CN102936602A

CN102936602A - 重组人胰岛素样生长因子-2蛋白及其生产方法

Info

Publication number: CN102936602A
Application number: CN2012104115293A
Authority: CN
Inventors: 吴东海; 李洪波; 胡兴; 徐爱民; 李鹏; 金守光; 李娜
Original assignee: Guangzhou Institute of Biomedicine and Health of CAS
Current assignee: Guangzhou Institute of Biomedicine and Health of CAS
Priority date: 2012-10-24
Filing date: 2012-10-24
Publication date: 2013-02-20

Abstract

本发明公开一种重组人胰岛素样生长因子-2蛋白及其生产方法，表达宿主BL21（DE3），载体pET32-a(+)，步骤如下：克隆hIGF2基因；构建原核表达载体；可溶性的N端带有His×6标记的Trx-hIGF2融合蛋白的表达；Trx-hIGF2融合蛋白的纯化；利用带His×6标记的肠激酶对Trx-hIGF2融合蛋白进行酶切，得高纯度的hIGF2。本发明首次用BL21（DE3）和pET32-a(+)，实现hIGF2高效可溶性融合表达；用His×6标签及肠激酶切割技术，实现在蛋白质一级结构上，与hIGF2完全相同的重组hIGF2蛋白的制备，表达产物也具有生物活性。

Description

重组人胰岛素样生长因子-2蛋白及其生产方法

技术领域

本发明涉及应用重组DNA技术生产基因工程蛋白药物技术，具体来说，涉及一种重组人胰岛素样生长因子-2蛋白及其生产方法。

背景技术

胰岛素样生长因子（insulin-like growth factor，IGF）是一类多功能细胞增殖调控因子，因其化学结构与胰岛素相似而得名。人胰岛素样生长因子-2（Human Insulin Like Growth Factor-2，hIGF2）基因由9个外显子、8个内含子组成，其转录与表达受到4个启动子调控，为一单拷贝基因，全长3kb。成熟的人IGF2蛋白由67个氨基酸残基组成，它在胎儿发育、肿瘤细胞增殖、肌肉生长等方面具有重要的调控作用。IGF2与有促进有丝分裂活性作用的胰岛素具有结构上的同源性，业已证明，IGF2至少在啮齿类动物中是促进有丝分裂的主要生长因子。体外细胞培养实验也已证明，IGF2是肌细胞生长过程中的自分泌信号。

IGF2是一种潜在的胎儿生长激素。IGF2的表达与个体发育密切相关，IGF2的缺乏与人类身材矮小相关，它们的过度表达与肢端肥大有关，IGF2还可调节脂肪细胞的生长，从而影响个体的脂肪与肌肉比例。除此之外，IGF2还在器官的形成和分化中发挥重要作用。IGF2作为调节多肽，与许多疾病的发生和发展密切相关，如一种先天性的疾病：贝-威综合症就是因为IGF2过度表达引起的。IGF2也与许多肿瘤的发生密切相关。IGF2基因的LOI已经在横纹肌肉瘤、平滑肌肉瘤、睾丸生殖细胞癌、乳腺癌及肺癌等20多种肿瘤中被发现，而且IGF2转基因小鼠中这些肿瘤的发生率也明显增高。这说明IGF2在肿瘤发生中可能有着十分重要的地位。近年来，多项研究已发现在结肠肿瘤及肝癌发生期间，IGF2mRNA的表达增强。IGF2的自分泌为某些细胞生长的初级方式，其旁分泌为广泛基质肿瘤如乳腺癌生长的主要方式，尚未发现IGF2经自分泌调节的肿瘤。IGF2是目前生物、医学领域研究的热点，随着其发生印迹机制的理解不断演进，深入研究IGF2的遗传学特征、表达机制及生物学意义，将有助于人类控制自身疾病，能为临床诊断和治疗带来新思路。因此，IGF2重组蛋白极具开发价值。

