JPH02502245A

JPH02502245A - 異種蛋白をコード付けするｃｄｎａ類、発現ベクター類および宿主類

Info

Publication number: JPH02502245A
Application number: JP63502127A
Authority: JP
Inventors: トミチ，チエ‐シエン・チウ; オルソン，エリック・アール; モット，ジョン・イー
Original assignee: ジ・アップジョン・カンパニー
Priority date: 1987-02-19
Filing date: 1988-01-27
Publication date: 1990-07-26
Anticipated expiration: 2012-02-12
Also published as: DE3850410D1; WO1988006186A2; WO1988006186A3; AU615432B2; HK65497A; AU1363988A; DK580188A; EP0418219A1; EP0418219B1; DK580188D0; DE3850410T2; KR960016704B1; JP2580303B2; ATE107696T1; KR890700663A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ソマトトロピンをコード付けするｃＤＮＡ類、発現ベクター類および宿主類発明の分野本発明は異種ポリペプチドの発現に関する。さらに詳しくは、本発明はエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｔ）において高レベルで発現されるソマトトロピンをコード付けする新規なｃＤＮＡＩ９［を開示する。突然変異したイー・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）宿主細胞よりなる一般的発現系および二重レプリコン配置を有する発現ベクターも本明細書中にて開示する。

情報の開示形質転換微生物による種々の種類の動物からのソマトトロピンの発現は公知である（ゲデル・ディ・ブイら（Ｇｏｅｄｄｅｌ、　Ｄ、Ｖ、、　ｅｔ　ａｌ、）、「ヒト成長ホルモンについてコード付けするＤＮＡ配列のニジエリ　　　　　　゛ヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ）における直接発現」、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２８１：５４４−５４８　（１９７９）；およびシーブルグ・ビイーｘイチら（Ｓｅｅｂｕｒｇ、　Ｐ−Ｈ，、ｅｔ　ａｌ、）、「ウシおよびブタ成長ホルモンの効果的な細菌発現」、ディー・エヌ・エイ（ＤＮＡ）、２：３７−４５　（１９８３））。

天然に生じるウシ・ソマトトロピン（ＢＳｔ）は異種蛋白の混合物であり、そのアミノ酸配列は公知である（バラジニ・エイ・シイら（Ｐａｌａｄｉｎｉ、　Ａ −Ｃ，、ｅｔ　ａｌ、）、「成長ホルモンの分子生物学」、シイ・アール・シイ・レビューズ・イン・バイオケミストリー（ＣＲＣ，Ｒｅｖｉｅｗｓ　ｉｎＢｉｏｃｈｅｍ、）、１５　（１）　：２５−５６　（１９８３））。

天然に生じる該混合物はウシの下垂体から精製されてきた。ＢＳｔを成長および授乳の促進に用いることについての商業的可能性はよく認識されており、乳牛および肉牛双方についての生物学的研究によって記述されている（エバード・ビイ・ジェイおよびバウマン・ディ・イー（Ｅｐｐａｒｄ、　Ｐ、Ｊ、　ａｎｄ　Ｂａｕｍａｎ、　Ｄ、Ｅ、）、「乳牛への授乳を実行するのに対する成長ホルモン長期投与の効果（Ｔｈｅ　Ｅｆｆｅｃｔｏｆ　Ｌｏｎｇ−Ｔｅｒｍ　Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｉ（ｏｒｍｏｎｅ　ｏｎ　Ｐｅｒｆｏｒｍａｂｃｅｏｒ　Ｌａｃｔａｔｉｎｇ　Ｄａｉｒｙ　Ｃｏｗｓ）　Ｊ　；およびバウマン・ディ・イー（Ｂａｕｍａｎ、　Ｄ、Ｅ、）、ｒ反舞動物の成長速度および乳腺の発育に対する成長ホルモンの効果（Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｈｏｒｍｏｎｅ　ｏｎ　ＧｒｏｗｔｈＲａｔｓ　ａｎｄ　Ｍａｍｍａｒｙ　Ｄｅｖｅｌｏｐ＋ｎｅｎｔ　ｏｆ　Ｒｕｍ１ｎｎａｎｔｓ）　Ｊ　、飼料製造業者のコーネル（Ｃｏｒｎｅｌｌ）栄養会議１９８４年会報、５−１７頁、コーネル大学により出版、イシ力（Ｉｔｈａｃａ）　、ニューヨーク州）。

組換体ウシ・ソマトトロピン（ｒＢＳＴ）は種々の遺伝的組換体プラスミドを用いて形質転換微生物で産生できる（欧州特許出願４７６００号；英国特許出願ＧＢ２０７３２４ＳＡ号；およびショーネル・ビイ・イーら（Ｓｃｈｏｎｅｒ、　Ｂ、Ｅ、、　ｅｔ　ａｌ、）、エシェリヒア・’：１　！Ｊ　（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）におけるウシ成長ホルモン発現についてのｍＲＮＡ翻訳効率の役割、プロシーディングズ・オプ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）ＵＳＡ、８１　：　５４０３−５４０７　（１９８４））。

ＢＳｔの同族体も公知である（欧州特許出願１０３３９５号：およびシ厘−ネル・ビイ・イーら（Ｓｃｈｏｎｅｒ、　Ｂ、Ｅ、、　ｅｔ　ａｌ、）前掲）０本発明とは異なり、ＢＳｔのこれらの同族体はＢＳｔ遺伝子の５′末端にて塩基を挿入または欠失し、それにより天然に生じるアミノ酸配列と異なる蛋白をつくりだすことに関するものである。

好ましいコドンを最大化するための　ｒＢＳｔ　　ｃＤＮＡに対する修飾はＧＣＣないしＧＣＴの最初の２つの天然アラニンコドンを変化させることを包含する（欧州特許出願１１１８１４号）。しかしながら、欧州特許出願１１１８１４号は、好ましいコドン置換および二次構造の減少は発現の最大化に対して臨界的であることを教示するものである。本発明は、ｃＤＮＡをランナウェイーレプリフン型プラスミドと組み合わせた場合、これらの公知変化の多くは高レベルの発現を達成するのに不必要であることを示す。

ＢＳｔを発現する形質組換微生物を培養しおよび発酵する方法も公知であり、前記引例文献に詳細に記載されている。

形質転換細胞からの生物学的に活性なｒＢＳｔの精製も以前に記載されている（米国特許第４５１１５０２号：第４５１１５０３号；第４５１２９２２号ｉ第４５１８５２６号；欧州特許出願１３１８４３号；およびショーネル・アール・シイら（Ｓｃｈｏｎｅｒ、　Ｒ。

Ｇ、、　ｅｔ　ａｌ、）、ｒＢＳｔを過剰産生するイー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）　ＭＪ胞からの蛋白顆粒の単離および精製」、バイオ−チク（Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈ、）、３：１５１−１５４　（１９８５））。

本発明は、天然ソマトトロピンｃＤＮＡに比し、高しベルテ発現されるソマトトロピンおよびソマトトロピンの同族体をコード付けするｃＤＮＡ類を開示する。

ブタおよびウシ・ソマトトロピンの天然ｃＤＮＡ類がほとんどのイー・コリ（Ｅ、ｃｏｌ　ｉ）系にて商業的に許容されるレベルで発現されないことおよびかかる発現にはｃＤＮＡにおける変化が必要であることは公知である。ｃＤＮＡにおける好ましいコドンのパーセンテイジを増加させようとする試みは効果がほとんどなく、許容できる高レベルの発現に到達するために、研究者達はｃＤＮＡの実質的な修飾に頼っていた。シーブルグ・ビイ・エイチら（Ｓｅｅｂｕｒｇ、　Ｐ、Ｈ，、ｅｔ　ａｌ、）　、ディー・エヌ・エイ（ＤＮＡ）　、２　：　３７− ４５　（１９８３）は、ウシ・ソマトトロピンの天然ｃＤＮＡにおけるアミノ酸残基１１についてのコドンの後に存在する強い二次構造を除去することによって発現を増大させた（欧州特許出願７５４４４号も参照）。彼らは、二次的なステム・ループ構造の除去は発現を促進すると仮説をたてた；この研究は読む者の注意を−１２にカロリー１モル過剰の水素結合領域に導くであろう。　本発明は、高レベルの発現は実質的な塩基配列の変化を含む必要がないことを教示する。むしろ、ｒＢＳｔ　　ｃＤＮＡの最初の４つのコドンにおいて塩基対の変化をより少なくすることによって、非ランナウェイプラスミドにおける発現の実質的増大を達成できる。ランチウェイプラスミドと組み合わせると、本発明のｃＤＮＡＪ５［はより高いレベル、商業的に許容できるレベルで発現される。

ｒＢＳ　ｔを発現するだめのランナウェイプラスミドの使用は公知である（欧州特許出願１５９１２３号および１１１８１４号）。いずれの出願もｒＢＳｔのアミノ末端について本明細書中で開示する正確なりＮＡ配列を開示するものではない。

欧州特許出！［１０３３９５号は、もし最初の３ないし９のトリブレットコドンが欠失されると、イー・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）におけるｒＢＳｔの発現はＢＳｔの天然ｃＤＮＡについての少なくとも１００倍以上になることを開示している。欧州特許出ｔ［１０３３９５号は、また、シャイン−ダルガノ領域に干渉する二次構造を除去するｔ；めに初期コドンにおいて点突然変異を使用できる可能性を間接的に示唆するものであるが、ＢＳｔ蛋白のその部分の一次アミノ酸配列を変更することなく、有意な効果を伴ってかかる変化を実現することはできないと結論している。

発明の要約本発明は、イー・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）宿主細胞がソマトトロピン様蛋白を産生ずることを可能とするように該宿主細胞を形質転換するのに有用な、好ましくはランチウェイ塁レプリコンを含有する発現プラスミドに関し、該プラスミドはウシ、ブタおよびヒツジ・ソマトトロピンよりなる群から選択されるソマトトロピンならびにその同族体をコード付けするｃＤＮＡを含有し、ここに該ソマトトロピンをコード付けする最初の４つのコドンはａ）　　　ＧＣＣＴＴＣＣＣＡ　　ＧＣＴ；ｂ’）　　　ＧＣＴ　　ＴＴＣＣＣＡ　　ＧＣＴ。

ｃ）　　　ＡＣＣＴＴＣＣＣＡ　　ＧＣＣ；ｄ）　　　ＧＣＣＴＴＣＣＣＡ　　ＧＴＣ：ｅ）　　　ＡＡＡ　　ＴＴＣＣＣＡ　　ＧＣＣ；ｆ）　　ＴＴＣＴＴＣＣＣＡ　　ｃｔｃｃ；およびｇ）　　　ＴＴＣＣＣＡ　　ＧＣＣＡＴＧよりなる群から選択される。

好ましいランチウェイ塁レプリコンはコペンハーゲン、デンマークのＡ／Ｓアルフレッド・ベンゾン（Ａｌｆｒｅｄ　Ｂｅｎｚｏｎ）から商業的に入手可能なＲ１突然変異に由来するものである。特に、ベンゾンのｐＢＥＵｅシリーズ中に見い出されるレプリコン、すなわち、同じランチウェイレプリコンであるｐＢＥＵ −５０またはｐＢＥＵ−１７である。最も好ましいのは、ランチウェイレプリコンがｐＢＲ３２２からの元のレプリコンと組み合わされて入れられた発現プラにおいて例外的に高いレベルのソマトトロピンの発現を生じる。好ましいイー・コリ（Ｅ、ｃｏｌ　ｉ）宿主細胞は、ｒｐｏＨまたはｈｆｌＢ遺伝子（後記参照）のいずれかの突然変異を有するものである。最も好ましいのは、ｒｐｏＨ１１２またはｈｆｌＢ２９対立遺伝子を有する宿主細胞である（後記参照）。

二重レプリコン配置を有する前記発現プラスミドは一般には異種遺伝子の発現に用いられるものであり、ｒｐｏＨまたはｈｆｌＢ遺伝子、好ましくはｒｐｏＨ１１２およびｈｆｌＢ２９対立遺伝子のｃｏｌｉ）宿主細胞と組み合わせＩ；場合に特に有利である。ソマトトロピンの発現に加えて、宿主とベクターのこの組合せはキモシン、インターフェロンもしくはインターフェロン様蛋白類、インターリューキン順、インシュリン、ウィルス蛋白類、ウロキナーゼ、コロニー刺激因子、腫瘍壊死因子、蛋白Ｃ等の如き生物学的に重要な蛋白の発現に有用である。

定義「発現ユニット」なる語は転写、翻訳に必要なおよび調節遺伝子産生物による識別に必要な、構造遺伝子、調節遺伝子および制御要素を包含する遺伝子発現および調節の完全なユニットを含有するＤＮＡ配列を意味する。

「異種の」なる語は、遺伝子について言及する場合、安定なプラスミドにより、またはゲノム中への取込みいずれかにより該遺伝子が宿主細胞に挿入されたことを示し、蛋白について言及する場合、該蛋白が異種遺伝子の産生物であることを示す。異種蛋白は宿主細胞によって通常は産生されないあるいは通常は限定量で産生される蛋白である。

「天然の」は天然源から生じるアミノ酸または核酸の配列をいう。

「天然蛋白」は天然に生じる蛋白と同一の一次構造を有する蛋白である。オリゴヌクレオチドまたはコドンについては、天然核酸配列は天然に生じるものと同一である。例えば、天然に生じるｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡの塩基対配列は天然配列ということになる。

組換体遺伝子もしくは蛋白については、天然配列は、所望により、アミノ末端に存在するメチオニンまたはメチオニン残基をコード付けする開始コドンＡＴＧの存在を包含させてもよい。

ｒＢＳｔＪはアミノ末端にａ　Ｉａ−ｐｈｅ−ｐｒｏ−ａ　Ｉａ　−ｍｅｔまたはｐｈｅ−ｐｒｏ−ａｌａ−ｍｅｔを有する蛋白の異種・混合物を包含するウシ・ソマトトロピンをいう。本出願の目的には、ナンバリング目的では最初のコドンまたは残基はアラニンであると考えられる。類縁語句はウシ成長ホルモン、ＢＧＭ、組換体ウシ・ソマトトロピン二またはｒＢＳ　ｔを包含する。組換体ＢＳｔは所望によりそのアミン末端にメチオニン残基をさらに有していてもよい。

「レプリコン」は組換ＤＮＡクローニングおよび発現プラスミドの複製を制御するＤＮＡ配列をいう。

「ランチウェイレプリコン」はコピー数制御を欠くかまたはそれかる喪失の結果、複製の非制御が起こり、ランチウェイレプリコンが組み込まれたＤＮＡ分子のコピー数が増加する。類縁語句はランナラエイレプリコンを含有するプラスミドであるランチウェイ型プラスミドまたはランチウェイプラスミドを包含する。

「ソマトトロピン」は哺乳動物、魚類および爬虫類の成長ホルモンをいう。語句「天然の」によって限定されないならば、語句「ソマトトロピン（類）」は成長ホルモン活性が維持されるのを可能とするアミノ酸配列の十分な同一性があるこれらの蛋白の同族体を包含する。かかる同族体は下垂体からの精製調製物中に見い出される異種の種と同一のアミノ酸配列を有する組換産生ソマトトロピン、および欧州特許出ａ１０３３９５号および７５４４４号に記載されている如きソマトトロピンをコード付けするＤＮＡ類の修飾によって人工的につくりだされた同族体を包含する。加えて、ｒＢＳｔの一次配列において、いずれのしアミノ酸もそのＤＪ性体で置き換えることができ、分子それ自体の活性に影響を与えることなく種々のアミノ酸を交換することができる。かくして、例えば、（１）アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリンおよびプロリンは交換可能であり、（２）フェニルアラニンおよびトリプトファンは交換可能であり、（３）セリン、スレオニンおよびチロシンは交換可能であり、（４）アスパラギンおよびグルタミンは交換可能であり、（５）リジン、アルギニン、ヒスチジンおよびオルニチンは交換可能であり、および（６）アスパラギン酸およびグルタミン酸は交換可能である。

「形質転換微生物」は分子遺伝学でよく知られた技術を用いて人工的に細胞に挿入されたプラスミドを含有するまたはそれを宿らせる原核生物もしくは真核生物の単細胞生物をいう。

詳細な記載本発明は組換体微生物類において真核生物成長ホルモン遺伝子の高レベル発現を生じる突然変異体ｃＤＮＡ配列を調製する方法を提供するものである。特に、異なるベクターにて成熟ウシおよびブタ成長ホルモンのイー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）中での高レベル合成を得るのに有用ないくつかのｃＤＮＡの組み立てを説明する。比較の！こめ、ヌクレオチドの変化を伴うおよび変化を伴わない、ＢＳ　ｔ　　ｃＤＮＡ第１表は成熟ＢＳｔ　　ｃＤＮＡのコーディング配列を記載するものであり、第２表は天然ｃＤＮＡに比較し、発現を促進させるためにＢＳｔ　　ｃＤＮＡの５°領域に導入した突然変異を記載するものである。第２表のオリゴヌクレオチドは以下に記載する方法により化学的に合成したものである。

