CN118006590A - 一种Microbacterium dextranolyticumβ-葡萄糖苷酶的突变体及方法和应用 - Google Patents

一种Microbacterium dextranolyticumβ-葡萄糖苷酶的突变体及方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于酶工程技术领域，公开了一种Microbacterium dextranolyticumβ‑葡萄糖苷酶突变体，是通过将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的β‑葡萄糖苷酶的第329位由谷氨酸突变为甘氨酸而得到的；或者，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的β‑葡萄糖苷酶的第329位由谷氨酸突变为天冬酰胺而得到的；或者，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的β‑葡萄糖苷酶的第329位由谷氨酸突变为赖氨酸，同时将第72位由精氨酸突变为天冬酰胺而得到的。本发明解决目前高值天然产物酶法转化生产中存在的技术问题，通过定点突变技术获得一种酶活力提升的β‑葡萄糖苷酶突变体。

Description

一种Microbacterium dextranolyticumβ-葡萄糖苷酶的突变 体及方法和应用
技术领域
本发明属于酶工程技术领域，尤其是一种Microbacterium dextranolyticumβ-葡萄糖苷酶的突变体及方法和应用。
背景技术
Microbacterium dextranolyticumβ-葡萄糖苷酶是来自GH3家族的水解酶，催化糖苷键的水解断裂，其高效水解糖基的能力，能够解决工业水解糖基过程中带来的环境污染及高耗能的问题，其保留型水解机制也能专一、特异地水解特定类型的糖苷，并保证原有苷元的分子结构不被改变。因此，在天然产物转化合成的过程中，β-葡萄糖苷酶具有极大的优势。
许多天然产物因其具有良好的生理活性而被人们广泛用于药品、保健食品的添加之中。天然产物结构之中含有许多葡萄糖单元，如人参皂苷Rb1、虎杖苷、黄芪甲苷等，一些研究表明这些葡萄糖单元的水解能够使得这些天然产物的溶解度、生物利用度甚至生理活性得到提高。但是目前主要通过植物提取或化学水解法来获取这些缺少葡萄糖单元的天然产物，存在着效率低和污染大的缺点，并且由于水解反应的非特异性，容易形成许多其他的副产物，使得分离提取的工作变得十分困难。针对上述问题，使用酶法获得这些天然产物成为一种很好的方式。由于工业生产的严格要求，仍然迫切需要更高效、更稳定的酶资源。在挖掘到合适的酶资源后，通过定点突变技术，可以使酶的活性得到提高。如CN107142254A将来源于嗜酸耐热脂环酸芽孢杆菌Alicyclobacillus sp.A4的β-葡萄糖苷酶的315位氨基酸由组氨酸突变为精氨酸，得到较高葡萄糖耐受性β-葡萄糖苷酶突变体，在相同条件下，葡萄糖对突变体和野生型的酶活促进作用分别为212％和163％。CN115011582B将来自特异腐质霉(Humicola insolens)来源的野生型β-葡萄糖苷酶bglHi的354位的丙氨酸突变为脯氨酸，使得活性相较野生型提高了40.28％。
目前现有的许多β-葡萄糖苷酶主要用于水解小分子底物如水杨苷、虎杖苷等，但对于分子量较大的天然产物如人参皂苷、黄芪甲苷的水解鲜有报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种Microbacteriumdextranolyticumβ-葡萄糖苷酶的突变体及方法和应用。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种Microbacterium dextranolyticumβ-葡萄糖苷酶突变体，所述β-葡萄糖苷酶突变体是通过：将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的β-葡萄糖苷酶的第329位由谷氨酸突变为甘氨酸而得到的；
或者，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的β-葡萄糖苷酶的第329位由谷氨酸突变为天冬酰胺而得到的；
或者，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的β-葡萄糖苷酶的第329位由谷氨酸突变为赖氨酸，同时将第72位由精氨酸突变为天冬酰胺而得到的。
编码如上所述的Microbacterium dextranolyticumβ-葡萄糖苷酶突变体的基因。
携带如上所述基因的重组质粒。进一步的，所使用的载体质粒为pETDuet-1。
携带如上所述基因或权利要求3所述重组质粒的微生物细胞。进一步的，所使用的表达菌株为大肠杆菌BL21(DE3)。
一种利用如上所述微生物细胞制备Microbacterium dextranolyticumβ-葡萄糖苷酶突变体酶液的方法，所述方法将重组细胞接种至培养基中进行培养，添加诱导剂后继续培养，获得含有β-葡萄糖苷酶突变体的菌液；将菌液进行离心收集菌体，经过超声破碎后，将破碎所得溶液离心获得上清液，获得所述Microbacterium dextranolyticumβ-葡萄糖苷酶突变体酶液。
一种利用如上所述的突变体制备人参皂苷CK的方法，所述方法为将Microbacterium dextranolyticumβ-葡萄糖苷酶突变体酶液添加至含有人参皂苷Rb1的反应体系中进行反应，得到反应液，反应液经过分离即能够得到制备的人参皂苷CK；
其中，反应体系中添加突变体酶液的体积为反应体系体积的30-50％，反应体系中底物人参皂苷Rb1的浓度为5-10g/L，反应的pH为6.5-7.5、温度为40-50℃。
一种利用如上所述的突变体制备环黄芪醇-β-D-木糖苷的方法，其特征在于：所述方法为将Microbacterium dextranolyticumβ-葡萄糖苷酶突变体添加至含有黄芪甲苷的反应体系中进行反应，得到反应液，反应液经过分离即能够得到制备的人参皂苷CK；
其中，反应体系中添加突变体酶液的体积为反应体系体积的30-50％，反应体系中底物人参皂苷Rb1的浓度为5-10g/L，反应的pH为6.5-7.5、温度为40-50℃。
一种利用如上所述的突变体制备白藜芦醇的方法，所述方法为将Microbacteriumdextranolyticumβ-葡萄糖苷酶突变体添加至含有人参皂苷Rb1的反应体系中进行反应，得到反应液，反应液经过分离即能够得到制备的虎杖苷；
