ES2281822T3 - Vectores de expresion, celulas huesped transformadas y procedimiento de fermentacion para la produccion de polipeptidos recombinantes. - Google Patents
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Abstract
Un vector de expresión, que comprende un polinucleótido que codifica una proteína de fusión que comprende la secuencia de señal del gen gac de Pseudomonas diminuta y un polipéptido de interés distinto del gac de Pseudomonas diminuta, en donde dicha secuencia de señal y dicho polipéptido de interés están conectados de tal modo que durante la expresión del polinucleótido en una célula huésped adecuada la secuencia de señal se segmenta de la proteína de fusión y el polipéptido de interés se libera al periplasma de la célula huésped.
Description
Vectores de expresión, células huésped
transformadas y procedimiento de fermentación para la producción de
polipéptidos recombinantes.
La presente invención se refiere a un vector de
expresión que comprende un polinucleótido que codifica una proteína
de fusión que comprende la secuencia de señal del gen gac de
Pseudomonas diminuta y un polipéptido de interés, a una
célula huésped procariótica transformada con tal vector de expresión
y a un procedimiento para la producción de un polipéptido de
interés que usa dicha célula huésped y dicho vector de
expresión.
Es una materia de la presente invención
proporcionar un procedimiento para la producción eficaz y directa
de un polipéptido recombinante maduro en una célula huésped
procariótica. El procedimiento de acuerdo con la presente
invención, por ejemplo, puede usarse favorablemente para la
producción de interferón alfa 2B humano recombinante
(rhIFN\alpha2B) en Escherichia coli (E. coli).
En la producción de proteínas recombinantes en
microorganismos procarióticos, tal como la expresión de proteínas
eucarióticas humanas u otras en células bacterianas, a menudo es
difícil obtener un extremo N claramente definido que sea tan
homogéneo casi al 100% como sea posible. Esto se aplica en
particular a proteínas farmacéuticas recombinantes cuya secuencia
de aminoácidos en muchos casos debe ser idéntica a la secuencia de
aminoácidos presente naturalmente en seres humanos/animales. Sin
embargo, cualquier heterogeneidad o desviación de la secuencia
natural es inaceptable en muchos casos debido a que estos productos
muestran frecuentemente diferentes propiedades inmunológicas (por
ejemplo, inducción de la formación de anticuerpos) y farmacológicas
(semivida, farmacocinética). Por estas razones, es necesario en la
mayoría de los casos producir un producto idéntico al natural
(homogéneo y sin aminoácidos extraños en el extremo N).
Durante la expresión natural, por ejemplo, en
seres humanos, muchas proteínas farmacéuticas que están en uso se
transportan al espacio extracelular y la segmentación de la
secuencia de señal presente en la proteína precursora con este
propósito da como resultado un extremo N claramente definido. Tal
extremo N homogéneo no siempre es fácil de producir, por ejemplo en
células bacterianas, por varias razones.
La síntesis de todas las proteínas citoplásmicas
en microorganismos procarióticos comienza con una metionina debido
al codón de iniciación ATG, que es tanto un sitio de iniciación de
la traducción como el codón para la metionina. Dependiendo de la
estructura del segundo aminoácido después de la metionina
N-terminal, esta metionina puede ser segmentada por
una metionina aminopeptidasa (MAP) de la célula huésped, conduciendo
a una mezcla de un producto que se inicia bien con Met o bien con
el segundo aminoácido. La separación de estas dos especies es muy
difícil y conduce a rendimientos reducidos. En la producción
citoplásmica recombinante de un polipéptido, es habitual que una
proporción no poco considerable (1-50%) del
polipéptido permanezca inalterada por la MAP. Por lo tanto, la
producción de polipéptidos recombinantes usando un sistema de
expresión de Met citoplásmico a menudo es altamente
desfavorable.
Otra posibilidad para producir un polipéptido
recombinante maduro a través de una ruta citoplásmica es la
producción de una proteína de fusión N-terminal con
segmentación in vitro química o enzimática subsiguiente. Sin
embargo, en muchos casos, el extremo N de la proteína de fusión no
es fácilmente accesible a la segmentación enzimática conduciendo a
bajas velocidades de segmentación o ausencia de segmentación total.
Esto puede deberse a que el extremo N sea estructuralmente
inaccesible.
Además, las proteínas recombinantes se expresan
en el citoplasma de microorganismos procarióticos en un estado
reducido con el efecto de que los enlaces disulfuro a menudo
necesarios para el plegamiento y la función correctos de la
proteína no se forman o no se forman correctamente. Los polipéptidos
recombinantes que contienen enlaces disulfuro pueden necesitar por
lo tanto una difícil oxidación in vitro.
Además, la expresión citoplásmica conduce a
menudo a la formación de cuerpos de inclusión, que tienen que
solubilizarse bajo condiciones desnaturalizantes seguido por un
replegamiento hasta la estructura natural antes del procedimiento de
purificación real.
Por otra parte, la expresión periplásmica podría
dar directamente un producto con las propiedades deseadas:
- (i)
- Extremo N maduro correcto mediante segmentación de una secuencia de señal periplásmica mediante el aparato de peptidasa de señal de la célula huésped
- (ii)
- Expresión soluble debida al plegamiento correcto
- (iii)
- Formación de enlaces disulfuro correcta debido al medio oxidativo en el periplasma muy similar al encontrado en el fluido extracelular humano (donde esta molécula se encuentra naturalmente).
De acuerdo con esto, por lo tanto, un objetivo
de la presente invención es proporcionar un sistema de expresión
periplásmico que sea adecuado para la producción de un polipéptido
recombinante de interés en una célula huésped procariótica.
Se ha encontrado ahora sorprendentemente dentro
del contexto de la presente invención que un vector de expresión
que codifica la secuencia de señal del gen de glutaril
7-ACA acilasa (gen gac) de Pseudomonas
diminuta y un polipéptido de interés es particularmente
adecuado para el uso en un procedimiento para la producción
recombinante del polipéptido.
En un aspecto, la presente invención se refiere
así a un vector de expresión que comprende un polinucleótido que
codifica una proteína de fusión que comprende la secuencia de señal
del gen gac de Pseudomonas diminuta y un polipéptido de
interés distinto de gac de Pseudomonas diminuta, en donde
dicha secuencia de señal y dicho polipéptido de interés están
conectados de tal modo que durante la expresión del polinucleótido
en una célula huésped adecuada la secuencia de señal se segmenta de
la proteína de fusión y el polipéptido de interés se libera al
periplasma de la célula huésped.
De acuerdo con la presente invención, puede
producirse una variedad de polipéptidos de interés mediante la
utilización del vector de expresión. Por ejemplo, el polipéptido de
interés puede seleccionarse del grupo que consiste en un
interferón, una interleuquina, una hormona de crecimiento, un factor
de crecimiento, una citoquina, una enzima, un inhibidor de enzima,
un anticuerpo y un fragmento de anticuerpo, y similares, por
ejemplo interferón alfa 2A, interferón alfa 2B,
interleuquina-3, interleuquina-6,
hormona del crecimiento humana, insulina, factor estimulante de
colonias de granulocitos, factor estimulante de colonias de
granulocitos-macrófagos, factor estimulante de
colonias de macrófagos, interferón beta 1, somatropina bovina,
somatropina porcina, interleuquina-11,
interleuquina-2, un fragmento Fab y péptidos
pequeños tales como calcitonina, hormona paratiroidea (PTH) o un
glucagón. Preferiblemente, dentro del alcance de la presente
invención, el polipéptido de interés es un interferón 2 humano
recombinante, en particular interferón alfa 2A humano o interferón
alfa 2B humano, prefiriéndose particularmente el último para ser el
polipéptido de interés.
Con respecto al polinucleótido que codifica la
parte de la proteína de fusión que es el polipéptido de interés,
puede usarse un cDNA o un polinucleótido sintético. Si un cDNA o un
polinucleótido sintético dado correspondiente a una secuencia
génica presente en la naturaleza se expresa solo pobremente, la
estructura del cDNA o el polinucleótido sintético puede adaptarse a
la célula huésped respectiva mediante optimización de codones.
A este respecto, dentro de una modalidad
preferida de la presente invención, el polinucleótido que codifica
el polipéptido de interés que es rhIFN\alpha2B comprenderá la
siguiente secuencia de nucleótidos (Nº ID SEC 1)
donde 48 de 165 codones del
interferón alfa 2B humano presente en la naturaleza se han alterado
con respecto a la secuencia de nucleótidos sin cambiar la secuencia
de
aminoácidos.
Con respecto a la cepa de Pseudomonas
diminuta, cualquier cepa de Pseudomonas diminuta que
exhiba una actividad de ácido
glutaril-7-aminocefalospórico
acilasa tendrá un gen gac que codifica una secuencia de señal
adecuada.
Por ejemplo, tal cepa de Pseudomonas
diminuta se ha descrito en la Patente Checa Nº CZ 278.515 bajo
la denominación Nº CCM 3987.
Tal cepa de Pseudomonas diminuta tiene el
gen que codifica la enzima
glutaril-7-ACA-acilasa,
abreviada gac.
Una modalidad preferida de la presente invención
se refiere al vector de expresión de acuerdo con la presente
invención, en donde dicha secuencia de señal de gen gac de
Pseudomonas diminuta, que forma parte de dicha proteína de
fusión, comprende la secuencia de aminoácidos (Nº ID SEC 2)
- MLRVLHRAASALVMATVIGLAPAVAFA.
