CN104560753A - 转人-鲑嵌合降钙素串联基因酵母YS-5hsCT及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种转人-鲑嵌合降钙素串联基因酵母YS？-5hsCT及其制备方法和应用，本发明构建含5拷贝人-鲑嵌合降钙素串联基因的质粒，酶切获得线性DNA片段rDNA2-ura3-P_pgk-5hsCT-rDNA1，以rDNA为同源重组位点介导整合到酿酒酵母中获得转基因酵母YS-5hsCT。实现外源基因在酵母细胞内的高效稳定表达，大大提高了降钙素的表达量，更重要的是消除了抗生素等选择标记给后期工业化生产带来的环境方面不良影响或食品安全性问题。酿酒酵母生产周期短，发酵技术成熟，安全性好，且转基因酿酒酵母不需要蛋白提取、切割加工和纯化等繁琐工艺就可以直接口服，极大地降低了工业化生产成本。基本可以实现降钙素的口服给药。

Description

转人-鲑嵌合降钙素串联基因酵母YS-5hsCT及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术和生物工程技术领域，具体涉及转人-鲑嵌合降钙素串联基因酵母YS-5hsCT及其制备方法和应用。

背景技术

降钙素(calcitonin，简称CT)是由32个氨基酸残基组成的一种多肽类激素，由鱼、鸟类等脊椎动物的后腮体或哺乳动物的甲状腺滤泡旁细胞(C细胞)分泌的。自从Copp等人1961年首次发现降钙素以来，人们对其分子结构和作用机理进行了广泛的研究。不同来源的降钙素氨基酸序列不同，但不同生物的降钙素对人都有活性，后鳃体来源的降钙素活性高于甲状腺来源的降钙素。目前在临床上以鲑鱼降钙素(salmon calcitonin，简称sCT)活性最高，是人降钙素(human calcitonin，简称hCT)活性的20－40倍。降钙素已经在临床上应用多年，主要用于预防和治疗老年性骨质疏松、Paget氏综合症、高钙血症等，并作为糖尿病、胃溃疡、急性胰肠炎等疾病的辅助治疗药物。目前降钙素已经开发上市的剂型只有注射和鼻喷给药两种，无口服给药剂型，临床使用最多的是化学合成的鲑鱼降钙素注射剂(如密盖息、盖瑞宁等)。由于降钙素生物半衰期短，临床给药时间长达12个月以上，对于患者来说用药极为不便，且伴有额外的痛苦；并且生物当中的降钙素含量极微，而化学合成的降钙素产量低、造价昂贵且容易造成环境污染，极大地限制了降钙素的广泛使用。

随着基因工程技术的兴起和发展，利用高效的生物表达系统(原核表达系统和真核表达系统)制备廉价的降钙素成为可能。近二十年，国内外利用生物工程技术已经获得降钙素的多种表达方式。原核表达系统中外源蛋白产量高，生产周期短，但无法对外源蛋白进行转录后修饰，酰胺化工艺水平直接影响重组表达降钙素的活性，且细菌易产生热源和内毒素，不易除去，蛋白纯化工艺复杂，生产成本很高。真核表达系统可对外源蛋白进行酰胺化修饰，节约了生产成本，但外源基因的表达量普遍较低，生产周期较长、蛋白提取和纯化工艺更为复杂，限制了其在生产中的应用。并且降钙素分子太小，在溶液中极不稳定，真核表达系统仍无法避免蛋白提取、切割、纯化等烦琐的后续工作，严重影响目的蛋白的得率。所以，目前存在的问题迫切地要求发展一种更廉价更高效的真核表达系统。

2001年，Blanquet在“Trends Biotechnol”上提出了“biodrug”的概念，指出冷冻干燥后的重组酿酒酵母可在消化液存在的条件下作为载体运输口服多肽。酿酒酵母被认为是食品安全级的真核微生物，生产周期短，发酵技术相当成熟。冷冻干燥后的酵母对胃肠道的抗降解能力强，对表达的产物能起到良好的保护作用。而且研究表明，降钙素能够以多肽的形式直接穿过动物胃肠道的表皮细胞进入血液。因此用酿酒酵母表达降钙素，可直接口服，免去蛋白提取、切割加工和纯化等工艺，极大地节约了工业化生产成本，为降钙素的临床应用提供一条有效廉价的给药途径。

发明内容

本发明提供了转人-鲑嵌合降钙素串联基因酵母YS-5hsCT及其制备方法和应用，本发明以rDNA为同源重组位点将5拷贝人-鲑嵌合降钙素串联基因转入酵母，通过串联降钙素基因提高拷贝数，并以rDNA为同源重组位点实现降钙素基因在酿酒酵母基因组中的高拷贝稳定整合，从而提高降钙素在酿酒酵母中的表达量。本发明可以解决目前降钙素在表达系统中的表达量低、需纯化、活性低、造价高及不能口服给药等一系列的问题。更重要的是以ura3基因为酿酒酵母的遗传选择标记基因，消除了抗生素等选择标记给后期工业化生产带来的不良影响或不安全问题。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案予以实现：

酿酒酵母YS-△ura，其分类命名为酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为：CGMCC No.10014。

酿酒酵母YS-5hsCT，其分类命名为酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为：CGMCC No.10015。

本发明还提供了所述的酿酒酵母YS-5hsCT的制备方法，它包括如下步骤：

(1)5拷贝人-鲑嵌合降钙素串联基因5hsCT的克隆：

将5拷贝人-鲑嵌合降钙素串联基因5hsCT进行PCR反应扩增，连入克隆载体，构建含有5hsCT基因的重组载体；

(2)pgk基因启动子的克隆：

以酿酒酵母基因组DNA为模板，进行PCR反应扩增获得pgk基因，连入克隆载体，构建含有pgk基因的重组载体；

(3)选择标记基因ura3的克隆：

以酿酒酵母基因组DNA为模板，进行PCR反应扩增获得ura3基因，连入克隆载体，构建含有ura3基因的重组载体；

(4)rDNA基因的克隆：

以酿酒酵母基因组DNA为模板，分别进行PCR反应扩增获得rDNA1和rDNA2两个基因，分别连入克隆载体，分别构建含有rDNA1和rDNA2基因的重组载体；

(5)含人-鲑嵌合降钙素串联基因重组载体的制备：

先将rDNA1基因插入到克隆载体中，然后将5hsCT基因插入到rDNA1基因的上游，再将pgk基因插入到5hsCT的上游，构建含有P_pgk-5hsCT-rDNA1重组片段的重组载体1；

再将P_pgk-5hsCT-rDNA1重组片段插入到克隆载体中；

将rDNA2基因插入到pgk基因的上游，再将ura3基因插入到rDNA2和pgk之间，构建含有rDNA2-ura3-P_pgk-5hsCT-rDNA1重组片段的重组载体2；

(6)人-鲑嵌合降钙素串联基因向酿酒酵母的转化：

所述重组载体2经酶切获得线性DNA片段rDNA2-ura3-P_pgk-5hsCT-rDNA1，该线性片段转化酿酒酵母YS-△ura感受态细胞，转化子在SD/-Ura固体培养基上筛选重组子获得转基因酵母YS-5hsCT。

