JP2580303B2 - 異種蛋白をコ−ド付けするｃＤＮＡ類、発現ベクタ−類および宿主類 - Google Patents

異種蛋白をコ−ド付けするｃＤＮＡ類、発現ベクタ−類および宿主類

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JP2580303B2 JP63502127A JP50212788A JP2580303B2 JP 2580303 B2 JP2580303 B2 JP 2580303B2 JP 63502127 A JP63502127 A JP 63502127A JP 50212788 A JP50212788 A JP 50212788A JP 2580303 B2 JP2580303 B2 JP 2580303B2
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Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は異種ポリペプチドの発現に関する。さらに詳
しくは、本発明はエシェリヒア・コリ（Escherichia co
li）において高レベルで発現されるソマトトロピンをコ
ード付けする新規なcDNA類を開示する。突然変異したイ
ー・コリ（E.coli）宿主細胞よりなる一般的発現系およ
び二重レプリコン配置を有する発現ベクターも本明細書
中にて開示する。
情報の開示 形質転換微生物による種々の種類の動物からのソマト
トロピンの発現は公知である（ゲデル・デイ・ブイら
（Goeddel,D.V.,et al.）、「ヒト成長ホルモンについ
てコード付けするDNA配列のエシェリヒア・コリ（Esche
richia coli）における直接発現」、ネイチャー（Natur
e）、281:544−548（1979）；およびシーブルグ・ピイ
・エイチら（Seeburg,P.H.,et al.）、「ウシおよびブ
タ成長ホルモンの効果的な細菌発現」、デイー・エヌ・
エイ（DNA）、2:37−45（1983））。
天然に生じるウシ・ソマトトロピン（BSt）は異種蛋
白の混合物であり、そのアミノ酸配列は公知である（パ
ラジニ・エイ・シイら（Paladini,A.C.,et al.）、「成
長ホルモンの分子生物学」、シイ・アール・シイ・レビ
ューズ・イン・バイオケミストリー（CRC Reviews in B
iochem.）、15（１）:25−56（1983））。天然に生じる
該混合物はウシの下垂体から精製されてきた。BStを成
長および授乳の促進に用いることについての商業的可能
性はよく認識されており、乳牛および肉牛双方について
の生物学的研究によって記述されている（エパード・ピ
イ・ジェイおよびバウマン・デイ・イー（Eppard,P.J.a
nd Bauman,D.E.）、「乳牛への授乳を実行するのに対す
る成長ホルモン長期投与の効果（The Effect of Long−
Term Administration of Growth Hormone on Performab
ce of Lactating Dairy Cows）」；およびバウマン・デ
イ・イー（Bauman,D.E.）、「反芻動物の成長速度およ
び乳腺の発育に対する成長ホルモンの効果（Effect of
Growth Hormone on Growth Rats and Mammary Developm
ent of Ruminnants）」、飼料製造業者のコーネル（Cor
nell）栄養会議1984年会報、５−17頁、コーネル大学に
より出版、イシカ（Ithaca）、ニューヨーク州）。
組換体ウシ・ソマトトロピン（rBST）は種々の遺伝的
組換体プラスミドを用いて形質転換微生物で産生できる
（欧州特許出願47600号；英国特許出願GB2073245A号；
およびショーネル・ビイ・イーら（Schoner,B.E.,et a
l.）、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）におけ
るウシ成長ホルモン発現についてのmRNA翻訳効率の役
割、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミ
ー・オブ・サイエンシズ（Proc.Natl.Acad.Sci.）USA、
81:5403−5407（1984））。
BStの同族体も公知である（欧州特許出願103395号；
およびショーネル・ビイ・イーら（Schoner,B.E.,et a
l.）前掲）。本発明とは異なり、BStのこれらの同族体
はBSt遺伝子の5'末端にて塩基を挿入または欠失し、そ
れにより天然に生じるアミノ酸配列と異なる蛋白をつく
りだすことに関するものである。好ましいコドンを最大
化するためのrBSt cDNAに対する修飾はGCCないしGCTの
最初の２つの天然アラニンコドンを変化させることを包
含する（欧州特許出願111814号）。しかしながら、欧州
特許出願111814号は、好ましいコドン置換および二次構
造の減少は発現の最大化に対して臨界的であることを教
示するものである。本発明は、cDNAをランナウェイ−レ
プリコン型プラスミドと組み合わせた場合、これらの公
知変化の多くは高レベルの発現を達成するのに不必要で
あることを示す。
BStを発現する形質組換微生物を培養しおよび発酵す
る方法も公知であり、前記引例文献に詳細に記載されて
いる。
形質転換細胞からの生物学的に活性なrBStの精製も以
前に記載されている（米国特許第4511502号；第4511503
号；第4512922号；第4518526号；欧州特許出願131843
号；およびショーネル・アール・ジイら（Schoner,R.
G.,et al.）、「BStを過剰産生するイー・コリ（E.col
i）細胞からの蛋白顆粒の単離および精製」、バイオー
テク（Bio−Tech.）、3:151−154（1985））。
本発明は、天然ソフトトロピンcDNAに比し、高レベル
で発現されるソフトトロピンおよびソマトトロピンの同
族体をコード付けするcDNA類を開示する。ブタおよびウ
シ・ソマトトロピンの天然cDNA類がほとんどのイー・コ
リ（E.coli）系にて商業的に許容されるレベルで発現さ
れないことおよびかかる発現にはcDNAにおける変化が必
要であることは公知である。cDNAにおける好ましいコド
ンのパーセンテイジを増加させようとする試みは効果が
ほとんどなく、許容できる高レベルの発現に到達するた
めに、研究者達はcDNAの実質的な修飾に頼っていた。シ
ーブルグ・ピイ・エイチら（Seeburg,P.H.,et al.）、
ディー・エヌ・エイ（DNA）、2:37−45（1983）は、ウ
シ・ソマトトロピンの天然cDNAにおけるアミノ酸残基11
についてのコドンの後に存在する強い二次構造を除去す
ることによって発現を増大させた（欧州特許出願75444
号も参照）。彼らは、二次的なステム・ループ構造の除
去は発現を促進すると仮説をたてた；この研究は読む者
の注意を−12Kカロリー／モル過剰の水素結合領域に導
くであろう。本発明は、高レベルの発現は実質的な塩基
配列の変化を含む必要がないことを教示する。むしろ、
rBSt cDNAの最初の４つのコドンにおいて塩基対の変化
をより少なくすることによって、非ランナウェイプラス
ミドにおける発現の実質的増大を達成できる。ランナウ
ェイプラスミドと組み合わせると、本発明のcDNA類はよ
り高いレベル、商業的に許容できるレベルで発現され
る。
rBStを発現するためのランナウェイプラスミドの使用
は公知である（欧州特許出願159123号および111814
号）。いずれの出願もrBStのアミノ末端について本明細
書中で開示する正確なDNA配列を開示するものではな
い。
欧州特許出願103395号は、もし最初の３ないし９のト
リプレットコドンが欠失されると、イー・コリ（E.col
i）におけるrBStの発現はBStの天然cDNAについての少な
くとも100倍以上になることを開示している。欧州特許
出願103395号は、また、シャイン−ダルガノ領域に干渉
する二次構造を除去するために初期コドンにおいて点突
然変異を使用できる可能性を間接的に示唆するものであ
るが、BSt蛋白のその部分の一次アミノ酸配列を変更す
ることなく、有意な効果を伴ってかかる変化を実現する
ことはできないと結論している。
発明の要約 本発明は、イー・コリ（E.coli）宿主細胞がソマトト
ロピン様蛋白を産生することを可能とするように該宿主
細胞を形質転換するのに有用な、好ましくはランナウェ
イ型レプリコンを含有する発現プラスミドに関し、該プ
ラスミドはウシ、ブタおよびヒツジ・ソマトトロピンよ
りなる群から選択されるソマトトロピンならびにその同
族体をコード付けするcDNAを含有し、ここに該ソマトト
ロピンをコード付けする最初の４つのコドンは ａ）GCC TTC CCA GCT; ｂ）GCT TTC CCA GCT; ｃ）ACC TTC CCA GCC; ｄ）GCC TTC CCA GTC; ｅ）AAA TTC CCA GCC; ｆ）TTC TTC CCA GCC;および ｇ）TTC CCA GCC ATG よりなる群から選択される。
好ましいランナウェイ型レプリコンはコペンハーゲ
ン、デンマークのA/Sアルフレッド／ベンゾン（Alfred
Benzon）から商業的に入手可能なR1突然変異に由来する
ものである。特に、ベンゾンのpBEU♯シリーズ中に見い
出されるレプリコン、すなわち、同じランナウェイレプ
リコンであるpBEU−50またはpBEU−17である。最も好ま
しいのは、ランナウェイレプリコンがpBR322からの元の
レプリコンと組み合わされて入れられた発現プラスミド
である。これらのキメラプラスミドはイー・コリ（E.co
li）において例外的に高いレベルのソマトトロピンの発
現を生じる。好ましいイー・コリ（E.coli）宿主細胞
は、rpoHまたはhflB遺伝子（後記参照）のいずれかの突
然変異を有するものである。最も好ましいのは、rpoH11
2またはhflB29対立遺伝子を有する宿主細胞である（後
記参照）。
二重レプリコン配置を有する前記発現プラスミドは一
般には異種遺伝子の発現に用いられるものであり、rpoH
またはhflB遺伝子、好ましくはrpoHl12およびhflB29対
立遺伝子のいずれかにおいて突然変異を有する好ましい
イー・コリ（E.coli）宿主細胞と組み合わせた場合に特
に有利である。ソマトトロピンの発現に加えて、宿主と
ベクターのこの組合せはキモシン、インターフェロンも
しくはインターフェロン様蛋白類、インターリューキン
類、インシュリン、ウイルス蛋白類、ウロキナーゼ、コ
ロニー刺激因子、腫瘍懐死因子、蛋白Ｃ等の如き生物学
的に重要な蛋白の発現に有用である。
定義 「発現ユニット」なる語は転写、翻訳に必要なおよび
調節遺伝子産生物による識別に必要な、構造遺伝子調節
遺伝子および制御要素を包含する遺伝子発現および調節
の完全なユニットを含有するDNA配列を意味する。
「異種の」なる語は、遺伝子について言及する場合、
安定なプラスミドにより、またはゲノム中への取込みい
ずれかにより該遺伝子が宿主細胞に挿入されたことを示
し、蛋白について言及する場合、該蛋白が異種遺伝子の
産生物であることを示す。異種蛋白は宿主細胞によって
通常は産生されないあるいは通常は限定量で産生される
蛋白である。
「天然の」は天然源から生じるアミノ酸または核酸の
配列をいう。「天然蛋白」は天然に生じる蛋白と同一の
一次構造を有する蛋白である。オリゴヌクレオチドまた