Por ejemplo, tal secuencia de aminoácidos puede
estar codificada por la siguiente secuencia polinucleotídica (Nº ID
SEC 3)
Asimismo, puede usarse una secuencia
polinucleotídica en la que los nucleótidos se han alterado a fin de
crear un sitio de enzima de restricción con tal de que tales
mutaciones sean silenciosas, es decir, no cambien la secuencia de
aminoácidos de la secuencia de señal de gac según se esboza
anteriormente.
De acuerdo con esto, otro ejemplo para una
secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia de señal de gac
puede ser (Nº ID SEC 4)
en donde, en comparación con la
secuencia polinucleotídica mencionada anteriormente, se ha
introducido una sola mutación (C\rightarrowG) con respecto al
último nucleótido del codón 23, para obtener un sitio de enzima de
restricción (sitio Sac 11) que puede usarse en una clonación
adicional.
Otra modalidad preferida de la presente
invención se refiere al vector de expresión de acuerdo con la
presente invención, en donde dicho vector es un plásmido. Puede
usarse un plásmido de número de copias bajo (aproximadamente
1-10 copias por célula), medio (aproximadamente
10-50 copias por célula) o alto (aproximadamente
>50 copias por célula). Estas definiciones se aplican si tal
plásmido se usa en un ambiente favorable, y tales números de copias
pueden ser inferiores bajo ciertas condiciones de fermentación, por
ejemplo bajo condiciones de temperatura reducida. Para sistemas
inducibles fuertes, un replicón básico de número de copias medio
(por ejemplo, pBR322) puede ser adecuado, para la expresión basal
fuerte a partir de elementos de expresión de fuerza baja o media
(promotor, RBS, gen estructural) puede ser más adecuado un replicón
de alto número de copias (por ejemplo, plásmidos de la serie pUC).
En el contexto de la presente invención, en particular con respecto
a la producción de rhIFN\alpha2B, se usa preferiblemente un
plásmido de alto número de copias. De cuerdo con esto, una
modalidad preferida adicional de la presente invención se refiere a
un vector de expresión de acuerdo con la presente invención, en
donde dicho vector es un plásmido de alto número de copias.
Elementos adicionales del vector de expresión de
acuerdo con la presente invención comprenden elementos de
transcripción y traducción, en particular un promotor y un sitio de
unión ribosómica (RBS).
Para la expresión periplásmica, el sitio de
unión ribosómica no debe ser ni demasiado fuerte ni demasiado
débil. Lo primero podría conducir a un sobreesfuerzo del aparato de
exportación de proteínas periplásmico (translocasa, etc.) y a la
deposición de proteína de fusión no segmentada (a menudo insoluble)
en el citoplasma. Lo segundo podría conducir a rendimientos de
proteína pobres. La situación a nivel de transcripción (promotor)
es similar a la que existe a nivel de traducción (RBS). La
transcripción no debe ser ni demasiado fuerte ni demasiado débil
para evitar los fenómenos descritos. Además, el comienzo repentino
de la producción de proteína cuando se usa un promotor inducible
puede provocar problemas con el "taponamiento" del aparato de
exportación o al menos requerirá un ajuste fino intensivo de la
etapa de inducción y los parámetros de fermentación. Esto conducirá
a menudo a procesos no
robustos.
robustos.
Se ha encontrado que en el contexto de la
presente invención la región promotora y el sitio de unión
ribosómica del gen gac de Pseudomonas diminuta son
particularmente adecuados para servir como elementos reguladores de
la transcripción y la traducción.
Por lo tanto, una modalidad preferida comprende
un vector de expresión de acuerdo con la presente invención, en
donde dicho vector comprende además un polinucleótido que comprende
la región promotora y el sitio de unión ribosómica del gen gac de
Pseudomonas diminuta, polinucleótido que está conectado
operativamente al polinucleótido que codifica la proteína de fusión
que comprende la secuencia de señal y el polipéptido de interés.
\newpage
En una modalidad preferida adicional del mismo,
dicho polinucleótido que comprende la región promotora y el sitio de
unión ribosómica comprende la secuencia de nucleótidos (Nº ID SEC
5)
En una modalidad preferida adicional más del
mismo, dicho polinucleótido que comprende la región promotora y el
sitio de unión ribosómica comprende la secuencia de nucleótidos (Nº
ID SEC 6)
Elementos adicionales pueden estar presentes en
un vector de expresión de acuerdo con la presente invención, según
sea apropiado.
Por ejemplo, un vector de expresión de acuerdo
con la presente invención puede comprender un polinucleótido que
comprende uno o más terminadores de la transcripción.
Asimismo, un vector de expresión de acuerdo con
la presente invención puede comprender un polinucleótido que
codifica uno o más marcadores seleccionables, por ejemplo, para
proporcionar resistencia a antibióticos de una célula huésped
transformada. Marcadores seleccionables adecuados son ampliamente
conocidos en la técnica. En el contexto de la presente invención,
el vector de expresión comprende favorablemente un polinucleótido
que comprende un gen de resistencia a tretraciclina.
Adicionalmente, cuando es adecuado, pueden estar
presentes elementos reguladores adicionales en un vector de
expresión de acuerdo con la presente invención. Los elementos
reguladores son ampliamente conocidos en la técnica, como un
represor o un potenciador.
En un aspecto adicional, la presente invención
se refiere a células huésped procarióticas que se transforman con
un vector de expresión de acuerdo con la presente invención para
poder llevar a cabo la expresión del polipéptido de interés.
Por lo tanto, la presente invención se refiere a
una célula huésped procariótica transformada con un vector de
expresión que es compatible con la célula huésped, comprendiendo
dicho vector un polinucleótido que codifica una proteína de fusión
que comprende la secuencia de señal del gen gac de Pseudomonas
diminuta y un polipéptido de interés distinto de gac de
Pseudomonas diminuta, en donde dicha secuencia de señal y
dicho polipéptido de interés están conectados de tal modo que
durante la expresión del polinucleótido en una célula huésped
adecuada la secuencia de señal se segmenta de la proteína de fusión
y el polipéptido de interés se libera al periplasma de la célula
huésped.
Ejemplos para polipéptidos de interés adecuados
son los que se mencionan anteriormente. Una de sus modalidades
preferidas se refiere a tal célula huésped procariótica, en donde el
polipéptido de interés es un interferón alfa 2. En particular, tal
interferón alfa 2 se selecciona del grupo que consiste en interferón
alfa 2A e interferón alfa 2B, prefiriéndose el último.
Otra de sus modalidades preferidas se refiere a
una célula huésped de acuerdo con la presente invención, en la que
dicho vector es un plásmido, preferiblemente un plásmido de alto
número de copias.
La presente invención se refiere además a una
célula huésped de acuerdo con la presente invención, en donde dicha
secuencia de señal del gen gac de Pseudomonas diminuta
comprende la secuencia de aminoácidos (Nº ID SEC 2)
- MLRVLHRAASALVMATVIGLAPAVAFA.
En un aspecto adicional, la presente invención
se refiere a la célula huésped de acuerdo con la presente invención,
en la que el vector comprende además un polinucleótido que
comprende la región promotora y el sitio de unión ribosómica del
gen gac de Pseudomonas diminuta, polinucleótido que está
conectado operativamente al polinucleótido que codifica la proteína
de fusión que comprende la secuencia de señal y el polipéptido de
interés.
Tal polinucleótido que comprende la región
promotora y el sitio de unión ribosómica comprende preferiblemente
la secuencia de nucleótidos (Nº ID SEC 5)
En una de sus modalidades preferidas
adicionales, tal polinucleótido comprende la región promotora y el
sitio de unión ribosómica comprende la secuencia de nucleótidos (Nº
ID SEC 6)
Con respecto a las células huésped
procarióticas, preferiblemente, dicha célula huésped de acuerdo con
la presente invención es una célula bacteriana Gram negativa.
Preferiblemente, tal célula bacteriana se selecciona del grupo que
consiste en Escherichia coli (E. coli), especies de
Pseudomonas, especies de Enterobacter, especies de Campylobacter y
especies de Vitreoscilla, prefiriéndose particularmente E.
coli. Preferiblemente, se usarán derivados de E. coli K
12 debido a que tales cepas tienen una larga historia de uso seguro
y son particularmente adecuadas para la expresión periplasmática.
Asimismo, pueden usarse otros tipos de E. coli, por ejemplo
derivados de E. coli B.
En una modalidad preferida de la presente
invención, la célula huésped procariótica se deriva de E.
coli W3110 (ATCC 27325). Tal cepa se ha depositado en the
American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard,
Manassas, VA 20110-2209, EE.UU. de A., el 28 de
febrero de 2001, bajo el Nº de Registro
PTA-3132.
E. coli W3110 (ATCC 27325) y la cepa
depositada ATCC PTA-3132 pueden caracterizarse
genéticamente como sigue:
Escherichia coli K-12
[F^{-} mcrA mcrB IN(rrnD-rrnE)I
lambda].
