CN116987201B - 调控哺乳动物生殖能力的多聚重组蛋白、制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种调控哺乳动物生殖能力的多聚重组蛋白、制备方法和应用，属于生物工程技术领域；本发明的多聚重组蛋白结构为N端GnRH多肽复合物‑柔性肽1‑重组乳铁蛋白‑柔性肽2‑重组CRM197蛋白‑柔性肽3‑C端GnRH多肽复合物，具有多种蛋白质组成的复合结构，可通过口服或者注射免疫哺乳动物，有效诱导GnRH抗体的产生，可以产生更加持久、显著的抑制生殖能力的作用，对于哺乳动物的生殖调控、激素调节、医学研究及临床应用具有重要作用。

Description

调控哺乳动物生殖能力的多聚重组蛋白、制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种调控哺乳动物生殖能力的多聚重组蛋白、制备方法和应用。
背景技术
促性腺激素释放激素（Gonadotropin-Releasing Hormone, GnRH）是一种由下丘脑分泌的含有十个氨基酸的肽类激素，又被称作促黄体素释放激素（LuteinizingHormone-Releasing Hormone, LHRH）。GnRH是神经系统、免疫系统和内分泌系统之间重要的调控因子，GnRH类似物对脑垂体具有双向作用，小剂量短期治疗时可以促进卵泡生成素和黄体生成素的分泌，而大剂量长时间使用可以降低体内促性腺激素的分泌，并对性腺功能产生抑制效果。GnRH类似物在人类及哺乳动物辅助生殖、调节性腺功能及激素水平方面具有重要作用。
随着生物工程及激素免疫学的发展，激素免疫中和技术（HormoneImmunoneutralization, HIN）日益成为内分泌研究的重要工具，而GnRH疫苗的概念也应运而生，其基本原理为：使用外源GnRH主动免疫哺乳动物，诱导免疫系统产生过量GnRH特异性抗体与内源性GnRH结合从而使内源性GnRH失去生物学活性，干扰下丘脑-垂体-性腺轴功能，并抑制LH与FSH的释放，从而发挥调节哺乳动物生殖活动的作用。
由于哺乳动物GnRH为10个氨基酸组成的短肽，其作为半抗原需要与外源载体蛋白偶联才能有效刺激免疫系统产生GnRH抗体。在GnRH免疫疗法早期，GnRH标准品或GnRH类似物可以通过碳化二亚胺法、戊二醛法、m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide (MBS)法与载体蛋白偶联。例如，碳化二亚胺法可以用于GnRH类似物单体与人血清蛋白（HumanSerum Albumin, HAS）偶联并采用弗氏佐剂用于免疫公牛。戊二醛法可以用于GnRH类似物单体与PAP蛋白（pokeweed antiviral protein, PAP)偶联免疫公犬。由于GnRH单体与内源性GnRH分子结构相同，因此GnRH单体与载体蛋白化学偶联后免疫哺乳动物效果并不稳定。而通过原核表达的GnRH单体也存在缺乏生物学活性的问题。目前也有报道通过基因工程将GnRH基因序列与乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）表面抗原（HBsAg）基因插入家蚕多角体病毒载体，使用重组病毒昆虫细胞及家蚕并表达HBsAg-GnRH重组蛋白，但存在重组蛋白表达水平较低，无法投入应用。因此研发一种能高效表达具有生物学活性的GnRH多肽的方法对医学及农业生产具有重要意义。
现有技术中，关于GnRH的重组蛋白对于调控生殖能力的持久性和显著性还不够高，且多通过注射诱导GnRH抗体的产生，未见有关于口服的报道。
发明内容
本发明是为了解决现有技术中GnRH的重组蛋白对于调控生殖能力的持久性和显著性不够高，对GnRH抗体水平调控效果不好的技术问题，目的在于提供一种调控哺乳动物生殖能力的多聚重组蛋白、制备方法和应用，本发明的多聚重组蛋白能够有效诱导GnRH抗体的产生，可以产生更加持久、显著的抑制生殖能力的作用，对于哺乳动物的生殖调控、激素调节、医学研究及临床应用具有重要作用。
本发明通过下述技术方案实现。
本发明提供一种调控哺乳动物生殖能力的多聚重组蛋白，所述多聚重组蛋白的结构包括串联的N端GnRH多肽复合物、柔性肽1、重组乳铁蛋白、柔性肽2、重组CRM197蛋白、柔性肽3和C端GnRH多肽复合物。
本发明设计了一种同时表达GnRH多肽复合物、重组乳铁蛋白、重组白喉毒素无毒突变体CRM197蛋白、柔性肽的新型表达载体系统pGEX-NGnRHpoly-linker1-LF-linker2-CRM197-linker3-CGnRHpoly，通过该表达载体表达得到本发明多聚重组蛋白，多聚重组蛋白在结构上具有独特性和专一性。
本发明的多聚重组蛋白在GnRH多肽复合物、重组乳铁蛋白、重组白喉毒素无毒突变体CRM197蛋白的协调机制下，可通过口服或者注射免疫哺乳动物，有效诱导GnRH抗体的产生，可以产生更加持久、显著的抑制生殖能力的作用，对于哺乳动物的生殖调控、激素调节、医学研究及临床应用具有重要作用。
作为进一步的技术方案，编码所述多聚重组蛋白的基因具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
作为进一步的技术方案，所述多聚重组蛋白具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
本发明还提供一种调控哺乳动物生殖能力的多聚重组蛋白的制备方法，包括以下步骤：
