CN115746117A

CN115746117A - 加拿大棘球蚴ec95蛋白的制备及应用

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Publication number: CN115746117A
Application number: CN202111033020.5A
Authority: CN
Inventors: 张震; 仲从浩; 聂东升; 王江辉; 杜祥月
Original assignee: Shanghai Shen Lian Biomedical Corp
Current assignee: Shanghai Shen Lian Biomedical Corp
Priority date: 2021-09-03
Filing date: 2021-09-03
Publication date: 2023-03-07

Abstract

本发明公开了一种加拿大棘球蚴EC95蛋白的制备及应用；所述重组蛋白包括dEC95氨基酸序列；所述dEC95氨基酸序列为加拿大棘球绦虫的EC95删去N端的信号肽区域及C端的跨膜区，得到的修饰后的氨基酸序列；所述EC95基因序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明针对加拿大棘球蚴中的EC95进行修饰，并制备重组表达质粒、重组大肠杆菌工程菌；用这种重组大肠杆菌工程菌表达的融合蛋白具有纯度高、可溶性好、纯化方便、生物学活性高等优点。

Description

加拿大棘球蚴EC95蛋白的制备及应用

技术领域

本发明涉及加拿大棘球蚴EC95蛋白的制备及应用；具体涉及加拿大棘球蚴EC95蛋白序列的修饰方法，以及用这种经过修饰后蛋白序列制备重组表达质粒、重组大肠杆菌工程菌，以及大肠杆菌工程菌诱导表达方法。

背景技术

棘球蚴病(Echinococcosis)，是由棘球蚴属绦虫的幼虫——棘球蚴(hydatidcyst)寄生于人和动物的肺、肝等组织器官而引起的一种严重的人兽共患寄生虫病。棘球蚴病流行广，呈世界性分布，世界动物卫生组织(World Organization for Animal Health；法语：Office international des épizooties，OIE)将棘球蚴病归为全球通报的传染病，归属为多种动物共患病；世界卫生组织(World Health Organization，WHO)将棘球蚴病列为全球早期预警系统优先预测和应急处置的疾病之一。棘球蚴病也是中国卫生部规划防治的五大寄生虫病之一。

根据病灶的形态及感染病原的差异，棘球蚴病主要分为细粒棘球蚴病(cysticechinococcosis,CE)和多房棘球蚴病两种，其中细粒棘球蚴病分布最广，患者人数最多。CE的致病原目前由几个棘球绦虫复合种构成：狭义细粒棘球绦虫(EchinococcusgranuLosus)、加拿大棘球绦虫(Echinococcus.canadensis)、马棘球绦虫、奥氏棘球绦虫，其中由狭义细粒棘球绦虫G1型引起的CE超过90％，而由加拿大棘球蚴绦虫G6型引起的CE超过7％。

目前研究表明控制棘球蚴病的流行主要是通过切断棘球绦虫发育环节，控制人、畜等中间宿主对棘球蚴的感染，预防或驱虫治疗犬类等终宿主，阻断虫卵的大范围播散。其中对于中间宿主接种疫苗可以有效控制细粒棘球蚴病的流行。Lightowlers等发现EG95是存在于Eg中的天然六钩蚴抗原之一，并且是筛选的众多蛋白中最有效的保护性抗原，已有成功研制抗羊细粒棘球蚴病的疫苗。然而现有重组EG95蛋白疫苗是由大肠杆菌包涵体复性制备，纯度低且难以维持蛋白的空间结构，而且与加拿大棘球蚴绦虫G6型无明显交叉保护性，因此有一定的局限性。

发明内容

鉴于上述现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种加拿大棘球蚴EC95蛋白的制备及应用；具体是针对加拿大棘球蚴中的EC95进行修饰，并制备重组表达质粒、重组大肠杆菌工程菌，以及用这种重组大肠杆菌工程菌表达的融合蛋白具有纯度高、可溶性好、纯化方便、生物学活性高等优点。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

