CN110066760A

CN110066760A - 一种表达α-L-鼠李糖苷酶的重组大肠杆菌及其应用

Info

Publication number: CN110066760A
Application number: CN201910435031.2A
Authority: CN
Inventors: 周景文; 陈坚; 吕云斌; 曾伟主; 堵国成
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Shaanxi Liangwei Bioengineering Co.,Ltd.
Priority date: 2019-05-23
Filing date: 2019-05-23
Publication date: 2019-07-30
Anticipated expiration: 2039-05-23
Also published as: CN110066760B

Abstract

本发明公开了一种表达α‑L‑鼠李糖苷酶的重组大肠杆菌及其应用，属于基因工程技术与生物医药领域。将编码序列为SEQ ID NO.2所述序列在大肠杆菌BL21(DE3)中进行异源表达，用0.5μmol/L IPTG进行诱导并获得活力为5.6U/L的重组鼠李糖苷水解酶。该重组酶具有特异性水解芦丁、橙皮苷、柚皮苷、新橙皮苷以及朝藿定C鼠李糖苷的活性。重组酶添加量为460U/L时，90min内完全催化水解1g/L的朝藿定C生成唯一产物淫羊藿苷。

Description

一种表达α-L-鼠李糖苷酶的重组大肠杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及一种表达α-L-鼠李糖苷酶的重组大肠杆菌及其应用，属于基因工程及生物医药技术领域。

背景技术

α-L-鼠李糖苷酶(EC3.2.1.40)是一种能够特异性地水解鼠李糖苷键的水解酶，在自然界中分布广泛。该酶能够专一、高效地水解多种存在α-鼠李糖苷键的糖苷类物质，如柚皮苷(naringin)、芦丁(rutin)、橙皮苷(hesperidin)以及朝藿定C(epimedin C)等，释放鼠李糖。α-L-鼠李糖苷酶主要来源于微生物，在细菌(芽胞杆菌属、乳杆菌属、单胞菌属等)以及真菌(曲霉、木酶、青霉等)中均有多种α-L-鼠李糖苷酶被报道过。

α-L-鼠李糖苷酶被广泛地运用在食品、医药等领域。食品工业中，α-L-鼠李糖苷酶是柚苷酶和橙皮苷酶的主要活性成分，能够有效地除去柑橘类果汁中存在的苦味，并且能够改善和提升酿酒过程中的香气，α-L-鼠李糖苷酶的应用极大地提升了软硬饮料的品质。医疗与保健领域中，许多黄酮类化合物的生物利用度受到糖苷键的影响，通过利用α-L-鼠李糖苷酶对黄酮芸香糖苷进行水解，增加了黄酮类葡萄糖苷含量，更利于生物活性物质的吸收。

多数从植物中提取的糖苷类黄酮化合物都含有一个或者多个鼠李糖基(包括黄酮3位以及7位)，较为常见的有芦丁、橙皮苷、柚皮苷、新橙皮苷以及朝藿定C等。该系列黄酮化合物中，鼠李糖基的存在很大程度上影响了它们的溶解性以及生物活性。利用生物或者化学的手段，将其中的鼠李糖基水解不仅能够极大改善溶解性，提高人体对黄酮类化合物的吸收率，更能够提高黄酮化合物的生物学活性。酶法水解具有温和、高效、专一等特点，适合用于鼠李糖苷类黄酮化合物的水解，因而，高催化活性的黄酮鼠李糖苷水解酶具有巨大的应用潜力。

然而，不是所有有鼠李糖基的化合物都能被α-L-鼠李糖苷酶水解。α-鼠李糖苷键的类型有多种，包括α-1、α-1,2以及α-1,6，配糖基又有黄酮母核C-3、C-7、葡萄糖苷以及鼠李糖苷等多种。另外，α-L-鼠李糖苷酶的水解作用具有高度的催化专一性，某一特定来源的鼠李糖苷酶往往只能水解一种或两种糖苷键。目前，有报道的糖苷水解酶作用的糖苷键主要为鼠李糖苷-α-1,2-葡萄糖苷，针对朝藿定C的鼠李糖苷-α-1，2-鼠李糖苷键，仅有唯一的鼠李糖苷酶报道具有催化活性。2018年，南京林业大学研究报道，来源于多形拟杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron)的鼠李糖苷酶能够催化水解朝藿定C，在最适条件下，4小时内按3500U/g底物催化浓度为1g/L的朝藿定C水解率达到90.5％。然而，利用全细胞体系进行催化朝藿定C水解的研究未见报道，针对混有其他糖苷类黄酮如淫羊藿提取物的水解尚未有研究。

目前，生产α-L-鼠李糖苷酶的常用方法是曲霉发酵法，酶活最高可达2500 U/mL。虽然，利用曲霉发酵能够获得较高的α-L-鼠李糖苷酶活性，但是其发酵时间往往需要96h以上。另外曲霉发酵法获得的产物中，掺杂其他多种糖苷水解酶，为下游的分离纯化造成巨大的困难，需要非常精细的分离纯化步骤才能保证获得高纯度的特定α-L-鼠李糖苷酶，以实现专一性的水解催化应用。发酵时间过久及分离纯化困难的缺陷，限制了曲霉发酵法生产α-L-鼠李糖苷酶的工业生产利用。因此，挖掘一种能够特异性水解朝藿定C的α-L-鼠李糖苷酶，并将其在大肠杆菌中进行重组表达，对工业化应用具有重要的指导意义。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种重组大肠杆菌，是以大肠杆菌为宿主，表达了α-L-鼠李糖苷酶，所述α-L-鼠李糖苷酶含SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌以pET系列载体为表达载体。