Ａ、　−膜性一般に、命名法の定義ならびに本発明で用いる一般的な実験室的手法の記載はマニアナイス・ティら（Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、、　ｅｔ　ａｌ、）、モレキュラー・クローニング・ア・ラボラトリ−・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）　、コールド会スプリングｍハーバー拳ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、コールド・スプリング＋ハーバ−（Ｃｏｌｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ）　、ニューヨーク（１９８２）の記載中に見い出される。該マニュアルを以下「マニアナイス」といい、ここに参照のために挙げる。

すべてのイー・コリ（Ｅ、ｃｏ　１　ｉ）株はルリア・ブロス（ＬＢ）、グルコースを含んだＬＢ、ディフコ（ｐｉｆｃｏ）の抗生物質培地＃２、まｔ；はグルコースおよび酸加水分解カゼインアミノ酸を補足したＭ９培地上で培養する。抗生物質耐性株はマニアナイスに記載されている薬剤濃度で維持する。

形質転換はモリソン・ディ・エイ（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、　Ｄ、Ａ、）　、ジャーナル・オブ・バタテリオロジー（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）、１３２：３４９ −３５１　（１９７７）、またはクラークークルティス・ジエイ・イーおよびクルティス・アール（Ｃ１ａｒｋ−Ｃｕｒｔｉｓｓ、　Ｊ、　Ｅ、　ａｎｄ　Ｃｕｒｔｉｓｓ。

Ｒｏ）、メト・エンザイモル（Ｍｅｔｈ；　Ｅｎｚｙｍｏｌ、）、１０１：３４７−３６２（１９８’３）によって記載されている方法によって行う。

すべての酵素は製造業者の指示にしたがって用いる。制限フラグメントはアガロースもしくはポリアクリルアミドゲル電気泳動いずれかによって分離し、電気溶出（マニアナイス）またはガラス粉末上への吸着によって単離する（ポゲルスタイン・ビイ・およびブレスビー・ディ（Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ、　Ｂ、　ａｎｄ　Ｇ１１ｌｅｓｐｉｅ、Ｄ、）、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）　Ｕ　Ｓ　Ａ、　７６　：　６１５−６１９（１９７９）。

大規模なかつ急速なプラスミドの単離はマニアティスに記載されている如くに行う。

蛋白濃度はコーマシー・ブルー結合に基づき、バイオラド（ＢｉｏＲａｄ）製蛋白アッセイキットを用いて測定する。

蛋白分析についてのＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動はモース・エルら（Ｍｏｒｓｅ、　Ｌ、　ｅｔ　ａｌ、）　、ジャーナル・オブ・パイロロジー（Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、）、２６　：　３８９−４１０　（１９７８）　、およびレムリ（−ニー＊ケイ（Ｌａｅｍ＋＋＋ｌｉ、Ｕ、に、）　、ネイチ＋　−（Ｎａｔｕｒｅ）（ロンドン（Ｌｏｎｄｏｎ））２２６　＝　６８０−６８５　（１９７０）に記載されている如くに行う。

ウェスタン・イムノブロッティング分析はトウビン・エイチら（Ｔｏｖｂｉｎ、　Ｈｏ、　ｅｔ　ａｌ、）　、プロシーディングズ・オプ・ナショナル・アカデミ−・オプ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）ＵＳＡ、７６　：　４３５０−４３５４　（１’１７’ｌ）に記載されている如くに行った。

コロニーハイブリダイゼーションはグルンスティン・エムら（Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ、　Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、）、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）ＵＳＡ、７２：３９６１−５　（１９７５）に一般的に記載されている如くに行う。フィルターは次いで十分に風乾し、８０℃にて２時間真空中にて加熱する。

オリゴヌクレオチドグローブについてのハイブリダイゼーション条件は以前にゲデル・ディ・ブイら（Ｇｏｅｄｄｅｌ、　Ｄ、Ｖ、、　ｅｔ　ａｌ、）、ネイチャー　（Ｎａｔｕｒｅ）、２９０：２０−２６　（１９８１）によって記載されている通りである。ハイブリダイゼーシヨンの後、プローブ含有溶液を取り出し、保存し、フィルターを０．１％ＳＤＳ。

５ｘｓｓｃで洗浄する。フィルターを風乾し、セットし、コダック製Ｘ−ＯＭＡＴ　　ＡＲフィルムおよびデュポン製りロネックス・ライトニング（Ｃｒｏｎｅｘ　Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ）と増感スクリーンを用イＴ　−７０”０にてラジオオートグラフィーに付す。

プラスミドの配列決定には、ホームズ・ディ・ニスら（Ｈｏｍｅｓ。

Ｄ、Ｓ、　ｅｔ　ａｌ、）　、アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｎ＋、）、１１４：１９３　（１９８１）の方法により、まｔ；はマニアティスに記載されているアルカリ溶解法によってプラスミドＤＮＡのミニ溶解物を調製する。ジデオキシ配列決定は二本鎖プラスミドを用い、サンガー− エフら（Ｓａｎｇｅｒ、　Ｆ、　ｅｔ　ａｌ、）　、ジャーナル・オプ・モレキュラー・バイオロジー〇、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、）、１４３：　１６１−１７８　（１９７７）によって行う。ジデオキシ含有反応物は９０℃で２分間加熱し、氷上でクエンチすることによって電気泳動用に調製する。調製した８％変成ポリアクリルアミドゲルにル−ンあたり２〜３μａを与え、サンガーおよびクルソン（Ｓａｎｇｅｒ　ａｎｄ　Ｃｏｕｌｓｏｎ）　、エフ・イー・ビイ・ニス・レターズ（ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、）、８７　：　１０７−１１０　（１９７８）に準じて実行する。

ヌクレオチドの大きさはキロベース（ｋｂ）まｔ；は塩基対（ｂ　ｐ）いずれかで表す。

商業的に入手不可能なオリゴヌクレオチドは、二一ドハムーバンデバンター・ディ・アールら（Ｎｅｅｄｈａｍ−ＶａｎＤｅｖａｎｔｅｒ、　Ｄ、Ｒ，ａｔ　ａｌ、）、ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、）、１２　：　６１５９−６１６８　（１９８４）に記載されている如く、自動合成装置を用い、固相ホスホルアミディト・トリエステル法により化学的に合成できる（ポカージ・ニス・エルおよびカルサーズ・エム・エイチ（Ｂｅａｕｃａｇｅ、　Ｓ、Ｌ、　ａｎｄ　Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ、　Ｍ、Ｈ，）　、テトラヘドロン・レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　　Ｌｅｔｔｓ、）、２２　（２０）：１８５９−１８６２　（１９８１））。オリゴヌクレオチドを精製した後、ウォーターン製５ｅｐ−ＰａｋＣ１８カラム上でそれらを脱塩する。　合成オリゴヌクレオチドの配列は、マキサム・エイ・エムおよびギルバート・ダブリュー　（Ｍａｘａｍ、　Ａ、Ｍ、　ａｎｄ　Ｇ１１ｂｅｒｔ、　ｗ、）、メソッズ・イン・工゛ンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、６５　：　４９９−５６０　（１９８０）の化学分解法を用いて確認する。

別法として、マキサムおよびギルバートの方法、前掲、またはワレイス・アール・ビイら（Ｗａｌｌａｃｅ、　ＲＪ、　ｅｔ　ａｌ、）　、ジーン（Ｇｅｎｅ）、鎖停止法（ｃｈａｉｎ　ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ）を用いてオリゴヌクレオチドフラグメントをプラスミド中に組み立てた後、該配列を確認できる。　オリゴヌクレオチドを組み立てるには、リンカ−中に結ぶべきオリゴヌクレオチドの５’　−ＯＨ末端を、オリゴヌクレオチドｌμｇあたりγ−”Ｐ− ＡＴＰ　　２μＣｉの存在において、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化し、続いて過剰の非標識ＡＴＰで追跡する。アニーリングは５０ｍＭ）リス−ＨＣｌ、ｐＨ７，８，１０ｍＭ　　ＭｇＣ１，中で、１０分で９０℃まで加熱し、続いて２〜４時間にわたって室温までゆっくり冷却することによって行う。

１５℃において１時間インキュベートしならびにＡＴＰを０．５ｍＭまで、ＤＴＴを２０ｍＭまで、および４００Ｕ　　Ｔ４　　ＤＮＡリガーゼを添加した後、反応混合物を１５℃にて一晩インキユベートする。標準物として標識化したＨａｅＩＩＩ消化−Ｘ１７４ＤＮＡを用いる１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動、続いての電気溶出（マニアナイス）およびエタノールでの沈澱によって、正しく組み立てられたリンカ−を精製する。

Ｂ、　　［核生物における発現クローン化遺伝子の原核生物系での高レベル発現を達成するためには、ｍＲＮＡ転写を指示する強力なプロモータ、および少なくとも翻訳開始用のリポソーム結合部位を含有する発現ベクターを組み立てることが必須である。多量の遺伝子産生物の蓄積はしばしば細胞の成長を抑制し、時々細胞の死滅をひき起こすので、産生物の合成を指示するために選択したプロモータは、プロモータの導入前に細胞の成長が高密度に達すことができるように調製すべきである。

この目的に適しｔ；調製領域の例は、イー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）　トリプトファン生合成経路のプロモータおよびオペレータ領域ならびに７アージラムダ（ＰＬ）の左方プロモータである。該ｔｒｐプロモータはトリプトファンの存在において抑制され、トリプトファン飢餓によりまたは誘導物質インドールアクリル酸によって誘導される（ヤノ７スキイ・シイら（Ｙａｎｏｆｓｋｙ、Ｃ，、ａｔ　ａｌ、）、ジャーナル・オブ・バクテリオロジ−（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）、１５８：１０１８　１０２４（１９８４））。プロモータＰＬはリプレッサーｃｌによって制御される。ｃｌ遺伝子、例えば、ｃ　Ｉ　８５７における温度感受性突然変異によって、ＰＬは３８℃を超える温度で誘導される（ヘルスコビイツ・アイおよびハーゲン・ディ（Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ、１．　ａｎｄ　Ｗａｇｅｎ、　Ｄ、）、アヌ・レブ・ジェネト（Ａｎｎｕ、　Ｒｅｖ、　Ｇｅｎｅｔ、）、１４：３９９−４４５（１９８０））。最も好ましいのは、発現されるべき遺伝子を挿入するためにシャイン−ダルガノ配列から適当な距離に制限酵素部位を有する発現ベクターである。

真核生物遺伝子によってコード付けされる蛋白をそのｅＤＮＡ配列からイー・フリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）細胞内で合成するには、５″非翻訳領域およびシグナルペプチドについてコード付けする配列を除去し、該蛋白についてコード付けする配列の翻訳開始用開始コドンを供給するのが便利である。翻訳効率を最大化するには、蛋白についてのコーディング領域のいくつかを化学的に合成したオリゴヌクレオチドで置き換えることも必要であろう。本発明は特に欠失した５′非翻訳領域、プレ配列、および成熟ＢＳｔの最初についての６６ｂｐコ一デイング配列を有する切断ＢＳｔ遺伝子を記載する。この切断ＢＳｔ配列を発明者らの発現ベクターｐＴｒｐｌ中にクローンしてプラスミドｐＴｒｐ−ＢＳｔｍｌｂを得る。発現用の切断ＢＳｔ配列を完成するには、オリゴヌクレオチドをｐ　Ｔ　ｒ　ｐ　− Ｂ　Ｓ　ｔ　ｍ　ｌ　ｂに挿入する。該オリゴヌクレオチドは、アミノ酸残基における変化を伴いまたは伴わずに、最適発現に導く変化に一体化させるように設計できる。

本発明の好ましい具体例は高コピー数プラスミドまたはランチウェイ型複製開始点を利用する。すべてのプラスミドがそこからプラスミドの複製が起てるＤＮＡ配列を有することは公知である。これらの配列は性質が種々あり、一般に複製開始点（ｏ　ｒ　ｉ）もしくはレプリコンという。ある場合には、該ｏｒｉは複製についてのイー・コリ宿主蛋白を用いることによって機能できるが、他のものはプラスミドによってコード付けされた蛋白因子をさらに必要とする。

細胞当たりのプラスミドのコピーの数（すなわち、コピー数）は、複製開始点におけるおよびプラスミドコード付は遺伝子の調節における変化によって影響され得る。構成性的にまｔ；は制御条件下においてのいずれかでプラスミド複製を増大せしめるベクター突然変異は単離されている。構成性的高コピー数のプラスミドの例はベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ａｒｃｈ　Ｌａｂｓ）、ガイセルスブルグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）　、メリーランド州、米国、から入手可能なｐＵｃ１９（ヤニシューベロン・シイら（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ、　Ｃ，ｅｔａｌ、）　、ジーン（Ｇｅｎｅ）、３３：１０３−１１９　（１９８５）；およびｐＨｃ３１４（ポロス・アイら（Ｂｏｒｏｓ、　１．　ｅｔ　ａｌ、）　、ジーン（Ｇｅｎｅ）、３０：２５７−２６０　（１９８４））である。制御条件下でのプラスミド複製の増加はプラスミドｒランナウェイ」という。

制御メカニズムは、通常、培養温度におけるシフトである。本明細書中にて用いられる好ましい「ランチウェイ」ベクター系はＲＩプラスミド由来のものであった。Ｒｒのベクター誘導体の温度感受性突然変異は二工程選択にて単離した（ウリンおよびノルドストロム（Ｕｈｌｉｎ　ａｎｄ　Ｎｏｒｄｓｔｒｏｍ）　、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネチイクス（Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、）、１６５：１６７−１７９６：９１−１０６　（１９７９））。加熱誘導に際し、これらのベクターは細胞中に７５％もの合計ＤＮＡを含むことができる。

Ｒ１グラスミドの複製領域は約２．５ｋｂのＤＮＡ配列上に集められる（ライダーら（Ｒｙｄｅｒ　ｅｔ　ａｌ、）　、ジーン（Ｇｅｎｅ）、１７：２９９−３１０　（１９ｇ２））、この領域は少なくとも３つの遺伝子および複製開始点を含有する（ライトおよびモリン（Ｌｉｇｈｔ　ａｎｄＭｏｌｉｎ）　、イー・エム・ビイ・オー・ジャーナル（ＥＭＢＯＪ、）、２：９３−９８　（１９８３）；ライトら（Ｌｉｇｈｔ　ｅｔ　ａｌ、）　、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティクス（Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、）、１９８　：　５０３−５０８　（１９８５））、該遺伝子はｃｏｐＢ。

ｃｏｐｅｓおよびｒｅｐＡである。ｒｅｐＡ蛋白の産生は該ｏｒｉにおける複製を開始させるように作用する。開始事象の数は産生されたｒｅｐＡ蛋白量に比例する。ｃｏｐＡおよびｃｏｐＢ遺伝子産生物の機能はつくられるｒｅｐＡ蛋白量を調製することである。

ｃｏｐＢ産生物はｒｅｐＡの特異的プロモータに結合するりプレッサー分子である（リイゼおよびモリン（Ｒｉｉｓｅ　ａｎｄ　Ｍｏ１ｉｎ）　、プラスミド（Ｐｌａｓｍｉｄ）、１５：１６３−１７１　（１９８６）；ジブスコツら（Ｇｉｖｓｃｏｖ　ｅｔ　ａｌ、）、ジーン（Ｇｅｎｅ）、５７　：　２０３−２１１（１９８７））。ｒｅｐＡ遺伝子は、また、上流のｃｏｐＢプロモータから発現される。ｃｏｐＡ遺伝子は、ｃｏｐＢおよびｒｅｐＡと反対方向に転写されるそれ自身のプロモータを有し、ｒｅｐＡｍＲＮＡにハイブリダイズするアンチセンスＲＮＡを産生し、ｒｅｐＡ　　ｍＲＮＡの翻訳開始効率を減少させる。