目前，主要利用大肠杆菌来生产重组人IGF2蛋白。而这些利用大肠杆菌来生产重组人IGF2蛋白的方法都有明显的缺陷。大肠杆菌的人IGF2表达产物通常以包涵体形式存在，要通过变性复性等复杂操作才能得到活性形式的hIGF2，从而减少了活性蛋白的产率；若想得到可溶性的重组蛋白，往往采取以融合蛋白的形式进行表达，而将融合片段去除是一件非常繁琐的工作，大大增加了生产的成本；最后，要得到高纯度的蛋白往往需要经过多步纯化操作处理，纯化的步骤越多，蛋白质的得率就会越低，且可能导致目标产物的失活。

发明内容

基于此，本发明提供一种重组hIGF2蛋白及其高效表达、纯化和制备方法，该方法首次利用重组载体pET32-a(+)和表达宿主大肠杆菌BL21 CodonPlus（DE3)菌株，实现了hIGF2的融合且可溶表达，并获得了大量稳定、可溶且具有生物活性的hIGF2重组蛋白，该蛋白在一级结构上与天然人IGF2完全相同。利用镍亲合层析可以快速将蛋白从细胞裂解上清液中分离出来，获得高纯度的Trx-hIGF2融合蛋白。利用N端带有His×6标记的肠激酶对Trx-hIGF2融合蛋白进行酶切，经镍亲合层析，将未经切割的Trx-hIGF2融合蛋白、Trx-His×6融合片段及加入的肠激酶吸附于层析柱上，而经切割的hIGF2重组蛋白存在于穿透液中，穿透液经超滤浓缩后得到高纯度的产品。利用该方法得到的hIGF2重组蛋白，能刺激NIH/3T3的增殖并激活Akt信号通路的磷酸化，表明该方法制备的重组人IGF2具有很好的生物学活性。

解决上述问题的技术方案如下：

一种Trx-hIGF2融合蛋白的生产方法，主要包括以下步骤：

（1）克隆hIGF2基因：以人肾脏细胞中提取的总mRNA为模板，先用RT-PCR扩增总cDNA，再以该cDNA为模板，用特异引物扩增出完整hIGF2基因片段，所用hIGF2特异引物中引入BamH I酶切位点和HindIII酶切位点；回收PCR产物连接到质粒pMD20-T载体，得重组质粒hIGF2/pMD20-T，经过测序确定为读码框正确的重组载体；

（2）构建原核表达载体：将表达载体pET32-a(+)和步骤（1）所得的重组质粒hIGF2/pMD20-T经Hind III及BamH I双酶切并纯化回收，并用T4DNA连接酶连接，得重组载体pET32-a(+)/hIGF2，将重组载体转化到大肠杆菌TOP10菌株中，再从TOP10中提取重组载体pET32-a(+)/hIGF2；用热激法，将重组载体pET32-a(+)/hIGF2转入到大肠杆菌表达菌株BL21CodonPlus（DE3）中，经LBAmp抗性平板筛选得到大肠杆菌重组转化子；

（3）Trx-hIGF2融合蛋白的表达：将步骤（2）所得的大肠杆菌重组转化子于37℃培养至OD₆₀₀为0.55－0.65，加入0.05－1.0mM的IPTG，于温度为20℃的条件下诱导5-7小时，超声破碎，离心取上清液，得到大量表达的可溶性的N端带有His×6标记的Trx-hIGF2融合蛋白；

（4）Trx-hIGF2融合蛋白的纯化：利用镍亲合层析法对步骤（3）所得的Trx-hIGF2融合蛋白进行纯化。

一种hIGF2重组蛋白的生产方法，主要包括以下步骤：

（2）构建原核表达载体：将表达载体pET32-a(+)和步骤（1）所得的重组质粒hIGF2/pMD20-T经Hind III及BamH I双酶切并纯化回收，并用T4DNA连接酶连接，得重组载体pET32-a(+)/hIGF2，将重组载体转化到大肠杆菌TOP10菌株中，再从TOP10中提取重组载体pET32-a(+)/hIGF2；用热激法，将重组载体pET32-a(+)/hIGF2转入到大肠杆菌表达菌株BL21 CodonPlus（DE3）中，经LBAmp抗性平板筛选得到了大肠杆菌重组转化子；