S1、设计得到如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；
S2、重组质粒的构建：将SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列与经过双酶切的载体连接，连接后的产物转化至E.coli DH5α感受态细胞后，对E.coli DH5α进行扩大培养，提取重组质粒；
S3、多聚重组蛋白的表达与纯化：将重组质粒转化入基因工程菌中，通过IPTG诱导多聚重组蛋白的表达，分离纯化得到多聚重组蛋白。
作为进一步的的技术方案，步骤S2所述重组质粒的构建包括：
S21、提取pGEX-5X-1-H质粒；
S22、使用双酶切体系BamHI酶和EcoRI酶进行双酶切，得到酶切后的pGEX-5X-1-H；
S23、将酶切后的pGEX-5X-1-H与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列在T4 DNA连接酶作用下连接，得到连接产物；
S24、连接产物转化至E.coli DH5α感受态细胞后，对E.coli DH5α进行扩大培养，提取重组质粒。
作为进一步的的技术方案，步骤S22包括：
使用双酶切体系BamHI酶0.5µL、EcoRI酶0.5µL、pGEX-5X-1-H载体6µg、10xBufferR 2µL和ddH2O 10µL的混合液，在37℃下对pGEX-5X-1-H载体恒温双酶切2h，双酶切后使用琼脂糖凝胶电泳，并对酶切后的pGEX-5X-1-H纯化。
作为进一步的的技术方案，步骤S3多聚重组蛋白的表达与纯化包括：
S31、将重组质粒转化入E.coli BL21基因工程菌中，振荡培养细菌至对数生长期，使用IPTG进行处理，诱导重组蛋白质的表达；
S32、离心收集菌体，超声波破碎，丢弃细菌裂解上清得到包涵体沉淀；
S33、使用尿素的包涵体溶解液充分溶解包涵体沉淀，调整包涵体蛋白浓度，使用从含有高浓度尿素到低浓度尿素的包涵体复性缓冲液和PBS缓冲液对溶解的包涵体蛋白进行透析，得到复性重组蛋白，对复性的重组蛋白进行纯化，得到多聚重组蛋白。
作为进一步的的技术方案，步骤S31中，加入IPTG至终浓度为0.2 mmol/L，诱导温度为37℃，诱导时间为4h。
本发明还提供所述的多聚重组蛋白在制备调控哺乳动物生殖能力的产品中的应用。
本发明还提供一种疫苗，包含所述的多聚重组蛋白。
本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果。
1、本发明设计了一种同时表达GnRH多肽复合物、重组乳铁蛋白、重组白喉毒素无毒突变体CRM197蛋白、柔性肽的新型表达载体系统pGEX-NGnRHpoly-linker1-LF-linker2-CRM197-linker3-CGnRHpoly，通过该表达载体表达得到本发明多聚重组蛋白，多聚重组蛋白在结构上具有独特性和专一性。
2、本发明的多聚重组蛋白在GnRH多肽复合物、重组乳铁蛋白、重组白喉毒素无毒突变体CRM197蛋白的协调机制下，可通过口服或者注射免疫哺乳动物，有效诱导GnRH抗体的产生，可以产生更加持久、显著的抑制生殖能力的作用，对于哺乳动物的生殖调控、激素调节、医学研究及临床应用具有重要作用。
3、本发明的多聚重组蛋白结构中，重组乳铁蛋白具有较强的抗蛋白水解能力，使口服后的多聚重组蛋白可以在胃肠道内保持稳定并提升滞留时间，有助于多肽的吸收，并且，小肠内存在较多的乳铁蛋白受体，在乳铁蛋白受体的介导转运下，多聚重组蛋白或多肽更容易被消化道吸收。
4、本发明的多聚重组蛋白结构中，重组白喉毒素无毒突变体CRM197蛋白可以有效提高神经内药物转运效果，提高N端GnRH多肽复合物、C端GnRH多肽复合物的递送效率，多肽及多种重组蛋白的串联表达可以提升多肽在体内的稳定性；柔性肽可以使两侧的重组蛋白或多肽空间彼此独立，可以实现各自独立功能。
5、本发明多聚重组蛋白具有多种蛋白质组成的复合结构，可以在重组蛋白的N端和C端同时展示GnRH多肽复合物，而且携带的CRM197可以有效提高神经内药物转运效果，携带的重组乳铁蛋白可以有效提升重组蛋白口服吸收效果，相比通过原核表达系统同时表达的GnRH6聚体-CRM197重组蛋白，在胃肠道内或注射后更加稳定，可以更加有效的通过口服诱导GnRH抗体产生，避免注射对动物造成的应激反应。
附图说明
为了更清楚地说明本发明示例性实施方式的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
在附图中：
图1为本发明的多聚重组蛋白疏水性分析图；
图2为本发明的多聚重组蛋白三级结构分析图；
图3为本发明构建的重组质粒双酶切鉴定图；
图4为本发明构建的重组质粒结构示意图；
图5为本发明多聚重组蛋白表达SDS-PAGE鉴定图；
图6为不同IPTG浓度下对多聚重组蛋白IPTG诱导结果图；
图7为本发明多聚重组蛋白纯化SDS-PAGE鉴定图；
图8为本发明多聚重组蛋白Western-blot鉴定图；
图9为小鼠免疫实验的免疫程序图；
图10为小鼠免疫后血清检测结果；其中，A图表示多聚重组蛋白免疫公鼠GnRH水平，B图表示多聚重组蛋白免疫母鼠GnRH水平，C图表示多聚重组蛋白免疫公鼠睾酮（T）浓度；
图11为公鼠睾丸组织切片H&E染色镜检图；中，A图表示多聚重组蛋白免疫公鼠睾丸组织切片H&E染色镜检(40X)；B图表示多聚重组蛋白免疫公鼠睾丸组织切片H&E染色镜检(10X)；C图表示生理盐水♂组公鼠睾丸组织切片H&E染色镜检(40X)；D图表示生理盐水♂组公鼠睾丸组织切片H&E染色镜检(10X)；