本明細書中にて用いるｐＢＥＵ−５０およびｐＢＥＵ−１７の如きベンゾン（Ｂｅｎｚｏｎ）ベクターはＲ１に由来する元の二段階温度制御ランチウェイベクターからのものであった（ウリンおよびノルドストロム（Ｕｈｌｉｎ　ａｎｄ　Ｎｏｒｄｓｔｒｏｍ）　、前掲；ウリンおよびクラーク（Ｕｈｌｉｎ　ａｎｄ　Ｃ１ａｒｋ）、「モレキュラー・バイオロジー、パソジエニシティ、アンド・ニーコロジー・オブ・バクチリアル・プラスミズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｓｉｔｙ、　ａｎｄ　Ｅｃｏｌｏｇｙ　ｏｒ　Ｂａｃｔｅ−ｒｉａｌ　Ｐｌａｓｍｉｄｓ）　、ニス・ビイ・レビイ、アール・シイ・クロウニスおよびイー・エル・ケー−１−ツヒ（Ｓ、　Ｂ、　Ｌｅｖｙ、　Ｒ，Ｃ−Ｃｌｏｗｅｓ　ａｎｄＥ、　Ｌ、　Ｋｏｅｎｉｇ）　Ｗａｑ　プレナム・プレス（Ｐｌｅｎｕｗ　Ｐｒｅｓｓ）、６７０頁（１９ｇり）。これらのベクターは２つのプロモータ突然変異を含有する。第１のものはアンチセンス　ｃｏｐＡ　　ＲＮＡ量を減少させるｃｏｐＡプロモータにおける突然変異であり、第２のものは高温で転写開始を増大させるｃｏｐＢプロモータにおける突然変異である（ジブスコツら（Ｇｉｖｓｃｏｖ　ｅｔ　ａｌ、）　、前掲））ａｐＢＥＵ− ５０ベクターを含有するイー・コリ細胞を３０℃またはそれ以下の温度で増殖させる。細胞を３４℃以上の温度にシフトすると、プラスミドコピー数が増大し、これは今度はベクター中にクローンされた遺伝子の発現を増幅する（ウリンら（Ｕｈｌｉｎ　ｅｔ　ａｌ、）　、前掲））。

ｐＢＲ３２２レプリコンおよびｐＢＥＵ−１７のランチウェイレプリコンよりなるキメラベクターは本発明の修飾されたソマトトロピンを特に高レベルで発現する。低レベルのグロテアーゼ活性を示す２種のイー・コリ株と組み合わせると、発現レベルは極端に高くなる。

イー・コリにおけるいくつかの遺伝子が細胞中でのグロテアーゼの発現に影響を与えることは公知である。これらの遺伝子はＪｏｎ。

ｈｆｌＡ、ｈｆｌＢ、およびｒｏｐＨを包含する（セル（Ｃｅｌｌ）、４１　：　５８７−５９５　（１９８５）；プロシーディングズ・オブ・ナシ謄ナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、）ＵＳＡ　　８１：６６４７−６６５１　（１９８４）；プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オプ・サイユンシズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）　ＵＳＡ、　８１　：　６７７９−６７８３（１９８４）；セル（Ｃｅｌｌ）、３１：５６５−５６７　（１９８２）；ジェネティクス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）　７７　：　４３５−４４８　（１９７４）　）。

ｒｐｏＨまたはｈｆｌＢ突然変異のいずれかを含有する株は、本明細書中において修飾された如く、特にランチウェイプラスミドと組み合わせｔ：場合にｒＢＳ　ｔの発現を促進することが証明された。好ましい対立遺伝子はｒｐｏＨｌ　１２およびｈｆｌＢ２９である。他の低プロテアーゼ株はｒＢＳ　ｔの発現を促進することができない。

組換体微生物から哺乳動物ソマトトロピンを単離および精製する技術は当該分野においてよく知られている（例えば、米国特許第４５１１５０２号、第４５１２９２２号、第４５１８５２６号：欧州特許出！［１３１８４３号；およびシＢ− ナー・アール・シイら（Ｓｃｈｏｎｅｒ、　Ｒ，Ｇ−ｅｔ　ａｌ、）　、前掲参照）。簡単に述べれば、該手順は細胞の溶解、選択的遠心、天然コンフィギユレーションに対するいずれかの非天然ジスルフィド結合の再配置、およびカラムクロマトグラフィーを含む。

チャート１−１４におけるプラスミドおよびフラグメントを表わす約束は以下の通りである：チャート上の単一線図は、プロモータまたは構造遺伝子下方に示された矢印の方向に翻訳開始または転写が起こる環状および線状二本鎖ＤＮＡを共に表す。星印（＊）はプラスミドの環状形を完成させるためのヌクレオチドの架橋を表わす。

フラグメントは二本鎖ＤＮＡの線状片であるから、それらは星印を有しない。エンドヌクレアーゼ制限部位は線の上方に示す。遺伝子マーカーは線の下方に示す。マーカー間の相対的な間隔は現寅の距離を示すものではなく、単に示されｆ：　Ｄ　Ｎ　Ａ配列上でのそれらの相対的な位置を示す意図である。

実施例１　非ランナウェイベクターにおけるｒＢＳｔの発現Ａ）　発現ベクターｐＴｒｐ！微生物において異種蛋白を発現するための原核生物発現ベクターは、好ましくは、転写を伝達するための強力な調節可能なプロモータおよび翻訳開始用の強力なリポソーム結合部位を有する。イー・コリにおける成熟ＢＳｔの発現用に、本発明者らは、ｐＳＫ４由来の発現ベクターｐＴｒｐｌを組み立てた（カイテス・ビイ・ニスら（Ｋａｙｔｅｓ、　Ｐ、Ｓ、、　ｅｔ　ａｌ、）、ジャーナル・オブ・バイオチク１０ジー（Ｊ、　Ｂｉｏｔｅｃｈ、）、４：２０５−２１８　（１９８６））、ｐＴｒｐｌはイー・コリ・トリプトファンオペロンのプロモータおよびオペレータ配列、ｔｒｐＬ遺伝子のシャイン−ダルガノ配列、ｐＢＲ３２２からの複製開始点およびアンピシリン耐性用遺伝子を含有する。

ｐＴｒｐｌはｔｒｐＬシャイン−ダルガノ配列に統〈唯一のＣｌａｌ部位および開始コドン、ＡＴＧ、の直後の唯一のＫｐｎｌ／Ａｓｐ７１８部位を有する。ｐＴｒｐｌのＣｌａｌ部位に開始コドンを有する遺伝子の挿入は、その遺伝子の発現を可能にする。

ＫｐｎＩ／Ａｓｐ７１８部位における遺伝子の挿入は、どの部位が用いられるかに応じて、アミノ酸ｇｉｎまたはｇｉｎとｖａｔとの融合として、その遺伝子を発現する結果となる。

ｐＴｒｐｌを作成するには、チャートｌに示すごとく、２つの相補的オリゴヌクレオチドをｐＳＫ４に挿入する。プラスミドｐＳＫ４ハｔ　ｒ　ｐオペロンのプロモータ／オペレータ領域ならびにやはりアンピシリンに対する耐性を特異化するｐＢＲ３２２にクローンされたｔｒｐＬリポソーム結合部位を含有する。ｔｒｐ配列を包含する大きなりａｍＨＩ／ＣＩａＩフラグメントをｐＳＫ４から切り出し、アガロースゲルから電気溶出によって精製する（フラグメントｌ）。２つの相補的オリゴヌクレオチドを組み合わせてフラグメント２を得る。７ラグメント２は５′および３′末端において各々Ｃａ１ＩおよびＢａｍＨＩ粘着末端を有し、それをフラグメントｌに結ぶ。ＫｐｎＩ／Ａｓｐ７１８部位を含むクローンおよびｔｒｐプロモータを特徴とする制限パターンを選択し、これをｐＴｒｐｌ列状定法によって確認する。

Ｂ）　切断ＢＳｔ遺伝子の組み立て５′非翻訳領域、プレ配列、およびＢＳｔの最初についてコード付けする配列を欠失するｔ；めに、４９４ｂｐ　　Ｐｖｕｎフラグメント３をｐＬＧ２３から単離する（チャート２）。ブダペスト条約に従って、１９８１年、５月１２日にｐＬＧ２３を米国イリノイ州、ペオリア（ｐｅｏｒ　ｉａ）にあるノーザン・リーグ１ナル・リサーチ、ラボラトリ−（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　Ｒｅｇｉｏｎａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に寄託し、受託番号ＮＲＲＬ　　Ｂ１２４３６を与えられた。ｐＬＧ２３は５″および３′非翻訳領域を包含し、ｐＢＲ３２２のＰｓｔｌにクローンされた、ＢＳｔについての全長ｃＤＮＡを含有する。宿主微生物はイー・コリＨＢ　１０１である。このプラスミドの特徴は、１９８２年１２月１５日に公開された欧州特許比１！！６７０２６号および１９８１年６月１日出願の米国特許比！２６９１８７号に十分に記載されており、共にここに参照のために挙げる。フラグメント３は、ＢＳｔのアミノ酸残基２４〜１８８についてコード付けするｃＤＮＡ配列を含有する（第１表参照）。次いで、あらかじめＫｐｎＩで消化したｐＴｒｐｌに７ラグメント３を結び、クレノーフラグメントで処理して粘着末端を除去する（７ラグメント４）。ＢＳｔ７ラグメントを所望の向きにベクターへ結んで、最初の２２のアミノ酸残基についてのコドンを失ったＢＳｔ　　ｃＤＮＡ配列を得る。特徴的な？ｉ１１＠パターンで選択し、ＤＮＡ配列決定法で確認した所望のクローンをｐＴｒｐ−ＢＳｔｍｌと名付ける。

ＢＳｔ　　ｃＤＮＡは、２つのＰｖｕＩ［部位、アミノ酸残基２３についてのコドンにおける１つおよび残基１８８における１つ、を含有する。切断したＢＳｔ配列の操作を容易にするために、ｐＴｒｐ−ＢＳｔｍｌにおいて第２のＰｖｕ１１部位を除去する。アミノ酸残基を変化させることなくこのｐｖｕＩＩを除去するために、ｐＴｒｐ−ＢＳｔｍｌにおけるＭｓｔｌｌおよびＢａｍＨＩ間の５６ｂｐ領域をオリゴヌクレオチドで置き換える。チャート３において、大きなりａｍＨＩ／ＭｓｔＵ７ラグメント５をｐＴｒｐ−ＢＳｔｍｌから単離し、組み立てた４つのオリゴヌクレオチドに結び、単離してフラグメント６を得る。ｐＴｒｐ −Ｂ！３ｔｍｌｂと呼ぶ得られたプラスミドを特徴的な制限パターンよって選択し、ＤＮＡ配列決定法によって確認する。ｐ　Ｔ　ｒ　ｐ　−Ｂ　Ｓ　ｔ　ｍ　ｌ　ｂにおいて、ｐＴｒｐ−８５ｔｍｌにおける如＜ＢＳｔ配列を切断する。すなわち、最初の２２のアミノ酸についてのコドンを失わせる。ＭｓｔＩ［部位の後における３′末端の配列を修飾してｐｖｕ　１１部位を除去し、アミノ酸配列を変更することなくＨｉｎｄＩ［［部位を導入する。２つの停止コドン、統いてＢａｍＨ１部位を遺伝子の末端直後に導入する。

Ｃ）　　ＥＳｔ発現用プラスミドの組み立て成熟ＢＳｔの高レベル発現を得るために、４つのオリゴヌクレオチドを用いてＴｒｐ−ＢＳｔｍｌｂにおいて小さいＣ１ａＩないしＰｖｕＩｆ領域を置き換えてＢＳｔ配列を失わせる。ベクター中のもう１つのＰｖｕ　ｎ部位の存在のために、ベクターを２つの部分に分離するのはより簡単である。チャート４に示す如＜、４．３ｋｂＭｓ　ｔ　ｎ／Ｃ１ａ　Ｉフラグメント７をｐＴｒｐ−ＢＳｔｍｌｂから単離する。このフラグメントはｔｒｐプロモータ／オペレータ、ｔｒｐＬシャイン−ダルガノ配列、ｐＢＲ３２２複製開始点、アンピシリン耐性決定基、およびＢＳｔ遺伝子の３′末端を含有する。

また、ＢＳｔアミノ酸残基２４ないし１７６についてコード付けする配列を含有する４５０ｂｐ　　ＰｖｕＩ［／ＭｓｔＩ［７ラグメント８をｐ７ｒｐ−Ｂｓｔｍｌｂから単離する。フラグメント７および８を７ラグメント９、すでに組み立て精製した４つのオリゴヌクレオチドのブロック、に結ぶ。プローブとして４つのオリゴヌクレオチドのうち１つを用いるコロニーハイブリダイゼーシ鱈ンにより選択し、ＤＮＡ配列決定法によって確認した、得られたプラスミドをｐＴｒｐ −ＢＳｔｍ４と呼ぶ。ｐＴｒｐ−ＢＳｔｍ４において、ＢＳｔ遺伝子の最初においてなされた唯一の変化はＧＣＣないしＧＣＴの位置４におけるアラニンについてのコドンの変化である。

遺伝子の最初において他の変化を伴ってＢＳｔ発現用プラスミドを組み立てるために、ブロックにおいて４つとして組み立てた他のオリゴヌクレオチドを用いてフラグメント７および８に結ぶ。第２表において、用いたオリゴヌクレオチドブロックおよび得られｔ；プフスミドを掲げる。なされた変化は星印を付したヌクレオチドで示し、以下にまとめる。イー・コリＫ１２においてＢＳｔを発現するこれらの組立体の相対的能力は以下の通りである：ｐＴｒｐ−ＢＳｔ　１０２、ＢＳｔの最初における変化無し　　　＜０．０１％ｐＴｒｐ−ＢＳｔｍ４．ａｌａ４がＧＣＣからＧＣＴに変化　　　　　　　　　１％ｐＴｒｐ−ＢＳｔｍ５、ａｌａｌおよびａｌａ４がＧＣＣからＧＣＴに変化　　　１％ｐＭＢＳｔ４、ａｌａｌがＣＣＣからｔｈｒ　（ＡＣＣ）に変化　　　　　　　　１％ｐＭＢＳｔ４、ａｌａ４がＧＣＣからｖａｌ（ＧＴＣ）に変化　　　　　　　　１％ｐＴｒｐ−ＢＳｔ［ｐｈｅｌ、ａｌａｌがｐｈｅ（ＴＴＣ）に変化　　　　　　　２− ５％ｐＴｒｐ−［１ｙｓ］、ａｌａｌが１ｙｓ（ＡＡＡ）に変化　　　　　　　　２−５％ｐＴｒｐ−ＢＳｔｍ３、ａｌａｌが欠失　　　　　　　　　　　　　　１％実施例２　ランナウェイベクターにおけるｃＤＮＡ由来の遺伝子１０２、ｍ４およびｍ５での誘導Ａ）ランチウェイベクターｐ５０−１０２、ｐ５０−ＢＳｔｍ４およびｐ５０− ＢＳｔｍ５の組み立て実施例１に従って組み立てたＢＳｔ遺伝子の増強された発現突然変異をランチウェイレプリコンを有するプラスミドで用いることもできる。ランチウェイレプリコンについてのベクター源はｐＢＥＵ−５０という名称であり、デンマーク、コペンハーゲンＤＫ１７００のＡ／Ｓアルフレッド・ベンゾン（Ａｌｆｒｅｄ　　Ｂｅｎｚｏｎ）から商業的に入手可能である。このベクターは約１０ｋｂの大きさであり、温度感受性ｃｏｐＢプロモータおよびｃｏｐＡについてのダウン（ｄｏｗｎ）プロモータを有する。該ベクターは、また、テトラサイクリン（ｔ　ｅ　ｔ）およびアンピシリン（ａｍｐ）に対する耐性遺伝子も有する。

チャート５に示す如く、ｐＢＥＵ−５０のグラスミドＤＮＡを、各々ベクターＤＮＡを１回切断するＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化した。該消化により０．３７５ｋｂおよび１Ｏｋｂの７ラグメントが生じる。該１０ｋｂフラグメントを電気溶出によってアガロースゲルから単離した（フラグメント１０）。

ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化することによって、ｒＢＳ　を遺伝子を含有するＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ７ラグメントをｐＴｒｐ−ＢＳｔ１０２、ｐＴｒｐ −ＢＳｔｍ４およびｐＴｒｐ−ＢＳｔｍ５から単離した。この消化により３．９ｋｂおよび０．８７２ｋｂ７ラグメントが生じる。該０．８７２ｋｂ７ラグメント（フラグメント１１）を前記した如くにアガロースゲルから単離した。フラグメント１１はトリプトファンプロモータおよびトリプトファン先導リポソーム結合部位をコード付けする約２４０ｂｐを含有する。該７ラグメントの残りはｒＢＳｔ　　ｃＤＮＡ遺伝子をコード付けする。

該フラグメントをｐＢＥＵ−５０から単離したフラグメントｌＯと結ぶことによって３つのｒＢＳｔ　　ｃＤＮＡフラグメント（チャート５におけるフラグメント１１に例示）を各々クローンした。かく産生されたプラスミドをコンピテントイー・コリに入れて形質転換した（マニアティス）。元のＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩフラグメントをｒＢＳｔフラグメントで置き換えることによってテトラサイクリン耐性遺伝子を機能的に破壊する。形質転換からのコロニーをテトラサイクリン感受性についてスクリーニングし、選択したコロニーからのＤＮＡを制限消化によって分析して組み立てを確認した。

