CN108192906B

CN108192906B - 一种含有低温脂肪酶基因的工程菌及其构建方法和应用

Info

Publication number: CN108192906B
Application number: CN201711457722.XA
Authority: CN
Inventors: 谢悦波; 姚竣耀; 刘才群
Original assignee: Jiangsu Shibang Biological Engineering Technology Co ltd
Current assignee: Jiangsu Shibang Biological Engineering Technology Co ltd
Priority date: 2017-12-28
Filing date: 2017-12-28
Publication date: 2021-05-11
Anticipated expiration: 2037-12-28
Also published as: CN108192906A

Abstract

本发明公开了一种含有低温脂肪酶基因的重组工程菌及其构建方法。本发明还公开了一种融合蛋白sole‑lip‑948。本发明还公开了重组工程菌株BL21‑pCAMBIA1301‑sole‑lip‑948在污水处理中的应用。本发明还公开了一种污水处理方法。本发明首次将sole基因和南极适冷菌低温脂肪酶基因lip‑948融合获得融合基因sole‑lip‑948，并成功构建重组工程菌株BL21‑pCAMBIA1301‑sole‑lip‑948。本发明首次将该融合蛋白sole‑lip‑948与进行固定化获得固定化脂肪酶，该固定化脂肪酶酶活高达200U/ml。本发明的固定化脂肪酶能高效处理生活污水，CODcr去除率高达97.8%，BOD去除率高达97.1%，氨氮去除率高达86.6%。

Description

一种含有低温脂肪酶基因的工程菌及其构建方法和应用

技术领域

本发明属于污水处理技术领域，特别涉及一种含有低温脂肪酶基因的工程菌及其构建方法和应用。

背景技术

随着我国的经济发展，社会的进步促进了工农提高，随之也带来了不同程度的环业生产能力得到境污染，特别是污水成为了环境污染的来源之一，污水的污染程度也日益严重，逐渐由低向高演变，处理污水的难度也日益加大。

目前，污水处理的方法主要有物理、化学和生物处理方法，其中，生物处理方法是利用微生物产生的酶进行对污水中的油脂进行水解从而达到净化污水的目的。近年来有不少研究者将脂肪酶用于污水处理获得了很大的进展，但是这些脂肪酶在污水处理时，在低温或极低温度下处理效率大大降低。

脂肪酶是一类酯键水解酶，广泛存在于动物组织、植物种子和微生物中，它能在油水界面催化天然油脂，将其降解为甘油和游离的脂肪酸，目前工业上实用的脂肪酶基本上都是中温酶，最是酶活温度一般都在50℃左右，与中温酶相比，低温脂肪酶具有较低的活化能和低温下仍具有较高的酶活力，低温脂肪酶是一种胞外酶，酶的产生要经过异源表达、修饰折叠，最终分泌到细胞外。决定脂肪酶表达的因素有很多，比如宿主、外源基因、外界环境等因素，目前虽然有少数低温脂肪酶基因已经得到克隆和测序，但是克隆到工程菌中后，基本都用于洗涤业、食品加工、生物制药、环境生物技术等领域，很少有能成功用于污水处理的相关报道。

发明内容

发明目的：为了克服现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题是提供了一种含有低温脂肪酶基因的工程菌的构建方法。本发明采用融合基因技术，采用重叠PCR技术将低温脂肪酶基因lip-948与sole基因成功融合表达获得了融合基因sole-lip-948。该融合基因sole-lip-948是通过上海生工生物公司合成获得。

本发明还要解决的技术问题是提供了所述的构建方法获得的工程菌。

本发明还要解决的技术问题是提供了所述的构建方法获得的工程菌的高效表达。

本发明最后要解决的技术问题是提供了该含有低温脂肪酶基因的工程菌在污水处理中的应用。

技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种含有低温脂肪酶基因的工程菌的构建方法，包括以下步骤：

1)融合基因sole-lip-948的制备；本发明的融合基因sole-lip-948的制备是在生工生物工程(上海)股份有限公司合成得到；

2)将融合基因sole-lip-948导入表达载体pCAMBIA1301中获得重组表达载体pCAMBIA1301-sole-lip-948；

3)将重组表达载体pCAMBIA1301-sole-lip-948转化到大肠杆菌BL21中，挑取阳性克隆LB培养基中过夜培养得到重组工程菌株BL21-pCAMBIA1301-sole-lip-948。

其中，上述融合基因sole-lip-948的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明内容还包括上述的构建方法获得的重组工程菌株BL21-pCAMBIA1301-sole-lip-948。