在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主。

在本发明的一种实施方式中，编码上述α-L-鼠李糖苷酶的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

本发明的第二个目的是提供上述重组大肠杆菌的构建方法，所述方法包括以下步骤：

(1)合成α-L-鼠李糖苷酶基因；

(2)将α-L-鼠李糖苷酶基因与表达载体连接，获得pET28a-AnRhaE；

(3)将pET28a-AnRhaE转化至大肠杆菌中。

本发明的第三个目的是提供上述重组大肠杆菌在水解朝藿定C中的应用。

本发明的第四个目的是提供上述重组大肠杆菌在水解淫羊藿次苷II中的应用。

本发明的第五个目的是提供上述重组大肠杆菌在水解芦丁或柚皮苷中的应用。

本发明的第六个目的是提供上述重组大肠杆菌在水解橙皮苷或新橙皮苷中的应用。

本发明的有益效果：

本发明通过将编码α-L-鼠李糖苷酶的基因序列连接至大肠杆菌表达载体pET28a上，在大肠杆菌宿主BL21(DE3)进行诱导表达。以0.5μmol/L IPTG诱导16h，获得重组酶酶活力为5.6 U/L，通过5 L发酵罐优化放大，以0.5μmol/L IPTG诱导7h，获得重组酶酶活力达574U/L，相比于放大化表达前，酶活提高了100倍。

在添加重组细胞活力为460 U/L(干重4g/L)，催化水解浓度为1g/L的朝藿定C，在90min内完全水解。利用重组细胞进行淫羊藿混合样品的水解，添加重组细胞活力为460 U/L，90min内催化1g/L(淫羊藿苷纯度为50％)淫羊藿粗提样品中的朝藿定C和鼠李糖基淫羊藿次苷II，完全水解为淫羊藿苷和宝藿苷I，而不水解其他组分或者产生其他产物。

附图说明

图1：AnRhaE重组大肠杆菌表达SDS-PAGE电泳结果。

图2：AnRhaE水解朝藿定C1,2-鼠李糖苷键HPLC图谱。

图3：AnRhaE鼠李糖苷水解酶催化水解朝藿定C。

图4：AnRhaE水解芦丁及柚皮苷的1,6-鼠李糖苷键HPLC图谱，A：芦丁；B柚皮苷。

图5：AnRhaE水解橙皮苷及新橙皮苷的1,2-鼠李糖苷键HPLC图谱，A：橙皮苷；B：新橙皮苷。

图6：AnRhaE水解淫羊藿粗提品HPLC图谱。

具体实施方式

(一)培养基

LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L。加入20g/L琼脂条，以配制LB固体培养基。

TB培养基：蛋白胨12g/L，酵母粉24g/L，磷酸二氢钾2.31g/L，磷酸氢二钾12.54g/L，甘油4g/L。

(二)鼠李糖苷酶活力测定方法：将底物对硝基苯基鼠李糖苷(pNPR)溶于50mMpH6.0的吗啉乙磺酸(MES)缓冲液，至pNPR终浓度为10mM。吸取200μL底物溶液，向其中加入400μL酶液，充分混合均匀。按照每孔50μL吸取反应液至96孔酶标板，置于合适的温度进行酶促反应，以加入150μL0.5 M浓度的Na₂CO₃终止反应，并于405nm处测定吸光值。每组三个平行，每20min终止一组反应并测定吸光度，共记录1h内吸光度值变化。

酶活力定义为：在pH6.0和37℃的反应条件下，每分钟生成1μmol对硝基苯酚所需酶量为1 U。

(三)对硝基苯酚标曲制备：将对硝基苯酚溶于50mM pH6.0的MES缓冲液，分别配制成终浓度为10μM，50μM，100μM，500μM，1mM，5mM以及10mM的贮液，按照每孔50μL吸取至酶标板，并向其中加入150μL0.5 M浓度的Na₂CO₃，于405nm处测定吸光值，制备对硝基苯酚标曲。

(四)朝藿定C及淫羊藿苷HPLC测定：采用Shimadzu高效液相色谱进行测定。LC条件：色谱柱，Thermo Hypersil ODS-2column；流动相A，含有1‰甲酸的超纯水；流动相B，含有1‰甲酸的乙腈；流动相比例条件，0-10min，10-40％B，10-30min，40-80％B，30-35min，80-80％B，35-37min，80-10％B，37-40min，10-10％B；流速：1mL/min；柱温：30℃；进样量：10μL；检测器：紫外检测器A290。

实施例1 AnRhaE基因合成及重组表达α-L鼠李糖苷酶大肠杆菌构建

根据NCBI数据库的构巢曲霉(Aspergillus nidulans)的鼠李糖苷水解酶AnRhaE基因进行密码子优化，由金唯智公司进行基因合成，最终基因序列如SEQ ID NO.2所示。

设计用于扩增AnRhaE序列的引物对F：TTA AGA AGG AGA TAT ACC ATG GCA ATGTCT TTG TCT ATA TCT GGT GT，R：GTG CGG CCG CAA GCT TGT CGACAC CTAAAG TTG ATTCGA ATC TAT。以合成序列为模板，以该引物对进行PCR扩增，选择Primer Star MasterMix(Takara公司)高保真pfu酶进行，条件为预变性95℃，3min；扩增阶段30个循环，按照95℃，10s，53℃，5s，72℃，2min进行；延伸72℃，5min。将PCR产物进行产物纯化，将载体pET28a进行Nco I和Sal I双酶切及产物纯化，用Infusion-Cloning的方法将两步纯化片段重组为载体pET28a-AnRhaE，并转化大肠杆菌JM109。得到的载体送金唯智测序，比对正确后转化大肠杆菌BL21(DE3)。