得られたベクターをｐ５０−１０２、ｐ５０−ＢＳｔｍ４およびｐ５０−ＢＳｔｍ５と呼ぶ。ＢＳｔの最初において修飾を有しないｐ５０−１０２を組み立てて、ＢＳｔがａｘａ４（ｐ５０−ＢＳｔｍ４）ならびにａｌａｌおよびａｌａ４（ｐ５０−ＢＳｔｍ５）についてのコドンにおいて修飾されたｐ５０−ＢＳｔｍ４およびｐ５０−ＢＳｔｍ５と比較した。同様の方法を用いることによって、実施例１からの他の新規なｃＤＮＡ類を用いてｐ５０−ＭＢＳｔ４、ｐ５０−ＭＢＳｔ１２、ｐ５０−ＢＳｔ　　［ｐｈｅｌ　、ｐ５０−ＢＳｔ［１ｙ　Ｓ］　、およびｐ５０−ＢＳｔｍ３と名付けられた同様なプラスミドを組み立てることができる。

Ｂ）　二重レプリコンランナウェイベクターの組み立て以下の実施例は、本明細書中てに記載するソマトトロピンの発現に有用なレプリコンの新規組合せの組み立てについての詳細を示すものである。この分類のキメラベクターをｐＵＲＡと名付ける。組み立てにおける最初の工程はランチウェイレプリコンおよびベンゾン（Ｂｅｎｚｏｎ）族プラスミドからの連合遺伝子の単離を含む（チャート６参照）、２．４ｋｂ　　ＡｈａＩ［−Ｎｄｅｌフラグメント（フラグメント１２）をＡ／Ｓアル７レフド・ベンゾンから商業的に入手可能なｐＢＥＵ−５０に類縁のｐＢＥＵ−１７と呼ばれるベンゾンベクター（１３，８ｋｂ）から単離した。

フラグメント１２（３，６ｋｂ）はベクターの完全な複製領域を含有するものであり、これをｐＢＲ３２２のＮａｒＩおよびＮｄｅ１部位にクローンしＩ；。該クローニングによりｐＢＲ３２２の約２ｋｂがｐＢＥＵ−１７からの２．４ｋｂで置き換えられる。ＡｈａＩ［およびＮａｒｌ制限部位は相補末端を有し、Ｎａｒ１部位が再生される。ＮｄｅＩ部位も再生される。ベクターは二重の複製開始点、１つはｐＢＥＵ−１７からのもの、およびもう１つはｐＢＲ３２２ベクターからのもの、を含有する。得られｔ；ベクターをｐＵＲＡと名付ける（５　ｋ　ｂ）。このベクターも元のｐＢＲ３２２プラスミドに存在していたＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩについての唯一の制限部位を含有する。

ｐＵＲＡシリーズのキメラプラスミド、例えば、寅施例１からのｐＴｒｐ−ＢＳｔｍ４によりコード付けされ？：ＢＳｔ（ｍ４遺伝子）、を用いてソマトトロピンを発現させるために、発現ベクターｐＵＲＡ−ｍ４を三重結びから組み立てた（チャート７）。結んだのは＝（１）ｔｒｐプロモータ、ｔｒｐ先導リポソーム結合部位、およびｍ４遺伝子（フラグメント１３）を含有するｐ５０−ＢＳｔｍ４（チャート５）からの単離したＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩフラグメント（８７５ｂｐ）；　（２）（チャールズ・ヤノフスキイ（ＣｈａｒｌｅｓＹａｎｏｆｓｋｙ）博士、スタンフォード医学校、から入手した）プラスミドベクターｐＶＶ２０２Ｔからの３５０ｂｐ　　ＢａｍＨＩフラグメント（フラグメント１４）として単離したイー・コリ遺伝子ｒｐｏＢＣについての転写ターミネータ、および（３）Ｉ）ＵＲＡをＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化した後単離したｐＵＲＡプラスミドベクター７ラグメント（４，６ｋｂ、７ラグメント１５）であった。フラグメント１３〜１５を混合し、結び、コンピテントイー・コリに入れて形質転換した。形質転換クローンからのベクターＤＮＡを分析し、イー・コリ（Ｅ−ｃｏｌｉ）染色体におけるｒｐｏＢＣ遺伝子に対するのと同一の、ｍ４遺伝子の転写に対する向きにターミネータを有するベクターをｐＵＲＡ−ｍ４　（５，８ｋｂ）と名付けた。

ｐＵＲＡ　　ｍ４の模式図をチャート７に示す。

選択した特定の転写ターミネータが本発明において有用な唯一のターミネータではないことに注意すべきである。多くの効果的なｒｈｏ独立転写ターミネータのうちいずれも置き換えることができる。これらのターミネータの総説についてはセル（Ｃｅｌｌ）　、３２　：１０２９−１０３２　（１９８３）およびアヌ・レブ・ジエネト（Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｇｅｎｅｔ、）、１３：３１９−５３　（１９７９）参照。

同様にしてｐＴＲｐ−ＢＳ　ｔｍ５、ｐ５０−ＭＢＳｔ４、ｐ５０−ＭＢＳｔ１２、ｐ５０−ＢＳｔ　　［ｐｈｅ］　、ｐ５０−ＢＳｔ［１ｙ　ｓ］　、およびｐ５０−ＢＳｔｍ３からのＢＳｔ遺伝子をｐＵＲＡに挿入してｐＵＲＡ−ｍ５　　ｐＵＲＡ−ＭＢＳｔ４、ｐＵＲＡ−ＭＢＳ　ｔ　１２、ｐＵＲＡ−ＢＳｔ　　［ｐｈｅ］　、ｐＵＲＡ−ＢＳｔ　　［Ｉｙｓ］　、ｐＵＲＡ−ＢＳｔｍ３を得ることができる。

Ｃ）　　ｒＢＳｔ発現用イー・コリ主の組み立てイー・コリ祖先様をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシヨン（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）から−人手し、これをＡＴＣＣｅ２３７１６と名付ける。この株はバタテリオファージラムダに対して浴深性であり、やはりＦプラスミドを有する（バックマン・ビイ・ジェイ（Ｂａｃｈｍａｎｎ、　Ｂ、ｌ）　、バクト・レブ（Ｂａｃｔ。

Ｒｅｖ、）、３６　：　５２５−５５７　（１９７２）。

ラムダ溶原菌を該株から除去した。これは、ミラー・ジェイ・エイチ（Ｍｉｌｌｅｒ　Ｊ、Ｈ，）　、エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジエネチイクス（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）　、コールド・スプリングｅハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）　　（１９７２）　、によって記載されている如くＰｌｖｉｒバクテリオファージ形質導入法によって行った。該Ｐ１ｖｉｒバクテリオファージはコールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリーズ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）　、コールド・スプリング・ハーバ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ）　、ニューヨークから「遺伝子融合株キットに関する実験（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　にｅｎｅＦｕｓｉｏｎ　５ｔｒ−ａｉｎ　Ｈｉｔ）　Ｊの一部として入手可能である。

バクテリオファージＰｌｖｉｒをコリ・ジェネチック・ストック・センター（Ｃｏｌｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　５ｔｏｃｋ　Ｃｅｎｔｅｒ）、ｃ１０バーパラ・バックマン（Ｂａｒｂａｒａ　Ｂａｃｈｍａｎｎ）博士、イエール大学、ニュー争バーベン（Ｎｅｗ　Ｈａｖｅｎ）　、コネティカット州０６５１０から入手可能なイー・コリ株ＣＧ５Ｃ６１８０上で増殖させた。この株はバクテリオファージラムダに対して浴深性でなく、（キノリネートシンセターゼのＡ蛋白をコード付けする）ｎａｄＡ遺伝子に挿入されたＴｎｌＯ要素を含有し、バクテリオファージラムダの組み込み部位に隣接して位置する。該ＴｎｌＯ要素はｎａｄＡ遺伝子を破壊し、細胞をしてニコチンアミドの外性源に依存せしめる。該ＴｎｌＯ要素はテトラサイクリン耐性についてコード付けする遺伝子を有する。ｃｃｓｃ６１８０　（ｎａｄＡ：　：ＴｎｌＯ）からのＰｌｖｉｒ溶解物を用いて、テトラサイクリン耐性について選択することによってｎａｄＡ：：ＴｎｌＯ対立遺伝子をＡＴＣＣｅ２３７１６に形質導入した。

バクテリオファージＴ４ｒｎに対する感受性により、該選択からの多くのコロニーｔ−隣接ラムダフフ７−ジの組換ロスについてテストしに（ベンゼル・ニス（Ｂｅｎｚｅｒ、　Ｓ、）　、プロシーディングズ・オブ・ナシュナル・アカデミ −・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ−Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ−Ｓｃｉ、）ＵＳＡ、４７　：　４０３４０８　（１９６１））ａ正常なｎａｄＡ遺伝子を有しかつラムダに対して浴深性でない（該コリ・ジェネティク・ストック・センター（Ｃｏｌｉ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　５ｔｏｃｋ　Ｃｅｎｔｅｒ）、ニューバーペン・コネチカット州から入手可能な）Ｗ３１１０株上でＰｌｖｉｒを増殖させることによってｎａｄＡ＝　：ＴｎｌＯ対立遺伝子を除去した。ニコチンアミドを補足していない培地上で細胞を平板培養することによって正常なｎａｄＡ対立遺伝子についての選択を行った。

次に、４ｐｇ／ｍｎリファンピシン（ｒｉｆａｍｐｉｃｉｎ）の存在において細胞を、多世代の間、増殖させることによって該Ｆプラスミドを除去した。Ｆプラスミドを失った細胞をＦプラスミド特異性バクテリオファージの増殖を支持するそれらの能力によって同定しに（９口・エル・シイ・およびエム・シュノス（Ｃａｒｏ、　Ｌ−Ｇ。

ａｎｄ　Ｍ、　５ｃｈｎｏｓ）　、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）　Ｕ　Ｓ　Ａ。

ｓａ＝　１２６−１３１　（１９６６）。得られた株をに１２Ｄと名付１すｔこ。

Ｃ）　　Ｋ１２Ｄ株におけるｐ５０−１０２、ｐ５０−ＢＳｔｍ４およびｐ５０ −ＢＳｔｍ５ベクターの誘導アンピシリン耐性について選択することによってベクターをコンビタントに１２Ｄ細胞に入れて形質転換した。１００μｇ／ｍＱアンピシリンを含有するＬＢ培地中で３種の培養物を一晩増殖させた。

翌日、細胞を１１５０だけ同−培地中に継代培養し、約２７５ｒｐｍに設定しｔ；ニュー・ブルンスウィック（Ｎｅｗ　Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ）振盪インキュベーター中の滅菌フラスコを用いて２７℃にてインキュベートした。

０−Ｄ、＊５−−−０−２−０．３まで培養物を増殖させ、次いで３８．５℃までシフトしてランチウェイ複製を誘導した。

誘導後、サンプルをとり、５ＤＳ−ＰＡＧＥゲル分析によって分析した（レムリイ（Ｌａｅｍｍｌｊ）　、前掲）。ゲルをコーマシー・ブルーで染色し、スキャンして目に見えるｒＢＳｔ量を測定した。

ｐ５０−１０２の誘導について検出可能なｒＢＳｔはなかっｔ；。

ｐ５０−ＢＳｔｍ４またはｐ５０−ＢＳｔｍ５いずれかを含有する培養物により、１３なしい１８領域パ一セント間のＢＳｔが産生された。　　ｐ５０−１０２およびｐ５０−ＢＳｔｍ４を含有する誘導細胞の２００．Ｄ、サンプル中に存在するｒＢＳ　を袋間についてＨＰＬＣでの比較を行った。ｐ５０−１０２は検出可能なｒＢＳ　ｔを示さず（０，００ｍｇ／ｍＱ）、ｐ５０−ＢＳｔｍ４は１７９．０２ｍｇ／ｍ１２を示した。

これらの結果は、ＧＣＣないしＧＣＴのＢＳｔの第４番目の位置におけるアラニンについてのコドンにおける単一塩基の変化がランチウェイプラスミドにおいて高レベルのｒＢＳ　を産生をひき起こすことを示す。

実施例３　　ｒｐｏＨ１１２およびｈｆｌＢ２９対立遺伝子でのイー・コリ宿主の組み立てイー・コリ株ＣＡＧ６７１を力ロール・グロス（Ｃａｒｏｌ　　Ｇｒｏｓｓ）ｉｌｌ＞　（ライスコンシン大学、マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）　、ウィスコンシン州）から入手した。この株はｒｐｏＨ１１２対立遺伝子を含有し、隣接挿入のｚｈｇ：：ＴｎｌＯを有するものであった（グロスマン・エイ・ディら（Ｇｒｏｓｓｍａｎ、　Ａ、Ｄ、　ｅｔ　ａｌ、）　、ジャーナル・オブ・バクテリオロジ−（Ｊ、　Ｂａｃｔ、）、１６１：９３９−９４３（１９８５））、バクテリオファージＰｌｖｉｒをＣＡＧ６７１株上で増殖し、かつ溶解物を用いることによって、ｒｐｏＨ１１２対立遺伝子をＫ１２Ｄに導入してに１２Ｄ株をテトラサイクリン耐性に形質導入しくｒｐｏＨ１１２対立遺伝子に隣接して位置するＴｎｌＯにおけるコード付け）、およびｒｐｏＨｌ　１２対立遺伝子において共形質導入した（ミラー・ジエイ・エイチ（Ｍｉｌｌｅｒ、　Ｊ、Ｈ，、前掲））。

得られた株をＤ１１２と名付け、ブダペスト条約に従って１９８７年２月４日にアグリカルチュラル・リサーチ・サービス・カルチャー争コレクション（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　５ｅｒｖｉｃｅＣｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）　、ノーザン・リージョナル・リサーチ・センター（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　Ｒｅｇｉｏｎａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃｅｎｔｅｒ）、ノース− ユニバーシテ４”ストリート（Ｎｏｒｔｈ　Ｌｌｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　５ｔｒｅｅｔ）　１８１５、ペオリア（Ｐｅｏｒｉａ）　、イリノイ州６１６０４、ＵＳＡに寄託し、受託番号ＮＲＲＬ　　Ｂ−１８１６８が与えられた。

イー・コリ株ｘ９３９３はロナルド・ソメルビル（ＲｏｎａｌｄＳｏｍ＋ｎｅｒｖｉ　１ｉｅ）博士（プルドウ（ｐｕｒｄｕｅ）大学、インジアナ州）から入手しｔ；。この株はｈｆｌＢ２９対立遺伝子、および隣接するＴｎｌＯ要素を含有する（バネット・エフら（Ｂａｎｕｅｔｔ、　Ｆ、　ｅｔ　ａｌ、）、ジャーナル・オブ・バイオロジー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、）　、ｌ　８７　：　２１３−２２４　（１９８６））。ｒｐｏＨについて記載したのと同様の方法によって該ｈｆｌＢ２９対立遺伝子をＫ１２Ｄ株に導入しｌ；。得られた株をＢ２９と名付けた。

実施例４　　ｒｐｏＨ１１２およびｈｒｔＢ２９対立遺伝子ならびに二重レプリコンプラスミドと共にイー・コリ宿主を用いるＢＳＴの発現ベクターｐＵＲＡ　　ｍ４をイー・コリ株Ｋ１２Ｄ、Ｄ１１２（ｒｐｏＨ１１２を有するＫ１２Ｄ）およびＢ２９　（ｈ　ｆ　ｌＢ２９を有するに１２Ｄ）のコンピテント細胞に入れて形質転換した。

２７℃エヤー振盪器中０ＬＢＢａスを含有する振盪フラスコ中で培養物を増殖させた。所望の時点で、培養物を３７°Ｃ振盪器に移してランチウェイベクター複製およびｒＢＳ　を発現を誘導した。その後、加熱シフトに先立ってサンプルを何回か採取した。該サンプルを５ＤＳ−ＰＡＧＥおよびゲル・スキャンニングによって分析した。

結果は、ｒＢＳ　ｔかに１２Ｄにおいて目に見える蛋白１３，３％、Ｂ２９において３２％、およびＤ１１２において４１％に達したことを示す。

これらの結果は、天然ｃＤＮＡにおける開示された修飾を行った場合、ランチウェイプラスミドの異なる組み合わせによってｒＢｓｔの発現が促進されるが、ｒｐｏＨもしくはｈｆ　ＩＢ対立遺伝子を含有するイー・コリ株にキメラプラスミドを入れた場合、特に有利な発現レベルの上昇があることを示す。

実施例５　ランナウェイプラスミド複製およびｐ　Ｕ　ＲＡ　−ｍ　４でのｒＢＳｔの合成の自然誘導Ａ）　　ｒＢＳｔ合成の自然誘導とプラスミドランナウェイ復製の自然誘導との間の関係ランチウェイ複製ベクターｐＵＲＡ−ｍ４を含有し、かつ発酵に適合した株ＤＩ　１２　（ＢＳＴ−１と呼ぶ、以下の節Ｃ参照）の培養物を、グルコースと酵母エキスもしくはカザミノ酸いずれかとを補足した明確な無機塩培地のフラスコに接種した。２８℃でインキュベートし、Ａ□。のＯ，Ｄ、にて３７℃に移した振盪フラスコからサンプルを得、５ＤＳ−ＰＡＧＥに付した（レムリイ（Ｌａｅｍｍｌｉ）、前掲））。かかるサンプルは、プラスミドランナウェイ複製の熱誘導性およびｐＵＲＡ−ｍ４を特徴づけるｒＢＳｔ発現のため、認め得るｒＢＳｔ合成を示した。しかしながら、同一の培地を含有する対のフラスコから得られ、同一の培養物を接種するが終始２８℃でインキュベートしｔ；サンプルを５ＤＳ− ＰＡＧＥ分析に付した場合、認め得るｒＢＳｔ合成も観察された。これらの観察は、株ＢＳＴ−１が自然に（すなわち、非熱的に）ｒＢＳｔ合成を誘導できることを示す。

