CN112877227B - 一种高产鼠李糖苷酶的毕赤酵母菌株 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程和微生物改造技术领域，具体提供了一种高产鼠李糖苷酶的毕赤酵母菌株及其应用。所述菌株的保藏编号为CCTCC NO:M2019968，可广泛应用于鼠李糖苷酶的生产，从而有利于降低鼠李糖苷酶的生产成本，促进其在食品加工领域中的推广与应用。

Description

一种高产鼠李糖苷酶的毕赤酵母菌株

技术领域

本发明属于基因工程和微生物改造技术领域，具体内容涉及一种高产鼠李糖苷酶的毕赤酵母菌株及其应用。

背景技术

α-L-鼠李糖苷酶(α-L-rhamnosidase(EC3.2.1.40)属于转化糖苷水解酶类，能够专一、高效地水解许多糖苷类物质如柚皮苷(naringin)、芦丁(rutin)、橙皮苷(hesperidin)等末端的α-L-鼠李糖基。α-L-鼠李糖苷酶的来源广泛，在动物组织、植物和微生物中均发现了α-L-鼠李糖苷酶。目前关于动物组织和植物来源的α-L-鼠李糖苷酶的报道相对较少，主要是通过细菌(如芽孢杆菌属、单胞菌属等)和真菌(如曲霉属、青霉属、木霉属、犁头霉属及裂殖菌属等)发酵来获取α-L-鼠李糖苷酶。

不同微生物来源的α-L-鼠李糖苷酶酶学性质存在差异。细菌来源的α-L-鼠李糖苷酶最适pH呈中性或碱性，而真菌分泌的α-L-鼠李糖苷酶的最适pH一般在酸性范围内，主要在4.0-7.0之间。微生物中的α-L-鼠李糖苷酶的最适反应温度一般是45-60℃。近年来也有发现耐热、嗜低温及耐碱性的α-L-鼠李糖苷酶。

α-L-鼠李糖苷酶是柚苷酶及橙皮苷酶的主要活性成分，是去除柑桔类果汁苦味的有效物质。果汁中的苦味物质柚皮苷被柚苷酶水解的过程共有两步反应，首先在α-L-鼠李糖苷酶的作用下水解柚皮苷生成普鲁宁，接着在β-D-葡萄糖苷酶的作用下，生成柚皮素。在果汁酶法脱苦过程中，α-L-鼠李糖苷酶参与的第一步反应是脱苦的关键。

微生物分泌的α-L-鼠李糖苷酶是一种诱导酶，需要诱导物柚皮苷、橙皮苷、鼠李糖等存在时才能合成α-L-鼠李糖苷酶，而且微生物中α-L-鼠李糖苷酶的诱导受到碳源代谢调节，给微生物发酵产α-L-鼠李糖苷酶造成阻碍。同时随着α-L-鼠李糖苷酶的应用越来越广泛，传统发酵的生产方式不能满足日益增长的需求，也很难达到很高的纯度。因此，选择现代生物技术来研究α-L-鼠李糖苷酶是一种必然趋势。

微生物来源的α-L-鼠李糖苷酶具有很多潜在的应用价值，近年来，对该酶的研究越来越受到学者的关注。在α-L-鼠李糖苷酶产酶菌株的筛选、发酵条件的优化以及酶的分离纯化和性质研究日趋成熟，为产业生产α-L-鼠李糖苷酶酶制剂及α-L-鼠李糖苷酶在食品医药加工工业中的应用提供了一定的参考价值。

发明内容

本发明为解决现有技术问题，提供了一种高产鼠李糖苷酶的毕赤酵母菌株及其应用。申请人首先将构巢曲霉(Aspergillus nidulans)的鼠李糖苷酶基因在毕赤酵母(Pichia pastoris)宿主中进行过表达，构建得到重组菌株；然后以该重组菌株为出发菌，进一步通过紫外诱变的方法获得鼠李糖苷酶产量得到显著提高的突变菌，能大幅度降低鼠李糖苷酶的生产成本，有利于促进该酶的广泛应用。

本发明一方面涉及一种毕赤酵母工程菌，其携带有表达鼠李糖苷酶基因的重组质粒。

本发明另一方面涉及一种毕赤酵母突变菌株，是以上述毕赤酵母工程菌为出发菌，通过紫外诱变的方法获得的。

所述突变菌株为毕赤酵母RhaAN-2(Pichia pastoris RhaAN-2)，已于2019年11月25日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2019968。