实施例2诱导重组大肠杆菌发酵产α-L鼠李糖苷酶

将构建完成的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a–AnRhaE(以转化有空载体的菌株BL21(DE3)/pET28a作为对照)于含有卡那霉素浓度为50μg/mL的LB平板划线，37℃培养12h。挑取单菌落转接入5mL含有卡那霉素浓度为50μg/mL的LB液体培养基，37℃ 220rpm振荡培养12h。按照1％的接种量转接至100mL含有卡那霉素浓度为50μg/mL的TB液体培养基，37℃220rpm振荡培养至OD₆₀₀值为0.8。向培养物中加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.5μmol/L，以25℃，220rpm继续振荡培养16h。

培养结束吸取1mL培养物测定最终OD₆₀₀值，以5000×g离心10min收集菌体。用20mL0.1 M pH7.4的PB缓冲液重悬菌体，5000×g离心10min，洗涤菌体除去残余培养基。以0.1M pH7.4的PB缓冲液重悬菌体，控制最终重悬菌液OD₆₀₀值为5。使用高压均质机对重悬菌液进行破碎，设置工作压力为1400bar，工作一个循环。破碎完成后，收集破碎液，以12000×g离心10min，收集上清，即为α-L-鼠李糖苷酶粗酶液。电泳结果见图1。获得的重组酶酶活力为5.6 U/L。通过5 L发酵罐优化放大，在通气量2.5vvm，搅拌转速为400r/min，恒速12g/h流加甘油补料的条件下，以0.5μmol/L IPTG诱导7h，获得的重组酶酶活力为574 U/L，相比于放大化表达前，酶活提高了100倍。

实施例3重组AnRhaE水解朝藿定C鼠李糖苷-α-1,2-鼠李糖苷键

制备重组α-L-鼠李糖苷酶酶液，以pNPR测定酶活力。吸取40μL重组α-L-鼠李糖苷酶酶液至1.5mL离心管，加入10μL朝藿定C溶液(浓度1g/L，溶于无水乙醇)，添加去离子水150μL。于37℃条件下进行催化反应，每60min向离心管内加入200μL无水乙醇，终止反应。将反应液于12000×g离心10min，经过0.22μm有机滤膜过滤，进行HPLC分析(见图2)。重组α-L-鼠李糖苷酶具有水解朝藿定C的3位鼠李糖苷-α-1,2-鼠李糖苷键的活性，当添加活力为460U/L，90min完全催化水解1g/L朝藿定C生成淫羊藿苷(见图3)。

实施例4重组AnRhaE水解芦丁及橙皮苷α-1,6-鼠李糖苷键

制备重组α-L-鼠李糖苷酶酶液，以pNPR测定酶活力。通过底物芦丁和橙皮苷的水解实验，确定AnRhaE对α-1,6-鼠李糖苷键的水解活性。吸取40μL至1.5mL离心管，分别加入10μL芦丁和橙皮苷溶液(浓度1g/L，溶于无水乙醇)，添加去离子水150μL。于37℃条件下进行催化反应，每60min向离心管内加入200μL无水乙醇，终止反应。将反应液于12000×g离心10min，经过0.22μm有机滤膜过滤，进行HPLC分析。证明重组α-L-鼠李糖苷酶具有水解芦丁的3位葡萄糖苷-α-1,6-鼠李糖苷键的活性，以及水解橙皮苷7位葡萄糖苷-α-1,6-鼠李糖苷键的活性(见图4)。

实施例5重组AnRhaE水解柚皮苷及新橙皮苷α-1,2-鼠李糖苷键

制备重组α-L-鼠李糖苷酶酶液，以pNPR测定酶活力。通过底物柚皮苷和新橙皮苷的水解实验，确定AnRhaE对α-1,2-鼠李糖苷键的水解活性。吸取40μL至1.5mL离心管，加入10μL柚皮苷及新橙皮苷溶液(浓度1g/L，溶于无水乙醇)，添加去离子水150μL。于37℃条件下进行催化反应，每60min向离心管内加入200μL无水乙醇，终止反应。将反应液于12000×g离心10min，经过0.22μm有机滤膜过滤，进行HPLC分析。重组α-L-鼠李糖苷酶具有水解柚皮苷的7位葡萄糖苷-α-1,2-鼠李糖苷键的活性，以及水解新橙皮苷的7位葡萄糖苷-α-1,2-鼠李糖苷键的活性(见图5)。

实施例6重组AnRhaE全细胞催化水解淫羊藿提取物样品

通过诱导发酵，获得表达重组AnRhaE的大肠杆菌细胞，利用PB缓冲液(0.1 MpH7.4)进行洗涤细胞后。将重组细胞添加至淫羊藿粗提品溶液中，至其终浓度为1g/L，细胞浓度为16 OD(干重4g/L，活力460 U/L)。吸取500μL重悬细胞加入2000μL浓度1.25g/L的淫羊藿粗提品(溶于PB缓冲液，50％淫羊藿苷纯度)。于37℃条件下进行催化反应，每30min向离心管内吸取500μL，加入至500μL甲醇中终止反应。将反应液于12000×g离心10min，经过0.22μm有机滤膜过滤，进行HPLC分析(见图6)。