本发明还提供了所述的酿酒酵母YS-5hsCT在制备治疗骨质疏松症、Paget氏综合症和高钙血症的药物或保健品中的应用。所述酿酒酵母YS-5hsCT的用量为0.01g/kg以上。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：本发明通过将5个单拷贝人-鲑嵌合降钙素基因串联起来，单拷贝之间由一段柔性肽相连，合成一个新型5拷贝人-鲑嵌合降钙素串联基因(5hsCT)，提高了自身拷贝数和稳定性，再以rDNA为同源重组位点介导5拷贝人-鲑嵌合降钙素串联基因在酿酒酵母基因组中实现高拷贝数的稳定整合，实现外源基因在酵母细胞内的高效稳定表达，大大提高了降钙素的表达量，并采用酿酒酵母本身的组成型强启动子(pgk promoter)高效启动人-鲑嵌合降钙素的表达，同时以ura3基因为酿酒酵母的遗传选择标记基因，消除了抗生素等选择标记给后期工业化生产带来的不良影响或不安全问题。本发明实验证明所述转基因酵母YS-5hsCT灌胃正常小白鼠具有持续的降血钙能力。为降钙素的口服给药提供了新途径，增加其在纯化及临床应用过程中的稳定性，延长其生物半衰期，拓宽了降钙素在骨质疏松症等临床治疗上的应用，为降钙素在医疗事业上更广泛的使用提供了依据。

本发明通过将人-鲑嵌合降钙素在酿酒酵母这种真核系统中来表达，基于酿酒酵母生产容易、发酵技术已相当成熟、表达量较高的优势，其次酿酒酵母是食品安全级的模式真核微生物，可以直接食用，并且冷冻干燥后的酵母可缓解消化液环境下降解能力，减少降钙素的降解，使得降钙素能够以多肽的形式直接穿过动物胃肠道的表皮细胞进入血液。得到的转人-鲑嵌合降钙素串联基因的酿酒酵母可以直接口服，不需要蛋白提纯、切割加工和纯化等繁琐工艺，安全性好，从而极大地降低了生产成本，基本可以实现降钙素的口服给药。

附图说明

图1为重组克隆载体pUC18-rDNA2-ura3-Ppgk-5hsCT-rDNA1构建流程图；

图2为重组人-鲑嵌合降钙素5拷贝串联基因的表达框；

图3为重组克隆载体pUC18-rDNA2-ura3-Ppgk-5hsCT-rDNA1酶切验证结果图；

图4为利用PCR方法筛选酵母转化子电泳结果图；

图5为转基因酵母基因组DNA酶切结果及Southern Blot检测结果图；

图6为转基因酵母SDS-PAGE结果及Western Blot检测结果图；

图7为转基因酵母在小鼠体内的降血钙活性图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细的说明。

人-鲑嵌合降钙素基因(chimeric human-salmon Calcitonin，hsCT)以人和鲑鱼降钙素为先导物，以降低降钙素的抗原性、增加其生物活性为目的，对降钙素的基因进行改造，利用计算机辅助软件设计并合成了一种活性高、抗原性低的新型降钙素基因。该基因单拷贝全长为96bp，编码32个氨基酸，其中前16个氨基酸有14个人源氨基酸，后16个全部为鲑鱼源氨基酸，其活性高于hCT，而抗原性低于sCT。由于单拷贝人-鲑嵌合降钙素的分子量仅为3.5KD，在溶液环境下极不稳定。

酿酒酵母中存在高效的同源重组修复双链DNA断裂(DSB)机制，一些系统性的研究表明15bp长的同源区域就有可能获得重组克隆，当同源区域为30bp长时，有效同源重组的频率可接近80％，这使得酿酒酵母比其它生物更合适应用同源重组技术进行外源基因的重组克隆。酵母基因组中有100－200个重复rDNA单元，本发明以此为整合位点提高整合拷贝数。

筛选标记的存在可以便于重组子的筛选，提高筛选效率，使筛选工作量大大减少。对酿酒酵母而言，现今筛选标记主要使用抗生素标记。但是如果转化后的工程菌株拟应用于工、农业化生产，尤其是食品工业化生产时，抗生素筛选标记将不能满足工业要求。因为抗生素筛选标记的存在会对工程菌的发酵产生一系列食品安全、环境污染等方面的不利影响。现今，人们对食品安全性要求越来越高，寻找一种安全、可靠的筛选方法来替代抗生素标记成为必然趋势。本发明正是采用营养缺陷型标记基因转化的育种方法可以很好地解决上述问题。通过营养缺陷型标记获得的转化子不带抗生素标记，在代谢产物生产中不会出现抗生素问题的困扰。本发明利用前期筛选出的尿嘧啶缺陷型酿酒酵母菌株YS-△ura，采用此菌株为受体菌，以rDNA重复单元作为同源重组位点将野生型尿嘧啶基因(ura3)介入酿酒酵母基因组，通过ura3基因的表达来筛选转化子，有利于人-鲑嵌合降钙素的工业化生产。

实施例1：转人-鲑嵌合降钙素串联基因酵母的制备

1、5拷贝人-鲑嵌合降钙素串联基因的制备

根据5拷贝人-鲑嵌合降钙素串联基因5hsCT基因(如序列表SEQ ID No:1序列所示)DNA序列设计引物，在引物5hsCT-F和5hsCT-R上分别引入Xba Ⅰ和Sac Ⅰ位点。引物序列分别为：

5hsCT-F：5′-GCTCTAGAATGCTGTGCGGCAACCTG-3′(SEQ ID No:7)；

5hsCT-R：5′-CGAGCTCTCATTACGGGGTGCCGGAGCCGGTG-3′(SEQ ID No:8)。

构建质粒pUC18-5hsCT，并以其为模板进行PCR反应，PCR反应程序:94℃预变性5min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃保温8min。PCR产物经2％琼脂糖凝胶电泳检测回收约560bp后，克隆到pMD18-T载体上，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，培养后挑选单菌落，经PCR、酶切鉴定筛选出阳性克隆菌株，经测序分析，所述5拷贝人-鲑嵌合降钙素串联基因(如序列表SEQ ID No:1序列所示)可编码186个氨基酸残基，其第1位为起始密码子的甲硫氨酸，第2位为增加疏水性、保护二硫键而增加的亮氨酸，第186位之后两个氨基酸为连续的终止密码子，分子量为19.5KD，编码产生的氨基酸序列如序列表SEQ ID No:2所示。

本发明所用的酿酒酵母受体为Saccharomyces cerevisiae，即Saccharomyces cerevisiaeYS-△ura。所述人-鲑嵌合降钙素串联基因(5hsCT)为5个单拷贝人-鲑嵌合降钙素基因串联而成，单拷贝之间由一段柔性肽连接，5个单拷贝之间有4个柔性肽，所述柔性肽的DNA序列为GGCTCGTCGAGTGGTGTG，氨基酸序列为Gly-Ser-Ser-Ser-Gly-Val。

2、pgk基因启动子的克隆：

人-鲑嵌合降钙素串联基因之前为pgk promoter(P_pgk，磷酸甘油酸激酶基因启动子)，它是酿酒酵母系统中启动效率最强的启动子之一，且为组成型启动子，不受碳源抑制，在不改变培养条件下可实现5hsCT在酿酒酵母细胞内连续表达。

根据GenBank(GenBank Accession No.X59720.2)公布的pgk基因序列(SEQ ID No：3所示)，分别在其起始密码子ATG上游-1477bp处和-7bp处设计上下游引物，引物命名分别为Ppgk-F和Ppgk-R，并在上游引物5′末端引入HindⅢ和SalⅠ位点，在下游引物3′末端引入XbaⅠ位点。引物序列分别为:

P_pgk-F：5′-AAGCTTGTCGACTCTAACTGATCTATCCAAAACTGAAA-3′(SEQ ID No:9)；

P_pgk-R：5′-TCTAGAATATTTGTTGTAAAAAGTAGATAATTACT-3′(SEQ ID No:10)。

以酿酒酵母基因组DNA为模板，PCR反应程序:94℃预变性5min；94℃变性30s，51℃退火30s，72℃延伸1.5min，30个循环；72℃保温8min。PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测后回收约1490bp，克隆到pMD18-T载体上，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，培养后挑选单菌落，经PCR、酶切鉴定筛选出阳性克隆菌株，经测序分析，与预期序列一致(如序列表SEQ ID No:3序列所示)。