（4）Trx-hIGF2融合蛋白的纯化：利用镍亲合层析法对步骤（3）所得的Trx-hIGF2融合蛋白进行纯化;

（5）利用带有His×6标记的肠激酶对步骤（4）所得的Trx-hIGF2融合蛋白进行酶切，经镍亲合层析，未经切割的Trx-hIGF2融合蛋白、Trx-His×6蛋白片段及加入的肠激酶吸附在镍亲合层析树脂上，而经切割的不带His×6的hIGF2重组蛋白存在于穿透液中，穿透液经超滤浓缩后得到hIGF2重组蛋白。

在其中一些实施例中，步骤（1）所述hIGF2特异引物为：

hIGF2-上游引物：5’-GCGGATCCGCTTACCGCCCCAGTGAGAC-3’

hIGF2-下游引物：5’-GCTTAGTCTAGATCGGACTTGGCGGGGGTAG-3’。

在其中一些实施例中，步骤（2）所述的表达载体为pET32-a(+)，表达菌株为大肠杆菌BL21CodonPlus（DE3）。

在其中一些实施例中，步骤（4）所述的镍亲合层析方法中，所用的洗脱液为含有300mM咪唑的pH 8.0 Tris-HCl溶液；所得的Trx-hIGF2融合蛋白纯度为90%以上。

在其中一些实施例中，步骤（5）所述浓缩后的hIGF2重组蛋白纯度为95%以上。

本发明所述的一种重组hIGF2蛋白及其生产方法具有以下优点：

一是利用pET32-a(+)载体和BL21 CodonPlus（DE3）菌株，实现了表达产物与增溶因子Trx融合，得到可溶形式的hIGF2重组蛋白，优化了可溶性重组蛋白的表达条件；

二是表达产物带有His×6标签，摸索出一条有效纯化重组融合hIGF2蛋白的方法；

三是利用带有His×6标记的肠激酶对Trx-hIGF2融合蛋白进行酶切，经镍亲合层析，将未经切割的的Trx-hIGF2融合蛋白、Trx-His×6蛋白片段及加入的肠激酶吸附在镍亲合层析树脂上，而经切割的在氨基酸一级结构上与天然hIGF2完全相同的重组hIGF2蛋白存在于穿透液中，穿透液经超滤浓缩后得到高纯度的hIGF2重组蛋白，所得蛋白经MODLI-TOF-TOF确定为hIGF2蛋白；该蛋白在一级结构上与天然的hIGF2完全相同，既保证了hIGF2重组蛋白的生物学活性也高效地获得了大量稳定的与天然hIGF2一级结构完全相同的重组蛋白。

四是测定了大肠杆菌表达的hIGF2重组蛋白的生物活性，测定结果表明：利用该方法得到的hIGF2重组蛋白，能刺激NIH/3T3的增殖并激活Akt信号通路的磷酸化。

附图说明

图1为hIGF2基因PCR结果示意图；

图2为载体构建示意图；

图3为表达载体的酶切验证图；

图4为表达产物的优化图；

图5为表达产物的纯化及验证图；

图6为融合蛋白的切割及纯化图；

图7为重组人IGF2的质谱验证结果；

图8-A为表达产物刺激NIH/3T3细胞增殖实验分析图；

图8-B为表达产物激活Akt信号通路的磷酸化结果分析图。

具体实施方式

本发明选用大肠杆菌表达菌株BL21 CodonPlus（DE3）、载体扩增菌株TOP10和表达载体pET32-a(+)均购自美国Invritrogen公司。

所用的培养基配方如下：

1）LB液体培养基：NaCl 10g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，蒸馏水1L，高压灭菌，室温保存；

