CN1721446A - 融合蛋白及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明的融合蛋白是将藻蓝蛋白β亚基基因融合在人和鲑鱼降钙素嵌和体基因上游而构成的。该融合基因长648bp，其分子量为23KDa，该融合蛋白的氨基酸序列与SEQ NO.2所示的序列具有100％的同源性，有213个氨基酸残基的多肽；该融合蛋白的原核表达载体的保藏号：CCTCC1261。该降钙素嵌和体基因长102bp；该藻蓝蛋白β亚基为长519bp的cpcB基因，是编码171个氨基酸残基的多肽。该融合蛋白的构建无需再加工，无需纯化，使得降钙素在表达中，既减少蛋白酶的降解，又省却切割后加工步骤，降钙素的表达量高，增加了临床应用过程的稳定性，降低了降钙素的抗原性，增加其生物活性。
Description
技术领域
本发明涉及降钙素基因的改造。具体讲是一种融合蛋白及其制备方法，该蛋白是将藻蓝蛋白β亚基基因融合在人和鲑鱼嵌合降钙素基因的上游经表达而获得的，其属于分子生物学技术和生物工程技术交叉技术领域。
背景技术
现有技术中，降钙素(calcitonin，简称：CT)是由哺乳动物的甲状腺滤泡旁细胞(C细胞)或鱼、鸟等其它脊椎动物的后腮腺分泌的一种调节钙磷代谢的多肽激素。降钙素都是由32个氨基酸组成的多肽，在体内的主要作用是通过抑制破骨细胞活性，减少骨质吸收，促进钙在骨中的沉积，从而降低血钙。临床上降钙素广泛用于治疗骨质疏松、各种原因引起的骨骼疼痛、Paget’s疾病、高钙血症、肿瘤性疾病，还可作为胃溃疡、急性胰腺炎等的辅助治疗药物。目前，临床使用的主要是化学合成鲑鱼降钙素(如密盖息)，但由于降钙素生物半衰期短，临床治疗上述疾病必须长达12个月以上的疗程，长期使用40％-70％的患者会出现与抗体相关的耐受，另外，降钙素分子内1-7位氨基酸存在二硫键，溶解度低，化学合成时需要较大体系，得率很低，因而价格昂贵，很难普及推广，而且容易造成环境污染。而人的降钙素活性较低，仅为鲑鱼降钙素(sCT)的2％-5％。因此，随着我国人口的老龄化，对降钙素的需求日益增加，用基因工程手段对降钙素基因进行改造、重组表达成为众多研究者努力的方向。
现有技术的降钙素的结构特征包括：基因特征，降钙素基因与编码降钙素基因相关肽的基因位于同一个转录单位上，即CT/CGRP复合基因，该基因长约6.5kb，由6个外显子组成，其中，CT前体mRNA由外显子I、II、III、IV编码，基因内部无内含子；分子特征，无论哺乳动物的CT还是鱼类的CT分子都是三个结构域，(1)N末端1-7位是由二硫键形成的环状结构；(2)8-22位的两性α-螺旋结构；(3)23-32位的C-末端无规则亲水结构。在各种来源的CT中，sCT分子带有最多的正电荷，碱性强，形成螺旋状结构多，刚性强，在人体内降解慢。一侧亲水性强，与受体亲和性好；另一侧疏水性好，容易在活化cAMPase后识别受体，既而稳定地结合受体，因而活性高。鲑鱼降钙素的活性较高被证明是由于与受体有较强的结合力。另外，CT的活性还与N端--C端的“远程效应”有关，也就是两端的相互作用。各种降钙素中间肽链的差异使之各自产生抗体。C-末端为酰胺化结构，是受体结合的重要结构。在各种来源的降钙素中，抗原决定簇均位于8-17位氨基酸。
早在八十年代末就已开始降钙素基因工程的研究，有关降钙素的表达多采用融合表达、分泌表达，也有在昆虫等真核细胞表达的报道。其中，融合表达就是将两个或多个开放阅读框架按一定顺序连接在一起，表达出一种杂和蛋白。一般采用通过标准肽键与运载序列连接，以融合蛋白的形式在大肠杆菌中表达，运载序列能通常起到稳定靶蛋白的作用，使其免受胞内蛋白酶的降解。融合表达具有较高的表达量(30-50％)，但因多采用与某一特定配基有高亲和力的运载体连接，以作为亲和层析纯化的标签。但靶序列附加标签会有不利后果，即可能丧失生物活性。目前所上市的20多种融合载体，其融合伴侣多为有某种生物功能的蛋白，如pGEM中的β-半乳糖苷酶，pGEX中的GST(谷胱苷肽-S-转移酶)，pMAL中的MBP(麦芽糖结合蛋白)，pTrx中的Trx(硫氧还蛋白)等，即便是自然界中不存在的人工标签，如聚组氨酸标签(His tag)也可能影响蛋白的生物活性，因此，只有从融合蛋白上切割下来，才能获得天然的具有生物活性的靶蛋白。尽管已经开发出多种能在靶蛋白和运载蛋白的连接处切割肽键的化学和酶学方法，但如何从融合蛋白上彻底去除标签或运载蛋白，仍是一个难题。化学方法特异识别特定的氨基酸残基或一组氨基酸，如氰溴化物只能于Met残基后切割，而甲酸只能在Asp-Pro的Pro-后切割。如果融合蛋白的连接区有这些位点而靶蛋白中没有，就可以切割下完整的蛋白。但事实上大多数靶蛋白中都含有一个或多个潜在的切割位点，因此化学方法有其局限性。而且不总是显示上述的特异性，反应映条件苛刻，容易使靶蛋白变性。酶学方法要求在靶蛋白和运载蛋白的连接区设计特异的酶解位点，可以特异地切割，但这种看似神奇地方法实际上只有一半能完全切割。另外，蛋白酶的特异性不是绝对的，或者蛋白酶中有其他蛋白酶的污染，致使靶蛋白内部相应位点被切割，从而使加工过程前功尽弃。