本发明还涉及上述毕赤酵母菌株在鼠李糖苷酶生产中的应用。

本发明提供的突变菌株毕赤酵母RhaAN-2，能大幅度提高鼠李糖苷酶的表达量，10L罐发酵160h后，其发酵上清液中鼠李糖苷酶酶活达到536u/ml，比出发菌提高了63％，取得了意料不到的技术效果。所述突变菌株重组表达的鼠李糖苷酶最适作用pH为5.0-8.0，最适作用温度为55℃。所述鼠李糖苷酶可大大提高朝藿定C的水解效率，淫羊藿苷的转化率高于91％，可广泛应用于淫羊藿苷的生产。所述突变菌株可广泛应用于鼠李糖苷酶的生产，从而有利于降低鼠李糖苷酶的生产成本，促进其在食品加工领域中的推广与应用。

附图说明

图1为相对酶活-pH变化曲线；

图2为相对酶活-温度变化曲线；

图3为30L罐发酵进程曲线。

具体实施方式

本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如MOLECULAR CLONING:ALABORATORY MANUAL,3nd Ed.(Sambrook,2001)和CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(Ausubel,2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，本领域的技术人员可以在本发明所记载的技术方案的基础上，采用本领域其它常规的方法、实验方案和试剂，而不限于本发明具体实施例的限定。

下面结合具体实施方式对本发明进行详细描述。

实施例1鼠李糖苷酶基因的克隆

以构巢曲霉(Aspergillus nidulans)基因组为模板，利用引物1和引物2扩增出鼠李糖苷酶基因片段。

PCR引物和反应条件如下：

引物1(F)：ATGTCGCTGTCAATTTCTGGC

引物2(R)：TCAACCGAGCGTACTCTCAAA

反应条件为：94℃变性5min；然后94℃变性30s，58℃复性30s，72℃延伸150s，30个循环后，72℃保温10min。琼脂糖电泳结果显示，扩增得到的鼠李糖苷酶基因大小为2586bp。

实施例2重组载体的构建

PCR扩增上述鼠李糖苷酶基因，引物两端引入EcoRI、NotI位点。引物序列如下：

引物3(F)：GTAGAATTC ATGTCGCTGTCAATTTCTGGC

引物4(R)：GACGCGGCCGCTCAACCGAGCGTACTCTCAAA

PCR反应条件为：94℃变性5min；然后94℃变性30s，58℃复性30s，72℃延伸150s，30个循环后，72℃保温10min。琼脂糖凝胶电泳结果显示，鼠李糖苷酶基因为大小2586bp的片段。

将上述获得的鼠李糖苷酶基因片段与表达载体pPIC9K分别进行限制性内切酶EcoRI、NotI双酶切，酶切条件如下：

37℃水浴酶切处理2h，电泳后分别回收两个目的片段，溶于20ul ddH₂O。用T4 DNA连接酶进行连接，连接体系如下：

22℃连接1h，转化大肠杆菌DH5a感受态，涂布LB+AMP平板，37℃培养过夜后长出单菌落，菌落PCR验证连接正确的转化子提取质粒送测序，测序正确后，即得到含有鼠李糖苷酶基因的重组载体pPIC9K-RhaAN。

实施例3毕赤酵母工程菌株的构建

重组酵母表达质粒pPIC9K-RhaAN用Sal I进行线性化，表达质粒线性化片段通过电穿孔法转化毕赤酵母GS115，在MD平板上筛选得到毕赤酵母重组菌株GS115/pPIC9K-RhaAN，再在含不同浓度遗传霉素的YPD平板上筛选多拷贝的转化子。

挑取单个转化子转接于BMGY培养基中，30℃、250rpm振荡培养1d后，再转入BMM培养基中30℃、250rpm振荡培养，每天添加0.5％的甲醇。诱导表达4d后，离心去除菌体，得到含鼠李糖苷酶的上清液，测定摇瓶鼠李糖苷酶的活力达到18U/ml，说明毕赤酵母工程菌株构建成功，命名为毕赤酵母RhaAN-1(Pichia pastoris RhaAN-1)。

