JPS60260598A - ポリペプチドの製造方法 - Google Patents
ポリペプチドの製造方法Info
- Publication number
- JPS60260598A JPS60260598A JP60102801A JP10280185A JPS60260598A JP S60260598 A JPS60260598 A JP S60260598A JP 60102801 A JP60102801 A JP 60102801A JP 10280185 A JP10280185 A JP 10280185A JP S60260598 A JPS60260598 A JP S60260598A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dna
- sequence
- isolation
- streptomyces
- tendamistat
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
- C12N15/625—DNA sequences coding for fusion proteins containing a sequence coding for a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/36—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Actinomyces; from Streptomyces (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/76—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Actinomyces; for Streptomyces
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Detergent Compositions (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、信号（シグナル）ペプチダーゼを含有するス
トレプトミセス細胞中において信号ペプチドおよびポリ
にゾチドに分解され、後者は培地中に排出される原ペプ
チドの構成分である信号ペゾチドｒＣ関する。本発＃４
ＩＩ′ｉさらに、この信号ペプチドをコードするＤＮＡ
配列、構造遺伝子を具備する読み枠中にこのＤＮＡ配列
を含有する遺伝子構造、このタイプの遺伝子構造を含有
するプラスミド、ならびにこのタイプのプラスミドを含
有する宿主生物に関する。本発明の内容およびその好適
なる態様゛を下記に詳述する。
トレプトミセス細胞中において信号ペプチドおよびポリ
にゾチドに分解され、後者は培地中に排出される原ペプ
チドの構成分である信号ペゾチドｒＣ関する。本発＃４
ＩＩ′ｉさらに、この信号ペプチドをコードするＤＮＡ
配列、構造遺伝子を具備する読み枠中にこのＤＮＡ配列
を含有する遺伝子構造、このタイプの遺伝子構造を含有
するプラスミド、ならびにこのタイプのプラスミドを含
有する宿主生物に関する。本発明の内容およびその好適
なる態様゛を下記に詳述する。
ストレプトミセス磨テンダニ）ｉｌｌ （Ｓｔｒｅｐｔ
ｏｒｗａｅｇｔｅｎａａｅ）の発酵によるテンダミスタ
ット（ｔｅｎｃＬａ−ｍｉｓｔａｔ）の調製法は、すで
に西独特許出願Ｐ５ふ３１８６ａ３号において提起され
、その調製法は、テンダミスタットを産生じ、ｉ死産致
死ＪｔＣ８ｕｂ−１ｓｔｈａｌ ｄｏｓθ）のアクリフ
ラピンによ多処理されたストレプトミセス・テンダニ菌
株を用いることよシなるものである。テンダミスタット
の遺伝子を含有するＤＮＡ断片がこの処理を受けた菌株
から単離されるが、すなわちそれは２．３ｋｂ（キロベ
ース）のＰａｔ Ｉ Ｗｔ片（ｆｒａｇｍｅｎｔ）であ
る。このＤＮＡを大腸劇中において増幅′せしめ、この
ＤＮＡを純粋な形において再単離することは、予めＰｓ
ｔ Ｋよ多切断されたプラスミドｐＢＲ３２２にこのＤ