其中，上述重组工程菌株BL21-pCAMBIA1301-sole-lip-948的培养温度为10～20℃。

本发明内容还包括一种融合蛋白sole-lip-948，所述融合蛋白sole-lip-948是通过将所述的重组工程菌株BL21-pCAMBIA1301-sole-lip-948进行诱导表达获得。

本发明中的lip-948基因序列参见序列表SEQ ID NO：2所示。本发明中的sole基因序列参见序列表SEQ ID NO：3所示。

发明内容还包括上述的重组工程菌株BL21-pCAMBIA1301-sole-lip-948在污水处理中的应用。

本发明内容还包括一种生活污水处理方法，包括以下步骤：

1)重组工程菌株BL21-pCAMBIA1301-sole-lip-948进行诱导表达获得菌液；

2)脂肪酶lip-948的纯化和固定化；

3)将固定化脂肪酶lip-948进行生活污水处理。

其中，所述脂肪酶lip-948的纯化和固定化步骤为：将步骤1)诱导后的菌液加入磷酸缓冲液，超声波处理，然后加入大豆卵磷脂和橄榄油混匀，再超声波处理，冰上放置然后超声波处理，冰上放置，然后离心收集上层油体即为固定化脂肪酶Lip-948。

其中，上述超声波的功率为30W、破碎时间为8s、间隔时间为8s，每次超声20个循环。

其中，上述污水处理环境温度为10℃，所述生活污水的pH为9.0。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1)本发明首次将sole基因和南极适冷菌低温脂肪酶基因lip-948融合获得融合基因sole-lip-948，并成功构建重组工程菌株BL21-pCAMBIA1301-sole-lip-948。

2)本发明首次对重组工程菌株BL21-pCAMBIA1301-sole-lip-948成功诱导得到了融合蛋白sole-lip-948。

3)本发明首次将该融合蛋白sole-lip-948与进行固定化获得固定化脂肪酶，该固定化脂肪酶酶活高达200U/ml。

4)本发明首次将该固定化脂肪酶用于生活污水处理中，并获得了十分显著的效果。本发明的固定化脂肪酶能高效处理生活污水，CODcr去除率高达97.8％，BOD去除率高达97.1％，氨氮去除率高达86.6％。

附图说明

图1为pCAMBIA1301载体结构示意图。

具体实施方式：

下面通过实施例来进一步阐述本发明。

本发明使用的试剂及菌株均为市面上购买获得。

实施例1：重组工程菌株BL21-pCAMBIA1301-sole-lip-948的构建

1、根据NCBI上公布的lip-948(GENBANK登录号：GU247897)和sole基因(GENBANK登录号：AF091840)的登录号获得其基因序列，通过将lip-948基因的N端和油体蛋白的C末端通过Linker连接获得sole-lip-948基因序列。所述Linker的基因序列为：ggtaccatcgaaggaagaatg；将sole-lip-948碱基序列委托上海生工生物公司进行基因的合成；该设计的序列如SEQ ID NO：1所示。

2、将合成好的目的基因sole-lip-948以及表达载体pCAMBIA1301分别进行内切酶双酶切，该内切酶为HindIII和EcoRI，酶切条件为常规的酶切温度和酶切体系。将酶切好的片段进行连接获得重组载体pCAMBIA1301-sole-lip-948，将重组载体pCAMBIA1301-sole-lip-948转入大肠杆菌BL21中即可获得重组工程菌株BL21-pCAMBIA1301-sole-lip-948。

3、将重组工程菌株BL21-pCAMBIA1301-sole-lip-948进行质粒提取获得的质粒送上海生工生物公司测序，测序结果显示重组载体成功转化至BL21中。实施例2IPTG诱导表达融合蛋白及其纯化

挑取重组工程菌株BL21-pCAMBIA1301-sole-lip-948按照1％的接种量接种到50ml的氨苄青霉素的LB培养基中进行培养，37℃，220rpm培养过夜，然后按照2％的接种量接种到新鲜培养基中，37℃，220rpm培养至OD600为0.6时，加入IPTG至浓度为1.0mM，30℃，220rpm，诱导表达8h，7000rpm，4℃离心5min，菌泥用100mM Tris-HCl(pH8.0)重悬，收集细菌沉淀并分别用1mL PBS缓冲液对其进行重悬，在冰水浴中进行超声裂解。分别取完整的诱导菌体以及超声波裂解后的上清、沉淀样品进行SDS-PAGE电泳。在86kDa处出现与预期目标大小一致的条带。