第一方面，本发明涉及一种加拿大棘球蚴EC95重组蛋白，所述重组蛋白包括dEC95氨基酸序列；

所述dEC95氨基酸序列为加拿大棘球绦虫的EC95经过氨基酸序列修饰，删去N端的信号肽区域及C端的跨膜区，得到的修饰后的氨基酸序列；所述EC95基因序列如SEQ IDNO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

作为本发明的一个实施方案，将EC95氨基酸序列的N-端截短13、14、15或16个氨基酸；C-端截短20、22、24或26个氨基酸。

作为本发明的一个实施方案，将EC95氨基酸序列的N-端截短14个氨基酸，C-端截短24个氨基酸。修饰后的EC95氨基酸序列，即dEC95氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

第二方面，本发明涉及一种加拿大棘球蚴EC95重组蛋白的制备方法，所述方法包括如下步骤：

S1、将dEC95的编码基因克隆到原核表达载体，获得重组表达质粒；

S2、以重组表达质粒转染原核表达菌株，筛选单克隆，发酵培养，诱导表达得到所述重组蛋白。

作为本发明的一个实施方案，步骤S1具体包括如下步骤：

A1、基因合成密码子优化的适合大肠杆菌表达的dEC95基因序列；dEC95氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；

或，两个dEC95氨基酸序列通过linker进行连接，形成2dEC95氨基酸序列；基因合成密码子优化的适合大肠杆菌表达的2dEC95基因序列；

本发明的重组蛋白组合是本发明首创；且由于EC95的蛋白结构均没有被解析，因此对其功能研究比较困难。不同的截短会造成二聚体中两个单体之间的配合问题，很容易造成异源二聚体错误折叠或者失去活性。本发明通过分子模拟、分子动力学等方法预测了空间结构，因此做出了正确的截短选择，使蛋白可溶性表达，并且维持了稳定的空间结构和构象。

A2、将dEC95或2dEC95基因克隆到pET24a质粒载体中，构建得到pET24a-dEC95或pET24a-2dEC95质粒。

作为本发明的一个实施方案，所述步骤A2中将修饰后的2个EC95氨基酸序列通过富含甘氨酸和丝氨酸的linker连接。优选地，将修饰后的2个EC95氨基酸序列通过GGGSGGGS连接，2dEC95氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

作为本发明的一个实施方案，步骤S2中，pET24a-dEC95、pET24a-2dEC95分别转化到大肠杆菌中。筛选单克隆后将对应的大肠杆菌分别命名为24a-dEC95、24a-2dEC95。

进一步的，所述大肠杆菌来源于市场上可得到的，在此举例但不限于：BL21(DE3)，B834(DE3)，BLR(DE3)，JM109，XL1Blue，ER2566，Rosetta，GI698。优选BL21(DE3)。

作为本发明的一个实施方案，步骤S2具体包括如下步骤：

B1、pET24a-dEC95、pET24a-2dEC95分别转化到大肠杆菌中，筛选单克隆后得到大肠杆菌24a-dEC95、24a-2dEC95；

B2、分别将24a-dEC95、24a-2dEC95菌株接种到500mL含硫酸卡那霉素的LB培养基中，在37℃条件下震荡培养至至OD值为1.2～1.5时，将种子液接种至发酵罐中进行发酵，当菌体OD值达到20～25时，添加IPTG至终浓度为0.4mM，诱导12～14h。诱导表达并纯化得到重组蛋白。

进一步的，所述步骤B2中，用色谱层析进行蛋白纯化，包括但不限于：离子交换色谱(例如阳离子交换色谱)、疏水相互作用色谱、吸附层析法(例如羟基磷灰石色谱)、凝胶过滤(凝胶排阻)层析法、亲和层析法、分子筛层析法。优选亲和层析法。

