CN114107341A

CN114107341A - 真菌来源的α-L-鼠李糖苷酶在高效生产淫羊藿苷中的应用

Info

Publication number: CN114107341A
Application number: CN202111434208.0A
Authority: CN
Inventors: 田灵芝; 董洪钢
Original assignee: Zhejiang Xizhenglin Biotechnology Co ltd
Current assignee: Zhejiang Xizhenglin Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-11-29
Filing date: 2021-11-29
Publication date: 2022-03-01
Anticipated expiration: 2041-11-29
Also published as: CN114107341B

Abstract

本发明涉及α‑L‑鼠李糖苷酶的应用技术，特别涉及一种真菌来源的α‑L‑鼠李糖苷酶在高效生产淫羊藿苷中的应用，包括如下步骤：步骤一、AmRhaE基因合成及重组表达α‑L鼠李糖苷酶大肠杆菌构建；步骤二、50mL体系诱导重组大肠杆菌发酵产α‑L鼠李糖苷酶；步骤三、5L发酵罐诱导重组大肠杆菌发酵产α‑L鼠李糖苷酶；步骤四、重组大肠杆菌全细胞催化水解淫羊藿提取物样品；还可以包括步骤五、重组AmRhaE粗酶液催化水解淫羊藿提取物样品；本发明通过将编码α‑L‑鼠李糖苷酶的基因序列连接至大肠杆菌表达载体pET28a上，在大肠杆菌宿主BL21(DE3)进行诱导表达。以0.5mMIPTG25℃诱导12h，获得重组酶酶活力为32U/mL，通过5L发酵罐优化放大，以0.5mMIPTG诱导12h，获得重组酶酶活力达197U/mL，相比于放大化表达前，酶活提高了6.15倍。

Description

真菌来源的α-L-鼠李糖苷酶在高效生产淫羊藿苷中的应用

技术领域

本发明涉及α-L-鼠李糖苷酶的应用技术，特别涉及一种真菌来源的α-L-鼠李糖苷酶在高效生产淫羊藿苷中的应用。

背景技术

α-L-鼠李糖苷酶(EC3.2.1.40)是能特异性水解鼠李糖苷键的一种水解酶，广泛分布在自然界中的微生物，在细菌(芽孢杆菌属、乳杆菌属、单胞菌属等)以及真菌(曲霉、木霉、青霉等)中均有α-L-鼠李糖苷酶。α-L-鼠李糖苷酶可高效水解多种含有α-鼠李糖苷键的糖苷类物质，例如人参皂苷、柚皮苷、芦丁、橙皮苷以及朝藿定C等。

α-L-鼠李糖苷酶被广泛地应用在食品、医药等领域。食品工业中，α-L-鼠李糖苷酶是柚苷酶和橙皮苷酶的主要活性成分，能够有效改善柑橘类果汁风味，去除苦味。且在酿酒工业中能明显提升酿酒过程中香味物质的比例。α-L-鼠李糖苷酶的应用极大地提升了软硬饮料的品质。在医疗与保健领域中，由于受到糖苷键的影响许多黄酮类化合物生物利用率比较低，而通过α-L-鼠李糖苷酶对黄酮类化合物苷进行水解，增加了黄酮类葡萄糖苷含量，更利于生物活性物质的吸收。

淫羊藿苷为小檗科植物淫羊藿(EpimediumbrevicornuMaxim)、箭叶淫羊藿(EpimediumsagittatumMaxim)、柔毛淫羊藿(EpimediumpubescensMaxim)或朝鲜淫羊藿(EpimediumkoreanumNakai)的干燥茎叶提取物。分子式C33H40015，分子量676.65，CAS号489-32-7。

淫羊藿苷有多种药理作用，并且其水解产物淫羊藿苷元已作为中药一类抗癌新药获批国家临床批件，并进入快速审批程序，并被多位权威专家认为是在中药现代化研究中，继青蒿素之后的又一重大成果。但淫羊藿苷元在淫羊藿属植物体内含量极低，现确实可行的获得方式为通过淫羊藿苷水解获得淫羊藿苷元。然而天然环境中，在淫羊藿草中淫羊藿苷的比例一般在2％以下，相对而言，朝藿定C的含量会比淫羊藿苷更丰富，通常是淫羊藿苷含量的5～6倍。通过水解朝藿定C可以制备淫羊藿苷。可采用生物酶促法催化含量较高的朝藿定C脱去一分子的鼠李糖转化为淫羊藿苷。因此研究淫羊藿苷的大规模工业生产并且环境友好的制备工艺，面对淫羊藿苷元的市场需求，极具现实意义。

