CN115746145A - 细粒棘球蚴及加拿大棘球蚴eg95/ec95蛋白组合的制备及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种细粒棘球蚴及加拿大棘球蚴EG95/EC95蛋白组合的制备及应用；所述重组蛋白组合包括dEG95和dEC95氨基酸序列；dEG95氨基酸序列为狭义细粒棘球绦虫的EG95删去N端的信号肽区域及C端的跨膜区，得到的修饰后的氨基酸序列；EG95基因序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；dEC95氨基酸序列为加拿大棘球绦虫的EC95删去N端的信号肽区域及C端的跨膜区，得到的修饰后的氨基酸序列；EC95基因序列如SEQ ID NO.4所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。本发明的方法具备蛋白表达量高、工艺简单、生产成本低等优点。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，涉及一种细粒棘球蚴及加拿大棘球蚴EG95/EC95蛋白组合的制备及应用；尤其涉及细粒棘球蚴及加拿大棘球蚴EG95/EC95蛋白质序列的修饰方法，以及用这种经过修饰后蛋白序列制备重组表达质粒、重组大肠杆菌工程菌，以及大肠杆菌工程菌诱导表达方法。
背景技术
棘球蚴病(Echinococcosis)，是由棘球蚴属绦虫的幼虫——棘球蚴(hydatidcyst)寄生于人和动物的肺、肝等组织器官而引起的一种严重的人兽共患寄生虫病。棘球蚴病流行广，呈世界性分布，世界动物卫生组织(World Organization for Animal Health；法语：Office international desépizooties，OIE)将棘球蚴病归为全球通报的传染病，归属为多种动物共患病；世界卫生组织(World Health Organization，WHO)将棘球蚴病列为全球早期预警系统优先预测和应急处置的疾病之一。棘球蚴病也是中国卫生部规划防治的五大寄生虫病之一。
根据病灶的形态及感染病原的差异，棘球蚴病主要分为细粒棘球蚴病(cysticechinococcosis,CE)和多房棘球蚴病两种，其中细粒棘球蚴病分布最广，患者人数最多。CE的致病原目前由几个棘球绦虫复合种构成：狭义细粒棘球绦虫(EchinococcusgranuLosus)、加拿大棘球绦虫(Echinococcus.canadensis)、马棘球绦虫、奥氏棘球绦虫，其中由狭义细粒棘球绦虫G1型引起的CE超过90％，而由加拿大棘球蚴绦虫G6型引起的CE超过7％。
目前研究表明控制棘球蚴病的流行主要是通过切断棘球绦虫发育环节，控制人、畜等中间宿主对棘球蚴的感染，预防或驱虫治疗犬类等终宿主，阻断虫卵的大范围播散。其中对于中间宿主接种疫苗可以有效控制细粒棘球蚴病的流行。Lightowlers等发现EG95是存在于Eg中的天然六钩蚴抗原之一，并且是筛选的众多蛋白中最有效的保护性抗原，已有成功研制抗羊细粒棘球蚴病的疫苗。然而现有重组EG95蛋白疫苗是由大肠杆菌包涵体复性制备，纯度低且难以维持蛋白的空间结构，而且与加拿大棘球蚴绦虫G6型无明显交叉保护性，因此有一定的局限性。
发明内容
鉴于上述现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种细粒棘球蚴及加拿大棘球蚴EG95/EC95蛋白组合的制备及应用；具体是针对细粒棘球蚴EG95及加拿大棘球蚴中的EC95进行修饰，并制备重组表达质粒、重组大肠杆菌工程菌，以及用这种重组大肠杆菌工程菌表达的融合蛋白具有纯度高、可溶性好、纯化方便、生物学活性高等优点。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
第一方面，本发明涉及一种重组蛋白组合，所述重组蛋白组合包括dEG95氨基酸序列和dEC95氨基酸序列；
所述dEG95氨基酸序列为狭义细粒棘球绦虫的EG95经过氨基酸序列修饰，删去N端的信号肽区域及C端的跨膜区，得到的修饰后的氨基酸序列；所述EG95基因序列如SEQ IDNO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述dEC95氨基酸序列为加拿大棘球绦虫的EC95经过氨基酸序列修饰，删去N端的信号肽区域及C端的跨膜区，得到的修饰后的氨基酸序列；所述EC95基因序列如SEQ IDNO.4所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
作为本发明的一个实施方案，将EG95氨基酸序列的N-端截短13、14、15或16个氨基酸；C-端截短20、22、24或26个氨基酸。
作为本发明的一个实施方案，将EG95氨基酸序列的N-端截短14个氨基酸，C-端截短24个氨基酸。修饰后的EG95氨基酸序列，即dEG95氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
作为本发明的一个实施方案，将EC95氨基酸序列的N-端截短13、14、15或16个氨基酸；C-端截短20、22、24或26个氨基酸。
作为本发明的一个实施方案，EC95氨基酸序列的N-端截短14个氨基酸，C-端截短24个氨基酸。修饰后的EC95氨基酸序列，即dEC95氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
作为本发明的一个实施方案，dEG95氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；dEC95氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
第二方面，本发明涉及一种重组蛋白组合的制备方法，所述方法包括如下步骤：
S1、将dEG95和dEC95的编码基因克隆到原核表达载体，获得重组表达质粒；
S2、以重组表达质粒转染原核表达菌株，筛选单克隆，发酵培养，诱导表达得到所述重组蛋白。
具体地，作为本发明的一个实施方案，步骤S1包括如下步骤：
A1、分别基因合成密码子优化的适合大肠杆菌表达的dEG95、dEC95基因序列；
dEG95氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，dEC95氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；
或，两个dEG95氨基酸序列、两个dEC95氨基酸序列分别通过linker进行连接，形成2dEG95氨基酸序列、2dEC95氨基酸序列；分别基因合成密码子优化的适合大肠杆菌表达的2dEG95、2dEC95基因序列；
或，dEG95氨基酸序列及dEC95氨基酸序列通过linker进行连接，形成dEG95-dEC95氨基酸序列或dEC95-dEG95氨基酸序列；分别基因合成密码子优化的适合大肠杆菌表达的dEG95-dEC95或dEC95-dEG95基因序列；
本发明的重组蛋白组合是本发明首创；且由于EG95及EC95的蛋白结构均没有被解析，因此对其功能研究比较困难。不同的截短会造成异源二聚体中两个单体之间的配合问题，很容易造成异源二聚体错误折叠或者失去活性。本发明通过分子模拟、分子动力学等方法预测了他们的空间结构，因此做出了正确的截短选择，使蛋白可溶性表达，并且维持了稳定的空间结构和构象。
A2、将dEG95及dEC95基因分别按不同顺序依次克隆到pETDuetTM-1质粒载体中，构建得到pETDuet-dEG95-dEC95或pETDuet-dEC95-dEG95质粒；
或，将2dEG95及2dEC95基因分别按不同顺序依次克隆到pETDuetTM-1质粒载体中，构建得到pETDuet-2dEG95-2dEC95或pETDuet-2dEC95-2dEG95质粒；
或，将dEG95-dEC95或dEC95-dEG95基因克隆到pET24a质粒载体中，构建得到pET24a-dEG95-dEC95或pET24a-dEC95-dEG95质粒。
作为本发明的一个实施方案，步骤A1中，所述linker为富含甘氨酸和丝氨酸的linker。优选为GGGSGGGS。
作为本发明的一个实施方案，步骤S2中，所述原核表达菌株为大肠杆菌。所述大肠杆菌来源于市场上可得到的，在此举例但不限于：BL21(DE3)，B834(DE3)，BLR(DE3)，JM109，XL1Blue，ER2566，Rosetta，GI698。优选BL21(DE3)。
作为本发明的一个实施方案，步骤S2中，将
pETDuet-dEG95-dEC95、pETDuet-dEC95-dEG95、pET24a-dEG95-dEC95、pET24a-dEC95-dEG95、pETDuet-2dEG95-2dEC95或pETDuet-2dEC95-2dEG95重组表达质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)。筛选单克隆，得到重组大肠杆菌工程菌Duet-dEG95-dEC95、Duet-dEC95-dEG95、24a-dEG95-dEC95、24a-dEC95-dEG95、Duet-2dEG95-2dEC95或Duet-2dEC95-2dEG95。
作为本发明的一个实施方案，步骤S2中，将Duet-dEG95-dEC95、Duet-dEC95-dEG95、24a-dEG95-dEC95、24a-dEC95-dEG95、Duet-2dEG95-2dEC95或Duet-2dEC95-2dEG95菌株接种到500mL含相应抗生素的LB培养基中，在37℃条件下震荡培养至至OD值为1.2～1.5时，将种子液接种至发酵罐中进行发酵，当菌体OD值达到20～25时，添加IPTG至终浓度为0.4mM，诱导12～14h；诱导表达得到重组蛋白复合物。
作为本发明的一个实施方案，步骤S2还包括用色谱层析进行蛋白纯化的步骤，包括但不限于：离子交换色谱(例如阳离子交换色谱)、疏水相互作用色谱、吸附层析法(例如羟基磷灰石色谱)、凝胶过滤(凝胶排阻)层析法、亲和层析法、分子筛层析法。优选亲和层析法。
