条件下，振荡转化24 h，间隔6h取样，用高效液相色谱检测转化液成分，测得甘油转化为1,3-丙二醇的转化率为82.8 %。

实施例3：

将实施例2步骤（5）中细胞转化液成分中甘油的浓度改为20 g/L或80 g/L，其它转化制备1,3-丙二醇的条件及转化率测定的方法与实施例2完全相同。

细胞转化液成分中甘油的浓度为20 g/L时，用高效液相色谱检测转化液成分，测得甘油转化为1,3-丙二醇的转化率为84.9%。

细胞转化液成分中甘油的浓度为80 g/L，用高效液相色谱检测转化液成分，测得甘油转化为1,3-丙二醇的转化率为77.1%。

实施例4：

将实施例2步骤（5）中酪酸梭菌XYB11菌体和E.coli-Cb-dhaT菌体的混合质量比改为2:1或1:2，其它转化制备1,3-丙二醇的条件及转化率测定的方法与实施例2完全相同。

酪酸梭菌XYB11菌体和E.coli-Cb-dhaT菌体的混合质量比为2:1时，用高效液相色谱检测转化液成分，测得甘油转化为1,3-丙二醇的转化率为79.7%。

酪酸梭菌XYB11菌体和E.coli-Cb-dhaT菌体的混合质量比为1:2时，用高效液相色谱检测转化液成分，测得甘油转化为1,3-丙二醇的转化率为80.4%。

实施例5：

将实施例2步骤（6）中转化温度改为30℃或35℃，转速改为100rpm，其它转化制备1,3-丙二醇的条件及转化率测定的方法与实施例2完全相同。

转化温度为30℃时，用高效液相色谱检测转化液成分，测得甘油转化为1,3-丙二醇的转化率为75.8%。

转化温度为35℃时，用高效液相色谱检测转化液成分，测得甘油转化为1,3-丙二醇的转化率为78.8%。

实施例6：

将实施例2步骤（6）中振荡转化时间改为16h或48h，转速改为140rpm，其它转化制备1,3-丙二醇的条件及转化率测定的方法与实施例2完全相同。

振荡转化时间为16h时，用高效液相色谱检测转化液成分，测得甘油转化为1,3-丙二醇的转化率为78.6.%。

振荡转化时间为48h时，用高效液相色谱检测转化液成分，测得甘油转化为1,3-丙二醇的转化率为82.3%。

实施例7：

构建来源于Klebsiella pneumoniae 的PDOR重组工程菌并利用批发酵生产1,3-PD的方法，其步骤如下：

1、将克雷伯肺炎杆菌的PDOR的编码基因dhaT克隆到质粒pUC18K上。

2、再将质粒转化至K. pneumoniae菌中构建K. pneumoniae/pUC18 K-dhaT 重组基因工程菌过表达PDOR。

3、制备粗酶液测定酶活，其PDOR的最高比活力为47.3U/mg。

4、在3.7L的摇瓶中进行批发酵，其结果显示，过表达PDOR对1,3-PD的浓度并没有影响，甘油转化为1,3-丙二醇的转化率为52.7%。

实施例8：

构建来源于Klebsiella pneumoniae 的PDOR重组工程菌并利用全细胞转化法生产1,3-PD的方法，其步骤如下：

1、将克雷伯肺炎杆菌的PDOR编码基因dhaT克隆到质粒pUC18K上。

3、制备粗酶液测定酶活，其PDOR的最高比活力为47.3 U/mg

4、在全细胞系统中利用底物甘油转化生产1,3-PD，经过12小时的转化，甘油转化为1,3-丙二醇的转化率为65.3%。

本发明的实施例表明，本发明利用构建的工程菌E.coli-Cb-dhaT和酪酸梭菌XYB11的全细胞混合转化20g/L的甘油生产1,3-PD，转化率可达84.9%；基因工程菌E.coli-Cb-dhaT的1,3-丙二醇氧化还原酶酶活达98 U/mg。

此外，本发明构建的混合全细胞转化65g/L的甘油生产1,3-PD，转化率可达82.8%，与其他浓度的综合比较下，65g/L甘油浓度时，同时具有较高的甘油转化率和1,3-PD生产率，适合1,3-PD的大规模工业化生产。

Claims

1.一种全细胞混合转化甘油生产1,3-丙二醇的方法，其特征在于，所述全细胞混合为酪酸梭菌XYB11和基因工程菌E.coli-Cb-dhaT的混合；所述基因工程菌E.coli-Cb-dhaT中含有1,3-丙二醇氧化还原酶；所述基因工程菌E.coli-Cb-dhaT中的dhaT基因为酪酸梭菌XYB11中的1，3-PD氧化还原酶基因；所述方法包括以下步骤：

（1）制备酪酸梭菌XYB11菌体待用；

（2）制备基因工程菌E.coli-Cb-dhaT菌体待用；

（3）将步骤（1）和（2）分别得到的酪酸梭菌XYB11菌体和E.coli-Cb-dhaT菌体按一定质量比，得到混合全细胞；将混合全细胞加入细胞转化液中，得到混合转化液；细胞转化液组成为：甘油65g/L，100mM pH7.4的磷酸钾缓冲液；酪酸梭菌XYB11菌体和E.coli-Cb-dhaT菌体混合的质量比为1-2:1-2；

（4）将步骤（3）中的混合转化液置于30-37℃，100-160rpm条件下振荡转化，得到含有1,3-丙二醇的溶液。

2.根据权利要求1所述的全细胞混合转化甘油生产1,3-丙二醇的方法，其特征在于，步骤（1）中，制备酪酸梭菌XYB11菌体的方法为：将酪酸梭菌XYB11于37℃静置厌氧培养，8000rpm，4℃离心10min，将收集的酪酸梭菌XYB11菌泥，用pH7.4的磷酸钾缓冲液洗涤，得到酪酸梭菌XYB11菌体。

3.根据权利要求1所述的全细胞混合转化甘油生产1,3-丙二醇的方法，其特征在于，步骤（2）中，制备基因工程菌E.coli-Cb-dhaT菌体的方法为：将基因工程菌E.coli-Cb-dhaT在LB-Kan培养基中37℃振荡培养至菌体光密度值为0.6时，加入IPTG至终浓度0.1mmol/L进行诱导表达；将基因工程菌E.coli-Cb-dhaT菌液4℃离心10min，收集E.coli-Cb-dhaT菌泥，用pH7.4的磷酸钾缓冲液洗涤，得到E.coli-Cb-dhaT菌体。

4.根据权利要求1所述的全细胞混合转化甘油生产1,3-丙二醇的方法，其特征在于，步骤（4）中，转化的时间为16-48h。

5.根据权利要求1所述的全细胞混合转化甘油生产1,3-丙二醇的方法，其特征在于，步骤（4）中，转化温度为37℃。

6.根据权利要求1所述的全细胞混合转化甘油生产1,3-丙二醇的方法，其特征在于，步骤（3）中，酪酸梭菌XYB11菌体和E.coli-Cb-dhaT菌体混合的质量比为1:1。

7.根据权利要求1-6任意一项所述的全细胞混合转化甘油生产1,3-丙二醇的方法，其特征在于，基因工程菌E.coli-Cb-dhaT的1,3-丙二醇氧化还原酶酶活达98U/mg；甘油的转化率为84.9%。