3、ura3遗传选择标记基因的克隆：

根据GenBank(GenBank Accession No.NC_001137.3)公布的ura3基因序列(SEQ ID No:4所示)，分别在其起始密码子ATG上游-255bp处和下游+1004bp处设计上下游引物，命名分别为ura3-F和ura3-R，并在上下游引物均引入SalⅠ位点。引物序列分别为:

ura3-F：5′-GTCGACAAGGTTAATGTGGCTGTGGTTTC-3′(SEQ ID No:11)；

ura3-R：5′-GTCGACAAAATACTGTTACTTGGTTCTGG-3′(SEQ ID No:12)。

以酿酒酵母基因组DNA为模板，PCR反应程序:94℃预变性5min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1.5min，30个循环；72℃保温10min。PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测后回收约1600bp，克隆到pMD18-T载体上，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，培养后挑选单菌落，经PCR、酶切鉴定筛选出阳性克隆。经测序，所述的ura3基因位于pgkpromoter之前，作为酿酒酵母遗传转化的选择标记基因，该ura3基因全长为1611bp，经序列比对分析得出48～262bp为ura3基因的启动子序列，263～1405bp为基因编码区，1406bp之后序列为polyA尾序列。除了基因编码区中有339bp是GenBank公布的ura3基因序列(GenBank Accession No.NC_001137.3)中不包含的，推测是内含子序列之外，其他与预期序列一致。(如序列表SEQ ID No:4序列所示)。

4.rDNA片段的克隆：

参考Lopes等发现rDNA中有一段从5S到25S之间的DNA序列能介导外源基因稳定的整合，选择rDNA序列(GenBank Accession No.NC_001144.5)中Hpa Ⅰ位点两侧的两段rDNA序列介导外源基因与酿酒酵母基因组的同源重组，设计其引物分别命名为rDNA1-F和rDNA1-R、rDNA2-F和rDNA2-R。设计引物时rDNA1-F的5′末端引入BamH Ⅰ和Sac Ⅰ位点，rDNA1-R的3′末端引入Hpa Ⅰ和EcoR Ⅰ位点。引物rDNA2-F的5′末端引入Sph Ⅰ和Hpa Ⅰ位点，rDNA2-R的3′末端引入Sal Ⅰ位点。引物序列分别为:

rDNA1-F：5′-GGATCCGAGCTCACCTACCGACCAACTTTCA-3′(SEQ ID No:13)；

rDNA1-R：5′-GAATTCGTTAACAGGACATGCCTTTGATAT-3′(SEQ ID No:14)；

rDNA2-F：5′-GCATGCGTTAACTATAGGAAATGAGCTTTTCT-3′(SEQ ID No:15)；

rDNA2-R：5′-GTCGACGCGAAACCACAGCCAAGG-3′(SEQ ID No:16)；

以酿酒酵母基因组DNA为模板进行PCR反应，PCR反应程序:94℃预变性5min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃保温7min。PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测回收约1100bp和1460bp后，分别克隆到pMD18-T载体上，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，培养后挑选单菌落，经PCR、酶切鉴定筛选出阳性克隆菌株，经测序分析，所述的rDNA片段分别位于线性DNA片段rDNA2-ura3-P_pgk-5hsCT-rDNA1的两侧，线性DNA片段rDNA2-ura3-P_pgk-5hsCT-rDNA1通过rDNA位点与酿酒酵母发生同源重组，该rDNA1片段和rDNA2片段长度分别为1102bp和1474bp，寡核苷酸长链序列rDNA1如SEQ ID No:5所示，寡核苷酸长链序列rDNA2如SEQ ID No:6所示，与预期序列一致。

5.含5拷贝人-鲑嵌合降钙素串联基因的重组克隆载体pUC18-rDNA2-ura3-Ppgk-5hsCT-rDNA1的构建：

根据各个基因的序列分析和实验设计要求，以克隆载体pUC18为基础，构建重组质粒pUC18-rDNA2-ura3-Ppgk-5hsCT-rDNA1。先将用BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切pMD18-rDNA1后得到的rDNA1片段，插入到经相同内切酶消化的pUC18载体上，然后将用Xba Ⅰ和SacⅠ酶切pMD18-5hsCT后得到的5hsCT插入到rDNA1片段的上游，再将用Hind Ⅲ和Xba Ⅰ酶切pMD18-Ppgk后得到的Ppgk插入到5hsCT的上游，构建成重组中间质粒pUC18-Ppgk-5hsCT-rDNA1。

由于缺少酶切位点，将用EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ酶切pUC18-Ppgk-5hsCT-rDNA1后得到的Ppgk-5hsCT-rDNA1片段插入到经相同内切酶消化的pUC18载体上。将用Sph Ⅰ和Sal Ⅰ酶切pMD18-rDNA2后得到的rDNA2片段插入到Ppgk的上游，再将用Sal Ⅰ酶切pMD18-ura3后获得的ura3插入到rDNA2和Ppgk之间的Sal Ⅰ位点，构建成重组质粒pUC18-rDNA2-ura3-Ppgk-5hsCT-rDNA1(重组质粒构建过程如图1所示，其表达框如图2所示)。

分别经七组限制性内切酶酶切(重组质粒酶切验证结果如图3)：1号表示经Sph Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切得到1474bp rDNA2片段、1611bp ura3基因和Ppgk-5hsCT-rDNA1-pUC18片段；2号表示经SalⅠ单酶切得到1611bp ura3基因和Ppgk-5hsCT-rDNA1-pUC18-rDNA2片段；3号表示经SalⅠ和XbaⅠ双酶切得到1492bp pgk promoter、1611bp ura3基因和5hsCT-rDNA1-pUC18-rDNA2片段；4号表示经Xba Ⅰ和Sac Ⅰ双酶切得到576bp 5hsCT基因和rDNA1-pUC18-rDNA2-ura3-Ppgk；5号表示经Sac Ⅰ和Hpa Ⅰ双酶切得到1096bprDNA1片段、pUC18片段和5153bp rDNA2-ura3-Ppgk-5hsCT片段；6号表示经Hpa Ⅰ单酶切得到pUC18片段和6249bp rDNA2-ura3-Ppgk-5hsCT-rDNA1片段；7号表示经Sac I单酶切得到线性化质粒pUC18-rDNA2-ura3-Ppgk-5hsCT-rDNA1；0号为未经酶切处理的质粒pUC18-rDNA2-ura3-Ppgk-5hsCT-rDNA1。分析验证后，得到的片段大小均与预期一致。

在重组质粒pUC18-rDNA2-ura3-Ppgk-5hsCT-rDNA1中，rDNA作为同源重组位点位于ura3-Ppgk-5hsCT表达框两侧，ura3全基因作为遗传选择标记基因独立位于Ppgk之前，Ppgk仅负责启动5hsCT基因。在5hsCT基因末尾带有的2个终止密码子足以终止其转录翻译过程。

6.人-鲑嵌合降钙素基因向酿酒酵母的转化：

重组质粒pUC18-rDNA2-ura3-Ppgk-5hsCT-rDNA1经过Hpa I酶切之后，通过乙醇沉淀的方法获得rDNA2-ura3-Ppgk-5hsCT-rDNA1线性片段，该线性片段通过LiAc介导的方法转化尿嘧啶缺陷型酿酒酵母YS-△ura感受态细胞。转化子在SD/-Ura(缺尿嘧啶选择培养基)平板上筛选重组子。PCR鉴定阳性克隆，结果如图4所示，N为阴性对照(未转基因酵母YS-△ura)，1、2、3为阳性菌株(转基因酵母YS-5hsCT)。