其中，反应体系中添加突变体酶液的体积为反应体系体积的30-50％，反应体系中底物人参皂苷Rb1的浓度为5-10g/L，反应的pH为6.5-7.5、温度为40-50℃。
如上所述的突变体在制备人参皂苷CK和/或人参皂苷75和/或白藜芦醇和/或环黄芪醇-β-D-木糖苷中的应用。
一种利用如上所述的突变体实现将虎杖苷转化为白藜芦醇的方法，所述方法将获得的β-葡萄糖苷酶突变体加入到含有虎杖苷的反应体系中进行反应，反应结束后得到的反应液经过提取获得白藜芦醇；
其中，所述反应体系中，β-葡萄糖苷酶突变体的添加量为10-100U/mL；
或者，所述反应体系中，含有包含β-葡萄糖苷酶突变体、虎杖苷及适当缓冲液系统；
或者，所述反应体系中，使用的缓冲液为磷酸盐缓冲液，其浓度为0.02-0.1M；
或者，所述反应是在30-40℃，pH 6-7的条件下进行的。
本发明取得的优点和积极效果为：
1、本发明获得的来自Microbacterium dextranolyticum的β-葡萄糖苷酶，并通过定点突变技术获得β-葡萄糖苷酶突变体，在大肠杆菌蛋白表达系统中进行了异源表达。在相同的反应条件下，本发明提供的β-葡萄糖苷酶突变体E329K/R72N特异性水解虎杖苷转化为白藜芦醇的能力提升约为25％。突变体E329N水解人参皂苷Rb1得到的人参皂苷CK及人参皂苷75的能力均有提高。突变体E329G特异性水解黄芪甲苷转化为环黄芪醇-6-O-木糖苷的能力提升约为20％。本发明的突变体在医药健康、食品保健和生物合成等领域具有较高的应用价值。
2、本发明通过定点突变构建获得的水解活性提高的β-葡萄糖苷酶突变体E329G、E329N、E329K/R72N，水解活性分别是野生型的3.90倍、3.71倍和15.06倍。在最优条件下，E329G制备的环黄芪醇-β-D-木糖苷的产率为99.8％，为野生型的1.2倍，E329N制备人参皂苷CK与人参皂苷75的产率分别为40.8％和59.2％，分别是野生型的1.1倍和3.2倍，E329K/R72N制备白藜芦醇的产量为99.7％，为野生型的1.25倍，具有较好的工业化应用潜力。
3、本发明解决目前高值天然产物酶法转化生产中存在的技术问题，通过定点突变技术获得一种酶活力提升的β-葡萄糖苷酶突变体。
附图说明
图1为本发明中实施例中来自Microbacterium dextranolyticum的β-葡萄糖苷酶基因突变体构建的全质粒PCR扩增电泳图；其中：M为DNAMarker，1为E329K突变体扩增结果，2为E329G突变体扩增结果，3为E329N突变体扩增结果，4为E329K/R72N突变体扩增结果图；
图2为本发明中实施例中β-葡萄糖苷酶野生型及突变体纯化后SDS-PAGE分析结果图；其中，M为DNAMarker，1为野生型，2为突变体E329K/R72N纯化结果，3为突变体E329G扩增结果，4为突变体E329N纯化结果图；
图3为本发明中实施例突变体E329K/R72N转化虎杖苷的液相色谱检测结果图；
图4为本发明中实施例突变体E329N转化人参皂苷Rb1的液相色谱检测结果图；
图5为本发明中实施例突变体E329G转化黄芪甲苷的液相色谱检测结果图。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明进一步说明，下属实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
具体实施例中所涉及的各种实验操作，均为本领域的常规技术，本文中没有特别注释的部分，本领域的普通技术人员可以参照本发明申请日之前的各种常用工具书、科技文献或相关的说明书、手册等予以实施。
一种Microbacterium dextranolyticumβ-葡萄糖苷酶突变体，所述β-葡萄糖苷酶突变体是通过：将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的β-葡萄糖苷酶的第329位由谷氨酸突变为甘氨酸而得到的；
或者，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的β-葡萄糖苷酶的第329位由谷氨酸突变为天冬酰胺而得到的；
或者，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的β-葡萄糖苷酶的第329位由谷氨酸突变为赖氨酸，同时将第72位由精氨酸突变为天冬酰胺而得到的。
编码如上所述的Microbacterium dextranolyticumβ-葡萄糖苷酶突变体的基因。
携带如上所述基因的重组质粒。进一步的，所使用的载体质粒为pETDuet-1。
携带如上所述基因或权利要求3所述重组质粒的微生物细胞。进一步的，所使用的表达菌株为大肠杆菌BL21(DE3)。
一种利用如上所述微生物细胞制备Microbacterium dextranolyticumβ-葡萄糖苷酶突变体酶液的方法，所述方法将重组细胞接种至培养基中进行培养，添加诱导剂后继续培养，获得含有β-葡萄糖苷酶突变体的菌液；将菌液进行离心收集菌体，经过超声破碎后，将破碎所得溶液离心获得上清液，获得所述Microbacterium dextranolyticumβ-葡萄糖苷酶突变体酶液。
一种利用如上所述的突变体制备人参皂苷CK的方法，所述方法为将Microbacterium dextranolyticumβ-葡萄糖苷酶突变体酶液添加至含有人参皂苷Rb1的反应体系中进行反应，得到反应液，反应液经过分离即能够得到制备的人参皂苷CK；
其中，反应体系中添加突变体酶液的体积为反应体系体积的30-50％，反应体系中底物人参皂苷Rb1的浓度为5-10g/L，反应的pH为6.5-7.5、温度为40-50℃。
一种利用如上所述的突变体制备环黄芪醇-β-D-木糖苷的方法，其特征在于：所述方法为将Microbacterium dextranolyticumβ-葡萄糖苷酶突变体添加至含有黄芪甲苷的反应体系中进行反应，得到反应液，反应液经过分离即能够得到制备的人参皂苷CK；
其中，反应体系中添加突变体酶液的体积为反应体系体积的30-50％，反应体系中底物人参皂苷Rb1的浓度为5-10g/L，反应的pH为6.5-7.5、温度为40-50℃。
一种利用如上所述的突变体制备白藜芦醇的方法，所述方法为将Microbacteriumdextranolyticumβ-葡萄糖苷酶突变体添加至含有人参皂苷Rb1的反应体系中进行反应，得到反应液，反应液经过分离即能够得到制备的虎杖苷；
其中，反应体系中添加突变体酶液的体积为反应体系体积的30-50％，反应体系中底物人参皂苷Rb1的浓度为5-10g/L，反应的pH为6.5-7.5、温度为40-50℃。
