CN101376887B - 猪口蹄疫重组免疫复合肽的制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及猪口蹄疫重组免疫复合肽的构建方法和应用，属于生物工程技术领域。该免疫多肽佐剂为口蹄疫病毒新型辅助T细胞表位(I-S-I-S-E-I-K-G-V-I-V-H-K-I-E-T-I-L-F)和囊素模拟肽(T-P-N-L-K-H-G)通过柔性Linker融合而成。融合基因插入表达载体，转化大肠杆菌，获得高效表达猪口蹄疫重组免疫复合肽的基因工程菌，通过液体培养、纯化制得的猪口蹄疫重组免疫复合肽融合蛋白，该融合蛋白经N端带有His标签的肠激酶去除硫氧还蛋白，再经亲和层析纯化，可获得单一的猪口蹄疫重组免疫复合肽，样品纯度极高。该重组免疫复合肽可作为口蹄疫疫苗的新型多肽免疫佐剂。动物免疫实验证实，安全性好，无毒副作用。能够有效增强机体细胞免疫和体液免疫水平。

Description

猪口蹄疫重组免疫复合肽的制备方法及应用

技术领域

本发明涉及猪口蹄疫重组免疫复合肽的制备方法及应用，属于生物技术制药工业中的基因工程生产免疫佐剂的技术领域。

背景技术

口蹄疫(foot-and-mouth disease，FMD)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus，FMDV)引起的烈性传染病，主要感染偶蹄目动物。除动物死亡造成直接经济损失外，动物在患病期间肉和奶的生产停止导致该地区甚至该国家的畜产品进出口贸易停止，也造成巨大的经济损失。因此，世界各国都很重视本病的防制。

FMDV感染机体产生中和性抗体需要B细胞和T细胞的参与，感染FMDV的小鼠血清中既存在T细胞依赖性IgG1和IgG2，也存在非T细胞依赖性IgG3，表明T细胞在FMDV的抗原构成和免疫应答中起重要的作用。FMDV的VP1G-H环内有诱导生成B细胞的位点，也有激发产生Th细胞的位点。试验发现在VP1的41～209氨基酸残基位上至少存在11个不同的T细胞表位。含有T细胞表位的多肽能增强Th细胞的活性，并同时协同诱导机体产生抗病毒抗体。含有Asia I型FMDV的B细胞和T细胞表位的融合蛋白能引起豚鼠免疫反应，该融合表位为抗Asia I型FMDV提供了选择。

疫苗是控制FMD的最有效措施，FMD弱毒疫苗和灭活疫苗等常规疫苗都具有良好的免疫原性，在预防和控制FMD的过程中发挥着重要作用，但在灭活疫苗的生产、使用过程中有诱发FMD的危险，这促使基因工程疫苗逐渐成为FMD疫苗研究的热点。但基因工程疫苗在诱导机体免疫反应方面还存在一些不尽如人意之处，因此，研究者试图从多方面增强FMD疫苗的免疫效果。法氏囊(bursa of Fabricus，BF)是禽类重要的中枢免疫器官，法氏囊超滤物(1KD以下)中含有许多生物活性物质，特别是一些小肽对禽类具有免疫调节功能，能促进禽类、哺乳动物细胞的分化发育，促进免疫器官的成熟。其中的囊素三肽(K-H-G)作为BF组织中活性成分的重要组成部分不仅对禽类具有免疫调节功能，而且对哺乳动物及人类淋巴细胞也具有明显的免疫学及生理学活性。由于天然的BS只能从鸡的法氏囊组织中提取，来源受到很大的限制，而且其它杂蛋白含量高，纯化难度大，其实际效果也受到很大程度的影响。化学合成的BS成本高，不适合田间推广。因此利用基因工程技术，体外大量表达BS活性肽，将可能使BS作为一种有效的免疫增强剂而得到最为广泛的应用。

本发明为制备重组的猪口蹄疫免疫复合肽提供了切实可行的技术路线，按本方法制备的猪口蹄疫重组免疫复合肽可作为猪口蹄疫疫苗新型的基因工程多肽疫苗佐剂。

发明内容

技术问题本发明的目的在于研制出具有良好免疫效果的基因工程多肽，为临床上的猪口蹄疫防治提供一个合适的免疫佐剂。同时提供一种以大肠杆菌为宿主的基因工程免疫多肽的制备方法。本发明还涉及基因工程猪口蹄疫免疫复合肽在猪口蹄疫防治中的应用。

