CN111218437A

CN111218437A - 一种高产的碱性脂肪酶及基因与菌株和应用

Info

Publication number: CN111218437A
Application number: CN202010124632.4A
Authority: CN
Inventors: 杨江科; 张奕昀; 魏子翔
Original assignee: Wuhan Polytechnic University
Current assignee: Wuhan Polytechnic University
Priority date: 2020-02-27
Filing date: 2020-02-27
Publication date: 2020-06-02
Anticipated expiration: 2040-02-27
Also published as: CN111218437B

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种高产的碱性脂肪酶及基因与菌株和应用。本发明的脂肪酶ROLIP的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明提供的脂肪酶ROLIP在原有脂肪酶基础上通过人工定向改造而来，具有显著提高的结构稳定性和表达水平。

Description

一种高产的碱性脂肪酶及基因与菌株和应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，更具体地，涉及一种高产的碱性脂肪酶及基因与菌株和应用。

背景技术

脂肪酶(EC3.1.1.3)又称甘油酯水解酶或三羧酸甘油酯水解酶，水解三酰甘油酯为脂肪酸、单酸甘油酯、二酸甘油酯及甘油。且以甘油三酯作为底物时，不同类型的脂肪酶催化特性亦不尽相同。在使用脂肪酶作为生物催化剂的反应中，可以使用多种类型的底物，无论是合成还是水解，产物大都具有稳定性良好和底物专一等优势。脂肪酶催化过程中对催化辅酶的依赖性较小，反应条件温和简单，催化反应进程易于控制，副反应及副产物相对较少。未来随着界面酶学、非水相酶学等研究的深入，脂肪酶也将在更广泛的领域展现出新的应用前景。

脂肪酶是最早被研究应用的酶种之一。自1834年兔胰脂肪酶被报道到如今，对脂肪酶的认知已有百年之久。而利用微生物进行发酵其优势远优于从自然材料中提取。早在60年代，曲霉、根霉等菌种来源的脂肪酶已在日本实现商品化生产。因为脂肪酶具有能水解油脂的特点，使其在手性化合物拆分、酯合成、高聚物合成、化工合成等方面有着突出的应用。碱性脂肪酶由于其对碱性环境的偏好性，在洗涤、造纸、医药、生物能源等领域具有广泛的用途。但目前，碱性脂肪酶的工业化应用仍然存在需要解决的关键性问题：1)酶来源受限；2)自然条件下，产酶量有限；3)产量较低，经济成本较高。

如上所述的缺陷在一定程度上减缓了碱性脂肪酶的应用进程。自然条件下，脂肪酶产出量有限，利用常规选育方法很难满足工业化生产的需要。因此，利用基因工程技术，对脂肪酶进行必要的分子改造，这样不仅能有效提高重组表达体分泌外源蛋白的能力，还能通过控制基因序列来改良酶的性质，与传统方法相比，精准而高效地赋予酶新的特性，从而更好地满足工业化生产的需要。

发明内容

本发明的目的是提供一种高水平表达的碱性脂肪酶ROLIP及基因序列、重组表达载体、重组表达菌株、蛋白结构域优化、50-L小型发酵罐产酶能力评价与应用。

为了实现上述目的，本发明提供一种脂肪酶ROLIP，所述脂肪酶ROLIP的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

根据本发明，本发明改造后的脂肪酶ROLIP由原始米根霉(Rhizopus oryzae)脂肪酶ROL(GenBank accession number:AF229435)通过人工的理性设计改造而来。原脂肪酶ROL的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。具体改造过程包括：通过定点突变的方法将第158位的丝氨酸突变为苏氨酸(S158T)，第247位的谷氨酰胺突变为亮氨酸(Q247L)，第294位的谷氨酰胺突变为组氨酸(Q294H)。所述定点突变技术为本领域常规的方法，其具体操作步骤为本领域技术人员公知，在此不再赘述。

本发明的第二方面提供一种脂肪酶基因rolip，用于编码所述的脂肪酶，所述脂肪酶基因rolip的碱基序列与SEQ ID NO：2所示的碱基序列具有95％以上的同一性。优选地，根据本发明，所述脂肪酶基因rolip含有SEQ ID NO：2所示的碱基序列即可实现本发明的效果。在最优情况下，所述脂肪酶基因rolip的碱基序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明提供的脂肪酶基因rolip，系基于脂肪酶氨基酸序列人工设计与优化而成。优化后的脂肪酶基因rolip的核心苷酸序列含有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。与原始的脂肪酶基因rol相比，本发明的脂肪酶基因rolip依照毕赤酵母对密码子的偏好性进行了重新设计。用毕赤酵母中使用频率较高或最高的密码子替代低频使用的密码子，从而显著提高了人工设计的脂肪酶基因rolip在毕赤酵母细胞中的表达量。原始脂肪酶基因rol的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。本发明根据原始脂肪酶的氨基酸序列，人工设计出一条全新的脂肪酶基因序列，并通过人工合成的方法获得所述脂肪酶基因片段。进行蛋白结构域优化前，多拷贝重组表达菌株活性最高的为622.5U/mL。进行优化后，发酵罐条件下，其活性最高的为26700U/mL，前后相较，酶活力提高42.89倍。