第三方面，本发明涉及一种包含所述重组蛋白组合的编码基因的重组表达质粒。

作为本发明的一个实施方案，所述重组表达质粒为pET24a-dEC95或pET24a-2dEC95质粒。

上述重组表达质粒中，pET24a-dEC95质粒是以dEC95为模板，通过上游引物Nde I-F和下游引物Xho I-R，PCR扩增得到基因片段dEC95；连接到pET24a原核表达载体，连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，提取质粒，经测序验证而得。

pET24a-2dEC95质粒是以2dEC95为模板，通过上游引物Nde I-F和下游引物Xho I-R，PCR扩增得到基因片段2dEC95；连接到pET24a原核表达载体，连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，提取质粒，经测序验证而得。

第四方面，本发明涉及一种重组大肠杆菌工程菌，为前述的重组表达质粒转化E.coli而得。在一些实施例中，是转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞而得。

所述工程菌为24a-dEC95或24a-2dEC95，所述步骤B2中24a-dEC95、24a-2dEC95两个菌株均可以通过表达EC95蛋白；优选的，将使用24a-2dEC95菌株。因此，本发明还涉及一种重组大肠杆菌工程菌，所述工程菌为大肠杆菌Escherichia coli 24a-2dEC95，保藏编号为CCTCC NO：M2021749。

第五方面，本发明涉及一种前述的加拿大棘球蚴EC95重组蛋白在制备抗棘球蚴病感染的药剂中的用途。

所述药剂和/或疫苗的施用对象包括羊、牛、骆驼。

本发明中，大肠杆菌24a-2dEC95(Escherichia coli 24a-2dEC95)，已经于2021年6月23日递交中国典型培养物保藏中心保藏，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M 2021749。

本发明具有如下有益效果：

本发明提出了制备加拿大棘球蚴EC95蛋白的方法，该方法具备蛋白表达量高、工艺简单、生产成本低等优点。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为表达验证SDS-PAGE图；其中，泳道M：蛋白标准分子量；泳道1：24a-dEC95未诱导全菌样品；泳道2：24a-dEC95诱导后全菌样品；泳道3：24a-dEC95诱导后沉淀样品；泳道4：24a-dEC95诱导后上清样品；泳道5：24a-2dEC95诱导后沉淀样品；泳道6：24a-2dEC95诱导后上清样品；泳道7：24a-2dEC95诱导后全菌样品；泳道8：24a-2dEC95未诱导全菌样品；

图2为蛋白纯化结果；其中，泳道M：蛋白标准分子量；泳道1：蛋白样品2dEC95；泳道2：蛋白样品dEC95。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。

本发明采用了如下技术方案：

S1：加拿大棘球绦虫的EC95基因序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示，经过氨基酸序列修饰，删去N端的信号肽区域及C端的跨膜区，得到修饰后的氨基酸序列称为dEC95；

S2：两个dEC95氨基酸序列通过linker进行连接，形成2dEC95氨基酸序列；

S3：基因合成密码子优化的适合大肠杆菌表达的dEC95、2dEC95两个序列；

S4：将dEC95基因及2dEC95分别克隆到pET24a质粒载体中，分别构建了pET24a-dEC95及pET24a-2dEC95质粒；

S5：pET24a-dEC95、pET24a-2dEC95分别转化到大肠杆菌中，筛选单克隆后将对应的大肠杆菌分别命名为24a-dEC95、24a-2dEC95。

S6：分别将24a-dEC95、24a-2dEC95菌株接种到500mL含硫酸卡那霉素的LB培养基中，在37℃条件下震荡培养至至OD值为1.2～1.5时，将种子液接种至发酵罐中进行发酵，当菌体OD值达到20～25时，添加IPTG至终浓度为0.4mM，诱导12～14h。诱导表达并纯化得到重组蛋白。

上述步骤S1中将EC95氨基酸序列的N-端截短13、14、15或16个氨基酸；C-端截短20、22、24或26个氨基酸；优选地，将EC95氨基酸序列的N-端截短14个氨基酸，C-端截短24个氨基酸，修饰后的EC95氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

上述步骤S2中将修饰后的2个EC95氨基酸序列通过富含甘氨酸和丝氨酸的linker连接；优选地，将修饰后的2个EC95氨基酸序列通过GGGSGGGS连接，氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示。