グルコースおよび酵母エキスを補足した明確な無機塩培地中で行った発酵によって、ｒＢＳｔ合成の自然誘導を受けるｐ　Ｕ　ＲＡ　−ｍ　４の能力を確認した。さ゛らに、これらの発酵によって、ｒＢＳｔ合成の自然誘導がプラスミドランナウェイ復製の自然誘導が起こると同時に起こることが確立された。熱誘導の不存在において、ｐＵＲＡ−ｍ４は自然に実質的により高いコピー数まで増加した。第３表のデータは、プラスミドコピー数の自然誘導とｒＢＳ　を合成の自然誘導間の関係を示す。接種後約１５時間まで、逆相ＨＰＬＣ分析に付したサングル中にｒＢＳｔの蓄積が検出され！；、プラスミドコピー数（プラスミドＤＮＡ含量）における同様の一時的増加が終始２８℃で行った発酵の間にｐ　Ｕ　ＲＡ　 −ｍ　４について観察された。

Ｂ）　　ｒＢＳｔ合成の不存在におけるプラスミドランナウェイ復製の自然誘導可能性ＥｃｏＲＩおよびＨ４ｎｄｎｌ制限部位と境界を接する約８５０塩基対７ラグメントを除去し、かくしてｒＢＳｔ合成をコード付けする遺伝子を欠失することによってプラスミドｐＵＲＡ４Δｂ　ｇ　ｈ　ｔｙＮをプラスミドｐＵＲＡ−ｍ４から組み立てた（チャー［３）。イー・コリ株ＢＳＴ−ＩＣ，４２℃における明確な最小培地上での増殖により得られ、かつＤＮＡ伝達形質転換によってｐＵＲＡ−ｍ４が除去されたことが見いだされた株ＢＳＴ−１のグラスミドなしの誘導体、にプラスミドｐＵＲＡ４　　Δｂ　ｇ　ｈ　ｔｙｕを導入した。得られた株はｒＢＳ　ｔを合成することができなかった。

イー・コリ宿主株ＢＳｔ−１ｃをブダペスト条約に従って１９８８年２月２日、アグリカルチュラル・リサーチ・サービス・カルチャー中コレクション（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　５ｅｒｖｉｃｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）　、ノーサン・リージョナル・リサーチ・センター（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　Ｒｅｇｉｏｎａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃｅｎｔｅｒ）、ノース慟ユニ／（−シテ（’ストリー）　（Ｎｏｒｔｈ　Ｌｌｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　５ｔｒｅｅｔ）　　ｌ　８１５、ベオリア（Ｐｅｏｒｉａ）、イリノイ州６１６０４、米国に寄託し、受託番号ＮＲＲＬ　　Ｂ−１８３０３が与えられた。

グルコースおよび酵母エキスを補足した明確な無機塩培地中で行つた発酵からのデータは、ランチウェイプラスミド複製の自然誘導を受ける株ＢＳＴ−１ｃ（ｐＵＲＡ４　　Δｂ　ｇ　ｈ　ｘ７．ｌ）の能力を示す。

株ＢＳＴ−１から得られた調製物を含有するプラスミドと比較した場合、ＢＳＴ −ＩＣからの調製物（ｐＵＲＡ４　　Δｂ　ｇ　ｈ　ｔｚｎ）により、両様からのプラスミドはそれらの各発酵の終わりまで非常に似Ｉ；レベルまで自然に増加することがはっきりした（第４表）。従って、ランチウェイ複製の実質的に高レベルのプラスミドコピー数までの自然誘導は本質的に宿主ｒＢＳｔ合成から独立しているものであった。

Ｃ）　自然誘導についての発酵条件ここに記載するのはｐＵＲＡプラスミドで形質転換したイー・コリ宿主についての好ましい発酵プロトコルである。

これらの実験で用いる株の組立体をＢＳＴ−１と名付けた。

ＢＳＴ−１は、ｐＵＲＡ−Ｈ４で形質転換したＤ１１２株を以下に記載する発酵種培地に適用することによって得られるものであった。

ＢＳＴ−１は株ＢＳＴ−ＩＣ（前お）をｐＵＲＡ−ｍ４（前記）で形質転換することによっても産生できる。

２種の発酵培地、ＲＢ６およびＲＢ７を実験で用いた。これらの培地の組成および調製法は以下の通りである：Ａ）　培地調製手順：１）　培地　ＲＢ５＝成分　　　　濃度　　員Ｎａ（ＮＨａ）ＨｐＯ４−ＨｚＯ１１ｇ／Ｑ　　９９ｇＫｓＨＰＯａ　　　　　　２．６　ｇ／Ｑ　　２４　ｇクエン酸・ＨｚＯ２−１ｇ／Ｑ　　　　１９　ｇ酵母エキス　　　　　　　　　　Ｌｏｇ／Ｑ　　　　９．０ｇ（ＮＨ，）、Ｓｏ、　　　　　０．６６ｇ／ｆｆ　　５．９ｇＭｇ５０．　　　　　０．２５ｇ／１２２．２ｇ５ＡＧ　４１３０　　　０．７５ｍ１２／１２６．８ｍ１２１５Ｑ７アーメンター中、前記成分をＲ１０，水にて全量を８．３Ｑとし、１２１℃にて２０分間滅菌し、次いで冷却する。７アーメンターを接種するに先立って、滅菌しｆ：　５００　ｇ／Ｑグルコース溶液、微量養素９ｍｆｆおよび滅菌した２５ｇ／ｆｆアンピシリン溶液をファーメンタ−に無菌的に加える（以下の「発酵添加」の節参照）。

２）　培地　ＲＢ７：成分　　　　創１１Ｎａ（ＮＨ４）ＨＰＯｉ・ＨｘＯ１１ｇ／Ｑ　　９９ｇＫ、ＨＰｏ、　　　　　　２．６ｇ／Ｑ　　２４ｇクエン酸、Ｈ，ｏ　　　　　　　　　２．１ｇＩＱ　　　１９ｇ酵母エキス　　　　　　　　　　１．０ｇ／Ｑ　　　　９．ＯｇＤ、Ｌ−メチオニン　　　　　　０．７５ｇ／ρ　　６．７ｇ（食品グレード）（ＮＨ，）ｚｓｏ、　　　　　　　　　　０．６６ｇＩＱ　　　５．９ｇＭ　ｇ　Ｓ　Ｏ４０−２５ｇ　／　Ｑ　　　２．２　ｇＳＡＧ　　４１３０　　　　　　　　０．７５ｍｆｆ／Ｑ　６．８ｍ１２その他の手順はＲＢ５についてのものに同じ。

３）　発酵添加：ａ）　微量養素溶液（２００ｍＱ）：成　分　　　　　　　　　　量（ダラム）ＦｅＳＯａ・ＨｘＯ５，２２クエン酸・Ｈ，０５，０４痕跡量酸分＊８＋ｎＱを前記成分に加え、全量を２００ｍＱとし、０．２２ミクロンフィルターを通す経路により滅菌する。

（＊）痕跡量成分溶液を以下の通りに調製する：成分　　　　　量（ｍｇ）クエン酸・ＨｘＯ７０００Ｔ（、Ｂｏ、　　　　　　　２４７．４ＭｎＣＱ　ｔ・４Ｈ！Ｏ１５８，０ＣｏＣＱ、・６Ｈ２０７１，４（ＮＨ４）　Ｊ（Ｏｙｏ　ｚ＋・４Ｈ２０３７，ｌＺｎ５Ｏ，・７Ｈ，０２８− ８Ｃｕ　Ｓ　Ｏ４１５−９蒸留水で全量を１００ｍＱとする。

ｂ）　　５００　ｇ／リットルのグルコース添加（６７５ｍＱ）：１リツトル振盪フラスコ中のグルコース３３８ｇをＲ１０，水で全量を６７５ｍ１２とし、十分量のＩＮ　　Ｈ，Ｓｏ、を添加してＰＨを４まで低下させ、１２１’Ｏにて２０分間滅菌する。

ｃ）　　２５ｇ／（ｌアンピシリン添加（３００ｍｎ）：アンピシリン９ｇをＲ，Ｏ，水３６０ｒ１２に溶解することによつて２５ｇ／Ｑアンピシリン溶液を調製する。ＩＮ　　ＮａＯＨを滴下することによって懸濁液をｐＨ８−０まで滴定する。０．４５ミクロンフィルターを用いて得られた溶液を滅菌し、冷蔵し、２４時間内に用いる。

（滅菌後）培地ＲＢ６またはＲＢ７の９リツトルを含有する１６リツトルの７アーメンターを振盪フラスコからのブロス３０ｍ１２で接種する。培養物の貯蔵および種培養物の調製の手順は以下の通りである：Ｂ）　アンプルおよび種調製手順１）　以下の培地を用いるペトリ皿を調製する。

成分　　　　濃度　　ｌバクトーアガール　　　　　　　　　　　　　　　　　１５ｇ／Ｑ　　　　　　　３．７５ｇトリブチ（カーゼ・ソイーＴトル　　　　　　　　４０ｇ／Ｑ　　　　　　１０．０ｇ前記成分をＲ９０，水で全量２５０ｍ１２とし、綿栓でシールした５００ｍ（ｌエルシンマイヤーフラスコ中の得られた溶液を１２１°Ｃにて２０分間滅菌し、次いでフラスコを５０℃の水浴に入れる。培地を加熱フラスコからあらかじめ滅菌したベトリ皿に移す。層流のフード下、皿の覆いを支柱で支えて開放した状態で、皿を一晩放置して乾燥させる。覆つｔ；皿を逆の姿勢で貯蔵する。

２）　液体窒素の気相下で貯蔵したイー・コリの１本のアンプルの内容物で前記調製ベトリ皿を線条接種することによって、組換体イー・コリの単コロニーを調製する。該ペトリ皿を２８℃にて２日間インキュベートする。

３）以下の培地を含有する３つの振盪フラスコを調製する。

成分　　　　　創１　　象に、ＨＰｏ、　　　　　　２．６　ｇＩＱ　Ｏ−０７８ｇＮａ（ＮＨ，）ＨＰＯ，−４Ｈｘ０１１．Ｏｇ／１２０．３３ｇりｘン酸・Ｈｚｏ　　　　　　　　　　２．Ｉｇ／１２　　０．０６３ｇ（ＮＨ４）　ｘｓＯａ　　　　０．６６　ｇＩＱ　Ｏｏｏ　２０　ｇＭｇＳＯ４・７Ｈｚ０　　　０．９９ｇ／１２０．０３０ｇグリセロール　　　　　　　　　５．０ｇ／Ｑ　０．１５ｇ酵母エキス　　　　　　　　　１０．０　ｇ／Ｉ２０．３０　ｇＲｏｏ、水　　　　　　　　　　　　　　　２９．０ｍｆｆ前記振盪フラスコを綿栓でシールし、それらを１２１’ｃにて２０分間滅菌し、次いで使用前にそれらを室温まで冷却する。

４）単コロニーを無菌的にフラスコへ継代することによって前記各フラスコを接種する。３２０ｒｐｍ、２８℃に設定した環箋制御インキュベーター振盪器中に振盪フラスコを入れる。振盪フラスコの１つを定期的にサンプリングし、１％ホルムアルデヒド９ｍ１２で希釈しＩ；サンプル１ｍ＋２の５５０ｎｍにおける吸光度を測定する。

吸光度０．３が得られたならば、残りの２つの振盪フラスコを冷蔵し、冷蔵後２４時間内にこれらのフラスコのうち１つを発酵種として用いる。

５）　以下の培地を含有する６つの振盪フラスコを調製する：成分　　　　　濃度　　ｌＫ、ＨＰｏ、　　　　　２．６　ｇ／（１０，０５２ｇＮａ（ＮＨａ）ＨＰＯ＊ ”４　Ｈ２Ｏ１１，ｏｇ＃２　２．２ｇりｓン酸−ＨｚＯ２，１ｇ／ｇ　　　０．４２ｇ（ＮＨ４）！ＳＯ４０，６６ｇ／ｆｆ　Ｏ，１４ｇＭｇ５ｏ、−７ＨｚＯ０，９９ｇ／ｆｆ　０．２０ｇグリセロール　　　　　　　　５．０ｇ／ｆｆ　　　１．０ｇ酵母エキス　　　　　　　　　１０．０　ｇＩＱ　　　２．ＯｇＲｏｏ、水　　　　　　　　　　　　　　　２９８．ＯｍＵ前記振盪フラスコを綿栓でシールし、それらを１２１°Ｃにて２０分間滅菌し、使用前に室温まで冷却する。

６）アンピシリン９グラムをＲ，Ｏ，水３６０ｍｇに溶解することによって２５ｇ／１２アンピシリン溶液を調製する。アンピシリン完全に溶解させるために、滴下によりＩＮ　　ＮａＯＨを加えることによって懸濁液をｐ）（８，０まで滴定する。０．４５ミクロンのフィルターを用いて溶液を滅菌し、冷蔵する。溶液を２４時間内に用いる。

７）各振盪フラスコに種１ｍ１２およびアンピシリン溶液０．３ｍＱを無菌的に加えることによって前記振盪フラスコを接種する。

３２０ｒｐｍ、２８℃に設定した環境制御インキュベーター振盪基中に振盪フラスコを入れる。振盪フラスコのうち１つを定期的にサンプリングし、１％ホルムアルデヒド９ｍ１２で希釈したサンプル１ｍ１２の吸光度を５５０ｎｍにて測定する。吸光度０．１になると、残りの振盪フラスコを冷蔵する。

８）アンプル充填に先立ちグリセロール６７ｇを各振盪フラスコに加える。

９）アンプルに充填するのに固定した送液ポンプを使用する場合、送液容量をｌ＋ｎ＋Ｑに設定する。アンプルに充填する間、氷冷し、時々培養物を攪拌する（アンプルは充填に先立って冷却しなければならない）。

水酸化アンモニウム（５０重量％）のオン／オフＰＨ制御を用いて発酵ブロスのｐＨを制御する。回転およびエアレーション速度は、各々、６００ｒｐｍおよび１３．５　ｓ　１ｍに設定し、ファーメンタ−における逆圧、ｐＨｓおよび温度は各々ｌｏｐｓｉｇ、７．２および２７℃で制御する。

２７°Ｃにて、９リツトルの規模でＢＳＴ−１を培地ＲＢ６上で培養した。細胞密度０．５ｇ／ｆｆ（乾燥重量）における自然誘導を過ぎると暗色の極封入小体が形成された。発酵の３２時間後、各々１．５９ｇ／Ｑおよび５．１ｇ／ｆｆのＢＳｔおよび細胞収率が得られた。

実施例６　　ｐＵＲＡ−ｍ４に関するプラスミド維持安定性Ａ）　　ＢＳＴ−１振盪フラスコ培養物におけるｐ　Ｕ　ＲＡ　−ｍ　４の安定性２８°Ｃにて、アンピシリンなしの複合液体培地中で数世代増殖させた培養物で行った実験の間に、株ＢＳＴ−１におけるｐＵＲＡ−ｍ４の維持安定性を定量した。培養物から一部を順次とり、１０−’の希釈にて、アンピシリンなしの新鮮な複合培地を含有するフラスコに綴代培養した。２８℃におけるインキュベーションに続き、該プロセスを繰り返した。各継代サイクルの最初および最後に、培養物サンプルをとり、希釈し、４０μｇ／ｍＱアンピシリンを補足したまたは補足してないいずれかの複合培地上の平板にて平板培養し、２８℃にてインキュベートした。（アンピシリンなしの）合計活性集団の定量により、以下の式：％式％）に従っての、各継代サイクル間に起こる合計世代数（ｎ）の見積りが可能となった。両培地上で定量した活性集団の比較により、以下の：ＰＳＦ−（Ａｐ平板上のＣＦ　Ｕ／ｍｆｆ　）　／　（非補足平板上のＣＦＵ／ｍａ）に従っての、プラスミド安定性頻度（Ｐ　Ｓ　Ｆ）の見積りが可能となった。