SD/-Ura培养基的配方如下(w/v)：2％葡萄糖；0.67％YNB；1％(NH₄)₂SO₄；3-4％琼脂；0.002％精氨酸；0.002％组氨酸；0.006％异亮氨酸；0.006％亮氨酸；0.004％赖氨酸；0.001％甲硫氨酸；0.006％苯丙氨酸；0.005％苏氨酸；0.004％色氨酸；0.005％酪氨酸；0.001％腺嘌呤。

7.转基因酵母和未转基因酵母的培养：

转基因酵母YS-5hsCT和未转基因酵母YS-△ura分别在30℃条件下预先在YPD培养基培养到对数期。吸取1/10的菌液到新鲜YPD培养基中继续培养细胞到10⁸cells/mL。摇床设置为28℃，200rpm。

YPD培养基的配方如下(w/v)：2％葡萄糖；2％蛋白胨；1％酵母提取物。

8.重组人-鲑嵌合降钙素在酿酒酵母细胞内的表达：

磷酸甘油酸激酶基因的启动子(Ppgk)是酿酒酵母系统中一种高效的组成型启动子，该启动子不受碳源控制，随着酵母细胞的不断生长，外源基因在任意时间段随之表达，并且在酵母细胞内积累。所以，在不改变培养条件情况下实现了外源蛋白在转基因酵母细胞内的连续表达。

(1)挑取一个转基因酵母YS-5hsCT单克隆到10mL YPD液体培养基当中，与此同时挑取一个未转基因酵母YS-△ura单克隆于10mL YPD液体培养基中作为阴性对照，于30℃恒温摇床中培养过夜。

(2)在波长600nm下读取培养物吸光值，OD₆₀₀应该在2到5之间。当OD₆₀₀低于2或者超过5时，继续培养到该浓度范围或者稀释到该浓度。

(3)以3000-3500rpm在室温条件下离心5min。

(4)重悬浮细胞新鲜的YPD培养基中，调节OD₆₀₀值达到0.5-0.6之间。

(5)在30℃的摇床上培养酵母细胞，在48-72小时之内吸取相当于2OD₆₀₀的细胞培养物置于冰上。

(6)分析细胞培养物。

9.转人-鲑嵌合降钙素串联基因酵母的冷冻干燥：

酿酒酵母细胞在冷冻离心机中以4℃，3000rpm，5min的条件收获，然后重悬于生理盐水中。重悬液以1℃/min的速率冷冻到－40℃。样品在冷冻干燥仪上冷冻干燥，压力6Pa，在冷冻干燥的最后两小时内，加热样品到23℃以减少残留水蒸气。

将本发明所用的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae，简称为YS-△ura)和转基因后的重组酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae，简称为YS-5hsCT)进行菌种保藏。

保藏单位的名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。酿酒酵母Saccharomycescerevisiae(YS-△ura)的保藏日期：2014年11月19日；保藏编号：CGMCC No.10014。

保藏单位的名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。酿酒酵母Saccharomycescerevisiae(YS-5hsCT)的保藏日期：2014年11月18日；保藏编号：CGMCC No.10015。实施例2：转人-鲑嵌合降钙素串联基因酵母的Southern Blot检测：

1.对转基因酵母和未转基因酵母进行southern blot前的培养步骤如实施例1中步骤7所述。

2.酵母基因组DNA的提取：

(1)取含有1×10⁸-2×10⁸cells酵母细胞的过夜培养液至1.5mL离心管中，12000rpm离心1min。

(2)用微量移液器尽量吸除上清。向沉淀中加入500μL的GenTLE Yeast Solution A，轻微震荡并充分悬浮沉淀，于37℃温育1h，期间轻轻振荡离心管数次。

(3)加入100μL的GenTLE Yeast Solution B，轻微震荡混匀后，于70℃水浴10min。

(4)加入200μL的GenTLE Yeast Solution C，轻微震荡混匀后，冰上冷却5min。

(5)12000rpm，4℃离心5min。小心将上清移入新的1.5mL离心管中(切勿吸取沉淀)。加入上清液1/2体积的异丙醇(约400μL)，上下颠倒离心管使其充分混匀。

(6)12000rpm，4℃离心5min，弃上清。向沉淀中加入500μL预冷的70％乙醇，轻轻上下颠倒洗涤沉淀。

(7)12000rpm，4℃离心5min。用微量移液器尽量吸除上清。室温下自然干燥DNA沉淀至无乙醇气味。

(8)加入适量的TE Buffer溶解基因组DNA。

3.限制性内切酶酶切及琼脂糖凝胶电泳检测：

(1)将转基因酵母和未转基因酵母的基因组DNA分别用BamH Ⅰ和Bgl Ⅱ(图5(a)中N、1、2、3号所示)、Xho Ⅰ和Not Ⅰ(图5(a)中N’、1’、2’、3’号所示)两组限制性内切酶进行酶切。酶切体系(30μl)如下表：

(2)体系内各成分混匀后，于37℃培养箱中温育40-50min。

(3)全部酶切产物经0.7-0.8％琼脂糖凝胶120V电泳45～60min。电泳检测结果呈弥散状，说明基因组DNA全部切开，否则酶切不完全。(酵母基因组DNA酶切后电泳结果如图5(a)所示)

4.探针DNA片段的获得和DIG DNA探针的标记：

(1)用XbaⅠ和SacⅠ酶切质粒pUC18-5hsCT，得到长度为576bp的5hsCT基因，回收该片断，测量回收DNA产物的浓度并记录结果。

(2)在反应管中加入1μg的模板DNA用无菌水将体积加至16μL。

(3)将盛有DNA的离心管置于沸水中加热变性10min后，迅速放在冰上。

(4)加入4μL DIG-High Prime(vial 1)，混合均匀，稍微离心。置于37℃恒温培养箱保温20h。

(5)加入2μL 0.2M的EDTA(pH8.0)终止反应或置于沸水中加热10min之后迅速冰浴。

5.DNA的转移和固定

(1)将0.7％琼脂糖凝胶置于变性液中浸泡45min。

(2)蒸馏水洗5min后，将琼脂糖凝胶转移到中和液中浸泡20min。

(3)重复步骤(2)。

(4)将琼脂糖凝胶转移到蒸馏水中洗5min后，然后搭建转膜平台，通过虹吸法将DNA转移到硝酸纤维素膜上，琼脂糖凝胶与杂交膜(即硝酸纤维素膜)在相同位置切角标记。

(5)当纸巾湿透后及时更换，并及时补充转移液20×SSC，转移时间为18-24h。取下滤膜于2×SSC溶液中浸泡5min。用吸水纸吸干杂交膜上的水，置于在室温下晾干30min。