技术方案

1)本发明技术要点之一提供一种基因工程猪口蹄疫免疫复合肽及其基因

猪口蹄疫重组免疫复合肽基因其特征是由猪口蹄疫辅助性T细胞表位基因和双拷贝的囊素模拟肽基因通过柔性Linker(G-G-G-S)基因串联而成连接，并在5’端加有肠激酶识别位点基因序列。该串联基因推导的氨基酸多肽为猪口蹄疫重组免疫复合肽。该猪口蹄疫重组免疫复合肽其特征在于将T细胞表位多肽和囊素模拟肽串联而成。一方面，T细胞表位多肽能增强Th1细胞的活性，并同时协同诱导机体产生抗口蹄疫病毒抗体。同时，囊素模拟肽能促进B细胞的分化成熟，诱导抗体生成。二者通过柔性氨基酸连接，在保持独立的空间结构的同时能有效发挥各自的生物学功能。5’端加有肠激酶识别位点序列，能在该酶的作用下，可获得保持天然N端的猪口蹄疫重组免疫复合肽。

2)本发明技术要点之二提供了一种能高效表达猪口蹄疫重组免疫复合肽的基因工程菌的构建方法

为生产成本低的猪口蹄疫重组免疫复合肽，须构建一种高效表达猪口蹄疫重组免疫复合肽，即能生产猪口蹄疫重组免疫复合肽的基因工程菌，本发明基因工程菌是携带重组载体的大肠杆菌BL21(DE3)，重组载体是含有猪口蹄疫重组免疫复合肽基因的pET32a载体。

3)本发明技术要点之三提供一种可溶性的基因工程猪口蹄疫免疫复合肽制备方法

本发明选用大肠杆菌表达系统，pET32a载体以T7启动子，在IPTG诱导下能高效表达外源基因。将猪口蹄疫重组免疫复合肽基因插入硫氧还蛋白(TRX)基因C端，利用硫氧还蛋白分子伴侣作用，获得了可溶性的基因工程猪口蹄疫免疫复合肽融合蛋白。该融合蛋白，首先经Ni柱亲和层析纯化后，再通过N端带有His标签的肠激酶酶切去除硫氧还蛋白，可获得保持天然N端的猪口蹄疫重组免疫复合肽。再次进行亲和层析，收集穿透峰，冷冻干燥，得到纯度极高的猪口蹄疫重组免疫复合肽。

4)本发明技术要点之四提供了基因工程猪口蹄疫免疫复合肽的应用

本发明利用小鼠动物模型，将猪口蹄疫免疫复合肽配合猪口蹄疫灭活疫苗使用。通过免疫小鼠的抗体和抗体亚型、脾淋巴细胞增殖、血清中IL-4和IFN-γ的测定。评价基因工程猪口蹄疫免疫复合肽的免疫佐剂效果。

为实现以上技术要点，下面详细介绍本发明的技术方案

一种高效表达猪口蹄疫重组免疫复合肽的基因工程菌株，其构建包括以下步骤：

1)猪口蹄疫重组免疫复合肽基因SEQ.ID.NO.1的重叠PCR(SOE)扩增。设计了三条PCR引物：

引物F1，SEQ.ID.NO.2：

5’-CCGGAATTCGGCGGCGGCGGCAGCGATGATGATGATAAAATTAGCATTAGCGAAATTAAAGGCGTG-3’EcoRI

引物F2，SEQ.ID.NO.3：

5’-GGGGTGCTGCCGCCGCCGCCAAACAGAATGGTTTCAATTTTATGCACAATCACGCCTTTAATTTCG-3’

引物F3，SEQ.ID.NO.4：

5’-GCGGCGGCAGCACCCCGAACCTGAAACATGGCACCCCGAACCTGAAACATGGCTAAGTCGACTCG-3’SalI

PCR反应体系50μl：10×PCR Buffer，5μL，MgCl₂，3μL；dNTP，10mmol/L，1μL；引物F1、F2和引物F2，终浓度为20pmol/L各2μL；TaKaRa ExTaq0.5μL；灭菌超纯水，34.5μL；

PCR反应条件：94℃预变性2min，进入TD-PCR循环：94℃30s，退火温度从55℃，每循环1min，共30个循环；72℃延伸6min，经过胶回收后获得猪口蹄疫重组免疫复合肽基因；