生物催化法制备淫羊藿苷，因其步骤简单，条件温和，环境友好，具有很高的经济价值。生物催化法以淫羊藿苷粗提物为底物，α-L-鼠李糖苷酶水解除去朝藿定C的α-1,2鼠李糖苷键连接的末端鼠李糖，生成产物淫羊藿苷。但利用现有的α-L-鼠李糖苷酶酶催化淫羊藿苷粗提物，朝藿定C的转化率还不尽如人意。中国专利文献CN110066760A(申请号CN201910435031.2)公开了，重组AnRhaE全细胞催化水解淫羊藿提取物样品，于37℃进行催化反应90min可将朝藿定C完全转化为淫羊藿苷，但其转化的浓度与效率离工业化生产还有一定的距离。因此挖掘一种在混合样品中高效催化朝藿定C生成淫羊藿苷的酶，以指导大规模工业化生产淫羊藿苷极具社会价值。

发明内容

针对背景技术中提到的问题，本发明的目的是提供一种真菌来源的α-L-鼠李糖苷酶在高效生产淫羊藿苷中的应用，以解决背景技术中提到的问题。

本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：一种真菌来源的α-L-鼠李糖苷酶在高效生产淫羊藿苷中的应用，包括如下步骤：

步骤一、AmRhaE基因合成及重组表达α-L鼠李糖苷酶大肠杆菌构建；

根据木隆曲霉的鼠李糖苷水解酶AmRhaE基因进行密码子优化，以该基因为模板设计用于扩增AmRhaE引物序列对F和R；以上述引物对进行PCR扩增，将PCR产物采用1％琼脂糖凝胶电泳检测，纯化，并通过胶回收试剂盒进行回收，得到木隆曲霉的鼠李糖苷水解酶AmRhaE基因片段；

其中，上、下游引物F和R的序列如下:

F:5’-AGACCATGGAGATGTCCCTGTCCATTGCTA-3’，下划线表示NcoⅠ酶切位点；

R:5’-GCAGTCGACACCCAGGCTGCTCTCGAAAC-3’，下划线表示SalⅠ酶切位点；

NcoI和SalI限制性内切酶对纯化后的PCR产物和表达载体pET28a分别进行双酶切，回收基因及载体的酶切片段连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化产物涂布含50mg/L卡那霉素的LB平板，恒温培养过夜，挑取过夜培养的平板上的单菌落进行菌落PCR验证；将条带大小正确的菌落接种于LB液体培养基中培养，提取质粒进行序列测定；α-L-鼠李糖苷酶AmRhaE的编码基因大小为2589bp，通过序列比对得到测序正确重组质粒pET28a-AmRhaE；

步骤二、50mL体系诱导重组大肠杆菌发酵产α-L鼠李糖苷酶；

将测序正确的重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)，构建重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-AmRhaE；将上述重组菌株于含有50mg/L卡那霉素的LB平板划线培养；单菌落转接入5mL含有卡那霉素浓度为50mg/L的LB液体培养基中振荡培养；按1％的接种量转接至50mL含有卡那霉素浓度为50mg/mL的LB液体培养基中振荡培养；向培养物中加入异丙基硫代半乳糖苷至终浓度为0.5mM，以25℃/30℃/37℃继续振荡培养；

培养结束后吸取1mL培养物测定最终OD600值，并收集菌体；用20mL0.1MpH7.4的PB缓冲液重悬菌体，再进行离心，洗涤菌体除去残余培养基；以0.1MpH7.4的PB缓冲液重悬菌体，控制最终重悬菌液OD600值为20；使用超声细胞破碎仪对重悬菌液进行破碎，收集上清，即为α-L-鼠李糖苷酶粗酶液；

步骤三、5L发酵罐诱导重组大肠杆菌发酵产α-L鼠李糖苷酶；

将α-L-鼠李糖苷酶通过5L发酵罐放大培养，种子培养液按照5％接种量转接在装液量为2L的TY培养基中；

培养结束后吸取1mL培养物测定最终OD600值，离心收集菌体，用PB缓冲液重悬菌体，离心处理，洗涤菌体除去残余培养基，以PB缓冲液重悬菌体，控制最终重悬菌液OD600值为20，使用超声细胞破碎仪对重悬菌液进行破碎，收集上清，即为α-L-鼠李糖苷酶粗酶液；

步骤四、重组大肠杆菌全细胞催化水解淫羊藿提取物样品；

通过诱导发酵，获得表达AmRhaE的重组大肠杆菌细胞，利用PB缓冲液进行洗涤细胞，超声破碎细胞测定α-L-鼠李糖苷酶AmRhaE粗酶液的酶活，控制添加酶活在400U/mL，将34.7g的朝藿定C含量11.5％的淫羊藿苷粗提物，添加至1000mL的0.1M，OD600＝40，pH6的PB溶液中，得到朝藿定C为4g/L的反应体系，全细胞催化反应条件为45℃，500rpm，分别在0h、18h及24h吸取300μL反应液留样检测，加入乙醇终止反应；将反应液离心处理，经过有机滤膜过滤，得待测样品。

作为优选，还可以包括步骤五、重组AmRhaE粗酶液催化水解淫羊藿提取物样品；

收集发酵得到的细胞，以0.1M，pH7.4的PB缓冲液重悬菌体，控制最终重悬菌液OD600值为20，使用超声细胞破碎仪对重悬菌液进行破碎，破碎条件设置为功率300W破碎15min，脉冲1秒，暂停两秒，收集上清，即为α-L-鼠李糖苷酶粗酶液；