はコドンについては、天然核酸配列は天然に生じるもの
と同一である。例えば、天然に生じるmRNAから合成した
cDNAの塩基対配列は天然配列ということになる。組換体
遺伝子もしくは蛋白については、天然配列は、所望によ
り、アミノ末端に存在するメチオニンまたはメチオニン
残基をコード付けする開始コドンATGの存在を包含させ
てもよい。
「BSt」はアミノ末端にala−phe−pro−ala−metまた
はphe−pro−ala−metを有する蛋白の異種混合物を包含
するウシ・ソマトトロピンをいう。本出願の目的には、
ナンバリング目的では最初のコドンまたは残基はアラニ
ンであると考えられる。類縁語句はウシ成長ホルモン、
BGH、組換体ウシ・ソマトトロピン、またはrBStを包含
する。組換体BStは所望によりそのアミノ末端にメチオ
ニン残基をさらに有していてもよい。
「レプリコン」は組換DNAクローニングおよび発現プ
ラスミドの複製を制御するDNA配列をいう。
「ランナウェイレプリコン」はコピー数制御を欠くか
またはそれを喪失するよう誘導できるかのいずれかであ
る配列を含有する。かかる喪失の結果、複製の非制御が
起こり、ランナウェイレプリコンが組み込まれたDNA分
子のコピー数が増加する。類縁語句はランナウェイレプ
リコンを含有するプラスミドであるランナウェイ型プラ
スミドまたはランナウェイプラスミドを包含する。
「ソフトトロピン」は哺乳動物、魚類および爬虫類の
成長ホルモンをいう。語句「天然の」によって限定され
ないならば、語句「ソマトトロピン（類）」は成長ホル
モン活性が維持されるのを可能とするアミノ酸配列の十
分な同一性があるこれらの蛋白の同族体を包含する。か
かる同族体は下垂体からの精製調製物中に見い出される
異種の種と同一のアミノ酸配列を有する組換産生ソマト
トロピン、および欧州特許出願103395号および75444号
に記載されている如きソマトトロピンをコード付けする
DNA類の修飾によって人工的につくりだされた同族体を
包含する。加えて、rBStの一次配列において、いずれの
Ｌアミノ酸もそのＤ異性体で置き換えることができ、分
子それ自体の活性に影響を与えることなく種々のアミノ
酸を交換することができる。かくして、例えば、（１）
アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリンおよびプロ
リンは交換可能であり、（２）フェニルアラニンおよび
トリプトファンは交換可能であり、（３）セリン、スレ
オニンおよびチロシンは交換可能であり、（４）アスパ
ラギンおよびグルタミンは交換可能であり、（５）リジ
ン、アルギニン、ヒスチジンおよびオルニチンは交換可
能であり、および（６）アスパラギン酸およびグルタミ
ン酸は交換可能である。
「形質転換微生物」は分子遺伝学でよく知られた技術
を用いて人工的に細胞に挿入されたプラスミドを含有す
るまたはそれを宿らせる原核生物もしくは真核生物の単
細胞生物をいう。
詳細な記載 本発明は組換体微生物類において真核生物成長ホルモ
ン遺伝子の高レベル発現を生じる突然変異体cDNA配列を
調製する方法を提供するものである。特に、異なるベク
ターにて成熟ウシおよびブタ成長ホルモンのイー・コリ
（E.coli）中での高レベル合成を得るのに有用ないくつ
かのcDNAの組み立てを説明する。比較のため、ヌクレオ
チドの変化を伴うおよび変化を伴わない、BSt cDNAを含
有するプラスミドについて、発現された産生物の量を提
示する。第１表は成熟BSt cDNAのコーディング配列を記
載するものであり、第２表は天然cDNAに比較し、発現を
促進させるためにBSt cDNAの５′領域に導入した突然変
異を記載するものである。第２表のオリゴヌクレオチド
は以下に記載する方法により化学的に合成したものであ
る。
A.一般法 一般に、命名法の定義ならびに本発明で用いる一般的
な実験室的手法の記載はマニアティス・ティら（Maniat
is,T.,et al.）、モレキュラー・クローニング・ア・
ラボラトリー・マニュアル（Molecular Cloning,A Labo
ratory Manual）、コールド・スプリング・ハーバー・
ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）、コ
ールド・スプリング・ハーバー（Cold Spring Harbo
r）、ニューヨーク（1982）の記載中に見い出される。
該マニュアルを以下「マニュアティス」といい、ここに
参照のために挙げる。
すべてのイー・コリ（E.coli）株はルリア・ブロス
（LB）、グルコースを含んだLB、ディフコ（Difco）の
抗生物質培地♯２、またはグルコースおよび酸加水分解
カゼインアミノ酸を補足したM9培地上で培養する。抗生
物質耐性株はマニアティスに記載されている薬剤濃度で
維持する。
形質転換はモリソン・ディ・エイ（Morrison,D.
A.）、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（J.Bacter
iol.）、132:349−351（1977）、またはクラーク−クル
ティス・ジエイ・イーおよびクルティス・アール（Clar
k−Curtiss,J.E.and Curtiss,R.）、メト・エンザイモ
ル（Meth.Enzymol.）、101:347−362（1983）によって
記載されている方法によって行う。
すべての酵素は製造業者の指示にしたがって用いる。
制限フラグメントはアガロースもしくはポリアクリルア
ミドゲル電気泳動いずれかによって分離し、電気溶出
（マニアティス）またはガラス粉末上への吸着によって
単離する（ボゲルスタイン・ビイ・およびグレスピー・
デイ（Vogelstein B.and Gillespie,D.）、プロシーデ
ィングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイ
エンシズ（Proc.Natl.Acad.Sci.）USA、76:615−619（1
979）。
大規模なかつ急速なプラスミドの単離はマニアティス
に記載されている如くに行う。
蛋白濃度はコーマシー・ブルー結合に基づき、バイオ
ラド（BioRad）製蛋白アッセイキットを用いて測定す
る。
蛋白分析についてのSDSポリアクリルアミドゲル電気
泳動はモース・エルら（Morse,L.et al.）、ジャーナル
・オブ・バイロロジー（J.Virol.）、26:389−410（197
8）、およびレムリィ・ユー・ケイ（Laemmli,U.K.）、
ネイチャー（Nature）（ロンドン（London））226:680
−685（1970）に記載されている如くに行う。
ウェスタン・イムノブロッティング分析はトウビン・
エイチら（Towbin,H.,et al.）、プロシーディングズ・
オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ
（Proc.Natl.Acad.Sci.）USA、76:4350−4354（1979）
に記載されている如くに行った。
コロニーハイブリダイゼーションはグルンステイン・
エムら（Grunstein,M.et al.）、プロシーディングズ・
オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ
（Proc.Natl.Acad.Sci.）USA、72:3961−５（1975）に
一般的に記載されている如くに行う。フィルターは次い
で十分に風乾し、80℃にて２時間真空中にて加熱する。
オリゴヌクレオチドプローブについてのハイブリダイ
ゼーション条件は以前にゲデル・デイ・ブイら（Goedde
l,D.V.,et al.）、ネイチャー（Nature）、290:20−26
（1981）によって記載されている通りである。ハイブリ
ダイゼーションの後、プローブ含有溶液を取り出し、保
存し、フィルターを0.1％SDS、５×SSCで洗浄する。フ
ィールターを風乾し、セットし、コダック製Ｘ−OMAT A
Rフィルムおよびデュポン製クロネックス・ライトニン
グ（Cronex Lightning）と増感スクリーンを用いて−70
℃にてラジオオートグラフィーに付す。
プラスミドの配列決定には、ホームズ・デイ・エスら
（Homes,D.S.et al.）、アナリティカル・バイオケミス
トリー（Anal.Biochem.）、114:193（1981）の方法によ
り、またはマニアティスに記載されているアルカリ溶解
法によってプラスミドDNAのミニ溶解物を調製する。ジ
デオキシ配列決定は日本鎖プラスミドを用い、サンガー
・エフら（Sanger,F.et al.）、ジャーナル・オブ・モ
レキュラー・バイオロジー（J.Mol.Biol.）、143:161−
178（1977）によって行う。ジデオキシ含有反応物は90
℃で２分間加熱し、氷上でクエンチすることによって電
気泳動用に調製する。調製した８％変成ポリアクリルア
ミドゲルに１レーンあたり２〜３μｌを与え、サンガー
およびクルソン（Sanger and Coulson）、エフ・イー・
ビイ・エス・レターズ（FEBS Lett.）、87:107−110（1
978）に準じて実行する。
ヌクレオチドの大きさはキロベース（kb）または塩基
対（bp）いずれかで表す。
商業的に入手不可能なオリゴヌクレオチドは、ニード
ハム−バンデバンター・デイ・アールら（Needham−Van
Devanter,D.R.et al.）、ヌクレイック・アシッズ・リ
サーチ（Nucleic Acids Res.）、12:6159−6168（198
4）に記載されている如く、自動合成装置を用い、固相
ホスホルアミデイト・トリエステル法により化学的に合
成できる（ボカージ・エス・エルおよびカルサーズ・エ
ム・エイチ（Beaucage,S.L.and Caruthers,M.H.）、テ
トラヘドロン・レターズ（Tetrahedron Letts.）22（2
0）:1859−1862（1981））。オリゴヌクレオチドを精製
した後、ウォーターズ製Sep−PakC18カラム上でそれら
を脱塩する。合成オリゴヌクレオチドの配列は、マキサ
ム・エイ・エムおよびギルバート・ダブリュー（Maxam,
A.M.and Gilbert,W.）、メソッズ・イン・エンザイモロ
ジー（Methods in Enzymology）、65:499−560（1980）
の化学分解法を用いて確認する。別法として、マキサム
およびギルバートの方法、前掲、またはワレイス・アー
ル・ビイら（Wallace,R.B.et al.）、ジーン（Gene）、
16:21−26（1981）の二本鎖鋳型の配列決定についての
鎖停止法（chain termination method）を用いてオリゴ
ヌクレオチドフラグメントをプラスミド中に組み立てた
後、該配列を確認できる。オリゴヌクレオチドを組み立
てるには、リンカー中に結ぶべきオリゴヌクレオチドの
５′−OH末端を、オリゴヌクレオチド 1μｇあたりγ−
32P−ATP 2μCiの存在において、T4ポリヌクレオチドキ
ナーゼでリン酸化し、続いて過剰の非標識ATPで追跡す
る。アニーリングは50mMトリス−HCl、pH7.8、10mM MgC
l2中で、10分で90℃まで加熱し、続いて２〜４時間にわ
たって室温までゆっくり冷却することによって行う。15
℃において１時間インキュベートしならびにATPを0.5mM
まで、DTTを20mMまで、および400U T4 DNAリガーゼを添
加した後、反応混合物を15℃にて一晩インキュベートす