≧９５％の細菌がアンピシリン耐性であると検出された如く、プラスミドｐＵＲＡ−ｍ４が１３１．９世代までと、長い増殖の間安定であることをデータは示した。

Ｂ）ＢＳＴ−１のファーメンタ−培養物におけるｐ　Ｕ　ＲＡ　−ｍ　４の安定性アンピシリンなしの培地中における５０００リツトル規模での発酵の間に、株ＢＳＴ−１におけるｐＵＲＡ−ｍ４の安定性を定量した。発酵を行っている間に何回かサンプルの一部を無菌的に取り出し、前記（実施例６、Ａ）の如く取り扱って、起こった細菌の世代数およびプラスミド安定性頻度を見積もった。ｐ　Ｕ　ＲＡ　−ｍ　４が１８．４世代の発酵の間完全に安定であったことをデータは示した。

実施例７　ブタ・ソマトトロピン（ＰＳｔ）の発現Ａ）　発現ベクターｐＴｒｐ −ｃｏｎｓＤの組み立てさてチャート８を参照し、ｐＴｒｐ−ｃｏｎＳＤを作成するためには、チャート８に示された如くオリゴヌクレオチドを用い、ｐＳＫ４におけるＨｐａＩ−ＨｉｎｃｌＩ［Ｉ領域を置き換える。

ｐｓＫ４をＨｉｎｄｎｌ、細菌アルカリ性ホスファターゼ（ＢＡＰ）およびＨｐａＩで処理してフラグメント１６を得る。フラグメント１７は合成によって産生するが、それは、組み立て、次いで精製した４つのオリゴヌクレオチドを含有する二本鎖ＤＮＡ配列である。

フラグメント１６および１７を一緒に結び、クローン化する。

Ｔｒｐプロモータに特徴的な制限パターンを有するクローンを選択し、これをｐＴｒｐ−ｃｏｎＳＤと名付ける。ｐＴｒｐ−ｃｏｎＳＤにおけるＴｒｐプロモータの下流配列を配列決定法によって確認する。発現ベクターｐＴｒｐ　　ｃｏｎＳＤはトリプトファンオペロンのプロモータおよびオペレータ領域、ならびにアンピシリン耐性を有するｐＢＲ３２２パックグランドにおけるイー・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）フンセンサスシャインダルガノ（ｃｏｎＳＤ、ＧＧＡＧＧ）配列を含有する。

Ｂ）　　ＰＳｔを含有するプラスミドの組み立てさてチャート９を参照し、ＰＳｔについてのｃＤＮＡの調製法は公知である（ビイ・エイチ・シーブルグら（Ｐ、Ｈ，Ｓｅｅｂｕｒｇ　ｅｔ　ａｌ）、ディー・エヌ・エイ（ＤＮＡ）、２　：３７−４５．１９８３．およびＥｌｌ、州特許出！１１１３８９号、米国特許比＠４３９９７７号）。

ＧＣティリングによって、ｐＢＲ３２２のＰｓｔＩ部位にｃ　ＤＮＡをクローニングする。５゛および３′非翻訳領域を包含するＰＳｔについての全長ｃＤＮＡはＰｓｔｌ消化によってベクターから切除できる。このＰｓｔｌフラグメント（フラグメント１９９００ｂｐ）は２つのＨｇｌＡｌ部位、プレ配列における１つおよび成熟配列の第１５フドンにおける１つ、を含有する。切断したＰＳｔ　　ｃＤＮＡ配列を含有する６６０ｂｐ　Ｈｇ１Ａ］−ＰｓｔＩフラグメントを２つのオリゴヌクレオチドと一緒に発現ベクターｐＴｒｐ−ｃｏｎＳＤにクローニングする。チャート９に示す如＜、ｐＴｒｐ−ｃｏｎＳＤをＫｐｎＩ、クレノー７ラグメントおよびＣ１ａＩで処理してフラグメント１８を得る。次いでフラグメント１８をフラグるＨｇ１ＡＩ粘着末端および３″末端における平滑ＰｓｔＩと共に成熟ＰＳｔ配列の最初の１４のコドンについて切断したＰＳｔｃＤＮＡを含有する。フラグメント２１は成熟ＰＳｔについての最初の１４コドン、翻訳開始コドン、ＡＴＧ、ｐＴｒｐ−ｃｏｎｓＤへ結ぶためのＣＩａＩ粘着末端、およびＰＳｔフラグメントに結ぶためのＨｇ１Ａ１粘着末端を含有する２つの相補的オリゴヌクレオチドのアニール産生物である。得られた組立体、ｐＴｒｐ−ＰＳｔｌ、においてＰＳｔの発現はｐＢＲ３２２バックグランドにおけるＴｒｐプロモータの制御下にある。このＰＳｔにおける第４番目のアラニンについてのコドンを天然ｃＤＮＡにおけるＧＣＣからＧＣＴに変化させる。

同様にして、ＰＳｔ　　ｃＤＮＡにおいて変化がなされていないｐＴｒｐ−ＰＳｔｃを組み立てる。

Ｃ）　　Ｐｓｉ遺伝子のｐＵＲＡ発現ベクターへの導入フンセンサスシャインダルガノ配列と組み合わせ、ＵＲＡベクタるＰＳｔ発現ベクターの組み立てをここに詳細に述べる。

チャートｌＯを参照し、＄）ＵＲＡベクターをＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素で消化し、二重複製。ｒｉおよびアンピシリン耐性遺伝子を含有するフラグメント２２　（４，６ｋｂ）を前記しｔ；如く単離する。

ｐＴｒｐ−ＰＳｔ　Ｉベクター（チャート９）を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、フラグメント２３（９００ｂｐ）を前記した如く単離する。フラグメント２３はｔｒｐプロモータ、コンセンサスリポソーム結合部位および修飾したブタ・ソマトトロピン遺伝子を含有する。フラグメント２２および２３を結んでｐＵＲＡ−ＰＳｔｌ（チャート１０）を得る。プラスミドｐＵＲＡ−ＰＳ　ｔ　１を次いでイー・コリのコンピテント細胞に入れて形質転換する。クローニングの確認はクローンの制限消化およびＤＮＡ配列決定法によって行う。

このベクターはブタ遺伝子の末端における転写ターミネータを必要としない。ｃＤＮＡに由来する遺伝子のコード領域下流のＤＮＡ配列はイー・コリにおける十分な転写停止活性を有する。

Ｄ）　イー・コリにおけるＰＳｔ発現の誘導プラスミドｐＵＲＡ−ＰＳ　ｔ　ｌをコンピテントＤ１１２細胞に入れて形質転換し、ｒＢＳｔについて前記した如く誘導する。

ｒＰＳｔの単離についての手法もｒＢＳｔについて記載したに同じである。発現レベルは全細胞蛋白の２５％に達した。

実施例ｇ　　ＴｒｐＬシャインダルガノ配列でのブタ・ソマトトロピン（ＰＳｔ）の発現Ａ）発現ベクターｐＴｒｐ−ｔ　ｒｐＬ−ＰＳｔｃおよびｐＴｒｐ−ｔ　ｒｐＬ −ＰＳｔ　ｌの組み立てさらにブタ遺伝子組立体ＰＳｔｃおよびＰｓｉの発現レベルを評価するために、これらの遺伝子をＴｒｐプロモータおよびｔｒｐＬシャイン−ダルガノ配列の制御下に置いた。

チャートｉｌを参照し、発現ベクターｐＴｒｐ＋（実施例１）をＴｒｐプロモータおよびＴｒｐＬシャイン−ダルガノ配列の源として用いた。ｐＴｒｐ＋をまずＫｐｎＩで消化し、タレノーフラグメントで処理して平滑末端を得る。次いで該ＤＮＡをＣ１ａＩで切断し、大きなベクターフラグメント（フラグメント２４）を前記した如く精製する。ＰＳｔ遺伝子のｃＤＮＡクローンのＰｓｔｌ消化物（実施例５）をクレノーフラグメントで処理して平滑末端を得、次いでＨｇ１ＡＩで切断する。次いでこの７ラグメント（７ラグメント２０）を精製する。２つのＤＮＡオリゴヌクレオチドから合成二本鎖ＤＮＡリンカ−フラグメントを組み立てる。２つの合成リンカ−フラグメントを作成する。第１のものはＰＳｔの第２７ラニンコドンについてＧＣＣないしＧＣＴ変化を有しくフラグメント２５）、第２のリンカ−は非修飾ＰＳｔ　　ｃＤＮＡ配列を有する（フラグメント２６）。フラグメント２０．２４および２５を結んでｐＴｒｐ−ｔ　ｒｐＬ−ＰＳｔ　１を得、フラグメント２０．２４および２６を結んでｐＴｒｐ−ｔ　ｒｐＬ−ＰＳｔｃを得る。

Ｂ）　　ｔｒｐＬ−ＰＳｔｃもしくはｔｒｐＬ−ＰＳｔｌ遺伝子いずれかを含有するｐＵＲＡベクターの組み立てｔｒｐ先導シャイン−ダルガノ配列（ｔｒｐＬ）と組み合わせてｐＵＲＡベクターのキメラランナウェイレプリコンおよびｔｒｐプロモータを用いるＰＳｔ発現ベクターの組み立てをここに詳しく述べる（チャート１２）。

ｐＵＲＡベクターをＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素で消化し、フラグメント２２　（４，６ｋｂ）を単離する。ｐＴｒｐ−ｔｒｐＬ−ＰＳｔｃおよびｐＴｒｐ−ｔ　ｒｐＬ−ＰＳｔ　ｌベクター（チャート１１）を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、各消化から約９００ｂｐの７ラグメントを単離する。ｐＴｒｐ−ｔｒｐＬ−ＰＳｔｃからおよびｐＴｒｐ−ｔ　ｒｐＬ−ＰＳｔ　Ｉからかく産生しＩ；フラグメントを各々フラグメント２７および２８と名付ける。フラグメント２２および２７を結んでｐＵＲＡ−ｔｒｐＬ−ＰＳ　ｔ　ｃを得る。フラグメント２２および２８を結んでｐＵＲＡ−ｔｒｐＬ−ＰＳｔｌを得る。クローニングの確認は制限分析およびＤＮＡ配列決定法によって行う。

Ｃ）　　ｐＵＲＡ−ｔｒｐＬ−ＰＳｔｃおよびｐＵＲＡ−ｔｒｐＬ−Ｐｓｉの誘導プラスミドｐＵＲＡ　−ｔ　ｒ　ｐＬ−ＰＳ　ｔ　ｃおよびｐＵＲＡ−ｔｒｐＬ −ＰＳｔｌを株Ｄ１１２のコンピテント細胞に入れて形質転換し、ｒＥＳ　ｔについて前記した如くに誘導する。誘導のサンプルを５ＤＳ−ＰＡＧＥ、　コーマシー・ブルー染色およびゲルスキャンニングによって分析する。ブタ・ソマトトロピンはｐＵＲＡ−ｔｒｐＬ−ＰＳｔｃ誘導で検出できなかった。　ｐＵＲＡ　 −ｔ　ｒ　ｐＬ−ＰＳｔｌの誘導は合計可視蛋白約５％の高レベルに発現されるブタ・ソマトトロピンを示した。

寅施例９　ヒト・インターリューキン−１β（ＩＬ−１β）ノ発現Ａ）　　ＩＬ −１β遺伝子を含有するプラスミドの組立ヒトＩＬ−１β配列のクローニングは、５′非翻訳領域の一部およびＩＬ−１βの全てのコード領域を含有し、停止コドンの後で終了するｃＤＮＡ配列から由来したものであった。このｃＤＮＡ配列はヒト５Ｋ−Ｈｅｐ−ＩＦＩ胞系から組み立てたものであり、ｐＴｒｐｌ（チャートｌ）にクローニングしてｐＴｒｐ−ＩＬＩ　−１を得た。もう１つの継代クローニングを行って成熟ＩＬ−１β配列を含有するｐＴｒｐ−ｃｏｎｓＤ−ＨＣ −４Ｌｌ−１を組み立てた。これらのプラスミドの組み立ては公表されている（ディ・ビイ・カーターら（Ｄ、Ｂ、　Ｃａｒｔｅｒ、　ｅｔ　ａｌ）、１９８８、プロテインズ：ストラクチャー・ファンクション・アンド・ジエネテイックス（Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ、　Ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）の出版物をここに参照のために挙げる）。プラスミドｐＴｒｐ −ｃｏｎＳＤ−ＨＣ−ＩＬＩ−１をチャート１４に示す。

プラスミドｐＴｒｐ−ｃｏｎｓＤ−ＨＣ−ＩＬＩ−１をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、得られた７９０塩基対の７ラグメントを単離し、次いで混合し、ｐＵＲＡの４．６キロベ一ス対ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨ１フラグメント（チャート６）で結んでｐＵＲＡ−ＩＬ−１−ＩＡを得る。統いてｐＵＲＡ−ＩＬ−１−ＩＡをＢａｍＨＩテＭ化１．、混合し、ｐＶＶ２０２ＴのＢａｍＨＩフラグメント１４（チャート７）で結んでｐＵＲＡ　−Ｉ　Ｌ　−１−Ｉ　Ｃを得る。

Ｂ）ＩＬ−１β発現の自然誘導細胞に入れて形質転換した。ＢＳＴ−ＩＣの種培養物（ｐＵＲＡ−Ｉ　Ｌ　Ｌ　 −Ｉ　Ｃ）をグルコース、酵母エキス、およびトリプトファンを補足した明確な無機塩培地を含有する振盪フラスコ中で増殖させ、終始２８℃でインキュベートした。グルコースおよびカザミノ酸を補足した明確な無機塩培地に培養物の一部を継代培養し、次いで培養物を終始２８°Ｃでインキュベートした。培養物サンプルを定期的にとり、５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析、統いてのゲルのデンシトメーター追跡に付して、得られたＩＬ−１βレベルを定量した。第５表のデータは、ＩＬ −１β産生がかかる条件下で自然に誘導され、かがる自然誘導の結果、培養０．Ｄ、ｌＡｓ５ｏにおいて２８°Ｃから３７℃にシフトする（熱的誘導）以外は、同一培地中で同様の培養によって達成されるものと非常に似たＩＬ−］βレベルとなった。