图12为公鼠睾丸对比图；其中，A图为多聚重组蛋白免疫♂组公鼠睾丸，B图为生理盐水♂组公鼠睾丸，C图为醋酸甲地孕酮♂组，D图手术对照♂组公鼠睾丸，E图为GnRH6聚体-CRM197重组蛋白♂组；
图13为犬免疫实验的免疫程序图；
图14为不同治疗组诱导犬GnRH抗体的结果图；其中，A图表示生理盐水诱导犬GnRH抗体的结果；B图表示多聚重组蛋白在注射2周后犬GnRH抗体水平；C图表示多聚重组蛋白在口服2周后犬GnRH抗体水平；D图表示口服GnRH6-CRM197重组蛋白犬GnRH抗体水平；
图15为猫免疫实验的免疫程序图；
图16为不同治疗组诱导猫GnRH抗体的结果图；其中，A图表示生理盐水诱导猫GnRH抗体的结果；B图表示多聚重组蛋白在注射2周后猫GnRH抗体水平；C图表示多聚重组蛋白在口服2周后猫GnRH抗体水平；D图表示口服GnRH6-CRM197重组蛋白猫GnRH抗体水平。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
下面对主要用到的实验材料做说明。
1.实验动物：C57BL/6小鼠采购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司、比格犬、家猫采购自CRO企业。
2.实验样品：Ecoli. DH5α感受态、Ecoli. BL21(DE3)感受态，pGEX-5X-1载体。
3.主要试剂：
表一、试剂列表
试剂 厂家
0.25%胰蛋白酶 美国Gibco公司
胎牛血清（FBS） 美国Hyclone公司
磷酸盐缓冲液（PBS） 北京索莱宝科技有限公司
PBST缓冲液 北京索莱宝科技有限公司
TBST缓冲液 北京索莱宝科技有限公司
异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG） 北京索莱宝科技有限公司
DEPC水 碧云天生物技术有限公司
生理盐水 北京索莱宝科技有限公司
弗氏完全佐剂 碧云天生物技术有限公司
病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒 天根生化科技（北京）有限公司
All-in-one 1 st Strand cDNA Synthesis SuperMix 近岸蛋白质科技有限公司
琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒 天根生化科技（北京）有限公司
PCR 2 × Tag Plus PCR Master Mix（含染料） 天根生化科技（北京）有限公司
质粒小提试剂盒 Omega公司
核酸内切酶 碧云天生物技术有限公司
T4 DNA连接酶 美国纽英伦生物技术有限公司
琼脂粉 北京索莱宝科技有限公司
氯化钠（NaCl） 成都市科隆化学品有限公司
胰蛋白胨 英国Oxoid公司
酵母提取物 英国Oxoid公司
氨苄青霉（Ampicilin，Amp+） BioFROXX公司
考马斯亮蓝染色脱色套装 北京索莱宝科技有限公司
DNA marker 天根生化科技（北京）有限公司
蛋白marker 碧云天生物技术有限公司
琼脂糖 Bioweste
SYBR Safe DNA 凝胶染料 Thermo Fisher Scientific
50 × TAE电泳缓冲液 生工生物工程（上海）股份有限公司
尿素 成都市科隆化学品有限公司
三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl） 武汉赛维尔生物科技有限公司
乙二胺四乙酸（EDTA） 源叶生物
碳酸氢钠（NaHCO3） 源叶生物
100 mmol/L苯甲基磺酰氟（PMSF） 碧云天生物技术有限公司
丙三醇 成都市科隆化学品有限公司
SDS凝胶配制试剂盒 碧云天生物技术有限公司
SDS-PAGE电泳缓冲液 碧云天生物技术有限公司
5 × SDS-PAGE蛋白上样缓冲液 碧云天生物技术有限公司
Western转膜液 碧云天生物技术有限公司
HRP标记羊抗兔IgG 英国Abcam公司
HRP标记兔抗猪IgG 北京博奥森生物技术有限公司
超敏ECL化学发光试剂盒 碧云天生物技术有限公司
BCA蛋白质浓度测定试剂盒 天根生化科技（北京）有限公司
ELISA包被液 北京索莱宝科技有限公司
脱脂奶粉 北京索莱宝科技有限公司
明胶 北京索莱宝科技有限公司
牛血清白蛋白（BSA） BioFROXX公司
氯仿 重庆科试化学有限公司
异丙醇 成都市科龙化工试剂厂
无水乙醇 上海麦克林生化科技有限公司
硫酸（H2SO4） 成都市科龙化工试剂厂
TMB双组分显色液试剂盒 北京索莱宝科技有限公司
。
4.相关试剂的配制。
（1）1%琼脂糖凝胶：称取1.5 g琼脂糖，加入100 mL 1 × TAE电泳缓冲液，微波炉加热至完全熔化，冷却至50℃~60℃时加入4 µl SYBR Safe DNA 凝胶染料。
（2）氨苄青霉素（Amp+）（50 µg/mL）：称取0.5 g Amp+，加入8 mL灭菌ddH2O，充分溶解后定容至10 mL，0.22 µm滤膜过滤后置于-20℃保存。
（3）LB液体培养基：称取1 g胰蛋白胨、0.5 g酵母提取物、1 g NaCl，加入50 mLddH2O充分搅拌溶解后定容至100 mL，调节pH值至7.2-7.4，高温高压灭菌，冷却后置于4℃保存。