作为本发明的一个实施方案，2dEG95氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；2dEC95氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示；dEG95-dEC95氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示；dEC95-dEG95氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。
第三方面，本发明涉及一种包含所述重组蛋白组合的编码基因的重组表达质粒。
作为本发明的一个实施方案，所述重组表达质粒为pETDuet-dEG95-dEC95、pETDuet-dEC95-dEG95、pET24a-dEG95-dEC95、pET24a-dEC95-dEG95、pETDuet-2dEG95-2dEC95或pETDuet-2dEC95-2dEG95。
上述重组表达质粒中，pETDuet-dEG95-dEC95质粒是以dEC95为模板，采用上游引物dEC95-Nde I-F和下游引物dEC95-Xho I-R，PCR扩增得到基因片段dEC95，连接到pETDuet-dEG95，连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，提取质粒，经测序验证而得。其中，以dEG95为模板，采用上游引物dEG95-BamH I-F和下游引物dEG95-Hind III-R，PCR扩增得到基因片段dEG95，连接到pETDuet-1原核表达载体，得pETDuet-dEG95。
pETDuet-dEC95-dEG95质粒是以dEG95为模板，采用上游引物dEG95-Nde I-F和下游引物dEG95-Xho I-R，PCR扩增得到基因片段dEG95，连接pETDuet-dEC95，连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞提取质粒，经测序验证而得。其中，以dEC95为模板，采用上游引物dEC95-BamH I-F和下游引物dEC95-Hind III-R，PCR扩增得到基因片段dEC95，连接到pETDuet-1原核表达载体，得pETDuet-dEC95。
pET24a-dEG95-dEC95是以dEG95-dEC95为模板，采用上游引物dEG95-Nde I-F和下游引物dEC95-Xho I-R，PCR扩增得到基因片段dEG95-dEC95，连接到pET24a原核表达载体，连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，提取质粒，经测序验证而得。
pET24a-dEC95-dEG95是以dEC95-dEG95为模板，采用上游引物dEC95-Nde I-F和下游引物dEG95-Xho I-R，PCR扩增得到基因片段dEC95-dEG95，连接到pET24a原核表达载体，连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，提取质粒，经测序验证而得。
pETDuet-2dEG95-2dEC95是以2dEC95为模板，采用上游引物dEC95-Nde I-F和下游引物dEC95-Xho I-R，PCR扩增得到基因片段2dEC95，连接到pETDuet-2dEG95，连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，提取质粒，经测序验证而得。其中，以2dEG95为模板，采用上游引物dEG95-BamH I-F和下游引物dEG95-Hind III-R，PCR扩增得到基因片段2dEG95，连接到用同样内切酶BamH I和内切酶Hind III处理的pETDuet-1原核表达载体，得pETDuet-2dEG95。
pETDuet-2dEC95-2dEG95是以2dEG95为模板，采用上游引物dEG95-Nde I-F和下游引物dEG95-Xho I-R，PCR扩增得到基因片段2dEG95，连接到pETDuet-2dEC95，连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，提取质粒，经测序验证而得。其中，以2dEC95为模板，采用上游引物dEC95-BamH I-F和下游引物dEC95-Hind III-R，PCR扩增得到基因片段2dEC95，连接到用同样内切酶BamH I和内切酶Hind III处理的pETDuet-1原核表达载体，得pETDuet-2dEC95。
第四方面，本发明涉及一种重组大肠杆菌工程菌，为前述的重组表达质粒转化E.coli而得。在一些实施例中，是转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞而得。
所述工程菌为Duet-dEG95-dEC95、Duet-dEC95-dEG95、24a-dEG95-dEC95、24a-dEC95-dEG95、Duet-2dEG95-2dEC95或Duet-2dEC95-2dEG95。
Duet-dEG95-dEC95、Duet-dEC95-dEG95、24a-dEG95-dEC95、24a-dEC95-dEG95、Duet-2dEG95-2dEC95、Duet-2dEC95-2dEG95六个菌株均可以通过表达EG95/EC95蛋白组合；优选的，将使用24a-dEG95-dEC95、Duet-2dEG95-2dEC95菌株；再优选的，将使用24a-dEG95-dEC95菌株。该菌株表达量更好，免疫原性更好。
因此，本发明还涉及一种重组大肠杆菌工程菌，所述工程菌为大肠杆菌Escherichia coli 24a-dEG95-dEC95，保藏编号为CCTCC NO：M2021750。
第五方面，本发明涉及一种前述的重组蛋白组合在制备抗棘球蚴病感染的药剂和/或疫苗中的用途。
所述药剂和/或疫苗的施用对象包括羊、牛、骆驼。
本发明中涉及的大肠杆菌24a-dEG95-dEC95(Escherichia coli 24a-dEG95-dEC95)，已经于2021年6月23日递交中国典型培养物保藏中心保藏，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M 2021750。
本发明具有如下有益效果：
1)本发明通过基于分子模拟、分子动力学的结构生物学分析，提出了制备细粒棘球蚴及加拿大棘球蚴EG95/EC95蛋白组合的制备方法，该方法实现了目的蛋白可溶及高效表达、且具有工艺简单、生产成本低等优点，制备的目的蛋白免疫原性效果突出。
2)本发明采用异源二聚体的方式巧妙的使蛋白分别保持各自原有结构和功能的情况下简化了操作，首次将EG95及EC95蛋白融合表达使融合蛋白在可溶性表达的情况下具备了两组分蛋白各自的活性，为后续的疫苗及药物开发夯实了基础。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1蛋白表达验证电泳图；其中，泳道1：蛋白质分子量标准样品；泳道2：空白对照；泳道3：Duet-dEG95-dEC95上清；泳道4：Duet-dEG95-dEC95沉淀；泳道5：Duet-dEC95-dEG95上清；泳道6：Duet-dEC95-dEG95沉淀；泳道7：24a-dEG95-dEC95上清；泳道8：24a-dEG95-dEC95沉淀；泳道9：24a-dEC95-dEG95上清；泳道10：
24a-dEC95-dEG95沉淀；泳道11：Duet-2dEG95-2dEC95上清；泳道12：Duet-2dEG95-2dEC95沉淀；泳道13：Duet-2dEC95-2dEG95上清；泳道14：Duet-2dEC95-2dEG95沉淀；泳道15：空白对照；
图2重组蛋白纯化结果电泳图；其中，泳道1：蛋白质分子量标准样品；泳道2：Duet-dEG95-dEC95纯化得到蛋白样品；泳道3：Duet-dEC95-dEG95纯化得到蛋白样品；泳道4：24a-dEG95-dEC95纯化得到蛋白样品；泳道5：24a-dEC95-dEG95纯化得到蛋白样品；泳道6：Duet-2dEG95-2dEC95纯化得到蛋白样品；泳道7：Duet-2dEC95-2dEG95纯化得到蛋白样品；
图3为EG95抗原竞争ELISA检测结果；
图4为EC95抗原竞争ELISA检测结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。
本发明涉及一种细粒棘球蚴及加拿大棘球蚴EG95/EC95蛋白组合的制备，包括如下步骤：
B1：狭义细粒棘球绦虫的EG95基因序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示，经过氨基酸序列修饰，删去N端的信号肽区域及C端的跨膜区，得到修饰后的氨基酸序列称为dEG95；
B2：加拿大棘球绦虫的EC95基因序列如SEQ ID NO.4所示，氨基酸序列如SEQ IDNO.5所示，经过氨基酸序列修饰，删去N端的信号肽区域及C端的跨膜区，得到修饰后的氨基酸序列称为dEC95；
B3：两个dEG95氨基酸序列通过linker进行连接，形成2dEG95氨基酸序列；
B4：两个dEC95氨基酸序列通过linker进行连接，形成2dEC95氨基酸序列；
B5：dEG95氨基酸序列及dEC95氨基酸序列按照不同的顺序通过linker进行连接，形成dEG95-dEC95氨基酸序列及dEC95-dEG95氨基酸序列；
B6：分别基因合成密码子优化的适合大肠杆菌表达的dEG95、2dEG95、dEC95、2dEC95、dEG95-dEC95、dEC95-dEG95六个序列；
B7：将dEG95及dEC95基因按不同顺序依次克隆到pETDuetTM-1质粒载体中，分别构建了pETDuet-dEG95-dEC95及pETDuet-dEC95-dEG95质粒；
B8：将dEG95-dEC95及dEC95-dEG95基因分别克隆到pET24a质粒载体中，构建了pET24a-dEG95-dEC95及pET24a-dEC95-dEG95质粒；
B9：将2dEG95及2dEC95基因按不同顺序依次克隆到pETDuetTM-1质粒载体中，分别构建了pETDuet-2dEG95-2dEC95及pETDuet-2dEC95-2dEG95质粒；