第１表　ウシ・ソマトトロピン−ｃＤＮＡ配列および対応するアミノ酸配列コ０　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　６０ＣＣＣＴｒＣＣＣＡ　ＣＣＣＡＴＣＴＣＣＴＴＧ　ＴＣＣｃｃＣＣＴＣｍ　ＧＣＯＡＡＣＧＣＴ　ＧＴＣＣＴＣＣＧに　ＣＣＴ　ＣＡＣＣＡ b ＾１ａ　　ｎｏ　　デ【０　Ａｌａ　　Ｍａｔ　　Ｓｉｒ　　Ｌａｕ　　Ｓｅｒ　　Ｃ１ｙ　　Ｌａｕ　　ｎｏ　　Ａｌａ　　Ａｍｎ　Ａｌ＝@Ｖａｌ　　Ｌａｕ　　Ａｒｇ　Ａｌａ　　（ｉｎ　）ＩＬｍＣＴ（：　ＣＡＴ　ＣＡＧ　　ＣＴＧ　ＧＣＴ　ＣＣＴ　ＣＡＣＡＣＣＴＴＣＭＡ　ＧＡＧ　　ｍ　ＧＡＧ　　ＣＣ；ＣＡＣＣＴＡＣＡＴ（F　　ＣＣＣＣＡＣ（：ＧＡＬｅｕ　ＩＩｓ　　Ｇｉｎ　ＴＪｕ　ＡＬａ　Ａｌａ　　Ａｓｐ　　Ｔｈｒ　　Ｐｈａ　　Ｌｙａ　　Ｃ１ｕ　　Ｆｈａ　　にＧｌｕ　Ａｒ■@Ｔｈｒ　丁ｙｒ　　！１＠　　Ｐｒｏ　　Ｃ１ｕ　Ｃ１ｙＣＡＧ　ＡＣＡ　丁＾ＣＴＣＣＡＴＣＣＡ（：　ＡＡＣＡＣＣＣＡＣｉ　　（Ｔｒ　ＣＣＣＴｒＣＴＧＣＴＴＣＴＣＴ　にＡＡ　　ＡＣＣＡ嘯メ@　ｃｃｃ　　ｃｃｃＣｌｎ　Ａｒｇ　丁ｙｒ　　Ｓ＠ｒ　　１１＠　　Ｇｉｎ　Ａｓｎ　丁ｈｒ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ　　Ａｌａ　　Ｆ）ｎ　　Ｃｙｓ　　Ｐｈｅ　@Ｓｓｒ　　Ｃ１ｕ　Ｔｈｒ　　１１＊　　Ｐｒｏ　　＾１−２１０　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２＆０ＣＣＣＡｃｅ　ＧＧＣＡＡＣＡＡＴ　ＣＡＣＣＣＣＣＡＧ　　ＣＡＣＡＡＡ　ＴＣＡ　（：ＡＣＴｒＧ　ＧＡＧ　ＣＴＧ　　ＣＴＴ　　ＣＧbＡＴＣＴＣＡ　　ＣＴＣ１’ｒｏ　Ｔｈｒ　Ｃ１ｙ　Ｌｙｅ　Ａｓｎ　Ｃ１ｕ　Ａｌａ　Ｇｉｎ　Ｃ１ｎ　ＬＦ　　Ｓｔｒ　Ａｓｐ　Ｌｓｕ　Ｇｌｕ　Ｌａｕ　Ｌｅ普@人ｒｇ　　ｌｉｅ　　Ｓｅｒ　ＬａｕＣＴＣＣＴＣＡＴＣＣＡＧ　ＴＣＣＴにＧ　　（Ｔｒ　ＣＣＯＣＣＣＣＴに　　ＣＡＣＴｒＣＣＴＣＡＧＣＡＣＡ　　にＴＣＴＴＣＡＣＣＡ`ＣＡＣＣＬｅｕ　ｔＪｕ　Ｉｌａ　Ｃ１ｎ　Ｓ＃ｒ　Ｔｒｐ　ｔａｕ　Ｃ１ｙ　Ｐｒｏ　Ｌｓｕ　Ｇｉｎ　Ｐｂｓ　Ｌａｕ　Ｓａｒ　Ａｒｇ　Ｖａｌ@ｔｈｅ　Ｔｈｒ＾ｓｎ　Ｓｅｒ第１表　（続き） τＴＧ　　ＧｒＧ　　ｍ　　ＧＣＣＡｃＣＴＣＣＣＡＣＣＧＴ　　（ＴＣＴＡＴ　　ＧＡＧ　　Ｍに　　ＣＴＣＡＡＣＣＡＣＣＴＣＧＡＧ　@ＧＡＡ　　ＣＣＣＡＴＣｌａｕ　Ｖａｌ　Ｆｈ＠Ｃ１ｙ　Ｔｈｒ　ｊａｒ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　ＶａＩＴｙｒ　Ｃ１ｕ　Ｌｙｓ　ｔａｕ　Ｌｙｓ＾ｍｐ　Ｌａｕ　Ｃ１普@Ｃ１ｕ　Ｃ１ｙ　１１ｓＣＴＧ　　（：ＣＣＣＴＧ　ＡＴＣＣＧＧ　　ＣＡＩＩ；　ＣＴＧ　　にＭ　　にＡ丁　ＧＣＣＡＣＣＣＣＣＣＧＧ　　ＣＣＴ　Ｃ，ＧＧ　@ＣＡに　　ＡＴＣＣＴＣＡＡＣＣＡＧＬ＃ｕ　　Ａｌａ　　Ｌａｕ　Ｈ＠ｔ　Ａｒｇ　Ｃ１ｕ　　Ｌ・ｕ　　Ｃ１ｕ　Ａｓｐ　Ｃ１ｙ　Ｔｈｒ　　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　　Ａｌａ　　b１ｙ　　Ｃ１ｎ　　Ｉｌａ　　しｕ　　Ｌｙｓ　　Ｇ１ｎ＾ＣＣτ＾τｃＡｃ　ＡＡＡ　ＴπＣＡＣＡＣＡ　ＡＡＣＡＴｃ　ＣＣＣＡＧＴ　ｃＡｃ　ＣＡＣｃｃａ　ｃｒａ　ｃ’ ｒｃ　Ｍｅ　ＡＡＣ■`Ｃ：　ＣＣＴ τｈｒ　Ｔｙｒ　＾廖Ｐ　　Ｌｙａ　　Ｆｔｎ　＾−Ｐ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｍｅｔ　Ａｒｇ　Ｓｉｒ　Ａｓｐ　　Ａｓｐ　　Ａｌａ　　Ｉａ普@Ｌａｕ　　Ｌｙ −＾寥ｎ　Ｔｙｒ　　Ｃ１ｙＣＴＣＣＴＣＴＣＣＴＧＣＴｒｃ　ＣＣＣＭＣＣＡＣＣＴＧ　ＣＡＴ　ｋｋＧ　ＡＣＣにＡＣＡＣＣＴＡＣＣＴＧ　ＡＧｃ（ＴＣＡＴＣＭＣＬａｕ　　ＬＪｕ　　Ｓｉｒ　　Ｃｙｓ　　Ｆｈａ　　Ａｒｇ　Ｌｙｍ　　ＡＩＩＰ　　Ｌａｕ　　Ｈｌｓ　　Ｌｙ膳　Ｔｈｒ　　Ｃ１ｕ　@τｈｒ’ ズ’ｙｒ　　Ｌａｕ　　Ａｒｇ　　Ｖａｌ　　Ｍａｃ　　ＬｙｓＴＧＣＣＧＣＣＧＣＴＴＣＧＧＧ　　ＧＡＧ　　にＧＣＣＡＯＣＴにＴ　　ＧＣＣＴＴＣＴＡＣＣｙｓ　　Ａｒｇ　Ａｒｇ　　Ｉ’）ｎ　　にｌｙ　　Ｃ１ｕ　Ａｌａ　　Ｓ＠ｒ　　ＣＦ　　Ａ１１ｌ　　Ｐｈｓ　　ｈｄ第２表　ｒＢ　Ｓ　Ｔの合成５′端部を完成させるのに用いる合成オリゴヌクレオチドオリゴヌクレオチド１．　　ｐＴｒｐ−ＢＳｅ１０２　　についての天然ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａオリゴヌクレオチド２．　　ｐＴｒｐ−ＢＳｔｍ４＊　　　　　　ＩＣＧＡ？ＡＡＴＧ　ＧＣＣＴＴＣＣＣＡ　ＧＣＴ　ＡＴＧ　ＴＣＣＴＴＧ　ＴＣＣＧＣＣＣＴＣＴＴＡＴ’ｒＡＣＣＧＧ　ＡＡＧ　ＧＣＴ　　ＣＧＡ　ＴＡＣＡにＧ　ＡＡＣＡＧＧ　ＣＣＧ　ＧＡＣＡＡＡ　ＣＧＧＴｒＧＣＣＡＡＣＧＣＴ　ＧＴＧ　ＣＴＣＣＧＧ　α：Ｔ　ＣＡＧ　ＣＡＣＣＴＧ　ＣＡＴ　ＣＡＧＴＴＧ　ＣＧＡ　ＣＡＣＧＡＧ　ＧＣＣＣＧＡ　ＧＴＣＧＴＧ　ＧＡＣＧＴＡ　Ｃ’ＴＣオリゴヌクレオチド３、ｐＴｒｐ−ＢＳｔ＋ｆ☆　　　　　　　　　☆　　　　　　ＩＣＣＡＴＡＡＴＧ　ＧＣＴ　　ｎＣＣＣＡ　ＧＣＴ　ＡＴＧ　ＴＣＣＴＴＧ　ＴＣＣＧＧＣＣＴＧ　ＴＴＡＴｒＡＣＣＧＡ　ＡＡＧ　ＧＧＴ　ＣＣＡ　ＴＡＣＡＧＧ　ＡＡＣＡＧＧ　ＣＣＧ　ＧｋＣＡＡＡ　ＣＧＧＴｒＧＣＣｆｉＪ、ＣＧＣＴ　ＧＴＧ　ＣＴＣＣＣＧＧＣＴ　　ＣＡＧ　ＣＡＣＣＴＧ　ＣＡＴ　ＣＡＧＴｒＧ　ＣＧＡ　ＣＡＣＣＡＧ　ＧＣＣＣＧＡ　にＴＣにＴＯＧＡＣＧＴＡ　にＴＣオリゴヌクレオチド４．　　ｐＫＢｓセ４ＴｒにＧＣＣＡＡＣＧＣＴ　Ｇ’ＴＧ　ＣＴＣＣＯＧ　ＧＣＴ　ＣＡＧ　ＣＡＣＣＴＧ　ＣＡＴ　ＣＡＧＴｒＧ　ＣＧＡ　ＣＡＣＧＡＧ　ＧＣＣＣＧＡ　ＣＴＣ、（１；Ｔ（ｕ　ＧＡＣＧＴＡ　（ｉｃ第２表　（続き）オリゴヌクレオチド、、　　ｐＬｌｓｔ１２オ！Ｊ　コヌクレオチ）’　６　、　　ｐＴｒｐ−ＢＳｔ［１７ｓｌｐｈ＋！オリゴヌクＬ／　、ｔ　チト６　、　　ｐＴｒｐ−ＢＳｔ［ｐｈａｌｐｈｅオリゴヌクレオチド７、　　ｐＴｒｐ−ＢＳｔｍ３第３表ランチウェイプラスミド複製およびｒＢＳｔ合成の自然誘導接種後時間　　　　ｒＢＳｔ力価　　　　比プラスミド含量（時間）　　　　（ｇ　　ｒＢＳｔ／す７トル）（１０１ｃ′細菌あたり）。

９−０　　　　　　０．００００　　　　　　１８２．７４１１６．０　　　　　　０．０１１３　　　　　　４８２，２６８１８．０　　　　　　０．０７７０　　　　　　８３４．６７３１９．０　　　　　　０．１３０３　　　　１．０６３，０５ｇ２２．０　　　　　　０．４６２７　　　　１．１４５．４５２２５．０　　　　　　０．７３９６　　　　１，０８８．０５３２７−０　　　　　　０．９５４３　　　　１，１５２．０５１２９．０　　　　　　１．０８７１　　　　１．２０５．５００３１．０　　　　　　１．０９７５　　　　１，１２２．２２４ａ　　閉環状モノマープラスミドのバンドのデンシトメトリー追跡からのピーク面積第４表ｒＢＳ　を合成の不存在におけるランチウェイプラスミド複製の自然誘導プラスミド　　　　　　　接種後時間　　　比プラスミド含量（時間’）　　　（ｔｏ”細菌あたり）。

ｐＵＲＡ−ｍ４　　　　　　１６．０　　　　　５９１．７６３ｐＵＲＡ−ｍ４　　　　　　２２．０　　　１．２４９．２２６ｐＵＲＡ−ｍ４　　　　　　３１．０　　　１，１４９，７７０ｐＵＲＡ４　　Δｂｇｈｔ７Ｎ　１８．０　　　　　５４０，４５０ｐＵＲＡ４　　Δｋ）ｇ）ｌｔｚＭ　２４．０　　　　　９７０．１９９ｐＵＲＡ４　　ΔｂｇｈｉｚＨ３０，０１，７５５，５２５ａ　閉環状モノマープラスミドのバンドのデンシトメトリー追跡からのピーク面積第５表ランチウェイベクターｐＵＲＡ−ＩＬＩ−ＩＣでのＩＬ−１β産生の自然誘導培養インキュベーション温度　接種後時間　産生されたＩＬ−１β（時間）　　　（合計蛋白％）２８℃　　　　　　　０．０　　　　　３．９２８．０　　　　１８．８２８℃→３７°Ｃ２８，０２０，６チヤート１．　　ｐＴｒｐｌの組み立て（ａ）　　ｐＳＫ４をＣ］ａＴおよびＢａｍＨＩで切断してフラグメントｌ　　（４，２ｋｂ）を単離する。

フラグメント１（ｂ）　　二本鎖ＤＮＡの合成配列、フラグメント２、をフラグメントｌに結んでｐＴｒｐｌ　（４，３ｋｂ）を得る。

フラグメント２ＴｒｐｌＡｍｐＲ−アンピシリン耐性Ｄ−Ｔｒｐプロモータ／オペレータＥ−シャイン−ダルガノ配列Ｃ−合成配列チヤード２−　ｐＴｒｐ−ＢＳｔｍｌの組み立て（ａ）　　ｐＬＧ２３をＰｖｕｎで切断して７ラグメント３（４９４ｋｂ）を単離する。

（ｂ）　　ｐＴｒｐｌをＫｐｎＩおよびクレノーで処理してフラグメント４　（４，３ｋｂ）を得る。

フラグメント４（Ｃ）　　フラグメント３を７ラグメント４に結んでｐＴｒｐ−ＢＳ　ｔｍｌを得る。

ｐＴｒｐ−ＢＳｔｍｌ　（４，８ｋｂ）ＡｍｐＲ−アンピシリン耐性Ｄ＝Ｔ　ｒ　ｐプロモータ／オペレータＥ−シャイン−ダルガノ配列Ｃ−合成配列Ｂ−ＢＳｔ配列チャート３．　　ｐＴｒｐ−ＢＳｔｍｌｂ（ａ）ｐＴｒｐ−ＢＳｔｍｌをＭｓｔｎおよびＢａｍＨＩで切断してフラグメント５　（４，８ｋｂ）を単離する。

（ｂ）　４つのオリゴヌクレオチドを組み立ててフラグメント６を得る。

（Ｃ）　　フラグメント６を７ラグメント５に結んでｐＴｒｐ−Ｂ　Ｓ　−ｔ　ｍ　ｌ　ｂを得る。

ｐＴｒｐ−ＢＳｔｍｌｂ　（４，８ｋｂ）ＡｍｐＲ−アンピシリン耐性Ｄ−Ｔｒｐプロモータ／オペレータＥ−シャイン−ダルガノＣ−合成配列Ｂ−ＢＳｔ配列チャート４．　　ｐＴｒｐ−ＢＳｔｍ４（ａ）ｐＴｒｐ−ＢＳｔｍｌｂをＭｓｔｎおよびＣ１ａＩで切断してフラグメント７　（４，３ｋｂ）を得る。

（ｂ）　　ｐＴｒｐ−ＢＳｔｍｌｂをｐｖｕｌｒおよびＭｓｔＩ［で切断して７ラグメント８　（４５０ｋｂ）を単離する。

フラグメント８（ｃ）　４つのオリゴヌクレオチドを組み立ててフラグメント９を得る。

オリゴヌクレオチド２（第２表）會　　　　　　ＩＣＧＡＴＡＡＴＧ　ＧＣＣＴＴＣＣＣＡ　ＧＣＴ　ＡＴに　ＴＣＣＴｒＧ　ＴＣＣＧＧＣＣＴＧ　ＴＴＡＴｒＡ（：　ＣＧＧ　ＡＡＧ　ＧＧＴ　ＣＧＡ　ＴＡＣＡにＧ　ＡＡＣＡＧＧ　ＣＣＧ　ＧＡＣＡＡＡ　ＣＯＯｒｒｃｃｃ　ＡＡＣＧＣＴ　ｃ’ｒｃ　ｃｒｃ　ｃｃｃ　ＣＣＴ　ＣＡＧ　ＣＡＣｅｒａ　ＣＡＴ　ＣＡＧτＴＧ　ＣＧＡ　ＣＡＣにＡＧ　ＧＣＣＣＧＡ　Ｃ：ＴＣＧＴＧ　にＡＣＧＴＡ　ＧτＣ（ｄ）　　フラグメント７．８、および９を結んでｐＴｒｐ−ＢＳｔｍ４　（４，８ｋｂ）を得る。

ｐＴｒｐ−ＢＳｔｍ４３′ ＡｍｐＲ−アンピシリン耐性Ｄ−Ｔｒｐプロモータ／オペレータＥ−シャイン−ダルガノ配列Ｃ−合成配列Ｂ−ＢＳｔ配列チャート５．　　ｐ５０−ＢＳｔｍ４の組み立て（ａ）　　プラスミドｐＢＥＵ５０をＴ；ｃｏＲｌおよびＢａｍＨＩで消化し、大きな１０ｋｂ７ラグメントｌＯをゲル単離する。

ＢＥＵ５０フラグメント１Ｏ（ｂ）　　プラスミドｐＴｒｐ−ＢＳｔｍ４　（チャート４）をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化してフラグメント１１（，８７２ｋｂ）を得、これをゲル単離する。

フラグメント１１（ｃ）　７ラグメントｌＯおよび１１をアニールし、Ｔ４！Ｊガーゼを用いて結んでｐ５０−ＢＳｔｍ４を得る。

Ａｍｐ＝アンピシリン耐性Ｄ−Ｔｒｐプロモータ／オペレータＥ−シャイン−ダルガノ配列Ｃ−合成配列Ｂ＝ＢＳ　を配列ＣｏｐＢ＝ＲｅｐＡを調節する遺伝子ＣｏｐＡ＝ＲｅｐＡを調節する遺伝子ＲｅｐＡ−ランナウェイ複製を開始する遺伝子Ｏｒ　１＝ｐＢＲ３２２からのレプリコンチャート６−　　ｐｔＪＲＡの組み立て（ａ）　　ベクターｐＢＥＬ７ −１７　（１３，８ｋｂ）をＡｈａＩ［およびＮｄｅＩで消化して７ラグメント１２　（２，４ｋｂ）を得る。

（ｂ）　　あらかじめＮａｒＩおよびＮｄｅｌで消化したｐＢＲ３２２（４，４ｋｂ）にフラグメント１２を挿入し、結んでｐＵＲＡ（５，０ｋｂ）を得る。

ＣｏｐＢ−ＲｅｐＡを調節する遺伝子ＣｏｐＡ＝ＲｅｐＡを調節する遺伝子ＲｅｐＡ−ランナウェイ複製を開始する遺伝子Ｏｒ　ｉ＊＝ｐＢＥＵ−１７からのランチウェイレプリコンＯｒ　１＝ｐＢＲ３２２からのレプリコンＡｍｐ−アンピシリン耐性チャート７−　ｐＵＲＡ−ｍ４の組み立て（ａ）　　ｐ５０−ＢＳｔｍ４　（チャート５）をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化してＴｒｐプロモータおよびｒＢＳｔ遺伝子を含有するフラグメント１３（８７５ｋｂ）を得る。