（4）Amp+抗性的LB液体培养基（Amp+终浓度为100 µg/mL）：100 mL LB液体培养基加入200 µL Amp+（50 mg/mL）充分混匀。
（5）Amp+抗性的LB固体平板：称取1 g胰蛋白胨、0.5 g酵母提取物、1 g NaCl，1.5g琼脂粉，加入50 mL ddH2O充分搅拌溶解后定容至100 mL，调节pH值至7.2-7.4，高温高压灭菌后冷却至50℃~60℃，加入200 µL配制好的Amp+（50 mg/mL）充分混匀后倾倒平板，凝固后置于4℃保存。
（6）SDS-PAGE凝胶配制：
表二、12%分离胶配方
蒸馏水 1.3 mL
30% Acr-Bis(29:1) 1.7 mL
1 mol/L Tris（PH 8.8） 1.9 mL
10% SDS 0.05 mL
10%凝胶聚合催化剂 0.05 mL
TEMED 0.002 mL
5 mL
表三、5%浓缩胶配方
蒸馏水 1.4 mL
30% Acr-Bis(29:1) 0.33 mL
1 mol/L Tris（PH 6.8） 0.25 mL
10% SDS 0.02 mL
10%凝胶聚合催化剂 0.02 mL
TEMED 0.002 mL
2 mL
。
（7）Western blot封闭液：称取5 g BSA，加入100 mL TBST缓冲液中，充分搅拌溶解。
（8）蛋白溶解复性相关试剂。
①超声破碎缓冲液：称取Tris-HCl 15.76 g，EDTA 14.6 g，NaCl 29.22 g，加入500 mL ddH2O充分搅拌溶解，加入50 mL丙三醇，定容至1000 mL，4℃保存。
②包涵体洗涤液I：称取Tris-HCl 1.58 g，EDTA 2.92 g，尿素12.12 g，加入200 µL TritonX-100，1 000 mL ddH2O充分搅拌溶解，调节pH值至8.0，4℃保存。
③包涵体洗涤液II：称取Tris-HCl 1.58 g，EDTA 2.92 g，加入200 µL TritonX-100，1 000 mL ddH2O充分搅拌溶解，调节pH值至8.0，4℃保存。
④包涵体溶解液Buffer A（现配现用）：称取Tris-HCl 0.25 g，NaCl 2.34 g，尿素38.44 g，加入80 mL ddH2O充分搅拌溶解，调节pH值至8.0，4℃保存。
⑤透析袋处理液I：称取NaHCO310 g，EDTA 0.15 g，加入490 mL ddH2O充分搅拌溶解，调节pH值至8.0，4℃保存。
⑥透析袋处理液II：称取EDTA 0.15 g，加入500 mL ddH2O充分搅拌溶解，调节pH值至8.0，4℃保存。
⑦透析Buffer B（现配现用）：称取Tris-HCl 0.63 g，NaCl 5.84 g，尿素72.07 g，加入0.8 mL 100 mmol/L PMSF和200 mL ddH2O充分搅拌溶解，调节pH值至8.0，4℃保存。
⑧透析Buffer C（现配现用）：称取Tris-HCl 0.63 g，NaCl 5.84 g，尿素48.05 g，加入0.8 mL 100 mmol/L PMSF和200 mL ddH2O充分搅拌溶解，调节pH值至8.0，4℃保存。
⑨透析Buffer D（现配现用）：称取Tris-HCl 0.63 g，NaCl 5.84 g，尿素24.02 g，加入0.8 mL 100 mmol/L PMSF和200 mL ddH2O充分搅拌溶解，调节pH值至8.0，4℃保存。
⑩透析Buffer E：称取Tris-HCl 0.63 g，NaCl 5.84 g，加入0.8 mL 100 mmol/LPMSF和200 mL ddH2O充分搅拌溶解，调节pH值至8.0，4℃保存。
实施例1。
本实施例提供一种调控哺乳动物生殖能力的多聚重组蛋白，具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
实施例2。
本实施例提供一种调控哺乳动物生殖能力的多聚重组蛋白的制备方法，具体为：
1.编码多聚重组蛋白的基因设计。
根据N端GnRH多肽复合物序列（SEQ ID NO.3）、柔性肽1序列（SEQ ID NO.4）、重组乳铁蛋白序列（SEQ ID NO.5）、柔性肽2序列（SEQ ID NO.6）、重组CRM197蛋白序列（SEQ IDNO.7）、柔性肽3序列（SEQ ID NO.8）以及C端GnRH多肽复合物序列（SEQ ID NO.9），设计得到全长为4575bp，如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，用于克隆入载体的酶切位点，其中，N端GnRH多肽复合物是指GnRH 8聚体，C端GnRH多肽复合物是指GnRH 9聚体。
2.重组质粒 pGEX-NGnRHpoly–linker1-LF-linker2-CRM197-linker3-CgnRHpoly的构建。
本发明选择pGEX-5X-1-H(RBS)载体作为本发明载体的基础骨架结构，需要说明的是，本发明所述的表达多聚重组蛋白的载体也可以使用目前已知的其他原核表达载体进行构建。
2.1载体提取：将1µg pGEX-5X-1-H(RBS)（购自金斯瑞生物科技有限公司），加入100µL DH5α感受态细胞，在离心管充分混合后冰浴30min。冰浴后将感受态细胞于42℃保温90s，再次冰浴2min。向离心管加入800µL LB培养基，37℃ 200rpm/ min振荡培养1h。取10-50µL转化后的感受态细胞涂布于Amp培养皿上，于37℃培养12-24小时，挑取单个菌落后于200mL LB培养基(加入氨苄青霉素至100µg/mL)扩大培养，并使用QIAGEN质粒小提试剂盒（QIAGEN，德国）提取pGEX-5X-1-H(RBS)质粒。