将诱导后的菌液(含质粒pCAMBIA1301-sole-Lip-948的BL21(DE3)菌株)2mL于EP管中，15000×g 4℃离心1min，收集菌体，弃掉培养基，再用1mL磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.5)重悬，超声波处理(功率：30w，破碎8s，间隔8s，超声处理在冰浴上进行)20个循环，向超声EP管中加入500μg大豆卵磷脂和50μL的橄榄油，用移液器混匀，再超声波处理(功率：30w，破碎8s，间隔8s，超声处理在冰浴上进行)20个循环；冰上放置5min。然后超声波处理20s(功率：30w)，冰上放置5分钟，重复两次后15000rpm离心20min收集上层油体，即为固定化脂肪酶Lip-948。

实验例3固定化脂肪酶Lip-948的酶活测定

脂肪酶酶活定义：1g固定酶粉或1ml液体酶，在一定温度pH条件下，1min水解底物产生1μmol的可滴定的脂肪酸，即为1个酶活力单位，以μ/g或μ/mL表示。

测定原理：脂肪酶在一定条件下，能使得甘油三酯水解成脂肪酸、甘油二酯、甘油单酯和甘油，所释放的脂肪酸可用标准碱溶液进行中和滴定，用pH计或酚酞指示反应终点，根据消耗的减量，计算其酶活力。

将固定化脂肪酶lip-948用磷酸缓冲液溶解并稀释，转入含有橄榄油(分析纯)和4％聚乙烯醇(橄榄油和4％聚乙烯醇＝1:3的比例)的试管中，采用指示剂滴定法进行测定并做平行实验，取平均值，最终测得固定化脂肪酶Lip-948酶的酶活力为200U/ml。

实施例4固定化脂肪酶lip-948污水处理研究

将实施例3制备的固定化脂肪酶lip-948，分别在环境温度为0℃、10℃、20℃、生活污水的pH分别为7、8、9、10时，进行污水处理情况的实验研究。同时在同样的环境温度条件下，设置对比例1为污水PH为中性条件下时，采用市面上购买的常规的脂肪酶Lip-948的实验研究；对比例2为污水PH＝10的条件下采用的市面上购买的常规的脂肪酶Lip-948的实验研究。

通过对生活污水作为水样，具体的实验结果参见表1。

表1

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 江苏世邦生物工程科技有限公司

<120> 一种含有低温脂肪酶基因的工程菌及其构建方法和应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1389

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1389)