本发明的第三方面提供一种重组表达载体，其包括上述脂肪酶基因rolip，还可包括其他功能单元。在脂肪酶ROLIP的氨基酸序列和脂肪酶基因rolip的核苷酸序列确定的情况下，本领域技术人员能够选择合适的重组表达载体以及其他功能单元，例如，毕赤酵母表达载体。

本发明对所述重组表达载体的制备方法没有特别限定，可根据本领域常规技术手段确定。

根据本发明一种具体实施方式，所述重组表达载体的制备方法包括以下步骤：将合成的脂肪酶基因rolip连接至表达载体中。在本发明的一些实施例中，所述表达载体为毕赤酵母表达载体pPICZαA。当然，在本发明其他实施例中，也可选用其他毕赤酵母表达载体。

根据本发明一种更加具体的实施方式，所述重组表达载体的制备方法包括如下步骤：将所述脂肪酶基因rolip分别用限制性内切酶EcoR I和Not I双酶切，得到具有粘性末端的脂肪酶基因rolip片段；将毕赤酵母表达载体pPICZαA分别用限制性内切酶EcoR I和Not I双酶切，得到具有粘性末端的载体pPICZαA片段；将所述具有粘性末端的脂肪酶基因rolip片段和所述具有粘性末端的载体pPICZαA片段通过T4 DNA连接酶连接，获得脂肪酶重组表达载体pPICZαA-rolip。

本发明的第四方面提供一种重组表达菌株，包括上述重组表达载体pPICZαA-rolip，其表达产物为所述脂肪酶ROLIP。在脂肪酶ROLIP的氨基酸序列确定的情况下，本领域技术人员能够获得合适的重组表达菌株。

通常来说，所述宿主细胞可以是大肠杆菌、芽孢杆菌、曲霉，也可以是酵母等细胞，或者是其他类型的细胞，例如动植物细胞等。优选地，所述重组表达菌株的宿主细胞为毕赤酵母。同时，本发明提供的脂肪酶ROLIP经过优化，采用了更适合于毕赤酵母进行转录翻译表达的策略，提高了脂肪酶基因rolip在毕赤酵母细胞中的表达量。

本发明对所述重组表达菌株的制备方法没有特别限定，可根据本领域常规技术手段确定。

根据本发明一种具体实施方式，所述重组表达菌株的制备方法包括如下步骤：将重组表达载体pPICZαA-rolip通过限制性内切酶线性化；将上述线性化的重组表达载体pPICZαA-rolip导入毕赤酵母中，获得重组表达菌株。可选地，通过电转将重组表达载体导入毕赤酵母宿主细胞中，获得重组表达菌株。在本发明的一些实施例中，所述毕赤酵母为巴斯德毕赤酵母X-33，当然，在本发明其他实施例中，也可选用其他毕赤酵母菌株。

根据本发明一种更加具体的实施方式，所述重组表达菌株的制备方法包括如下步骤：将重组表达质粒pPICZαA-rolip通过Bgl II限制性内切酶线性化；通过电转化法将线性化的pPICZαA-rolip导入毕赤酵母宿主细胞中，28℃孵育2小时后涂布于含有Zeocin^TM抗性的YPD平板，筛选阳性克隆，即获得重组表达菌株。

本发明中，重组表达菌株制备脂肪酶的方法可以采用本领域常规的方法。根据本发明一种具体实施方式，生产脂肪酶的方法包括：通过发酵培养上述重组表达菌株，从培养物(发酵上清液)中提纯获得脂肪酶。在一些实施方式中，也可以不经过提纯处理，直接将发酵上清液视为脂肪酶产物。

根据本发明一种更加具体的实施方式，由上述重组表达菌株制备脂肪酶的方法包括如下步骤：挑取重组表达菌株按1/25接种量接种至25mL BMMY液体培养基中，28℃，200r/min培养，每隔24h添加2％甲醇诱导表达。72h后停止发酵，取发酵上清液加入适量上样缓冲液，沸水浴5min，制15％聚丙烯酰胺凝胶电泳分析诱导产物。利用碱滴定法测定其活性，Bradford法测定蛋白含量。

本发明还提供所述脂肪酶的应用，将所述的脂肪酶与含脂肪物料接触。所述含脂肪物料可以为脂肪。

本发明提供的脂肪酶ROLIP系由原始脂肪酶突变而来，经探究与结构稳定性相关联的氨基酸，优化后的脂肪酶在毕赤酵母中有更高的表达量。与此同时，脂肪酶ROLIP密码子的优化进一步显著提高了人工合成的脂肪酶基因rolip在毕赤酵母细胞中的表达量，也显著提高了重组脂肪酶的活力，本发明完成了在50-L小型发酵罐条件下的产酶评估实验，为该酶的产业化应用奠定了基础。