Un aspecto adicional de la presente invención se
refiere a un procedimiento para la producción de un polipéptido de
interés, que comprende
- (i)
- proporcionar una célula huésped procariótica transformada con un vector de expresión que es compatible con la célula huésped, comprendiendo dicho vector un polinucleótido que codifica una proteína de fusión que comprende la secuencia de señal del gen gac de Pseudomonas diminuta y un polipéptido de interés distinto de gac de Pseudomonas diminuta, en donde dicha secuencia de señal y dicho polipéptido de interés están conectados de tal modo que durante la expresión del polinucleótido en una célula huésped adecuada la secuencia de señal se segmenta de la proteína de fusión y el polipéptido de interés se libera al periplasma de la célula huésped, y
- (ii)
- cultivar la célula huésped procariótica bajo condiciones que provocan la expresión del polinucleótido, con lo que durante la formación de la proteína de fusión la secuencia de señal se segmenta de la proteína de fusión y el polipéptido de interés se libera en periplasma de la célula huésped.
Opcionalmente, el procedimiento de acuerdo con
la presente invención comprende además el aislamiento del
polipéptido de interés.
Ejemplos para polipéptido de interés adecuados
son los que se mencionan anteriormente. Una de sus modalidades
preferidas se refiere a tal célula huésped procariótica, en donde el
polipéptido de interés es un interferón alfa 2. En particular, tal
interferón alfa 2 se selecciona del grupo que consiste en interferón
alfa 2A e interferón alfa 2B, prefiriéndose el último.
Otra de sus modalidades preferidas se refiere al
procedimiento de acuerdo con la presente invención, en el que dicho
vector es un plásmido, preferiblemente un plásmido de alto número de
copias.
La presente invención se refiere además a un
procedimiento de acuerdo con la presente invención, en el que dicha
secuencia de señal del gen gac de Pseudomonas diminuta
comprende la secuencia de aminoácidos (Nº ID SEC 2)
- MLRVLHRAASALVMATVIGLAPAVAFA.
En un aspecto adicional, la presente invención
se refiere al procedimiento de acuerdo con la presente invención,
en el que dicho vector comprende además un polinucleótido que
comprende la región promotora y el sitio de unión ribosómica del
gen gac de Pseudomonas diminuta, polinucleótido que está
conectado operativamente al polinucleótido que codifica la proteína
de fusión que comprende la secuencia de señal y el polipéptido de
interés.
Tal polinucleótido que comprende la región
promotora y el sitio de unión ribosómica comprende preferiblemente
la secuencia de nucleótidos (Nº ID SEC 5)
En una de sus modalidades preferidas, tal
polinucleótido que comprende la región promotora y el sitio de unión
ribosómica comprende la secuencia de nucleótidos (Nº ID SEC 6)
Con respecto a células huésped procarióticas,
preferiblemente, dicha célula huésped de acuerdo con la presente
invención es una célula de E. coli; cuyas implicaciones se
han descrito con detalle anteriormente.
En una modalidad adicional la presente invención
se refiere a la parte de cultivación (o fermentación) del
procedimiento utilizando la célula huésped transformada de acuerdo
con la presente invención.
Muchos factores pueden influir en la
productividad de procedimientos de fermentación que emplean
organismos recombinantes. La estrategia de fermentación aplicada
tiene que considerar las sensibles relaciones entre la fisiología
microbiana y el número de copias de plásmidos, la estabilidad de los
plásmidos y la expresión génica que no solo está determinada a
nivel génico sino también por la composición del medio y las
condiciones del procedimiento. Además de la estabilidad de la cepa
huésped, la estabilidad del producto es de gran importancia para la
producción de alto nivel de proteína recombinante.
Para el desarrollo de un procedimiento de
fermentación que emplea un sistema de expresión constitutivo, las
condiciones de crecimiento y la formación de producto recombinante
están estrechamente relacionadas entre sí. Por lo tanto, el
esfuerzo para un crecimiento óptimo y un control de las condiciones
de crecimiento que están en una relación estrecha para la formación
de producto durante toda la marcha de la fermentación es superior en
comparación con sistemas de expresión inducidos.
Procedimientos de fermentación de E. coli
típicos para la producción de proteínas recombinantes se
caracterizan por cortos tiempos de fermentación en un intervalo de
entre unas pocas horas y aproximadamente 100 horas de cultivación.
Lo más a menudo, no solo una fuente de carbono sino también diversas
fuentes de nitrógeno complejas o inorgánicas, diferentes sales y
elementos traza se alimentan a cultivos de E. coli. La
alimentación de carbono sigue habitualmente perfiles temporales con
un incremento por etapas o un incremento exponencial de las
velocidades de alimentación. A veces también se usan mezclas de
fuentes de carbono durante fermentaciones de E. coli. La
alimentación de la fuente de carbono habitualmente se acopla a la
capacidad de transferencia de oxígeno del biorreactor mediante el
uso de diversas estrategias de control.
Un objetivo adicional de la presente invención
es proporcionar un procedimiento de fermentación robusto y
reproducible, basado en el sistema de expresión de gac y células
huésped transformadas correspondientes de acuerdo con la presente
invención, para la expresión periplasmática de alto rendimiento de
un polipéptido de interés sin el uso de una alimentación de fuentes
de nitrógeno extensiva y opcionalmente sin la adición de elementos
traza al medio de fermentación.
El procedimiento de acuerdo con la invención se
lleva a cabo en principio cultivando inicialmente la célula huésped
bacteriana, es decir, la cepa de expresión, de acuerdo con la
práctica microbiológica conocida de por sí. La cepa generalmente se
cría partiendo de una sola colonia en un medio nutritivo, pero
también es posible emplear suspensiones de células crioconservadas
(bancos de células). La cepa generalmente se cultiva en un
procedimiento de varias fases para obtener suficiente biomasa para
uso adicional.
A pequeña escala, esto puede tener lugar en
matraces agitados, en donde es posible en la mayoría de los casos
emplear un medio complejo (por ejemplo, caldo LB). Sin embargo,
también es posible usar medios definidos (por ejemplo, medio de
citrato). Para el cultivo, se hace crecer un precultivo de pequeño
volumen de la cepa huésped (inoculada con una sola colonia o con
una suspensión celular procedente de un biocultivo), no siendo
generalmente la temperatura para este cultivo crítica para el
resultado de la expresión posterior, de modo que es posible
trabajar habitualmente a temperaturas relativamente altas (por
ejemplo, 30ºC o 35ºC). El principal cultivo se establece en un
volumen mayor (por ejemplo 500 ml), donde en particular es necesario
asegurar una buena aireación (gran volumen de matraz en comparación
con el volumen del contenido, alta velocidad de rotación). Puesto
que se pretende que la expresión tenga lugar en forma soluble, el
principal cultivo en la mayoría de los casos también se llevará a
cabo a una temperatura algo inferior (por ejemplo, 22ºC o 28ºC).
Tanto sistemas inducibles (por ejemplo, con promotor de trp, lac,
tac o phoA) como sistemas constitutivos (como el sistema preferido
de la presente invención que comprende el promotor de gac) son
adecuados para producir proteínas solubles. Las células resultantes
pueden recogerse y procesarse adicionalmente.
A una escala mayor, el sistema de varias fases
consiste en una pluralidad de biorreactores (fermentadores), que
emplean preferiblemente medios nutritivos definidos para poder
mejorar el control ingenieril del procedimiento o que emplean
medios nutritivos complejos para potenciar el crecimiento del
microorganismo y para incrementar la robustez del procedimiento.
Además, es posible incrementar mucho la formación de biomasa y
producto mediante la alimentación de nutrientes particulares (modo
de alimentación discontinuo). Por ejemplo, se usan un fermentador
de fase preliminar y un fermentador de fase principal. El
fermentador de fase preliminar se inocula con el llamado inóculo
que generalmente se hace crecer a partir de una sola colonia o un
criocultivo en un matraz agitado. Debe asegurarse una buena
aireación en el fermentador - y especialmente en su fase principal.
Las células resultantes se aportan de nuevo para el procesamiento
adicional.
De acuerdo con esto, en una modalidad preferida,
el cultivo (o la cultivación) del procedimiento de acuerdo con la
presente invención según se describe aquí se está realizando como un
procedimiento de varias fases que comprende una etapa de precultivo
y una etapa de cultivo principal. Alternativamente, es posible una
fermentación de una sola etapa sin etapa de precultivo. En una
modalidad aún más preferida, el procedimiento de acuerdo con la
presente invención según se describe aquí se está realizando como un
procedimiento de fermentación de varias fases que comprende una
etapa de matraz agitado, opcionalmente una etapa de precultivo y una
etapa de cultivo principal.
En particular, dicho cultivo de la célula
huésped procariótica en la etapa de cultivo principal se realiza en
un medio de cultivo que comprende un sustrato durante más de
aproximadamente 90% del tiempo de cultivación a una concentración
de sustrato inferior que la constante de saturación del sustrato,
acompañado por altos niveles de concentración de oxígeno disuelto,
y acompañado además por una velocidad de crecimiento específica de
las células huésped bacterianas que disminuye uniformemente,
realizándose el procedimiento a una temperatura que es inferior que
la temperatura óptima para el crecimiento de la célula huésped.
En este contexto, la constante de saturación es
la concentración de un sustrato (en particular, la fuente de
carbono) a la que la célula huésped se está haciendo crecer a una
velocidad de crecimiento específica que es equivalente a 50% de la
velocidad de crecimiento específica máxima.