2）LB/Amp平板：NaCl 10g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，蒸馏水1L，琼脂粉15g，高压灭菌后，冷却至70℃以下，加入1mL氨苄青霉素（Ampicillin）（100mg/ml），充分混均后倒板，4℃避光保存；

3）LB/Amp培养基：NaCl 10g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，蒸馏水1L，高压灭菌后，冷却至70℃以下，加入1mL氨苄青霉素（100mg/ml），充分混均，4℃保存；

4）50×TAE琼脂糖凝胶电泳缓冲液：Tris碱121g，冰乙酸28.6mL，0.5mol/LEDTA（pH 8.0)50mL，加蒸馏水定容至500mL，室温保存；

5）50mg/mL氨苄青霉素保存液：氨苄青霉素0.5g，加蒸馏水溶解并定容至10mL，分装后于-20℃保存；

6）5×SDS-PAGE上样缓冲液：1M Tris-HCl（pH 6.8)1.25mL，SDS 0.5g，BPB25mg，甘油2.5mL，加去离子水溶解后定容至5mL，分装（每份约500μL）后于室温保存，使用时每份加入25μL β-巯基乙醇混匀；

7）5×SDS-PAGE电泳缓冲液：Tris 15.1g，甘氨酸94g，SDS 5.0g，加入约800mL去离子水，充分搅拌溶解后定容至1L，室温保存；

8）考马斯亮蓝R-250染色液：考马斯亮蓝R-2500.25g，加入225mL甲醇、46mL的冰乙酸、225mL去离子水并搅拌均匀，滤纸去除颗粒物质后，室温保存；

9）考马斯亮蓝脱色液：冰乙酸50mL，甲醇150mL，去离子水300mL，充分混合后，室温保存；

所述一种重组人胰岛素样生长因子-2（hIGF2）蛋白的生产方法，主要包括以下步骤：

1、克隆hIGF2基因

设计一对引物，以人肾脏细胞中提取的总mRNA为模板，先用RT-PCR扩增总cDNA，再用hIGF2特异引物扩增出完整人重组hIGF2基因片段，所用hIGF2特异引物中引入BamH I酶切位点和HindIII酶切位点，PCR条件为：95℃预变性，4min，一个热循环；94℃热变性30s，55℃褪火30s，72℃延伸30s，34个热循环；72℃复性10min。所获得的扩增片断连接到pMD20-T载体（购自于广州TAKARA公司），得到重组质粒hIGF2/pMD20-T，用PCR，酶切和核酸测序鉴定，测定序列与Genebank公布的hIGF2的序列一致。

hIGF2特异引物为：

SEQ ID NO:1：

hIGF2-上游引物：5’-GCGGATCCGCTTACCGCCCCAGTGAGAC-3’（斜体加下划线部分序列代表BamH I酶切位点）；

SEQ ID NO:2：

hIGF2-下游引物：5’-GCTTAGTCTAGATCGGACTTGGCGGGGGTAG-3’；（斜体加下划线部分序列代表HindIII酶切位点）

PCR结果如图1所示。

2、构建原核表达载体

（1）用经过Hind III和BamH I双酶切重组质粒hIGF2/pMD20-T，获得目的片断hIGF2，反应体系如下（所用内切酶及缓冲液均购自大连TAKARA公司）：

（2）用Hind III和BamH I双酶切pET32-a(+)，获得载体片断，反应体系如下（所用内切酶及缓冲液均购自大连TAKARA公司）：

（3）由（1）及（2）步骤后所得目的片断和载体片断，DNA凝胶收回试剂盒回收，该试剂盒购自大连TAKARA公司，具体操作按试剂盒说明书进行。载体构建示意图见图2。