同时，蛋白酶的加入会不可避免地引入另一种蛋白，有些蛋白酶如果不能够保证从切割反应体系中彻底去除，可能会引起致命的后果，如在pGEX系统中用于切割靶蛋白的凝血酶、Xa因子等。分泌表达是融合表达的另一种形式，其是利用含有原核信号肽的载体进行表达，新合成的蛋白被转运到周质空间。其缺陷是表达量不高，因为通常细菌的总蛋白中只有4％分泌至周质，而分泌到胞外的蛋白虽适合一些细胞因子或小肽，但需要从较大体积的培养基分离获得；分泌表达的另一缺陷是信号肽不切割或发生错误切割。有人在昆虫细胞中表达是利用杆状病毒载体和在很强的病毒启动子后带有外源基因的转移质粒共转染昆虫培养细胞的稳定细胞系，可以产生杆状病毒。进入细胞后，质粒和病毒基因进行同源重组，形成的重组体在内源多角体蛋白的位置带有外源基因，外源蛋白的表达发生在重组杆状病毒对细胞的急性溶解感染期。蛋白质的生产是短期行为，并且导致细胞死亡，从死亡后的细胞中分离靶蛋白。因此需要不停地制备用于感染的新细胞，这对于大规模生产很不现实。并且在真核细胞中，很难将外源蛋白和其他的内源同系物区分开来。
总之，无论原核还是真核表达都无法避免蛋白提取、切割、纯化等烦琐的后续工作，而在纯化过程中会因为降钙素分子太小，在溶液中极不稳定，严重影响目的蛋白的得率。
发明内容
本发明的发明目的是在上述降钙素基因工程的工作基础上，对降钙素的基因进行改造，降低降钙素的抗原性、增加其生物活性。以人和鲑鱼降钙素为先导物，利用计算机辅助软件合成了一系列嵌合降钙素，并构建含有其基因的重组质粒，从中筛选活性高、抗原性低的类似物作为新型降钙素基因。为增加目的蛋白的稳定性，提高降钙素的表达量，增加纯化及临床应用过程中的稳定性，提高CT生物半衰期，找到一分子量相对大的、无毒副作用的另一其它蛋白，应用基因工程技术，将嵌合降钙素与该其它蛋白融合，构建无需再加工的融合蛋白。
本发明的目的是由以下技术方案实现的，研制了一种融合蛋白基因，是将藻蓝蛋白β亚基基因融合在人和鲑鱼嵌合降钙素基因的上游而构成的，其融合基因的核苷酸序列与SEQ NO.1所示的核苷酸序列具有100％的同源性，该融合基因是含有648bp的DNA片断。
研制了一种融合蛋白，是将藻蓝蛋白β亚基基因融合在人和鲑鱼嵌合降钙素基因的上游经表达而获得的，该融合蛋白的分子量为23KDa，其氨基酸序列与SEQ NO.2所示的氨基酸序列具有100％的同源性，该融合蛋白是含有213个氨基酸残基的多肽；该融合蛋白的原核表达载体——大肠杆菌工程菌pBCT/GI724已由中科院微生物所保藏，其保藏号：CGMCC№
1261，保藏日期2004年12月8日，分类命名：大肠埃希氏菌。
所述的人和鲑鱼嵌合降钙素基因，其大小为111bp，核苷酸序列与SEQ NO.3所示的核苷酸序列具有100％的同源性，其编码34个氨基酸残基的多肽，氨基酸序列与SEQ NO.4所示的氨基酸序列具有100％同源性，其中前20个氨基酸中16个为人源性，第1位是疏水性亮氨酸，或是缬氨酸，或缺失；第9位是疏水性亮氨酸，或是甲硫氨酸；第17位是丙氨酸，或是苯丙氨酸；第18位天冬酰胺，或是组氨酸；第19位氨基酸人鱼相同；第20位为苯丙氨酸，或为谷氨酰胺；后13个氨基酸为鲑鱼源性；第34位为甘氨酸，或为精氨酸，其为体外酰胺化提供氨基，或缺失；
该嵌合体的具体氨基酸序列如下：
Lea Cys Gly Asn Leu Ser Thr Cys Leu Leu Gly Thr Tyr Thr Gln
1 5 9 10 15
Asp Ala Asn Lys phe Gln Thr Tyr Pro Arg Thr Asn Thr Gly Ser
16 19 20 25 30
Gly Thr Pro Gly。
31 34
所述的藻蓝蛋白β亚基，其基因的核苷酸序列为：519bp的cpcB基因，其核苷酸序列与SEQ NO.3所示的核苷酸序列具有100％的同源性，其是编码171个氨基酸残基的多肽。
所述的藻蓝蛋白β亚基，其是通过柔性连接肽与嵌合降钙素连接的，该连接肽基因长24bp，核苷酸序列与SEQ NO.7具有100％同源性，其氨基酸序列与SEQ NO.8具有100％同源性；
所述的融合基因或融合蛋白的制备方法，有如下步骤：
(1)嵌合基因制备：
依人和鲑鱼的降钙素为先导，利用计算机辅助软件设计系列嵌合体，利用化学合成与酶相结合方法，获得嵌合降钙素基因，经EcoR I和BamH I切割后，连入经同样内切酶切割的克隆载体pUC19，构建重组质粒pUC19-cCT，经测序，与预期序列一致。
(2)融合基因制备：
将节旋藻(螺旋藻)/Arthrospira(Spirulina)platensis FACHB341的藻蓝蛋白β亚基基因融合在上述嵌合降钙素基因的上游，在两基因间设计连接序列，使两种肽在折叠中相对独立，构建含有融合基因的克隆载体，其步骤如下；