<400> 1

atg gct gag cat tat ggt caa caa cag cag acc agg gcg cct cac ctg 48

Met Ala Glu His Tyr Gly Gln Gln Gln Gln Thr Arg Ala Pro His Leu

1 5 10 15

cag ctg cag ccg cgc gcc cag cgg gta gtg aag gcg gcc acc gcc gtg 96

Gln Leu Gln Pro Arg Ala Gln Arg Val Val Lys Ala Ala Thr Ala Val

20 25 30

aca gcc ggc ggc tcg ctt ctc gtc ctc tct ggc ctc act tta gcc gga 144

Thr Ala Gly Gly Ser Leu Leu Val Leu Ser Gly Leu Thr Leu Ala Gly

35 40 45

act gtt att gcg ctc acc atc gcc act ccg ctg ctt gtg atc ttt agc 192

Thr Val Ile Ala Leu Thr Ile Ala Thr Pro Leu Leu Val Ile Phe Ser

50 55 60

ccc gtt ctg gtg ccg gcg gtc ata acc att ttc ttg ctg ggt gcg ggt 240

Pro Val Leu Val Pro Ala Val Ile Thr Ile Phe Leu Leu Gly Ala Gly

65 70 75 80

ttt ctg gca tcc gga ggc ttc ggc gtg gcg gcg ctg agt gtg ctg tcg 288

Phe Leu Ala Ser Gly Gly Phe Gly Val Ala Ala Leu Ser Val Leu Ser

85 90 95

tgg att tac aga tat ctg aca ggg aaa cac ccg ccg ggg gcg gat cag 336

Trp Ile Tyr Arg Tyr Leu Thr Gly Lys His Pro Pro Gly Ala Asp Gln

100 105 110

ctg gaa tcg gca aag acg aag ctg gcg agc aag gcg cga gag atg aag 384

Leu Glu Ser Ala Lys Thr Lys Leu Ala Ser Lys Ala Arg Glu Met Lys

115 120 125

gat agg gca gag cag ttc tcg cag cag cct gtt gcg ggt acc atc gaa 432

Asp Arg Ala Glu Gln Phe Ser Gln Gln Pro Val Ala Gly Thr Ile Glu

130 135 140

gga aga atg atg cta tta aaa cgc cta agc ctt gcc act ttg tta agc 480

Gly Arg Met Met Leu Leu Lys Arg Leu Ser Leu Ala Thr Leu Leu Ser

145 150 155 160

ttt tca gtc gtt ggt tgt acc acc gcg ccc aat acc ttg gcg ata aat 528

Phe Ser Val Val Gly Cys Thr Thr Ala Pro Asn Thr Leu Ala Ile Asn

165 170 175

acc acc caa aag att att cag tat gaa cgc tca aaa tca gac ctt acg 576

Thr Thr Gln Lys Ile Ile Gln Tyr Glu Arg Ser Lys Ser Asp Leu Thr

180 185 190

act cag tca ttt acg tta agc tct ggc gat aaa ata gtc tat gca gaa 624

Thr Gln Ser Phe Thr Leu Ser Ser Gly Asp Lys Ile Val Tyr Ala Glu

195 200 205

aac ggt aat gtc gcg ggc gag cct tta tta ttg att cat ggc ttt ggc 672

Asn Gly Asn Val Ala Gly Glu Pro Leu Leu Leu Ile His Gly Phe Gly

210 215 220

ggt aat aaa gac aac ttt acc cgt atc gct cgg cag tta gaa aac tat 720

Gly Asn Lys Asp Asn Phe Thr Arg Ile Ala Arg Gln Leu Glu Asn Tyr

225 230 235 240

aat ctg atc att cct gac ttg ctc ggc ttt ggt gac tct agt aaa ccg 768

Asn Leu Ile Ile Pro Asp Leu Leu Gly Phe Gly Asp Ser Ser Lys Pro

245 250 255

atg gcg gct gac tat cgc tcg gag gcg caa gcg acg cgc tta cac gag 816

Met Ala Ala Asp Tyr Arg Ser Glu Ala Gln Ala Thr Arg Leu His Glu

260 265 270

cta ctg caa gct aaa ggc ttg gca tct aac att cat gtc ggt ggc aac 864

Leu Leu Gln Ala Lys Gly Leu Ala Ser Asn Ile His Val Gly Gly Asn

275 280 285

tca atg ggc ggc gct atc agt gtt gct tat gct gcg aag tat cct aaa 912

Ser Met Gly Gly Ala Ile Ser Val Ala Tyr Ala Ala Lys Tyr Pro Lys

290 295 300

gaa gtc aaa agt ctg tgg ctg ata gac agt gcg ggc ttt tgg tca gtg 960

Glu Val Lys Ser Leu Trp Leu Ile Asp Ser Ala Gly Phe Trp Ser Val

305 310 315 320

ggt gtg ccg aaa tcc tta gaa agt gca act ctt gag aac aat ccg cta 1008

Gly Val Pro Lys Ser Leu Glu Ser Ala Thr Leu Glu Asn Asn Pro Leu

325 330 335

ttg gtc gat aag aag gaa gac ttt tat gct atg tat gac ttt gtt atg 1056

Leu Val Asp Lys Lys Glu Asp Phe Tyr Ala Met Tyr Asp Phe Val Met

340 345 350

tct aag ccg cct tat att cct aag tct gta aaa gcc gta ttc gcg caa 1104