(6)置于80℃的烘箱中干燥2h，使DNA牢牢固定于硝酸纤维素膜上。

6.Southern blot杂交：

(1)将适当体积(0.2mL/cm²)的杂交缓冲液或DIG Easy Hyb预热到37℃。

(2)将膜置于干净的培养皿中，加入适当体积的杂交缓冲液，37℃保温30min，温和搅动。

(3)DIG标记的探针(5-25ng/mL杂交液)在沸水中变性5min后，迅速置于冰上冷却。

(4)将DIG标记的探针加到预热的杂交缓冲液或DIG Easy Hyb(0.025mL/cm²)中，充分混匀但不要摇动出气泡。

(5)弃去预杂交液，换上探针和缓冲液的混合物。温和搅动，42℃保温16h。

(6)在室温下用适当体积的2×SSC(含0.1％SDS)漂洗膜两次，每次5min，温和摇动。

(7)在68℃下用适当体积的0.5×SSC(含0.1％SDS)漂洗膜两次，每次15min，温和摇动。

7.免疫检测：

(1)将膜置于Washing buffer中室温下稍微漂洗1-5min。

(2)在100mL Blocking solution中室温下温和摇动30min。

(3)在20mL Antibody solution中室温下温和摇动30min，。

(4)用100mL Washing buffer漂洗膜两次，每次15min，室温下温和摇动。

(5)在20mL Detecion buffer中平衡2-5min。

(6)将10mL新配制的显色溶液与膜一起置于干净的容器中，黑暗温育，静止。待条带显色适中后，用50mL蒸馏水洗膜，室温晾干保存。

(7)Southern Blot检测结果显示，阴性对照组(N和N’)均无杂交条带，实验组(1、2、3)均有多条杂交条带，而实验组(1’、2’、3’)均有单一杂交条带，说明5hsCT基因成功转入酿酒酵母基因组中且其拷贝数为多拷贝(Southern Blot检测结果如图5(b)所示)。

实施例3：人-鲑嵌合降钙素在酿酒酵母细胞内表达的Western Blot定性分析：

1.对转基因酵母和未转基因酵母进行Western Blot前的培养步骤如实施例1中步骤8所述。

2.酵母细胞内蛋白的处理：

(1)将收集的酵母培养物溶于160μL三蒸水，再加入40μL 5×SDS-PAGE Loading Buffer，混合均匀。

(2)置沸水浴10-15min，期间震荡数次，室温冷却，待酵母细胞裂解物完全沉淀。

3.SDS-PAGE检测:

(1)按下表配制SDS-聚丙烯酰胺凝胶：

安好装置，用微量移液器将分离胶注入玻璃板夹层中，液面达到一定高度之后，用少量蒸馏水封闭，以保持胶面平整，同时防止氧气进入凝胶阻止凝胶的凝固。待30min分离胶聚合后，再配制浓缩胶，用吸水纸吸去上层水分，然后用微量移液器灌入浓缩胶，插好上样梳子。

(2)在电泳槽中加入Tris-Gly电泳缓冲液后，小心拔去制胶梳子，用微量移液器清洗点样孔，将处理好的样品上清液30-40μL按顺序上样。

(3)先使用低电压(70-80V)，约30min，待样品刚刚进入分离胶或在浓缩胶内浓缩成一条直线后，加大电压(100-120V)，当溴酚兰指示剂达到离底部边缘约1cm时，停止电泳。

(4)取出凝胶，做好记号，置于适量10％三氯乙酸溶液中固定30min。

(5)将凝胶转至考马斯亮蓝染色液中，振荡染色6-8h。

(6)将凝胶转至脱色液中，振荡脱色数小时直至凝胶背景干净，条带清晰为止。

(7)凝胶置于蒸馏水中4℃保存(SDS-PAGE蛋白电泳结果如图6(a)所示，P为阳性对照，N为阴性对照，1号为24h蛋白样品，2号为48h蛋白样品，3号为72h蛋白样品)。

4.酵母蛋白的电转移：

(1)将胶浸于转移缓冲液中平衡10min。(注意：如检测20kDa以下的小分子蛋白，可省略此步，因小分子蛋白容易扩散出胶。)

(2)依据胶的大小剪取硝酸纤维素膜和滤纸6片，放入转移缓冲液中平衡10min。如用PVDF膜必须在纯甲醇中浸泡活化1-5s。

(3)采用“半干转”装置，按照“夹心法”装好电转移装置(顺序从下到上依次为：三层滤纸-硝酸纤维素膜-蛋白凝胶-三层滤纸)，将凝胶靠近阴极，膜靠近阳极，于10V、100-150mA条件下电转移约25min。

(4)电转移结束后，在室温下用蒸馏水洗涤硝酸纤维素膜，裁下一小条置于丽春红中染色1min，其间温和摇动染色液。蛋白条带出现后，室温下用蒸馏水漂洗数次，直至丽春红洗去。确定电转移成功后，进行Western Blot检测。

5.Western Blot检测：

(1)用适量封闭液(5％脱脂奶粉的0.02mol/L PBS溶液，用量以浸没整张膜为准)，37℃封闭1h或4℃封闭过夜。

(2)用适量的0.02mol/L PBS洗涤硝酸纤维素膜2次(5min/次)。

(3)与一抗反应：兔抗人降钙素抗体(效价1:100-500)用抗体稀释液按1:500的比例稀释，37℃反应2h。

(4)用适量的0.02mol/L PBS洗涤硝酸纤维素膜2次(5min/次)。

(5)与二抗反应：辣根过氧化物聚合酶(HRP)标记山羊抗兔lgG(效价1:500-1000)，用抗体稀释液按l:1000的比例稀释二抗，37℃反应1h。

(6)用适量的0.02mol/L PBS洗涤硝酸纤维素膜4次(5min/次)。

(7)将硝酸纤维素膜置于增强型DAB显色液中，置黑暗处室温下反应20-30min，显色出现蓝紫色目的蛋白条带后，用蒸馏水洗涤，晾干后置于阴暗处保存。

(8)Western Blot检测结果显示，阴性对照(N)与人降钙素抗体无抗原抗体免疫反应条带，阳性对照(P)和实验组(24h、48h、72h)与人降钙素抗体均有明显的抗原抗体免疫反应条带，说明5hsCT在酿酒酵母细胞中成功高效表达，表现出与人降钙素抗体有较强的免疫反应，且蛋白表达量不呈现明显的时间效应(Western Blot检测结果如图6(b)所示)。

实施例4：人-鲑嵌合降钙素在酿酒酵母细胞内表达的酶联免疫吸附(Elisa)测定：

1.对转基因酵母和未转基因酵母进行Elisa前的培养步骤如实施例1中步骤8所述。

2.采用超声波破碎法提取转基因酵母和未转基因酵母的总蛋白：

(1)称取500mg冷冻干燥后的酵母于10ml离心管中，加入4mL 0.02mol/L PBS溶液，使沉淀彻底悬浮，置于冰上。

(2)超声波破碎20min后，在4℃条件下4500rpm离心5min，弃沉淀。

(3)将上清液转移到多个1.5ml离心管中，在4℃条件下12000rpm离心5min，弃沉淀。

(4)测定各样品的总蛋白浓度并记录数据，样品置于-20℃保存。

3.酶联免疫吸附(Elisa)测定步骤如下：

(1)分别将人降钙素标准品、阴性对照的总蛋白和待测样品的总蛋白用包被液(简称CB，pH 9.6)按一定比例稀释(1:2，1:2²，1:2³，1:2⁴，1:2⁵，1:2⁶，1:2⁷,1:2⁸,1:2⁹)，包被酶标板(每孔150μL)，每个样品设置两个重复，4℃过夜。同时设置空白孔3个、加抗原不加1抗的孔3个、加抗原加1抗不加2抗的孔3个；

(2)吸出包被液，加入封闭液(含5％脱脂奶粉的0.01mol/L PBS缓冲液)，每孔200μL，37℃封闭1h。

(3)封闭结束后，弃去封闭液，每孔加入200μL 0.02mol/L PBST洗板3次。

(4)每孔加入200μL含兔抗人降钙素抗体(效价：1:500-1000)按1:1000比例稀释的抗体溶液，37℃温育2h。

(5)反应结束后，弃去溶液，每孔加入200μL 0.02mol/L PBST，洗板3次。

(6)每孔加入200μL含HRP标记山羊抗兔IgG(效价：1:3000-25000)按1:5000比例稀释的抗体溶液，37℃温育1h。

(7)反应结束后，弃去溶液，每孔加入200μL 0.02mol/L的PBST洗板3次。

(8)每孔加入100μL TMB显色液，室温下避光反应10min。当阳性对照出现明显颜色变化或阴性对照略有显色时，每孔加入100μL 2mol/L的H₂SO₄溶液，终止反应。