本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

通过结合附图对本发明示例性实施方式进行更详细的描述，本发明的上述以及其它目的、特征和优势将变得更加明显。

图1示出了本发明实施例1中脂肪酶突变位点的设计。

图2为本发明实施例2中优化前的脂肪酶基因rol和经过密码子优化后的脂肪酶基因rolip密码子使用频率的比较。

图3A和图3B分别为本发明实施例3中将重新设计的脂肪酶基因rolip克隆入重组表达载体pPICZαA和原始脂肪酶基因rol克隆入重组表达载体pPICZαA的酶切检验结果。

图4A示出了本发明实施例4中原始脂肪酶基因rol重组表达菌株发酵后上清液的SDS-PAGE测试结果，图4B为重新设计的脂肪酶基因rolip重组表达菌株发酵后上清液的SDS-PAGE测试结果，图4C为发酵液中蛋白含量的变化柱状图。

图5A为脂肪酶LIP的最适反应pH变化曲线图，图5B为脂肪酶ROLIP的最适反应pH变化曲线图。

图6示出了本发明实施例4中改造后的重组表达菌株在发酵罐条件下上清液的酶活及蛋白含量随诱导时间的变化柱状图。其中，图6A为多拷贝重组表达菌株在不同发酵时间下的SDS-PAGE检测图。图6B为重组表达菌株在发酵罐条件下上清液的酶活力随时间变化的柱状图。图6C为重组表达菌株在发酵罐条件下上清液的蛋白含量随时间变化的柱状图。

图7为本发明实施例7中脂肪酶ROLIP在碱性条件下对油酯的水解曲线。

具体实施方式

下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1

本实施例用于说明通过定点突变的方法对脂肪酶的改造。

本发明基于原始的来源于米根霉(Rhizopus oryzae)的脂肪酶ROL(GenBankaccession number:AF229435)，通过人工的理性设计对ROL进行了定点突变改造。具体改造过程包括：通过定点突变的方法将第158位的丝氨酸突变为苏氨酸(S158T)，第247位的谷氨酰胺突变为亮氨酸(Q247L)，第294位的谷氨酰胺突变为组氨酸(Q294H)。所述定点突变技术为本领域常规的方法，其具体操作步骤为本领域技术人员公知，在此不再赘述。原始脂肪酶ROL的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，原始脂肪酶基因rol的碱基序列如SEQ ID NO：4所示。经改造后的脂肪酶ROLIP的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

图1示出了本发明实施例1中经定点突变的三个氨基酸位点(S158T)，(Q247L)和(Q294H)。

实施例2

本实施例用于说明通过脂肪酶基因结构域的优化获得改造后的基因rolip。

本实施例基于突变后的脂肪酶的氨基酸序列，利用DNA2.0软件，人工重新设计了脂肪酶基因的核苷酸序列。具体包括：与原始的脂肪酶基因rol相比，采用高频率的密码子替代低频率的密码子；降低了基因编码的mRNA的二级结构的复杂度和最小自由能。计算机辅助下设计脂肪酶基因rolip序列，通过人工合成的方法获得脂肪酶基因rolip片段。

本实施例根据脂肪酶的氨基酸序列，人工设计出一条全新的脂肪酶基因序列，并通过人工合成的方法获得所述脂肪酶基因片段。所述人工合成基因的技术为本领域常规的方法，其具体操作步骤为本领域技术人员公知，在此不再赘述。改造后的脂肪酶基因的碱基序列如SEQ ID NO：2所示，命名为rolip，所述脂肪酶基因rolip编码出的脂肪酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

图2A为本发明实施例2中原始脂肪酶ROL前100个氨基酸的密码子使用频率图。图2B为优化后脂肪酶ROLIP前100个氨基酸的密码子使用频率。图示经优化后ROLIP密码子使用频率明显高于ROL。

实施例3

本实施例用于说明改造后的脂肪酶基因rolip和原始脂肪酶基因rol重组表达菌株的构建。

(1)在脂肪酶基因rolip两端加上酶切位点EcoR I和Not I酶切位点，经EcoR I和Not I酶切；同样载体pPICZαA经EcoR I和Not I酶切。其中，酶切体系为：30μL DNA、1.5μLEcoR I、1.5μL Not I、20μL的Buffer H加水补齐至200μL体积，在37℃条件下酶切4小时。