2)高效表达权利要求1所述猪口蹄疫重组免疫复合肽基因的基因工程菌株的构建上述猪口蹄疫重组免疫复合肽基因PCR产物和pET32a均用EcoRI、SalI双酶切，T4DNALigase连接，连接产物转化E.coli DH5α，重组表达质粒进行EcoRI和SalI双酶切鉴定；酶切鉴定为阳性的质粒测序，命名为pET32a—KCMP；

3)采用CaCl₂转化法，将重组质粒pET32a-KCMP转化进入大肠杆菌BL21(DE3)中，筛选阳性克隆。

可溶性的基因工程猪口蹄疫免疫复合肽制备方法，包括以下步骤：

1)猪口蹄疫重组免疫复合肽的表达

挑取基因工程菌单菌落接种到盛有3ml LB液体培养基(50μg/ml氨苄青霉素)试管中，于37℃振摇培养过夜，第二天从中取出一定量的菌体加到另一盛有3ml LB液体培养基中，使菌体浓度达到OD₆₀₀≈0.1，37℃振摇培养2～4小时，当菌体浓度OD₆₀₀≈0.4-0.6时，加入终浓度为1mM的IPTG进行诱导表达4～6h，每隔1小时收集100μL菌液。4000rpm，离心10min，收集菌体，将收集的菌体用100μL PBS重悬后，加等体积的2×SDS凝胶加样缓冲液(100mmol/L Tris·Cl(pH6.8)；200mmol/L二硫苏糖醇(DTT)；4％SDS(电泳级)；0.2％溴酚蓝；20％甘油)，100℃煮沸5min以使蛋白质变形，取10μL加样进行SDS-PAGE凝胶电泳。

2)猪口蹄疫重组免疫复合肽融合蛋白的纯化

将诱导表达的菌液于12000rmp离心10min收获沉淀，以洗涤液(5mM咪唑，0.5M NaCl，20mM Tris-HCl，pH7.9)重悬菌体，后经超声波裂解10min，随后12000rmp离心10min收获包涵体沉淀和上清，经SDS-PAGE电泳鉴定表达产物主要以可溶性表达。将此上清用Ni-NTA亲合层析柱进行纯化。

3)肠激酶酶切猪口蹄疫重组免疫复合肽及纯化

再通过N端带有His标签的肠激酶切去除硫氧还蛋白，可获得保持天然N端的猪口蹄疫重组免疫复合肽。再次进行亲和层析，收集穿透峰，将纯化的蛋白用PBS进行透析，得到纯度极高的猪口蹄疫重组免疫复合肽。并在GeneQuant pro RNA/DNA Calculator定量后冷冻干燥。

基因工程猪口蹄疫免疫复合肽的应用，包括以下步骤：利用小鼠动物模型，将猪口蹄疫免疫复合肽配合猪灭活疫苗使用。通过免疫小鼠的抗体和抗体亚型、脾淋巴细胞增殖、血清中IL-4和IFN-γ的测定。评价基因工程猪口蹄疫免疫复合肽的免疫佐剂效果。

有益效果

1提高猪口蹄疫疫苗免疫效果

本发明应用猪口蹄疫重组免疫复合肽作为分子佐剂，将猪口蹄疫辅助性T细胞表位和双拷贝的囊素模拟肽通过柔性Linker(G-G-G-S)融合形成新型的猪口蹄疫重组免疫复合肽，可以增强猪口蹄疫灭活疫苗的免疫原性，将猪口蹄疫重组免疫复合肽配合猪口蹄疫灭活疫苗联合免疫BALB/c小鼠后，其体液免疫和细胞免疫都比单独的猪口蹄疫灭活疫苗免疫效果好，并且无任何过敏反应。