结果表明，重组AnRhaE全细胞可在90min内催化1g/L(淫羊藿苷纯度为50％)淫羊藿粗提样品中的朝藿定C和鼠李糖基淫羊藿次苷II，完全水解为淫羊藿苷和宝藿苷I，而不水解其他组分或者产生其他产物。

对比例1其他来源的鼠李糖苷酶经过密码子优化在大肠杆菌中重组表达，及其与构巢曲霉来源α-L-鼠李糖苷酶对比

粪堆梭菌、嗜酸乳杆菌以及黑曲霉来源的鼠李糖苷酶(经过密码子优化后)基因序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示，人工合成该基因序列，将其转入大肠杆菌中重组表达，其余条件同实施例1和2。其中粪堆梭菌和黑曲霉来源的鼠李糖苷酶在大肠杆菌中都没有得到活性表达，形成无活性的包涵体。嗜酸乳杆菌得到了活性表达，其鼠李糖苷酶活力为12.5 U/L，然而该来源的鼠李糖苷酶并未检测到催化水解朝藿定C的活力。

不同来源的鼠李糖苷酶对于pNPR、芦丁、橙皮苷、柚皮甘、新橙皮苷、朝藿定C的水解活性如表1所示。

表1不同来源的鼠李糖苷酶对于含鼠李糖苷键物质的水解活性

组别

pNPR

芦丁

橙皮苷

柚皮苷

新橙皮苷

朝藿定C

AnRhaR(黑曲霉)

ND

AnRhaE(构巢曲霉)

√

√(极弱)

√

CsRamA(粪堆梭菌)

ND

LaRamA(嗜酸乳杆菌)

√

ND

√

ND

CK(对照)

ND

ND表示未检测到活性，√表示检测到相关水解活性。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种表达α-L-鼠李糖苷酶的重组大肠杆菌及其应用