En este contexto, la velocidad de crecimiento
específica es el incremento de la concentración de biomasa en un
cierto intervalo de tiempo dividido por la concentración de biomasa
media de dicho intervalo de tiempo.
Preferiblemente, el medio de cultivo del cultivo
principal, así como, cuando es aplicable, del precultivo, es un
medio complejo que comprende una fuente de nitrógeno compleja,
preferiblemente un extracto de levadura, diversas sales y una
fuente de carbono para apoyar el crecimiento inicial de la célula
huésped. En una de sus modalidades preferidas, dicha fuente de
carbono bien se añade al medio de cultivo principal mediante la
alimentación de dicha fuente de carbono después de la inoculación o
bien, preferiblemente, está presente en el cultivo principal en el
momento de la inoculación.
Preferiblemente, la concentración de oxígeno
disuelto en la etapa de cultivo principal es superior a
aproximadamente 20%, más preferiblemente de aproximadamente 40% a
aproximadamente 100% de la saturación.
Preferiblemente, la velocidad de crecimiento que
disminuye uniformemente en la etapa de cultivo principal es de
aproximadamente 2 h^{-1} a aproximadamente 0,001 h^{-1}.
En una modalidad preferida, la temperatura en la
etapa de cultivo principal está entre aproximadamente 22ºC y
aproximadamente 35ºC, preferiblemente entre aproximadamente 25ºC y
aproximadamente 31ºC, lo más preferiblemente aproximadamente
28ºC.
En otra modalidad preferida, dicha cultivación
en el precultivo y/o el cultivo principal se realiza a un valor de
pH en el intervalo de aproximadamente 6,7 a aproximadamente 7,3.
En una modalidad preferida adicional de la
presente invención, el sustrato es glicerol o, preferiblemente, un
carbohidrato. Preferiblemente, el carbohidrato es glucosa.
Según se menciona en la presente, ejemplos para
proteínas de interés adecuadas son los que se mencionan
anteriormente. En una modalidad preferida, el polipéptido de
interés es un interferón alfa 2. En particular, tal interferón alfa
2 se selecciona del grupo que consiste en interferón alfa 2A e
interferón alfa 2B, prefiriéndose el último.
En una modalidad más preferida que se refiere a
todos los aspectos del procedimiento de la presente invención, la
célula huésped es una célula de E. coli.
El polipéptido de interés puede aislarse a
continuación mediante métodos de purificación de proteínas conocidos
por los expertos (véase, por ejemplo, M.P. Deutscher, en: Methods
in Enzymology: Guide to Protein Purification, Academic Press Inc.,
(1990), 309-392). Una secuencia de purificación
comprende generalmente una etapa de ruptura de células, una etapa
de clarificación (centrifugación o microfiltración) y diversas
etapas cromatográficas, filtraciones y/o precipitaciones. Un
ejemplo adecuado para el aislamiento de un polipéptido de interés
producido de acuerdo con la presente invención se da
posteriormente.
\newpage
La cepa de E. coli W3110 (ATCC 27325) se
ha depositado en the American Type Culture Collection (ATCC), 10801
University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209,
EE.UU. de A. el 28 de febrero de 2001, bajo el Nº de Registro
PTA-3132.
Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar la
presente invención sin limitar de ningún modo su alcance. El
contenido descrito en los ejemplos se refiere a modalidades
preferidas de la presente invención.
El polipéptido rhIFN\alpha2b
(interferón-\alpha2b humano recombinante) se
produce en la cepa W3110 de Escherichia coli
K-12 transformada con un plásmido que contiene un
gen sintético optimizado que codifica para rhIFN\alpha2b.
rhIFN\alpha2b se produce bajo el control del promotor y el sitio
de unión ribosómica (RBS) del gen de glutaril 7-ACA
acilasa (gac) a partir de Pseudomonas diminuta CCM
3987 mediante fermentación de E. coli K-12
recombinante. rhIFN\alpha2b se expresa como una proteína de fusión
N-terminal con la secuencia de señal procedente del
mismo gen (gac), dirigiendo la proteína al periplasma con
procesamiento (segmentación) simultáneo de la secuencia de señal.
El procedimiento de fermentación por lo tanto da directamente
rhIFN\alpha2b maduro con una secuencia primaria idéntica a la de
interferón alfa 2b humano presente en la naturaleza. El plásmido de
expresión se denomina pMG414, la cepa de producción W311
0[pMG414].
pUC19 sirve como el punto de partida para la
construcción del plásmido vectorial. pUC19 es un plásmido de alto
número de copias usado frecuentemente y caracterizado a fondo.
Contiene un origen de replicación altamente eficaz y un gen de
resistencia a ampicilina (amp o bla)
(Yanisch-Perron y otros, 1985; Vieira y Messing,
1982; números de registro del GenBank L09137 y X02514).
Aun cuando pUC19 se use frecuentemente para la
construcción de plásmidos de expresión, el gen amp puede no
ser un marcador seleccionable ideal para propósitos industriales.
Por esta rezón, el promotor y la región de codificación del gen amp
se retiran y se reemplazan por el promotor y la región de
codificación del gen de resistencia a tetraciclina (tet)
procedente del plásmido de seguridad bien conocido pBR322 (Bolivar
y otros, 1977a, 1977b, 1978; revisión: Balbás y otros, 1986; números
de registro del GenBank J01749, K00005, L08654, M10283, M10286,
M10356, M10784, M10785, M10786, M33694, V01119). Este trabajo de
clonación se realiza con la ayuda de técnicas de PCR de alta
fidelidad.
Para alcanzar esto, el fragmento que abarca los
pb 1743 a 679 de pUC19 se amplifica usando PCR de alta fidelidad
(sistema de DNA polimerasa de Pwo de Roche Biochemicals) y los
siguientes oligonucleótidos fosforilados en 5':
| Oligo 235: | 5'-Fosfato-TAACTGTCAG ACCAAGTTTA CTC-3' | (Nº ID SEC 7) |
| Oligo 236: | 5'-Fosfato GCGTTTCGGT GATGACGGTG-3' | (Nº ID SEC 8) |
El fragmento de PCR resultante tiene 1624 pb de
longitud y contiene la cadena principal completa de pUC19 que
carece del promotor y la secuencia de codificación de amp,
pero que incluye el codón de parada y el terminador de la
transcripción del gen amp.
Según se menciona anteriormente, el promotor y
la secuencia promotora de tet (excluyendo el codón de parada)
se amplifican a partir de pBR322. De nuevo, se usó PCR de alta
fidelidad para amplificar los pb 4 a 1273 de pBR322. Se usaron para
esta amplificación los siguientes oligonucleótidos fosforilados en
5':
| Oligo 237: | 5'-Fosfato-TCATGTTTGA CAGCTTATCA TCG -3' | (Nº ID SEC 9) |
| Oligo 238: | 5'-Fosfato-GGTCGAGGTG GCCCGGCTC -3' | (Nº ID SEC 10) |
El fragmento de PCR resultante tiene 1270 pb de
longitud. Los dos fragmentos de PCR se purifican mediante
electroforesis en gel de agarosa preparativa y se ligan usando DNA
ligasa de T4 (Rapid DNA Ligation Kit, Roche Biochemicals). El DNA
ligado se purifica y se somete a electroporación en Escherichia
coli K-12 DH10B (células electrocompetentes
Life Technologies ElectroMAX DH10B, genotipo: F mcrA
\Delta(mrr-hsdRMS-mcrBS)
\phi80d/acZ\DeltaM15 \DeltalacX74 deoR
recA1 endA1 araD139 \Delta(ara,
leu)7697 ga/U ga/K \lambda^{-} rpsL
nupG). Las células transformadas se cultivan en placa sobre
agar LB, 15 mg/l de tetraciclina y 3 g/l de glucosa. Los cultivos
líquidos se hacen crecer en caldo LB que contiene 15 mg/l de
tetraciclina y 3 g/l de glucosa y el DNA plasmídico se aísla de
estos cultivos usando métodos minipreparatorios estándar. Los DNAs
plasmídicos se analizan mediante análisis de restricción para
corregir la integración del fragmento de tet en la cadena
principal de pUC19. Tal integración del fragmento era inespecífica
con respecto a la orientación, solo aproximadamente 50% de todo el
clon que contiene inserto tenía el fragmento insertado en la
orientación correcta, es decir, el gen tet marchaba en la
misma dirección que el gen amp en pUC19. Una cantidad mayor
de DNA se aísla de cultivos líquidos de unos pocos clones y se
somete a análisis de restricción más detallados. De los clones que
muestran patrones de restricción correctos, se selecciona uno para
el trabajo de clonación adicional.
El plásmido respectivo se denominó pMG402. Es
idéntico a pUC19 en todas las características y funciones excepto
por el hecho de que debe hacerse crecer sobre/en medio que contiene
tetraciclina en lugar de medio que contiene ampicilina. De este
modo se genera un vector de alto número de copias resistente a tet
adecuado para propósitos industriales.