B10：pETDuet-dEG95-dEC95、pETDuet-dEC95-dEG95、pET24a-dEG95-dEC95、pET24a-dEC95-dEG95、pETDuet-2dEG95-2dEC95、pETDuet-2dEC95-2dEG95分别转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，筛选单克隆后将对应的大肠杆菌分别命名为Duet-dEG95-dEC95、Duet-dEC95-dEG95、24a-dEG95-dEC95、24a-dEC95-dEG95、Duet-2dEG95-2dEC95、Duet-2dEC95-2dEG95。
B11：分别将Duet-dEG95-dEC95、Duet-dEC95-dEG95、24a-dEG95-dEC95、24a-dEC95-dEG95、Duet-2dEG95-2dEC95、Duet-2dEC95-2dEG95菌株接种到500mL含相应抗生素的LB培养基中，在37℃条件下震荡培养至至OD值为1.2～1.5时，将种子液接种至发酵罐中进行发酵，当菌体OD值达到20～25时，添加IPTG至终浓度为0.4mM，诱导12～14h。诱导表达得到重组蛋白复合物。
其中，步骤B1中将EG95氨基酸序列的N-端截短13、14、15或16个氨基酸；C-端截短20、22、24或26个氨基酸；优选地，将EG95氨基酸序列的N-端截短14个氨基酸，C-端截短24个氨基酸，修饰后得到的dEG95氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
步骤B2中将EC95氨基酸序列的N-端截短13、14、15或16个氨基酸；C-端截短20、22、24或26个氨基酸；优选地，将EC95氨基酸序列的N-端截短14个氨基酸，C-端截短24个氨基酸，修饰后得到的dEC95氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
步骤B3中将2个dEG95氨基酸序列通过富含甘氨酸和丝氨酸的linker连接；优选地，将2个dEG95氨基酸序列通过GGGSGGGS连接，氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
步骤B4中将2个dEC95氨基酸序列通过富含甘氨酸和丝氨酸的linker连接；优选地，将2个dEC95氨基酸序列通过GGGSGGGS连接，氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
步骤B5中将dEG95及dEC95氨基酸序列通过富含甘氨酸和丝氨酸的linker连接；优选地，将dEG95及dEC95氨基酸序列通过GGGSGGGS连接，根据dEG95及dEC95的顺序不同氨基酸序列如SEQ ID NO.9(dEG95-dEC95)、SEQ ID NO.10(dEC95-dEG95)所示。
步骤B10中大肠杆菌来源于市场上可得到的，在此举例但不限于：BL21(DE3)，B834(DE3)，BLR(DE3)，JM109，XL1Blue，ER2566，Rosetta，GI698。优选BL21(DE3)。
步骤B11中Duet-dEG95-dEC95、Duet-dEC95-dEG95、24a-dEG95-dEC95、24a-dEC95-dEG95、Duet-2dEG95-2dEC95、Duet-2dEC95-2dEG95六个菌株均可以通过表达EG95/EC95蛋白组合；优选的，将使用24a-dEG95-dEC95、Duet-2dEG95-2dEC95菌株；再优选的，将使用24a-dEG95-dEC95菌株。
步骤B11还包括用色谱层析进行蛋白纯化的步骤，包括但不限于：离子交换色谱(例如阳离子交换色谱)、疏水相互作用色谱、吸附层析法(例如羟基磷灰石色谱)、凝胶过滤(凝胶排阻)层析法、亲和层析法、分子筛层析法。优选亲和层析法。
实施例1、基因序列的优化与合成
以E.coli为宿主菌，本发明对编码重组蛋白dEG95、dEC95、2dEG95、2dEC95、dEG95-dEC95和dEC95-dEG95的碱基序列进行了密码子的优化，优化后的碱基序列由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。其中，将EG95氨基酸序列的N-端截短14个氨基酸，C-端截短24个氨基酸，2个修饰后的EG95氨基酸序列通过“GGGSGGGS”连接，构建得到单链同源二聚体2dEG95；将EC95氨基酸序列的N-端截短14个氨基酸，C-端截短24个氨基酸，2个修饰后的EC95氨基酸序列通过“GGGSGGGS”连接，构建得到单链同源二聚体2dEC95；修饰后的EG95氨基酸序列和修饰后的EC95氨基酸序列按照不同先后顺序，通过“GGGSGGGS”连接，构建得到单链异源二聚体dEG95-dEC95和dEC95-dEG95。
同步的，以E.coli为宿主菌，本发明对编码重组蛋白aEG95和aEC95的碱基序列进行了密码子的优化，优化后的碱基序列由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。所述aEG95氨基酸序列为EG95蛋白氨基酸序列的N-端截短8个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO.19所示；所述aEC95氨基酸序列为EC95蛋白氨基酸序列的N-端截短8个氨基酸，氨基酸序列如SEQ IDNO.20所示。将aEG95氨基酸序列和aEC95氨基酸序列按照不同先后顺序，通过“GGGSGGGS”连接，构建得到单链异源二聚体aEG95-aEC95和aEC95-aEG95。
实施例2、重组表达载体的构建。
2.1重组表达载体pETDuet-2dEG95-2dEC95的构建。
2.1.1构建pETDuet-2dEG95载体
(1)以2dEG95为模板，设计上游引物dEG95-BamH I-F和下游引物dEG95-Hind III-R，PCR扩增得到基因片段2dEG95，上游引物的5’端引入限制性内切酶BamH I位点及保护性碱基，其中BamH I位点序列为GGATCC；下游引物的5’端引入限制性内切酶Hind III位点，一个终止密码子及保护性碱基，其中Hind III位点序列为AAGCTT。引物序列及PCR反应程序如表1和表2所示。
表1：引物名称及序列信息
表2：PCR反应程序
(2)将扩增得到的基因片段2dEG95，用内切酶BamH I和内切酶Hind III消化处理，回收酶切后的基因片段，连接到用同样内切酶BamH I和内切酶Hind III处理的pETDuet-1原核表达载体，连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，涂布于含有50μg/ml氨苄青霉素的平板，37℃培养，等平板上的菌落清晰可见时，挑取单菌落于含有50μg/ml氨苄青霉素的3ml液体培养基，37℃培养，随后提取质粒。得到重组质粒pETDuet-2dEG95。
2.1.2构建pETDuet-2dEG95-2dEC95载体。
(1)以2dEC95为模板，设计上游引物dEC95-Nde I-F和下游引物dEC95-Xho I-R，PCR扩增得到基因片段2dEC95，上游引物的5’端引入限制性内切酶Nde I位点及保护性碱基，其中Nde I位点序列为CATATG；下游引物的5’端引入限制性内切酶Xho I位点，一个终止密码子及保护性碱基，其中Xho I位点序列为CTCGAG。引物序列及PCR反应程序如表3和表4所示。
表3：引物名称及序列信息
表4：PCR反应程序
(2)将扩增得到的基因片段2dEC95，用内切酶Nde I和内切酶Xho I消化处理，回收酶切后的基因片段，连接到用同样内切酶Nde I和内切酶Xho I处理的pETDuet-2dEG95，连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，涂布于含有50μg/ml氨苄青霉素的平板，37℃培养，等平板上的菌落清晰可见时，挑取单菌落于含有50μg/ml氨苄青霉素的3ml液体培养基，37℃培养，随后提取质粒。得到重组质粒pETDuet-2dEG95-2dEC95，重组质粒通过测序验证确认与目的序列一致。
2.2重组表达载体pETDuet-2dEC95-2dEG95的构建。
2.2.1构建pETDuet-2dEC95载体
(1)以2dEC95为模板，设计上游引物dEC95-BamH I-F和下游引物dEC95-Hind III-R，PCR扩增得到基因片段2dEC95，上游引物的5’端引入限制性内切酶BamH I位点及保护性碱基，其中BamH I位点序列为GGATCC；下游引物的5’端引入限制性内切酶Hind III位点，一个终止密码子及保护性碱基，其中Hind III位点序列为AAGCTT。引物序列及PCR反应程序如表5和表6所示。
表5：引物名称及序列信息
| 引物名称 | 序列 |
| dEC95-BamH I-F | 5’-CGCGGATCCCTGGCACAGGAATACAAAGG-3’SEQ ID NO.15 |
| dEC95-Hind III-R | 5’-CCCAAGCTTTTA GACGGTAGATTCTTTTTTAC-3’SEQ ID NO.16 |
表6：PCR反应程序
(2)将扩增得到的基因片段2dEC95，用内切酶BamH I和内切酶Hind III消化处理，回收酶切后的基因片段，连接到用同样内切酶BamH I和内切酶Hind III处理的pETDuet-1原核表达载体，连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，涂布于含有50μg/ml氨苄青霉素的平板，37℃培养，等平板上的菌落清晰可见时，挑取单菌落于含有50μg/ml氨苄青霉素的3ml液体培养基，37℃培养，随后提取质粒。得到重组质粒pETDuet-2dEC95。
2.2.2构建pETDuet-2dEC95-2dEG95载体。