2.2酶切：使用双酶切体系BamHI酶0.5µL、EcoRI酶0.5µL、pGEX-5X-1-H载体6µg、10xBuffer R 2µL和ddH2O 10µL的混合液，在37℃下对pGEX-5X-1-H载体恒温双酶切2h。双酶切后使用1%琼脂糖凝胶电泳，并对酶切后的pGEX-5X-1-H(RBS)使用QIAGEN DNA凝胶回收试剂盒纯化。
2.3连接、转化和扩大培养：将酶切后的pGEX-5X-1-H(RBS) 3µg、SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列 7µg、T4 DNA连接酶 1µg、10xBuffer R 2µL、ddH2O 7µL，在离心管内充分混合后4℃连接过夜，从而将全长为4575bp的SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列克隆入pGEX-5X-1载体BamHI/EcoRI酶切位点，基于pGEX-5X-1载体骨架构建了一种表达多聚重组蛋白的新型载体。然后将连接产物转化至E.coli DH5α感受态细胞后，对E.coli DH5α进行扩大培养，使用QIAGEN质粒小提试剂盒提取重组质粒。并通过BamHI/EcoRI双酶切鉴定、二代测序方式对重组质粒进行鉴定，将鉴定正确的重组质粒命名为：
pGEX-NGnRHpoly–linker1-LF-linker2-CRM197-linker3-CGnRHpoly。
3.多聚重组蛋白的表达与纯化。
将重组质粒pGEX-NGnRHpoly–linker1-LF-linker2-CRM197-linker3-CGnRHpoly转化入E.coli BL21基因工程菌中，将质粒转化后的BL21工程菌命名为BL21-多聚重组蛋白。在37℃培养条件下，200rpm下振荡培养细菌至对数生长期（OD600nm达0.6-0.8左右），使用0.2mM浓度的IPTG对BL21进行4h处理，诱导重组蛋白质的表达。
6000rpm离心10min收集菌体，对收集的菌体进行超声波破碎，并分离细菌菌体与细菌裂解上清，丢弃上清得到包涵体沉淀。使用8 mol/L尿素的包涵体溶解液充分溶解包涵体沉淀，调整包涵体蛋白浓度，使用从含有高浓度尿素到低浓度尿素的包涵体复性缓冲液和PBS缓冲液对溶解的包涵体蛋白进行透析，得到复性蛋白。使用GST标签蛋白纯化试剂盒对复性的重组蛋白进行纯化。最后，分别对细菌裂解菌体、细菌裂解上清、纯化重组蛋白进行SDS-PAGE电泳和Western-blot分析。并将重组蛋白命名为：多聚重组蛋白。
实施例3。
本实施例与实施例2的不同之处在于：多聚重组蛋白的表达与纯化过程中，使用0.4 mM浓度的IPTG对BL21进行4h处理。
实施例4。
本实施例与实施例2的不同之处在于：多聚重组蛋白的表达与纯化过程中，使用0.8 mM浓度的IPTG对BL21进行4h处理。
下面为实施例2制备的重组质粒和多聚重组蛋白的相关检测结果。
1、多聚重组蛋白生物信息学分析结果。
1.1、通过在线软件Antibody Epitope Prediction对多聚重组蛋白抗原表位区分析结果表明，5-122、245-267、301-311、319-334、420-466、473-485、498-509、561-574、1017-1026、1056-1130、1139-1176、1222-1241、1244-1266、1287-1300、1318-1521等氨基酸位置为优势抗原表位区（见表四）。说明多聚重组蛋白具有诱导特异性抗体的结构基础。
表四、多聚重组蛋白抗原表位区分析结果
序号 起点 终点 多肽序列 长度
1 5 122 EHWSYGLRPGGKREHWSYGLRPGGKREHWSYGLRPGGKREHWSYGLRPGGKREHWSYGLRPGGKREHWSYGLRPGGKREHWSYGLRPGGKREHWSYGLRPGGKRKLGGGGSGGGGSGG 118
2 147 147 R 1
3 160 164 WFKCR 5
4 168 176 WRMKKLGAP 9
5 213 216 RDPY 4
6 228 231 TKES 4
7 245 267 GSNFQLDQLQGRKSCHTGLGRSA 23
8 281 289 SWTESLEPL 9
9 291 291 G 1
10 296 296 F 1
11 298 299 SA 2
12 301 311 CVPCIDRQAYP 11
13 319 334 GEGENQCACSSREPYF 16
14 360 368 ENLPEKADR 9
15 377 386 NNSRAPVDAF 10
16 405 409 DGKED 5
17 420 466 EKSGKNKSRSFQLFGSPPGQRDLLFKDSALGFLRIPSKVDSALYLGS 47
18 473 485 KNLRETAEEVKAR 13
19 498 509 EQKKCQQWSQQS 12
20 543 546 IYTA 4
21 561 574 SSKHSSLDCVLRPT 14
22 586 609 ANEGLTWNSLKDKKSCHTAVDRTA 24
23 621 645 QTGSCAFDEFFSQSCAPGADPKSRL 25