鼠李糖苷酶酶活测定方法

(1)酶活单位的定义

在50℃、pH值为4.8的条件下，每分钟从浓度为5mmol/L的4-硝基苯基α-L-阿拉伯呋喃糖苷的溶液中降解释放1微摩尔对硝基酚所需要的酶量为一个酶活力单位U。

(2)酶活测定方法

5mmol/L 4-硝基苯基α-L-阿拉伯呋喃糖苷溶液：准确称取4-硝基苯基α-L-阿拉伯呋喃糖苷0.0713g,精确到0.0001g，缓缓加入相应的缓冲液接近50ml，磁力搅拌约10min，用2mol/L的柠檬酸或者氢氧化钠调相应的pH值，最后定容到50ml，现用现配。

酶液：用pH4.8的柠檬酸钠缓冲液稀释至适当倍数，控制吸光值在0.2-0.4范围。

标准曲线的绘制：将5mmol/L对硝基苯酚溶液精确稀释10倍，再分别稀释2、4、6、8、10、12、16倍。

取0.5mL上述对硝基苯酚稀释液(空白对照取缓冲液)，加入碳酸钠溶液2mL，加入底物溶液0.5mL，混合均匀，以空白对照调零，以在410nm测定吸光值。

以体系中对硝基苯酚的含量为横坐标(X)，吸光值为纵坐标(y)，绘制标准曲线y＝kA+b。

测定：取适量底物，50℃预热5min；

取四支15*150试管(一支空白管，三支样品管)，分别向四支管中，准确加入用已稀释好的酶液0.5mL；

将四支试管同时置于50±0.1℃水浴中，预热2min；

准确向样品试管中加入0.5mL底物溶液，准确计时15min；

迅速、准确地向各管中加入碳酸钠溶液2.0mL，于空白管中准确加入底物溶液0.50mL,摇匀。

以空白管调零，在分光光度计波长410nm下，用10mm比色杯，分别测量。

三支样品管中样液的吸光度，取平均值。

通过查标准曲线或用线性回归方程求出对硝基苯酚的含量。

酶活计算公式：A＝X×1/0.5×n/15

式中：

A—鼠李糖苷酶酶活力，u/g(或u/mL)；

X—吸光度在标准曲线上查得(或计算出)的对硝基苯酚含量，μmol；

1/0.5—所加入的酶液体积；

n—酶样的稀释倍数；

15—时间换算系数。

实施例4诱变筛选

紫外诱变导致的突变随机性很强，突变产生的效果也是随机的，难以预测。因此，为了获得有效的正突变，技术人员通常需要进行多轮紫外诱变，筛选的工作量较大，而且存在无法获得有效正突变的可能性。但因为紫外诱变所需设备简单、费用少，并且可在短时间内获得大量突变体，因此，它现在仍是一种常用的诱变选育方法。

申请人以毕赤酵母RhaAN-1为出发菌株，通过紫外诱变方法对其进行遗传学改造，进一步提高其鼠李糖苷酶的产量。

将毕赤酵母RhaAN-1接种于YPD平板，30℃培养2-3d，使用无菌水洗菌体，制成悬浮液，稀释至1×10⁶个/mL，紫外灯(40W)照射2-10min，距离约22cm，致死率达到90％以上，涂布平板，30℃培养48h。

第一轮紫外诱变共获得了约523个突变菌单菌落，将各个单菌落分别接种于装有200ul BMGY液体培养基的96孔板，30℃250rpm振荡培养1d后，离心去掉上层培养基，再加入200ul BMM培养基，30℃、250rpm振荡培养2d，每天添加0.5％的甲醇。诱导表达2d后，离心去除菌体，得到含鼠李糖苷酶的上清液，测定鼠李糖苷酶的活力，以出发菌RhaAN-1为对照，筛选出发酵酶活力得到显著提高的突变菌株。

结果显示，第一轮紫外诱变筛选获得的突变菌中，没有一株突变菌发酵上清液中鼠李糖苷酶的酶活高于出发菌。申请人又按照上述方法继续进行了18轮诱变筛选，最终获得1株鼠李糖苷酶产量显著高于出发菌的突变菌株，命名毕赤酵母RhaAN-2(Pichiapastoris RhaAN-2)。