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 861

<212> PRT

<213> Aspergillus nidulans

<400> 1

Met Ser Leu Ser Ile Ser Gly Val Thr Phe Glu His His Arg Ser Ala

1 5 10 15

Leu Gly Ile Gly Glu Pro Ser Pro Arg Ile Ser Trp Arg Phe Asp Gly

20 25 30

Thr Val Ser Asn Trp Thr Gln Ser Ala Tyr Glu Ile Glu Ile Asn Arg

35 40 45

Ala Gly Gln Ala Asn Thr Phe Arg Val Asn Ser Ser Asp Ser Val Leu

50 55 60

Val Pro Trp Pro Ser Asp Pro Leu Gln Ser Gly Glu Glu Ala Thr Val

65 70 75 80

Arg Val Arg Ser Phe Gly Arg Ala Asn Gln Pro Asp Ala Pro Trp Ser

85 90 95

Asp Pro Val Thr Val Glu Pro Gly Leu Leu Asp Glu Asp Asp Trp Gln

100 105 110

Ser Ala Val Ala Ile Val Ser Asp Arg Glu Thr Glu Val Asn Ala Thr

115 120 125

His Arg Pro Ile Tyr Phe Arg Lys Asp Phe Asp Val Asp Glu Glu Ile

130 135 140

Leu Ser Ala Arg Leu Tyr Ile Thr Ala Leu Gly Val Tyr Glu Ala Glu

145 150 155 160

Ile Asn Gly Gln Pro Val Gly Asp His Val Leu Ala Pro Gly Trp Gln

165 170 175

Ala Tyr Ser His Arg His Glu Tyr Asn Thr Tyr Asp Val Thr Asp Leu

180 185 190

Leu Gln Thr Gly Asp Asn Thr Ile Gly Val Thr Val Gly Glu Gly Trp

195 200 205

Tyr Ala Gly Ala Leu Thr Trp Ser Met Thr Arg Asn Ile Tyr Gly Asp

210 215 220

Thr Leu Gly Leu Leu Ser Leu Leu Ser Ile Ala Thr Ala Asp Gly Lys

225 230 235 240

Thr Ile Tyr Val Pro Ser Asp Glu Thr Trp Gln Ser Ser Thr Gly Pro

245 250 255

Ile Ile Ala Ser Glu Ile Tyr Asn Gly Glu Thr Tyr Asp Ser Thr Gln

260 265 270

Ala Ile Glu Gly Trp Ser Gln Pro Gly Phe Asp Ala Ser Gly Trp Leu

275 280 285

Gly Thr His Glu Val Thr Phe Asp Lys Ser Val Leu Ala Ala Pro Asp

290 295 300

Ala Pro Ala Val Arg Arg Val Glu Glu Arg Arg Leu Glu Ser Val Phe

305 310 315 320

Lys Ser Ala Ser Gly Lys Thr Val Leu Asp Phe Gly Gln Asn Leu Val

325 330 335

Gly Trp Leu Arg Val Arg Val Lys Gly Pro Arg Gly Ser Thr Ile Ser

340 345 350

Phe Val His Thr Glu Val Met Glu Asn Gly Glu Val Ala Thr Arg Pro

355 360 365

Leu Arg Asn Ala Lys Ala Thr Asp Asn Leu Thr Leu Ser Gly Glu Glu

370 375 380

Gln Glu Trp Glu Pro Ser Phe Thr Phe His Gly Phe Arg Tyr Val Gln

385 390 395 400

Val Thr Gly Trp Pro Glu Glu Thr Glu Leu Asn Ala Asp Ser Val Thr

405 410 415

Ala Ile Val Ile Asn Ser Asp Met Glu Gln Thr Gly Phe Phe Ser Cys

420 425 430

Ser Asn Pro Leu Leu Asn Lys Leu His Glu Asn Ile Ile Trp Ser Met

435 440 445

Arg Gly Asn Phe Leu Ser Ile Pro Thr Asp Cys Pro Gln Arg Asp Glu

450 455 460

Arg Leu Gly Trp Thr Gly Asp Ile His Ala Phe Ala Arg Thr Ala Asn

465 470 475 480

Phe Ile Tyr Asp Thr Ser Gly Phe Leu Arg Gly Trp Leu Arg Asp Ala

485 490 495

Tyr Ser Glu Gln Leu Glu Asn Asn Tyr Ala Pro Pro Tyr Val Ile Pro

500 505 510

Asn Val Leu Gly Pro Gly Ser Pro Thr Ser Ile Trp Gly Asp Ala Ile

515 520 525

Val Ser Val Pro Trp Asp Leu Phe Gln Thr Tyr Gly Asp Lys Ala Met

530 535 540

Leu Ser Glu Gln Tyr Ala Gly Ala Thr Ala Trp Leu Asp Lys Gly Ile

545 550 555 560

Leu Arg Asn Glu Ala Gly Leu Trp Asn Arg Ser Thr Phe Gln Tyr Ala

565 570 575

Asp Trp Leu Asp Pro Leu Ala Pro Pro Asp Asp Pro Gly Ala Ala Thr

580 585 590

Thr Asn Lys Tyr Leu Val Ser Asp Ala Tyr Leu Ile His Ser Thr Glu

595 600 605

Leu Val Ala Asn Ile Ser Ala Tyr Leu Asp Arg Pro Asp Asp Ala Glu

610 615 620

Arg Tyr Ala Ala Asp Arg Ala Asp Leu Thr Arg Ala Phe Gln Lys Ala

625 630 635 640

Trp Ile Ser Ala Asn Gly Thr Val Ala Asn Glu Thr Gln Thr Gly Leu

645 650 655

Thr Leu Pro Leu Tyr Phe Lys Leu Phe Glu Arg Pro Glu His Tyr Thr

660 665 670

Asp Ala Val Ser Arg Leu Val Asp Ile Ile Lys Glu Asn Glu Tyr Lys

675 680 685

Val Gly Thr Gly Phe Ala Gly Thr His Leu Leu Gly His Thr Leu Ser

690 695 700

Ala Tyr Asn Ala Ser Ser Thr Phe Tyr Asn Thr Leu Leu Gln Glu Asp

705 710 715 720

Val Pro Gly Trp Leu Phe Gln Val Leu Met Asn Gly Thr Thr Thr Trp

725 730 735

Glu Arg Trp Asp Ser Met Leu Ala Asn Gly Ser Val Asn Pro Gly Glu

740 745 750