上述步骤S5中大肠杆菌来源于市场上可得到的，在此举例但不限于：BL21(DE3)，B834(DE3)，BLR(DE3)，JM109，XL1Blue，ER2566，Rosetta，GI698。优选BL21(DE3)。

上述步骤S6中24a-dEC95、24a-2dEC95两个菌株均可以通过表达EC95蛋白；优选的，将使用24a-2dEC95菌株，菌种保藏编号CCTCC M 2021749。

上述步骤S6中，用色谱层析进行蛋白纯化，包括但不限于：离子交换色谱(例如阳离子交换色谱)、疏水相互作用色谱、吸附层析法(例如羟基磷灰石色谱)、凝胶过滤(凝胶排阻)层析法、亲和层析法、分子筛层析法。优选亲和层析法。

具体见以下各实施例：

实施例1、基因序列的优化与合成。

以E.coli为宿主菌，本发明对编码重组蛋白dEC95、2dEC95的碱基序列进行了密码子的优化，优化后的碱基序列由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。其中，将EC95氨基酸序列的N-端截短14个氨基酸，C-端截短24个氨基酸，2个修饰后的EC95氨基酸序列通过“GGGSGGGS”连接，构建得到单链同源二聚体2dEC95。

同步的，以E.coli为宿主菌，本发明对编码重组蛋白aEC95碱基序列进行了密码子的优化，优化后的碱基序列由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。所述aEC95氨基酸序列为EC95蛋白氨基酸序列的N-端截短8个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。2个修饰后的EC95氨基酸序列aEC95通过“GGGSGGGS”连接，构建得到单链同源二聚体2aEC95。

实施例2、重组表达载体的构建。

2.1重组表达载体pET24a-dEC95的构建。

(1)以dEC95为模板，设计上游引物Nde I-F和下游引物Xho I-R，PCR扩增得到基因片段dEC95，上游引物的5’端引入限制性内切酶Nde I位点及保护性碱基，其中Nde I位点序列为CATATG；下游引物的5’端引入限制性内切酶Xho I位点，一个终止密码子及保护性碱基，其中Xho I位点序列为CTCGAG。引物序列及PCR反应程序如表1和表2所示。

表1：PCR引物名称及序列

表2：PCR反应程序

(2)将扩增得到的基因片段dEC95，用内切酶Nde I和内切酶Xho I消化处理，回收酶切后的基因片段，连接到用同样内切酶Nde I和内切酶Xho I处理的pET24a原核表达载体，连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，涂布于含有100μg/ml硫酸卡那霉素的平板，37℃培养，等平板上的菌落清晰可见时，挑取单菌落于含有100μg/ml硫酸卡那霉素的3ml液体培养基，37℃培养，随后提取质粒。得到重组质粒pET24a-dEC95，重组质粒通过测序验证确认与目的序列一致。

2.2重组表达载体pET24a-2dEC95的构建。

(1)以2dEC95为模板，设计上游引物Nde I-F和下游引物Xho I-R，PCR扩增得到基因片段2dEC95，上游引物的5’端引入限制性内切酶Nde I位点及保护性碱基，其中Nde I位点序列为CATATG；下游引物的5’端引入限制性内切酶Xho I位点，一个终止密码子及保护性碱基，其中Xho I位点序列为CTCGAG。引物序列及PCR反应程序如表3和表4所示。

表3：PCR引物名称及序列

引物名称	序列
		Nde I-F	5’-GGTCCATATGCATCACCATCATCACCACGACCTG-3’SEQ ID NO.5
Xho I-R	5’-CCGCTCGAGTTA GACGGTAGATTCTTTTTTACCAGC-3’SEQ ID NO.6