24 649 669 CAGDDQGLDKCVPNSKEKYYG 21
25 692 712 VWENTNGESTADWAKNLNRED 21
26 719 730 DGTRKPVTEAQS 12
27 764 807 KNGKNCPDKFCLFKSETKNLLFNDNTECLAKLGGRPTYEEYLGT 44
28 818 823 KCSTSP 6
29 830 878 FLTRGGGGSGGGGSGGGGSMGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVD 49
30 882 927 KGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAG 46
31 950 950 T 1
32 952 968 KKELGLSLTEPLMEQVG 17
33 970 978 EEFIKRFGD 9
34 990 1006 AEGSSSVEYINNWEQAK 17
35 1017 1026 ETRGKRGQDA 10
36 1037 1049 GNRVRRSVGSSLS 13
37 1056 1130 DVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAW 75
38 1139 1176 DSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEE 38
39 1222 1241 NSYNRPAYSPGHKTQPFLHD 20
40 1244 1266 AVSWNTVEDSIIRTGFQGESGHD 23
41 1287 1300 PGKLDVNKSKTHIS 14
42 1315 1315 G 1
43 1318 1521 TFCRPKSPVYVGNGVHANLHVAFHRSSSEKIHSNEISSDSIGVLGYQKTVDHTKVNSKLSLFFEIKSGGGGSGGGGSGGGGSLEMGKREHWSYGLRPGGKREHWSYGLRPGGKREHWSYGLRPGGKREHWSYGLRPGGKREHWSYGLRPGGKREHWSYGLRPGGKREHWSYGLRPGGKREHWSYGLRPGGKREHWSYGLRPGGK 204
1.2、使用在线软件ProtParam对多聚重组蛋白进行基本理化性质分析，结果显示多聚重组蛋白分子量为166.9Kda，理论等电点（isoelectric point, pI）9.09。多聚重组蛋白在哺乳动物网状红细胞（体外）、酵母细胞内和大肠杆菌内半衰期分别为30h、>20h、>10h，脂溶指数为70.14。蛋白质疏水性分析表明，重组多聚蛋白具有较好的结构稳定性（见图1）。
1.3、使用在线软件SWISS-MODEL软件对多聚重组蛋白三级结构进行了分析（见图2）。结果表明多聚重组蛋白的N端GnRH多肽复合物、重组乳铁蛋白、重组CRM197蛋白、C端GnRH多肽复合物可以通过柔性肽结合，各个结构彼此独立有利于发挥各自生物学功能。
1.4、使用在线软件TMHMMP预测多聚重组蛋白质跨膜区，结果显示重组蛋白不存在跨膜区结构，说明该重组蛋白不属于膜蛋白，有利于重组蛋白的表达和大规模生产。
2、重组质粒的鉴定。
如图3所示，为重组质粒双酶切鉴定图，其中，M表示DNA Marker条带，1表示酶切前的重组质粒条带；2表示酶切后的重组质粒条带，从图3可知，重组质粒经双酶切鉴定在4575bp处有目的条带且测序结果正确，表明成功构建重组质粒，图4为本发明构建的重组质粒结构示意图，将其命名为pGEX-NGnRHpoly–linker1-LF-linker2-CRM197-linker3-CGnRHpoly。
3、多聚重组蛋白的表达与鉴定。
本发明使用SDS-PAGE电泳和Western blot鉴定目的蛋白的表达形式。
实验结果显示，经过IPTG诱导后，多聚重组蛋白在E.coli BL21(DE3)基因工程菌中稳定表达，分子量为166.9KDa，符合生物信息学预测结果。
如图5为本发明多聚重组蛋白表达SDS-PAGE鉴定图，从图可知，多聚重组蛋白主要以包涵体形式表达。
如图6为不同IPTG浓度下对多聚重组蛋白IPTG诱导结果图，结果显示IPTG浓度0.2mmol/L，诱导温度为37oC，诱导时间4h为多聚重组蛋白最佳诱导条件。
如图7为本发明多聚重组蛋白纯化SDS-PAGE鉴定图，使用GST标签蛋白纯化试剂盒对复性的多聚重组蛋白进行纯化，SDS-PAGE鉴定结果表明多聚重组蛋白被纯化。
如图8为本发明多聚重组蛋白Western-blot鉴定图，Western-blot结果表明多聚重组蛋白可以与GnRH特异性抗体结合，因此纯化后的重组蛋白具有良好生物学活性。
下面是对实施例2制备的多聚重组蛋白对生殖能力抑制能力、诱导GnRH抗体产生能力的相关效果验证，其包括对照实验。
1、小鼠免疫实验。
1.1、实验组和对照组设计。
将C57BL/6公鼠分为：多聚重组蛋白治疗♂组（12只）、生理盐水♂组（12只）、醋酸甲地孕酮♂组（12只）、手术绝育♂组（12只）、GnRH6聚体-CRM197重组蛋白治疗♂对照组（12只）。
将C57BL/6母鼠分为：多聚重组蛋白治疗♀组（12只）、生理盐水♀组（12只）、乙炔雌二醇♀组（12只）、手术绝育♀组（12只）、GnRH6聚体-CRM197重组蛋白治疗♀对照组（12只）。
1.2、免疫方案。