以未破碎的细胞为对照组，于45℃，220rpm进行α-L-鼠李糖苷酶粗酶液催化反应含4g/L朝藿定C的粗提物，分别在反应0h、24h及吸取300μL反应液，加入乙醇终止反应，将反应液离心处理，经过有机滤膜过滤，得待测样品。

作为优选，步骤一的PCR扩增选用高保真聚合酶进行，条件为预变性95℃，3min；扩增阶段30个循环，按照95℃，10s，58℃，30s，72℃，2min进行；延伸72℃，5min。

作为优选，步骤二和三的破碎条件为功率300W，脉冲1秒，暂停两秒，破碎15min。

综上所述，本发明主要具有以下有益效果：本发明通过将编码α-L-鼠李糖苷酶的基因序列连接至大肠杆菌表达载体pET28a上，在大肠杆菌宿主BL21(DE3)进行诱导表达。以0.5mMIPTG25℃诱导12h，获得重组酶酶活力为32U/mL，通过5L发酵罐优化放大，以0.5mMIPTG诱导12h，获得重组酶酶活力达197U/mL，相比于放大化表达前，酶活提高了6.15倍。

在添加重组细胞活力为400U/mL，催化水解浓度为含4g/L朝藿定C的淫羊藿苷粗提物，在24h，朝藿定C的转化率为97％。利用重组α-L-鼠李糖苷酶粗酶液进行淫羊藿粗提物的水解相比于全细胞转化，朝藿定C的水解率在反应24h时提高了16％。

附图说明

图1是本发明的单菌落进行菌落PCR验证的验证结果图；

图2是本发明使用超声细胞破碎仪对重悬菌液进行破碎的电泳结果图；

图3是本发明采用重组AmRhaE全细胞催化水解淫羊藿提取物样品时的待测样品进行HPLC分析的实验结果图；

图4是本发明采用重组AmRhaE粗酶液催化水解淫羊藿提取物样品时的待测样品进行HPLC分析的实验结果图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

一、建立培养基

LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L。加入15g/L琼脂粉以配置固体培养基。

TY培养基：蛋白胨12g/L，酵母粉8g/L，氯化钠3g/L，磷酸三钾4g/L，一水合柠檬酸2.1g/L，柠檬酸铁铵0.3g/L，甘油10g/L，硫酸铵2.5g/L，硫酸镁0.5g/L。

补料培养基：蛋白胨25g/L，酵母粉50g/L，甘油400g/L。

二、建立鼠李糖苷酶活力测定方法：

将底物对硝基苯基鼠李糖苷(pNPR)溶于50mMpH6.0的吗啉乙磺酸(MES)缓冲液，至pNPR终浓度为10mM。吸取200μL底物溶液，向其中加入400μL酶液，充分混合均匀。按照每孔50μL吸取反应液至96孔酶标板，置于合适的温度进行酶促反应，以加入150μL0.5M浓度的Na2CO3终止反应，并于405nm处测定吸光值。每组三个平行，5min、10min及20min终止一组反应并测定吸光度。

酶活定义：每分钟水解pNPR释放1μmol的对硝基苯酚为1个酶活单位(U)。

三、对硝基苯酚标曲制备：

将对硝基苯酚溶于50mMpH6.0的MES缓冲液，分别配制成终浓度为10μM，50μM，100μM，500μM及1mM的贮液，按照每孔50μL吸取至酶标板，并向其中加入150μL0.5M浓度的Na2CO3，于405nm处测定吸光值，制备对硝基苯酚标曲。

四、朝藿定C及淫羊藿苷HPLC测定：

采用Shimadzu高效液相色谱进行测定。LC条件：色谱柱，ThermoHypersilODS-2column；流动相A，超纯水；流动相B，乙腈；流速：1mL/min；柱温：40℃；进样量：10μL；检测器：紫外检测器A270。时间程序，0～22min25％B，22～30min62％B，30～40min90％B，40～47.5min25％B。

朝藿定C的转化率＝(初始朝藿定C浓度-反应后朝藿定C浓度)/初始朝藿定C浓度。

根据NCBI数据库的木隆曲霉(AspergillusMulundensis)的鼠李糖苷水解酶AmRhaE基因进行密码子优化，由金唯智公司进行基因合成，最终基因序列如SEQIDNO.3所示。以该基因为模板设计用于扩增AmRhaE引物序列对F和R。以上述引物对进行PCR扩增，选用PrimerStarMasterMix(Takara公司)高保真聚合酶进行，条件为预变性95℃，3min；扩增阶段30个循环，按照95℃，10s，58℃，30s，72℃，2min进行；延伸72℃，5min。将PCR产物采用1％琼脂糖凝胶电泳检测，纯化，并通过胶回收试剂盒进行回收，得到木隆曲霉(AspergillusMulundensis)的鼠李糖苷水解酶AmRhaE基因片段。