①设计一对引物：以节旋藻(螺旋藻)藻蓝蛋白β亚基为模板设计引物cpcB1和cpcB2，在引物cpcB1中包含EcoR I、Nde I位点，在引物cpcB2中包含BamH I位点，同时也是接头的两个氨基酸(GlySer)的反向编码，随后是编码连接肽N端的5个氨基酸(GlyGlyGlySerGly)和cpcB C端的8个氨基酸的反向互补编码序列，并在引物cpcB2的3′端设计简并引物，消除了cpcB原有的终止密码子；
②PCR扩增β亚基：采用PCR扩增藻蓝蛋白β亚基，获得538bp大小β亚基基因片断，经2％凝胶电泳回收，用EcoR I和BamH I切割，连入经同样酶切的载体中，筛选重组质粒，命名为pCPCB；
③设计另对引物：以pUC19-cCT为模板设计引物CT1和CT2；在CT15‘端的BamHI位点和紧接上的GGT编码连接肽C端的3个氨基酸(Gly Ser Gly)，随后是cCTN端的5个氨基酸的编码序列，CT2包含SphI位点、终止密码子及cCT C端的5个氨基酸的反向互补编码序列；
④PCR扩增嵌合降钙素基因：采用PCR扩增嵌合降钙素基因，回收片断用BamH I和Sph I切割；
⑤融合：连入经同样酶切的②步的重组质粒pCPCB中，构建了带有融合基因BCT的重组质粒，命名为pUC-BCT，该pUC-BCT重组质粒含有长度为648bp的融合蛋白cpcB-CT基因；该融合基因以连接序列连接，即柔性连接肽与嵌合降钙素连接的，该连接肽的核苷酸序列与SEQ NO.7具有100％同源性。含融合基因的质粒再经双重PCR筛选、酶切鉴定重组子，测序证实基因框架正确后，转化DH5α，筛选重组菌落，获得大肠杆菌工程菌pUC-BCT/DH5α。
(3)融合基因的表达：
①含融合基因的表达载体的构建：用Nde I和Sph I切割上述(2)中的⑤步的重组质粒pUC-BCT，再连入经同样内切酶切割的表达载体pLEX中，用pLEX测序引物和cpcB1-CT2特异引物双重PCR筛选，结合酶切鉴定筛选重组表达质粒，命名为pBCT；
②转化大肠杆菌GI724：
用氯化钙和氯化锰转化法转化大肠杆菌GI724，于RMG-Amp平板挑出目的克隆菌落，30℃斜线培养12-16小时；
③从第一天的平板中挑选一单克隆于1ml RM培养基(100μg/ml Amp)中，30℃、以200-225rpm/min的转速震荡培养，过夜；
④按接种量为OD550＝0.1接种于10ml诱导培养基(100μg/ml Amp)中，30℃、培养2～3小时，至OD550＝0.5；
⑤当OD550达到0.5时，移出1ml样品于微量离心管中，高速离心2～3分钟，沉淀细胞，倒出上清，-20℃保存待用，其余细菌继续培养；
⑥加入色氨酸至终浓度100μg/ml，将培养物转至37℃震荡培养；
⑦每隔1小时取样一次，同步骤⑤；
沉淀经快速超声破碎—冻融2次以上循环，超速离心后，分上清与沉淀保存至SDS-PAGE凝胶电泳分析，通过改变诱导时间优化表达条件，最终得该融合蛋白的原核表达载体——大肠杆菌工程菌pBCT/GI724，其保藏号为：CCTCC1261；
结果：SDS-PAGE电泳测定分子大小为23KD；灰度扫描测定可溶性重组融合蛋白占菌体总蛋白的8-20％；诱导时间为2-5小时；
(4)重组蛋白的特异性分析：
电泳后凝胶电转移过夜，用Western blotting测定重组融合蛋白的特异性；结果证明该融合蛋白能够与人降钙素抗体发生特异性反应，对照菌株pLEX/GI724无杂交条带。
(5)重组蛋白的纯化及活性测定：
诱导表达4h的菌液离心得菌体，经超声破碎，取上清。取10ml均分置于10个管中，加入固态硫酸铵，浓度为20％饱和度-100％饱和度，经快速蛋白质印迹筛选，85％饱和硫酸铵为最佳沉淀浓度。经硫酸铵初步纯化后，过Sephardex葡聚糖凝胶层析柱，0.02M磷酸盐、0.1MKCL洗脱获二级纯化的蛋白；纯化的重组蛋白经检测与抗人降钙素抗体发生强阳性反应，与抗鲑鱼降钙素抗体仅有微弱反应，融合蛋白能够与受体结合，并具有降血钙作用。
所述的(2)中的①步引物cpcB1和引物cpcB2，其序列如下：
cpcB1：5′-ggaattccatatgtttgatgccttcac-3′；
cpcB2：5′-cgggatccaccagatccaccgccggaaacygcygcagcagcacggtc-3′。
所述的(2)中的③步引物CT1和CT2，其序列如下：
CT1：5′-cgggatccggtctgtgcggtaacctgtc-3′；
CT2：5′--acatgcatgctcattacggagtaccagaaccg-3′。
本发明优点在于：由于本发明的融合蛋白是来自现有技术的降钙素基因工程，在此基础上本发明对降钙素的基因进行了改造，构建了活性高、抗原性低的降钙素基因类似物，并找到了一分子量相对大的、无毒副作用的蛋白——所述的藻蓝蛋白β亚基与之融合，构建了无需再加工，或者无需再纯化的融合蛋白的表达质粒或转基因生物，以此获得的降钙素在表达、纯化过程中既减少蛋白酶的降解，又省却了切割等后加工步骤，提高了降钙素的表达量，增加了纯化及临床应用过程中的稳定性，降低了本发明的降钙素的抗原性，增加其生物活性。本发明的融合蛋白具体结构是：将藻蓝蛋白β亚基基因融合在人和鲑鱼嵌合降钙素基因的上游构建成功融合基因，其融合基因的核苷酸序列与SEQ NO.1所示的核苷酸序列具有100％的同源性，该融合基因是含有648bp的DNA片断。该融合蛋白是将藻蓝蛋白β亚基基因融合在人和鲑鱼降钙素嵌和体基因的上游经表达而获得的，该融合蛋白的分子量为23KDa，该融合蛋白的氨基酸序列与SEQ NO.2所示的氨基酸序列具有100％的同源性，该融合蛋白是含有213个氨基酸残基的多肽；该重组的融合蛋白的原核表达载体已由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号：CCTCC1261。