(2)将脂肪酶基因rolip酶切片段和pPICZαA酶切片段通过T₄ DNA连接酶连接，获得重组表达载体pPICZαA-rolip；其中，连接体系为：6μL的基因片段、1.5μL的pPICZαA片段、1μL的T₄ buffer、1μL的T₄ DNA连接酶、加水补齐至10μL；在16℃条件下过夜连接，将酶连体系转化至大肠杆菌(DH5α)。转化过程为：(i)将制备好的DH 5α感受态提前取出，放在冰水混合物中自然解冻。(ii)解冻完成后，吸取50μL DH 5α感受态与5μL质粒混合，为了达到最佳的混合效果，可用移液枪轻轻吹打或使用涡旋震荡仪低速轻微振荡。(iii)将上述样品放在冰上静置30min。(iv)将上述样品放在42℃水浴锅中静置保温1min，继而迅速插入冰盒中冰浴3-5min。(v)取800μL预热LB液体培养基加入上述管中，37℃条件下静置1小时。(vi)4℃条件下6000rpm离心4min，吸取600μL上清液丢弃，将剩余菌液吹吸混匀。(vii)将转化完成后的菌液涂布于LB(含Amp 100ug/mL)抗性平板筛选阳性克隆，提取质粒，即得到改造后的具有脂肪酶基因rolip的重组表达载体pPICZαA-rolip。提取重组表达载体pPICZαA-rolip，进行双酶切验证(EcoR I、Not I)，结果如图3A所示(图中：M为DL5000 DNA Marker，1泳道为pPICZαA-rolip重组表达载体，2泳道为pPICZαA-rolip重组表达载体经EcoR I和Not I双酶切验证)。图3A中，双酶切验证，在1.0kb、3.7kb位置有条带，说明脂肪酶基因rolip成功连接至pPICZαA重组表达载体上。

(3)将重组表达载体pPICZαA-rolip转化入巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)X-33中，然后在YPD(含酵母粉、蛋白胨和葡萄糖的培养基)平板上筛选得到含脂肪酶基因rolip的重组表达菌株。其中，电转化方法为：(i)取10μL浓缩后的重组表达质粒与90μL新鲜毕赤酵母感受态混合，混匀后转入预冷电转杯中，放在冰盒上冰浴5min。(ii)打开电转仪，调节电击参数，电压1500V，电阻200Ω，电容25μF。(iii)待电击结束后，迅速向电转杯中加入YPD与1M山梨醇同比例混合液，轻轻吹打混匀后转入1.5mL无菌离心管中，静置于28℃培养箱2小时。(iv)取100μL菌液涂布于YPD抗性平板，静置28℃培养箱3天，并随时观察平板上菌体的生长情况。

依照本实施例所述的操作程序，本发明构建了原始脂肪酶基因rol的基因重组表达质粒pPICZαA-rol和重组表达菌株。结果如图3B所示(图中：M为DL5000 DNA Marker，1泳道为pPICZαA-rol重组表达载体，2泳道为pPICZαA-rol重组表达载体经EcoR I单酶切验证，3泳道为pPICZαA-rol重组表达载体经EcoR I和Not I双酶切验证)。图3B中，单酶切验证在4.7kb位置有条带，双酶切验证，在1.0kb、3.7kb位置有条带，说明脂肪酶基因rol成功连接至pPICZαA重组表达载体上。

实施例4

本实施例用于优化后的脂肪重组表达菌株和原始脂肪酶重组表达菌株在摇瓶中表达脂肪酶的操作。

(1)将实施例3所获得的优化后的脂肪酶重组表达菌株或原始脂肪酶重组表达菌株接种于装有25mL YPD培养基的250mL容量瓶中，28℃、200r/min恒温振荡培养。当OD₆₀₀约为3.0-6.0时，5000r/min离心5min收集菌体，加入25mL培养基BMMY悬浮菌体，继续培养，每24h加入甲醇终浓度为1％的甲醇进行诱导表达，并于25℃下继续培养96h。每24h取样，通过SDS-PAGE检测发酵液中的蛋白质，并检测其脂肪酶活性。

(2)脂肪酶活性的测定：样品组及对照组每瓶滴加25μL酚酞作为指示剂，用0.5M氢氧化钠标准溶液滴定，反应液微见偏红且轻晃瓶身，溶液不褪色，以此判定为到达滴定终点；计算样品组及对照组所消耗的0.5M氢氧化钠标准溶液的体积，通过计算两者差值来确定脂肪酶活力的高低。

其中，实验组消耗氢氧化钠标准溶液的体积为V₂(mL)，空白组消耗氢氧化钠标准溶液的体积为V₁(mL)，M为NaOH标准溶液的浓度(mmol/L)，N为稀释倍数，t为反应时间(min)。

(3)蛋白含量测定采用Bradford法，具体操作步骤如下：分别取含10-100μg蛋白质溶液于小试管中，用灭菌双蒸水调体积至0.1mL；加入5mL蛋白试剂，充分震荡混匀，2-3分钟后于595nm处测定吸光度值。以0.1mL灭菌双蒸水及5mL蛋白试剂作为空白对照；用不同浓度的蛋白质溶液作标准曲线，蛋白质浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线作为定量依据。

依照本实施例所述的操作程序，本发明分别对原始脂肪酶基因rol重组表达菌株和重新设计的脂肪酶基因rolip重组表达菌株在摇瓶中进行了产酶发酵。图4A示出了本发明实施例4中原始脂肪酶基因rol重组表达菌株发酵后上清液的SDS-PAGE测试结果。M为蛋白质Marker，泳道1-8为不同菌株；图4B为重新设计的脂肪酶基因rolip重组表达菌株发酵后上清液的SDS-PAGE测试结果，M为蛋白质Marker，泳道1-6为不同菌株；图4C为发酵液中蛋白含量的变化柱状图，其中左侧柱代表ROLIP，右侧柱代表ROL。由图4A-4C所示，优化后脂肪酶基因rolip的产量明显高于原始脂肪酶rol的产量。