其中，上、下游引物F和R的序列如下:

NcoI和SalI限制性内切酶对纯化后的PCR产物和表达载体pET28a分别进行双酶切，回收基因及载体的酶切片段，LigationMix(Takara公司)22℃连接1h-1.5h，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化产物涂布含50mg/L卡那霉素的LB平板，37℃恒温培养过夜，挑取过夜培养的平板上的单菌落进行菌落PCR验证，验证结果如图1所示。将条带大小正确的菌落接种于5mLLB液体培养基中，37℃培养8-10h，提取质粒进行序列测定。α-L-鼠李糖苷酶AmRhaE的编码基因大小为2589bp，核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，通过序列比对得到测序正确重组质粒pET28a-AmRhaE。

步骤二、250mL体系诱导重组大肠杆菌发酵产α-L鼠李糖苷酶

将例1中测序正确的重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)，构建重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-AmRhaE(以转化有空载体的大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a为空白对照)。将上述重组菌株于含有50mg/L卡那霉素的LB平板划线，37℃培养12h。单菌落转接入5mL含有卡那霉素浓度为50mg/L的LB液体培养基，37℃，220rpm振荡培养12h。按1％的接种量转接至50mL含有卡那霉素浓度为50mg/mL的LB液体培养基，37℃，220rpm振荡培养至OD600值约为0.8，向培养物中加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.5mM，以25℃/30℃/37℃，220rpm继续振荡培养16h。

培养结束后吸取1mL培养物测定最终OD600值，以5000×g离心10min收集菌体。用20mL0.1MpH7.4的PB缓冲液重悬菌体，5000×g离心10min，洗涤菌体除去残余培养基。以0.1MpH7.4的PB缓冲液重悬菌体，控制最终重悬菌液OD600值为20。使用超声细胞破碎仪对重悬菌液进行破碎，破碎条件为：功率300W，脉冲1秒，暂停两秒，破碎15min。收集上清，即为α-L-鼠李糖苷酶粗酶液。电泳结果见图2。SDS-PAGE显示蛋白的分子量在95kDa左右，与预测分子量95.2kDa一致。

取粗酶液按鼠李糖苷酶活力测定方法测定酶活。实验结果显示在50mL培养体系下，25℃/30℃/37℃诱导表达，粗酶液酶活分别为32/17.25/15U/mL。

步骤三、35L发酵罐诱导重组大肠杆菌发酵产α-L鼠李糖苷酶

将例2中α-L-鼠李糖苷酶通过5L发酵罐放大培养，种子培养液按照5％(v/v)接种量转接在装液量为2L的TY培养基中，控制发酵温度为37℃，pH7.0-7.2之间，初始转速为300r/min，之后3h逐级升至600r/min,当pH开始上升时以45mL/h的速率进行匀速补料，补料培养基体积为每1L发酵体系补料300mL；当菌体培养至OD600为15-20左右时，加入終浓度约为0.5mMIPTG于25℃进行诱导表达12小时。

培养结束后吸取1mL培养物测定最终OD600值，以5000×g离心10min收集菌体。用20mL0.1MpH7.4的PB缓冲液重悬菌体，5000×g离心10min，洗涤菌体除去残余培养基。以0.1MpH7.4的PB缓冲液重悬菌体，控制最终重悬菌液OD600值为20。使用超声细胞破碎仪对重悬菌液进行破碎，破碎条件为：功率300W，脉冲1秒，暂停两秒，破碎15min。收集上清，即为α-L-鼠李糖苷酶粗酶液。

取粗酶液按鼠李糖苷酶活力测定方法测定酶活。实验结果显示在5L培养体系下，25℃诱导表达，粗酶液酶活为197U/mL，在例2的基础上提高了6.15倍

步骤四、重组AmRhaE全细胞催化水解淫羊藿提取物样品

通过诱导发酵，获得表达重组AmRhaE的大肠杆菌细胞，利用PB缓冲液(0.1MpH7.4)进行洗涤细胞。超声破碎细胞测定α-L-鼠李糖苷酶AmRhaE粗酶液的酶活，控制添加酶活在400U/mL。将34.7g的淫羊藿苷粗提物(朝藿定C含量11.5％)添加至1000mLPB溶液(0.1M，OD600＝40，pH6)中，得到朝藿定C为4g/L的反应体系。全细胞催化反应条件为45℃，500rpm。分别在0h、18h及24h吸取300μL反应液留样检测，加入700μL乙醇终止反应。将反应液于12000×g离心10min，经过0.22μm有机滤膜过滤，得待测样品。将待测样品进行HPLC分析，实验结果(见图3)

结果表明，重组AmRhaE全细胞催化条件催化水解淫羊藿苷提取物24h，朝藿定C转化率为97％。

步骤五、重组AmRhaE粗酶液催化水解淫羊藿提取物样品

收集发酵得到的细胞，以0.1MpH7.4的PB缓冲液重悬菌体，控制最终重悬菌液OD600值为20。使用超声细胞破碎仪对重悬菌液进行破碎，破碎条件设置为功率300W破碎15min，脉冲1秒，暂停两秒。收集上清，即为α-L-鼠李糖苷酶粗酶液。