本发明的融合基因的制备方法，首次设计的(1)——(2)——(3)——(4)——(5)重要步骤：构建了pUC-BCT重组质粒，其含有长度为648bp的融合蛋白cpcB-CT基因片断。构建了pBCT重组表达质粒，转化大肠杆菌后经诱导获得的蛋白能够与人降钙素抗体发生特异性反应。本发明首次设计的上述(1)——(5)步骤，其方法简便，切实可行；该上述步骤在表达、纯化过程中，既减少蛋白酶的降解，又省却了切割等后加工步骤；首次设计的该上述步骤增加了降钙素在纯化及临床应用过程中的稳定性，降低了其抗原性，增加其生物活性。本发明在上述步骤(2)中的②步的PCR扩增β亚基时，所设计的引物cpcB1和引物cpcB2，其序列如下：
cpcB1：5′-ggaattccatatgtttgatgccttcac-3′；
cpcB2：5′-cgggatccaccagatccaccgccggaaacygcygcagcagcacggtc-3′。
两该引物cpcB1和引物cpcB2的设计确保PCR扩增β亚基，并使得筛选重组质粒——pCPCB获得成功。本发明在上述步骤(2)中的④步的PCR扩增嵌合降钙素基因时，所设计的引物CT1和CT2是以③步中的pUC19-cCT为模板；该引物CT1和CT2的序列如下：
CT1：5′-cgggatccggtctgtgcggtaacctgtc-3′；
CT2：5′-acatgcatgctcattacggagtaccagaaccg-3′。
两该引物CT1和CT2在将扩增降钙素嵌合基因插入上述步骤(2)中的②步的重组质粒pCPCB中，使得构建带有融合基因BCT的重组质粒——pUC-BCT获得成功。
由于本发明的融合蛋白是含有213个氨基酸残基的多肽，使得带有降钙素的本发明融合蛋白(基因是含有648bp)的分子比原嵌合降钙素(基因长111bp)要大得多，因此提高了本发明融合蛋白在溶液中的稳定性，即增加了在纯化及临床应用过程中的稳定性，进而使目的蛋白获得率提高；无需再加工，或者无需纯化，该工艺方法简便，切实可行。本发明的融合基因已经整和入集胞藻基因组并获得高效表达。本发明的嵌合降钙素的融合基因也已经转化入酿酒酵母并获得高效表达。
附图及其具体实施方式
本发明的实施例结合附图进一步说明如下：
图1为融合基因的构建流程图。
图2为原核表达载体的构建流程图。
图3为重组质粒pBCT PCR产物2％凝胶电泳分析图。
图4为融合基因的原核表达SDS-PAGE检测与免疫印迹分析图。
图5为免疫荧光测定图。
图6为ELISA定量测定融合蛋白图。
图7为重组蛋白的大鼠测定降血钙活性图。
图8为融合基因的序列表图SEQ NO.1。
图9为融合基因的氨基酸序列表SEQ NO.2。
图10为嵌合降钙素核苷酸序列表SEQ NO.3。
图11为嵌合降钙素氨基酸序列表SEQ NO.4。
图12为藻蓝蛋白β亚基核苷酸序列表SEQ NO.5。
图13为藻蓝蛋白β亚基氨基酸序列表SEQ NO.6。
图14为连接肽的核苷酸序列表SEQ NO.7。
图15为连接肽的氨基酸序列表SEQ NO.8。
参见图1——7的附图说明，
图1的融合基因的构建流程的附图说明见实施例1和实施例2。
图2的原核表达载体的构建流程的附图说明见实施例3。
图3中有CT的特异引物扩增带1；cpcB的特异引物扩增带2；CT上游与cpcB的下游特异引物扩增带3；pLEX载体通用引物扩增带4；DNA Marker DL2000表示5。
图4中有蛋白小分子量标准1；BCT/pLEX/GI724表达产物超声后沉淀2；BCT/pLEX/GI724表达产物超声后上清3；BCT/plEX/GI724L2表达全菌4；pLEX/GI724在同样时间下的诱导表达产物全菌5；6、7、8、9分别为2、3、4、5的免疫印迹结果。
图5中A为重组藻蓝蛋白β亚基作为抗原对照的荧光照片，B为重组融合蛋白作为抗原的荧光照片。
图6中有用hCT标准品的读数所做的标准曲线。重组蛋白作一定比例稀释，测定重组蛋白的浓度。
图7中有溶媒对照(0.1M.NaAC)A；cpcB对照(0.12mg)B；Mecalcic(3.5KD)C 80mIU；BCT(23KD)D 100μg；BCT(23KD)E 50μg。
图8——图15为各序列表SEQ NO.1——8，见图结构。
实施例1.嵌合基因制备：
依人和鲑鱼的降钙素为先导，利用计算机辅助软件设计系列嵌合体，从中筛选高活性、低抗原性的降钙素类似物，即能够具有降血钙活性、与人CT有相似抗原性的CT类似物。利用化学合成与酶相结合方法，获得嵌合降钙素基因，导入克隆载体pUC19，构建重组质粒pUC19-cCT，经测序，与预期序列一致，见图1。