如上所述的突变体在制备人参皂苷CK和/或人参皂苷75和/或白藜芦醇和/或环黄芪醇-β-D-木糖苷中的应用。
一种利用如上所述的突变体实现将虎杖苷转化为白藜芦醇的方法，所述方法将获得的β-葡萄糖苷酶突变体加入到含有虎杖苷的反应体系中进行反应，反应结束后得到的反应液经过提取获得白藜芦醇；
其中，所述反应体系中，β-葡萄糖苷酶突变体的添加量为10-100U/mL；
或者，所述反应体系中，含有包含β-葡萄糖苷酶突变体、虎杖苷及适当缓冲液系统；
或者，所述反应体系中，使用的缓冲液为磷酸盐缓冲液，其浓度为0.02-0.1M；
或者，所述反应是在30-40℃，pH 6-7的条件下进行的。
具体地，相关的制备及检测如下：
下述实施例中涉及的大肠杆菌E.coli BL21(DE3)购自擎科生物；下述实施例中涉及的pETDuet-1质粒购自金斯瑞公司；下述实施例中所涉及到的天然产物均购自上海源叶公司。
下述实施例中涉及的培养基如下：
LB培养基：酵母提取物5.0g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L；固体培养基则加入15-20g/L琼脂。
下述实施例中酶活及液相检测方法如下：
本发明所用β-葡萄糖苷酶及突变体酶活检测方法主要是基于测定酶解生成的底物的浓度进行换算。以人工合成的底物对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)为底物，水解产生的产物对硝基苯酚(pNP)在碱性条件下显色，通过测定405nm处该物质的含量。具体检测方法如下：取10ul适当稀释后的酶液，加入至90ul于37℃预热后的反应体系，使体系中包含pNPG 2mM，磷酸盐缓冲液100mM，pH 7.0。混合后反应1min，加入100ul 2M碳酸钠溶液终止反应。以煮沸灭活的酶液作为对照，测定OD405nm处的吸光度，代入标准曲线计算体系中pNP浓度。
pNP标准曲线的绘制：分别配置包含2-10μM的pNP体系8-10个，以无菌水作为空白，测定OD405nm处吸光度，绘制吸光度与浓度关系的线性回归曲线并计算R2值，直至R2值介于0.99与1之间。
β-葡萄糖苷酶及突变体酶活力计算公式：酶活力S＝C×V1×n/1000×t×V2
式中，C为pNP的浓度(μM)；V1为反应液体积(mL)；V2为酶液的体积(mL)；n为酶液稀释倍数；t为反应时间(min)。
酶活定义：在37℃条件下每分钟水解生成1μmol对硝基苯(pNP)所需的酶量定义为1个酶活单位(U)。
虎杖苷及水解产物液相色谱检测条件：使用岛津LC40高效液相色谱仪进行分析，色谱柱为安捷伦C18色谱柱(4.6×250mm，5μm)，检测器为PDA检测器，检测波长为306nm，柱温设置为40℃，流速为1mL/min，流动相A(水)与B(乙腈)的梯度洗脱程序如下：0min，72:28；7min，28:72；9min，28:72；20min，72:28。
人参皂苷Rb1及水解产物液相色谱检测条件：使用岛津LC40高效液相色谱仪进行分析，色谱柱为安捷伦C18色谱柱(4.6×250mm，5μm)，检测器为PDA检测器，检测波长为203nm，柱温设置为40℃，流速为0.8mL/min，流动相A(水)与B(乙腈)的梯度洗脱程序如下：0min，70:30；5min，70:30；15min，43:57；25min，30:70；30min，30:70；45min；70:30。黄芪甲苷(ASI)及水解产物液相色谱检测条件：使用岛津LC40高效液相色谱仪进行分析，色谱柱为安捷伦C18色谱柱(4.6×250mm，5μm)，检测器为ELSD检测器，柱温设置为40℃，流速为1mL/min，流动相为75％的甲醇。
转化率的计算公式为：(C1/C1+C2+…+Cn)×100％，式中C1为产物浓度(mM)，C2、…、Cn分别为其余各组分的浓度(mM)。
实施例1：Microbacterium dextranolyticum来源的β-葡萄糖苷酶BgMd的表达
将序列Genebank登录号WP_204962958.1，如序列SEQ ID NO.1所示。经过对大肠杆菌密码子优化，交由金斯瑞公司合成并构建至表达载体pETDuet-1的BamH I和Kpn I酶切位点之间，得到含有β-葡萄糖苷酶的重组质粒pETDuet-BgMd，如SEQ ID NO.2所示。
将获得的含有β-葡萄糖苷酶的重组质粒pETDuet-BgMd转化至BL21(DE3)中，具体步骤为：将重组质粒大肠杆菌pETDuet-BgMd与大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞于冰上混合，冰浴30min后置于42℃水浴锅中热激1min，随后冰浴2-3min，加入1mL LB培养基37℃复苏30min-1h，随后离心收集菌体，去除多余上清涂布在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基平板上，置于37℃培养箱倒置培养12h，获得单菌落经验证正确后即为重组大肠杆菌。
将获得的重组大肠杆菌接种至含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中于37℃，220rpm的摇床中过夜培养并进行菌种保藏，之后按照1％(v/v)转接至新鲜含有100μg/mL氨苄青霉素LB培养基，培养至OD600为0.6-0.8，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷至终浓度为1mmol/L，置于16℃，160rpm的摇床低温诱导。诱导结束后通过离心收集菌体，使用适量磷酸盐缓冲液重悬，经过超声破碎后离心获得上清，即为野生型的粗酶液。
实施例2：突变体的构建
根据核苷酸序列SEQ ID NO.2所示的β-葡萄糖苷酶的基因序列，分别设计E329K、E329G、E329N和R72N的突变引物，对β-葡萄糖苷酶BgMd进行定点突变，具体步骤如下：
利用全质粒PCR技术，以上述携带编码β-葡萄糖苷酶BgMd的重组质粒pETDuet-BgMd为模板，分别加入下列突变引物并配置相应的PCR体系进行扩增。
引入E329K突变的定点突变引物为：
正向引物：5’-CCGACTGGAAATTGGTCAACGATAATCATGTTGGTGATC-3’(SEQ ID NO.3)
反向引物：5’-TTGACCAATTTCCAGTCGGTGACGACCACG-3’(SEQ ID NO.4)
引入E329G突变的定点突变引物为：
正向引物：5’-CCGACTGGGGTTTGGTCAACGATAATCATGTTGGTGATC-3’(SEQ ID NO.5)