以未破碎的细胞为对照组，于45℃，220rpm进行α-L-鼠李糖苷酶粗酶液催化反应含4g/L朝藿定C的粗提物，分别在反应0h、24h及吸取300μL反应液，加入700μL乙醇终止反应。将反应液于12000×g离心10min，经过0.22μm有机滤膜过滤，得待测样品，随后进行HPLC分析(见图4)

实验结果：催化水解淫羊藿苷提取物24h时，全细胞催化条件下朝藿定C转化率为85.99％，重组α-L-鼠李糖苷酶粗酶液催化条件下朝藿定C的转化率为97.26％。利用重组α-L-鼠李糖苷酶粗酶液进行淫羊藿粗提物的水解相比于全细胞转化，朝藿定C的水解率在反应24h时提高了13.10％。因此实验结果表明粗酶液催化效果优于全细胞转化。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

序列表

<110> 浙江熙正霖生物科技有限公司

<120> 真菌来源的α-L-鼠李糖苷酶在高效生产淫羊藿苷中的应用

<141> 2021-11-29

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 862

<212> PRT

<213> Aspergillus nomius

<400> 1

Met Ser Leu Ser Ile Ala Ser Val Thr Phe Glu His His Arg Ser Ala

1 5 10 15

Leu Gly Ile Gly Glu Pro Ser Pro Arg Ile Ser Trp Arg Phe Asp Gly

20 25 30

Thr Val Ser Asn Trp Thr Gln Ser Ala Tyr Glu Leu Glu Ile Gln Arg

35 40 45

Ala Gly Glu Ala Ser Thr Phe Arg Val Asn Ser Ser Asp Ser Val Leu

50 55 60

Val Pro Trp Pro Ala Asp Pro Leu Gln Ser Gly Glu Glu Ala Thr Val

65 70 75 80

Arg Val Arg Ala Phe Gly His Ser Asn Gln Pro Gly Ser Ser Trp Ser

85 90 95

Glu Pro Val Thr Val Glu Pro Gly Leu Leu Ser Ala Asp Asp Trp Gln

100 105 110

Gly Ala Val Ala Ile Val Ser Asp Arg Glu Thr Glu Val Asn Ala Thr

115 120 125

His Arg Pro Ile Tyr Phe Arg Lys Asp Phe Asp Val Asp Glu Glu Ile

130 135 140

Leu Ser Ala Arg Leu Tyr Ile Thr Ala Leu Gly Val Tyr Glu Ala Glu

145 150 155 160

Ile Asn Gly Gln Ala Val Gly Asp His Val Leu Ala Pro Gly Trp Gln

165 170 175

Ser Tyr Thr His Arg His Glu Tyr Asn Thr Tyr Asp Val Thr Asp Leu

180 185 190

Leu Gln Ala Gly Asp Asn Ala Ile Gly Val Thr Val Gly Glu Gly Trp

195 200 205

Tyr Ala Gly Ala Leu Ser Trp Asn Met Ile Arg Asn Ile Tyr Gly Asp

210 215 220

Thr Leu Gly Phe Leu Ser Leu Leu Ser Ile Thr Thr Ala Asn Gly Glu

225 230 235 240

Thr Ile Tyr Ile Pro Ser Asp Ser Thr Trp Thr Ser Ser Thr Gly Pro

245 250 255

Ile Val Ala Ser Glu Ile Tyr Asn Gly Glu Thr Tyr Asp Ser Thr Gln

260 265 270

Glu Ile Glu Gly Trp Ser Glu Pro Gly Phe Asp Ala Ser Asp Trp Leu

275 280 285

Gly Thr His Glu Val Glu Phe Asp Lys Ser Val Leu Ala Ala Pro Asp

290 295 300

Ala Pro Pro Val Arg Arg Ile Glu Glu Arg Lys Leu Glu Asn Val Phe

305 310 315 320

Lys Ser Ala Ser Gly Lys Thr Val Leu Asp Phe Gly Gln Asn Leu Val

325 330 335

Gly Trp Leu Arg Val Arg Val Lys Gly Pro Gln Gly Ser Thr Val Ser

340 345 350

Phe Leu His Thr Glu Val Met Glu Asn Gly Glu Val Ala Thr Arg Pro

355 360 365

Leu Arg Asn Ala Lys Ala Thr Asp Asn Leu Thr Leu Ser Gly Asp Asp

370 375 380

Gln Glu Trp Glu Pro Ser Phe Thr Phe His Gly Phe Arg Phe Val Gln

385 390 395 400

Val Thr Gly Trp Pro Glu Glu Thr Glu Leu Asp Ala Asp Ser Val Thr

405 410 415

Ala Ile Val Ile Asn Ser Asp Met Glu Gln Thr Gly Phe Phe Asn Cys

420 425 430

Ser Asn Pro Leu Leu Asn Lys Leu His Glu Asn Ile Ile Trp Ser Met

435 440 445

Arg Gly Asn Phe Phe Ser Ile Pro Thr Asp Cys Pro Gln Arg Asp Glu

450 455 460

Arg Leu Gly Trp Thr Gly Asp Ile Asn Ala Phe Ala Arg Thr Ala Asn

465 470 475 480