Características del plásmido pMG402:
- pb 1954-680: cadena principal de pUC19 (= pUC19 que carece del promotor y el gen estructural de amp)
- pb 681-1953: promotor y gen estructural de tet procedente de pBR322
rhIFN\alpha2b se expresa como una fusión
N-terminal con la secuencia de señal de glutaril
7-ACA acilasa de Pseudomonas diminuta CCM
3987 (gac1ss = Nº ID SEC 2) dirigiendo la proteína al periplasma con
procesamiento (segmentación) simultáneo de la secuencia de señal
mediante el aparato de peptidasa de señal de la célula huésped.
Secuencia de aminoácidos de gac1ss (27 aa):
\hskip0.3cmMLRVLHRAAS ALVMATVIGL APAVAFA
En la región 3' de la secuencia de codificación
del gac1ss se introduce un sitio de endonucleasa de restricción
Sac II a través del cebador de PCR 3' creando una mutación
silenciosa (secuencia de aminoácidos inalterada). Este sitio Sac II
permite la fusión de la región de codificación de gac1ss con el gen
de rhIFN\alpha2b.
Este gen estructural para rhIFN\alpha2b se
sintetiza químicamente. Difiere de la secuencia de cDNA humano
natural en 48 de 161 codones y se diseña para eliminar cualesquiera
codones débiles y tendentes al error.
En la siguiente tabla, se indican cambios de
codones. En la tabla, "Codón natural" se refiere a la secuencia
de cDNA publicada por Streuli y otros, 1980 (Número de Registro del
GenBank V00548). Los números de aminoácidos se refieren a
hIFN\alpha2b maduro (partiendo de Cys 1). La secuencia de
aminoácidos que ha de ser codificada por el gen sintético se toma
de la base de datos SwissProt, número de registro P01563/P01564
(aminoácidos 24 a 188).
\vskip1.000000\baselineskip
El gen resultante permite la transcripción y la
traducción eficaces y precisas de rhIFN\alpha2b en Escherichia
coli. Puesto que el gen se diseña para la expresión en un
sistema bacteriano, no contiene secuencias no traducidas (intrones,
etc.).
El gen estructural se sintetiza químicamente. En
resumen, oligonucleótidos complementarios solapados de
aproximadamente 30 a 50 nucleótidos de longitud se sintetizan de un
modo que cubre ambas hebras de la secuencia del gen estructural sin
huecos. Los oligonucleótidos se hibridan entre sí y se ligan usando
DNA ligasa de T4. El producto de reacción se corta con
endonucleasas de restricción y se clona en el vector pUC18. El
plásmido resultante se somete a secuenciación y muestra la secuencia
correcta.
El gen sintético en este plásmido no contiene la
secuencia de señal de gac. Esta parte de la región de
codificación se introduce a través del fragmento de gac que
contiene promotor, RBS y secuencia de señal y se fusiona al gen
estructural de rhIFN\alpha2b.
El fragmento de gac se genera mediante
síntesis química. Por ejemplo, oligonucleótidos complementarios
solapados de aproximadamente 30 a 50 nucleótidos de longitud se
sintetizan de un modo que cubre la longitud total de ambas hebras
del fragmento de gac (incluyendo los sitios de reconocimiento
de endonucleasas de restricción en ambos lados más un mínimo de 6
pares de bases adicionales para permitir la segmentación eficaz)
sin huecos. Los oligonucleótidos se hibridan a continuación entre sí
(por ejemplo, mediante calentamiento y enfriamiento subsiguiente) y
se ligan usando DNA ligasa de T4. El producto de reacción se corta a
continuación con las endonucleasas de restricción respectivas
(xbaI y EcoRI) y se clona en el vector pMG402 (véase
posteriormente).
Alternativamente, el fragmento de gac que
contiene promotor, RBS y secuencia de señal puede amplificarse a
partir de un plásmido que comprende elementos tales como el plásmido
pKS55, construcción que se describe en la Patente Checa Nº 278.515.
El gen gac clonado allí se ha derivado de una cepa de Pseudomonas
diminuta (CCM 3987). La amplificación se lleva a cabo usando un
sistema de PCR de alta fidelidad. Los sitios de endonucleasas de
restricción necesarios para la clonación se introducen a través de
los siguientes cebadores de PCR.
Cebadores:
| 1. | 5'-Fosfato-GGGGGGTCTAGACCAACAACATCTTCAACGTCTACC-3' | (Nº ID SEC 11) | |
| 2. | 5'-Fosfato-CC CCC CGA ATT CAC TAG TAC GCG TCT CTC TCC-3' | (Nº ID SEC 12) |
No habrá diferencia en el comportamiento entre
un fragmento de gac generado a través de amplificación por
PCR de alta fidelidad y un fragmento de gac generado mediante
síntesis química.
\newpage
El fragmento de gac así creado tiene la
siguiente secuencia de nucleótidos (Nº ID SEC 13):
El fragmento de gac (bien sintético o
bien creado a través de PCR) y el plásmido vectorial pMG402 se ligan
usando los sitios XbaI y EcoRI. De este modo se
genera el vector de expresión pMG412.
El vector de expresión, pMG412, contiene los
codones 1-23 + el primer nucleótido del codón 24 de
la secuencia de señal de gac. En los codones 22-24
se introduce el sitio Sac II mediante mutación silenciosa. Cualquier
cosa aguas abajo del sitio Sac II en pMG412 es cebador o secuencia
vectorial.
Los dos últimos nt del codón 24 + los codones
25-27 se introducen mediante el cebador de PCR
directo para el gen estructural diana (rhIFN\alpha2B, véase
anteriormente). Tal cebador contiene por lo tanto los siguientes
elementos:
- Solapamiento de corte (por ejemplo, 6 nucleótidos) - sitio Sac II - tc gcc ttt gcg (Nº ID SEC 14) - secuencia de hibridación correspondiente al extremo 5' del gen diana "maduro".
En particular, un cebador adecuado tiene la
siguiente secuencia de nucleótidos (Nº ID SEC 15):
- TT GCG CCC GCG GTC GCC TTT GCG - región de hibridación (Sac II subrayado)
Los últimos aminoácidos (24-27)
de la secuencia de señal de gac son V A F A (Nº ID SEC 16).
A partir del constructo plasmídico descrito
anteriormente, el gen de rhIFN\alpha2B se amplifica usando un
sistema de PCR de alta fidelidad. El cebador de PCR 5' contiene el
sitio Sac II para fusionar el gen con el fragmento de
gac más los últimos cuatro codones de la secuencia de señal
de gac. El cebador 3' contiene el codón de parada TAA (ocre) y el
sitio Mlu I para la clonación. La amplificación del gen
estructural de interferón alfa genera el siguiente fragmento (Nº ID
SEC 17):
Este fragmento de PCR de rhIFN\alpha2b y
pMG412 se ligan usando los sitios Sac II y Mlu I. De
este modo se generaba el plásmido de producción/expresión final
pMG414. Ambas hebras de pMG414 se someten a secuenciación y no
muestran diferencias con respecto a la secuencia esperada.
Características del plásmido pMG414 (tamaño
total 3668 pb):
- pb 2728-256:
- cadena principal de pUC19, parte 1
- pb 257-546:
- fragmento de gac (promotor, RBS, secuencia de señal)
- pb 547-1044:
- gen de rhIFN\alpha2b sintético (incluyendo el codón TAA)
- pb 1045-1454:
- sitios de clonación + cadena principal de pUC19, parte 2
- pb 1455-2727:
- gen tet procedente de pBR322 (promotor/RBS 1455-1536, secuencia de codificación que incluye el codón TAA 1537-2727)
De este modo, el fragmento de gac que
contiene promotor, RBS y secuencia de señal se fusiona al gen
estructural de rhIFN\alpha2b usando un sitio de endonucleasa de
restricción en el extremo 3' del fragmento de gac introducido
mediante un cebador de PCR. El mismo sitio se fusiona al extremo 5'
del gen estructural de rhIFN\alpha2b, también por medio de un
cebador de PCR. Así, después de clonar ambos elementos (fragmento de
gac y gen estructural de rhIFN\alpha2b) en el vector
básico, se genera un gen que codifica una proteína de fusión
gac1ss-rhIFN\alpha2b. De estos 192 codones totales
(576 nucleótidos), los 27 primeros codifican la secuencia de señal
de gac no presente en la proteína final y los aminoácidos
28-192 codifican rhIFN\alpha2b maduro (165
aminoácidos, cisteína 1 a ácido glutámico 165).
La secuencia de nucleótidos del casete de
expresión usado en el plásmido de expresión de rhIFN\alpha2b
pMG414 (807 pb) (véase posteriormente) y la secuencia de
aminoácidos de la proteína de fusión
gac1ss-rhIFN\alpha2b se muestran como sigue (Nº ID
SEC 18):
\vskip1.000000\baselineskip
La secuencia que se muestra se divide en
subpárrafos/regiones que comprenden:
- 1.
- el promotor de gac y RBS (primer párrafo, pb 257 a 465 de pMG414, véase posteriormente),
- 2.
- la región de codificación de la secuencia de señal de gac (segundo párrafo, pb 466 a 546 de pMG414, véase posteriormente),
- 3.
- el gen sintético para rhIFN\alpha2b (tercer párrafo, pb 547 a 1044 de pMG414 (véase posteriormente) - incluyendo el codón de parada TAA, y
- 4.
- el conector de clonación 3' (cuarto párrafo, pb 1045 a 1063 de pMG414, véase posteriormente).
En el pMG414, estas cuatro regiones están
empalmadas directamente entre sí. Están separadas en la figura solo
por razones de claridad.