所述突变菌株毕赤酵母RhaAN-2在摇瓶发酵条件下其发酵上清液中鼠李糖苷酶酶活力高达30u/ml，比出发菌提高了67％，取得了意料不到的技术效果。

申请人已于2019年11月25日将毕赤酵母RhaAN-2(Pichia pastoris RhaAN-2)保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2019968。

实施例5发酵放大

在50L发酵罐上进行出发菌毕赤酵母RhaAN-1和突变菌RhaAN-2的发酵，发酵使用的培养基配方为：硫酸钙1.1g/L、磷酸二氢钾5.5g/L、磷酸二氢铵55g/L、硫酸钾20.3g/L、硫酸镁16.4g/L、氢氧化钾1.65g/L、消泡剂0.05％。

发酵生产工艺：pH值5.0、温度25℃、搅拌速率300rpm、通风量1.0-1.5(v/v)、溶氧控制在20％以上。

整个发酵过程分为三个阶段：第一阶段为菌体培养阶段，按7％比例接入种子，30℃培养24-26h，以补完葡萄糖为标志；第二阶段为饥饿阶段，当葡萄糖补完之后，不流加任何碳源，当溶氧上升至80％以上表明该阶段结束，为期约30-60min；第三阶段为诱导表达阶段，流加甲醇诱导，并且保持溶氧在20％以上，培养时间在160h左右。发酵结束后，发酵液通过板框过滤机处理后获得粗酶液。

通过测定不同时间发酵液中鼠李糖苷酶活力，可得发酵进程曲线(图3)。

发酵结果可以看出，出发菌毕赤酵母RhaAN-1最终的发酵酶活为329U/ml，而突变菌株毕赤酵母RhaAN-2最终的发酵酶活高达536U/ml，比出发菌提高了63％。

实施例6鼠李糖苷酶的酶学性质分析

1、最适作用pH值

采用pH值分别为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0、10.0的缓冲液，将突变菌株毕赤酵母RhaAN-2发酵上清液进行稀释，鼠李糖苷酶底物也分别用对应pH值的缓冲液配制，在50℃下进行鼠李糖苷酶活力测定，计算酶活，以最高酶活为100％，计算相对酶活，做pH-相对酶活曲线，结果如图1所示，本发明提供的突变菌毕赤酵母RhaAN-2重组表达的鼠李糖苷酶最适作用pH为5.0-8.0。

2、最适作用温度

分别在30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃，pH4.8条件下，测定突变菌株毕赤酵母RhaAN-2发酵上清液中的鼠李糖苷酶活力，以最高酶活为100％，计算相对酶活，做温度-相对酶活曲线，结果如图2所示，本发明提供的突变菌毕赤酵母RhaAN-2重组表达的鼠李糖苷酶最适作用温度为55℃。

实施例7毕赤酵母RhaAN-2重组表达的鼠李糖苷酶在淫羊藿苷制备中的应用

秤取0.2g朝藿定C粗品(朝藿定C含量为40％)加入到50ml离心管中，加入9ml乙酸钠缓冲液(pH 5.5)，充分溶解后加入毕赤酵母RhaAN-2重组表达的鼠李糖苷酶240ul，再用乙酸钠缓冲液(pH 5.5)定容至10ml，在55℃的水浴锅中反应，每1h取样，用甲醇稀释5倍后进行HPLC检测，检测朝藿定C及淫羊藿苷的含量。

结果如下表所示，在毕赤酵母RhaAN-2重组表达的鼠李糖苷酶的作用下反应5h后，81.5％的朝藿定C发生了水解，其中91.43％左右的朝藿定C转化为淫羊藿苷。由此可见，所述毕赤酵母RhaAN-2重组表达的鼠李糖苷酶能大大提高朝藿定C到淫羊藿苷的转化效率，可广泛应用于淫羊藿苷的制备。

时间	朝藿定C(g/L)	淫羊藿苷(g/L)	朝藿定C转化为淫羊藿苷的转化率
				0	8.00	1.12
1h	4.04	4.12	92.16％
				2h	2.7	5.11	91.54％
3h	2.22	5.62	94.75％
				4h	1.69	5.85	91.17％
5h	1.48	6.02	91.43％

Claims (2)

1.一种毕赤酵母突变菌株，其特征在于，所述的毕赤酵母突变菌株的保藏编号为CCTCCNO: M2019968。

2.权利要求1所述的毕赤酵母突变菌株在生产鼠李糖苷酶中的应用。

Images