（4）回收得到的目的片断和载体用T4DNA连接酶（购自大连TAKARA公司）进行连接反应，反应体系如下：

得重组载体pET32a(+)/hIGF2。

（5）转化重组载体至大肠杆菌TOP10

pET32a(+)/hIGF2连接产物转化E.coli TOP10感受态细胞，涂板，37℃恒温培养箱中培养12小时；挑取培养板上长出的转化子，接入5mLA⁺/LB液体培养基中，37℃摇床培养过夜，提取重组质粒；对来自不同单克隆菌落的重组质粒进行酶切，15μL酶切体系：

酶切条件：37℃水浴，3h。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳检测，鉴定克隆结果，表达载体的酶切验证图（如图3所示）。

（6）转化重组载体至大肠杆菌表达菌株BL21 CodonPlus（DE3）

将阳性克隆的质粒热激转化到大肠杆菌株BL21 CodonPlus（DE3)感受态细胞，涂板（LB Amp抗性平板），37℃恒温培养箱中培养12小时，得到大肠杆菌重组转化子；

3、Trx-hIGF2融合蛋白的表达

得到的大肠杆菌重组转化子在37℃培养至OD₆₀₀为0.6时分别加入0mM、0.05mM、0.1mM、0.2mM、0.5mM和1.0mM的IPTG，分别于20℃和37℃诱导6小时，超声破碎后，离心取上清，得含目标蛋白的可溶蛋白，加入SDS-PAGE样品缓冲液，对其可溶蛋白进行分析，经比较分析，确定在低温条件下（20℃），即使使用低浓度的IPTG（0.05mM），在很短的时间内（6小时），就能实现融合蛋白N端带有His×6标记的Trx-hIGF2融合蛋白的高水平可溶性表达，表达产物的优化图（如图4所示）；

4、Trx-hIGF2融合蛋白的纯化

大肠杆菌重组转化子经扩大培养和诱导表达（20℃，0.05mM IPTG诱导6小时），收集经IPTG诱导后的表达菌的菌体，将菌体重悬液于50ml缓冲液A（50mM Tris-HCl，300mM NaCl，20mM咪唑和1mM蛋白酶抑制剂PMSF，pH 8.0）用超声破碎仪进行破碎，功率300W，破碎5s，间隙9s，90次；破碎后的菌液进行离心，4℃，30000g，15min；离心所得到的上清液加入到经缓冲液A预平衡的镍亲合层析柱中；经200ml缓冲液B（50mM Tris-HCl，300mMNaCl，20mM咪唑和1mM PMSF，0.5%-1% Triton X-114，pH 8.0，于冰浴中保存）漂洗蛋白纯化柱后（以上所有操作均在4℃进行）；加入不同浓度咪唑的（100 mM，200mM和300mM)缓冲液C（50mM Tris-HCl，pH 8.0，300mM NaCl)将蛋白洗脱下来，结果表明：利用300mM的咪唑可以得到纯度达90%的重组蛋白，融合蛋白的分子量约为25-30kDa（图5A所示）；所得蛋白经WB分析，结果表明，该蛋白是Trx-hIGF2融合蛋白（图5B所示）；经上述纯化步骤，1L诱导表达的菌液可纯化得到约20mg的N端带有His×6标记的Trx-hIGF2融合蛋白。

5、利用带有His×6标记的肠激酶对上述所得的Trx-hIGF2融合蛋白进行酶切，经镍亲合层析，将未经切割的Trx-hIGF2融合蛋白、Trx-His×6蛋白片段及加入的肠激酶吸附在镍亲合层析树脂上，而经切割的在氨基酸一级结构上与天然人IGF2完全相同的重组hIGF2蛋白存在于穿透液中，穿透液经超滤浓缩后得到纯度为96%的IGF2重组蛋白（融合蛋白的切割及纯化图如图6），各步骤的目标蛋白得率结果如表1所示，所得蛋白经MODLI-TOF-TOF确定为重组hIGF2蛋白（质谱验证结果如图7）。