Los codones de inicio (ATG) y de parada (TAA)
del marco de lectura abierto se muestran en negrita.
El primer codón (TGC) y el último (GAA) de
rhIFN\alpha2b maduro están subrayados.
Los sitios de endonucleasas de restricción
usados para la clonación están recuadrados. Estos son:
- -
- Xba I (TCTAGA) y EcoR I (GAATTC) para la introducción del fragmento de gac (promotor, RBS, secuencia de señal, sitios Sac II, Mlu I, Spe I)
- -
- Sac II (CCGCGG) y Mlu I (ACGCGT) para la introducción del fragmento de PCR de rhIFN\alpha2b (incluyendo cuatro codones para los cuatro últimos aminoácidos del gac1ss, el gen sintético de 495 pb para rhIFN\alpha2b maduro y el codón de parada TAA(T)).
El promotor de gac muestra alta actividad
constitutiva/basal, no se requiere la adición de un inductor químico
o un estímulo físico (cambio en las condiciones de cultivo).
El plásmido de expresión pMG414 se introduce en
la cepa huésped ATCC PTA-3132 (=W3110 (ATCC 27325))
mediante electroporación. Las células electrocompetentes se
preparan de acuerdo con un protocolo estándar, la electroporación
se lleva a cabo en cubetas de 0,1 mm a 1800 V usando un
electroporador de Eppendorf 2510.
Después de la electroporación, la reacción se
suspende en medio líquido y se cultiva en placa sobre placas de agar
que contienen tetraciclina.
El punto de partida para la selección de un clon
celular adecuado es una placa de transformación así obtenida.
Diversos clones de esta placa se hacen crecer en cultivo líquido y
se crioconservan como bancos de células de investigación. Su
productividad se prueba en experimentos en matraces agitados y se
compara. El mejor clon (E1/116) se usa para una explotación
adicional.
El mejor clon puede mostrar buena productividad
pero un crecimiento relativamente pobre. Este crecimiento pobre
puede resultar de diversos factores, por ejemplo la toxicidad del
producto para la célula huésped, la carga metabólica debida a la
síntesis de producto, etc. La adición de glucosa a menudo acarrea
alguna mejora debido a que la glucosa regula a la baja (por
ejemplo, mediante represión de catabolitos) muchos promotores
usados para la expresión de proteína recombinante. Además, la
glucosa tiene un efecto positivo general sobre el crecimiento de
E. coli debido a que puede introducirse directamente en el
metabolismo como una fuente de carbono.
En el caso de E1/116, se observa un efecto
positivo claro de la glucosa sobre el crecimiento. Los mejores
resultados se alcanzan con concentraciones de glucosa entre 2 y 5
g/l. Para adaptar la línea celular para hacer frente a la formación
de producto y por consiguiente para un mejor crecimiento en ausencia
de glucosa, la cepa se hace crecer por lo tanto en medio líquido en
matraces agitados durante varias pasadas ("cascada en matraz
agitado").
Más específicamente, un criovial de E1/116 se
descongela y la suspensión celular se cultiva en estrías sobre
placas de agar LB libres de glucosa que contienen tetraciclina. La
placa se incuba a 37ºC hasta que las colonias alcanzan un tamaño
suficiente para inocular un cultivo líquido. Las colonias se
transfieren desde la placa a pequeños matraces agitados cargados
con 15 ml de caldo LB libre de glucosa que contiene tetraciclina.
Los cultivos se agitan a 37ºC hasta que alcanzan una densidad
óptica a 600 nm de más de 0,5 (típicamente > 1,0). Para esta
primera ronda esto lleva hasta 48 horas debido a las pobres
características de crecimiento del aislado original.
El procedimiento descrito en el párrafo anterior
se realiza cinco veces consecutivas cultivándose el cultivo líquido
de la ronda previa en estrías sobre placas y sirviendo las colonias
procedentes de las placas para inocular el siguiente cultivo
líquido. Para cada cultivo líquido se determina la densidad óptica y
se toma una muestra para la determinación de la concentración de
producto usando SDS-PAGE - transferencia Western.
Los clones procedentes del cultivo con la mejor combinación de
crecimiento y productividad se usan a continuación para iniciar la
siguiente ronda.
En el transcurso de las diferentes rondas de
esta cascada de cultivo (es decir, etapas de propagación y
reaislamiento múltiples), las características de crecimiento de la
(sub)cepa o las (sub)cepas se mejoran gradualmente.
Eligiendo la cepa con la mejor combinación de crecimiento y
productividad en cada ronda, las concentraciones también se
incrementan gradualmente. Después de la quinta ronda se generan de
nuevo colonias simples sobre placas de agar LB que contienen
tetraciclina y se usan para inocular un cultivo líquido que contiene
tetraciclina para la generación de un lote de siembra primario
(PLS). El cultivo se hace crecer a 37ºC hasta una densidad óptica
de aproximadamente 1,5, se mezcla con una cantidad igual de glicerol
estéril al 40% p/v, se divide en partes alícuotas en viales
criogénicos y se congela a -80ºC. Este PSL se usa como un punto de
partida para la generación de los bancos de células GMP (Master
Cell Bank y Working Cell Bank) de la cepa de producción de
interferón alfa 2b. El reaislado se denomina E1/116a. Procedimientos
de reaislamiento como el descrito anteriormente han demostrado dar
resultados reproducibles.
E1/116 muestra excelentes características de
crecimiento en matraces agitados y biorreactores removidos
(fermentadores). Un inóculo adecuado para poner en marcha un
biorreactor puede hacerse crecer en un matraz agitado partiendo de
un vial de Working Cell Bank en aproximadamente 8 horas.
Se prepara un Master Cell Bank bajo condiciones
de cGMP a partir del lote de siembra primario descrito
anteriormente. Resumiendo, un vial de PSL se descongela y se
cultiva en placa sobre placas de agar que contienen tetraciclina.
Una sola colonia se recoge y se usa para inocular el cultivo en
matraz agitado de Master Cell Bank (MCB) (medio de caldo LB que
contiene tetraciclina). La suspensión celular procedente de la fase
de crecimiento logarítmica se mezcla 1 + 1 con glicerol al 40% p/v,
se divide en partes alícuotas a 1,8 ml en viales criogénicos, se
sella en un tubo criogénico y se congela en la fase líquida de un
depósito de nitrógeno líquido.
El Working Cell Bank se genera del mismo modo
que el Master Cell Bank, excepto que el cultivo en matraz agitado se
inocula con suspensión celular de un vial de MCB descongelado.
El procedimiento de fermentación se inicia
haciendo crecer la cepa E. coli K-12 W3110
obtenible de the Working Cell Bank según se describe anteriormente
en cultivos de matraz agitado en medio de Luria Bertani (LB) a 37ºC
con la adición del antibiótico hidrocloruro de tetraciclina para
evitar el crecimiento de células que no soportan plásmido.
El cultivo en matraz agitado se usa a
continuación para inocular el medio de cultivo de siembra (=
precultivo) (tamaño del inóculo = 0,4%). El medio para esta
cultivación de precultivo se basa en agua desionizada que contiene
glucosa como única fuente de carbono y autolisado de levadura como
una fuente de nitrógeno compleja. Además, sales inorgánicas como
KH_{2}PO_{4}, K_{2}HPO_{4}, (NH_{4})_{2}SO_{4}
y MgSO_{4}.7H_{2}O se añaden al medio. Como un agente
antiespumante se usa polipropipenglicol 2000 (PPG2000). En
particular, el medio de precultivo tiene la siguiente
composición:
\vskip1.000000\baselineskip
Medio Basal de
Precultivo
\newpage
Estos componentes del medio se esterilizan
juntos durante 20 minutos a 121ºC. Después del enfriamiento del
medio basal, una parte alícuota de una solución de reserva estéril
de 5 g/l del antibiótico hidrocloruro de tetraciclina se añade al
medio basal (la esterilización se realiza mediante filtración
(filtro de 0,22 \mum)).
\vskip1.000000\baselineskip
Solución de Reserva de
Hidrocloruro de Tetraciclina (5
g/l)
El tiempo de cultivación para el cultivo de
siembra es aproximadamente 16 horas. Durante la cultivación del
cultivo de siembra el valor del pH se controla hasta un punto fijo
de 7,0 \pm 0,2 con ácido sulfúrico e hidróxido sódico o solución
concentrada de amoníaco. La concentración de oxígeno disuelto se
mantiene a niveles mayores que 20% de saturación incrementando la
velocidad del agitador. La velocidad del agitador al principio de la
cultivación se fija a 300 rpm, la contrapresión en el recipiente a
0,3 bares y la velocidad de aireación se controla hasta 30 Umin
(equivalentes a "1 wm"). La temperatura se mantiene
constantemente a 37ºC durante la cultivación. Como un criterio de
transferencia del caldo a la fase principal del proceso de
fermentación, se usa un incremento de la concentración de oxígeno
disuelto después del consumo de la fuente de carbono.
Para la cultivación del cultivo principal se usa
un medio basado en agua desionizada, glucosa como una fuente de
carbono y autolisado de levadura como una fuente de nitrógeno
compleja. Además, de la adición de las sales inorgánicas
(NH_{4})_{2}SO_{4}, CaCl_{2}.2H_{2}O y
MgSO_{4}.7H_{2}O, se usa PPG2000 como un agente antiespumante.