(9)反应结束后，立即使用酶标仪测定各孔在450nm的光密度值。

(10)绘制人降钙素标准品的标准曲线，计算人-鲑嵌合降钙素在酿酒酵母细胞内的表达

量约为2.04％。

实施例5：转基因酵母在小鼠体内的降血钙活性测量

根据英国药典的方法进行了动物降血钙实验。动物采用了正常的小白鼠(雌雄各半)。在检测转基因酵母YS-5hsCT的体内活性实验当中，动物实验分为阴性对照组，阳性药物组以及高中低三个试剂组。阴性对照组根据小鼠体重按照1.00g/kg剂量灌胃冷冻干燥的未转基因酵母YS-△ura，阳性药物组皮下注射2IU/kg密钙息(医用鲑鱼降钙素注射液)。高中低三个剂量组分别根据小鼠体重按照1.00g/kg，0.10g/kg和0.01g/kg剂量灌胃冷冻干燥的转基因酵母YS-5hsCT。

通过图7可以看出，灌胃高中低三个剂量的转基因酵母YS-5hsCT均具有明显的降血钙活性。实验动物在不同的时间段(1，2，4，8，12小时)从眼球丛静脉毛细血管吸取全血制备血清，血清送往青岛市解放军401医院测定血钙值。在第2小时降血钙效应均达到最大，相比空白对照组小鼠，低、中、高三个剂量组小鼠的血钙值分别降低了0.498mM、0.593mM和0.625mM，其效果持续到10-12小时。相比之下，阳性药物组密钙息在2小时其药效达到最大，此时小鼠血钙值相比正常小鼠降低了0.47mM，然后迅速减弱，在9小时之后其药效几乎消失，小鼠血钙值恢复正常。实验还发现在第1小时，除了阳性药物组的血钙值明显降低，其他组的血钙值均略有升高，且呈现一定的剂量效应。这现象可能是在灌胃1h之内，酿酒酵母经小鼠胃肠的消化液环境下消化后，酿酒酵母细胞中的钙离子释放并被吸收，导致小鼠血液中钙离子含量有所升高，随后释放的降钙素发挥其作用，血钙值逐渐降低。

实验结果表明，灌胃剂量为0.01g/kg的转基因酵母YS-5hsCT就能明显降低小鼠血钙值，其最大降血钙能力比2IU/kg的阳性药物密钙息略高，且其持续时间明显长于注射的密钙息。灌胃低、中、高三个剂量的冷冻干燥的酵母YS-5hsCT均显著降低了小鼠血钙值(p<0.01)。其最大药效时间T_max均为2小时，小白鼠血钙值降低了0.625mM。实验发现灌胃YS-5hsCT能持续降低血钙值，且呈现出剂量效应。即对于人类临床应用来说，按12h的药效计算，体重为60kg的患者每天服用约1g的转基因酵母即可达到目前降钙素注射剂临床应用的疗效。可以实现降钙素的口服给药。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  中国海洋大学

<120>  转人-鲑嵌合降钙素串联基因的酵母YS -5hsCT及其制备方法和应用

 

<130> 

 

<160>  16   

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  564

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  1

atgctgtgcg gcaacctgtc tacttgcctg ctgggtacct acactcagga cgctcacaaa     60

 ctgcagacct acccgcgcac caacaccggt tctggtactc cgggctcgtc gagtggtgtg    120

tgtggcaacc tgagcacctg tctgctgggc acctataccc aggatgcgca taaactgcaa    180

acctatccgc gtaccaatac cggcagcggc accccgggct cgtcgagtgg tgtgtgcggt    240

 aacctgtcta cttgcctgct gggtacctac actcaggacg ctcacaaact gcagacctac    300

ccgcgcacca acaccggttc tggtactccg ggctcgtcga gtggcgtgtg tggcaacctg    360

agcacctgtc tgctgggcac ctatacccag gatgcgcata aactgcaaac ctatccgcgt    420

accaataccg gcagcggcac cccgggctcg tcgagtggtg tgtgcggcaa cctgtctact    480

tgcctgctgg gtacctacac tcaggacgct cacaaactgc agacctaccc gcgcaccaac    540

accggctccg gcaccccgta atga                                           564

 

<210>  2

<211>  186

<212>  pro

<213>  人工序列

 

<400>  2

Met Leu Cys Gly Asn Leu Ser Thr Cys Leu Leu Gly Thr Tyr Thr Gln

1                5                   10                  15

Asp Ala His Lys Leu Gln Thr Tyr Pro Arg Thr Asn Thr Gly Ser Gly

             20                  25                 30

Thr Pro Gly Ser Ser Ser Gly Val Cys Gly Asn Leu Ser Thr Cys Leu

        35                  40                  45

Leu Gly Thr Tyr Thr Gln Asp Ala His Lys Leu Gln Thr Tyr Pro Arg

    50                  55                  60

Thr Asn Thr Gly Ser Gly Thr Pro Gly Ser Ser Ser Gly Val Cys Gly

65                  70                  75                  80

Asn Leu Ser Thr Cys Leu Leu Gly Thr Tyr Thr Gln Asp Ala His Lys

                85                  90                  95

Leu Gln Thr Tyr Pro Arg Thr Asn Thr Gly Ser Gly Thr Pro Gly Ser

            100                 105                 110

 Ser Ser Gly Val Cys Gly Asn Leu Ser Thr Cys Leu Leu Gly Thr Tyr

        115                 120                 125

Thr Gln Asp Ala His Lys Leu Gln Thr Tyr Pro Arg Thr Asn Thr Gly

    130                 135                 140

Ser Gly Thr Pro Gly Ser Ser Ser Gly Val Cys Gly Asn Leu Ser Thr

145                 150                 155                 160

Cys Leu Leu Gly Thr Tyr Thr Gln Asp Ala His Lys Leu Gln Thr Tyr

                165                 170                 175

Pro Arg Thr Asn Thr Gly Ser Gly Thr Pro

            180                 185

 

<210>  3

<211>  1492

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  3

aagcttgtcg actctaactg atctatccaa aactgaaaat tacattcttg attaggttta     60

 tcacaggcaa atgtaatttg tggtattttg ccgttcaaaa tctgtagaat tttctcattg    120

 