Met Thr Ser Phe Asn His Tyr Ala Val Gly Ser Val Gly Ala Trp Met

755 760 765

His Glu Asn Ile Gly Gly Leu Arg Pro Ile Glu Pro Gly Trp Arg Arg

770 775 780

Phe Ala Val Asp Val Lys Val Gly Gly Gly Leu Ser Ser Ala Gln Glu

785 790 795 800

Arg Phe Leu Ser Pro Tyr Gly Ser Ala Glu Ser Ser Trp Glu Val Arg

805 810 815

Asp Gly Lys Phe Met Leu Gly Val Lys Val Pro Pro Asn Ser Glu Ala

820 825 830

Val Val Ser Leu Pro Gly Ala Pro Thr Arg Gly Lys Lys Glu Val Ile

835 840 845

Val Gly Ser Gly Met His Arg Phe Glu Ser Thr Leu Gly

850 855 860

<210> 2

<211> 2586

<212> DNA

<213> Aspergillus nidulans

<400> 2

atgtctttgt ctatatctgg tgttactttt gaacatcata gatcagcttt gggtattggt 60

gagccatctc ctaggatttc ttggagattt gacggtacag tttctaattg gacacaatct 120

gcatatgaaa ttgaaattaa cagagctggt caagctaata ctttcagagt taattcttca 180

gattcagtct tggttccttg gccatctgat cctttgcagt ctggtgaaga ggctactgtc 240

agagttcgtt ctttcggtag agctaatcaa ccagacgctc catggtcaga tcccgttact 300

gtcgaacccg gtttgttgga tgaggatgac tggcagtcag ctgtcgctat tgtctctgat 360

cgtgagacag aggtcaatgc tactcatcgt cctatatact ttaggaaaga ttttgatgtt 420

gatgaggaaa ttttgtctgc aagattgtac ataacagctt taggtgttta tgaggctgaa 480

attaacggac agcccgttgg tgaccacgtc ttggctcccg gttggcaagc ttactcacac 540

agacatgaat ataacactta tgatgtcaca gacttattgc aaactggtga caacactatt 600

ggtgtcactg tcggtgaagg atggtatgct ggtgcattga cttggtcaat gactagaaat 660

atttatggtg atactttggg tttattgtct ttgttgtcaa ttgctactgc agatggtaaa 720

acaatttacg ttccatctga cgaaacttgg caatcttcta ctggtcctat tattgcttct 780

gaaatttata atggagaaac atacgattca actcaagcta ttgagggttg gtcacaaccc 840

ggtttcgatg cttctggttg gttgggaact catgaggtca catttgataa atctgttttg 900

gctgctccag atgcaccagc agttaggagg gttgaggaaa ggagattgga gtcagttttt 960

aaatcagctt ctggtaagac agtcttagac tttggtcaga atttagttgg ttggttgaga 1020

gttagggtca agggtccaag aggttctaca atttctttcg ttcacacaga ggtcatggag 1080

aacggtgaag ttgctacaag gcctttgagg aatgcaaaag ctactgataa tttaacattg 1140

tctggtgagg agcaagagtg ggagccatct ttcacattcc atggttttag atacgtccaa 1200

gttactggat ggcccgaaga aactgagttg aacgctgatt cagttactgc tattgtcatt 1260

aactctgaca tggagcagac tggtttcttt tcttgttcaa atccattgtt aaataaattg 1320

catgaaaaca ttatttggtc aatgagaggt aattttttgt caattccaac agactgccca 1380

caaagagatg aaaggttggg atggactggt gatattcacg catttgcaag aactgctaac 1440

ttcatttatg acacttctgg tttcttgagg ggttggttga gggacgctta ctcagagcaa 1500

ttggaaaata attatgctcc accatatgtt attcctaacg ttttgggtcc cggttctcct 1560

acatctattt ggggagacgc tattgtttct gttccatggg atttatttca aacatatggt 1620

gataaagcta tgttgtctga acaatacgct ggcgcaacag cttggttgga caagggtatt 1680

ttgaggaacg aggctggttt gtggaatcgt tctacatttc aatacgcaga ctggttggat 1740

ccattggctc caccagatga ccccggtgct gctacaacta acaaatattt agtctctgat 1800

gcttatttga ttcattctac tgaattggtt gcaaatatat ctgcatattt ggatcgtccc 1860

gatgatgctg agagatacgc agctgataga gctgatttga ctagggcttt ccaaaaagct 1920

tggatttctg caaatggtac agttgcaaat gaaacacaaa ctggtttgac attgccattg 1980

tattttaagt tattcgaaag acccgaacac tacacagacg cagtctcaag gttggttgat 2040

attataaagg aaaatgaata taaggtcggt actggtttcg ctggtactca cttgttgggt 2100

catacattgt cagcatataa tgcatcttct actttctaca acactttgtt gcaagaagac 2160

gtccccggtt ggttgtttca agttttgatg aacggtacaa ctacatggga gagatgggat 2220

tctatgttgg caaacggttc agtcaacccc ggtgaaatga cttcttttaa ccattacgca 2280

gtcggatcag ttggtgcatg gatgcacgag aacattggtg gtttgaggcc tattgagccc 2340

ggttggagga gattcgctgt tgacgtcaag gtcggaggag gattgtcttc agcacaagaa 2400

aggtttttat ctccatacgg ttcagctgag tcatcatggg aggtcagaga tggtaagttt 2460

atgttgggtg tcaaggtccc acctaactct gaggcagttg tctctttgcc cggtgctcca 2520

acaagaggaa agaaggaggt cattgtcggt tctggtatgc atagattcga atcaacttta 2580

ggttaa 2586

<210> 3

<211> 2631

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atgatgagag tttataattt aaagacaaat aggattaaaa atcctatggg ttttgttatt 60