る。標準物として標識化したHaeIII消化φX174DNAを用
いる10％ポリアクリルアミドゲル電気泳動、続いての電
気溶出（マニアティス）およびエタノールでの沈澱によ
って、正しく組み立てられたリンカーを精製する。
B.原核生物における発現 クローン化遺伝子の原核生物系での高レベル発現を達
成するためには、mRNA転写を指示する強力なプロモー
タ、および少なくとも翻訳開始用のリボソーム結合部位
を含有する発現ベクターを組み立てることが必須であ
る。多量の遺伝子産生物の蓄積はしばしば細胞の成長を
抑制し、時々細胞の死滅をひき起こすので、産生物の合
成を指示するために選択したプロモータは、プロモータ
の導入前に細胞の成長が高密度に達すことができるよう
に調製すべきである。この目的に適した調整領域の例
は、イー・コリ（E.coli）トリプトファン生合成経路の
プロモータおよびオペレータ領域ならびにファージラム
ダ（PL）の左方プロモータである。該trpプロモータは
トリプトファンの存在において抑制され、トリプトファ
ン飢餓によりまたは誘導物質インドールアクリル酸によ
って誘導される（ヤノフスキイ・シイら（Yanofsky,C.,
et al.）、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（J.Ba
cteriol.）、158:1018−1024（1984））。プロモータPL
はリプレッサーcIによって制御される。cI遺伝子、例え
ば、cI857における温度感受性突然変異によって、PLは3
8℃を超える温度で誘導される（ヘルスコビィツ・アイ
およびハーゲン・デイ（Herskowitz,I.and Hagen,
D.）、アヌ・レブ・ジェネト（Annu.Rev.Genet.）、14:
399−445（1980））。最も好ましいのは、発現されるべ
き遺伝子を挿入するためにシャイン−ダルガノ配列から
適当な距離に制限酵素部位を有する発現ベクターであ
る。
真核生物遺伝子によってコード付けされる蛋白をその
cDNA配列からイー・コリ（E.coli）細胞内で合成するに
は、５′非翻訳領域およびシグナルペプチドについてコ
ード付けする配列を除去し、該蛋白についてコード付け
する配列の翻訳開始用開始コドンを供給するのが便利で
ある。翻訳効率を最大化するには、蛋白についてのコー
ディング領域のいくつかを化学的に合成したオリゴヌク
レオチドで置き換えることも必要であろう。本発明は特
に欠失した５′非翻訳領域、プレ配列、および成熟BSt
の最初についての66bpコーディング配列を有する切断BS
t遺伝子を記載する。この切断BSt配列を発明者らの発現
ベクターpTrpl中にクローンしてプラスミドpTrp−BStml
bを得る。発現用の切断BSt配列を完成するには、オリゴ
ヌクレオチドをpTrp−BStmlbに挿入する。該オリゴヌク
レオチドは、アミノ酸残基における変化を伴いまたは伴
わずに、最適発現に導く変化に一体化させるように設計
できる。
本発明の好ましい具体例は高コピー数プラスミドまた
はランナウェイ型複製開始点を利用する。すべてのプラ
スミドがそこからプラスミドの複製が起こるDNA配列を
有することは公知である。これらの配列は性質が種々あ
り、一般に複製開始点（ori）もしくはレプリコンとい
う。ある場合には、該oriは複製についてのイー・コリ
宿主蛋白を用いることによって機能できるが、他のもの
はプラスミドによってコード付けされた蛋白因子をさら
に必要とする。
細胞当たりのプラスミドのコピーの数（すなわち、コ
ピー数）は、複製開始点におけるおよびプラスミドコー
ド付け遺伝子の調節における変化によって影響され得
る。構成性的にまたは制御条件下においてのいずれかで
プラスミド複製を増大せしめるベクター突然変異は単離
されている。構成性的高コピー数のプラスミドの例はベ
セスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（Bethesda Reserch
Labs）、ガイセルスブルグ（Gaithersburg）、メリー
ランド州、米国、から入手可能なpUC19（ヤニシューペ
ロン・シイら（Yanisch−Perron,C.et al.）、ジーン
（Gene）、33:103−119（1985）；およびpHC314（ボロ
ス・アイら（Boros,I.et al.）、シーン（Gene）、30:2
57−260（1984）である。制御条件下でのプラスミド複
製の増加はプラスミド「ランナウェイ」という。制御メ
カニズムは、通常、培養温度におけるシフトである。本
明細書中にて用いられる好ましい「ランナウェイ」ベク
ター系はRIプラスミド由来のものであった。RIのベクタ
ー誘導体の温度感受性突然変異は二工程選択にて単離し
た（ウリンおよびノルドストロム（Uhlin and Nordstro
m）、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネチィ
クス（Mol.Gen.Genet.）、165:167−179（1978）；およ
びウリンら（Uhlin et al.）、ジーン（Gene）、6:91−
106（1979））。加熱誘導に際し、これらのベクターは
細胞中に75％もの合計DNAを含むことができる。
RIプラスミドの複製領域は約2.5kbのDNA配列上に集め
られる（ライダーら（Ryder et al.）、ジーン（Gen
e）、17:299−310（1982））。この領域は少なくとも３
つの遺伝子および複製開始点を含有する（ライトおよび
モリン（Light and Molin）、イー・エム・ビイ・オー
・ジャーナル（EMBO J.）、2:93−98（1983）；ライト
ら（Light et al.）、モレキュラー・アンド・ジェネラ
ル・ジェネティクス（Mol.Gen.Genet.）、198:503−508
（1985））。該遺伝子はcopB、copA、およびrepAであ
る。repA蛋白の産生は該oriにおける複製を開始させる
ように作用する。開始事象の数は産生されたrepA蛋白量
に比例する。copAおよびcopB遺伝子産生物の機能はつく
られるrepA蛋白量を調製することである。copB産生物は
repAの特異的プロモータに結合するリプレッサー分子で
ある（リイゼおよびモリン（Riise and Molin）、プラ
スミド（Plasmid）、15:163−171（1986）；ジブスコフ
ら（Givscov et al.）、ジーン（Gene）、57:203−211
（1987））。repA遺伝子は、また、上流のcopBプロモー
タから発現される。copA遺伝子は、copBおよびrepAと反
対方向に転写されるそれ自身のプロモータを有し、repA
mRNAにハイブリダイズするアンチセンスRNAを産生し、r
epA mRNAの翻訳開始効率を減少させる。
本明細書中にて用いるpBEU−50およびpBEU−17の如き
ベンゾン（Benzon）ベクターはRIに由来する元の二段階
温度制御ランナウェイベクターからのものであった（ウ
リンおよびノルドストロム（Uhlin and Nordstrom）、
前掲；ウリンおよびクラーク（Uhlin and Clark）、
「モレキュラー・バイオロジー・パソジェニシティ、ア
ンド・エーコロジー・オブ・バクテリアル・プラスミズ
（Molecular Biology,Pathogenisity,and Ecology of B
acterial Plasmids）、エス・ビイ・レビイ・アール・
シイ・クロウェスおよびイー・エル・ケーニッヒ（S.B.
Levy,R.C.Clowes and E.L.Koenig）編、プレナム・プレ
ス（Plenum Press）、670頁（1981））。これらのベク
ターは２つのプロモータ突然変異を含有する。第１のも
のはアンチセンスcopA RNA量を減少させるcopAプロモー
タにおける突然変異であり、第２のものは高温で転写開
始を増大させるcopBプロモータにおける突然変異である
（ジブスコフら（Givscov et al.）、前掲））。pBEU−
50ベクターを含有するイー・コリ細胞を30℃またはそれ
以下の温度で増殖させる。細胞を34℃以上の温度にシフ
トすると、プラスミドコピー数が増大し、これは今度は
ベクター中にクローンされた遺伝子の発現を増幅する
（ウリンら（Uhlin et al.）、前掲））。
pBR322レプリコンおよびpBEU−17のランナウェイレプ
リコンよりなるキメラベクターは本発明の修飾されたソ
マトトロピンを特に高レベルで発現する。低レベルのプ
ロテアーゼ活性を示す２種のイー・コリ株と組み合わせ
ると、発現レベルは極端に高くなる。
イー・コリにおけるいくつかの遺伝子が細胞中でのプ
ロテアーゼの発現に影響を与えることは公知である。こ
れらの遺伝子はlon、hflA、hflB、およびropHを包含す
る（セル（Cell）、41:587−595（1985）；プロシーデ
ィングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイ
エンシズ（Proc.Natl.Acad.Sci.）USA 81:6647−6651
（1984）；プロシーディングズ・オブ・ナショナル・ア
カデミー・オブ・サイエンシズ（Proc.Natl.Acad.Sc
i.）USA、81:6779−6783（1984）；セル（Cell）、31:5
65−567（1982）；ジェネティクス（Genetics）77:435
−448（1974））。rpoHまたはhflB突然変異のいずれか
を含有する株は、本明細書中において修飾された如く、
特にランナウェイプラスミドと組み合わせた場合にrBSt
の発現を促進することが証明された。好ましい対立遺伝
子はrpoHll2およびhflB29である。他の低プロテアーゼ
株はrBStの発現を促進することができない。
組換体微生物から哺乳動物ソマトトロピンを単離およ
び精製する技術は当該分野においてよく知られている
（例えば、米国特許第4511502号、第4512922号、第4518
526号；欧州特許出願131843号；およびショーナー・ア
ール・ジイら（Schoner,R.G.et al.）、前掲参照）。簡
単に述べれば、該手順は細胞の溶解、選択的遠心、天然
コンフィギュレーションに対するいずれかの非天然ジス
ルフィド結合の再配置、およびカラムクロマトグラフィ
ーを含む。
チャート１〜14におけるプラスミドおよびフラグメン
トを表わす約束は以下の通りである：チャート上の単一
線図は、プロモータまたは構造遺伝子下方に示された矢
印の方向に翻訳開始または転写が起こる環状および線状
二本鎖DNAを共に表す。星印（＊）はプラスミドの環状
形を完成させるためのヌクレオチドの架橋を表わす。フ
ラグメントは二本鎖DNAの線状片であるから、それらは
星印を有しない。エンドヌクレアーゼ制限部位は線の上
方に示す。遺伝子マーカーは線の下方に示す。マーカー
間の相対的な間隔は現実の距離を示すものではなく、単
に示されたDNA配列上でのそれらの相対的な位置を示す
意図である。
実施例１ 非ランナウェイベクターにおけるrBStの発現 Ａ）発現ベクターpTrp1 微生物において異種蛋白を発現するための原核生物発
現ベクターは、好ましくは、転写を伝達するための強力
な調節可能なプロモータおよび翻訳開始用の強力なリボ
ソーム結合部位を有する。イー・コリにおける成熟BSt
の発現用に、本発明者らは、pSK4由来の発現ベクターpT
rp1を組み立てた（カイテス・ピイ・エスら（Kaytes,P.