(1)以2dEG95为模板，设计上游引物dEG95-Nde I-F和下游引物dEG95-Xho I-R，PCR扩增得到基因片段2dEG95，上游引物的5’端引入限制性内切酶Nde I位点及保护性碱基，其中Nde I位点序列为CATATG；下游引物的5’端引入限制性内切酶Xho I位点，一个终止密码子及保护性碱基，其中Xho I位点序列为CTCGAG。引物序列及PCR反应程序如表7和表8所示。
表7：引物名称及序列信息
表8：PCR反应程序
(2)将扩增得到的基因片段2dEG95，用内切酶Nde I和内切酶Xho I消化处理，回收酶切后的基因片段，连接到用同样内切酶Nde I和内切酶Xho I处理的pETDuet-2dEC95，连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，涂布于含有50μg/ml氨苄青霉素的平板，37℃培养，等平板上的菌落清晰可见时，挑取单菌落于含有50μg/ml氨苄青霉素的3ml液体培养基，37℃培养，随后提取质粒。得到重组质粒pETDuet-2dEC95-2dEG95，重组质粒通过测序验证确认与目的序列一致。
2.3重组表达载体pETDuet-dEG95-dEC95的构建。
2.3.1构建pETDuet-dEG95载体
(1)以dEG95为模板，设计上游引物dEG95-BamH I-F和下游引物dEG95-Hind III-R，PCR扩增得到基因片段dEG95，上游引物的5’端引入限制性内切酶BamH I位点及保护性碱基，其中BamH I位点序列为GGATCC；下游引物的5’端引入限制性内切酶Hind III位点，一个终止密码子及保护性碱基，其中Hind III位点序列为AAGCTT。引物序列及PCR反应程序如表9和表10所示。
表9：引物名称及序列信息
表10：PCR反应程序
(2)将扩增得到的基因片段dEG95，用内切酶BamH I和内切酶Hind III消化处理，回收酶切后的基因片段，连接到用同样内切酶BamH I和内切酶Hind III处理的pETDuet-1原核表达载体，连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，涂布于含有50μg/ml氨苄青霉素的平板，37℃培养，等平板上的菌落清晰可见时，挑取单菌落于含有50μg/ml氨苄青霉素的3ml液体培养基，37℃培养，随后提取质粒。得到重组质粒pETDuet-dEG95。
2.3.2构建pETDuet-dEG95-dEC95载体。
(1)以dEC95为模板，设计上游引物dEC95-Nde I-F和下游引物dEC95-Xho I-R，PCR扩增得到基因片段dEC95，上游引物的5’端引入限制性内切酶Nde I位点及保护性碱基，其中Nde I位点序列为CATATG；下游引物的5’端引入限制性内切酶Xho I位点，一个终止密码子及保护性碱基，其中Xho I位点序列为CTCGAG。引物序列及PCR反应程序如表11和表12所示。
表11：引物名称及序列信息
表12：PCR反应程序
(2)将扩增得到的基因片段dEC95，用内切酶Nde I和内切酶Xho I消化处理，回收酶切后的基因片段，连接到用同样内切酶Nde I和内切酶Xho I处理的pETDuet-dEG95，连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，涂布于含有50μg/ml氨苄青霉素的平板，37℃培养，等平板上的菌落清晰可见时，挑取单菌落于含有50μg/ml氨苄青霉素的3ml液体培养基，37℃培养，随后提取质粒。得到重组质粒pETDuet-dEG95-dEC95，重组质粒通过测序验证确认与目的序列一致。
2.4重组表达载体pETDuet-dEC95-dEG95的构建。
2.4.1构建pETDuet-dEC95载体
(1)以dEC95为模板，设计上游引物dEC95-BamH I-F和下游引物dEC95-Hind III-R，PCR扩增得到基因片段dEC95，上游引物的5’端引入限制性内切酶BamH I位点及保护性碱基，其中BamH I位点序列为GGATCC；下游引物的5’端引入限制性内切酶Hind III位点，一个终止密码子及保护性碱基，其中Hind III位点序列为AAGCTT。引物序列及PCR反应程序如表13和表14所示。
表13：引物名称及序列信息
| 引物名称 | 序列 |
| dEC95-BamH I-F | 5’-CGCGGATCCCTGGCACAGGAATACAAAGG-3’SEQ ID NO.15 |
| dEC95-Hind III-R | 5’-CCCAAGCTTTTA GACGGTAGATTCTTTTTTAC-3’SEQ ID NO.16 |
表14：PCR反应程序
(2)将扩增得到的基因片段dEC95，用内切酶BamH I和内切酶Hind III消化处理，回收酶切后的基因片段，连接到用同样内切酶BamH I和内切酶Hind III处理的pETDuet-1原核表达载体，连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，涂布于含有50μg/ml氨苄青霉素的平板，37℃培养，等平板上的菌落清晰可见时，挑取单菌落于含有50μg/ml氨苄青霉素的3ml液体培养基，37℃培养，随后提取质粒。得到重组质粒pETDuet-dEC95。
2.4.2构建pETDuet-dEC95-dEG95载体。
(1)以dEG95为模板，设计上游引物dEG95-Nde I-F和下游引物dEG95-Xho I-R，PCR扩增得到基因片段dEG95，上游引物的5’端引入限制性内切酶Nde I位点及保护性碱基，其中Nde I位点序列为CATATG；下游引物的5’端引入限制性内切酶Xho I位点，一个终止密码子及保护性碱基，其中Xho I位点序列为CTCGAG。引物序列及PCR反应程序如表15和表16所示。
表15：引物名称及序列信息
| 引物名称 | 序列 |
| dEG95-Nde I-F | 5’-GGTCCATATGCATCACCATCATCACCACCTGGC-3’SEQ ID NO.17 |
| dEG95-Xho I-R | 5’-CCGCTCGAGTTA GACAGTAGATTCTTTTTTGC-3’SEQ ID NO.18 |
表16：PCR反应程序
(2)将扩增得到的基因片段dEG95，用内切酶Nde I和内切酶Xho I消化处理，回收酶切后的基因片段，连接到用同样内切酶Nde I和内切酶Xho I处理的pETDuet-dEC95，连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，涂布于含有50μg/ml氨苄青霉素的平板，37℃培养，等平板上的菌落清晰可见时，挑取单菌落于含有50μg/ml氨苄青霉素的3ml液体培养基，37℃培养，随后提取质粒。得到重组质粒pETDuet-dEC95-dEG95，重组质粒通过测序验证确认与目的序列一致。
2.5重组表达载体pET24a-dEG95-dEC95的构建。
(1)以dEG95-dEC95为模板，设计上游引物dEG95-Nde I-F和下游引物dEC95-XhoI-R，PCR扩增得到基因片段dEG95-dEC95，上游引物的5’端引入限制性内切酶Nde I位点及保护性碱基，其中Nde I位点序列为CATATG；下游引物的5’端引入限制性内切酶Xho I位点，一个终止密码子及保护性碱基，其中Xho I位点序列为CTCGAG。引物序列及PCR反应程序如表17和表18所示。
表17：引物名称及序列信息
表18：PCR反应程序
(2)将扩增得到的基因片段dEG95-dEC95，用内切酶Nde I和内切酶Xho I消化处理，回收酶切后的基因片段，连接到用同样内切酶Nde I和内切酶Xho I处理的pET24a原核表达载体，连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，涂布于含有100μg/ml硫酸卡那霉素的平板，37℃培养，等平板上的菌落清晰可见时，挑取单菌落于含有100μg/ml硫酸卡那霉素的3ml液体培养基，37℃培养，随后提取质粒。得到重组质粒pET24a-dEG95-dEC95，重组质粒通过测序验证确认与目的序列一致。
2.6重组表达载体pET24a-dEC95-dEG95的构建。
(1)以dEC95-dEG95为模板，设计上游引物dEC95-Nde I-F和下游引物dEG95-XhoI-R，PCR扩增得到基因片段dEC95-dEG95，上游引物的5’端引入限制性内切酶Nde I位点及保护性碱基，其中Nde I位点序列为CATATG；下游引物的5’端引入限制性内切酶Xho I位点，一个终止密码子及保护性碱基，其中Xho I位点序列为CTCGAG。引物序列及PCR反应程序如表19和表20所示。
表19：引物名称及序列信息
| 引物名称 | 序列 |
| dEC95-Nde I-F | 5’-GGTCCATATGCATCACCATCATCACCACCTG-3’SEQ ID NO.13 |
| dEG95-Xho I-R | 5’-CCGCTCGAGTTA GACAGTAGATTCTTTTTTGC-3’SEQ ID NO.18 |
表20：PCR反应程序
(2)将扩增得到的基因片段dEC95-dEG95，用内切酶Nde I和内切酶Xho I消化处理，回收酶切后的基因片段，连接到用同样内切酶Nde I和内切酶Xho I处理的pET24a原核表达载体，连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，涂布于含有100μg/ml硫酸卡那霉素的平板，37℃培养，等平板上的菌落清晰可见时，挑取单菌落于含有100μg/ml硫酸卡那霉素的3ml液体培养基，37℃培养，随后提取质粒。得到重组质粒pET24a-dEC95-dEG95，重组质粒通过测序验证确认与目的序列一致。
2.7重组表达载体pET24a-aEG95-aEC95的构建。
(1)以aEG95-aEC95为模板，设计上游引物aEG95-Nde I-F和下游引物aEC95-XhoI-R，PCR扩增得到基因片段aEG95-aEC95，上游引物的5’端引入限制性内切酶Nde I位点及保护性碱基，其中Nde I位点序列为CATATG；下游引物的5’端引入限制性内切酶Xho I位点，一个终止密码子及保护性碱基，其中Xho I位点序列为CTCGAG。引物序列及PCR反应程序如表21和表22所示。