Phe Ile Tyr Asp Thr Ala Gly Phe Leu Arg Gly Trp Leu Lys Asp Val

485 490 495

His Ser Glu Gln Leu Glu Asn Asn Tyr Ala Pro Pro Phe Val Ile Pro

500 505 510

Asn Val Leu Ala Gly Trp Gly Ser Ala Ala Ser Ile Trp Gly Asp Ala

515 520 525

Ile Val Gly Val Pro Trp Ala Leu Phe Gln Thr Tyr Gly Asp Lys Gly

530 535 540

Met Leu Ala Glu Gln Tyr Ala Gly Ala Gln Leu Trp Leu Asp Lys Gly

545 550 555 560

Ile Leu Arg Asn Glu Ala Gly Leu Trp Asn Arg Ser Ser Phe Gln Phe

565 570 575

Ala Asp Trp Leu Asp Pro Leu Ala Pro Pro Asp Ser Pro Gly Asp Ala

580 585 590

Thr Thr Asn Lys Tyr Leu Val Ser Asp Ala Tyr Leu Ile His Ser Thr

595 600 605

Glu Met Val Ala Asn Ile Ser Ala Tyr Leu Glu Tyr Ser Glu Glu Ala

610 615 620

Glu Lys Tyr Ala Ala Asp Arg Val Asn Leu Thr Arg Ala Phe Gln Arg

625 630 635 640

Ala Trp Ile Ser Asn Asn Gly Thr Val Ala Asn Glu Thr Gln Thr Gly

645 650 655

Leu Thr Leu Pro Leu Tyr Phe Lys Leu Phe Ala Gln Pro Ser His Tyr

660 665 670

Thr Ala Ala Ala Ser Arg Leu Val Asp Ile Ile Glu Glu Asn Asp Tyr

675 680 685

Lys Val Gly Thr Gly Phe Ala Gly Thr His Leu Leu Gly His Thr Leu

690 695 700

Ser Gln Tyr Asn Ala Ser Ser Thr Phe Tyr Asn Thr Leu Leu Gln Glu

705 710 715 720

Asp Val Pro Gly Trp Leu Phe Gln Val Leu Met Asn Gly Thr Thr Thr

725 730 735

Trp Glu Arg Trp Asp Ser Ile Leu Ala Asn Gly Ser Val Asn Pro Gly

740 745 750

Glu Met Thr Ser Phe Asn His Tyr Ala Val Gly Ser Val Gly Ala Trp

755 760 765

Met His Glu Asn Ile Gly Gly Leu Lys Pro Leu Thr Pro Gly Trp Lys

770 775 780

Arg Phe Ala Val Asp Val Arg Val Gly Gly Asp Leu Thr Ser Ala Asn

785 790 795 800

Glu Arg Phe Val Ser Pro Tyr Gly Val Val Glu Ser Ser Trp Arg Val

805 810 815

Glu Asn Gly Leu Phe Arg Leu Ala Val Arg Val Pro Pro Asn Ser Glu

820 825 830

Ala Val Val Thr Leu Pro Gly Met Thr Arg Ser Gly Arg Lys Gln Val

835 840 845

Thr Val Gly Ser Gly Val His Arg Phe Glu Ser Ser Leu Gly

850 855 860

<210> 2

<211> 2589

<212> DNA

<213> Aspergillus nomius

<400> 2

atgtccctgt ccattgctag cgtgactttt gaacaccatc gtagcgccct gggtatcggc 60

gaaccatctc ctcgtatttc ctggcgtttc gacggtaccg tttctaactg gactcagagc 120

gcttacgaac tggaaatcca gcgcgcaggt gaagcgtcta cctttcgtgt taactccagc 180

gacagcgttc tggtgccgtg gccggctgac ccgctgcagt ccggcgaaga agctacggtt 240

cgtgtgcgtg cttttggtca ctccaaccag ccgggttctt cttggtctga accggtaacc 300

gtggaaccgg gcctgctgtc tgcggacgat tggcagggtg ctgtcgcaat tgttagcgac 360

cgtgagaccg aagtgaacgc aacccaccgt ccgatctact tccgtaaaga cttcgacgta 420

gacgaagaga tcctgagcgc ccgtctgtat attaccgcgc tgggtgttta cgaagcggag 480

atcaacggtc aggctgttgg cgatcacgtt ctggcgccgg gctggcagag ctacactcac 540

cgtcacgagt acaacacgta tgatgttact gacctgctgc aggctggcga taacgcaatc 600

ggcgtgaccg tcggcgaagg ctggtacgca ggtgctctga gctggaacat gatccgtaac 660

atctacggtg atactctggg cttcctgtcc ctgctgtcta tcaccactgc aaacggtgaa 720

actatttata tcccgtccga ctctacctgg acctccagca ccggtccgat tgttgcatct 780