2易于实现大量生产

本发明在使用猪口蹄疫重组免疫复合肽作为分子佐剂时选择原核表达载体，其优点在于技术简单，成本低，产量高，纯化工艺简单，易于实现大量生产。

附图说明：

图1猪口蹄疫免疫复合肽的表达设计图

图2猪口蹄疫免疫复合肽的基因PCR扩增及重组表达载体鉴定图

M.DL2000Marker；1，3EcoRI和Sal I双酶切鉴定阳性质粒；2猪口蹄疫免疫复合肽的基因PCR扩增

图3猪口蹄疫免疫复合肽融合蛋白纯化的SDS-PAGE分析，产物

M.蛋白Marker；1，2，3猪口蹄疫免疫复合肽融合蛋白纯化的收集峰

图4猪口蹄疫免疫复合肽Tricine-SDS-PAGE

M1、M2.蛋白Marker；1，2，3猪口蹄疫免疫复合肽纯化的收集峰

图5淋巴细胞增殖(MTT)分析

1：PBS组2：灭活疫苗组3：灭活疫苗+猪口蹄疫重组免疫复合肽组

图6口蹄疫病毒抗体和抗体亚型检测

图7小鼠血清中细胞因子的含量

A：IFN-γ含量1：PBS组2：灭活疫苗组3：灭活疫苗+猪口蹄疫重组免疫复合肽组

B：IL-4含量1：PBS组2：灭活疫苗组3：灭活疫苗+猪口蹄疫重组免疫复合肽组

具体实施方式：

1猪口蹄疫重组免疫复合肽基因的重叠PCR(SOE)扩增

根据大肠杆菌偏嗜密码子设计猪口蹄疫重组免疫复合肽基因，分别在引物F1加上EcoRI酶切位点、引物F3中加上终止密码子和SalI酶切位点。猪口蹄疫重组免疫复合肽的表达设计图见(图1)

引物F1，SEQ.ID.NO.2：

5’-CCGGAATTCGGCGGCGGCGGCAGCGATGATGATGATAAAATTAGCATTAGCGAAATTAAAGGCGTG-3’EcoRI

引物F2，SEQ.ID.NO.3：

5’-GGGGTGCTGCCGCCGCCGCCAAACAGAATGGTTTCAATTTTATGCACAATCACGCCTTTAATTTCG-3’

引物F3，SEQ.ID.NO.4：

5’-GCGGCGGCAGCACCCCGAACCTGAAACATGGCACCCCGAACCTGAAACATGGCTAAGTCGACTCG-3’SalI

引物由上海Invitrongen公司合成

PCR反应体系50μl：10×PCR Buffer，5μL，MgCl₂，3μL；dNTP，10mmol/L，1μL；引物F1、F2和引物F2，终浓度为20pmol/L各2μL；TaKaRa ExTaq0.5μL；灭菌超纯水，34.5μL；

PCR反应条件：94℃预变性2min，进入TD-PCR循环：94℃30s，退火温度从55℃，每循环1min，共30个循环；72℃延伸10min，PCR产物经含有溴化乙锭(Ethidium Bromide，EB)1％琼脂糖凝胶电泳鉴定后，切下目的条带，随后按胶回收试剂盒(大连TaKaRa公司)使用说明进行回收，并对回收产物进行电泳鉴定约144bp大小片段即为猪口蹄疫重组免疫复合肽基因(图2)，对基因序列测定后，推导其编码的猪口蹄疫重组免疫复合肽为48个氨基酸。

2猪口蹄疫重组免疫复合肽基因的基因工程菌株构建

用EcoR I，Sal I对猪口蹄疫重组免疫复合肽基因和质粒载体pET-32a进行双酶切，并置于37℃水浴作用2h，酶切产物同样经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定后，胶回收试剂盒进行回收鉴定。经过酶切的猪口蹄疫重组免疫复合肽基因和pET-32a载体按1：3的摩尔比4℃过夜连接。取连接产物加入含有100μL感受态DH5α的聚丙烯离心管中，轻轻混匀后冰浴30min。将聚丙烯离心管从冰中取出后42℃热休克90sec，然后立即冰浴2min。加入800μL37℃预热的LB培养基，于37℃振摇(100～150rpm)45min。取100μL菌液均匀涂布含氨苄青霉素(Amp)50μg/ml的琼脂LB平板，在37℃正置20min后，倒置培养16～20h。按《分子克隆实验指南》上的碱裂解法提取质粒。对提取质粒进行EcoRI和SalI双酶切鉴定。以酶切出现144bp左右大小DNA片段的质粒为阳性质粒(图2)。并将阳性质粒命名为pET32a-KCMP。送上海Invitrongen公司测序。采用CaCl₂转化法，将重组质粒pET32a-KCMP转化进入大肠杆菌BL21(DE3)中，筛选阳性克隆，即为基因工程菌株。