表21：引物名称及序列信息
表22：PCR反应程序
(2)将扩增得到的基因片段aEG95-aEC95，用内切酶Nde I和内切酶Xho I消化处理，回收酶切后的基因片段，连接到用同样内切酶Nde I和内切酶Xho I处理的pET24a原核表达载体，连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，涂布于含有100μg/ml硫酸卡那霉素的平板，37℃培养，等平板上的菌落清晰可见时，挑取单菌落于含有100μg/ml硫酸卡那霉素的3ml液体培养基，37℃培养，随后提取质粒。得到重组质粒pET24a-aEG95-aEC95，重组质粒通过测序验证确认与目的序列一致。
2.8重组表达载体pET24a-aEC95-aEG95的构建。
(1)以aEC95-aEG95为模板，设计上游引物aEC95-Nde I-F和下游引物aEG95-XhoI-R，PCR扩增得到基因片段aEC95-aEG95，上游引物的5’端引入限制性内切酶Nde I位点及保护性碱基，其中Nde I位点序列为CATATG；下游引物的5’端引入限制性内切酶Xho I位点，一个终止密码子及保护性碱基，其中Xho I位点序列为CTCGAG。引物序列及PCR反应程序如表23和表24所示。
表23：引物名称及序列信息
表24：PCR反应程序
(2)将扩增得到的基因片段aEC95-aEG95，用内切酶Nde I和内切酶Xho I消化处理，回收酶切后的基因片段，连接到用同样内切酶Nde I和内切酶Xho I处理的pET24a原核表达载体，连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，涂布于含有100μg/ml硫酸卡那霉素的平板，37℃培养，等平板上的菌落清晰可见时，挑取单菌落于含有100μg/ml硫酸卡那霉素的3ml液体培养基，37℃培养，随后提取质粒。得到重组质粒pET24a-aEC95-aEG95，重组质粒通过测序验证确认与目的序列一致。
实施例3、重组菌的构建。
将上述的pETDuet-dEG95-dEC95、pETDuet-dEC95-dEG95、pET24a-dEG95-dEC95、pET24a-dEC95-dEG95、pETDuet-2dEG95-2dEC95、pETDuet-2dEC95-2dEG95、pET24a-aEG95-aEC95、pET24a-aEC95-aEG95分别转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，涂布于含有相应抗生素(50μg/ml氨苄青霉素或者100μg/ml硫酸卡那霉素)的LB培养基平板，37℃培养，等平板上的菌落清晰可见时，挑取单菌落于含有相应抗生素(50μg/ml氨苄青霉素或者100μg/ml硫酸卡那霉素)的3ml液体培养基，37℃培养，从中取1ml菌液加入终浓度为8％的甘油，-80℃冷冻保存，分别得到重组工程菌Duet-dEG95-dEC95、Duet-dEC95-dEG95、24a-dEG95-dEC95、24a-dEC95-dEG95、Duet-2dEG95-2dEC95、Duet-2dEC95-2dEG95、24a-aEG95-aEC95、24a-aEC95-aEG95，作为后续试验的种子。
实施例4、重组菌的表达验证。
4.1从-80℃中取出重组菌菌种，融化后，接种到含有相应抗生素(50μg/ml氨苄青霉素或者100μg/ml硫酸卡那霉素)的40ml液体LB培养基中，37℃培养，等OD600值到0.6时，加入终浓度为0.4mM的IPTG，20℃诱导表达12～14h。
4.2用一个预先称重的离心管10000g离心20分钟，弃上清，收集细胞。重悬沉淀于4ml冰冷的20mM Tris-HCl pH 7.5中，得到10倍的浓缩系数(40ml培养液到4ml缓冲液)。
4.3超声波处理。采用功率15％，工作2s，暂停2s，总时间15min，在冰上超声。
4.4整个裂解液14000g离心10分钟以分离可溶和不溶组分。
4.5SDS-PAGE电泳分析目的蛋白在可溶和不溶组分的分布情况，如图1所示。
4.6结果分析表明，Duet-dEG95-dEC95、Duet-dEC95-dEG95、24a-dEG95-dEC95、24a-dEC95-dEG95、Duet-2dEG95-2dEC95、Duet-2dEC95-2dEG95重组蛋白以部分可溶形式，部分包涵体形式表达；24a-aEG95-aEC95、24a-aEC95-aEG95大部分以包涵体形式表达。
实施例5、重组菌的发酵。
将菌株接种到500mL含相应抗生素(50μg/ml氨苄青霉素或者100μg/ml硫酸卡那霉素)LB培养基中，在37℃条件下震荡培养至OD600值为1.2～1.5左右时，按照10％的接种量，将种子液接种至5L发酵罐中进行发酵培养，当菌体OD600值达到20～25左右时，降低培养温度至28℃，同时添加IPTG至终浓度为0.4mM，诱导12～14h。离心收集菌体湿重约500g。
按照每克湿菌体加10毫升重悬缓冲液(20mM Tris-HCl pH 7.5，500mM NaCl)重悬菌体。
实施例6、重组蛋白的纯化。
6.1利用均质机对重悬菌液进行破碎，压力700bar，破碎4次。
6.2裂解液28000g离心40分钟，取上清。
6.3采用亲和层析的方式进行纯化，蛋白层析设备为AKTA pure 150m蛋白纯化仪，填料为Ni Sepharose 6FF，平衡液为20mM Tris-HCl pH 7.5，500mM NaCl，洗杂液为30mM咪唑，洗脱液为500mM咪唑。
6.4SDS-PAGE电泳分析蛋白纯化情况，如图2所示，结果表明目的蛋白完全与层析柱结合，并被洗脱液洗脱。一步纯化得到目的蛋白。
6.5运用灰度分析法，计算得到每升培养基纯化得重组蛋白量Duet-dEG95-dEC95、Duet-dEC95-dEG95、24a-dEG95-dEC95、24a-dEC95-dEG95、Duet-2dEG95-2dEC95、Duet-2dEC95-2dEG95、24a-dEG95-dEC95和24a-dEC95-dEG95依次为：83mg、57mg、750mg、541mg、673mg、607mg、45mg和38mg。其中24a-dEG95-dEC95纯化蛋白量最高。
实施例7、重组蛋白的免疫原性分析。
7.1免疫样品制备。将纯化得到的重组蛋白用PBS稀释至100μg/ml，与灭菌的Montanide ISA 50V佐剂按照体积比1:1进行乳化，制得免疫所需样品。
7.2兔子免疫实验。利用制备的样品每组免疫两只新西兰兔，免疫与采血流程包括：1)免疫前采血约5ml；2)第1天第一次免疫：每只兔子免疫1ml；3)第二次免疫前采血，制备血清留样；4)第15天第二次免疫：每只兔子免疫1ml；5)第三次免疫前采血，制备血清留样；6)第29天第三次免疫：每只兔子免疫0.5ml；7)第35天采血5-30ml，ELISA检测；8)第38天实验动物放血处理。
7.3抗体效价检测。采用ELISA法检测免疫血清的抗体效价，结果如表25所示，24a-dEG95-dEC95抗体效价明显高于其他组别。
表25：酶联免疫吸附剂测定法检测抗体效价结果
实施例8：抗血清的交叉保护效果评价。
据报道细粒棘球绦虫G1型和加拿大棘球蚴绦虫G6型不存在交叉保护效果，本发明设计了竞争ELISA的实验，为了便于纯化，包被抗原带有MBP标签，免疫用抗原带有6×HIS标签。
8.1将抗原MBP-2dEG95做为包被抗原，抗6×HIS-2dEG95血清分别与以下抗原孵育6×HIS-dEG95-dEC95、6×HIS-2dEG95、6×HIS-2dEC95。结果如图3，表明二价抗原6×HIS-dEG95-dEC95能够完全阻断抗6×HIS-2dEG95血清与MBP-2dEG95抗原的结合，进一步佐证抗原6×HIS-dEG95-dEC95保留了6×HIS-2dEG95的完整抗原性。
8.2将抗原MBP-2dEC95做为包被抗原，抗6×HIS-2dEC95血清分别与以下抗原孵育6×HIS-dEG95-dEC95、6×HIS-2dEC95、6×HIS-2dEG95。结果如图4，表明二价抗原6×HIS-dEG95-dEC95能够完全阻断抗6×HIS-2dEC95血清与MBP-2dEC95抗原的结合，进一步佐证抗原6×HIS-dEG95-dEC95保留了6×HIS-2dEC95的完整抗原性。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
序列表
<110> 申联生物医药（上海）股份有限公司
<120> 细粒棘球蚴及加拿大棘球蚴EG95/EC95蛋白组合的制备及应用
<130> DD15186
<160> 24
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 471
<212> DNA
<213> 细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus)
<400> 1
atggcattcc agttatgtct cattttgttt gcgacttcag ttttggctca ggaatacaaa 60
ggaatgggcg tagagacaag gacaacagag actccgctcc gtaaacactt caatttgact 120
cctgtgggtt ctcagggcat tcgcttaagt tgggaagtcc aacacttgtc tgacctcaaa 180
ggaacagata tttctctaaa agcggtgaat ccttctgacc cgttagtcta caaaagacaa 240
actgcaaaat tctcagatgg acaactcact atcggcgaac tgaagccctc cacattatac 300
aaaatgactg tggaagcagt gaaagcgaaa aagaccattt tgggattcac cgtagacatt 360
gagacaccgc gcgctggcaa gaaggaaagc actgtaatga ctagtggatc cgccttaaca 420
tccgcaatcg ctggttttgt attcagctgc atagtggttg tccttacttg a 471