gagatctaca acggtgagac ctacgatagc acccaggaaa ttgaaggttg gtctgagcca 840

ggcttcgatg cttctgactg gctgggtact catgaagtgg agttcgacaa atctgtcctg 900

gctgctccag acgcaccgcc ggttcgccgt atcgaggaac gtaaactgga gaacgtcttc 960

aaatctgcta gcggcaaaac cgtgctggat ttcggtcaga acctggttgg ttggctgcgc 1020

gtacgtgtta aaggcccaca gggctccacc gtgtcctttc tgcacaccga agttatggaa 1080

aacggtgagg ttgcaacccg tccactgcgt aacgcaaaag caactgataa cctgacgctg 1140

tctggcgatg accaggagtg ggaaccgtct ttcacttttc acggtttccg tttcgtacag 1200

gttactggtt ggccggaaga aaccgaactg gacgcggaca gcgttaccgc aattgtgatc 1260

aactctgata tggaacagac tggcttcttc aactgtagca atccactgct gaacaaactg 1320

catgaaaaca ttatttggtc tatgcgtggt aatttcttta gcatcccgac tgactgcccg 1380

cagcgtgatg aacgcctggg ttggacgggc gacatcaacg catttgcgcg tactgctaat 1440

tttatctacg ataccgctgg ctttctgcgt ggctggctga aagatgttca ttctgaacag 1500

ctggaaaaca actacgctcc gccattcgtt atcccgaatg ttctggcagg ctggggctcc 1560

gctgcgagca tctggggcga tgcaatcgtt ggcgttccgt gggcgctgtt ccagacttac 1620

ggtgacaagg gtatgctggc agaacagtat gctggtgccc agctgtggct ggacaaaggt 1680

attctgcgta acgaagcggg cctgtggaac cgctcttctt tccagtttgc agattggctg 1740

gatccgctgg cgccgccgga tagcccaggc gacgctacca ccaacaaata cctggtttct 1800

gacgcctacc tgattcatag cacggaaatg gtggcgaata tcagcgcgta cctggaatat 1860

tccgaagagg cggaaaaata cgcagctgat cgtgtgaacc tgactcgtgc gttccagcgt 1920

gcttggatta gcaacaacgg taccgtagct aatgaaactc agactggtct gaccctgcca 1980

ctgtacttca aactgttcgc acaaccgtct cattacacgg ccgcagcaag ccgtctggtt 2040

gatatcattg aagaaaacga ctacaaagtt ggtaccggtt tcgcaggtac ccatctgctg 2100

ggccatactc tgagccagta caacgctagc tctactttct ataacaccct gctgcaggaa 2160

gatgtaccag gttggctgtt ccaggttctg atgaacggta ccaccacctg ggaacgttgg 2220

gattccatcc tggctaacgg ttctgttaat ccgggcgaaa tgaccagctt caaccactat 2280

gcggtaggct ctgtaggtgc ttggatgcac gaaaacatcg gtggcctgaa gccgctgact 2340

cctggttgga aacgttttgc ggtagatgtg cgtgtcggtg gtgacctgac cagcgccaac 2400

gaacgtttcg tttctccata tggcgtcgtg gagtcttctt ggcgcgtcga aaacggcctg 2460

ttccgtctgg ccgttcgtgt tccaccgaac tctgaggcag ttgttacgct gcctggtatg 2520

actcgttctg gtcgtaaaca ggttacggtt ggctccggtg tacaccgttt cgagagcagc 2580

ctgggttaa 2589

<210> 3

<211> 2589

<212> DNA

<213> Aspergillus nomius

<400> 3

atgtccctgt ccattgctag cgtgactttt gaacaccatc gtagcgccct gggtatcggc 60

gaaccatctc ctcgtatttc ctggcgtttc gacggtaccg tttctaactg gactcagagc 120

gcttacgaac tggaaatcca gcgcgcaggt gaagcgtcta cctttcgtgt taactccagc 180

gacagcgttc tggtgccgtg gccggctgac ccgctgcagt ccggcgaaga agctacggtt 240

cgtgtgcgtg cttttggtca ctccaaccag ccgggttctt cttggtctga accggtaacc 300

gtggaaccgg gcctgctgtc tgcggacgat tggcagggtg ctgtcgcaat tgttagcgac 360

cgtgagaccg aagtgaacgc aacccaccgt ccgatctact tccgtaaaga cttcgacgta 420

gacgaagaga tcctgagcgc ccgtctgtat attaccgcgc tgggtgttta cgaagcggag 480

atcaacggtc aggctgttgg cgatcacgtt ctggcgccgg gctggcagag ctacactcac 540