3猪口蹄疫重组免疫复合肽的表达

挑取基因工程菌株单菌落接种到盛有3ml LB液体培养基(50μg/ml氨苄青霉素)试管中，于37℃振摇培养过夜，第二天从中取出一定量的菌体加到另一盛有3ml LB液体培养基中，使菌体浓度达到OD₆₀₀≈0.1，37℃振摇培养2～4小时，当菌体浓度OD₆₀₀≈0.4-0.6时，加入终浓度为1mM的IPTG进行诱导表达4～6h，每隔1小时收集100μL菌液。4000rpm，离心10min，收集菌体，将收集的菌体用100μL PBS重悬后，加等体积的2×SDS凝胶加样缓冲液(100mmol/L Tris·Cl(pH6.8)；200mmol/L二硫苏糖醇(DTT)；4％SDS(电泳级)；0.2％溴酚蓝；20％甘油)，100℃煮沸5min以使蛋白质变形，取10μL加样进行SDS-PAGE凝胶电泳，SDS-PAGE电泳凝胶的配制及电泳条件参照分子克隆手册。

将上述液体混匀后覆盖在分离胶之上，随后插入梳子，于室温下放置10min待胶凝固后，拔去梳子，向电泳槽内倒入Tris-甘氨酸电泳缓冲液(25mmol/LTris；250mmol/L甘氨酸(电泳级)(pH8.3)；0.1％SDS)，加样结束后接通电源。电源负极端接上槽，正极端接下槽。在浓缩胶中电压为80V，进入分离胶中电压调整为120V。直到样品到达分离胶底部后关闭电源，取出凝胶，用考马斯亮蓝染色1h，随后在脱色摇床上脱色1-2h，观察结果。

4猪口蹄疫重组免疫复合肽融合蛋白的纯化

将诱导表达的菌液于12000rmp离心10min收获沉淀，以洗涤液(5mM咪唑，0.5M NaCl，20mM Tris-HCl，pH7.9)重悬菌体，后经超声波裂解10min，随后12000rmp离心10min收获包涵体沉淀和上清，经SDS-PAGE电泳鉴定表达产物主要以可溶性表达。将此上清用蛋白质Ni柱亲和层析进行纯化，具体操作过程如下；

将树脂摇匀后，向柱子里加入5.0ml树脂悬液，置于室温下使其自然沉降，确保柱床体积为2.5ml，随后分别加入3倍体积得纯水、5倍体积1xCharge buffer、3倍体积1xBinding buffer。当1xBinding buffer流到柱床底部时，向柱子里加入表达产物，控制流速，以每小时25ml的流量过柱，确保蛋白能充分地结合到柱子上。接着加入25ml1xBingding buffer进行洗涤，随后用15ml1xWash buffer洗涤，最终用15ml的1x Elutebuffer洗脱蛋白，即得到猪口蹄疫重组免疫复合肽融合蛋白的纯化产物，分子量约26KDa。该融合蛋白在猪口蹄疫重组免疫复合肽N端连有硫氧还蛋白。(图3)。

5肠激酶酶切猪口蹄疫重组免疫复合肽及纯化

再通过N端带有His标签的肠激酶切去除硫氧还蛋白，可获得保持天然N端的猪口蹄疫重组免疫复合肽。再次进行Ni柱亲和层析，收集穿透峰，将纯化的蛋白用PBS进行透析，得到纯度极高分子量约6KDa的猪口蹄疫重组免疫复合肽(图4)。并在GeneQuant pro RNA/DNA Calculator定量后冷冻干燥。

6免疫小鼠

用上述纯度极高分子量约6KDa的猪口蹄疫重组免疫复合肽，配合猪口蹄疫疫苗联合免疫，评价其免疫增强效果。6周龄雌性BALB/c小鼠分为3组(灭活疫苗组、灭活疫苗+猪口蹄疫重组免疫复合肽组、PBS对照组)，每组10只，猪口蹄疫重组免疫复合肽所用剂量为20ug/鼠。采用腹膜内注射，间隔两周免疫一次，共免疫三次。并且最后一次免疫一周尾静脉采血。检测口蹄疫病毒抗体和抗体亚型以及血清中IL-4和IFN-γ的含量。同时分离脾脏淋巴细胞检测脾淋巴细胞增殖。O型FMD灭活疫苗为中牧股份兰州生物药厂产品。