第0周，将多聚重组蛋白、对照的GnRH6聚体-CRM197重组蛋白以每只小鼠1µg重组蛋白/1g体重进行皮下注射治疗小鼠。醋酸甲地孕酮♂组按0.1µg/1g体重饲喂醋酸甲地孕酮，乙炔雌二醇♀组按0.1µg/1g体重饲喂乙炔雌二醇。第2周，将多聚重组蛋白、对照的GnRH6聚体-CRM197重组蛋白以每只小鼠1µg重组蛋白/1g体重进行皮下注射治疗小鼠。
所有实验小鼠分别于第0周（免疫前）、第3周、第6周、第9周采血收集血清，通过ELISA方法检测小鼠血清GnRH抗体、睾酮（Testosterone, T）水平。于第9周随机在每组中随机选取4只小鼠对睾丸、卵巢进行组织切片镜检。
于第10周将以下小鼠实验组配对饲养：多聚重组蛋白治疗♂组、多聚重组蛋白治疗♀组剩余公母小鼠分别配对饲养；将生理盐水♂组、生理盐水♀组剩余公母小鼠分别配对饲养；将醋酸甲地孕酮♂组、乙炔雌二醇♀组剩余公母小鼠分别配对饲养；将手术绝育♂组、手术绝育♀组剩余公母小鼠分别配对饲养；对照的GnRH6聚体-CRM197重组蛋白♂组♀组剩余公母小鼠分别配对饲养。并观察每组新生小鼠生殖情况。
实验动物采用商品化日粮及饮水，实验鼠房温度控制在21oC ，湿度控制在50%，每日光照/黑暗时长为12h/12h。
1.3、实验结果。
（1）按照图9所示的小鼠免疫程序进行，小鼠血清检测结果如图10所示，其中，A图表示多聚重组蛋白免疫公鼠GnRH水平，B图表示多聚重组蛋白免疫母鼠GnRH水平，C图表示多聚重组蛋白免疫公鼠睾酮（T）浓度。
从图10可以看出，使用本发明多聚重组蛋白免疫C57BL/6公鼠、母鼠后均可以有效诱导GnRH特异性抗体的产生，并在免疫后3至9周内维持较高抗体水平，而醋酸甲地孕酮、乙炔雌二醇均没有对GnRH抗体水平产生显著影响。
（2）于免疫后第9周随机在每组中随机选取4只小鼠对睾丸、卵巢进行组织切片镜检。
如图11为公鼠睾丸组织切片H&E染色镜检图，其中，A图表示多聚重组蛋白免疫公鼠睾丸组织切片H&E染色镜检(40X)；B图表示多聚重组蛋白免疫公鼠睾丸组织切片H&E染色镜检(10X)；C图表示生理盐水♂组公鼠睾丸组织切片H&E染色镜检(40X)；D图表示生理盐水♂组公鼠睾丸组织切片H&E染色镜检(10X)。
从图11可知，睾丸组织切片H&E染色镜检显示，多聚重组蛋白免疫小鼠睾丸曲靖细精细管萎缩且数量减少，间质细胞萎缩且数量减少，精子减少而精原细胞显著退化。而生理盐水组小鼠睾丸曲精细管内各级生精细胞层次清晰，睾丸曲精细管内精原细胞、初级精母细胞、精子细胞、精子、睾丸间质组织内间质细胞轮廓清晰且饱满。
如图12为公鼠睾丸对比图，其中，A图为多聚重组蛋白免疫♂组公鼠睾丸，B图为生理盐水♂组公鼠睾丸，C图为醋酸甲地孕酮♂组，D图手术对照♂组公鼠睾丸，E图为GnRH6聚体-CRM197重组蛋白♂组。
从图12可以看出，多聚重组蛋白免疫小鼠睾丸体积显著低于生理盐水♂组、醋酸甲地孕酮♂组、手术对照♂组公鼠睾丸、GnRH6聚体-CRM197重组蛋白♂组小鼠睾丸，说明本发明的多聚重组蛋白可以显著抑制睾丸生理功能，证明了本发明多聚重组蛋白具有更良好的生殖抑制作用。
（3）于免疫后第10周将小鼠按照1.2的免疫方案进行配对饲养，首次免疫后28周观察生殖结果，结果显示：多聚重组蛋白免疫的公母鼠、手术绝育公母鼠繁殖新生小鼠数量为0；生理盐水组小鼠繁殖总数为128只；醋酸甲地孕酮♂组、乙炔雌二醇♀组繁殖总数为96只；对照的GnRH6聚体-CRM197重组蛋白治疗组繁殖总数41只。
以上结果说明本发明设计的多聚重组蛋白在免疫后28周内对C57BL/6生殖能力具有显著生殖抑制作用，并且在首次免疫28周内抑制作用显著强于醋酸甲地孕酮♂组、乙炔雌二醇♀组及对照GnRH6聚体-CRM197重组蛋白，相对GnRH6聚体-CRM197重组蛋白具有更持久的抑制生殖的效果。
综上所述，通过小鼠免疫实验，在注射免疫小鼠后可以有效诱导GnRH抗体的产生，抑制睾酮分泌，并在免疫后28周内持续抑制小鼠生殖能力，证明了本发明的多聚重组蛋白具有显著、持久的抑制生殖能力的作用，且相比于通过原核表达系统同时表达的GnRH6聚体-CRM197重组蛋白，具有更好的抑制生殖的能力。
2、犬免疫实验。
2.1、实验组和对照组设计。
将10月龄比格犬（雄性）分为多聚重组蛋白注射治疗♂组（4只）、多聚重组蛋白口服治疗♂组（4只）、生理盐水♂组（4只）、GnRH6聚体-CRM197重组蛋白口服♂对照组。
2.2、免疫方案。
第0周，多聚重组蛋白注射治疗♂组以每只犬1µg重组蛋白/1g体重进行皮下注射治疗；多聚重组蛋白、对照的GnRH6聚体-CRM197重组蛋白口服治疗♂组以每只犬2µg重组蛋白/1g体重进行口服治疗。第2周，将多聚重组蛋白注射治疗♂组以每只犬1µg重组蛋白/1g体重进行皮下注射治疗；多聚重组蛋白、对照的GnRH6聚体-CRM197重组蛋白口服治疗♂组以每只犬2µg重组蛋白/1g体重进行口服治疗。所有实验犬分别于第0（免疫前）、2、4、6、8、10周采血收集血清，通过ELISA方法检查犬血清GnRH抗体水平。
2.3、实验结果。
如图13为犬免疫实验的免疫程序图。
图14为不同治疗组导犬GnRH抗体的结果图，其中，A图表示生理盐水诱导犬GnRH抗体的结果；B图表示多聚重组蛋白在注射2周后犬GnRH抗体水平；C图表示多聚重组蛋白在口服2周后犬GnRH抗体水平；D图表示口服GnRH6-CRM197重组蛋白犬GnRH抗体水平。
从图14可以看出，生理盐水不能诱导犬GnRH抗体，多聚重组蛋白无论是注射还是口服免疫犬后，均可以有效诱导GnRH抗体产生，而口服GnRH6-CRM197重组蛋白对犬GnRH抗体水平调控不显著。