gtcacattac aacctgaaaa tactttatct acaatcatac cattcttata acatgtcccc    180

 ttaatactag gatcaggcat gaacgcatca cagacaaaat cttcttgaca aacgtcacaa    240

ttgatccctc cccatccgtt atcacaatga caggtgtcat tttgtgctct tatgggacga    300

tccttattac cgctttcatc cggtgataga ccgccacaga ggggcagaga gcaatcatca    360

cctgcaaacc cttctataca ctcacatcta ccagtgtacg aattgcattc agaaaactgt    420

 ttgcattcaa aaataggtag catacaatta aaacatggcg ggcacgtatc attgccctta    480

tcttgtgcag ttagacgcga atttttcgaa gaagtacctt caaagaatgg ggtctcatct    540

tgttttgcaa gtaccactga gcaggataat aatagaaatg ataatatact atagtagaga    600

taacgtcgat gacttcccat actgtaattg cttttagttg tgtattttta gtgtgcaagt    660

ttctgtaaat cgattaattt ttttttcttt cctcttttta ttaaccttaa tttttatttt    720

agattcctga cttcaactca agacgcacag atattataac atctgcacaa taggcatttg    780

caagaattac tcgtgagtaa ggaaagagtg aggaactatc gcatacctgc atttaaagat    840

 gccgatttgg gcgcgaatcc tttattttgg cttcaccctc atactattat cagggccaga    900

aaaaggaagt gtttccctcc ttcttgaatt gatgttaccc tcataaagca cgtggcctct    960

tatcgagaaa gaaattaccg tcgctcgtga tttgtttgca aaaagaacaa aactgaaaaa   1020

acccagacac gctcgacttc ctgtcttcct attgattgca gcttccaatt tcgtcacaca   1080

acaaggtcct agcgacggct cacaggtttt gtaacaagca atcgaaggtt ctggaatggc   1140

gggaaagggt ttagtaccac atgctatgat gcccactgtg atctccagag caaagttcgt   1200

tcgatcgtac tgttactctc tctctttcaa acagaattgt ccgaatcgtg tgacaacaac   1260

agcctgttct cacacactct tttcttctaa ccaagggggt ggtttagttt agtagaacct   1320

cgtgaaactt acatttacat atatataaac ttgcataaat tggtcaatgc aagaaataca   1380

tatttggtct tttctaattc gtagtttttc aagttcttag atgctttctt tttctctttt   1440

ttacagatca tcaaggaagt aattatctac tttttacaac aaatattcta ga           1492

 

<210>  4

<211>  1611

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  4

gtcgacaagg ttaatgtggc tgtggtttca gggtccataa agcttttcaa ttcatctttt     60

 ttttttttgt tctttttttt gattccggtt tctttgaaat ttttttgatt cggtaatctc    120

cgagcagaag gaagaacgaa ggaaggagca cagacttaga ttggtatata tacgcatatg    180

 tggtgttgaa gaaacatgaa attgcccagt attcttaacc caactgcaca gaacaaaaac    240

 ctgcaggaaa cgaagataaa tcatgtcgaa agctacatat aaggaacgtg ctgctactca    300

 tcctagtcct gttgctgcca agctatttaa tatcatgcac gaaaagcaaa caaacttgtg    360

tgcttcattg gatgttcgta cctgttggaa tagaaatcaa ctatcatcta ctaactagta    420

 tttacattac tagtatatta tcatatacgg tgttagaaga tgacgcaaat gatgagaaat    480

agtcatctaa attagtggaa gctgaaacgc aaggattgat aatgtaatag gatcaatgaa    540

 tataaacata taaaatgatg ataataatat ttatagaatt gtgtagaatt gcagattccc    600

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 caccaaggaa ttactggagt tagttgaagc attaggtccc aaaatttgtt tactaaaaac    780

acatgtggat atcttgactg atttttccat ggagggcaca gttaagccgc taaaggcatt    840

 atccgccaag tacaattttt tactcttcga agacagaaaa tttgctgaca ttggtaatac    900

agtcaaattg cagtactctg cgggtgtata cagaatagca gaatgggcag acattacgaa    960

tgcacacggt gtggtgggcc caggtattgt tagcggtttg aagcaggcgg cggaagaagt   1020

 aacaaaggaa cctagaggcc ttttgatgtt agcagaattg tcatgcaagg gctccctagc   1080

tactggagaa tatactaagg gtactgttga cattgcgaag agcgacaaag attttgttat   1140

cggctttatt gctcaaagag acatgggtgg aagagatgaa ggttacgatt ggttgattat   1200

gacacccggt gtgggtttag atgacaaggg agacgcattg ggtcaacagt atagaaccgt   1260

ggatgatgtg gtctctacag gatctgacat tattattgtt ggaagaggac tatttgcaaa   1320

 gggaagggat gctaaggtag agggtgaacg ttacagaaaa gcaggctggg aagcatattt   1380

gagaagatgc ggccagcaaa actaaaaaac tgtattataa gtaaatgcat gtatactaaa   1440

 ctcacaaatt agagcttcaa tttaattata tcagttatta cccgggaatc tcggtcgtaa   1500

 tgatttctat aatgacgaaa aaaaaaaaat tggaaagaaa aagcttcatg gcctttataa   1560

aaaggaacta tccaatacct cgccagaacc aagtaacagt attttgtcga c            1611

  

<210>  5

<211>  1102

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  5

ggatccgagc tcacctaccg accaactttc atgttctgtt tcgacctacc tcttgtaaat     60

 gacaaatcac ctttttcatc gtatgcacct tattctccac atcacaatgc actattgctt    120

 ttgctttttc acctgtcata tcctattgct attagatgaa atataataaa aattgtcctc    180

 cacccataac acctctcact cccacctact gaacatgtct ggaccctgcc ctcatatcac    240

 ctgcgtttcc gttaaactat cggttgcggc catatctacc agaaagcacc gtttcccgtc    300

 cgatcaactg tagttaagct ggtaagagcc tgaccgagta gtgtagtggg tgaccatacg    360

cgaaactcag gtgctgcaat ctttatttct tttttttttt tttttttttt ttttttttct    420

 agtttcttgg cttcctatgc taaatcccat aactaaccta ccattcgatt cagaaaaatt    480

 cgcactatcc agctgcactc ttcttctgaa gagttaagca ctccattatg ctcattgggt    540

tgctactact tgatatgtac aaacaatatt ctcctccgat attcctacaa aaaaaaaaaa    600

aaaaacactc cggttttgtt ctcttccctc catttccctc tcttctacgg ttaatacttt    660

cctcttcgtc tttttctaca ccctcgttta gttgcttctt attccttccc gctttcctgc    720

actaacattt tgccgcatta cactatatga tcgtagtaca tcttacaact ccgcataccg    780

cgtcgccgcg tcgccgcgtc gccaaaaatt tacttcgcca accattccat atctgttaag    840

tatacatgta tatattgcac tggctattca tcttgcactt ttcctctttc ttcttcccag    900

tagcctcatc cttttacgct gcctctctgg aacttgccat catcattccc tagaaactgc    960

catttactta aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa atgtccccac tgttcactgt tcactgttca   1020

cttgtctctt acatctttct tggtaaaatc gtagttcgta gtattttttt tcatatcaaa   1080

ggcatgtcct gttaacgaat tc                                            1102

  