S.,et al.）、ジャーナル・オブ・バイオテクノロジー
（J.Biotech.）、4:205−218（1986））。pTrp1はイー
・コリ・トリプトファンオペロンのプロモータおよびオ
ペレータ配列、trpL遺伝子のシャイン−ダルガノ配列、
pBR322からの複製開始点およびアンピシリン耐性用遺伝
子を含有する。pTrp1はtrpLシャイン−ダルガノ配列に
続く唯一のClaI部位および開始コドン、ATG、の直後の
唯一のKpnI/Asp718部位を有する。pTrp1のClaI部位に開
始コドンを有する遺伝子の挿入は、その遺伝子の発現を
可能にする。KpnI/Asp718部位における遺伝子の挿入
は、どの部位が用いられるかに応じて、アミノ酸glnま
たはglnとvalとの融合として、その遺伝子を発現する結
果となる。
pTrp1を作成するには、チャート１に示すごとく、２
つの相補的オリゴヌクレオチドをpSK4に挿入する。プラ
スミドpSK4はtrpオペロンのプロモータ／オペレータ領
域ならびにやはりアンピシリンに対する耐性を特異化す
るpBR322にクローンされたtrpLリボソーム結合部位を含
有する。trp配列を包含する大きなBamHI/ClaIフラグメ
ントをpSK4から切り出し、アガロースゲルから電気溶出
によって精製する（フラグメント１）。２つの相補的オ
リゴヌクレオチドを組み合わせてフラグメント２を得
る。フラグメント２は５′および３′末端において各々
CalIおよびBamHI粘着末端を有し、それをフラグメント
１に結ぶ。KpnI/Asp718部位を含むクローンおよびtrpプ
ロモータを特徴とする制限パターンを選択し、これをpT
rp1と呼ぶ。pTrp1におけるtrpプロモータから下流の配
列は配列決定法によって確認する。
Ｂ）切断BSt遺伝子の組み立て ５′非翻訳領域、プレ配列、およびBStの最初につい
てコード付けする配列を欠失するために、494bp PvuII
フラグメント３をpLG23から単離する（チャート２）。
ブダペスト条約に従って、1981年、５月12日にpLG23を
米国イリノイ州、ペオリア（Peoria）にあるノーザン・
リージョナル・リサーチ・ラボラトリー（Northern Reg
ional Research Laboratory）に寄託し、受託番号NRRL
B12436を与えられた。pLG23は５′および３′非翻訳領
域を包含し、pBR322のPstIにクローンされた、BStにつ
いての全長cDNAを含有する。宿主微生物はイー・コリHB
101である。このプラスミドの特徴は、1982年12月15日
に公開された欧州特許出願67026号および1981年６月１
日出願の米国特許出願269187号に十分に記載されてお
り、共にここに参照のために挙げる。フラグメント３
は、BStのアミノ酸残基24〜188についてコード付けする
cDNA配列を含有する（第１表参照）。次いで、あらかじ
めKpnIで消化したpTrp1にフラグメント３を結び、クレ
ノーフラグメントで処理して粘着末端を除去する（フラ
グメント４）。BStフラグメントを所望の向きにベクタ
ーへ結んで、最初の22のアミノ酸塩基についてのコドン
を失ったBSt cDNA配列を得る。特徴的な制限パターンで
選択し、DNA配列決定法で確認した所望のクローンをpTr
p−BStmlと名付ける。
BSt cDNAは、２つのPvuII部位、アミノ酸残基23につ
いてのコドンにおける１つおよび残基188における１
つ、を含有する。切断したBSt配列の操作を容易にする
ために、pTrp−BStm1において第２のPvuII部位を除去す
る。アミノ酸残基を変化させることなくこのPvuIIを除
去するために、pTrp−BStm1におけるMstIIおよびBamHI
間の56bp領域をオリゴヌクレオチドで置き換える。チャ
ート３において、大きなBamHI/MstIIフラグメント５をp
Trp−BStmlから単離し、組み立てた４つのオリゴヌクレ
オチドに結び、単離してフラグメント６を得る。pTrp−
BStmlbと呼ぶ得られたプラスミドを特徴的な制限パター
ンによって選択し、DNA配列決定法によって確認する。p
Trp−BStm1bにおいて、pTrp−BStm1における如くBSt配
列を切断する。すなわち、最初の22のアミノ酸について
のコドンを失わせる。MstII部位の後における３′末端
の配列を修飾してPvuII部位を除去し、アミノ酸配列を
変更することなくHindIII部位を導入する。２つの停止
コドン、続いてBamHI部位を遺伝子の末端直後に導入す
る。
Ｃ）BSt発現用プラスミドの組み立て 成熟BStの高レベル発現を得るために、４つのオリゴ
ヌクレオチドを用いてTrp−BStmlbにおいて小さいClaI
ないしPvuII領域を置き換えてBSt配列を失わせる。ベク
ター中のもう１つのPvuII部位の存在のために、ベクタ
ーを２つの部分に分離するのはより簡単である。チャー
ト４に示す如く、4.3kbMstII/ClaIフラグメント７をpTr
p−BStmlbから単離する。このフラグメントはtrpプロモ
ータ／オペレータ、trpLシャイン−ダルガノ配列、pBR3
22複製開始点、アンピシリン耐性決定基、およびBSt遺
伝子の３′末端を含有する。また、BStアミノ酸残基24
ないし176についてコード付けする配列を含有する450bp
PvuII/MstIIフラグメント８をpTrp−BStmlbから単離す
る。フラグメント７および８をフラグメント９、すでに
組み立て精製した４つのオリグヌクレオチドのブロッ
ク、に結ぶ。プローブとして４つのオリゴヌクレオチド
のうち１つを用いるコロニーハイブリダイゼーションに
より選択し、DNA配列決定法によって確認した、得られ
たプラスミドをpTrp−BStm4と呼ぶ。pTrp−BStm4におい
て、BSt遺伝子の最初においてなされた唯一の変化はGCC
ないしGCTの位置４におけるアラニンについてのコドン
の変化である。
遺伝子の最初において他の変化を伴ってBSt発現用プ
ラスミドを組み立てるために、ブロックにおいて４つと
して組み立てた他のオリゴヌクレオチドを用いてフラグ
メント７および８に結ぶ。第２表において、用いたオリ
ゴヌクレオチドブロックおよび得られたプラスミドを掲
げる。なされた変化は星印を付したヌクレオチドで示
し、以下にまとめる。イー・コリK12においてBStを発現
するこれらの組立体の相対的能力は以下の通りである： 実施例２ ランナウェイベクターにおけるcDNA由来の遺
伝子 102、m4およびm5での誘導 Ａ）ランナウェイベクターp50−102、p50−BStm4および
p50−BStm5の組み立て 実施例１に従って組み立てたBSt遺伝子の増強された
発現突然変異をランナウェイレプリコンを有するプラス
ミドで用いることもできる。ランナウェイレプリコンに
ついてのベクター源はpBEU−50という名称であり、デン
マーク、コペンハーゲンDK1700のA/Sアルフレッド・ベ
ンゾン（Alfred Benzon）から商業的に入手可能であ
る。このベクターは約10kbの大きさであり、温度感受性
copBプロモータおよびcopAについてのダウン（down）プ
ロモータを有する。該ベクターは、また、テトラサイク
リン（tet）およびアンピシリン（amp）に対する耐性遺
伝子も有する。
チャート５に示す如く、pBEU−50のプラスミドDNA
を、各々ベクターDNAを１回切断するEcoRIおよびBamHI
で消化した。該消化により0.375kbおよび10kbのフラグ
メントが生じる。該10kbフラグメントを電気溶出によっ
てアガロースゲルから単離した（フラグメント10）。
EcoRIおよびBamHIで消化することによって、rBSt遺伝
子を含有するEcoRI/BamHIフラグメントをpTrp−BSt10
2、pTrp−BStm4およびpTrp−BStm5から単離した。この
消化により3.9kbおよび0.872kbフラグメントが生じる。
該0.872kvフラグメント（フラグメント11）を前記した
如くにアガロースゲルから単離した。フラグメント11は
トリプトファンプロモータおよびトリプトファン先導リ
ボソーム結合部位をコード付けする約240bpを含有す
る。該フラグメントの残りはrBSt cDNA遺伝子をコード
付けする。
該フラグメントをpBEU−50から単離したフラグメント
10と結ぶことによって３つのrBSt cDNAフラグメント
（チャート５におけるフラグメント11に例示）を各々ク
ローンした。かく産生されたプラスミドをコンピテント
イー・コリに入れて形質転換した（マニアティス）。元
のEcoRI/BamHIフラグメントをrBStフラグメントで置き
換えることによってテトラサイクリン耐性遺伝子を機能
的に破壊する。形質転換からのコロニーをテトラサイク
リン感受性についてスクリーニングし、選択したコロニ
ーからのDNAを制限消化によって分析して組み立てを確
認した。得られたベクターをp50−102、p50−BStm4およ
びp50−BStm5と呼ぶ。BStの最初において修飾を有しな
いp50−102を組み立てて、BStがala4（p50−BStm4）な
らびにalalおよびala4（p50−BStm5）についてのコドン
において修飾されたp50−BStm4およびp50−BStm5と比較
した。同様の方法を用いることによって、実施例１から
の他の新規なcDNA類を用いてp50−MBSt4、p50−MBSt1
2、p50−BSt［phe］、p50−BSt［lys］、およびp50−BS
tm3と名付けられた同様なプラスミドを組み立てること
ができる。
Ｂ）二重レプリコンランナウェイベクターの組み立て 以下の実施例は、本明細書中にて記載するソマトトロ
ピンの発現に有用なレプリコンの新規組合せの組み立て
についての詳細を示すものである。この分類のキメラベ
クターをpURAと名付ける。組み立てにおける最初の工程
はランナウェイレプリコンおよびベンゾン（Benzon）族
プラスミドからの連合遺伝子の単離を含む（チャート６
参照）。2.4kb AhaII−Nde Iフラグメント（フラグメン
ト12）をA/Sアルフレッド・ベンゾンから商業的に入手
可能なpBEU−50に類縁のpBEU−17と呼ばれるベンゾンベ
クター（13.8kb）から単離した。フラグメント12（3.6k
b）はベクターの完全な複製領域を含有するものであ
り、これをpBR322のNarIおよびNdel部位にクローンし
た。該クローニングによりpBR322の約2kbがpBEU−17か
らの2.4kbで置き換えられる。AhaIIおよびNarI制限部位
は相補末端を有し、NarI部位が再生される。NdeI部位も
再生される。ベクターは二重の複製開始点、１つはpBEU
−17からのもの、およびもう１つはpBR322ベクターから
のもの、を含有する。得られたベクターをpURAと名付け
る（5kb）。このベクターも元のpBR322プラスミドに存
在していたEcoRIおよびBamHIについての唯一の制限部位
を含有する。
pURAシリーズのキメラプラスミド、例えば、実施例１
からのpTrp−BStm4によりコード付けされたBSt（m4遺伝
子）、を用いてソマトトロピンを発現させるために、発
現ベクターpURA−m4を三重結びから組み立てた（チャー
ト７）。結んだのは：（１）trpプロモータ、trp先導リ
ボソーム結合部位、およびm4遺伝子（フラグメント13）
を含有するp50−BStm4（チャート５）からの単離したEc
oRI−BamHIフラグメント（875bp）；（２）（チャール
ズ・ヤノフスキイ（Charles Vanofsky）博士、スタン
フォード医学校、から入手した）プラスミドベクターpV
V202Tからの350bp BamHIフラグメント（フラグメント1
4）として単離したイー・コリ遺伝子rpoBCについての転
写ターミネータ、および（３）pURAをEcoRIおよびBamHI
で消化した後単離したpURAプラスミドベクターフラグメ