实施例5

本实施例用于测试优化后的脂肪酶ROLIP和原始脂肪酶ROL的最适pH。

(1)优化后脂肪酶ROLIP最适pH的测定体系为：采用NaAC-HAC和Gly-NaOH溶液分别配制pH3.0、pH4.0、pH5.0、pH6.0、pH7.0、pH8.0、pH9.0、pH10.0和pH11.0的缓冲液。缓冲液中加入4mL 1％的橄榄油乳化液和1mL稀释后的酶液。将上述反应体系置入所设置于40℃中，反应10分钟，反应结束后，采用如实施例4中所述脂肪酶活力的测定法，测定脂肪酶在不同pH值体系中的酶活性。根据不同pH下测定的酶活绘制出脂肪酶活与pH的曲线，获得最适反应pH。

(2)依照上述方法，本发明测定了原始脂肪酶ROL的最适pH。结果如图5A和5B所示，脂肪酶ROL和ROLIP的最适pH均为pH9。两者间的酶活与pH关系曲线变化趋势一致。因此，本发明脂肪酶为碱性脂肪酶。

实施例6

本实施例用于说明改造后的脂肪酶基因rolip在50-L小型发酵罐中的产酶能力评估实验。

(1)选基因优化后，摇瓶发酵酶活最高的4拷贝8号脂肪酶重组表达菌株，提前三天在YPD平板上活化；将活化好的菌株接种于200mL YPD液体培养基，28℃摇床震荡培养14-16小时作为发酵种子液；配制30-L无机盐基础培养基(配方如下所示)灭菌处理，并用氨水调pH值为5.0；将上述摇好的发酵种子液转接入发酵罐中，转接过程中严格遵循无菌操作。其中，发酵培养基包括：175g KH₂PO₄、3.5g CaSO₄、21g(NH₄)₂SO₄、49g MgSO₄、60g K₂SO₄、140g甘油/葡萄糖、生物素溶液2mL/L，微量元素2mL/L，蛋白胨56g，蒸馏水定容至30-L。

(2)毕赤酵母高密度发酵主要分为两个阶段，营养生长阶段及甲醇诱导阶段。营养生长阶段又可以细分为如下几个阶段：快速生长阶段、营养流加阶段、饥饿阶段。快速生长阶段：毕赤酵母利用基础培养基中的碳元素及无机盐等快速生长，即此阶段为好氧阶段，时间持续20小时；营养流加阶段：每1L流加液补充5mL微量元素、5mL生物素及一半甘油/葡萄糖溶液。另需控制流加速度，以发酵罐能承受的压力参数为上限，每1L流加液补充5mL微量元素、5mL生物素，控制溶解氧大于40％，时间持续4小时；饥饿阶段：营养流加结束后，重组酵母菌株利用培养基中残存的营养物继续生长，随着饥饿时间的延长，溶解氧值上升，通气量降低，转速下降。最好适当延长饥饿时期，有利于后续甲醇诱导阶段的顺利进行。在发酵前24小时，菌体生长状况良好，鲜重达到29％，因而缩短了补料时间。同时在补料液25％的甘油中添加微量元素与生物素溶液；饥饿阶段完成后进入甲醇诱导阶段，时间持续30小时，在菌体诱导阶段：按照甲醇与甘油8：1的比例全程混饲诱导，同时添加微量元素与生物素溶液且根据不同发酵时长调节补料速度；0-2小时：每升发酵液每小时补料1mL，2-4小时：每升发酵液每小时补料2mL，4-24小时：每升发酵液每小时补料3mL；24-发酵结束：每升发酵液每小时补料4mL；在混饲诱导发酵过程中，细胞鲜重由诱导期的30％上升为39.7％，控制温度在29.5±0.5℃，通风比1：1.5，发酵液pH用氨水调节，使其维持在pH＝5.0的水平上；持续关注发酵液pH值，当出现发酵液pH值迅速增加的情况，表明酵母细胞已经开始破碎，此时应该结束发酵；每隔24小时取样一次，并测定发酵上清液中脂肪酶的活性及蛋白含量。结果如图6A-6C所示。

依照本实施例所述的操作程序，本发明对脂肪酶rolip基因重组表达菌株在发酵罐中进行了产酶发酵。图6A示出了本发明改造后的脂肪酶基因rolip重组表达菌株发酵后上清液的SDS-PAGE测试结果。M为蛋白质Marker，泳道1-7分别为发酵24小时、48小时、72小时、96小时、120小时、144小时、168小时的产酶量；图6B为脂肪酶基因rolip重组表达菌株发酵后上清液的酶活；图6C为发酵液中蛋白含量的变化。由图可知发酵168小时后，脂肪酶活性达到26700U/mL，蛋白含量为950μg/mL。