La glucosa inicial se esteriliza separadamente y se añade al resto
del medio estéril. El tamaño del inóculo para el medio del
fermentador principal estaba en un intervalo entre 0,75 y 3%. En
particular, el medio de cultivo principal tiene la siguiente
composición:
\vskip1.000000\baselineskip
Medio Basal de Cultivo
Principal
Estos componentes del medio se esterilizan
juntos durante 20 minutos a 121ºC. Después de enfriar, una parte
alícuota de una solución de reserva de glucosa termoesterilizada
separadamente de 800 g/l se añade al medio basal de cultivo
principal (la esterilización se realiza durante más de 30 minutos a
120ºC).
\vskip1.000000\baselineskip
Solución de Reserva de Glucosa,
800
g/l
El punto más importante durante esta cultivación
es la necesidad de un consumo completo de la glucosa inicial
presente en el medio. Esto conduce a un incremento brusco de la
concentración de oxígeno disuelto después de aproximadamente 9
horas de crecimiento. Empezando la alimentación de glucosa antes del
consumo total de la glucosa inicial, no se observa formación de
producto. La limitación de glucosa controlada por la alimentación
de la solución de glucosa a una velocidad constante es por lo tanto
muy importante. La temperatura durante la cultivación se controla
hasta un valor constante de aproximadamente 28ºC. La velocidad
inicial del agitador se fija a 300 rpm, la velocidad de aireación
se controla a 100 Umin (equivalentes a "1 vvm") y la
contrapresión en el recipiente se fija a 0,3 bares. El valor del pH
se controla hasta 7,1 \pm 0,3 con ácido sulfúrico e hidróxido
sódico o solución concentrada de amoníaco. Es aceptable un máximo
del valor del pH hasta 8,0 después del consumo de la glucosa
suministrada
inicialmente.
inicialmente.
La concentración del oxígeno disuelto se
controla hasta valores superiores a 20% de saturación. Dependiendo
de la capacidad de transferencia de oxígeno del biorreactor, la
concentración de OD se mantiene a niveles mayores que 20% de la
saturación, preferiblemente entre aproximadamente 40% y 100% de la
saturación, incrementando en primer lugar la velocidad del agitador
hasta un valor máximo. Si esto no es suficiente, en primer lugar se
incrementa la velocidad de aireación y después de eso la
contrapresión, respectivamente. Después de un tiempo de cultivo
entre 48 y 192 horas (se observa incremento lineal de formación de
producto con el tiempo de cultivación) el cultivo se recoge y se
enfría hasta 15 \pm 5ºC y se acondiciona para el procesamiento
aguas abajo mediante la adición de sacarosa/EDTA al caldo
enfriado.
Los resultados de una partida de fermentación se
analizan basándose en la técnica de transferencia Western o en
medidas de HPLC después de la extracción periplasmática del producto
en laboratorio o planta piloto.
Un caldo de fermentación obtenido como se
describe anteriormente que contiene células huésped que comprenden
el interferón alfa 2B expresado en el espacio periplásmico se ajusta
con ácido sulfúrico hasta un pH de 5,0 \pm 0,1 inmediatamente
después de la fermentación y se enfría hasta 4ºC \pm 2ºC. El pH
bajo y la temperatura baja ayudan a desactivar proteasas
endógenas.
El caldo de fermentación se ajusta hasta de 10ºC
a 20ºC, a continuación, sin concentración o lavado de las células,
se añade sacarosa sólida o líquida (200 g de sacarosa/kg de caldo de
fermentación) y EDTA (concentración 10 mM) y el pH se ajusta hasta
8,0. Después de un protocolo de penetración de células de una etapa
selectivo usando choque osmótico (1 + 3 diluciones) con agua
enfriada, con lo que el caldo de fermentación que comprende
sacarosa y EDTA se vierte o se bombea al agua enfriada (temperatura
aproximadamente 4ºC), el extracto periplásmico liberado se
clarifica. Se añade polietilenimina hasta una concentración final de
0,05% y el pH se ajusta hasta aproximadamente 7,5 con ácido
acético. Después de 15 a 45 minutos el residuo celular y el DNA
floculan, dejando un extracto en bruto transparente que contiene
interferón que puede someterse a centrifugación para mejorar la
transparencia.
Este procedimiento conduce a un extracto
periplásmico transparente que comprende el interferón alfa 2B
deseado con alto rendimiento con una pureza de > 20% con
respecto al contenido de proteína total. La polietilenimina ayuda a
separar los residuos celulares del extracto de proteína soluble
conduciendo a una solución de interferón muy pura.
Después de un ajuste del pH hasta 4,8 - 5,2 con
ácido acético y una etapa de filtración usando un filtro de 0,3
micras, el extracto en bruto del Ejemplo 3 se aplica a la columna de
CEX (S ceramic HyperD F (Biosepra)). Después de una etapa de lavado
con un tampón de equilibración (acetato sódico 20 mM y NaCl 70 mM a
pH 5,0) el interferón se eluye con un gradiente por etapas en NaCl
175 mM. La fracción recogida se procesa inmediatamente mediante la
etapa de procesamiento del Ejemplo 4.2.
La fracción procedente del Ejemplo 4.1 se ajusta
hasta un pH de 7,3 a 7,7 con hidróxido sódico, se diluye y se
purifica con agua hasta una conductividad de 3,5 a 4,5 mS/cm y se
aplica a la columna de AEX (Q ceramic HyperD F (Biosepra)). Después
del lavado, el interferón se eluye con un gradiente lineal de sal
(NaCl 0-300 mM) en NaCl aproximadamente 150 mM. Se
recogen fracciones que tienen una pureza de más de o igual a 90% del
área de acuerdo con HPLC en fase inversa IPC y se usan directamente
en la siguiente etapa (véase el Ejemplo 4.3).
\newpage
La fracción del Ejemplo 4.2 se diluye (1:1) con
una solución de reserva de sulfato sódico (sulfato sódico al 0,5%),
se ajusta hasta un pH de 7,3 a 7,7 con NaOH y HCl y se aplica a la
columna de HIC (Source 15PHE (Pharmacia). Después del lavado, la
fracción de interferón del Ejemplo 3 se eluye con una concentración
lineal de sulfato sódico (sulfato sódico 800-0 mM)
en sulfato sódico aproximadamente 400 mM. Las fracciones recogidas
que tienen una pureza de más de o igual a 93% del área y no tienen
impureza mayor que o igual a 3% de acuerdo con HPLC en fase inversa
IPC se usan directamente en la siguiente etapa de purificación.
Las fracciones recogidas del Ejemplo 4 se
diluyen con agua hasta una conductividad final de 7,5 a 8,5 mS/cm,
se ajustan hasta pH 4,3 a 4,7 con ácido acético al 99 a 100% y se
aplican a la columna de CEX (Toyopearl SP-650 S
(TosoHaas)). Después de una etapa de lavado, el interferón se eluye
en un gradiente lineal de NaCl (NaCl 0-300 mM) en
NaCl aproximadamente 250 mM. Se recogen las fracciones que tienen
una pureza de más de o igual a 95% del área y no tienen impureza
mayor que o igual a 3% de acuerdo con HPLC en fase inversa IPC y se
usan directamente en la siguiente etapa de purificación.
La última etapa de purificación es una etapa de
filtración en gel para retirar dímeros y otros agregados y para
realizar un intercambio de tampón para la formulación final. La
Superdex 75 pg usada en esta etapa muestra una buena resolución
incluso con un volumen de carga muy alto (5%-15%). La SEC se realiza
en fosfato sódico 25 mM y NaCl 130 mM + EDTA 0,3 mM a un pH de
aproximadamente 7,3 a 7,7.
Las fracciones con la pureza más alta (más de
95% del pico principal en RP-HPLC y sin pico lateral
> 3%) se reúnen para dar la solución a granel final que
comprende el interferón \alpha 2B humano recombinante deseado en
forma pura con un alto rendimiento.
<110> Sandoz AG
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Vectores de expresión, células
huésped transformadas y procedimiento de fermentación para la
producción de polipéptidos recombinantes
\vskip0.400000\baselineskip
<130> BP/G-33314A/BCK
\vskip0.400000\baselineskip
<140> PCT/EP2004/009067
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2004-08-12
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 495
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> DNA que codifica interferón alfa 2B
humano con utilización de codones alterados
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Pseudomonas diminuta
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Leu Arg Val Leu His Arg Ala Ala Ser Ala
Leu Val Met Ala Thr}
\sac{Val Ile Gly Leu Ala Pro Ala Val Ala Phe
Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 81
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Pseudomonas diminuta
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 81
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> DNA que codifica interferón alfa 2B
humano con utilización de codones alterados
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 100
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Pseudomonas diminuta
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 209
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Pseudomonas diminuta
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido, cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptaactgtcag accaagttta ctc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido, cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgtttcggy gatgacggtg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido, cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcatgtttga cagcttatca tcg
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido, cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggtcgaggtg gcccggctc
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido, cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggggggycta gaccaacaac atcttcaacg tctacc
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido, cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccccccgaat tcactagtac gcgtctctct cc
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 315
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> DNA que comprende parte del gen gac
de Pseudomonas diminuta
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido, cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcgcctttgc g
\hfill11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido, cebador de PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttgcgcccgc ggtcgccttt gcg
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Pseudomonas diminuta
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Ala Phe Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 540
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> DNA que comprende la secuencia de
nucleótidos que codifica interferón alfa 2B humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 807
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> DNA que codifica la proteína de
fusión que comprende el péptido de señal del gen gac de
Pseudomonas diminuta e interferón alfa 2B humano
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (210)..(788)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 192
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> DNA que codifica la proteína de
fusión que comprende el péptido de señal del gen gac de
Pseudomonas diminuta e interferón alfa 2B humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (41)
1. Un vector de expresión, que comprende un
polinucleótido que codifica una proteína de fusión que comprende la
secuencia de señal del gen gac de Pseudomonas diminuta y un
polipéptido de interés distinto del gac de Pseudomonas
diminuta, en donde dicha secuencia de señal y dicho polipéptido
de interés están conectados de tal modo que durante la expresión del
polinucleótido en una célula huésped adecuada la secuencia de señal
se segmenta de la proteína de fusión y el polipéptido de interés se
libera al periplasma de la célula huésped.