Ser Lys Pro Pro Tyr Ile Pro Lys Ser Val Lys Ala Val Phe Ala Gln

355 360 365

gag cgt atc gct aat aaa gca gta gaa tcc aaa ata ctc gcg caa ata 1152

Glu Arg Ile Ala Asn Lys Ala Val Glu Ser Lys Ile Leu Ala Gln Ile

370 375 380

gtt gaa gat aat gtt gag cag cgt gcc aag gtt atc gct gaa tat aat 1200

Val Glu Asp Asn Val Glu Gln Arg Ala Lys Val Ile Ala Glu Tyr Asn

385 390 395 400

att cca aca cta gtc gtt tgg ggt gag gaa gat aag gtc atc aag cct 1248

Ile Pro Thr Leu Val Val Trp Gly Glu Glu Asp Lys Val Ile Lys Pro

405 410 415

gaa aca gtg acg cta ata aaa gaa atc atc cca caa tca caa gtg att 1296

Glu Thr Val Thr Leu Ile Lys Glu Ile Ile Pro Gln Ser Gln Val Ile

420 425 430

acg atg cca aaa atc ggt cat gta ccg atg ata gaa gcg gtg aaa gat 1344

Thr Met Pro Lys Ile Gly His Val Pro Met Ile Glu Ala Val Lys Asp

435 440 445

acg gcg aat gat tat aaa gcg ttt cgt gaa ggg tta aag aaa tag 1389

Thr Ala Asn Asp Tyr Lys Ala Phe Arg Glu Gly Leu Lys Lys

450 455 460

<210> 2

<211> 948

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgctattaa aacgcctaag ccttgccact ttgttaagct tttcagtcgt tggttgtacc 60

accgcgccca ataccttggc gataaatacc acccaaaaga ttattcagta tgaacgctca 120

aaatcagacc ttacgactca gtcatttacg ttaagctctg gcgataaaat agtctatgca 180

gaaaacggta atgtcgcggg cgagccttta ttattgattc atggctttgg cggtaataaa 240

gacaacttta cccgtatcgc tcggcagtta gaaaactata atctgatcat tcctgacttg 300

ctcggctttg gtgactctag taaaccgatg gcggctgact atcgctcgga ggcgcaagcg 360

acgcgcttac acgagctact gcaagctaaa ggcttggcat ctaacattca tgtcggtggc 420

aactcaatgg gcggcgctat cagtgttgct tatgctgcga agtatcctaa agaagtcaaa 480

agtctgtggc tgatagacag tgcgggcttt tggtcagtgg gtgtgccgaa atccttagaa 540

agtgcaactc ttgagaacaa tccgctattg gtcgataaga aggaagactt ttatgctatg 600

tatgactttg ttatgtctaa gccgccttat attcctaagt ctgtaaaagc cgtattcgcg 660

caagagcgta tcgctaataa agcagtagaa tccaaaatac tcgcgcaaat agttgaagat 720

aatgttgagc agcgtgccaa ggttatcgct gaatataata ttccaacact agtcgtttgg 780

ggtgaggaag ataaggtcat caagcctgaa acagtgacgc taataaaaga aatcatccca 840

caatcacaag tgattacgat gccaaaaatc ggtcatgtac cgatgataga agcggtgaaa 900

gatacggcga atgattataa agcgtttcgt gaagggttaa agaaatag 948

<210> 3

<211> 420

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggctgagc attatggtca acaacagcag accagggcgc ctcacctgca gctgcagccg 60

cgcgcccagc gggtagtgaa ggcggccacc gccgtgacag ccggcggctc gcttctcgtc 120

ctctctggcc tcactttagc cggaactgtt attgcgctca ccatcgccac tccgctgctt 180

gtgatcttta gccccgttct ggtgccggcg gtcataacca ttttcttgct gggtgcgggt 240

tttctggcat ccggaggctt cggcgtggcg gcgctgagtg tgctgtcgtg gatttacaga 300

tatctgacag ggaaacaccc gccgggggcg gatcagctgg aatcggcaaa gacgaagctg 360

gcgagcaagg cgcgagagat gaaggatagg gcagagcagt tctcgcagca gcctgttgcg 420

Claims

1.一种生活污水处理方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）重组工程菌株BL21- pCAMBIA1301-sole-lip-948进行诱导表达获得菌液；

2）脂肪酶lip-948的纯化和固定化；

3）将固定化脂肪酶lip-948进行生活污水处理；

所述重组工程菌株BL21- pCAMBIA1301-sole-lip-948的构建方法如下：将融合基因sole-lip-948导入表达载体pCAMBIA1301中获得重组表达载体pCAMBIA1301- sole-lip-948；将重组表达载体pCAMBIA1301-sole-lip-948转化到大肠杆菌BL21中，挑取阳性克隆LB培养基中过夜培养得到重组工程菌株BL21- pCAMBIA1301 sole-lip-948；所述融合基因sole-lip-948的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

所述脂肪酶lip-948的纯化和固定化步骤为：将步骤1）诱导后的菌液加入磷酸缓冲液，超声波处理，然后加入大豆卵磷脂和橄榄油混匀，再超声波处理，冰上放置然后超声波处理，冰上放置，然后离心收集上层油体即为固定化脂肪酶Lip-948，所述超声波的功率为30W、破碎时间为8s、间隔时间为8s，每次超声20个循环，所述污水处理环境温度为10℃，所述生活污水的pH为9.0。