反向引物：5’-TTGACCAAACCCCAGTCGGTGACGACCACG-3’(SEQ ID NO.6)
引入E329N突变的定点突变引物为：
正向引物：5’-CCGACTGGAATTTGGTCAACGATAATCATGTTGGTGATC-3’(SEQ ID NO.7)
反向引物：5’-TTGACCAAATTCCAGTCGGTGACGACCACG-3’(SEQ ID NO.8)
配置的PCR体系均为：2×PhantaFlash Master Mix 15ul，正反向引物(10mM)各1.2ul，重组质粒模板(10ng/ul)1ul，dd水补至30ul。
PCR的扩增程序为：第一步为98℃预变性30s；然后进入28-35个循环：98℃变性10s，60℃退火5s，72℃延伸1min 50s；最后72℃延伸1min。
取2ul扩增后的产物，进行电泳检测，检测正确的PCR产物加入1ul DpnI酶，于37℃水浴2-4h消化模板。消化后经过产物回收试剂盒回收产物。将回收后的产物转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，挑取平板上的阳性菌落进行测序验证，验证正确的菌落接种至含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基置于37℃，220rpm的恒温摇床培养12h并进行菌种保藏，并如上述实施例1中进行诱导表达。
其中双点突变是在单点突变正确的基础上，使用质粒提取试剂盒提取质粒，以突变体的质粒为模板，加入下列突变引物并配置相应的PCR体系进行扩增，后续步骤如上述所述进行。
引入R72N突变的定点突变引物为：
正向引物：5’-TGCTGGAAGCGCCAGGTAATATCAGCAA-3’(SEQ ID NO.9)
反向引物：5’-GTGGTCGGGCTTTTGCTGATATTACCTGGCG-3’(SEQ ID NO.10)
得到的突变体E329K/R72N、E329G和E329N的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13所述。
如图1所示，扩增后的产物经过电泳检测，条带单一、明亮，大小位于5000bp-8000bp之间，与重组质粒理论大小7042bp基本一致，经过后续验证正确后可以说明突变体构建成功。
实施例3：野生型及突变体β-葡萄糖苷酶的纯化
将获得的粗酶液使用Ni离子亲和柱进行纯化，纯化过程如下：先使用6个柱体积的缓冲液A(50mM磷酸盐缓冲液，pH7.4，500mM NaCl，20mM咪唑)平衡柱子，然后将粗酶液通过微孔过滤器过滤后，加入1-2个柱体积的粗酶液进行吸附。使用10-20个柱体积的缓冲液A进行洗涤，然后使用5个柱体积的缓冲液B(50mM磷酸盐缓冲液，pH7.4，500mM NaCl，500mM咪唑)进行洗脱并收集洗脱液，获得的即为纯化后的野生型及突变体β-葡萄糖苷酶。取10ul纯化后的酶加入2ul 6×蛋白上样缓冲液，于100℃煮沸3-5min，进行SDS-PAGE电泳分析。
如图2所示，经过纯化后获得的纯酶液，条带单一、明亮，大小位于50kDa-70kDa之间，与根据氨基酸序列计算的分子量大小67.55kDa基本一致，说明野生型及突变体β-葡萄糖苷酶在大肠杆菌中表达情况良好。
野生型及突变体酶活性经过测定，结果如下表。
与授权专利CN 115232802 B报道的突变酶的比活力比野生酶显著提高1.5倍及以上相比，本实施例中获得的突变体相较野生型活性提高3倍以上，双点突变体活性提高超过15倍，效果显著。
实施例4：野生型及突变体β-葡萄糖苷酶催化天然产物的转化应用
虎杖苷的转化：
取实施例1和2获得的野生型及突变体的酶液，加入至虎杖苷的转化体系中，其中包含虎杖苷2g/L，0.1M磷酸盐缓冲液pH 7.0，酶液40％(v％，体积浓度)，混匀后于37℃200rpm恒温摇床中转化12h，反应结束后加入等体积甲醇使酶失活，离心取上清液过有机系微孔滤膜通过液相色谱检测。
如图3所示，野生型12h转化2g/L虎杖苷的转化率为45.3％，而突变体E329K/R72N的转化率最高，12h转化2g/L虎杖苷的转化率为99.7％，相比野生型提高了约25％。与专利授权号CN 115011582 B报道的对于虎杖苷转化率从约15％提高至99.7％，具有明显的优势。
人参皂苷Rb1的转化：
取实施例1和2获得的野生型及突变体的粗酶液，加入至人参皂苷Rb1的转化体系中，其中包含人参皂苷Rb12g/L，0.1M磷酸盐缓冲液pH 7.0，粗酶液40％(v％，体积浓度)，混匀后于37℃200rpm恒温摇床中转化12h，反应结束后加入等体积甲醇使酶失活，离心取上清液过有机系微孔滤膜通过液相色谱检测。
如图4所示，野生型12h转化2g/L人参皂苷Rb1转化至CK的转化率为36.6％，转化至人参皂苷75(Gyp75)的转化率为14.2％，而突变体E329N的转化率最高，12h转化2g/L人参皂苷Rb1转化至CK的转化率为40.8％，转化至Gyp75的转化率为59.2％，相比野生型分别提高了约11％和317％。与专利公开号CN 117210441 A报道的结果相比，本实施例能够获得到更加稀有、有价值的人参皂苷CK。
黄芪甲苷的转化：
取实施例1和2获得的野生型及突变体的粗酶液，加入至黄芪甲苷的转化体系中，其中包含黄芪甲苷2g/L，0.1M磷酸盐缓冲液pH 7.0，粗酶液40％(v％，体积浓度)，混匀后于37℃200rpm恒温摇床中转化12h，反应结束后加入等体积水饱和正丁醇使酶失活并萃取，离心取上清液并重复萃取一次，收集的有机相经过吹干后，加入一定体积甲醇复溶，取上清并加入dd水至甲醇的体积比为75％，过有机系微孔滤膜通过液相色谱检测。
如图5所示，野生型12h转化2g/L黄芪甲苷的转化率为83.1％，而突变体E329G的转化率最高，12h转化2g/L黄芪甲苷的转化至环黄芪醇-β-D-木糖苷(CMX)率为99.8％，相比野生型提高了约20％。
本发明中使用的序列如下：
SEQ ID NO.1蛋白序列BgMd氨基酸序列