2. El vector de acuerdo con la reivindicación 1,
en donde dicho vector es un plásmido.
3. El vector de acuerdo con la reivindicación 1,
en donde dicho vector es un plásmido de alto número de copias.
4. El vector de acuerdo con la reivindicación 1,
en el que el polipéptido de interés es interferón alfa 2.
5. El vector de acuerdo con la reivindicación 4,
en el que el interferón alfa 2 se selecciona del grupo que consiste
en interferón alfa 2A e interferón alfa 2B.
6. El vector de acuerdo con la reivindicación 1,
en el que dicha secuencia de señal del gen gac de Pseudomonas
diminuta comprende la secuencia de aminoácidos (Nº ID SEC 2)
- MLRVLHRAASALVMATVIGLAPAVAFA.
7. El vector de acuerdo con la reivindicación 6,
en donde dicho vector comprende además un polinucleótido que
comprende la región promotora y el sitio de unión ribosómica del gen
gac de Pseudomonas diminuta, polinucleótido que está
conectado operativamente al polinucleótido que codifica la proteína
de fusión que comprende la secuencia de señal y el polipéptido de
interés.
8. El vector de acuerdo con la reivindicación 7,
en el que dicho polinucleótido que comprende la región promotora y
el sitio de unión ribosómica comprende la secuencia de nucleótidos
(Nº ID SEC 5)
9. El vector de acuerdo con la reivindicación 8,
en el que dicho polinucleótido que comprende la región promotora y
el sitio de unión ribosómica comprende la secuencia de nucleótidos
(Nº ID SEC 6)
10. Una célula huésped procariótica transformada
con un vector de expresión que es compatible con la célula huésped,
comprendiendo dicho vector un polinucleótido que codifica una
proteína de fusión que comprende la secuencia de señal del gen gac
de Pseudomonas diminuta y un polipéptido de interés distinto
de gac de Pseudomonas diminuta, en donde dicha secuencia de
señal y dicho polipéptido de interés están conectados de tal modo
que durante la expresión del polinucleótido en una célula huésped
adecuada la secuencia de señal se segmenta de la proteína de fusión
y el polipéptido de interés se libera al periplasma de la célula
huésped.
11. La célula huésped de acuerdo con la
reivindicación 10, en la que dicho vector es un plásmido.
12. La célula huésped de acuerdo con la
reivindicación 10, en la que dicho vector es un plásmido de alto
número de copias.
13. La célula huésped de acuerdo con la
reivindicación 10, en la que el polipéptido de interés es interferón
alfa 2.
14. La célula huésped de acuerdo con la
reivindicación 13, en la que el interferón alfa 2 se selecciona del
grupo que consiste en interferón alfa 2A e interferón alfa 2B.
15. La célula huésped de acuerdo con la
reivindicación 10, en la que dicha secuencia de señal del gen gac de
Pseudomonas diminuta comprende la secuencia de aminoácidos
(Nº ID SEC 2)
- MLRVLHRAASALVMATVIGLAPAVAFA.
16. La célula huésped de acuerdo con la
reivindicación 10, en la que dicho vector comprende además un
polinucleótido que comprende la región promotora y el sitio de unión
ribosómica del gen gac de Pseudomonas diminuta,
polinucleótido que está conectado operativamente al polinucleótido
que codifica la proteína de fusión que comprende la secuencia de
señal y el polipéptido de interés.
17. La célula huésped de acuerdo con la
reivindicación 16, en la que dicho polinucleótido que comprende la
región promotora y el sitio de unión ribosómica comprende la
secuencia de nucleótidos (Nº ID SEC 5)
18. La célula huésped de acuerdo con la
reivindicación 16, en la que dicho polinucleótido que comprende la
región promotora y el sitio de unión ribosómica comprende la
secuencia de nucleótidos (Nº ID SEC 6)
19. La célula huésped de acuerdo con la
reivindicación 10, en donde dicha célula huésped es una célula de
E. coli.
20. Un procedimiento para la producción de un
polipéptido de interés, que comprende
- (i)
- proporcionar una célula huésped procariótica transformada con un vector de expresión que es compatible con la célula huésped, comprendiendo dicho vector un polinucleótido que codifica una proteína de fusión que comprende la secuencia de señal del gen gac de Pseudomonas diminuta y un polipéptido de interés distinto de gac de Pseudomonas diminuta, en donde dicha secuencia de señal y dicho polipéptido de interés están conectados de tal modo que durante la expresión del polinucleótido en una célula huésped adecuada la secuencia de señal se segmenta de la proteína de fusión y el polipéptido de interés se libera al periplasma de la célula huésped, y
- (ii)
- cultivar la célula huésped procariótica bajo condiciones que provocan la expresión del polinucleótido, con lo que durante la formación de la proteína de fusión la secuencia de señal se segmenta de la proteína de fusión y el polipéptido de interés se libera en periplasma de la célula huésped.
21. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 20, que comprende además el aislamiento del
polipéptido de interés.
22. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 20, en el que dicho vector es un plásmido.
23. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 20, en el que dicho vector es un plásmido de alto
número de copias.
24. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 20, en el que el polipéptido de interés es interferón
alfa 2.
25. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 24, en el que el interferón alfa 2 se selecciona del
grupo que consiste en interferón alfa 2A e interferón alfa 2B.
26. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 20, en el que dicha secuencia de señal del gen gac de
Pseudomonas diminuta comprende la secuencia de aminoácidos
(Nº ID SEC 2)
- MLRVLHRAASALVMATVIGLAPAVAFA.
27. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 20, en el que dicho vector comprende además un
polinucleótido que comprende la región promotora y el sitio de unión
ribosómica del gen gac de Pseudomonas diminuta,
polinucleótido que está conectado operativamente al polinucleótido
que codifica la proteína de fusión que comprende la secuencia de
señal y el polipéptido de interés.
28. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 27, en el que dicho polinucleótido que comprende la
región promotora y el sitio de unión ribosómica comprende la
secuencia de nucleótidos (Nº ID SEC 5)
\newpage
29. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 27, en el que dicho polinucleótido que comprende la
región promotora y el sitio de unión ribosómica comprende la
secuencia de nucleótidos (Nº ID SEC 6)
30. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 20, en el que dicha célula huésped es una célula de
E. coli.
31. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 20, realizándose dicho cultivo como un procedimiento
de fermentación de varias fases que comprende una etapa de matraz
agitado, opcionalmente una etapa de precultivo y una etapa de
cultivo principal.
32. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 31, en el que dicho cultivo de la célula huésped
procariótica en la etapa de cultivo principal se realiza en un medio
de cultivo que comprende un sustrato durante más de aproximadamente
90% del tiempo de cultivación a una concentración de sustrato
inferior que la constante de saturación del sustrato, acompañado por
altos niveles de concentración de oxígeno disuelto, y acompañado
además por una velocidad de crecimiento específica de las células
huésped bacterianas que disminuye uniformemente, realizándose el
procedimiento a una temperatura que es inferior que la temperatura
óptima para el crecimiento de la célula huésped.
33. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 32, en el que la concentración de oxígeno disuelto en
la etapa de cultivo principal es de aproximadamente 40% a
aproximadamente 100% de la saturación.
34. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 32, en el que la velocidad de crecimiento que
disminuye uniformemente en la etapa de cultivo principal es de
aproximadamente 2 h^{-1} a aproximadamente 0,001 h^{-1}.
35. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 32, en el que la temperatura en la etapa de cultivo
principal está entre aproximadamente 22ºC y aproximadamente
35ºC.
36. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 35, en el que la temperatura en la etapa de cultivo
principal está entre aproximadamente 25ºC y aproximadamente
31ºC.
37. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 36, en el que la temperatura en la etapa de cultivo
principal es aproximadamente 28ºC.
38. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 32, en donde dicho procedimiento se realiza a un
valor del pH en el intervalo de aproximadamente 6,7 a
aproximadamente 7,3 en la etapa de precultivo y/o la etapa de
cultivo principal.
39. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 32, en el que el sustrato es un carbohidrato o
glicerol.
40. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 39, en el que el carbohidrato es glucosa.
41. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 32, en el que la célula huésped es una célula de
E. coli.
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