3、猫免疫实验。
3.1、实验组和对照组设计。
将10月龄家猫（雄性）分为多聚重组蛋白注射治疗♂组（4只）、多聚重组蛋白口服治疗♂组（4只）、生理盐水♂组（4只）、GnRH6聚体-CRM197重组蛋白口服♂对照组。
3.2、免疫方案。
第0周，多聚重组蛋白注射治疗♂组以每只猫1µg重组蛋白/1g体重进行皮下注射治疗；多聚重组蛋白、对照的GnRH6聚体-CRM197重组蛋白口服治疗♂组以每只猫2µg重组蛋白/1g体重进行口服治疗。第2周，将多聚重组蛋白注射治疗♂组以每只猫1µg重组蛋白/1g体重进行皮下注射治疗；多聚重组蛋白、对照的GnRH6聚体-CRM197重组蛋白口服治疗♂组以每只猫2µg重组蛋白/1g体重进行口服治疗。所有实验猫分别于第0（免疫前）、2、4、6、8、10周采血收集血清，通过ELISA方法检查猫血清GnRH抗体水平。
3.3、实验结果。
如图15为猫免疫实验的免疫程序图。
图16为不同治疗组诱导猫GnRH抗体的结果图，其中，A图表示生理盐水诱导猫GnRH抗体的结果；B图表示多聚重组蛋白在注射2周后猫GnRH抗体水平；C图表示多聚重组蛋白在口服2周后猫GnRH抗体水平；D图表示口服GnRH6-CRM197重组蛋白猫GnRH抗体水平。
从图16可以看出，生理盐水不能诱导猫GnRH抗体，多聚重组蛋白无论是注射还是口服免疫猫后，均可以有效诱导GnRH抗体产生，而口服GnRH6-CRM197重组蛋白对猫GnRH抗体水平调控不显著。
最后，需要说明的是，本发明所述的多聚重组蛋白内的GnRH多聚体可以根据临床应用需要设计为GnRH 1-12聚体，不同蛋白组成的结构可以根据具体需要进行调整组合，如可以将LF和CRM197更换为其他蛋白组合，或将LF-linker-CRM197部分整体替换为单个蛋白，或多聚重组蛋白N端到C端位置可以调整。
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.调控哺乳动物生殖能力的多聚重组蛋白，其特征在于，所述多聚重组蛋白的结构为串联的N端GnRH多肽复合物、柔性肽1、重组乳铁蛋白、柔性肽2、重组CRM197蛋白、柔性肽3和C端GnRH多肽复合物；
编码所述多聚重组蛋白的基因如SEQ ID NO.1所示；
所述多聚重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.调控哺乳动物生殖能力的多聚重组蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、设计得到如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；
S2、重组质粒的构建：将SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列与经过双酶切的载体连接，连接后的产物转化至E.coli DH5α感受态细胞后，对E.coli DH5α进行扩大培养，提取重组质粒；
S3、多聚重组蛋白的表达与纯化：将重组质粒转化入基因工程菌中，通过IPTG诱导多聚重组蛋白的表达，分离纯化得到多聚重组蛋白。
3.根据权利要求2所述的调控哺乳动物生殖能力的多聚重组蛋白的制备方法，其特征在于，步骤S2所述重组质粒的构建包括：
S21、提取pGEX-5X-1-H质粒；
S22、使用双酶切体系BamHI酶和EcoRI酶进行双酶切，得到酶切后的pGEX-5X-1-H；
S23、将酶切后的pGEX-5X-1-H与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列在T4 DNA连接酶作用下连接，得到连接产物；
S24、连接产物转化至E.coli DH5α感受态细胞后，对E.coli DH5α进行扩大培养，提取重组质粒。
4.根据权利要求3所述的调控哺乳动物生殖能力的多聚重组蛋白的制备方法，其特征在于，步骤S22包括：
使用双酶切体系BamHI酶0.5µL、EcoRI酶0.5µL、pGEX-5X-1-H载体6µg、10xBuffer R 2µL和ddH2O 10µL的混合液，在37℃下对pGEX-5X-1-H载体恒温双酶切2h，双酶切后使用琼脂糖凝胶电泳，并对酶切后的pGEX-5X-1-H纯化。
5.根据权利要求2所述的调控哺乳动物生殖能力的多聚重组蛋白的制备方法，其特征在于，步骤S3多聚重组蛋白的表达与纯化包括：
S31、将重组质粒转化入E.coli BL21基因工程菌中，振荡培养细菌至对数生长期，使用IPTG进行处理，诱导重组蛋白质的表达；
S32、离心收集菌体，超声波破碎，丢弃细菌裂解上清得到包涵体沉淀；
S33、使用尿素的包涵体溶解液充分溶解包涵体沉淀，调整包涵体蛋白浓度，使用从含有高浓度尿素到低浓度尿素的包涵体复性缓冲液和PBS缓冲液对溶解的包涵体蛋白进行透析，得到复性重组蛋白，对复性的重组蛋白进行纯化，得到多聚重组蛋白。
6.根据权利要求5所述的调控哺乳动物生殖能力的多聚重组蛋白的制备方法，其特征在于，步骤S31中，加入IPTG至终浓度为0.2 mmol/L，诱导温度为37℃，诱导时间为4h。
7.如权利要求1所述的多聚重组蛋白在制备调控哺乳动物生殖能力的产品中的应用。
8.一种疫苗，其特征在于，包含权利要求1所述的多聚重组蛋白。
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