aataagccaa agttatcatg gttagtcgaa tcagacacag ctaagcacca agttgcagct 120

caagttgaga tatctgctga cattaatttc gagaacatta tttttgattc tggtaaaagg 180

actgacatag attctatttc ttactcacca caagtcgaat tgaagcctag gactagatac 240

tactggagag tcagagtttg gggtgacgat ggttctgagg ctgtctcaga ggctgcttgg 300

ttcgagacat ctaagatgga tgaaccatgg aaggctaagt ggattactcc cgattttgac 360

ccttcagtcc acccagtcgt cttcactgat ttctcaattg aaagggacgt cgctgacgca 420

agggcatacg tctgcggttt gggtttgtac gagatgtctg tcaacggtga gaagactggt 480

gacgagtact tagctcccgg tttggtcgca tacgacaaat ggattcctta tcagacatac 540

gacataactt ctcagttgaa aaagggtatt aatacagctg agtttttgtt gggtaatggt 600

tggtataaag gtagatatgg tttgaatcgt aagcagcctt ttcgttacgg taacgagttc 660

gctttgatat gtgaaataca cataacttat caagatggta cagctgatgt catatacact 720

gatacatctt ggaaagcaag aaagtcaaag gtcattgact ctggtattta tgatggtgaa 780

atatacgacg atactttctg cgacgacgct gtttaccccg ttagaattgc tgacttggat 840

gttaacaaat tggaaccaag acgttctccc ggtataaaga taaaggaaag gattaagccc 900

gctgaaatta ttagaactcc agaaggtgaa acagttattg acatgggaca gaacatggtc 960

ggatggttgg agttcactaa tcgtgctcca aagggtgctg aaataatgtt gcaattcgga 1020

gaagttttgc aagatggtaa cttttatagg gataatttga gaactgcaaa atgtgaattc 1080

cattatatat ctgatggtaa ggttaaaaaa gttagaccac attttacttt ctacggtttt 1140

aggtatgtta agttgactaa atgggaggga gaggtcaacc ccgaagattt cactggttta 1200

gtcttgtatt ctgatttgga gagaactggt aacattacaa ctgataattc attggtcaac 1260

agattgtttt tgaacgcatt gtggtctcaa aaaggaaatt ttttggacgt ccctacagat 1320

tgcccacaga gggatgaaag gatgggttgg actggtgatg ctcaagtctt ctctggtgct 1380

gcagctttca atatggatgt ttttgctttc tttggtaaat atttatacga cttgaagcaa 1440

gaacagaaag ctaggggtgg taatgttcca gtcgttgttc cagcacacga cgtcaagcaa 1500

aacggagctt gtggttgggg tgacgcagca gtcattattc cttggaatat gtacttacac 1560

tacggtgatg tctcaatatt agaacaacaa tataagtcta tgaagggttg ggttgattat 1620

attaagtcta aagacgatgc agctggtggt agaagattgt ggttaaacga ttttcattac 1680

ggtgattgtg tttctttgga cgtcgaagat ccattcaata gattcggtgg tacagaacat 1740

gcttacttag catctgcttt ttactcttat tctgctggta tagtttctaa agctgctaaa 1800

attttgaaca aaaaggaaga cgctgaatac tatagaaagt tgtcagagga agttaagaat 1860

gctattagaa aagaatactt cacaccaact ggtaggttag cagttaacac tcaaactgct 1920

tacgtcattg cattgtacat ggacttggtt ccagacgagt ggaaagagag ggtcgctttc 1980

gaattaagaa agaagttgaa agaaactaaa taccacttga ggactggttt cttgggaaca 2040

ccatacttgt gcagagtttt gtctgagtat ggatcaaatg atattgctta cagattattg 2100

acaaatactg actaccccgg ttggttgtac ccagtcacta tgggtgcaac aactatttgg 2160

gagaggtgga attctatgtt gcccgatgga aaggtttctg acactggtat gaattctttc 2220

aaccattact catacggttc tattgttgaa tggatttata gaaacgctgc tggtattcag 2280

cccgttgaag atgcacccgg ttttcgtaga tttcgtttga agccacaacc acattatttg 2340

ttaaaatctt tggacgctga gttcttgtct ccagcagaga agataatttc aaggtggaat 2400

attaatgaaa atggttcagt ctctttttat tttagaattc cattcaatac tactgctgaa 2460

ttggttttac cagatactga ggtccaagat tggaaagaat tcatgtcttt gaacgttgtc 2520

aatatattaa tattgacatg tttgaaggat ttgactagaa aatgtacaga acaaatttta 2580

cagtgtggta aattcatgaa gatgagaggt caaaagaaat tgtaaagatc t 2631

<210> 4

<211> 1449

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atggctgagt ggagaactca atctatttat tttttgttga ctgacagatt tggtagaact 60

gataattcta ctacagctac ttgtgatact ggtgaccaaa tttattgcgg tggttcatgg 120

caaggtatta ttaatcactt ggactatatt caaggtatgg gttttacagc tatttggatt 180

tctccaatta cagaacaatt gcctcaagat acagctgacg gtgaggcata ccatggatat 240

tggcagcaaa aaatttatga tgttaattca aatttcggta ctgcagatga tttgaagtct 300

ttgtcagacg ctttgcacgc taggggtatg tatttgatgg tcgacgtcgt cccaaaccac 360

atgggttatg ctggtaacgg taatgatgtt gattattctg ttttcgatcc attcgactct 420

tcttcttatt tccatcctta ttgtttaatt actgactggg ataacttgac aatggtccaa 480

gattgctggg aaggtgacac tattgtttct ttgccagatt taaatacaac agagactgct 540

gttcgtacaa tttggtacga ctgggtcgca gacttggtct caaactactc agtcgacggt 600

ttgagaattg actctgtctt ggaggtcgag ccagactttt tccccggtta ccaagaggct 660

gctggtgtct actgtgtcgg tgaagtcgac aacggtaacc cagcattgga ctgcccatac 720

caaaaggtct tggatggtgt tttgaattat ccaatatatt ggcaattgtt gtatgctttt 780

gaatcttcct ctggttctat ttcaaactta tacaatatga taaaatctgt cgcttcagac 840

tgctctgacc caactttgtt gggtaatttt attgaaaacc atgacaatcc tagatttgct 900

tcttatactt ctgattattc tcaagctaaa aatgttttgt catacatttt cttatctgat 960

ggtataccta ttgtttacgc tggtgaagag cagcactact ctggtggtaa ggtcccttac 1020

aatcgtgagg caacttggtt gtctggttac gatacatctg ctgaattgta tacttggatt 1080

gctacaacaa atgctattag aaaattggct atttcagcag attctgcata cattacttac 1140

gctaacgatg cattctatac tgattctaac actattgcta tgagaaaagg tacttctggt 1200

tcacaagtta taacagtttt gtctaataaa ggatcttctg gttcttctta tacattgact 1260

ttgtctggtt ctggttatac ttctggtaca aagttgatag aagcttatac ttgtacttct 1320

gtcactgttg actcttctgg tgacattccc gttccaatgg catctggttt gccaagggtc 1380

ttgttgccag cttctgttgt tgactcatct tcattatgtg gtggctctgg tagattatat 1440

gttgagtaa 1449

<210> 5

<211> 2790

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atgaaaatta ctaatatttt agtcaatcaa atggagcatc cattaggttt tgatttgtca 60