实施例2.融合基因制备：
将节旋藻(螺旋藻)/Arthrospira(Spirulina)platensis FACHB341的藻蓝蛋白β亚基基因融合在上述嵌合降钙素基因的上游，在两基因间设计连接序列，使两种肽在折叠中相对独立，构建含有融合基因的克隆载体，其步骤如下；
①设计一对引物：以节旋藻(螺旋藻)藻蓝蛋白β亚基为模板设计引物cpcB1和cpcB2，在引物cpcB1中包含EcoR I、Nde I位点，在引物cpcB2中包含BamH I位点，同时也是接头的两个氨基酸(GlySer)的反向编码，随后是编码连接肽N端的5个氨基酸(GlyGlyGlySerGly)和cpcB C端的8个氨基酸的反向互补编码序列，并在引物cpcB2的3′端设计简并引物，消除了cpcB原有的终止密码子；
cpcB1：5’-ggaattccatatgtttgatgccttcac-3’
cpcB2：5’-cgggatccaccagatccaccgccggaaacygcygcagcagcacggtc-3’
②PCR扩增β亚基：采用PCR扩增藻蓝蛋白β亚基，获得538bp大小β亚基基因片断，经2％凝胶电泳回收，用EcoR I和BamH I切割，连入经同样酶切的载体中，筛选重组质粒，命名为pCPCB；
③设计另对引物：以pUC19-cCT为模板设计引物CT1和CT2；在CT15‘端的BamHI位点和紧接上的GGT编码连接肽C端的3个氨基酸(GlySerGly)，随后是cCT N端的5个氨基酸的编码序列，CT2包含SphI位点、终止密码子及cCT C端的5个氨基酸的反向互补编码序列；
CT1：5’-cgggatccggtctgtgcggtaacctgtc-3’；
CT2：5’-cggaattcctcattacggagtaccagaaccg-3’。
④PCR扩增嵌合降钙素基因：采用PCR扩增嵌合降钙素基因，回收片断用BamH I和Sph I切割；
⑤融合：连入经同样酶切的②步的重组质粒pCPCB中，构建了带有融合基因BCT的重组质粒，命名为pUC-BCT，该pUC-BCT重组质粒含有长度为648bp的融合蛋白cpcB-CT基因；该融合基因以连接序列连接，即柔性连接肽与嵌合降钙素连接的，该连接肽的核苷酸序列与SEQ NO.7具有100％同源性。含融合基因的质粒再经双重PCR筛选、酶切鉴定重组子，测序证实基因框架正确后，转化DH5α，筛选重组菌落，获得大肠杆菌工程菌pUC-BCT/DH5α。
融合基因的构建流程图，见图1。
实施例3.融合基因的表达：
①含融合基因的表达载体的构建：用NdeI和SphI切割上述(2)中的⑤步的重组质粒pUC-BCT，再连入经同样内切酶切割的表达载体pLEX中，用pLEX测序引物和cpcB1-CT2特异引物双重PCR筛选，结合酶切鉴定筛选重组表达质粒，命名为pBCT；见图2原核表达载体的构建流程图；
②转化大肠杆菌GI724：
用氯化钙和氯化锰转化法转化大肠杆菌GI724，于RMG-Amp平板挑出目的克隆菌落，30℃斜线培养12-16小时；
③从第一天的平板中挑选一单克隆于1ml RM培养基(100μg/ml Amp)中，30℃、以200-225rpm/min的转速震荡培养，过夜；
④按接种量为OD550＝0.1接种于10ml诱导培养基(100μg/ml Amp)中，30℃、培养2～3小时，至OD550＝0.5；
⑤当OD550达到0.5时，移出1ml样品于微量离心管中，高速离心2～3分钟，沉淀细胞，倒出上清，-20℃保存待用，其余细菌继续培养；
⑥加入色氨酸至终浓度100μg/ml，将培养物转至37℃震荡培养；
⑦每隔1小时取样一次，同步骤⑤；
沉淀经快速超声破碎—冻融2次以上循环，超速离心后，分上清与沉淀保存至SDS-PAGE凝胶电泳分析，通过改变诱导时间优化表达条件，最终得该融合蛋白的原核表达载体——大肠杆菌工程菌pBCT/GI724，其保藏号为：CGMCC№
1261，保藏日期2004年12月8日，分类命名：大肠埃希氏菌。
结果：SDS-PAGE电泳测定分子大小为23KD；灰度扫描测定可溶性重组融合蛋白占菌体总蛋白的8-20％；诱导时间为2-5小时，见图4。
实施例4.重组蛋白的特异性分析：
电泳后凝胶电转移过夜，Western blotting测定目的蛋白的特异性，结果证明重组蛋白能够与人降钙素抗体发生特异性反应，对照菌株pLEX/GI724无杂交条带。见图4
实施例5.免疫荧光方法测定重组蛋白的活性：
1).胰酶消化体外培养的MCF-7细胞(含有CT受体)，加入6孔细胞培养板(培养板内预先置入用多聚赖氨酸处理，并灭菌的玻片)，5％CO2培养箱内培养。细胞长成单层后，将玻片取出置载玻片上，95％乙醇固定10min，PBS冲洗。受体阴性细胞采用体外培养的MDA-468。
2).20％山羊血清封闭20min，0.02M(PH7.2)，PBS洗涤。
3).加入重组蛋白，设密盖息作为阳性对照，单独表达的cpcB作为阴性对照。