实施例7

本实施例用于说明采用本发明的脂肪酶ROLIP对地沟油的水解制取脂肪酸。

(1)地沟油中游离脂肪酶的测定：取1mL地沟油，充分乳化，采用pH7.0的缓冲液重悬。采用如实施例4制备的发酵上清液，0.5M氢氧化钠溶液滴定，使用酚酞为指示剂。获得地沟油中游离脂肪酸的含量。

(2)脂肪酶对地沟油中油脂的水解：如上述取50mL地沟油，充分乳化，采用pH7.0的缓冲液重悬，加入适当稀释的脂肪酶，并置于40℃振荡孵育4h。每小时取1mL样品。采用上述氢氧化钠溶液滴定法测定脂肪酶水解地沟油后释放出的游离脂肪酸的量。图7为脂肪酶ROLIP在碱性条件下对油酯的水解曲线。可见，随着时间增长，脂肪酶ROLIP在碱性条件下对油酯的水解率逐渐增加。

综上所述，本发明通过对原始脂肪酶的重新设计与改造，对脂肪酶基因密码子的优化，成功地获得了新型脂肪酶ROLIP及脂肪酶基因rolip。该基因与表达载体pPICZαA连接后，转入毕赤酵母中表达，获得了高效的脂肪酶重组表达菌株。脂肪酶的重新设计与改造，脂肪酶基因密码子的优化显著提高了脂肪酶活性及蛋白表达力。其在发酵罐中诱导表达168小时，湿重为39.70％，上清液中脂肪酶的酶活力为26700U/mL，蛋白含量为950μg/mL。该酶的应用表明该酶可高效水解油酯，具有良好的应用潜力。

本发明提供的酶通过人工定向改造氨基酸，显著提高了其结构稳定性和表达水平。本发明提供的脂肪酶基因rolip以脂肪酶ROLIP的氨基酸序列为参照，以毕赤酵母密码子使用频率为标准，采用氨基酸的简并密码子中的高频密码子来翻译对应的氨基酸，从而替换原有的低频密码子，显著提高了改造后的脂肪酶ROLIP在表达水平，并提高了脂肪酶的酶活。其制备工艺简单且产量高，降低了脂肪酶的生产成本。

以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。

序列表

<110> 武汉轻工大学

<120> 一种高产的碱性脂肪酶及基因与菌株和应用

<130> BJI1901919WHPU

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 366

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Val Pro Val Ser Gly Lys Ser Gly Ser Ser Thr Thr Ala Val Ser Ala

1 5 10 15

Ser Asp Asn Ser Ala Leu Pro Pro Leu Ile Ser Ser Arg Cys Ala Pro

20 25 30

Pro Ser Asn Lys Gly Ser Lys Ser Asp Leu Gln Ala Glu Pro Tyr Tyr

35 40 45

Met Gln Lys Asn Thr Glu Trp Tyr Glu Ser His Gly Gly Asn Leu Thr

50 55 60

Ser Ile Gly Lys Arg Asp Asp Asn Leu Val Gly Gly Met Thr Leu Asp

65 70 75 80

Leu Pro Ser Asp Ala Pro Pro Ile Ser Leu Ser Gly Ser Thr Asn Ser

85 90 95

Ala Ser Asp Gly Gly Lys Val Val Ala Ala Thr Thr Ala Gln Ile Gln

100 105 110

Glu Phe Thr Lys Tyr Ala Gly Ile Ala Ala Thr Ala Tyr Cys Arg Ser

115 120 125

Val Val Pro Gly Asn Lys Trp Asp Cys Val Gln Cys Gln Lys Trp Val

130 135 140

Pro Asp Gly Lys Ile Ile Thr Thr Phe Thr Ser Leu Leu Thr Asp Thr

145 150 155 160

Asn Gly Tyr Val Leu Arg Ser Asp Lys Gln Lys Thr Ile Tyr Leu Val

165 170 175

Phe Arg Gly Thr Asn Ser Phe Arg Ser Ala Ile Thr Asp Ile Val Phe

180 185 190

Asn Phe Ser Asp Tyr Lys Pro Val Lys Gly Ala Lys Val His Ala Gly

195 200 205

Phe Leu Ser Ser Tyr Glu Gln Val Val Asn Asp Tyr Phe Pro Val Val

210 215 220

Gln Glu Gln Leu Thr Ala Asn Pro Thr Tyr Lys Val Ile Val Thr Gly

225 230 235 240

His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Leu Leu Ala Gly Met Asp Leu Tyr

245 250 255

Gln Arg Glu Pro Arg Leu Ser Pro Lys Asn Leu Ser Ile Phe Thr Val

260 265 270

Gly Gly Pro Arg Val Gly Asn Pro Thr Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ser