<210> 2
<211> 156
<212> PRT
<213> 细粒棘球绦虫Echinococcus granulosus)
<400> 2
Met Ala Phe Gln Leu Cys Leu Ile Leu Phe Ala Thr Ser Val Leu Ala
1 5 10 15
Gln Glu Tyr Lys Gly Met Gly Val Glu Thr Arg Thr Thr Glu Thr Pro
20 25 30
Leu Arg Lys His Phe Asn Leu Thr Pro Val Gly Ser Gln Gly Ile Arg
35 40 45
Leu Ser Trp Glu Val Gln His Leu Ser Asp Leu Lys Gly Thr Asp Ile
50 55 60
Ser Leu Lys Ala Val Asn Pro Ser Asp Pro Leu Val Tyr Lys Arg Gln
65 70 75 80
Thr Ala Lys Phe Ser Asp Gly Gln Leu Thr Ile Gly Glu Leu Lys Pro
85 90 95
Ser Thr Leu Tyr Lys Met Thr Val Glu Ala Val Lys Ala Lys Lys Thr
100 105 110
Ile Leu Gly Phe Thr Val Asp Ile Glu Thr Pro Arg Ala Gly Lys Lys
115 120 125
Glu Ser Thr Val Met Thr Ser Gly Ser Ala Leu Thr Ser Ala Ile Ala
130 135 140
Gly Phe Val Phe Ser Cys Ile Val Val Val Leu Thr
145 150 155
<210> 3
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Leu Ala Gln Glu Tyr Lys Gly Met Gly Val Glu Thr Arg Thr Thr Glu
1 5 10 15
Thr Pro Leu Arg Lys His Phe Asn Leu Thr Pro Val Gly Ser Gln Gly
20 25 30
Ile Arg Leu Ser Trp Glu Val Gln His Leu Ser Asp Leu Lys Gly Thr
35 40 45
Asp Ile Ser Leu Lys Ala Val Asn Pro Ser Asp Pro Leu Val Tyr Lys
50 55 60
Arg Gln Thr Ala Lys Phe Ser Asp Gly Gln Leu Thr Ile Gly Glu Leu
65 70 75 80
Lys Pro Ser Thr Leu Tyr Lys Met Thr Val Glu Ala Val Lys Ala Lys
85 90 95
Lys Thr Ile Leu Gly Phe Thr Val Asp Ile Glu Thr Pro Arg Ala Gly
100 105 110
Lys Lys Glu Ser Thr Val
115
<210> 4
<211> 471
<212> DNA
<213> 加拿大棘球绦虫(Echinococcus. canadensis)
<400> 4
atggcattcc agttatgtct cattttgttt gcgacttcag ttttggctca ggaatacaaa 60
ggaatgggca tagagacaag gacaacagag actccgctcc gcaaacactt caatttgact 120
cttgtgggtt ctcagggcat tcgcttaagt tgggatgtcc aacacttgtc tgacctcaaa 180
ggaacaaata tttctctaaa agcggtgaat ccttccgacc cgttagtcta caaaagacaa 240
actgcaaaat tctcagatgg acaactcact attggtgaac tgaagccctc cacattatac 300
aaaatgactg tggaagcagt gaaagcgaaa aagaccattt tggaattcac cgtagacatt 360
gagacaccgc ccgctggcaa gaaggaaagc actgtaatga ctagtggatc cgccttaaca 420
tccacaatcg ctggtttcgt attcagctgc atagtggttg tccttacttg a 471
<210> 5
<211> 156
<212> PRT
<213>加拿大棘球绦虫(Echinococcus. canadensis)
<400> 5
Met Ala Phe Gln Leu Cys Leu Ile Leu Phe Ala Thr Ser Val Leu Ala
1 5 10 15
Gln Glu Tyr Lys Gly Met Gly Ile Glu Thr Arg Thr Thr Glu Thr Pro
20 25 30
Leu Arg Lys His Phe Asn Leu Thr Leu Val Gly Ser Gln Gly Ile Arg
35 40 45
Leu Ser Trp Asp Val Gln His Leu Ser Asp Leu Lys Gly Thr Asn Ile
50 55 60
Ser Leu Lys Ala Val Asn Pro Ser Asp Pro Leu Val Tyr Lys Arg Gln
65 70 75 80
Thr Ala Lys Phe Ser Asp Gly Gln Leu Thr Ile Gly Glu Leu Lys Pro
85 90 95
Ser Thr Leu Tyr Lys Met Thr Val Glu Ala Val Lys Ala Lys Lys Thr
100 105 110
Ile Leu Glu Phe Thr Val Asp Ile Glu Thr Pro Pro Ala Gly Lys Lys
115 120 125
Glu Ser Thr Val Met Thr Ser Gly Ser Ala Leu Thr Ser Thr Ile Ala
130 135 140
Gly Phe Val Phe Ser Cys Ile Val Val Val Leu Thr
145 150 155
<210> 6
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Leu Ala Gln Glu Tyr Lys Gly Met Gly Ile Glu Thr Arg Thr Thr Glu
1 5 10 15
Thr Pro Leu Arg Lys His Phe Asn Leu Thr Leu Val Gly Ser Gln Gly
20 25 30
Ile Arg Leu Ser Trp Asp Val Gln His Leu Ser Asp Leu Lys Gly Thr
35 40 45
Asn Ile Ser Leu Lys Ala Val Asn Pro Ser Asp Pro Leu Val Tyr Lys
50 55 60
Arg Gln Thr Ala Lys Phe Ser Asp Gly Gln Leu Thr Ile Gly Glu Leu
65 70 75 80
Lys Pro Ser Thr Leu Tyr Lys Met Thr Val Glu Ala Val Lys Ala Lys
85 90 95
Lys Thr Ile Leu Glu Phe Thr Val Asp Ile Glu Thr Pro Pro Ala Gly
100 105 110
Lys Lys Glu Ser Thr Val
115
<210> 7
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Leu Ala Gln Glu Tyr Lys Gly Met Gly Val Glu Thr Arg Thr Thr Glu
1 5 10 15
Thr Pro Leu Arg Lys His Phe Asn Leu Thr Pro Val Gly Ser Gln Gly
20 25 30
Ile Arg Leu Ser Trp Glu Val Gln His Leu Ser Asp Leu Lys Gly Thr
35 40 45
Asp Ile Ser Leu Lys Ala Val Asn Pro Ser Asp Pro Leu Val Tyr Lys
50 55 60
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65 70 75 80
Lys Pro Ser Thr Leu Tyr Lys Met Thr Val Glu Ala Val Lys Ala Lys
85 90 95
Lys Thr Ile Leu Gly Phe Thr Val Asp Ile Glu Thr Pro Arg Ala Gly
100 105 110
Lys Lys Glu Ser Thr Val Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Leu Ala
115 120 125
Gln Glu Tyr Lys Gly Met Gly Val Glu Thr Arg Thr Thr Glu Thr Pro
130 135 140
Leu Arg Lys His Phe Asn Leu Thr Pro Val Gly Ser Gln Gly Ile Arg
145 150 155 160
Leu Ser Trp Glu Val Gln His Leu Ser Asp Leu Lys Gly Thr Asp Ile
165 170 175
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180 185 190