表4：PCR反应程序

(2)将扩增得到的基因片段2dEC95，用内切酶Nde I和内切酶Xho I消化处理，回收酶切后的基因片段，连接到用同样内切酶Nde I和内切酶Xho I处理的pET24a原核表达载体，连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，涂布于含有100μg/ml硫酸卡那霉素的平板，37℃培养，等平板上的菌落清晰可见时，挑取单菌落于含有100μg/ml硫酸卡那霉素的3ml液体培养基，37℃培养，随后提取质粒。得到重组质粒pET24a-2dEC95，重组质粒通过测序验证确认与目的序列一致。

2.3重组表达载体pET24a-aEC95的构建。

(1)以aEC95为模板，设计上游引物a-Nde I-F和下游引物a-Xho I-R，PCR扩增得到基因片段aEC95，上游引物的5’端引入限制性内切酶Nde I位点及保护性碱基，其中Nde I位点序列为CATATG；下游引物的5’端引入限制性内切酶Xho I位点，一个终止密码子及保护性碱基，其中Xho I位点序列为CTCGAG。引物序列及PCR反应程序如表5和表6所示。

表5：PCR引物名称及序列

引物名称	序列
		a-Nde I-F	5’-GGTCCATATGCATCACCATCATCACCACCTGTTC-3’SEQ ID NO.8
a-Xho I-R	5’-CCGCTCGAGTTA AGTCAGAACTACAACGATGC-3’SEQ ID NO.9

表6：PCR反应程序

(2)将扩增得到的基因片段aEC95，用内切酶Nde I和内切酶Xho I消化处理，回收酶切后的基因片段，连接到用同样内切酶Nde I和内切酶Xho I处理的pET24a原核表达载体，连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，涂布于含有100μg/ml硫酸卡那霉素的平板，37℃培养，等平板上的菌落清晰可见时，挑取单菌落于含有100μg/ml硫酸卡那霉素的3ml液体培养基，37℃培养，随后提取质粒。得到重组质粒pET24a-aEC95，重组质粒通过测序验证确认与目的序列一致。

2.4重组表达载体pET24a-2aEC95的构建。

(1)以2aEC95为模板，设计上游引物a-Nde I-F和下游引物a-Xho I-R，PCR扩增得到基因片段2aEC95，上游引物的5’端引入限制性内切酶Nde I位点及保护性碱基，其中NdeI位点序列为CATATG；下游引物的5’端引入限制性内切酶Xho I位点，一个终止密码子及保护性碱基，其中Xho I位点序列为CTCGAG。引物序列及PCR反应程序如表7和表8所示。

表7：PCR引物名称及序列

表8：PCR反应程序

(2)将扩增得到的基因片段2aEC95，用内切酶Nde I和内切酶Xho I消化处理，回收酶切后的基因片段，连接到用同样内切酶Nde I和内切酶Xho I处理的pET24a原核表达载体，连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，涂布于含有100μg/ml硫酸卡那霉素的平板，37℃培养，等平板上的菌落清晰可见时，挑取单菌落于含有100μg/ml硫酸卡那霉素的3ml液体培养基，37℃培养，随后提取质粒。得到重组质粒pET24a-2aEC95，重组质粒通过测序验证确认与目的序列一致。

实施例3、重组菌的构建。

将上述的pET24a-dEC95、pET24a-2dEC95、pET24a-aEC95、pET24a-2aEC95分别转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，涂布于含有抗生素100μg/ml硫酸卡那霉素的LB培养基平板，37℃培养，等平板上的菌落清晰可见时，挑取单菌落于含有抗生素100μg/ml硫酸卡那霉素的3ml液体培养基，37℃培养，从中取1ml菌液加入终浓度为8％的甘油，-80℃冷冻保存，分别得到重组工程菌24a-dEC95、24a-2dEC95、24a-aEC95、24a-2aEC95，作为后续试验的种子。

实施例4、重组菌的表达验证。

4.1从-80℃中取出重组菌菌种，融化后，接种到含有抗生素100μg/ml硫酸卡那霉素的40ml液体LB培养基中，37℃培养，等OD₆₀₀值到0.6时，加入终浓度为0.4mM的IPTG，20℃诱导表达12～14h。