MTPHLSTAADGTSYRDLNGNGVMDPYEDPRLSPEERADDLVSRMSLEEKCGLMFQTVIEVGDDGELLEAPGRISKSPTTEVVVGKNLSHFNVHAIRTARQAAVWNNNLQALAERTPHGVPVTISTDPRHAFVENTGVGFAAGPFSQWPEGLGLAAIDDVETVREFADVARREYRAVGIRAALHPQIDLATEPRWGRQAQTLGQDAARVAEFTAAYLQGFQGDELGPDSVACTTKHFPGGGPQKDGEDSHFPYGREQVYPGGMFEYHLEPFREAIRRGTAAMMPYYGMPVGLERGGEKIEEVGFGYNRQIVTDLLRGELGYDGVVVTDWELVNDNHVGDQVLPARAWGVEELTPAERMEKILDAGADQFGGEECVDLLLDLVRSGRIGEERIDASARRLLLVKFRLGLFDDPYVDPDEAERIVGNADFRAQGERAQARALTVLVNREDASGAPTLPLRPVGRVYVEGFRADEAAELGVVVDDPADADLALVRLGAPFDPRDDLFLEAWFHQGSLEFPPGRVYRMRRIAEQCPLVLVANLDRAAVLTPFAEFAAAIAADFGSSGAAVLDALTGRIAPEGRLPVELPRSMDAVRASREDVPSDTEDPLFPVHFGLSLTTARA
SEQ ID NO.2重组质粒pETDuet-BgMd核苷酸序列
ggggaattgtgagcggataacaattcccctctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatataccatgggcagcagccatcaccatcatcaccacagccaggatccgatgactccccacctatcaacagcagctgatggcaccagctatcgtgatttgaatggcaacggcgtgatggacccgtacgaagatccgcgtctgtcgccggaagaacgagcagacgacttggtcagccgtatgtccctggaagagaagtgcggtcttatgtttcagaccgtgattgaagttggtgacgacggcgagctgctggaagcgccaggtcgtatcagcaaaagcccgaccaccgaagtggttgtgggcaagaacctgtcccacttcaacgtgcacgcaattcgcaccgcgcgccaagctgcggtttggaataacaacctgcaagcactggcggagcgcaccccgcatggtgttccggttacaatttcgaccgacccgcgtcacgcctttgttgagaacaccggtgtggggttcgctgcgggtccgttcagccagtggcctgaaggtctgggcctggcagccatcgatgatgttgaaacggtaagagagttcgcggacgttgcgagacgcgagtatcgtgcggtgggcattcgcgcggcgctgcatccgcagattgatctcgctaccgagccgcgttggggtcgtcaggcacaaacgctgggtcaggatgccgcgcgcgtggctgagttcaccgctgcgtatctgcagggttttcaaggcgacgagctaggcccggattccgttgcctgcaccaccaaacactttccgggtggtggtccgcaaaaagatggtgaggacagccacttcccgtacggccgtgaacaggtttacccgggcggtatgtttgaataccatctggaaccgtttcgtgaagcgattcgtcgcggtactgctgctatgatgccgtactatggtatgccggtgggcttagagcgcggtggcgaaaagatcgaagaggtgggcttcggctataaccgtcaaatcgtgaccgatctgctgcgtggcgaactgggttatgatggcgtggtcgtcaccgactgggaattggtcaacgataatcatgttggtgatcaagttttgccggcacgcgcgtggggtgtcgaggaattgactccggcggaacgcatggagaagattctggacgctggtgcagaccagtttggtggcgaagagtgcgttgatctgttgttggacttagttcgttcaggtcgcatcggcgaggagcgcatcgacgcgagcgcacgccgtttgttactggtgaaattccgcctgggcctgttcgacgacccgtacgtggacccggatgaggccgaacgcattgttggcaacgcagacttccgcgcgcagggcgagagagcccaagcgcgagcgctgacggtcctggtgaatcgtgaggacgccagcggtgcgccaaccctaccgctgcgtcccgttggccgggtgtacgttgagggcttccgtgcggacgaagcggcggagctgggtgtggtggtagacgacccggcggacgcagacttggccttggttcgtctgggagctccattcgatccacgtgatgacttgtttctggaagcgtggtttcatcagggttctctggagttcccgcctgggcgtgtgtaccgtatgcgtcgtatcgcggagcagtgtccgctggttcttgtcgcaaatctggatcgtgcggcggttctgaccccgtttgccgaattcgctgccgcgatcgccgctgactttggttctagcggtgcggcagtgttggacgccctgactggtcgcatcgcgcctgagggtcgtcttccggttgagctgccacgtagcatggatgcggtgcgcgcgagccgtgaggacgtgccgagcgataccgaagatccgctgttcccggttcacttcggtttatccctgacgacggctcgtgcaggtaccctcgagtctggtaaagaaaccgctgctgcgaaatttgaacgccagcacatggactcgtctactagcgcagcttaattaacctaggctgctgccaccgctgagcaataactagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttgctgaaaggaggaactatatccggattggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgtttacaatttctggcggcacgatggcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaatcatgattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggtcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcatatatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagtatacactccgctatcgctacgtgactgggtcatggctgcgccccgacacccgccaacacccgctgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccggcatccgcttacagacaagctgtgaccgtctccgggagctgcatgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcgaggcagctgcggtaaagctcatcagcgtggtcgtgaagcgattcacagatgtctgcctgttcatccgcgtccagctcgttgagtttctccagaagcgttaatgtctggcttctgataaagcgggccatgttaagggcggttttttcctgtttggtcactgatgcctccgtgtaagggggatttctgttcatgggggtaatgataccgatgaaacgagagaggatgctcacgatacgggttactgatgatgaacatgcccggttactggaacgttgtgagggtaaacaactggcggtatggatgcggcgggaccagagaaaaatcactcagggtcaatgccagcgcttcgttaatacagatgtaggtgttccacagggtagccagcagcatcctgcgatgcagatccggaacataatggtgcagggcgctgacttccgcgtttccagactttacgaaacacggaaaccgaagaccattcatgttgttgctcaggtcgcagacgttttgcagcagcagtcgcttcacgttcgctcgcgtatcggtgattcattctgctaaccagtaaggcaaccccgccagcctagccgggtcctcaacgacaggagcacgatcatgctagtcatgccccgcgcccaccggaaggagctgactgggttgaaggctctcaagggcatcggtcgagatcccggtgcctaatgagtgagctaacttacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgccagggtggtttttcttttcaccagtgagacgggcaacagctgattgcccttcaccgcctggccctgagagagttgcagcaagcggtccacgctggtttgccccagcaggcgaaaatcctgtttgatggtggttaacggcgggatataacatgagctgtcttcggtatcgtcgtatcccactaccgagatgtccgcaccaacgcgcagcccggactcggtaatggcgcgcattgcgcccagcgccatctgatcgttggcaaccagcatcgcagtgggaacgatgccctcattcagcatttgcatggtttgttgaaaaccggacatggcactccagtcgccttcccgttccgctatcggctgaatttgattgcgagtgagatatttatgccagccagccagacgcagacgcgccgagacagaacttaatgggcccgctaacagcgcgatttgctggtgacccaatgcgaccagatgctccacgcccagtcgcgtaccgtcttcatgggagaaaataatactgttgatgggtgtctggtcagagacatcaagaaataacgccggaacattagtgcaggcagcttccacagcaatggcatcctggtcatccagcggatagttaatgatcagcccactgacgcgttgcgcgagaagattgtgcaccgccgctttacaggcttcgacgccgcttcgttctaccatcgacaccaccacgctggcacccagttgatcggcgcgagatttaatcgccgcgacaatttgcgacggcgcgtgcagggccagactggaggtggcaacgccaatcagcaacgactgtttgcccgccagttgttgtgccacgcggttgggaatgtaattcagctccgccatcgccgcttccactttttcccgcgttttcgcagaaacgtggctggcctggttcaccacgcgggaaacggtctgataagagacaccggcatactctgcgacatcgtataacgttactggtttcacattcaccaccctgaattgactctcttccgggcgctatcatgccataccgcgaaaggttttgcgccattcgatggtgtccgggatctcgacgctctcccttatgcgactcctgcattaggaagcagcccagtagtaggttgaggccgttgagcaccgccgccgcaaggaatggtgcatgcaaggagatggcgcccaacagtcccccggccacggggcctgccaccatacccacgccgaaacaagcgctcatgagcccgaagtggcgagcccgatcttccccatcggtgatgtcggcgatataggcgccagcaaccgcacctgtggcgccggtgatgccggccacgatgcgtccggcgtagaggatcgagatcgatctcgatcccgcgaaattaatacgactcactata
SEQ ID NO.3BgMd核苷酸序列