4).重组蛋白(浓度200ng/ml)，1∶100稀释，加入到封闭好的玻片上，37℃湿盒中温育60min，PBS冲洗，再加入一抗-兔抗人降钙素抗体，37℃湿盒中温育60min。
5).取出玻片，PBS洗涤5min，冷风吹干，加入异硫氰酸荧光素(FITC)标记的二抗-羊抗兔IgG，37℃湿盒中温育60min孵育1h，PBS洗涤，冷风吹干，10％甘油封片，于荧光显微镜下观察；结果：获得的重组融合蛋白通过免疫荧光测定，能够与受体结合，并具有与人降钙素抗体特异结合的活性。单独表达的cpcB不能与受体结合。对照组中，cpcB与MCF-7，重组融合蛋白、密盖息与固定的MDA-468细胞均未观察到荧光。见图5。
实施例6.ELISA-R法测定活性及定量：
1).以重组蛋白包被ELISA板，留一孔做空白对照，2.5％的BSA封闭，在7个孔中分别加入100μl 50ng/ml、25ng/ml、5ng/ml、1ng/ml 0.2ng/ml、0.04ng/ml、0ng/ml的鲑鱼降钙素标准品，用酶联免疫监测仪测定每孔在492nm的光吸收值，以大于阴性对照的2.1倍作为阳性标准，用标准品的读数作标准曲线，以测定样品中降钙素的含量，见图6。
2).用ELISA-受体法。包被从体外培养的细胞MCF-7提取的降钙素受体，4℃过夜。除对照外，各孔加入不同浓度的重组蛋白，以PBST为空白对照，以不加入抗原作为阴性对照。用密盖息作阳性对照并作剃度稀释，37℃湿盒中温育60min，在每一孔中加入鲑鱼降钙素抗体，37℃孵育45min，PBST洗板3-4次，加入辣根过氧化物酶标记二抗，1h后，PBST洗板，吸干液体，OPD显色6-8min，12％硫酸终止，用酶联免疫监测仪测定每孔在492nm的光吸收值，以大于阴性对照的2.1倍作为阳性标准，测定重组蛋白的生物效价；结果：重组蛋白经间接ELISA测定，证实具有抗原性，并能够与受体结合。纯化的融合蛋白用同样方法测定其含量为250μg/L。
实施例7.体内实验-大鼠降血钙试验测定降血钙活性：
Wister大鼠，180-220g，雌雄各半。实验前随即分组。以针剂密盖息为标准品，以重组的cpcB为阴性对照，以溶媒(0.1M的乙酸钠，PH6)为空白对照，融合蛋白分高(40μg/只)、低剂量(10μg/只)组，对禁食18h的大鼠行腹部皮下注射，1h后取眼眶静脉血，测定血钙浓度和血糖浓度，统计学方法采用t检验；结果：50μg/只计剂量组与阴性对照组相比有明显差异，P＜0.05。100μg/只剂品量组与标准组(80mIU/只)比较无明显差异，P＞0.05。结合ELISA-受体法测得的结果，推测融合蛋白的生物效价为0.8-1IU/mg，具有一定的降血钙作用，见图7。
实施例8.目的蛋白的纯化：
诱导表达5h的菌液离心得菌体，经超声破碎，取上清。取10ml均分置于10个管中，加入固态硫酸铵，浓度为20％饱和度-100％饱和度，经快速蛋白质印迹筛选，85％饱和硫酸铵为最佳沉淀浓度。经硫酸铵初步纯化后，过Sephardex葡聚糖凝胶层析柱，0.02M磷酸盐、0.1MKCL洗脱获二级纯化的蛋白；纯化的重组蛋白经检测与抗人降钙素抗体发生强阳性反应，与抗鲑鱼降钙素抗体仅有微弱反应，融合蛋白能够与受体结合，并具有降血钙作用。
实施例9.本发明的融合基因向集胞藻的转化应用：
用CT的下游引物(带有Not I酶切位点)和cpcB的上游引物共同扩增融合基因BCT，经Nde I切割、平端化后，再用Not I切割，插入经BamH I切割、平端化后再用Not I切割的中间载体pUC-PK(该载体为本实验室构建，带有铁缺乏诱导启动子和卡那霉素抗性基因)，以一端平一端粘的方式连入，可保证插入片段的正确性，转化大肠杆菌JM109，以氨苄青霉素、卡那霉素双抗筛选重组菌落，PCR、酶切鉴定重组质粒，命名为pPKBCT，用Apa I、Xhol I切割，回收3.7kb大小的片段，插入经同样酶切的同源重组载体pGROE(该载体为本实验室构建，带有同源重组平台-热休克蛋白基因)，经双抗筛选、PCR鉴定重组菌落，测序证明基因框架正确后，将重组质粒自然转化对数生长期的集胞藻，卡那霉素平板筛选单藻落，扩大培养后，经、Southern杂交，RT-PCR、SDS-PAGE电泳、Western blotting证实，融合基因整和入集胞藻基因组并获得表达。
实施例10.本发明的嵌和降钙素基因向酿酒酵母的转化应用：
1).提取重组质粒pPKBCT，用BamH I和Not I酶切割，回收cCT基因，插入经同样酶切的空质粒载体pYD中。
2).氯化钙法转化大肠杆菌DH5α，双重PCR筛选重组菌落。
3).酚氯仿法提取重组质粒pYD/cCT。
4).将构建好的质粒导入用醋酸锂处理的酿酒酵母细胞EBY100，在色氨酸缺陷的选择培养基上筛选阳性转化子，获表达CT的转基因酿酒酵母，pYD/cCT/EBY100。
5).半乳糖诱导下30℃表达重组降钙素。
6).免疫荧光及流式细胞仪检测重组肽的表达。
本领域的普通技术人员都会理解，在本发明的保护范围内，对于上述实施例进行修改，添加和替换都是可能的，其都没有超出本发明的保护范围。