4.2用一个预先称重的离心管10000g离心20分钟，弃上清，收集细胞。重悬沉淀于4ml冰冷的20mM Tris-HCl pH 7.5中，得到10倍的浓缩系数(40ml培养液到4ml缓冲液)。

4.3超声波处理。采用功率15％，工作2s，暂停2s，总时间15min，在冰上超声。

4.4整个裂解液14000g离心10分钟以分离可溶和不溶组分。

4.5SDS-PAGE电泳分析目的蛋白在可溶和不溶组分的分布情况，如图1所示。

4.6结果分析表明，24a-dEC95、24a-2dEC95重组蛋白以部分可溶形式，部分包涵体形式表达；pET24a-aEC95、pET24a-2aEC95大部分以包涵体形式表达。

实施例5、重组菌的发酵。

将菌株接种到500mL含抗生素100μg/ml硫酸卡那霉素LB培养基中，在37℃条件下震荡培养至OD₆₀₀值为1.2～1.5时，按照10％的接种量，将种子液接种至5L发酵罐中进行发酵培养，当菌体OD₆₀₀值达到20～25时，降低培养温度至28℃，同时添加IPTG至终浓度为0.4mM，诱导12～14h。离心收集菌体湿重约500g。

按照每克湿菌体加10毫升重悬缓冲液(20mM Tris-HCl pH 7.5，500mM NaCl)重悬菌体。

实施例6、重组蛋白的纯化。

6.1利用均质机对重悬菌液进行破碎，压力700bar，破碎4次。

6.2裂解液28000g离心40分钟，取上清。

6.3采用亲和层析的方式进行纯化，蛋白层析设备为AKTA pure 150m蛋白纯化仪，填料为Ni Sepharose 6FF，平衡液为20mM Tris-HCl pH 7.5，500mM NaCl，洗杂液为30mM咪唑，洗脱液为500mM咪唑。

6.4SDS-PAGE电泳分析蛋白纯化情况，如图2所示，结果表明目的蛋白完全与层析柱结合，并被洗脱液洗脱。一步纯化得到的目的蛋白纯度大于80％，浓度约1mg/ml。

实施例7、重组蛋白的免疫原性分析。

7.1免疫样品制备。将纯化得到的重组蛋白用PBS稀释至100μg/ml，与灭菌的Montanide ISA 50V佐剂按照体积比1:1进行乳化，制得免疫所需样品。

7.2兔子免疫实验。利用制备的样品每组免疫两只新西兰兔，免疫与采血流程包括：1)免疫前采血约5ml；2)第1天第一次免疫：每只兔子免疫1ml；3)第二次免疫前采血，制备血清留样；4)第15天第二次免疫：每只兔子免疫1ml；5)第三次免疫前采血，制备血清留样；6)第29天第三次免疫：每只兔子免疫0.5ml；7)第35天采血5-30ml，ELISA检测；8)第38天实验动物放血处理。

7.3抗体效价检测。采用ELISA法检测免疫血清的抗体效价，结果如表9所示，说明重组蛋白具有较好的免疫原性，2dEC95蛋白产生的抗体效价高于dEC95蛋白产生的抗体效价，说明单链二聚体的形式可以提高蛋白的免疫原性。

表9：抗体效价检测结果。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

序列表

<110> 申联生物医药（上海）股份有限公司

<120> 加拿大棘球蚴EC95蛋白的制备及应用

<130> DD15188

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 471

<212> DNA

<213> 加拿大棘球绦虫(Echinococcus. canadensis)

<400> 1

atggcattcc agttatgtct cattttgttt gcgacttcag ttttggctca ggaatacaaa 60

ggaatgggca tagagacaag gacaacagag actccgctcc gcaaacactt caatttgact 120

cttgtgggtt ctcagggcat tcgcttaagt tgggatgtcc aacacttgtc tgacctcaaa 180

ggaacaaata tttctctaaa agcggtgaat ccttccgacc cgttagtcta caaaagacaa 240

actgcaaaat tctcagatgg acaactcact attggtgaac tgaagccctc cacattatac 300

aaaatgactg tggaagcagt gaaagcgaaa aagaccattt tggaattcac cgtagacatt 360

gagacaccgc ccgctggcaa gaaggaaagc actgtaatga ctagtggatc cgccttaaca 420

tccacaatcg ctggtttcgt attcagctgc atagtggttg tccttacttg a 471

<210> 2

<211> 156

<212> PRT

<213> 加拿大棘球绦虫(Echinococcus. canadensis)