atgactccccacctatcaacagcagctgatggcaccagctatcgtgatttgaatggcaacggcgtgatggacccgtacgaagatccgcgtctgtcgccggaagaacgagcagacgacttggtcagccgtatgtccctggaagagaagtgcggtcttatgtttcagaccgtgattgaagttggtgacgacggcgagctgctggaagcgccaggtCAGatcagcaaaagcccgaccaccgaagtggttgtgggcaagaacctgtcccacttcaacgtgcacgcaattcgcaccgcgcgccaagctgcggtttggaataacaacctgcaagcactggcggagcgcaccccgcatggtgttccggttacaatttcgaccgacccgcgtcacgcctttgttgagaacaccggtgtggggttcgctgcgggtccgttcagccagtggcctgaaggtctgggcctggcagccatcgatgatgttgaaacggtaagagagttcgcggacgttgcgagacgcgagtatcgtgcggtgggcattcgcgcggcgctgcatccgcagattgatctcgctaccgagccgcgttggggtcgtcaggcacaaacgctgggtcaggatgccgcgcgcgtggctgagttcaccgctgcgtatctgcagggttttcaaggcgacgagctaggcccggattccgttgcctgcaccaccaaacactttccgggtggtggtccgcaaaaagatggtgaggacagccacttcccgtacggccgtgaacaggtttacccgggcggtatgtttgaataccatctggaaccgtttcgtgaagcgattcgtcgcggtactgctgctatgatgccgtactatggtatgccggtgggcttagagcgcggtggcgaaaagatcgaagaggtgggcttcggctataaccgtcaaatcgtgaccgatctgctgcgtggcgaactgggttatgatggcgtggtcgtcaccgactggCAGttggtcaacgataatcatgttggtgatcaagttttgccggcacgcgcgtggggtgtcgaggaattgactccggcggaacgcatggagaagattctggacgctggtgcagaccagtttggtggcgaagagtgcgttgatctgttgttggacttagttcgttcaggtcgcatcggcgaggagcgcatcgacgcgagcgcacgccgtttgttactggtgaaattccgcctgggcctgttcgacgacccgtacgtggacccggatgaggccgaacgcattgttggcaacgcagacttccgcgcgcagggcgagagagcccaagcgcgagcgctgacggtcctggtgaatcgtgaggacgccagcggtgcgccaaccctaccgctgcgtcccgttggccgggtgtacgttgagggcttccgtgcggacgaagcggcggagctgggtgtggtggtagacgacccggcggacgcagacttggccttggttcgtctgggagctccattcgatccacgtgatgacttgtttctggaagcgtggtttcatcagggttctctggagttcccgcctgggcgtgtgtaccgtatgcgtcgtatcgcggagcagtgtccgctggttcttgtcgcaaatctggatcgtgcggcggttctgaccccgtttgccgaattcgctgccgcgatcgccgctgactttggttctagcggtgcggcagtgttggacgccctgactggtcgcatcgcgcctgagggtcgtcttccggttgagctgccacgtagcatggatgcggtgcgcgcgagccgtgaggacgtgccgagcgataccgaagatccgctgttcccggttcacttcggtttatccctgacgacggctcgtgca
SEQ ID NO.4E329K-F引物序列
CCGACTGGAAATTGGTCAACGATAATCATGTTGGTGATC
SEQ ID NO.5E329K-R引物序列
TTGACCAATTTCCAGTCGGTGACGACCACG
SEQ ID NO.6E329G-F引物序列
CCGACTGGGGTTTGGTCAACGATAATCATGTTGGTGATC
SEQ ID NO.7E329G-R引物序列
TGACCAAACCCCAGTCGGTGACGACCACG
SEQ ID NO.8E329N-F引物序列
CCGACTGGAATTTGGTCAACGATAATCATGTTGGTGATC
SEQ ID NO.9E329N-R引物序列
TTGACCAAATTCCAGTCGGTGACGACCACG
SEQ ID NO.10R72N-F引物序列
TGCTGGAAGCGCCAGGTAATATCAGCAA
SEQ ID NO.11R72N-R引物序列
GTGGTCGGGCTTTTGCTGATATTACCTGGCG
SEQ ID NO.12突变体E329K/R72N氨基酸序列
MTPHLSTAADGTSYRDLNGNGVMDPYEDPRLSPEERADDLVSRMSLEEKCGLMFQTVIEVGDDGELLEAPGNISKSPTTEVVVGKNLSHFNVHAIRTARQAAVWNNNLQALAERTPHGVPVTISTDPRHAFVENTGVGFAAGPFSQWPEGLGLAAIDDVETVREFADVARREYRAVGIRAALHPQIDLATEPRWGRQAQTLGQDAARVAEFTAAYLQGFQGDELGPDSVACTTKHFPGGGPQKDGEDSHFPYGREQVYPGGMFEYHLEPFREAIRRGTAAMMPYYGMPVGLERGGEKIEEVGFGYNRQIVTDLLRGELGYDGVVVTDWKLVNDNHVGDQVLPARAWGVEELTPAERMEKILDAGADQFGGEECVDLLLDLVRSGRIGEERIDASARRLLLVKFRLGLFDDPYVDPDEAERIVGNADFRAQGERAQARALTVLVNREDASGAPTLPLRPVGRVYVEGFRADEAAELGVVVDDPADADLALVRLGAPFDPRDDLFLEAWFHQGSLEFPPGRVYRMRRIAEQCPLVLVANLDRAAVLTPFAEFAAAIAADFGSSGAAVLDALTGRIAPEGRLPVELPRSMDAVRASREDVPSDTEDPLFPVHFGLSLTTARA
SEQ ID NO.13突变体E329G氨基酸序列