Claims (9)
1、一种融合蛋白，其特征在于：该蛋白是将藻蓝蛋白β亚基基因融合在人和鲑鱼嵌合降钙素基因的上游经表达而获得的，其融合基因的核苷酸序列与SEQ NO.1所示的核苷酸序列具有100％的同源性，该融合基因是含有648bp的DNA片段。
2、一种融合蛋白，其特征在于：该融合蛋白是将藻蓝蛋白β亚基基因融合在人和鲑鱼嵌合降钙素基因的上游经表达而获得，该融合蛋白的分子量为23KDa，该融合蛋白的氨基酸序列与SEQ NO.2所示的氨基酸序列具有100％的同源性，该融合蛋白是含有213个氨基酸残基的多肽；该融合蛋白的原核表达载体——大肠杆菌工程菌pBCT/GI724已由中国微生物菌种保藏中心保藏，保藏号为：CGMCCo№
1261，分类命名：大肠埃希氏菌。
3、根据权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于：所述的人和鲑鱼嵌合降钙素基因，其大小为111bp，核苷酸序列与SEQ NO.3所示的核苷酸序列具有100％的同源性，其编码34个氨基酸残基的多肽，氨基酸序列与SEQ NO.4所示的氨基酸序列具有100％同源性，其中前20个氨基酸中16个为人源性，第1位是疏水性亮氨酸，或是缬氨酸，或缺失；第9位是疏水性亮氨酸，或是甲硫氨酸；第17位是丙氨酸，或是苯丙氨酸；第18位为天冬酰胺，或是组氨酸；第19位氨基酸人鱼相同；第20位为苯丙氨酸，或是谷氨酰胺；后13个氨基酸为鲑鱼源性；第34位为甘氨酸，或为精氨酸，或缺失；
该嵌合体的具体氨基酸序列如下：
Lea Cys Gly Asn Leu Ser Thr Cys Leu Leu Gly Thr Tyr Thr Gln
1 5 9 10 15
Asp Ala Asn Lys phe Gln Thr Tyr Pro Arg Thr Asn Thr Gly Ser
16 19 20 25 30
Gly Thr Pro Gly。
31 34
4、根据权利要求2所述融合蛋白，其特征在于：所述的藻蓝蛋白β亚基，其基因大小为519bp，核苷酸序列与SEQ NO.5所示的核苷酸序列具有100％的同源性，其编码171个氨基酸残基的多肽，氨基酸序列与SEQ NO.6所示序列具有100％同源性。
5、根据权利要求2所述融合蛋白，其特征在于：所述的藻蓝蛋白β亚基，其是通过柔性连接肽与嵌合降钙素连接的，该连接肽基因长24bp，核苷酸序列与SEQ NO.7具有100％同源性，其氨基酸序列与SEQ NO.8具有100％同源性。
6、一种按照权利要求1所述融合蛋白的制备方法，其特征在于：所述的融合基因制备方法，有如下步骤：
(1)嵌合基因制备：
依人和鲑鱼的降钙素为先导，利用计算机辅助软件设计系列嵌合体，利用化学合成与酶相结合方法，获得嵌合降钙素基因，经EcoRI和BamHI切割后，连入经同样内切酶切割的克隆载体pUC19，构建重组质粒pUC19-cCT，经测序，与预期序列一致；
(2)融合基因制备：
将节旋藻(Arthrospira platensis FACHB341)的藻蓝蛋白β亚基基因融合在上述嵌合降钙素基因的上游，在两基因间设计连接序列，使两种肽在折叠中相对独立，构建含育融合基因的克隆载体，其步骤如下；
①设计一对引物：以节旋藻藻蓝蛋白β亚基为模板设计引物cpcB1和cpcB2，在引物cpcB1中包含EcoRI、NdeI位点，在引物cpcB2中包含BamHI位点，同时也是接头的两个氨基酸(GlySer)的反向编码，随后是编码连接肽N端的5个氨基酸(GlyGlyGlySerGly)和cpcBC端的8个氨基酸的反向互补编码序列，并在引物cpcB2的3′端设计简并引物，消除了cpcB原有的终止密码子；
②PCR扩增β亚基：采用PCR扩增藻蓝蛋白β亚基，获得538bp大小β亚基基因片断，经2％凝胶电泳回收，用EcoRI和BamHI切割，连入经同样酶切的载体中，筛选重组质粒，命名为pCPCB；
③设计另对引物：以pUC19-cCT为模板设计引物CT1和CT2；在CT15‘端的BamHI位点和紧接上的GGT编码连接肽C端的3个氨基酸(GlySerGly)，随后是cCTN端的5个氨基酸的编码序列，CT2包含SphI位点、终止密码子及cCTC端的5个氨基酸的反向互补编码序列；
④PCR扩增嵌合降钙素基因；采用PCR扩增嵌合降钙素基因，回收片断用BamHI和SphI切割；
⑤融合：连入经同样酶切的②步的重组质粒pCPCB中，构建了带有融合基因BCT的重组质粒，命名为pUC-BCT，该pUC-BCT重组质粒含有长度为648bp的融合蛋白cpcB-CT基因；再经双重PCR筛选、酶切鉴定重组子，测序证实基因框架正确后，转化DH5α，筛选重组菌落，获得大肠杆菌工程菌pUC-BCT/DH5α。
7、根据权利要求6所述融合蛋白的制备方法，其特征在于：所述的(2)中的①步引物cpcB1和引物cpcB2，其序列如下：
cpcB1：5′-ggaattccatatgtttgatgccttcac-3′；
cpcB2：5′-cgggatccaccagatccaccgccggaaacygcygcagcagcacggtc-3′；