Thr Ala Lys Phe Ser Asp Gly Gln Leu Thr Ile Gly Glu Leu Lys Pro
195 200 205
Ser Thr Leu Tyr Lys Met Thr Val Glu Ala Val Lys Ala Lys Lys Thr
210 215 220
Ile Leu Gly Phe Thr Val Asp Ile Glu Thr Pro Arg Ala Gly Lys Lys
225 230 235 240
Glu Ser Thr Val
<210> 8
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Leu Ala Gln Glu Tyr Lys Gly Met Gly Ile Glu Thr Arg Thr Thr Glu
1 5 10 15
Thr Pro Leu Arg Lys His Phe Asn Leu Thr Leu Val Gly Ser Gln Gly
20 25 30
Ile Arg Leu Ser Trp Asp Val Gln His Leu Ser Asp Leu Lys Gly Thr
35 40 45
Asn Ile Ser Leu Lys Ala Val Asn Pro Ser Asp Pro Leu Val Tyr Lys
50 55 60
Arg Gln Thr Ala Lys Phe Ser Asp Gly Gln Leu Thr Ile Gly Glu Leu
65 70 75 80
Lys Pro Ser Thr Leu Tyr Lys Met Thr Val Glu Ala Val Lys Ala Lys
85 90 95
Lys Thr Ile Leu Glu Phe Thr Val Asp Ile Glu Thr Pro Pro Ala Gly
100 105 110
Lys Lys Glu Ser Thr Val Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Leu Ala
115 120 125
Gln Glu Tyr Lys Gly Met Gly Ile Glu Thr Arg Thr Thr Glu Thr Pro
130 135 140
Leu Arg Lys His Phe Asn Leu Thr Leu Val Gly Ser Gln Gly Ile Arg
145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
Thr Ala Lys Phe Ser Asp Gly Gln Leu Thr Ile Gly Glu Leu Lys Pro
195 200 205
Ser Thr Leu Tyr Lys Met Thr Val Glu Ala Val Lys Ala Lys Lys Thr
210 215 220
Ile Leu Glu Phe Thr Val Asp Ile Glu Thr Pro Pro Ala Gly Lys Lys
225 230 235 240
Glu Ser Thr Val
<210> 9
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Leu Ala Gln Glu Tyr Lys Gly Met Gly Val Glu Thr Arg Thr Thr Glu
1 5 10 15
Thr Pro Leu Arg Lys His Phe Asn Leu Thr Pro Val Gly Ser Gln Gly
20 25 30
Ile Arg Leu Ser Trp Glu Val Gln His Leu Ser Asp Leu Lys Gly Thr
35 40 45
Asp Ile Ser Leu Lys Ala Val Asn Pro Ser Asp Pro Leu Val Tyr Lys
50 55 60
Arg Gln Thr Ala Lys Phe Ser Asp Gly Gln Leu Thr Ile Gly Glu Leu
65 70 75 80
Lys Pro Ser Thr Leu Tyr Lys Met Thr Val Glu Ala Val Lys Ala Lys
85 90 95
Lys Thr Ile Leu Gly Phe Thr Val Asp Ile Glu Thr Pro Arg Ala Gly
100 105 110
Lys Lys Glu Ser Thr Val Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Leu Ala
115 120 125
Gln Glu Tyr Lys Gly Met Gly Ile Glu Thr Arg Thr Thr Glu Thr Pro
130 135 140
Leu Arg Lys His Phe Asn Leu Thr Leu Val Gly Ser Gln Gly Ile Arg
145 150 155 160
Leu Ser Trp Asp Val Gln His Leu Ser Asp Leu Lys Gly Thr Asn Ile
165 170 175
Ser Leu Lys Ala Val Asn Pro Ser Asp Pro Leu Val Tyr Lys Arg Gln
180 185 190
Thr Ala Lys Phe Ser Asp Gly Gln Leu Thr Ile Gly Glu Leu Lys Pro
195 200 205
Ser Thr Leu Tyr Lys Met Thr Val Glu Ala Val Lys Ala Lys Lys Thr
210 215 220
Ile Leu Glu Phe Thr Val Asp Ile Glu Thr Pro Pro Ala Gly Lys Lys
225 230 235 240
Glu Ser Thr Val
<210> 10
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Leu Ala Gln Glu Tyr Lys Gly Met Gly Ile Glu Thr Arg Thr Thr Glu
1 5 10 15
Thr Pro Leu Arg Lys His Phe Asn Leu Thr Leu Val Gly Ser Gln Gly
20 25 30
Ile Arg Leu Ser Trp Asp Val Gln His Leu Ser Asp Leu Lys Gly Thr
35 40 45
Asn Ile Ser Leu Lys Ala Val Asn Pro Ser Asp Pro Leu Val Tyr Lys
50 55 60
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65 70 75 80
Lys Pro Ser Thr Leu Tyr Lys Met Thr Val Glu Ala Val Lys Ala Lys
85 90 95
Lys Thr Ile Leu Glu Phe Thr Val Asp Ile Glu Thr Pro Pro Ala Gly
100 105 110
Lys Lys Glu Ser Thr Val Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Leu Ala
115 120 125
Gln Glu Tyr Lys Gly Met Gly Val Glu Thr Arg Thr Thr Glu Thr Pro
130 135 140
Leu Arg Lys His Phe Asn Leu Thr Pro Val Gly Ser Gln Gly Ile Arg
145 150 155 160
Leu Ser Trp Glu Val Gln His Leu Ser Asp Leu Lys Gly Thr Asp Ile
165 170 175
Ser Leu Lys Ala Val Asn Pro Ser Asp Pro Leu Val Tyr Lys Arg Gln
180 185 190
Thr Ala Lys Phe Ser Asp Gly Gln Leu Thr Ile Gly Glu Leu Lys Pro
195 200 205
Ser Thr Leu Tyr Lys Met Thr Val Glu Ala Val Lys Ala Lys Lys Thr
210 215 220
Ile Leu Gly Phe Thr Val Asp Ile Glu Thr Pro Arg Ala Gly Lys Lys
225 230 235 240
Glu Ser Thr Val
<210> 11
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cgcggatccc tggcgcaaga atacaaagg 29
<210> 12
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cccaagcttt tagacagtag attctttttt gcctg 35
<210> 13
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ggtccatatg catcaccatc atcaccacct g 31
<210> 14
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ccgctcgagt tagacggtag attctttttt accagc 36
<210> 15
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
cgcggatccc tggcacagga atacaaagg 29
<210> 16
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
cccaagcttt tagacggtag attctttttt ac 32