表1重组融合蛋白hIGF2的纯化结果

Table 1 Purification of recombinant fusion hIGF2

6、hIGF2重组蛋白的生物学活性分析

（A）将NIH/3T3细胞于10cm细胞培养板中，在含10% FBS的DMEM培养基中培养至细胞密度达90%以上。PBS洗涤细胞2次后，加入胰酶消化1分钟，终止消化并加入含10%FBS的DMEM培养基，并将细胞制成细胞悬液；800rpm离心5min后收集细胞，向收集的细胞中加入含10%FBS的DMEM（经CM阳离子柱处理过的）培养基，调节细胞密度至1×10⁵-2×10⁵cell/ml。将上述细胞悬液加至96孔板中，每孔加100μl，并向每孔中加入不同浓度的重组人IGF2蛋白。将细胞培养板于温箱中培养72h，向每个孔中加入10μl MTT，于温箱中培养4小时，吸去培养基，向每孔中加入100μl的DMSO，震荡10分钟后于575nm测定吸光值。细胞增殖实验表明，纯化得到的重组人IGF2具有促进NIH/3T3增殖的功能。表明该方法测得的重组人IGF2蛋白具有生物活性（图8-A）。

（B）将NIH/3T3细胞于10cm细胞培养板中，在含10%FBS的DMEM培养基中培养至细胞密度达90%以上。PBS洗涤细胞2次后，加入胰酶消化1分钟，终止消化并加入含10%FBS的DMEM培养基，将细胞制成细胞悬液。将细胞悬液于6孔板中培养至细胞密度约为80-90%时，吸去培养基，仅加入DMEM培养液，于温箱中饥饿6小时。向上述各孔细胞中加入不同终浓度的重组hIGF2蛋白，于细胞培养箱中培养30分钟后，加入100μL的RIPA裂解细胞，离心收集蛋白上清；每个时间分别做3个重复；收集的蛋白上清经测定浓度后，调整各样品蛋白至相同浓度，经10%SDS-PAGE后，转膜、封闭、一抗、二抗及显影；WB结果表明，在该浓度下(10ng/ml)经30分钟后Akt的磷酸化水平明显提高，该方法表达和纯化的重组hIGF2能激活相关信号通路，表达纯化的产物具有生物活性（图8-B）。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种Trx-hIGF2融合蛋白的生产方法，其特征在于，主要包括以下步骤：

2.一种hIGF2重组蛋白的生产方法，其特征在于，主要包括以下步骤：

（2）构建原核表达载体：将表达载体pET32-a(+)和步骤（1）所得的重组质粒hIGF2/pMD20-T经Hind III及BamH I双酶切并纯化回收，并用T4DNA连接酶连接，得重组载体pET32-a(+)/hIGF2，将重组载体转化到大肠杆菌TOP10菌株中，再从TOP10中提取重组载体pET32-a(+)/hIGF2；用热激法，将重组载体pET32-a(+)/hIGF2转入到大肠杆菌表达菌株BL21CodonPlus（DE3）中，经LBAmp抗性平板筛选得到了大肠杆菌重组转化子；

3.根据权利要求1或2所述的生产方法，其特征在于，步骤（1）所述hIGF2特异引物为：

hIGF2-上游引物：5’-GCGGATCCGCTTACCGCCCCAGTGAGAC-3’

hIGF2-下游引物：5’-GCTTAGTCTAGATCGGACTTGGCGGGGGTAG-3’。

4.根据权利要求1或2所述的生产方法，其特征在于，步骤（2）所述的表达载体为pET32-a(+)，表达菌株为大肠杆菌BL21 CodonPlus（DE3）。

5.根据权利要求1或2所述的生产方法，其特征在于，步骤（4）所述的镍亲合层析方法中，所用的洗脱液为含有300mM咪唑的pH 8.0 Tris-HCl溶液；所得的Trx-hIGF2融合蛋白纯度为90%以上。

6.根据权利要求2所述的生产方法，其特征在于，步骤（5）所述浓缩后的hIGF2重组蛋白纯度为95%以上。

7.根据权利要求2－6任一项所述的生产方法制得的hIGF2重组蛋白。