ント（4.6kb、フラグメント15）であった。フラグメン
ト13〜15を混合し、結び、コンピテントイー・コリに入
れて形質転換した。形質転換クローンからのベクターDN
Aを分析し、イー・コリ（E.coli）染色体におけるrpoBC
遺伝子に対するのと同一の、m4遺伝子の転写に対する向
きにターミネータを有するベクターをpURA−m4（5.8k
b）と名付けた。
pURA−m4の模式図をチャート７に示す。
選択した特定の転写ターミネータが本発明において有
用な唯一のターミネータではないことに注意すべきであ
る。多くの効果的なrho独立転写ターミネータのうちい
ずれも置き換えることができる。これらのターミネータ
の総説についてはセル（Cell）、32:1029−1032（198
3）およびアヌ・レブ・ジエネト（Ann.Rev.Genet.）、1
3:319−53（1979）参照。
同様にしてpTRp−BStm5、p50−MBSt4、p50−MBSt12、
p50−BSt［phe］、p50−BSt［lys］、およびp50−BStm3
からのBSt遺伝子をpURAに挿入してpURA−m5 pURA−MBS
t4、pURA−MBSt12、pURA−BSt［phe］、pURA−BSt［ly
s］、pURA−BStm3を得ることができる。
Ｃ）rBSt発現用イー・コリ主の組み立て イー・コリ祖先株をアメリカン・タイプ・カルチャー
・コレクション（American Type Culture Collectio
n）から入手し、これをATCC e23716と名付ける。この
株はバクテリオファージラムダに対して溶原性であり、
やはりＦプラスミドを有する（バックマン・ビイ・ジェ
イ（Bachmann,B.J.）、バクト・レブ（Bact.Rev.）、3
6:525−557（1972）。
ラムダ溶原菌を該株から除去した。これは、ミラー・
ジェイ・エイチ（Miller J.H.）、エクスペリメンツ・
イン・モレキュラー・ジェネチィクス（Experiments i
n Molecular Genetics）、コールド・スプリング・ハ
ーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor Labora
tory）（1972）、によって記憶されている如くPlvirバ
クテリオファージ形質導入法によって行った。該Plvir
バクテリオファージはコールド・スプリング・ハーバー
・ラボラトリーズ（Cold Spring Harbor Laboratori
es）、コールド・スプリング・ハーバー（Cold Spring
Harbor）、ニューヨークから「遺伝子融合株キットに
関する実験（Experiments with Gene Fusion Str−
ain Kit）」の一部として入手可能である。
バクテリオファージPlvirをコリ・ジェネチック・ス
トック・センター（Coli Genetic Stock Center）、
c/oバーバラ・バックマン（Barbara Bachmann）博士、
イェール大学、ニュー・ハーベン（New Haven）、コネ
ティカット州06510から入手可能なイー・コリ株CGSC618
0上で増殖させた。この株はバクテリオファージラムダ
に対して溶原性でなく、（キノリネートシンセターゼの
Ａ蛋白をコード付けする）nadA遺伝子に挿入されたTn10
要素を含有し、バクテリオファージラムダの組み込み部
位に隣接して位置する。該Tn10要素はnadA遺伝子を破壊
し、細胞をしてニコチンアミドの外性源に依存せしめ
る。該Tn10要素はテトラサイクリン耐性についてコード
付けする遺伝子を有する。CGSC6180（nadA::Tn10）から
のPlvir溶解物を用いて、テトラサイクリン耐性につい
て選択することによってnadA::Tn10対立遺伝子をATCC
e23716に形質導入した。バクテリオファージT4rIIに対
する感受性により、該選択からの多くのコロニーを隣接
ラムダフファージの組換ロスについてテストした（ベン
ゼル・エス（Benzer,S.）、プロシーディングズ・オブ
・ナシュナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Pro
c.Natl.Acad.Sci.）USA、47:403−408（1961））。正常
なnadA遺伝子を有しかつラムダに対して溶原性でない
（該コリ・ジェネティク・ストック・センター（Coli
Genetic Stock Center）、ニューハーベン・コネチカ
ット州から入手可能な）W3110株上でPlvirを増殖させる
ことによってnadA::Tn10対立遺伝子を除去した。ニコチ
ンアミドを補足していない培地上で細胞を平板培養する
ことによって正常なnadA対立遺伝子についての選択を行
った。
次に、４μg/mlリファンピシン（rifampicin）の存在
において細胞を、多世代の間、増殖させることによって
該Ｆプラスミドを除去した。Ｆプラスミドを失った細胞
をＦプラスミド特異性バクテリオファージの増殖を支持
するそれらの能力によって同定した（カロ・エル・ジイ
・およびエム・シュノス（Caro,L.G.and M.Schnos）、
プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・
オブ・サイエンシズ（Proc.Natl.Acad.Sci.）USA、56:1
26−131（1966）。得られた株をK12Dと名付けた。
Ｃ）K12D株におけるp50−102、p50−BStm4およびp50−B
Stm5べクターの誘導 アンピシリン耐性について選択することによってベク
ターをコンピタントK12D細胞に入れて形質転換した。10
0μg/mlアンピシリンを含有するLB培地中で３種の培養
物を一晩増殖させた。翌日、細胞を1/50だけ同一培地中
に継代培養し、約275rpmに設定したニュー・ブルンスウ
ィック（New Brunswick）振盪インキュベーター中の滅
菌フラスコを用いて27℃にてインキュベートした。O.D.
550nm0.2〜0.3まで培養物を増殖させ、次いで38.5℃ま
でシフトしてランナウェイ複製を誘導した。
誘導後、サンプルをとり、SDS−PAGEゲル分析によっ
て分析した（レムリィ（Laemmli）、前掲）。ゲルをコ
ーマシー・ブルーで染色し、スキャンして目に見えるrB
St量を測定した。
p50−102の誘導について検出可能なrBStはなかった。
p50−BStm4またはp50−BStm5いずれかを含有する培養物
により、13なしい18領域パーセント間のBStが産生され
た。p50−102およびp50−BStm4を含有する誘導細胞の20
O.D.サンプル中に存在するrBSt量間についてHPLCでの
比較を行った。p50−102は検出可能なrBStを示さず（0.
00mg/ml）、p50−BStm4は、179.02mg/mlを示した。
これらの結果は、GCCないしGCTのBStの第４番目の位
置におけるアラニンについてのコドンにおける単一塩基
の変化がランナウェイプラスミドにおいて高レベルのrB
St産生をひき起こすことを示す。
実施例３ rpoH112およびhflB29対立遺伝子でのイー・
コリ宿主の組み立て イー・コリ株CAG671をカロール・グロス（Carol Gro
ss）博士、（ウィスコンシン大学、マディソン（Madiso
n）、ウィスコンシン州）から入手した。この株はrpoH1
12対立遺伝子を含有し、隣接挿入のzhg::Tn10を有する
ものであった（グロスマン・エイ・デイら（Grossman,
A.D.et al.）、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー
（J.Bact.）、161:939−943（1985））。バクテリオフ
ァージPlvirをCAG671株上で増殖し、かつ溶解物を用い
ることによって、rpoH112対立遺伝子をK12Dに導入してK
12D株をテトラサイクリン耐性に形質導入し（rpoH112対
立遺伝子に隣接して位置するTn10におけるコード付
け）、およびrpoH112対立遺伝子において共形質導入し
た（ミラー・ジェイ・エイチ（Miller,J.H.、前
掲））。得られた株をD112と名付け、ブダペスト条約に
従って1987年２月４日にアグリカルチュラル・リサーチ
・サービス・カルチャー・コレクション（Agricultural
Research Service Culture Collection）、ノーザ
ン・リージョナル・リサーチ・センター（Northern Re
gional Research Center）、ノース・ユニバーシティ
・ストリート（North University Srteet）1815、ペ
オリア（Peoria）、イリノイ州61604、USAに寄託し、受
託番号NRRL Ｂ−18168が与えられた。
イー・コリ株x9393はロナルド・ソメルビル（Ronald
Sommerville）博士（プルドゥ（Purdue）大学、イン
ジアナ州）から入手した。この株はhflB29対立遺伝子、
および隣接するTn10要素を含有する（バネット・エフら
（Banuett,F.et al.）、ジャーナル・オブ・バイオロ
ジー（J.Biol.）、187:213−224（1986））。rpoHにつ
いて記載したのと同様の方法によって該hflb29対立遺伝
子をK12D株に導入した。得られた株をB29と名付けた。
実施例４ rpoH112およびhflB29対立遺伝子ならびに二
重レプリコンプラスミドと共にイー・コリ宿主を用いる
BSTの発現 ベクターpURA−m4をイー・コリ株K12D、D112（rpoH112
を有するK12D）およびB29（hflB29を有するK12D）のコ
ンピテント細胞に入れて形質転換した。27℃エヤー振盪
器中のLBブロスを含有する振盪フラスコ中で培養物を増
殖させた。所望の時点で、培養物を37℃振盪器に移して
ランナウェイベクター複製およびrBSt発現を誘導した。
その後、加熱シフトに先立ってサンプルを何回か採取し
た。該サンプルをSDS−PAGEおよびゲル・スキャンニン
グによって分析した。結果は、rBStがK12Dにおいて目に
見える蛋白13.3％、B29において32％、およびD112にお
いて41％に達したことを示す。
これらの結果は、天然cDNAにおける開示された修飾を
行った場合、ランナウェイプラスミドの異なる組み合わ
せによってrBStの発現が促進されるが、rpoHもしくはhf
1B対立遺伝子を含有するイー・コリ株にキメラプラスミ
ドを入れた場合、特に有利な発現レベルの上昇があるこ
とを示す。
実施例５ ランナウェイプラスミド複製およびpURA−m4
でのrBStの合成の自然誘導 Ａ）rBSt合成の自然誘導とプラスミドランナウェイ複製
の自然誘導との間の関係 ランナウェイ複製ベクターpURA−m4を含有し、かつ発
酵に適合した株D112（BST−１と呼ぶ、以下の節Ｃ参
照）の培養物を、グルコースと酵母エキスもしくはカザ
ミノ酸いずれかとを補足した明確な無機塩培地のフラス
コに接種した。28℃でインキュベートし、A550のO.D.に
て37℃に移した振盪フラスコからサンプルを得、SDS−P
AGEに付した（レムリィ（Laemmli）、前掲））。かかる
サンプルは、プラスミドランナウェイ複製の熱誘導性お
よびpURA−m4を特徴づけるrBSt発現のため、認め得るrB
St合成を示した。しかしながら、同一の培地を含有する
対のフラスコから得られ、同一の培養物を接種するが終
始28℃でインキュベートしたサンプルをSDS−PAGE分析
に付した場合、認め得るrBSt合成も観察された。これら
の観察は、株BST−１が自然に（すなわち、非熱的に）r
BSt合成を誘導できることを示す。
グルコースおよび酵母エキスを補足した明確な無機塩
培地中で行った発酵によって、rBSt合成の自然誘導を受