<210> 17
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ggtccatatg catcaccatc atcaccacct ggc 33
<210> 18
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ccgctcgagt tagacagtag attctttttt gc 32
<210> 19
<211> 148
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
Leu Phe Ala Thr Ser Val Leu Ala Gln Glu Tyr Lys Gly Met Gly Val
1 5 10 15
Glu Thr Arg Thr Thr Glu Thr Pro Leu Arg Lys His Phe Asn Leu Thr
20 25 30
Pro Val Gly Ser Gln Gly Ile Arg Leu Ser Trp Glu Val Gln His Leu
35 40 45
Ser Asp Leu Lys Gly Thr Asp Ile Ser Leu Lys Ala Val Asn Pro Ser
50 55 60
Asp Pro Leu Val Tyr Lys Arg Gln Thr Ala Lys Phe Ser Asp Gly Gln
65 70 75 80
Leu Thr Ile Gly Glu Leu Lys Pro Ser Thr Leu Tyr Lys Met Thr Val
85 90 95
Glu Ala Val Lys Ala Lys Lys Thr Ile Leu Gly Phe Thr Val Asp Ile
100 105 110
Glu Thr Pro Arg Ala Gly Lys Lys Glu Ser Thr Val Met Thr Ser Gly
115 120 125
Ser Ala Leu Thr Ser Ala Ile Ala Gly Phe Val Phe Ser Cys Ile Val
130 135 140
Val Val Leu Thr
145
<210> 20
<211> 148
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
Leu Phe Ala Thr Ser Val Leu Ala Gln Glu Tyr Lys Gly Met Gly Ile
1 5 10 15
Glu Thr Arg Thr Thr Glu Thr Pro Leu Arg Lys His Phe Asn Leu Thr
20 25 30
Leu Val Gly Ser Gln Gly Ile Arg Leu Ser Trp Asp Val Gln His Leu
35 40 45
Ser Asp Leu Lys Gly Thr Asn Ile Ser Leu Lys Ala Val Asn Pro Ser
50 55 60
Asp Pro Leu Val Tyr Lys Arg Gln Thr Ala Lys Phe Ser Asp Gly Gln
65 70 75 80
Leu Thr Ile Gly Glu Leu Lys Pro Ser Thr Leu Tyr Lys Met Thr Val
85 90 95
Glu Ala Val Lys Ala Lys Lys Thr Ile Leu Glu Phe Thr Val Asp Ile
100 105 110
Glu Thr Pro Pro Ala Gly Lys Lys Glu Ser Thr Val Met Thr Ser Gly
115 120 125
Ser Ala Leu Thr Ser Thr Ile Ala Gly Phe Val Phe Ser Cys Ile Val
130 135 140
Val Val Leu Thr
145
<210> 21
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
ggtccatatg catcaccatc atcaccacct gtt 33
<210> 22
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
ccgctcgagt taagtcagaa ctacaacgat gc 32
<210> 23
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
ggtccatatg catcaccatc atcaccacct g 31
<210> 24
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
ccgctcgagt taggtcagaa caacaacgat gc 32
Claims (10)
1.一种重组蛋白组合，其特征在于，所述重组蛋白组合包括dEG95氨基酸序列和dEC95氨基酸序列；
所述dEG95氨基酸序列为狭义细粒棘球绦虫的EG95删去N端的信号肽区域及C端的跨膜区，得到的修饰后的氨基酸序列；所述EG95基因序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQID NO.2所示；
所述dEC95氨基酸序列为加拿大棘球绦虫的EC95删去N端的信号肽区域及C端的跨膜区，得到的修饰后的氨基酸序列；所述EC95基因序列如SEQ ID NO.4所示，氨基酸序列如SEQID NO.5所示。
2.如权利要求1所述的重组蛋白组合，其特征在于，dEG95氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；dEC95氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
3.一种如权利要求1所述的重组蛋白组合的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
S1、将dEG95和dEC95的编码基因克隆到原核表达载体，获得重组表达质粒；
S2、以重组表达质粒转染原核表达菌株，筛选单克隆，发酵培养，诱导表达得到所述重组蛋白。
4.根据权利要求3所述的重组蛋白组合的制备方法，其特征在于，步骤S1具体包括如下步骤：
A1、分别基因合成密码子优化的适合大肠杆菌表达的dEG95、dEC95基因序列；dEG95氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，dEC95氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；
或，两个dEG95氨基酸序列、两个dEC95氨基酸序列分别通过linker进行连接，形成2dEG95氨基酸序列、2dEC95氨基酸序列；分别基因合成密码子优化的适合大肠杆菌表达的2dEG95、2dEC95基因序列；
或，dEG95氨基酸序列及dEC95氨基酸序列通过linker进行连接，形成dEG95-dEC95氨基酸序列或dEC95-dEG95氨基酸序列；分别基因合成密码子优化的适合大肠杆菌表达的dEG95-dEC95或dEC95-dEG95基因序列；
A2、将dEG95及dEC95基因分别按不同顺序依次克隆到pETDuetTM-1质粒载体中，构建得到pETDuet-dEG95-dEC95或pETDuet-dEC95-dEG95质粒；
或，将2dEG95及2dEC95基因分别按不同顺序依次克隆到pETDuetTM-1质粒载体中，构建得到pETDuet-2dEG95-2dEC95或pETDuet-2dEC95-2dEG95质粒；
或，将dEG95-dEC95或dEC95-dEG95基因克隆到pET24a质粒载体中，构建得到pET24a-dEG95-dEC95或pET24a-dEC95-dEG95质粒。
5.根据权利要求4所述的重组蛋白组合的制备方法，其特征在于，步骤S2中，将pETDuet-dEG95-dEC95、pETDuet-dEC95-dEG95、pET24a-dEG95-dEC95、pET24a-dEC95-dEG95、pETDuet-2dEG95-2dEC95或pETDuet-2dEC95-2dEG95重组表达质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)。
6.如权利要求4所述的重组蛋白组合的制备方法，其特征在于，2dEG95氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；2dEC95氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示；dEG95-dEC95氨基酸序列如SEQID NO.9所示；dEC95-dEG95氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。
7.一种包含如权利要求1所述重组蛋白组合的编码基因的重组表达质粒。
8.根据权利要求7所述的重组表达质粒，其特征在于，所述重组表达质粒为pETDuet-dEG95-dEC95、pETDuet-dEC95-dEG95、pET24a-dEG95-dEC95、pET24a-dEC95-dEG95、pETDuet-2dEG95-2dEC95或pETDuet-2dEC95-2dEG95。
9.一种重组大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述工程菌为如权利要求8所述的重组表达质粒转化E.coli而得。
10.一种重组大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述工程菌为大肠杆菌Escherichiacoli24a-dEG95-dEC95，保藏编号为CCTCC NO：M2021750。
Priority Applications (1)
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