cgtcacgagt acaacacgta tgatgttact gacctgctgc aggctggcga taacgcaatc 600

ggcgtgaccg tcggcgaagg ctggtacgca ggtgctctga gctggaacat gatccgtaac 660

atctacggtg atactctggg cttcctgtcc ctgctgtcta tcaccactgc aaacggtgaa 720

actatttata tcccgtccga ctctacctgg acctccagca ccggtccgat tgttgcatct 780

gagatctaca acggtgagac ctacgatagc acccaggaaa ttgaaggttg gtctgagcca 840

ggcttcgatg cttctgactg gctgggtact catgaagtgg agttcgacaa atctgtcctg 900

gctgctccag acgcaccgcc ggttcgccgt atcgaggaac gtaaactgga gaacgtcttc 960

aaatctgcta gcggcaaaac cgtgctggat ttcggtcaga acctggttgg ttggctgcgc 1020

gtacgtgtta aaggcccaca gggctccacc gtgtcctttc tgcacaccga agttatggaa 1080

aacggtgagg ttgcaacccg tccactgcgt aacgcaaaag caactgataa cctgacgctg 1140

tctggcgatg accaggagtg ggaaccgtct ttcacttttc acggtttccg tttcgtacag 1200

gttactggtt ggccggaaga aaccgaactg gacgcggaca gcgttaccgc aattgtgatc 1260

aactctgata tggaacagac tggcttcttc aactgtagca atccactgct gaacaaactg 1320

catgaaaaca ttatttggtc tatgcgtggt aatttcttta gcatcccgac tgactgcccg 1380

cagcgtgatg aacgcctggg ttggacgggc gacatcaacg catttgcgcg tactgctaat 1440

tttatctacg ataccgctgg ctttctgcgt ggctggctga aagatgttca ttctgaacag 1500

ctggaaaaca actacgctcc gccattcgtt atcccgaatg ttctggcagg ctggggctcc 1560

gctgcgagca tctggggcga tgcaatcgtt ggcgttccgt gggcgctgtt ccagacttac 1620

ggtgacaagg gtatgctggc agaacagtat gctggtgccc agctgtggct ggacaaaggt 1680

attctgcgta acgaagcggg cctgtggaac cgctcttctt tccagtttgc agattggctg 1740

gatccgctgg cgccgccgga tagcccaggc gacgctacca ccaacaaata cctggtttct 1800

gacgcctacc tgattcatag cacggaaatg gtggcgaata tcagcgcgta cctggaatat 1860

tccgaagagg cggaaaaata cgcagctgat cgtgtgaacc tgactcgtgc gttccagcgt 1920

gcttggatta gcaacaacgg taccgtagct aatgaaactc agactggtct gaccctgcca 1980

ctgtacttca aactgttcgc acaaccgtct cattacacgg ccgcagcaag ccgtctggtt 2040

gatatcattg aagaaaacga ctacaaagtt ggtaccggtt tcgcaggtac ccatctgctg 2100

ggccatactc tgagccagta caacgctagc tctactttct ataacaccct gctgcaggaa 2160

gatgtaccag gttggctgtt ccaggttctg atgaacggta ccaccacctg ggaacgttgg 2220

gattccatcc tggctaacgg ttctgttaat ccgggcgaaa tgaccagctt caaccactat 2280

gcggtaggct ctgtaggtgc ttggatgcac gaaaacatcg gtggcctgaa gccgctgact 2340

cctggttgga aacgttttgc ggtagatgtg cgtgtcggtg gtgacctgac cagcgccaac 2400

gaacgtttcg tttctccata tggcgtcgtg gagtcttctt ggcgcgtcga aaacggcctg 2460

ttccgtctgg ccgttcgtgt tccaccgaac tctgaggcag ttgttacgct gcctggtatg 2520

actcgttctg gtcgtaaaca ggttacggtt ggctccggtg tacaccgttt cgagagcagc 2580

ctgggttaa 2589

Claims

1.一种真菌来源的α-L-鼠李糖苷酶在高效生产淫羊藿苷中的应用，其特征在于：包括如下步骤：

其中，上、下游引物F和R的序列如下:

步骤二、50mL体系诱导重组大肠杆菌发酵产α-L鼠李糖苷酶；

步骤三、5L发酵罐诱导重组大肠杆菌发酵产α-L鼠李糖苷酶；

步骤四、重组大肠杆菌全细胞催化水解淫羊藿提取物样品；

2.根据权利要求1所述的真菌来源的α-L-鼠李糖苷酶在高效生产淫羊藿苷中的应用，其特征在于：还可以包括步骤五、重组AmRhaE粗酶液催化水解淫羊藿提取物样品；

3.根据权利要求1所述的真菌来源的α-L-鼠李糖苷酶在高效生产淫羊藿苷中的应用，其特征在于：步骤一的PCR扩增选用高保真聚合酶进行，条件为预变性95℃，3min；扩增阶段30个循环，按照95℃，10s，58℃，30s，72℃，2min进行；延伸72℃，5min。

4.根据权利要求1所述的真菌来源的α-L-鼠李糖苷酶在高效生产淫羊藿苷中的应用，其特征在于：步骤二和三的破碎条件为功率300W，脉冲1秒，暂停两秒，破碎15min。