けるpURA−m4の能力を確認した。さらに、これらの発酵
によって、rBSt合成の自然誘導がプラスミドランナウェ
イ複製の自然誘導が起こると同時に起こることが確立さ
れた。熱誘導の不存在において、pURA−m4は自然に実質
的により高いコピー数まで増加した。第３表のデータ
は、プラスミドコピー数の自然誘導とrBSt合成の自然誘
導間の関係を示す。接種後約15時間まで、逆相HPLC分析
に付したサンプル中にrBStの蓄積が検出された。プラス
ミドコピー数（プラスミドDNA含量）における同様の一
時的増加が終始28℃で行った発酵の間にpURA−m4につい
て観察された。
Ｂ）rBSt合成の不存在におけるプラスミドランナウェイ
複製の自然誘導可能性 EcoRIおよびHindIII制限部位と境界を接する約850塩
基対フラグメントを除去し、かくしてrBSt合成をコード
付けする遺伝子を欠失することによってプラスミドpURA
4ΔbghE/HをプラスミドpURA−m4から組み立てた（チャ
ート13）。イー・コリ株BST−1C、42℃における明確な
最小培地上での増殖により得られ、かつDNA伝達形質転
換によってpURA−m4が除去されたことが見いだされた株
BST−１のプラスミドなしの誘導体、にプラスミドpURA4
ΔbghE/Hを導入した。得られた株はrBStを合成するこ
とができなかった。イー・コリ宿主株BSt−1Cをブダペ
スト条約に従って1988年２月２日、アグリカルチュラル
・リサーチ・サービス・カルチャー・コレクション（Ag
ricultural Research Service Culture Collection）、
ノーザン・リージョナル・リサーチ・センター（Northe
rn Regional Research Center）、ノース・ユニバーシ
ティ・ストリート（North University Street）1815、
ペオリア（Peoria）、イリノイ州61604、米国に寄託
し、受託番号NRRL Ｂ−18303が与えられた。
グルコースおよび酵母エキスを補足した明確な無機塩
培地中で行った発酵からのデータは、ランナウェイプラ
スミド複製の自然誘導を受ける株BST−1C（pURA4 Δbg
hE/H）の能力を示す。株BST−１から得られた調製物を
含有するプラスミドと比較した場合、BST−1Cからの調
製物（pURA4 ΔbghE/H）により、両株からのプラスミ
ドはそれらの各発酵の終わりまで非常に似たレベルまで
自然に増加することがはっきりした（第４表）。従っ
て、ランナウェイ複製の実質的に高レベルのプラスミド
コピー数までの自然誘導は本質的に宿主rBSt合成から独
立しているものであった。
Ｃ）自然誘導についての発酵条件 ここに記載するのはpURAプラスミドで形質転換したイ
ー・コリ宿主についての好ましい発酵プロトコルであ
る。
これらの実験で用いる株の組立体をBST−１と名付け
た。
BST−１は、pURA−M4で形質転換したD112株を以下に記
載する発酵種培地に適用することによって得られるもの
であった。BST−１は株BST−1C（前記）をpURA−m4（前
記）で形質転換することによっても産生できる。
２種の発酵培地、RB6およびRB7を実験で用いた。これ
らの培地の組成および調製法は以下の通りである： Ａ）培地調製手順： １）培地RB6: 16lファーメンター中、前記成分をR.O.水にて全量を
8.3lとし、12l℃にて20分間滅菌し、次いで冷却する。
ファーメンターを接種するに先立って、滅菌した500g/l
グルコース溶液、微量養素9mlおよび滅菌した25g/lアン
ピシリン溶液をファーメンターに無菌的に加える（以下
の「発酵添加」の節参照）。
２）培地 RB7: その他の手順はRB6についてのものに同じ。
３）発酵添加： ａ）微量養素溶液（200ml）： 成分
量(ク゛ラム) FeSO4・H2O 5.22 クエン酸・H2O
5.04 痕跡量成分＊8mlを前記成分に加え、全量を200mlと
し、0.22ミクロンフィルターを通す経路により滅菌す
る。
（＊）痕跡量成分溶液を以下の通りに調製する： 成分
量(mg) クエン酸・H2O 7000 H3BO4 247.4 MnCl2・4H2O 158.0 CoCl2・6H2O 71.4 （NH4）6Mo7O24・4H2O ZnSO4・7H2O 28.8 CuSO4 15.
9 蒸留水で全量を100mlとする。
ｂ）500g/リットルのグルコース添加（675ml）： １リットル振盪フラスコ中のグルコース338gをR.O.水
で全量を675mlとし、十分量の1N H2SO4を添加してpHを
４まで低下させ、121℃にて20分間滅菌する。
ｃ）25g/lアンピシリン添加（300ml）： アンピシリン9gをR.O.水360mlに溶解することによっ
て25g/lアンピシリン溶液を調製する。1N NaOHを滴下
することによって懸濁液をpH8.0まで滴定する。0.45ミ
クロンフィルターを用いて得られた溶液を滅菌し、冷蔵
し、24時間内に用いる。
（滅菌後）培地RB6またはRB7の９リットルを含有する
16リットルのファーメンターを振盪フラスコからのブロ
ス30mlで接種する。培養物の貯蔵および種培養物の調製
の手順は以下の通りである： Ｂ）アンプルおよび種調製手順 １）以下の培地を用いるペトリ皿を調製する。
前記成分をR.O.水で全量250mlとし、綿栓でシールし
た500mlエルレンマイヤーフラスコ中の得られた溶液を1
21℃にて20分間滅菌し、次いでフラスコを50℃の水浴に
入れる。培地を加熱フラスコからあらかじめ滅菌したペ
トリ皿に移す。層流のフード下、皿の覆いを支柱で支え
て開放した状態で、皿を一晩放置して乾燥させる。覆っ
た皿を逆の姿勢で貯蔵する。
２）液体窒素の気相下で貯蔵したイー・コリの１本のア
ンプルの内容物で前記調製ペトリ皿を線条接種すること
によって、組換体イー・コリの単コロニーを調製する。
該ペトリ皿を28℃にて２日間インキュベートする。
３）以下の培地を含有する３つの振盪フラスコを調製す
る。
前記振盪フラスコを綿栓でシールし、それらを121℃
にて20分間滅菌し、次いで使用前にそれらを室温まで冷
却する。
４）単コロニーを無菌的にフラスコへ継代することによ
って前記各フラスコを接種する。320rpm、28℃に設定し
た環境制御インキュベーター振盪器中に振盪フラスコを
入れる。振盪フラスコの１つを定期的にサンプリング
し、１％ホルムアルデヒド9mlで希釈したサンプル1mlの
550nmにおける吸光度を測定する。吸光度0.3が得られた
ならば、残りの２つの振盪フラスコを冷蔵し、冷蔵後24
時間内にこれらのフラスコのうち１つを発酵種として用
いる。
５）以下の培地を含有する６つの振盪フラスコを調製す
る： 前記振盪フラスコを綿栓でシールし、それらを121℃
にて20分間滅菌し、使用前に室温まで冷却する。
６）アンピシリン９グラムをR.O.水360mlに溶解するこ
とによって25g/lアンピシリン溶液を調製する。アンピ
シンリを完全に溶解させるために、滴下により1N NaOH
を加えることによって懸濁液をpH8.0まで滴定する。0.4
5ミクロンのフィルターを用いて溶液を滅菌し、冷蔵す
る。溶液を24時間内に用いる。
７）各振盪フラスコに種1mlおよびアンピシリン溶液0.3
mlを無菌的に加えることによって前記振盪フラスコを接
種する。320rpm、28℃に設定した環境制御インキュベー
ター振盪器中に振盪フラスコを入れる。振盪フラスコの
うち１つを定期的にサンプリングし、１％ホルムアルデ
ヒド9mlで希釈したサンプル1mlの吸光度を550nmにて測
定する。吸光度0.1になると、残りの振盪フラスコを冷
蔵する。
８）アンプル充填に先立ちグリセロール67gを各振盪フ
ラスコに加える。
９）アンプルに充填するのに固定した送液ポンプを使用
する場合、送溶容量を1mlに設定する。アンプルに充填
する間、氷冷し、時々培養物を攪拌する（アンプルは充
填に先立って冷却しなければならない）。
水酸化アンモニウム（50重量％）のオン／オフpH制御
を用いて発酵ブロスのpHを制御する。回転およびエアレ
ーション速度は、各々、600rpmおよび13.5slmに設定
し、ファーメンターにおける逆圧、pH、および温度は各
々10psig、7.2および27℃で制御する。
27℃にて、９リットルの規模でBST−１を培地RB6上で
培養した。細胞密度0.5g/l（乾燥重量）における自然誘
導を過ぎると暗色の極封入小体が形成された。発酵の32
時間後、各々1.59g/lおよび5.1g/lのBStおよび細胞収率
が得られた。
実施例６ pURA−m4に関するプラスミド維持安定性 Ａ）BST−１振盪フラスコ培養物におけるpURA−m4の安
定性 28℃にて、アンピシリンなしの複合液体培地中で数世
代増殖させた培養物で行った実験の間に、株BST−１に
おけるpURA−m4の維持安定性を定量した。培養物から一
部を順次とり、10-5の希釈にて、アンピシリンなしの新
鮮な複合培地を含有するフラスコに継代培養した。28℃
におけるインキュベーションに続き、該プロセスを繰り
返した。各継代サイクルの最初および最後に、培養物サ
ンプルをとり、希釈し、40μg/mlアンピシリンを補足し
たまたは補足してないいずれかの複合培地上の平板にて
平板培養し、28℃にてインキュベートした。（アンピシ
リンなしの）合計活性集団の定量により、以下の式： ｎ＝（1nX−1nX0）/1n2 に従っての、各継代サイクル間に起こる合計世代数
（ｎ）の見積りが可能となった。両培地上で定量した活
性集団の比較により、以下の： PSF＝（Ap平板上のCFU/ml）／（非補足平板上のCFU/m
l） に従っての、プラスミド安定性頻度（PSF）の見積りが
可能となった。
≧95％の細菌がアンピシリン耐性であると検出された
如く、プラスミドpURA−m4が131.9世代までと、長い増
殖の間安定であることをデータは示した。
Ｂ）BST−１のファーメンター培養物におけるpURA−m4
の安定性 アンピシリンなしの培地中における5000リットル規模
での発酵の間に、株BST−１におけるpURA−m4の安定性
を定量した。発酵を行っている間に何回かサンプルの一
部を無菌的に取り出し、前記（実施例６、Ａ）の如く取
り扱って、起こった細菌の世代数およびプラスミド安定
性頻度を見積もった。pURA−m4が18.4世代の発酵の間完
全に安定であったことをデータは示した。
実施例７ ブタ・ソマトトロピン（PSt）の発現 Ａ）発現ベクターpTrp−conSDの組み立て さてチャート８を参照し、pTrp−conSDを作成するた
めには、チャート８に示された如くオリゴヌクレオチド
を用い、pSK4におけるHpaI−HindIII領域を置き換え
る。
pSK4をHindIII、細菌アルカリ性ホスファターゼ（BA
P）およびHpaIで処理してフラグメント16を得る。フラ
グメント17は合成によって産生するが、それは、組み立
て、次いで精製した４つのオリゴヌクレオチドを含有す
る二本鎖DNA配列である。フラグメント16および17を一
緒に結び、クローン化する。
Trpプロモータに特徴的な制限パターンを有するクロー
ンを選択し、これをpTrp−conSDと名付ける。pTrp−con
SDにおけるTrpプロモータの下流配列を配列決定法によ
って確認する。発現ベクターpTrp−conSDはトリプトフ
ァンオペロンのプロモータおよびオペレータ領域、なら
びにアンピシリン耐性を有するpBR322バックグランドに
おけるイー・コリ（E.coli）コンセンサスシャインダル
ガノ（conSD、GGAGG）配列を含有する。
Ｂ）PStを含有するプラスミドの組み立て さてチャート９を参照し、PStについてのcDNAの調製
法は公知である（ピイ・エイチ・シーブルグら（P.H.Se
eburg et al）、ディー・エヌ・エイ（DNA）、2:37−4
5、1983;および欧州特許出願111389号、米国特許出願43