<400> 2

Met Ala Phe Gln Leu Cys Leu Ile Leu Phe Ala Thr Ser Val Leu Ala

1 5 10 15

Gln Glu Tyr Lys Gly Met Gly Ile Glu Thr Arg Thr Thr Glu Thr Pro

20 25 30

Leu Arg Lys His Phe Asn Leu Thr Leu Val Gly Ser Gln Gly Ile Arg

35 40 45

Leu Ser Trp Asp Val Gln His Leu Ser Asp Leu Lys Gly Thr Asn Ile

50 55 60

Ser Leu Lys Ala Val Asn Pro Ser Asp Pro Leu Val Tyr Lys Arg Gln

65 70 75 80

Thr Ala Lys Phe Ser Asp Gly Gln Leu Thr Ile Gly Glu Leu Lys Pro

85 90 95

Ser Thr Leu Tyr Lys Met Thr Val Glu Ala Val Lys Ala Lys Lys Thr

100 105 110

Ile Leu Glu Phe Thr Val Asp Ile Glu Thr Pro Pro Ala Gly Lys Lys

115 120 125

Glu Ser Thr Val Met Thr Ser Gly Ser Ala Leu Thr Ser Thr Ile Ala

130 135 140

Gly Phe Val Phe Ser Cys Ile Val Val Val Leu Thr

145 150 155

<210> 3

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Leu Ala Gln Glu Tyr Lys Gly Met Gly Ile Glu Thr Arg Thr Thr Glu

1 5 10 15

Thr Pro Leu Arg Lys His Phe Asn Leu Thr Leu Val Gly Ser Gln Gly

20 25 30

Ile Arg Leu Ser Trp Asp Val Gln His Leu Ser Asp Leu Lys Gly Thr

35 40 45

Asn Ile Ser Leu Lys Ala Val Asn Pro Ser Asp Pro Leu Val Tyr Lys

50 55 60

Arg Gln Thr Ala Lys Phe Ser Asp Gly Gln Leu Thr Ile Gly Glu Leu

65 70 75 80

Lys Pro Ser Thr Leu Tyr Lys Met Thr Val Glu Ala Val Lys Ala Lys

85 90 95

Lys Thr Ile Leu Glu Phe Thr Val Asp Ile Glu Thr Pro Pro Ala Gly

100 105 110

Lys Lys Glu Ser Thr Val

115

<210> 4

<211> 244

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Leu Ala Gln Glu Tyr Lys Gly Met Gly Ile Glu Thr Arg Thr Thr Glu

1 5 10 15

Thr Pro Leu Arg Lys His Phe Asn Leu Thr Leu Val Gly Ser Gln Gly

20 25 30

Ile Arg Leu Ser Trp Asp Val Gln His Leu Ser Asp Leu Lys Gly Thr

35 40 45

Asn Ile Ser Leu Lys Ala Val Asn Pro Ser Asp Pro Leu Val Tyr Lys

50 55 60

Arg Gln Thr Ala Lys Phe Ser Asp Gly Gln Leu Thr Ile Gly Glu Leu

65 70 75 80

Lys Pro Ser Thr Leu Tyr Lys Met Thr Val Glu Ala Val Lys Ala Lys

85 90 95

Lys Thr Ile Leu Glu Phe Thr Val Asp Ile Glu Thr Pro Pro Ala Gly

100 105 110

Lys Lys Glu Ser Thr Val Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Leu Ala