7四甲基偶氮唑蓝法(MTT)

单独灭活疫苗免疫的小鼠组OD570平均值为0.46±0.032^b，灭活疫苗+猪口蹄疫重组免疫复合肽组为0.72±0.012^a，PBS组为0.15±0.033^c，这三组经统计学分析，灭活疫苗+猪口蹄疫重组免疫复合肽组和单独灭活疫苗组差异显著(P<0.05)，这一结果表明灭活疫苗+猪口蹄疫重组免疫复合肽组淋巴细胞增殖强于单独灭活疫苗组(图5)。8口蹄疫病毒抗体和抗体亚型检测

IgG亚型检测结果表明常规灭活疫苗主要诱导IgG1的产生，而灭活疫苗+猪口蹄疫重组免疫复合肽组不但能诱导高水平IgG1的产生，而且诱导IgG2a的产生的能力好于灭活苗。灭活疫苗和猪口蹄疫重组免疫复合肽二者联合免疫后诱导小鼠的抗体分泌水平强于灭活疫苗单独免疫(图6)。

9血清中IL-4和IFN-γ的测定

应用定量ELISA对血清中的IL-4和IFN-γ进行定量分析发现灭活苗主要诱导IL-4的分泌，免疫复合肽组但是加入免疫复合肽组诱导IFN-γ的分泌明显高于灭活苗组。如图7。

序列表

<110>南京农业大学

<120>猪口蹄疫重组免疫复合肽的制备方法及应用

<130>说明书

<140>00

<141>2008-09-18

<160>5

<170>PatentIn version3.1

<210>1

<211>147

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>猪口蹄疫重组免疫复合肽的基因

<222>(1)..(147)

<223>

<400>1

<210>2

<211>66

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>引物F1

<222>(1)..(66)

<223>

<400>2

<210>3

<211>66

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>引物F2

<222>(1)..(66)

<223>

<400>3

<210>4

<211>65

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>引物F3

<222>(1)..(65)

<223>

<400>4

<210>5

<211>48

<212>PRT

<213>人工合成

<220>

<221>猪口蹄疫重组免疫复合肽

<222>(1)..(48)

<223>

<400>5

Claims (3)

1.一种基因工程猪口蹄疫重组免疫复合肽基因，其序列为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

2.一种基因表达的猪口蹄疫重组免疫复合肽，其序列为SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列。

3.一种高效表达权利要求2所述猪口蹄疫重组免疫复合肽基因工程菌株，其构建包括以下步骤：

1)猪口蹄疫重组免疫复合肽基因的重叠延伸拼接PCR扩增SOE-PCR：

设计三条PCR引物：

引物F1，SEQ.ID.NO.2：

5’-CCGGAATTCGGCGGCGGCGGCAGCGATGATGATGATAAAATTAGCATTAGCGAAATTAAAGGCGTG-3’

引物F2，SEQ.ID.NO.3：

5’-GGGGTGCTGCCGCCGCCGCCAAACAGAATGGTTTCAATTTTATGCACAATCACGCCTTTAATTTCG-3’

引物F3，SEQ.ID.NO.4：

5’-GCGGCGGCAGCACCCCGAACCTGAAACATGGCACCCCGAACCTGAAACATGGCTAAGTCGACTCG-3’

PCR反应体系50μl：10×PCR Buffer，5μL，MgCl₂，3μL；dNTP，10mmol/L，1μL；引物F1、F2和引物F3，终浓度为20pmol/L各2μL；TaKaRa ExTaq 0.5μL；灭菌超纯水，34.5μL；

PCR反应程序：94℃预变性2min，进入TD-PCR循环：94℃30s，退火温度55℃，每循环1min，共30个循环；72℃延伸6min，经过胶回收后获得猪口蹄疫重组免疫复合肽基因；

2)pET32a重组表达载体的构建

上述猪口蹄疫重组免疫复合肽基因PCR产物和pET32a均用EcoRI、SalI双酶切，T4DNA Ligase连接，连接产物转化E.coli DH5α，重组表达质粒进行EcoRI和SalI双酶切鉴定；酶切鉴定为阳性的质粒测序，命名为pET32a-KCMP；

3)重组表达质粒pET32a-KCMP转化大肠杆菌BL21，筛选阳性克隆，即为所获得的高效表达猪口蹄疫重组免疫复合肽基因的基因工程菌株。

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