9977号）。GCテイリングによって、pBR322のPstI部位に
cDNAをクローニングする。５′および３′非翻訳領域を
包含するPStについての全長cDNAはPstI消化によってベ
クターから切除できる。このPstIフラグメント（フラグ
メント19900bp）は２つのHgiAl部位、プレ配列における
１つおよび成熟配列の第15コドンにおける１つ、を含有
する。切断したPSt cDNA配列を含有する660bp HgiAl
−PstIフラグメントを２つのオリゴヌクレオチドと一緒
に発現ベクターpTrp−conSDにクローニングする。チャ
ート９に示す如く、pTrp−conSDをKpnI、クレノーフラ
グメントおよびClaIで処理してフラグメント18を得る。
次いでフラグメント18をフラグメント20および21に結
ぶ。フラグメント20は５′末端におけるHgiAl粘着末端
および３′末端における平滑PstIと共に成熟PSt配列の
最初の14のコドンについて切断したPSt cDNAを含有す
る。フラグメント21は成熟PStについての最初の14コド
ン、翻訳開始コドン、ATG、pTrp−conSDへ結ぶためのCl
aI粘着末端、およびPStフラグメントに結ぶためのHgiAl
粘着末端を含有する２つの相補的オリゴヌクレオチドの
アニール産生物である。得られた組立体、pTrp−PSt1、
においてPStの発現はpBR322バックグランドにおけるTrp
プロモータの制御下にある。このPStにおける第４番目
のアラニンについてのコドンを天然cDNAにおけるGCCか
らGCTに変化させる。
同様にして、PSt cDNAにおいて変化がなされていない
pTrp−PStcを組み立てる。
Ｃ）PSt1遺伝子のpURA発現ベクターへの導入 コンセンサスシャインダルガノ配列と組み合わせ、UR
AベクターのキメラランナウェイレプリコンおよびTrpプ
ロモータを用いるPSt発現ベクターの組み立てをここに
詳細に述べる。
チャート10を参照し、pURAベクターをEcoRIおよびBam
HI制限酵素で消化し、二重複製oriおよびアンピシリン
耐性遺伝子を含有するフラグメント22（4.6kb）を前記
した如く単離する。
pTrp−PSt1ベクター（チャート９）を制限酵素EcoRI
およびBamHIで消化し、フラグメント23（900bp）を前記
した如く単離する。フラグメント23はtrpプロモータ、
コンセンサスリボソーム結合部位および修飾したブタ・
ソマトトロピン遺伝子を含有する。フラグメント22およ
び23を結んでpURA−PSt1（チャート10）を得る。プラス
ミドpURA−PSt1を次いでイー・コリのコンピテント細胞
に入れて形質転換する。クローニングの確認はクローン
の制限消化およびDNA配列決定法によって行う。
このベクターがブタ遺伝子の末端における転写ターミ
ネータを必要としない。cDNAに由来する遺伝子のコード
領域下流のDNA配列はイー・コリにおける十分な転写停
止活性を有する。
Ｄ）イー・コリにおけるPSt発現の誘導 プラスミドpURA−PSt1をコンピテントD112細胞に入れ
て形質転換し、rBStについて前記した如く誘導する。rP
Stの単離についての手法もrBStについて記載したに同じ
である。発現レベルは全細胞蛋白の25％に達した。
実施例８ TrpLシャインダルガノ配列でのブタ・ソマト
トロピン（PSt）の発現 Ａ）発現ベクターpTrp−trpL−PStcおよびpTrp−trpL−
PSt1の組み立て さらにブタ遺伝子組立体PStcおよびPSt1の発現レベル
を評価するために、これらの遺伝子をTrpプロモータお
よびtrpLシャイン−ダルガノ配列の制御下に置いた。
チャート11を参照し、発現ベクターpTrp1（実施例
１）をTrpプロモータおよびTrpLシャイン−ダルガノ配
列の源として用いた。pTrp1をまずKpnIで消化し、クレ
ノーフラグメントで処理して平滑末端を得る。次いで該
DNAをClaIで切断し、大きなベクターフラグメント（フ
ラグメント24）を前記した如く精製する。PSt遺伝子のc
DNAクローンのPstI消化物（実施例５）をクレノーフラ
グメントで処理して平滑末端を得、次いでHgiA1で切断
する。次いでこのフラグメント（フラグメント20）を精
製する。２つのDNAオリゴヌクレオチドから合成二本鎖D
NAリンカーフラグメントを組み立てる。２つの合成リン
カーフラグメントを作成する。第１のものはPStの第２
アラニンコドンについてGCCないしGCT変化を有し（フラ
グメント25）、第２のリンカーは非修飾PSt cDNA配列を
有する（フラグメント26）。フラグメント20、24および
25を結んでpTrp−trpL−PSt1を得、フラグメント20、24
および26を結んでpTrp−trpL−PStcを得る。
Ｂ）trpL−PStcもしくはtrpL−PSt1遺伝子いずれかを含
有するpURAベクターの組み立て trp先導シャイン−ダルガノ配列（trpL）と組み合わ
せてpURAベクターのキメラランナウェイレプリコンおよ
びtrpプロモータを用いるPSt発現ベクターの組み立てを
ここに詳しく述べる（チャート12）。
pURAベクターをEcoRIおよびBamHI制限酵素で消化し、
フラグメント22（4.6kb）を単離する。pTrp−trpL−PSt
cおよびpTrp−trpL−PSt1ベクター（チャート11）を制
限酵素EcoRIおよびBamHIで消化し、各消化から約900bp
のフラグメントを単離する。pTrp−trpL−PStcからおよ
びpURA−trpL−PSt1からかく産生したフラグメントを各
々フラグメント27および28と名付ける。フラグメント22
および27を結んでpURA−trpL−PStcを得る。フラグメン
ト22および28を結んでpURA−trpL−PSt1を得る。クロー
ニングの確認は制限分析およびDNA配列決定法によって
行う。
Ｃ）pURA−trpL−PStcおよびpURA−trpL−PSt1の誘導 プラスミドpURA−trpL−PStcおよびpURA−trpL−PSt1
を株D112のコンピテント細胞に入れて形質転換し、rBSt
について前記した如くに誘導する。誘導のサンプルをSD
S−PAGE、コーマシー・ブルー染色およびゲルスキャン
ニングによって分析する。ブタ・ソマトトロピンはpURA
−trpL−PStc誘導で検出できなかった。pURA−trpL−PS
t1の誘導は合計可視蛋白約５％の高レベルに発現される
ブタ・ソマトトロピンを示した。
実施例９ ヒト・インターリューキン−１β（IL−１
β）の発現 Ａ）IL−１β遺伝子を含有するプラスミドの組立 ヒトIL−１β配列のクローニングは、５′非翻訳領域
の一部およびIL−１βの全てのコード領域を含有し、停
止コドンの後で終了するcDNA配列から由来したものであ
った。このcDNA配列はヒトSK−Hep−１細胞系から組み
立てたものであり、pTrp1（チャート１）にクローニン
グしてpTrp−IL1−１を得た。もう１つの継代クローニ
ングを行って成熟IL−１β配列を含有するpTrp−conSD
−HC−IL1−１を組み立てた。これらのプラスミドの組
み立ては公表されている（デイ・ビイ・カーターら（D.
B.Carter,et al）、1988、プロテインズ：ストラクチャ
ー・ファンクション・アンド・ジェネティックス（Prot
eins:Structure,Function and Genetics）の出版物をこ
こに参照のために挙げる）。プラスミドpTrp−conSD−H
C−IL1−１をチャート14に示す。
プラスミドpTrp−conSD−HC−IL1−１をEcoRIおよびB
amHIで消化し、得られた790塩基対のフラグメントを単
離し、次いで混合し、pURAの4.6キロベース対EcoRI/Bam
HIフラグメント（チャート６）で結んでpURA−IL−１−
1Aを得る。続いてpURA−IL−１−1AをBamHIで消化し、
混合し、pVV202TのBamHIフラグメント14（チャート７）
で結んでpURA−IL−１−1Cを得る。
Ｂ）IL−１β発現の自然誘導 ベクターpURA−IL1−1CをBST−1Cのコンピテント細胞
に入れて形質転換した。BST−1Cの種培養物（pURA−IL1
−1C）をグルコース、酵母エキス、およびトリプトファ
ンを補足した明確な無機塩培地を含有する振盪フラスコ
中で増殖させ、終始28℃でインキュベートした。グルコ
ースおよびカザミノ酸を補足した明確な無機塩培地に培
養物の一部を継代培養し、次いで培養物を終始28℃でイ
ンキュベートした。培養物サンプルを定期的にとり、SD
S−PAGE分析、続いてのゲルのデンシトメーター追跡に
付して、得られたIL−１βレベルを定量した。第５表の
データは、IL−１β産生がかかる条件下で自然に誘導さ
れ、かかる自然誘導の結果、培養O.D.1A550において28
℃から37℃にシフトする（熱的誘導）以外は、同一培地
中で同様の培養によって達成されるものと非常に似たIL
−１βレベルとなった。
チャート1.pTrp1の組み立て （ａ）pSK4をClaIおよびBamHIで切断してフラグメント
１（4.2kb）を単離する。
（ｂ）二本鎖DNAの合成配列、フラグメント２、をフラ
グメント１に結んでpTrp1（4.3kb）を得る。
AmpR＝アンビシリン耐性 Ｄ＝Trpプロモータ／オペレータ Ｅ＝シャイン−ダルガノ配列 Ｃ＝合成配列 チャート2.pTrp−BStm1の組み立て （ａ）pLG23をPvuIIで切断してフラグメント３（494k
b）を単離する。
（ｂ）pTrp1をKpnIおよびクレノーで処理してフラグメ
ント４（4.3kb）を得る。
（ｃ）フラグメント３をフラグメント４に結んでpTrp−
BStm1を得る。
AmpR＝アンピシリン耐性 Ｄ＝Trpプロモータ／オペレータ Ｅ＝シャイン−ダルガノ配列 Ｃ＝合成配列 Ｂ＝BSt配列 チャート3.pTrp−BStm1b （ａ）pTrp−BStm1をMstIIおよびBamHIで切断してフラ
グメント５（4.8kb）を単離する。
（ｂ）４つのオリゴヌクレオチドを組み立ててフラグメ
ント６を得る。
（ｃ）フラグメント６をフラグメント５に結んでpTrp−
BStm1bを得る。
AmpR＝アンピシリン耐性 Ｄ＝Trpプロモータ／オペレータ Ｅ＝シャイン−ダルガノ Ｃ＝合成配列 Ｂ＝BSt配列 チャート4.pTrp−BStm4 （ａ）pTrp−BStm1bをMstIIおよびC1aIで切断してフラ
グメント７（4.3kb）を得る。
（ｂ）pTrp−BStm1bをPvuIIおよびMstIIで切断してフラ
グメント８（450kb）を単離する。
（ｃ）４つのオリゴヌクレオチドを組み立ててフラグメ
ント９を得る。
（ｄ）フラグメント７、８、および９を結んでpTrp−BS
tm4（4.8kb）を得る。
AmpR＝アンピシリン耐性 Ｄ＝Trpプロモータ／オペレータ Ｅ＝シャイン−ダルガノ配列 Ｃ＝合成配列 Ｂ＝BSt配列 チャート5.p50−BStm4の組み立て （ａ）プラスミドpBEU50をEcoRIおよびBamHIで消化し、
大きな10kbフラグメント10をゲル単離する。
（ｂ）プラスミドpTrp−BStm4（チャート４）をEcoRIお
よびBamHIで消化してフラグメント11（.872kb）を得、
これをゲル単離する。
（ｃ）フラグメント10および11をアニールし、T4リガー
ゼを用いて結んでp50−BStm4を得る。
Amp＝アンピシリン耐性 Ｄ＝Trpプロモータ／オペレータ Ｅ＝シャイン−ダルガノ配列 Ｃ＝合成配列 Ｂ＝BSt配列 CopB＝RepAを調節する遺伝子 CopA＝RepAを調節する遺伝子 RepA＝ランナウェイ複製を開始する遺伝子 Ori＝pBR322からのレプリコン チャート6.pURAの組み立て （ａ）ベクターpBEU−17（13.8kb）をAhaIIおよびNdeI
で消化してフラグメント12（2.4kb）を得る。
（ｂ）あらかじめNarIおよびNdeIで消化したpBR322（4.