aatttgagaa ttactttcga gttgactgaa atggagaata ttattggaaa cgtttataag 120

aatatatctg ttggtaaggt tgaatctgaa caaccaattt atttcgagcc agatgaattg 180

tacgaaaata atgcttttaa aattaatatg gaattagaac caagaacaaa atactgggtt 240

aagattggtg tcagaaatga caatgaagtt acttcttcaa atacatggtt tgagactggt 300

aaaatggacg aaaagttcta cggtaagtgg attacaaata agaaggatgt tgaaaatact 360

ttatttaaga aggatttcga attggctaac aagcaaataa agtcagctag attgtattct 420

actactttgg gtgtttacga agttgatttg aatggtgtca aggtcggtaa tgaatttttg 480

gcacccggtt ttactaacta tgataaaatt gttcaattgc aaacttatga tgttacaaaa 540

ttagtcacta aaaactctaa caacgaattg gtcttctctg tcggtgacgg ttggtacaag 600

ggtaatttgg gatttgatgg tggtcagaca aatatttacg gagacaagaa gtcaattttg 660

gctgaattac acgttacata cacagataac tcagaacaag ttatttctac tgactcttct 720

tggttgacta ctgaaggtaa aattattaaa tcttctatat attacggtga agacatagac 780

gatactaaag atatattgga ttggtcttct gttgttatat tgaataagtc aacttcaatt 840

gttagagaca gattatcttt gcctataatg aaaaaagaag ttttaaaagt taaagaaatt 900

attcacactc caaagaatga gatagttttg gatttcggtc agaaccacgc tggttggccc 960

gtttttatta atagattggc aagaggaaaa aagattactt tacaaatggg tgaaatttta 1020

caagatggaa atttctataa taaaaattta agattagcta gagcagcttt cacttacatt 1080

tctgatggtg aagagaaatt gattaggcct cattttacat atttcggttt tcgttatgtt 1140

aagatttctg gtgttactga cgttaacaaa gatgattttg agtcatgggt tttatactct 1200

gatttgaagc aaactggttt tattaaaact aataatgaca aagtcaatag attgtttaag 1260

aacgttattt ggggacaaaa atctaatttc atggatgtcc caactgattg tcctcaaagg 1320

gacgagagat tgggttggac tggagacgct gaaatattcg ctccaacagc ttctttcaac 1380

atgaacacat atgaattcta caaaaaatac gctaaagaca tgttggttga acaagaagat 1440

aacaaaggta tgttgcctat aattgttcca tcattgaaac aaaaatctac tggtatggct 1500

atttggtctg acgcagctac aattattcct tgggttactt ataggttctt tgatgactta 1560

ggtgtcttaa agcaaaatta ttctcaaatg aaaaattggg ttgattggat aacacaaaac 1620

acaaaaacaa aatatttatg gataggtcaa atgcaattag gtgactggtt gtctttagac 1680

aatggtgcta atccacaagg taaaactaat gaagactaca ttgcttctat ttattacttt 1740

gtctctgcat ctattgtctc taaggcagca agattgttac attacgacat ggaatctgac 1800

tattatgaaa atttggcaag gaacattaag actaacattt tgaatgagtt tgtcacagag 1860

aaaggtagaa ttgcaattga tactcaaact gctttagtct tggctttgca ttttggtttg 1920

gttcatgatt accagaaatc acaagttgtc gcagatttgg tcaagaaagt taaggatgac 1980

aataaacatt tacaaaccgg tttcgtcgga actcctttct tgttgtcagt tttatctaac 2040

aataaccaac atcacttggc tatggacatt ttcatgcaag aagattgtcc atcttggttg 2100

tacgaggtta atatgggtgc aactacaatt tgggaaagat ggaactctgt cttgcccgat 2160

ggtaagatga atccagaggg tatgaactca ttgaaccact actctttcgg tgcagtcatg 2220

atgtggatgt accagtgcgt cgtcggtttg aaccagttcg acgctggatt taaagaaatt 2280

tatttcgctc caaagttcga ttgtagattg aaagatatat attcagaatt cgattctaca 2340

tatggtaaga ttaaggttga ataccacttg gaaactaacg aaaaacattt gataaggatg 2400

aatttggtta ttccatttgg tgttaagatg aaagtcaagt tgccacgttc tgctaaatac 2460

ttgattaacg gaaaagaaaa gattggtata gtcaagttgg aatacggtaa atatgatatt 2520

tcttatattc ctactaaatc ttatttaaac tactacgact tgaattcaaa attagttgac 2580

attttagata ataatgactt ggttaagaga atagatcaaa tagatgaaaa aattttacaa 2640

aaggtcaaga ggatgggaaa tacaaggtct atattcatta ataaaaagat tgatgaattg 2700

ttggattttg aagaaatttc tcaagaagag aagaatcaat tggtcgatat attgcataaa 2760

acaatattca ttaagttgaa tttgttttaa 2790

Claims

1.一种重组大肠杆菌，其特征在于，以大肠杆菌为宿主，表达了α-L-鼠李糖苷酶，所述α-L-鼠李糖苷酶含SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

2.如权利要求1的重组大肠杆菌，其特征在于，以pET系列载体为表达载体。

3.如权利要求1或2的重组大肠杆菌，其特征在于，以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主。

4.如权利要求1-3任一所述的重组大肠杆菌，其特征在于，编码上述α-L-鼠李糖苷酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

5.权利要求1-4任一所述的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)合成α-L-鼠李糖苷酶基因；

(2)将α-L-鼠李糖苷酶基因与表达载体连接，获得pET28a-AnRhaE；

(3)将pET28a-AnRhaE转化至大肠杆菌中。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述转化是利用化学转化法进行的。

7.权利要求1-4任一所述的重组大肠杆菌在水解朝藿定C中的应用。

8.权利要求1-4任一所述重组大肠杆菌在水解淫羊藿次苷II中的应用。

9.权利要求1-4任一所述重组大肠杆菌在水解芦丁或柚皮苷中的应用。

10.权利要求1-4任一所述重组大肠杆菌在水解橙皮苷或新橙皮苷中的应用。