<210>  6

<211>  1474

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  6

gcatgcgtta actataggaa atgagctttt ctcaattctc taaacttata caagcactca     60

tgtttgccgc tctgatggtg cggaaaaaac tgctccatga agcaaactgt ccgggcaaat    120

 cctttcacgc tcgggaagct ttgtgaaagc ccttctcttt caacccatct ttgcaacgaa    180

aaaaaaaaaa aaaataaaaa ataaaaagac caaatagtaa atagtaactt acatacatta    240

gtaaatggta cactcttaca cactatcatc ctcatcgtat attataatag atatatacaa    300

tacatgtttt tacccggatc atagaattct taagacaaat aaaatttata gagacttgtt    360

 cagtctactt ctctctaaac taggccccgg ctcctgccag tacccactta gaaagaaata    420

 aaaaacaaat cagacaacaa aggcttaatc tcagcagatc gtaacaacaa ggctactcta    480

 ctgcttacaa taccccgttg tacatctaag tcgtatacaa atgatttatc cccacgcaaa    540

atgacattgc aattcgccag caagcaccca aggcctttcc gccaagtgca ccgttgctag    600

cctgctatgg ttcagcgacg ccacaaggac gccttattcg tatccatcta tattgtgtgg    660

 agcaaagaaa tcaccgcgtt ctagcatgga ttctgactta gaggcgttca gccataatcc    720

 agcggatggt agcttcgcgg caatgcctga tcagacagcc gcaaaaacca attatccgaa    780

 tgaactgttc ctctcgtact aagttcaatt actattgcgg taacattcat cagtagggta    840

 aaactaacct gtctcacgac ggtctaaacc cagctcacgt tccctattag tgggtgaaca    900

atccaacgct taccgaattc tgcttcggta tgataggaag agccgacatc gaagaatcaa    960

aaagcaatgt cgctatgaac gcttgactgc cacaagccag ttatccctgt ggtaactttt   1020

 ctggcacctc tagcctcaaa ttccgaggga ctaaaggatc gataggccac actttcatgg   1080

 tttgtattca cactgaaaat caaaatcaag ggggctttta cccttttgtt ctactggaga   1140

tttctgttct ccatgagccc cccttaggac atctgcgtta tcgtttaaca gatgtgccgc   1200

cccagccaaa ctccccacct gacaatgtct tcaacccgga tcagccccga atgggacctt   1260

 gaatgctaga acgtggaaaa tgaattccag ctccgcttca ttgaataagt aaagaaacta   1320

 taaaggtagt ggtatttcac tggcgccgaa gctcccactt attctacacc ctctatgtct   1380

cttcacaatg tcaaactaga gtcaagctca acagggtctt ctttccccgc tgattctgcc   1440

 aagcccgttc ccttggctgt ggtttcgcgt cgac                               1474

 

<210>  7

<211>  26

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  7

gctctagaat gctgtgcggc aacctg                                          26

 

<210>  8

<211>  32

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  8

cgagctctca ttacggggtg ccggagccgg tg                                   32

 

<210>  9

<211>  38

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  9

aagcttgtcg actctaactg atctatccaa aactgaaa                             38

 

<210>  10

<211>  35

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  10

tctagaatat ttgttgtaaa aagtagataa ttact                                35

 

<210>  11

<211>  29

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  11

gtcgacaagg ttaatgtggc tgtggtttc                                       29

  

<210>  12

<211>  29

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  12

gtcgacaaaa tactgttact tggttctgg                                       29

  

<210>  13

<211>  31

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  13

ggatccgagc tcacctaccg accaactttc a                                    31

  

<210>  14

<211>  30

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  14

gaattcgtta acaggacatg cctttgatat                                      30

  

<210>  15

<211>  32

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  15

gcatgcgtta actataggaa atgagctttt ct                                   32

 

<210>  16

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  16

gtcgacgcga aaccacagcc aagg                                            24

  

Claims (10)

1.酿酒酵母YS -△ura，其特征在于：其分类命名为酿酒酵母 Saccharomyces cerevisiae，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为：CGMCC No.10014。

2.酿酒酵母YS -5hsCT，其特征在于：其分类命名为酿酒酵母 Saccharomyces cerevisiae，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为：CGMCC No.10015。

3.权利要求2所述的酿酒酵母YS -5hsCT的制备方法，其特征在于它包括如下步骤：

(1) 5拷贝人-鲑嵌合降钙素串联基因5hsCT的克隆：

将5拷贝人-鲑嵌合降钙素串联基因5hsCT进行PCR反应扩增，连入克隆载体，构建含有5hsCT基因的重组载体；

(2) pgk 基因启动子的克隆：

以酿酒酵母基因组DNA为模板，进行PCR反应扩增获得 pgk基因，连入克隆载体，构建含有pgk基因的重组载体；

(3) 选择标记基因ura3的克隆：

以酿酒酵母基因组DNA为模板，进行PCR反应扩增获得 ura3基因，连入克隆载体，构建含有ura3基因的重组载体；

(4) rDNA基因的克隆：

以酿酒酵母基因组DNA为模板，分别进行PCR反应扩增获得 rDNA1和rDNA2两个基因，分别连入克隆载体，分别构建含有rDNA1和rDNA2基因的重组载体；

(5) 含人-鲑嵌合降钙素串联基因质粒的制备：

先将rDNA1基因插入到克隆载体中，然后将5hsCT基因插入到rDNA1基因的上游，再将pgk 基因插入到5hsCT的上游，构建含有P _pgk -5hsCT-rDNA1重组片段的重组载体1；

再将P _pgk -5hsCT-rDNA1重组片段插入到克隆载体中；

将rDNA2基因插入到pgk 基因的上游，再将ura3基因插入到rDNA2和pgk之间，构建含有rDNA2-ura3-P _pgk -5hsCT-rDNA1重组片段的重组载体2；

(6) 人-鲑嵌合降钙素串联基因向酿酒酵母的转化：

所述重组载体2经酶切获得线性DNA片段rDNA2-ura3-P _pgk -5hsCT-rDNA1，该线性片段转化酿酒酵母YS -△ura感受态细胞，转化子在SD/-Ura固体培养基上筛选重组子获得转基因酵母YS-5hsCT。

4.根据权利要求3所述的酿酒酵母YS -5hsCT的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中将5拷贝人-鲑嵌合降钙素串联基因5hsCT以5hsCT-F和5hsCT-R为引物进行PCR反应扩增：

引物5hsCT-F：5′-GCTCTAGAATGCTGTGCGGCAACCTG-3′；

引物5hsCT-R：5′-CGAGCTCTCATTACGGGGTGCCGGAGCCGGTG-3′；

所述5hsCT基因的序列如SEQ ID No:1所示。

5.根据权利要求3所述的酿酒酵母YS -5hsCT的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中以引物P _pgk -F和P _pgk -R进行PCR反应扩增获得 pgk基因：

引物P _pgk -F：5′-AAGCTTGTCGACTCTAACTGATCTATCCAAAACTGAAA-3′；

引物P _pgk -R：5′-TCTAGAATATTTGTTGTAAAAAGTAGATAATTACT-3′；

所述pgk基因的序列如SEQ ID No：3所示。

6.根据权利要求3所述的酿酒酵母YS -5hsCT的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中以引物ura3-F和ura3-R进行PCR反应扩增获得 ura3基因：

引物ura3-F：5′-GTCGACAAGGTTAATGTGGCTGTGGTTTC-3′；

引物ura3-R：5′-GTCGACAAAATACTGTTACTTGGTTCTGG-3′；

所述ura3基因的序列如SEQ ID NO:4所示。

7.根据权利要求3所述的酿酒酵母YS -5hsCT的制备方法，其特征在于：所述步骤（4）中以引物rDNA1-F和rDNA1-R、rDNA2-F和rDNA2-R分别进行PCR反应扩增获得 rDNA1和rDNA2两个基因：

引物rDNA1-F：5′-GGATCCGAGCTCACCTACCGACCAACTTTCA-3′

引物rDNA1-R：5′-GAATTCGTTAACAGGACATGCCTTTGATAT-3′

引物rDNA2-F：5′-GCATGCGTTAACTATAGGAAATGAGCTTTTCT-3′

引物rDNA2-R：5′-GTCGACGCGAAACCACAGCCAAGG-3′

所述rDNA1基因的序列如SEQ ID No:5所示，所述rDNA2基因的序列如SEQ ID No:6所示。

8.根据权利要求3所述的酿酒酵母YS -5hsCT的制备方法，其特征在于：所述克隆载体为pMD18-T载体。

9.权利要求2所述的酿酒酵母YS -5hsCT在制备治疗骨质疏松症、Paget氏综合症和高钙血症的药物或保健品中的应用。

10.根据权利要求9所述的酿酒酵母YS -5hsCT在制备治疗骨质疏松症、Paget氏综合症和高钙血症的药物或保健品中的应用，其特征在于：所述酿酒酵母YS -5hsCT的用量为0.01 g/kg以上。