4kb）にフラグメント12を挿入し、結んでpURA（5.0kb）
を得る。
CopB＝RepAを調節する遺伝子 CopA＝RepAを調節する遺伝子 RepA＝ランナウェイ複製を開始する遺伝子 Ori＊＝pBEU−17からのランナウェイレプリコン Ori＝pBR322からのレプリコン Amp＝アンピシリン耐性 チャート7.pURA−m4の組み立て （ａ）p50−BStm4（チャート５）をEcoRIおよびBamHIで
消化してTrpプロモータおよびrBSt遺伝子を含有するフ
ラグメント13（875kb）を得る。
（ｂ）pVV202TをBamHIで消化して転写ターミネータを含
有するフラグメント14（350kb）を得る。
（ｃ）pURA（チャート６）をEcoRIおよびBamHIで消化
してフラグメント15（4.6kb）を得、フラグメント13お
よび14で結んでpURA−m4（5.8kb）を得る。
CopB＝RepAを調節する遺伝子 CopA＝RepAを調節する遺伝子 RepA＝ランナウェイ複製を開始する遺伝子 Ori＊＝pBEU−17からのランナウェイレプリコン Ori＝pBR322からのレプリコン Amp＝アンピシリン耐性 Ｔ＝転写ターミネータ チャート8.pTrp−conSDの組み立て （ａ）pSK4をHindIII、BAPおよびHpaIで消化してフラグ
メント16（4.6kb）を得る。
（ｂ）二本鎖DNAフラグメント17の合成配列をフラグメ
ント18に結んでpTrp−conSD（4.6kb）を得る。
AmpR＝アンピシリン耐性 Ｄ＝Trpプロモータ／オペレータ Ｅ＝シヤイン−ダルガノ Ｃ＝合成配列 チャート9.pTrp−PSt1 （ａ）pTrp−conSDをKpnIおよびC1aIで消化してフラグ
メント18（4.6kb）を得る。
（ｂ）PStの全長cDNAを含有するPstIフラグメント（900
kb）を単離する（フラグメント19）。フラグメント19を
クレノーおよびHgiA1で処理してフラグメント20（660k
b）を単離する。
（ｃ）二本鎖DNAフラグメント21の合成配列をフラグメ
ント19および20に結んでpTrp−PSt1を得る。
AmpR＝アンピシリン耐性 Ｄ＝Trpプロモータ／オペレータ Ｅ＝シヤイン−ダルガノ配列 Ｃ＝合成配列 Ｐ＝ブタ・ソマトトロピン チャート10.pURA/PSt1の組み立て （ａ）プラスミドpURAをEcoRIおよびBamHIで消化してフ
ラグメント22を単離する。
（ｂ）プラスミドpTrp−PSt1をEcoRIおよびBamHIで切断
し、フラグメント23（900pb）を単離する。フラグメン
ト23および23を結んでpURA/PSt1を得る。
Amp＝アンピシリン耐性 Ｄ＝Trpプロモータ／オペレータ Ｅ＝シャイン−ダルガノ配列 Ｃ＝合成配列 Ｐ＝ブタ成長ホルモン CopB＝RepAを調節する遺伝子 CopA＝RepAを調節する遺伝子 RepA＝ランナウェイ複製を開始する遺伝子 Ori＊＝pBEU−17からのランナウェイレプリコン Ori＝pBR322からのレプリコン チャート11.pTrp−trpL−PStcおよびpTrp−trpL−PSt1 （ａ）pTrp1（チャート１）をKpnI、クレノーおよびCla
Iで処理してフラグメント24（4.6kb）を得る。
（ｂ）PStの全長cDNAを含有するPstIフラグメント（900
bp）を単離する（フラグメント19）。フラグメント19を
クレノーおよびHgiA1で処理してフラグメント20（600b
p）を得る。
（ｃ）二本鎖DNAフラグメント25の合成配列をフラグメ
ント24および20に結んでpTrp−trpL−PSt1を得、二本鎖
DNAフラグメント26の合成フラグメントをフラグメント2
4および20に結んでpTrp−trpL−PStcを得る。
pTrp−trpL−PStcおよびpTrp−trpL−PSt1 AmpR＝アンピシリン耐性 Ｄ＝Trpプロモータ／オペレータ Ｅ＝Trpシャイン−ダルガノ配列 Ｃ＝合成配列 Ｐ＝ブタ・ソマトトロピン チャート12.pURA−trpL−PStcおよびpURA−trpL−PSt
1の組み立て ａ）プラスミドpURAをEcoRIおよびBamHIで消化し、フラ
グメント22（チャート10）を単離する。
ｂ）プラスミドpTrp−trpL−PStcおよびpTrp−trpL−PS
t1をEcoRIおよびBamHIで切断し、フラグメント27および
28（900bp）を単離する。フラグメント22および27を結
んでpURA−trpL−PStcを得る。フラグメント22および28
を結んでpURA−trpL−PSt1を得る。単一の塩基対だけ異
なる両ベクターは以下の如くに表示できる。
pURA−trpL−PStcおよびpURA−trpL−PSt1 Amp＝アンピシリン耐性 Ｄ＝Trpプロモータ／オペレータ Ｅ＝TrpLシヤイン−ダルガノ配列 Ｃ＝合成配列 Ｐ＝ブタ・ソマトトロピン CopB＝RepAを調節する遺伝子 CopA＝RepAを調節する遺伝子 RepA＝レプリコンランナウェイ複製を開始する遺伝子 Ori＊＝pBEU−17からのランナウェイレプリコン Ori＝pBR322からのレプリコン チャート13.pURA−M4遺伝子の欠失 （ａ）プラスミドpURA−m4（チャート７）をEcoRIおよ
びHindIIIで消化して、突出する５′末端をクレノーフ
ラグメントおよびdNTPで満たすことによって平滑末端と
してフラグメント29を得る。
（ｂ）フラグメント29を結んでpURA4 ΔbghE/Hを得
る。
Ｃ＝合成BSt配列 Ｔ＝転写ターミネータ CopB＝RepAを調節する遺伝子 CopA＝RepAを調節する遺伝子 RepA＝ランナウェイを開始する遺伝子 Ori＊＝pBEU−17からの複製開始点 Ori＝pBR322からの複製開始点 Amp＝アンピシリン耐性 チャート14.プラスミドpTrp−conSD−HC−IL1−１ AmpR＝アンピシリン耐性 Ｄ＝Trpプロモータ／オペレータ Ｅ＝シャイン−ダルガノ配列 Ｉ＝IL−１β遺伝子
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 モット，ジョン・イー アメリカ合衆国ミシガン州49004、カラ マズー、イースト・シー・アベニュー 4720番

Claims (11)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】エシェリヒア・コリ（E.coli）宿主細胞を
    形質転換でき、かつ該宿主細胞が異種蛋白を産生するの
    を可能とする発現プラスミドであって、pBEU−17または
    pBEU−50からの突然変異体R1レプリコン、pBR322からの
    複製起点、および該異種蛋白をコード付けするcDNAより
    なる当該プラスミド。
  2. 【請求項２】該異種蛋白がブタ・ソマトトロピンである
    請求の範囲第１項記載のプラスミド。
  3. 【請求項３】該異種蛋白がウシ・ソマトトロピンである
    請求の範囲第１項記載のプラスミド。
  4. 【請求項４】ソマトトロピンをコード付けする該cDNAの
    最初の４個のコドンがGCC TTC CCA GCT、GCT TTC CCA G
    CT、ACC TTC CCA GCC、GCC TTC CCA GTC、AAA TTC CCA
    GCC、TTC TTC CCA GCCおよびTTC CCA GCC ATGより選択
    される請求の範囲第２項または第３項記載のプラスミ
    ド。
  5. 【請求項５】該cDNAの最初の４個のコドンがGCC TTC CC
    A GCTである請求の範囲第３項または第４項記載のプラ
    スミド。
  6. 【請求項６】rpoH遺伝子の突然変異および請求の範囲第
    １項ないし第５項のいずれか１項に記載のプラスミドよ
    りなるエシェリヒア・コリ（E.coli）宿主細胞。
  7. 【請求項７】該突然変異遺伝子がrpoH112対立遺伝子で
    ある請求の範囲第６項記載の宿主細胞。
  8. 【請求項８】hlfB遺伝子の突然変異および請求の範囲第
    １項ないし第５項いずれか１項に記載のプラスミドより
    なるエシェリヒア・コリ（E.coli）宿主細胞。
  9. 【請求項９】該突然変異遺伝子がhlfB29対立遺伝子であ
    る請求の範囲第６項記載の宿主細胞。
  10. 【請求項１０】請求の範囲第６項ないし第９項いずれか
    １項に記載の宿主細胞を用いることを特徴とする異種蛋
    白についての遺伝子を発現させる方法。
  11. 【請求項１１】テトラサイクリンに対する抵抗性を有す
    るエシェリヒア・コリ（E.coli）宿主細胞D112（NRRL B
    −18168）。
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