275 280 285

Thr Gly Ile Pro Phe His Arg Thr Val His Lys Arg Asp Ile Val Pro

290 295 300

His Val Pro Pro Gln Ser Phe Gly Phe Leu His Pro Gly Val Glu Ser

305 310 315 320

Trp Ile Lys Ser Gly Thr Ser Asn Val Gln Ile Cys Thr Ser Glu Ile

325 330 335

Glu Thr Lys Asp Cys Ser Asn Ser Ile Val Pro Phe Thr Ser Leu Leu

340 345 350

Asp His Leu Ser Tyr Phe Asp Ile Asn Glu Gly Ser Cys Leu

355 360 365

<210> 2

<211> 1101

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gttccagttt ctggtaagtc tggttcttct actactgctg tttctgcttc tgataactct 60

gctttgccac cattgatttc ttctagatgt gctccaccat ctaacaaggg ttctaagtct 120

gatttgcaag ctgaaccata ctacatgcaa aagaacactg aatggtacga atctcatggt 180

ggtaacttga cttctattgg taagagagat gataacttgg ttggtggtat gactttggat 240

ttgccatctg atgctccacc aatttctttg tctggttcta ctaactctgc ttctgatggt 300

ggtaaggttg ttgctgctac tactgctcaa attcaagaat ttactaagta cgctggtatt 360

gctgctactg cttactgtag atctgttgtt ccaggtaaca agtgggattg tgttcaatgt 420

caaaagtggg ttccagatgg taagattatt actactttta cttctttgtt gactgatact 480

aacggttacg ttttgagatc tgataagcaa aagactattt acttggtttt tagaggtact 540

aactctttta gatctgctat tactgatatt gtttttaact tttctgatta caagccagtt 600

aagggtgcta aggttcatgc tggttttttg tcttcttacg aacaagttgt taacgattac 660

tttccagttg ttcaagaaca attgactgct aatccaactt acaaggttat tgttactggt 720

cattctttgg gtggtgcttt ggctttgttg gctggtatgg atttgtacca aagagaacca 780

agattgtctc caaagaactt gtctattttt actgttggtg gtccaagagt tggtaaccca 840

acttttgctt actacgttga atctactggt attccatttc atagaactgt tcataagaga 900

gatattgttc cacatgttcc accacaatct tttggttttt tgcatccagg tgttgaatct 960

tggattaagt ctggtacttc taacgttcaa atttgtactt ctgaaattga aactaaggat 1020

tgttctaact ctattgttcc atttacttct ttgttggatc atttgtctta ctttgatatt 1080

aacgaaggtt cttgtttgta a 1101

<210> 3

<211> 366

<212> PRT

<213> Rhizopus oryzae

<400> 3

Val Pro Val Ser Gly Lys Ser Gly Ser Ser Thr Thr Ala Val Ser Ala

1 5 10 15

Ser Asp Asn Ser Ala Leu Pro Pro Leu Ile Ser Ser Arg Cys Ala Pro

20 25 30

Pro Ser Asn Lys Gly Ser Lys Ser Asp Leu Gln Ala Glu Pro Tyr Tyr

35 40 45

Met Gln Lys Asn Thr Glu Trp Tyr Glu Ser His Gly Gly Asn Leu Thr

50 55 60

Ser Ile Gly Lys Arg Asp Asp Asn Leu Val Gly Gly Met Thr Leu Asp

65 70 75 80

Leu Pro Ser Asp Ala Pro Pro Ile Ser Leu Ser Gly Ser Thr Asn Ser

85 90 95

Ala Ser Asp Gly Gly Lys Val Val Ala Ala Thr Thr Ala Gln Ile Gln

100 105 110

Glu Phe Thr Lys Tyr Ala Gly Ile Ala Ala Thr Ala Tyr Cys Arg Ser

115 120 125

Val Val Pro Gly Asn Lys Trp Asp Cys Val Gln Cys Gln Lys Trp Val

130 135 140

Pro Asp Gly Lys Ile Ile Thr Thr Phe Thr Ser Leu Leu Ser Asp Thr

145 150 155 160

Asn Gly Tyr Val Leu Arg Ser Asp Lys Gln Lys Thr Ile Tyr Leu Val

165 170 175

Phe Arg Gly Thr Asn Ser Phe Arg Ser Ala Ile Thr Asp Ile Val Phe

180 185 190

Asn Phe Ser Asp Tyr Lys Pro Val Lys Gly Ala Lys Val His Ala Gly

195 200 205

Phe Leu Ser Ser Tyr Glu Gln Val Val Asn Asp Tyr Phe Pro Val Val

210 215 220

Gln Glu Gln Leu Thr Ala Asn Pro Thr Tyr Lys Val Ile Val Thr Gly

225 230 235 240

His Ser Leu Gly Gly Ala Gln Ala Leu Leu Ala Gly Met Asp Leu Tyr

245 250 255

Gln Arg Glu Pro Arg Leu Ser Pro Lys Asn Leu Ser Ile Phe Thr Val

260 265 270

Gly Gly Pro Arg Val Gly Asn Pro Thr Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ser