115 120 125

Gln Glu Tyr Lys Gly Met Gly Ile Glu Thr Arg Thr Thr Glu Thr Pro

130 135 140

Leu Arg Lys His Phe Asn Leu Thr Leu Val Gly Ser Gln Gly Ile Arg

145 150 155 160

Leu Ser Trp Asp Val Gln His Leu Ser Asp Leu Lys Gly Thr Asn Ile

165 170 175

Ser Leu Lys Ala Val Asn Pro Ser Asp Pro Leu Val Tyr Lys Arg Gln

180 185 190

Thr Ala Lys Phe Ser Asp Gly Gln Leu Thr Ile Gly Glu Leu Lys Pro

195 200 205

Ser Thr Leu Tyr Lys Met Thr Val Glu Ala Val Lys Ala Lys Lys Thr

210 215 220

Ile Leu Glu Phe Thr Val Asp Ile Glu Thr Pro Pro Ala Gly Lys Lys

225 230 235 240

Glu Ser Thr Val

<210> 5

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggtccatatg catcaccatc atcaccacct ggca 34

<210> 6

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ccgctcgagt tagacggtag attctttttt accagc 36

<210> 7

<211> 148

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Leu Phe Ala Thr Ser Val Leu Ala Gln Glu Tyr Lys Gly Met Gly Ile

1 5 10 15

Glu Thr Arg Thr Thr Glu Thr Pro Leu Arg Lys His Phe Asn Leu Thr

20 25 30

Leu Val Gly Ser Gln Gly Ile Arg Leu Ser Trp Asp Val Gln His Leu

35 40 45

Ser Asp Leu Lys Gly Thr Asn Ile Ser Leu Lys Ala Val Asn Pro Ser

50 55 60

Asp Pro Leu Val Tyr Lys Arg Gln Thr Ala Lys Phe Ser Asp Gly Gln

65 70 75 80

Leu Thr Ile Gly Glu Leu Lys Pro Ser Thr Leu Tyr Lys Met Thr Val

85 90 95

Glu Ala Val Lys Ala Lys Lys Thr Ile Leu Glu Phe Thr Val Asp Ile

100 105 110

Glu Thr Pro Pro Ala Gly Lys Lys Glu Ser Thr Val Met Thr Ser Gly

115 120 125

Ser Ala Leu Thr Ser Thr Ile Ala Gly Phe Val Phe Ser Cys Ile Val

130 135 140

Val Val Leu Thr

145

<210> 8

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ggtccatatg catcaccatc atcaccacct gttc 34

<210> 9

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ccgctcgagt taagtcagaa ctacaacgat gc 32

Claims

1.一种加拿大棘球蚴EC95重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白包括dEC95氨基酸序列；

所述dEC95氨基酸序列为加拿大棘球绦虫的EC95删去N端的信号肽区域及C端的跨膜区，得到的修饰后的氨基酸序列；所述EC95基因序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQID NO.2所示。

2.如权利要求1所述的加拿大棘球蚴EC95重组蛋白，其特征在于，将EC95氨基酸序列的N-端截短13、14、15或16个氨基酸；C-端截短20、22、24或26个氨基酸。

3.如权利要求2所述的加拿大棘球蚴EC95重组蛋白，其特征在于，dEC95氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

4.一种如权利要求1所述的加拿大棘球蚴EC95重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

5.根据权利要求4所述的加拿大棘球蚴EC95重组蛋白的制备方法，其特征在于，步骤S1具体包括如下步骤：

6.如权利要求5所述的加拿大棘球蚴EC95重组蛋白的制备方法，其特征在于，2dEC95氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

7.一种包含如权利要求1所述加拿大棘球蚴EC95重组蛋白的编码基因的重组表达质粒。

8.一种重组大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述工程菌为如权利要求7所述的重组表达质粒转化E.coli而得。

9.一种重组大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述工程菌为大肠杆菌Escherichia coli24a-2dEC95，保藏编号为CCTCC NO：M2021749。

10.一种如权利要求1所述的加拿大棘球蚴EC95重组蛋白在制备抗棘球蚴病感染的药剂中的用途。