MTPHLSTAADGTSYRDLNGNGVMDPYEDPRLSPEERADDLVSRMSLEEKCGLMFQTVIEVGDDGELLEAPGRISKSPTTEVVVGKNLSHFNVHAIRTARQAAVWNNNLQALAERTPHGVPVTISTDPRHAFVENTGVGFAAGPFSQWPEGLGLAAIDDVETVREFADVARREYRAVGIRAALHPQIDLATEPRWGRQAQTLGQDAARVAEFTAAYLQGFQGDELGPDSVACTTKHFPGGGPQKDGEDSHFPYGREQVYPGGMFEYHLEPFREAIRRGTAAMMPYYGMPVGLERGGEKIEEVGFGYNRQIVTDLLRGELGYDGVVVTDWGLVNDNHVGDQVLPARAWGVEELTPAERMEKILDAGADQFGGEECVDLLLDLVRSGRIGEERIDASARRLLLVKFRLGLFDDPYVDPDEAERIVGNADFRAQGERAQARALTVLVNREDASGAPTLPLRPVGRVYVEGFRADEAAELGVVVDDPADADLALVRLGAPFDPRDDLFLEAWFHQGSLEFPPGRVYRMRRIAEQCPLVLVANLDRAAVLTPFAEFAAAIAADFGSSGAAVLDALTGRIAPEGRLPVELPRSMDAVRASREDVPSDTEDPLFPVHFGLSLTTARA
SEQ ID NO.14突变体E329N氨基酸序列
MTPHLSTAADGTSYRDLNGNGVMDPYEDPRLSPEERADDLVSRMSLEEKCGLMFQTVIEVGDDGELLEAPGRISKSPTTEVVVGKNLSHFNVHAIRTARQAAVWNNNLQALAERTPHGVPVTISTDPRHAFVENTGVGFAAGPFSQWPEGLGLAAIDDVETVREFADVARREYRAVGIRAALHPQIDLATEPRWGRQAQTLGQDAARVAEFTAAYLQGFQGDELGPDSVACTTKHFPGGGPQKDGEDSHFPYGREQVYPGGMFEYHLEPFREAIRRGTAAMMPYYGMPVGLERGGEKIEEVGFGYNRQIVTDLLRGELGYDGVVVTDWNLVNDNHVGDQVLPARAWGVEELTPAERMEKILDAGADQFGGEECVDLLLDLVRSGRIGEERIDASARRLLLVKFRLGLFDDPYVDPDEAERIVGNADFRAQGERAQARALTVLVNREDASGAPTLPLRPVGRVYVEGFRADEAAELGVVVDDPADADLALVRLGAPFDPRDDLFLEAWFHQGSLEFPPGRVYRMRRIAEQCPLVLVANLDRAAVLTPFAEFAAAIAADFGSSGAAVLDALTGRIAPEGRLPVELPRSMDAVRASREDVPSDTEDPLFPVHFGLSLTTARA
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。

Claims (10)

1.一种Microbacterium dextranolyticumβ-葡萄糖苷酶突变体，其特征在于：所述β-葡萄糖苷酶突变体是通过：将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的β-葡萄糖苷酶的第329位由谷氨酸突变为甘氨酸而得到的；
或者，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的β-葡萄糖苷酶的第329位由谷氨酸突变为天冬酰胺而得到的；
或者，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的β-葡萄糖苷酶的第329位由谷氨酸突变为赖氨酸，同时将第72位由精氨酸突变为天冬酰胺而得到的。
2.编码如权利要求1所述的Microbacterium dextranolyticumβ-葡萄糖苷酶突变体的基因。
3.携带如权利要求2所述基因的重组质粒。
4.携带如权利要求2所述基因或权利要求3所述重组质粒的微生物细胞。
5.一种利用如权利要求4所述微生物细胞制备Microbacterium dextranolyticumβ-葡萄糖苷酶突变体酶液的方法，其特征在于：所述方法将重组细胞接种至培养基中进行培养，添加诱导剂后继续培养，获得含有β-葡萄糖苷酶突变体的菌液；将菌液进行离心收集菌体，经过超声破碎后，将破碎所得溶液离心获得上清液，获得所述Microbacteriumdextranolyticumβ-葡萄糖苷酶突变体酶液。
6.一种利用如权利要求1所述的突变体制备人参皂苷CK的方法，其特征在于：所述方法为将Microbacterium dextranolyticumβ-葡萄糖苷酶突变体酶液添加至含有人参皂苷Rb1的反应体系中进行反应，得到反应液，反应液经过分离即能够得到制备的人参皂苷CK；
其中，反应体系中添加突变体酶液的体积为反应体系体积的30-50％，反应体系中底物人参皂苷Rb1的浓度为5-10g/L，反应的pH为6.5-7.5、温度为40-50℃。
7.一种利用如权利要求1所述的突变体制备环黄芪醇-β-D-木糖苷的方法，其特征在于：所述方法为将Microbacterium dextranolyticumβ-葡萄糖苷酶突变体添加至含有黄芪甲苷的反应体系中进行反应，得到反应液，反应液经过分离即能够得到制备的人参皂苷CK；
其中，反应体系中添加突变体酶液的体积为反应体系体积的30-50％，反应体系中底物人参皂苷Rb1的浓度为5-10g/L，反应的pH为6.5-7.5、温度为40-50℃。
8.一种利用如权利要求1所述的突变体制备白藜芦醇的方法，其特征在于：所述方法为将Microbacterium dextranolyticumβ-葡萄糖苷酶突变体添加至含有人参皂苷Rb1的反应体系中进行反应，得到反应液，反应液经过分离即能够得到制备的虎杖苷；
其中，反应体系中添加突变体酶液的体积为反应体系体积的30-50％，反应体系中底物人参皂苷Rb1的浓度为5-10g/L，反应的pH为6.5-7.5、温度为40-50℃。
9.如权利要求1所述的突变体在制备人参皂苷CK和/或人参皂苷75和/或白藜芦醇和/或环黄芪醇-β-D-木糖苷中的应用。
10.一种利用如权利要求1所述的突变体实现将虎杖苷转化为白藜芦醇的方法，其特征在于：所述方法将获得的β-葡萄糖苷酶突变体加入到含有虎杖苷的反应体系中进行反应，反应结束后得到的反应液经过提取获得白藜芦醇；
其中，所述反应体系中，β-葡萄糖苷酶突变体的添加量为10-100U/mL；
或者，所述反应体系中，含有包含β-葡萄糖苷酶突变体、虎杖苷及适当缓冲液系统；
或者，所述反应体系中，使用的缓冲液为磷酸盐缓冲液，其浓度为0.02-0.1M；
或者，所述反应是在30-40℃，pH 6-7的条件下进行的。
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CN118325874A (zh) * 2024-05-16 2024-07-12 广东金骏康生物技术有限公司 一种葡萄糖基水解酶组合突变体及其制备方法和应用

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