275 280 285

Thr Gly Ile Pro Phe Gln Arg Thr Val His Lys Arg Asp Ile Val Pro

290 295 300

His Val Pro Pro Gln Ser Phe Gly Phe Leu His Pro Gly Val Glu Ser

305 310 315 320

Trp Ile Lys Ser Gly Thr Ser Asn Val Gln Ile Cys Thr Ser Glu Ile

325 330 335

Glu Thr Lys Asp Cys Ser Asn Ser Ile Val Pro Phe Thr Ser Leu Leu

340 345 350

Asp His Leu Ser Tyr Phe Asp Ile Asn Glu Gly Ser Cys Leu

355 360 365

<210> 4

<211> 1101

<212> DNA

<213> Rhizopus oryzae

<400> 4

gttcctgttt ctggtaaatc tggatcttcc actaccgccg tctctgcatc tgacaattct 60

gccctccctc ctctcatttc cagccgttgt gctcctcctt ctaacaaggg aagtaaaagc 120

gatcttcaag ctgaacctta ctacatgcaa aagaatacag aatggtatga gtcccatggt 180

ggcaacctga catccatcgg aaagcgagat gacaatttgg ttggtggcat gactttggat 240

ttacctagcg atgctcctcc tatcagcctc tctggatcta ccaacagcgc ctctgatggt 300

ggtaaggttg ttgctgctac tactgctcaa attcaagagt tcaccaagta tgctggtatc 360

gctgccactg cctactgtcg ttctgttgtc cctggtaaca agtgggactg tgtccaatgt 420

caaaagtggg ttcctgatgg caagatcatc actaccttta cctccttgct ttccgacaca 480

aatggttacg tcttgagaag tgataaacaa aagaccattt atcttgtttt ccgtggtacc 540

aactccttca gaagtgccat cactgatatt gtcttcaact tttccgacta caagcctgtc 600

aagggcgcca aggttcatgc tggtttcctt tcctcttatg agcaagttgt caatgactat 660

ttccctgtcg tccaagaaca actgaccgcc aaccctactt acaaggtcat cgtcaccggt 720

cactcactcg gtggtgcaca agctttgctt gccggtatgg atctctacca acgtgaacca 780

agactgtctc ccaagaattt gagcatcttc actgttggtg gtcctcgtgt tggtaacccc 840

acctttgctt actatgttga atctaccggt attcctttcc aacgtaccgt tcacaagaga 900

gatatcgttc ctcacgttcc tcctcaatcc ttcggattcc ttcatcccgg tgttgaatct 960

tggattaagt ctggtacctc caacgttcaa atctgtactt ctgaaattga aaccaaggat 1020

tgcagtaact ctatcgttcc tttcacctct ctccttgatc acttgagtta ctttgatatc 1080

aacgaaggaa gctgtttgta a 1101

Claims

1.一种脂肪酶ROLIP，其特征在于，所述脂肪酶ROLIP的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种脂肪酶基因rolip，用于编码权利要求1所述的脂肪酶，其特征在于，所述脂肪酶基因rolip的碱基序列与SEQ ID NO：2所示的碱基序列具有95％以上的同一性，优选地，所述脂肪酶基因rolip的碱基序列如SEQ ID NO：2所示。

3.权利要求2所述的脂肪酶基因rolip的获取方法，其特征在于，包括如下步骤：通过定点突变的方法将原始脂肪酶第158位的丝氨酸突变为苏氨酸，第247位的谷氨酰胺突变为亮氨酸，第294位的谷氨酰胺突变为组氨酸。

4.一种重组表达载体，其特征在于，包括如权利要求2所述的脂肪酶基因rolip。

5.权利要求4所述的重组表达载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

将权利要求2所述的脂肪酶基因rolip通过限制性内切酶EcoR I和Not I双酶切，得到具有粘性末端的脂肪酶基因rolip片段；

将毕赤酵母表达载体pPICZαA分别用限制性内切酶EcoR I和Not I双酶切，得到具有粘性末端的载体pPICZαA片段；

将所述具有粘性末端的脂肪酶基因rolip片段和所述具有粘性末端的载体pPICZαA片段通过T4 DNA连接酶连接，获得脂肪酶重组表达载体pPICZαA-rolip。

6.一种重组表达菌株，其特征在于，包括如权利要求4所述的重组表达载体。

7.根据权利要求6所述的重组表达菌株，其中，所述重组表达菌株的宿主细胞为毕赤酵母。

8.权利要求6或7所述的重组表达菌株的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

将脂肪酶重组表达载体pPICZαA-rolip通过酶切位点将其线性化；

将线性化的重组表达载体pPICZαA-rolip导入宿主细胞中，获得重组表达菌株。

9.权利要求1所述的脂肪酶的生产方法，其特征在于，培养权利要求6或7所述的重组表达菌株，从培养物中获得脂肪酶。

10.权利要求1所述的脂肪酶的应用，其特征在于，将权利要求1中所述的脂肪酶与含脂肪物料接触。