所述的(2)中的③步引物CT1和CT2，其序列如下：
CT1；5′-cgggatccggtctgtgcggtaacctgtc-3′；
CT2：5′-acatgcatgctcattacggagtaccagaaccg-3′。
8、一种按照权利要求2所述融合蛋白的制备方法，其特征在于：所述的融合蛋白制备方法，有如下步骤：
(1)嵌合基因制备：
依人和鲑鱼的降钙素为先导，利用计算机辅助软件设计系列嵌合体，利用化学合成与酶法相结合，获得嵌合降钙素基因，经EcoRI和BamHI切割后，连入经同样内切酶切割的克隆载体pUC19，构建重组质粒pUC19-cCT，经测序，与预期序列一致；
(2)融合基因制备：
将节旋藻(Arthrospira platensis FACHB341)的藻蓝蛋白β亚基基因融合在上述嵌和降钙素基因的上游，在两基因间设计连接序列，使两种肽在折叠中相对独立，构建含有融合基因的克隆载体，其步骤如下：
①设计一对引物：以节旋藻藻蓝蛋白β亚基为模板设计引物cpcB1和cpcB2，在引物cpcB1中包含EcoRI、NdeI位点，在引物cpcB2中包含BamHI位点，同时也是接头的两个氨基酸(GlySer)的反向编码，随后是编码连接肽N端的5个氨基酸(GlyGlyGlySerGly)和cpcBC端的8个氨基酸的反向互补编码序列，并在引物cpcB2的3′端设计简并引物，消除了cpcB原有的终止密码子；
②PCR扩增β亚基：采用PCR扩增藻蓝蛋白β亚基，获得538bp大小β亚基基因片断，经2％凝胶电泳回收，用EcoRI和BamHI切割，连入经同样酶切的载体中，筛选重组质粒，命名为pCPCB；
③设计另对引物：以pUC19-cCT为模板设计引物CT1和CT2；在CT15′端的BamHI位点和紧接上的GGT编码连接肽C端的3个氨基酸(GlySerGly)，随后是cCTN端的5个氨基酸的编码序列，CT2包含SphI位点、终止密码子及cCTC端的5个氨基酸的反向互补编码序列；
④PCR扩增降钙素嵌和基因：采用PCR扩增嵌和降钙素基因，回收片断用BamHI和SphI切割；
⑤融合：插入经同样酶切的②步的重组质粒pCPCB中，构建了带有融合基因BCT的重组质粒，命名为pUC-BCT，该pUC-BCT重组质粒含有长度为648bp的融合蛋白cpcB-CT基因；再经双重PCR筛选、酶切鉴定重组子，测序证实基因框架正确后，转化DH5α，筛选重组菌落，获得大肠杆菌工程菌pUC-BCT/DH5α；
(3)重组融合基因的表达：
①含融合基因的表达载体的构建：用NdeI和SphI切割上述(2)中的⑤步的重组质粒pUC-BCT，再连入经同样内切酶切割的表达载体pLEX中，用pLEX测序引物和cpcB1-CT2特异引物双重PCR筛选，结合酶切鉴定筛选重组表达质粒，命名为pBCT；
②转化大肠杆菌GI724：
用氯化钙和氯化锰转化法转化大肠杆菌GI724，于RMG-Amp平板挑出目的克隆菌落，30℃斜线培养12-16小时；
③从第一天的平板中挑选一单克隆于1ml 100μg/ml Amp的RM培养基中，30℃、以200-225rpm/min的转速震荡培养，过夜；
④按接种量为OD550＝0.1接种于10ml 100μg/ml Amp的诱导培养基中，30℃、培养2～3小时，至OD550＝0.5；
⑤当OD550达到0.5时，移出1ml样品于微量离心管中，高速离心2～3分钟，沉淀细胞，倒出上清，-20℃保存待用，其余细菌继续培养；
⑥加入色氨酸至终浓度100μg/ml，将培养物转至37℃震荡培养；
⑦每隔1小时取样一次，同步骤⑤；
沉淀经快速超声破碎一冻融2次以上循环，超速离心后，分上清与沉淀保存至SDS-PAGE凝胶电泳分析，通过改变诱导时间优化表达条件，最终得该融合蛋白的原核表达载体——大肠杆菌工程菌pBCT/GI724，其保藏号为：CGMCC№
1261，分类命名：大肠埃希氏菌；
结果：SDS-PAGE电泳测定分子大小为23KD；灰度扫描测定可溶性重组融合蛋白占菌体总蛋白的8-20％；诱导时间为2-5小时；
(4)重组蛋白的特异性分析：
电泳后凝胶电转移过夜，用Western blotting测定重组融合蛋白的特异性；结果证明该融合蛋白能够与人降钙素抗体发生特异性反应，对照菌株pLEX/GI724无杂交条带。
9、根据权利要求8所述融合蛋白的制备方法，其特征在于：所述的(2)中的①步引物cpcB1和引物cpcB2，其序列如下：
cpcB1：5′-ggaattccatatgtttgatgccttcac-3′；
cpcB2：5′-cgggatccaccagatccaccgccggaaacygcygcagcagcacggtc-3′；
所述的(2)中的③步引物CT1和CT2，其序列如下：
CT1：5′-cgggatccggtctgtgcggtaacctgtc-3′；
CT2：5′-acatgcatgctcattacggagtaccagaaccg-3′。
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