フラグメント１３（ｂ）　　ｐＶＶ２０２ＴをＢａｍＨＩで消化して転写ターミネータを含有するフラグメント１４　（３５（Ｈｃｂ）を得る。

フラグメント１４（ｃ）ＰＵＲＡ　（チャート６）をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化してフラグメント１５　（４，６ｋｂ）を得、フラグメント１３および１４で結んでｐＵＲＡ−ｍ４　（５，８ｋｂ）を得る。

ｐ　Ｕ　ＲＡ　−ｍ　４ＣｏｐＢ＝ＲｅｐＡを調節する遺伝子Ｃｏｐ、Ａ＝ＲｅｐＡを調節する遺伝子ＲｅｐＡ−ランナウェイ複製を開始する遺伝子Ｏｒｉ＊−ｐＢＥＵ−１７からのランチウェイレプリコンＯｒｉ暉ｐＢＲ３２２からのレプリコンＡｍｐ−アンピシリン耐性Ｔ−転写ターミネータ５−＋−ト３．　　　ｐＴｒｌ）　　ｃｏｎｓＤの組み立て（ａ）　　ｐＳＫ４を）（ｉｎｄｌｌｌ、ＢＡＰおよびＨｐａＩで消化してフラグメント１６　（４，６ｋｂ）を得る。

フラグメント１６（ｂ）二本鎖ＤＮＡフラグメント１７の合成配列をフラグメント１８に結んでｐＴｒｐ−ｃｏｎＳＤ　（４，６ｋｂ）を得る。

フラグメント１７ｐＴｒｐ−ｃｏｎｓＤ　（４，６ｋｂ）ＡｍｐＲ寓アンピシリン耐性り腫Ｔｒｐプロモータ／オペレータＥ−シャイン−ダルガノＣ−合成配列チャー）９．ｐＴｒｐ−ＰＳｔ　１（ａ）　　ｐＴｒｐ−ｃｏｎＳＤをＫｐｎ　ＩおよびＣ１ａＩで消化してフラグメント１８（４，６ｋｂ）を得る。

フラグメント１８（ｂ）　　ＰＳｔの全長ｃＤＮＡを含有するＰｓｔＩフラグメント（９００ｋ　ｂ）を単離する（フラグメント１９）、フラグメント１９をクレノーおよびＨｇ１Ａｌで処理してフラグメント２０（６６０ｋ　ｂ）を単離する。

フラグメント２０（Ｃ）　　二本鎖ＤＮＡフラグメント２１の合成配列をフラグメント１９および２０に結んでｐＴｒｐ−ＰＳｔ　ｌを得る。

７ラグメント２１ｐＴｒｐ−ＰＳｔｌＡｍｐＲ請アンピシリン耐性Ｄ−Ｔｒｐプロモータ／オペレータＥ−シャイン−ダルガノ配列Ｃ−合成配列Ｐ−ブタ・ソマトトロピンチャート１０．　　ｐｔＪＲＡ／Ｆ’Ｓｔｌの組み立て（ａ）プラスミドｐＵＲＡを］：ｃｏＲｌおよびＢａｍＨＩで消化して７ラグメント２２を単離する。

７ラグメント２２（ｂ）プラスミドｐＴｒｐ−ＰＳｔｌをＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで切断し、フラグメント２３　（９００ｐｂ）を単離する。

フラグメント２３および２３を結んでｐＬＪＲＡ／ＰＳｔｌを得る。

ｐＵＲＡ／ＰＳｔｌＡｍｐ−アンピシリン耐性Ｄ−Ｔ　ｒ　ｐプロモータ／オペレータＥ−シャイン−ダルガノ配列Ｃ−合成配列Ｐ−ブタ成長ホルモンＣｏｐＢ＝ＲｅｐＡを調節する遺伝子ＣｏｐＡ−Ｒｅ　ｐＡを調節する遺伝子Ｏｒ　ｉ＊−ｐＢＥＵ−１７からのランチウェイレプリコンＯｒ　１＝ｐＢＲ３２２からのレプリコンチャート１１．ｐＴｒｐ−ｔｒｐＬ−ＰＳｔｃおよびｐＴｒｐ−ｔｒｐＬ−ＰＳｔｌａ）　　ｐＴｒｐｌ（チャートｌ）をＫｐｎＩ、クレノーおよびＣ１ａＩで処理してフラグメント２４　（４，６ｋｂ）を得る。

フラグメント２４ｂ）　　ＰＳｔの全長ｃＤＮＡを含有するｐｓｔｒ７ラグメント（９００ｂ　ｐ）を単離する（フラグメント１９）。フラグメント１９をクレノーおよびＨｇ１ＡＩで処理して７ラグメント２０（６００ｂ　ｐ）を得る。

Ｃ）　二本鎖ＤＮＡフラグメント２５の合成配列を７ラグメント２４および２０に結んでｐＴｒｐ−ｔ　ｒｐＬ−ＰＳｔ　１を得、二本ｉ１［ＤＮＡフラグメント２６の合成フラグメントをフラグメント２４および２０に結んでｐＴｒ　ｐ　 −ｔ　ｒ　ｐＬ−ＰＳ　ｔ　ｃを得る。

フラグメント２５７ラグメント２６ｐＴｒｐ−ｔｒｐＬ−ＰＳｔｃおよびｐＴｒｐ−ｔｒｐＬ−５ｔｌＡ　ｍ　ｐ　Ｒ−アンピシリン耐性Ｄ−Ｔｒｐプロモータ／オペレータＥ＝ＴｒｐＬシャイン−ダルガノ配列Ｃ−合成配列Ｐ−ブタ・ソマトトロピンチャー）１２．　　　ｐＵＲＡ−ｔｒｐＬ−ＰＳｔｃおよびｐＵＲＡ−ｔ　ｒｐＬ−ＰＳｔ　ｌの組み立てａ）プラスミドｐＵＲＡをＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、７ラグメント２２（チャート１０）を単離する。

フラグメント２２ｂ）　　グラスミドｐＴｒｐ−ｔｒｐＬ−ＰＳｔｃおよびｐＴｒｐ−ｔｒｐＬ− ＰＳｔ　ＩをＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで切断し、フラグメント２７および２８　（９００ｂｐ）を単離する。フラグメント２２および２７を結んでｐＵＲＡ　−ｔ　ｒ　ｐＬ−ＰＳ　ｔ　ｃを得る。フラグメント２２および２８を結んでｐＵＲＡ−ｔｒｐＬ−ＰＳｔｌを得る。単一の塩基対だけ異なる両ベクターは以下の如くに表示できる。

ｐＵＲＡ−ｔ　ｒｐＬ−ＰＳ　ｔ　ｃまたはｐＵＲＡ−ｔｒｐＬ−Ａｍｐ−アンピシリン耐性Ｄ−Ｔｒｐプロモータ／オペレータＥ＝ＴｒｐＬシャイン−ダルガノ配列Ｃ−合成配列Ｐ−ブタ・ソマトトロピンＣｏｐＢ＝ＲｅｐＡを調節する遺伝子ＣｏｐＡ−ＲｅｐＡを調節する遺伝子ＲｅｐＡ−レズリコンランナウェイ複製を開始する遺伝子Ｏｒ　ｉ＊＝ｐＢＥＵ −１７からのランナウェイレプリコンＯｒ　１＝ｐＢＲ３２２からのレプリコンチャート１３．　ｐＵＲＡ−ｍ４遺伝子の欠失（ａ）　　プラスミドｐＵＲＡ− Ｍ４（チ＋−）７）をＥｃｏＲＩおよびＨ４ｎｄＩｌｒで消化して、突出する５ ′末端をクレノーフラグメントおよびｄＮＴＰで満たすことによって平滑末端としてフラグメント２９を得る。

フラグメント２９（ｂ）　　フラグメント２９を結んでｐＵＲＡ４　　Δｂ　ｇ　ｈ　ｌ／）１を得る。

ｐｔＪＲＡ４　　Δｂ　ｇ　ｈ　ｌ／ＭＣ−合成りＳｔ配列Ｔ−転写ターミネータＣｏｐＢ−ＲｅｐＡを調節する遺伝子ＣｏｐＡ−ＲｅｐＡを調節する遺伝子ＲｅｐＡ−ランナウェイを開始する遺伝子Ｏｒ　ｉ＊＝ｐＢＥＵ−１７からの複製開始点Ｏｒ　１＝ｐＢＲ３２２からの複製開始点Ａｍｐ−アンピシリン耐性チャート１４．　　　プラスミドｐｒｒ　ｐ−Ｃｏ　ｎ　５Ｄ−ＨＣ−Ｉ　Ｌ　１Ａ　ｍ　ｐ　Ｒ−アンピシリン耐性Ｄ＝Ｔｒｐプロモータ／オペレータＥ−シャイン−ダルガノ配列１−ＩＬ−１β遺伝子国際調査報告、＋１．．．．．．−、、、、、　　ＰＣ？／ｌＪｓ　８８１００３２Ｂ＋−− 電−−ｍｓｍ、−ｖ−−ｈａ、ｐ（Ｔ７ｇｇ５８Ｂ１００３２Ｂ国際調査報告ＬＩＳ　８８００３２８Ｓ＾　　　２０９７７

Claims

【特許請求の範囲】

１．プラスミドがウシ、ブタおよびヒツジ・ソマトトロピンならびにその同族体から選択されるソマトトロピンをコード付けするｃＤＮＡを含有し、ここに該ソマトトロピンをコード付けする最初の４つのコドンがａ）ＧＣＣ　ＴＴＣ　ＣＣＡ　ＧＣＴ；ｂ）ＧＣＴ　ＴＴＣ　ＣＣＡ　ＧＣＴ；ｃ）ＡＣＣ　ＴＴＣ　ＣＣＡ　ＧＣＣ；ｄ）ＧＣＣ　ＴＴＣ　ＣＣＡ　ＧＴＣ；ｅ）ＡＡＡ　ＴＴＣ　ＣＣＡ　ＧＣＣ；ｆ）ＴＴＣ　ＴＴＣ　ＣＣＡ　ＧＣＣ；およびｇ）ＴＴＣ　ＣＣＡ　ＧＣＣ　ＡＴＧよりなる群から選択されることを特徴とするエシェリヒア・コリ宿主細胞を形質転換し、該宿主細胞をしてソマトトロピン様蛋白を産生せしめることを可能とするのに有用な発現プラスミド。
２．該プラスミドがランナウェイ型レプリコンを合有する請求の範囲第１項記数の発現プラスミド。
３．該ランナウェイ型レプリコンがプラスミドｐＢＥＵ−５０に由来する請求の範囲第２項記載の発現プラスミド。
４．該ランナウェイ型レプリコンをｐＢＲ３２２からの複製開始点と組み合わせて位置させる請求の範囲第３項記載の発現プラスミド。
５．ｒｐｏＨ遺伝子の突然変異および請求の範囲第４項記載の発現ベクターよりなることを特徴とするエシェリヒア・コリ宿主細胞。
６．該ｒｐｏＨ遺伝子がｒｐｏＨ１１２対立遺伝子である請求の範囲第５項記数の宿主細胞。
７．ｈｆｌＢ遺伝子の突然変異および請求の範囲第４記載の発現ベクターよりなることを特徴とするエシェリヒア・コリ宿主細胞。
８．該ｈｆｌＢ遺伝子がｈｆｌＢ２９対立遺伝子である請求の範囲第７項記載の宿主細胞。
９．該発現ベクターがウシ・ソマトトロピンについてコード付けする請求の範囲第５項記載のエシェリヒア・コリ。
１０．該発現ベクターがウシ・ソマトトロピンについてコード付けする請求の範囲第７項記載のエシェリヒア・コリ。
１１．該発現ベクターがブタ・ソマトトロピンについてコード付けする請求の範囲第５項記載のエシェリヒア・コリ。
１２．該発現ベクターがプタ・ソマトトロピンについてコード付けする請求の範囲第７項記載のエシェリヒア・コり。
１３．ａ）ｐ５０−ＢＳｔｍ４；ｂ）ｐ５０−ＢＳｔｍ５；ｃ）ｐ５０−ＭＢＳｔ４；ｄ）ｐ５０−ＭＢＳｔ１２；ｃ）ｐ５０−ＢＳｔ［ｌｙ５］；ｆ）ｐ５０−ＢＳｔ［ｐｈｅ］；およびｇ）ｐ５０−ＢＳｔｍ３よりなる群から選択される請求の範囲第２項記載のプラスミド。
１４．ｐ５０−ＢＳｔｍ４またはｐ５０　ＢＳＴｍ５である請求の範囲第１３項記載のプラスミド。
１５．ａ）ｐＵＲＡ−ｍ４；ｂ）ｐＵＲＡ−ｍ５；ｃ）ｐＵＲＡ−ＭＢＳｔ４；ｄ）ｐＵＲＡ−ＭＢＳｔ１２；ｅ）ｐＵＲＡ−ＢＳｔ［１ｙｓ］；ｆ）ｐＵＲＡ−ＢＳｔ［ｐｈｅ］；ｇ）ｐＵＲＡ−ＢＳｔｍ３；およびｈ）ｐＵＲＡ−ＰＳｔ１よりなる群から選択される請求の範囲第２項記数のプラスミド。
１６．ａ）ｐＵＲＡ−ｍ４；ｂ）ｐＵＲＡ−ｍ５；およびｃ）ｐＵＲＡ−ＰＳｔｌよりなる群から選択される請求の範囲第１５項記載のプラスミド。
１７．ｒｐｏＨ遺伝子における突然変異よりなり、プラスミドｐＢＥＵ−５０に由来するランナウェイ型レプリコンおよびｐＢＲ３２２からのレプリコンを共に含有する発現ベクターで形質転換したことを特徴とするエシェリヒア・コリ宿主細胞。
１８．該突然変異遺伝子がｒｐｏＨ１１２対立遺伝子である請求の範囲第１７項記載の宿主細胞。
１９．ｈｆｌＢ遺伝子における突然変異よりなり、プラスミドｐＢＥＵ−５０に由来するランナウェイ型レプリコンおよびｐＢＲ３２２からのレプリコンを共に含有する発現ベクターで形質転換したことを特徴とするエシェリヒア・コリ宿主細胞。
２０．該突然変異遺伝子がｈｆｌＢ２９対立遺伝子である請求の範囲第１９項記載の宿主細胞。
２１．ｒｐｏＨまたはｈｆｌＢ遺伝子いずれかにおける突然変異を有し、異種遺伝子を発現できる発現ユニットならびにプラスミドｐＢＥＵ−５０由来のランナウェイ型レプリコンおよびｐＢＲ３２２由来のレプリコンをともに含有する発現ベクターで形質転換したエシェリヒア・コリ宿主細胞を培養することを特徴とする異種遺伝子を発現する方法。
２２．エシェリヒア・コリ宿主細胞を形質転換し、および該宿主細胞をして異種蛋白を産生せしめるのに有用なｐＢＲ３２２からの複製開始点と組み合わせてランナウェイ型レプリコンを含有し、ここに該異種蛋白をコード付けするｃＤＮＡを含有することを特徴とする発現プラスミド。
２３．該ランナウェイ型レプリコンがプラスミドｐＢＥＵ−５０に由来する請求の範囲第２２項記載の発現ベクター。
２４．ｒｐｏＨ遺伝子の突然変異および訴求の範囲第２３項記載の発現ベクターよりなることを特徴とするエシェリヒア・コリ宿主細胞。
２５．該ｒｐｏＨ遺伝子がｒｐｏＨ１１２対立遺伝子である請求の範囲第２４項記載の宿主細胞。
２６．ｈｆｌＢ遺伝子の突然変異および請求の範囲第２３項記載の発現ベクターよりなることを特徴とするエシェリヒア・コリ宿主細胞。
２７．該ｈｆｌＢ遺伝子がｈｆｌＢ２９対立遺伝子である請求の範囲第２６項記載の宿主細胞。
２８．ａ）ｐＭＢＳｔ４；ｂ）ｐＭＢＳｔ１２；ｃ）ｐＴｒｐ−ＢＳｔ［ｐｈｅ］；およびｄ）ｐＴｒｐ−ＢＳｔ［ｌｙ５］よりなる群から選択されるプラスミドによってコード付けされるアミの酸配列を有するウシ・ソマトトロピン様ポリペプチド。
２９．エシェリヒア・コリ宿主細胞ＢＳＴ−ＩＣ（ＮＲＲＬＢ−１８３０３）またはＤ１１２（ＮＲＲＬ　Ｂ−１８１６８）。
３０．ＢＳＴ−ＩＣ（ＮＲＲＬ　Ｂ−１８３０３）である請求の範囲第２９項記載のエシェリヒア・コリ宿主細胞。