ＮＡ断片をとルこませることによル可能となった。
ｏｒｗａｅｇｔｅｎａａｅ）の発酵によるテンダミスタ
ット（ｔｅｎｃＬａ−ｍｉｓｔａｔ）の調製法は、すで
に西独特許出願Ｐ５ふ３１８６ａ３号において提起され
、その調製法は、テンダミスタットを産生じ、ｉ死産致
死ＪｔＣ８ｕｂ−１ｓｔｈａｌ ｄｏｓθ）のアクリフ
ラピンによ多処理されたストレプトミセス・テンダニ菌
株を用いることよシなるものである。テンダミスタット
の遺伝子を含有するＤＮＡ断片がこの処理を受けた菌株
から単離されるが、すなわちそれは２．３ｋｂ（キロベ
ース）のＰａｔ Ｉ Ｗｔ片（ｆｒａｇｍｅｎｔ）であ
る。このＤＮＡを大腸劇中において増幅′せしめ、この
ＤＮＡを純粋な形において再単離することは、予めＰｓ
ｔ Ｋよ多切断されたプラスミドｐＢＲ３２２にこのＤ
ＮＡ断片をとルこませることによル可能となった。
そして親任、次の式（１）
％式％（１）
（式中、Ｘはアミノ酸１０ないし２５個、好適には１７
ないし２０個（最適には２０個）よシなる疎水性領域を
表わす）で示される信号ペプチド（ｓｉｇｎａｌ ｐｅ
ｐｔｌｄｅ）（前はプチド）が、この２．５ｋｂ＠片上
のテンダミスタンド構造遺伝子のすぐ上流部位において
コードされることが見いだされたのである。
ないし２０個（最適には２０個）よシなる疎水性領域を
表わす）で示される信号ペプチド（ｓｉｇｎａｌ ｐｅ
ｐｔｌｄｅ）（前はプチド）が、この２．５ｋｂ＠片上
のテンダミスタンド構造遺伝子のすぐ上流部位において
コードされることが見いだされたのである。
さらにまた、この信号ペプチドの使用にょシ、適当な信
号イブチダーゼをｔＮする宿主細胞から他のペプチドが
培地中へ排出されることも見いだされたのである。かく
して本発明はまた次の式（〕 Ｓｉｇ−Ｒ（１） （式中Ｓｉｇは式（１）中のアミノ酸配列を表わし、Ｒ
は酸性アミノ酸、％にアスパラギン酸が好適にはアミノ
末端に位置するアミノ木端にょ多結合された遺伝的にコ
ード可能なペプチドの残基を表わす）で示される原はプ
チド（ｐｒｏｐｅｐｔｉｄｅ）に関するものである。
号イブチダーゼをｔＮする宿主細胞から他のペプチドが
培地中へ排出されることも見いだされたのである。かく
して本発明はまた次の式（〕 Ｓｉｇ−Ｒ（１） （式中Ｓｉｇは式（１）中のアミノ酸配列を表わし、Ｒ
は酸性アミノ酸、％にアスパラギン酸が好適にはアミノ
末端に位置するアミノ木端にょ多結合された遺伝的にコ
ード可能なペプチドの残基を表わす）で示される原はプ
チド（ｐｒｏｐｅｐｔｉｄｅ）に関するものである。
従って本発明の一つの局面では、Ｒが水素またはペプチ
ド残基例えばテンダミスタットを表わす式（Ｉ［）のペ
プチドに関するものでりる。本発明の他の一つの局面で
は、テンダミスタットを産生じ、好適には予め亜致死量
のアクリフ２ビンで処理されたストレプトミセス・テン
ダニ菌株からＤＮＡ全量単離、Ｐａｔ Ｉ Ｋよる分解
、ＤＮＡ配列配列表わち５’−（５２Ｐ−）ＣＯＴ Ｔ
ＯＡ ＯＴＧ ＴＯＧ ＴＯＴ ＴＯＧＴＡ−３’との
サチンハイプリダイ２セーシヨン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ
ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）、２．３ｋｂのＰａｔ
Ｉ断片の単離、ａａｍＨＩによる切断、配列Ａ（ｓｅｑ
ｕｅｎｃｅ Ａ）とのサザンハイプリダイゼーション、
（１９４ｋｂのＰｓｔ Ｉ Ｂａｎ Ｈｌ小断片の単離
、 ８ａｕ ３ａ Ｋよる切断、配夕ＩＩＡとのサザン
ハイブリダイゼーション、［１，５２５ｋｂのＢａｎ
Ｈ７ｓａｕ ３ａ小断片の単離およびＤＮＡの配列決定
によって得られ、下記の特性を有する対応するＤＮＡ配
列忙関する。すなわちａ）テンダミスタット構造遺伝子
のすぐ上流に位置し、 ｂ）それはアミノ末端において Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａ
ｒｇをコードし、 ｃ）ソれはカルボキシ末端において Ａｌａ−３ｅｒ−Ａｌａ をコードし、また ｄ）それは中央部においてアミノ酸１０ないし２５個、
好適には１７ないし２０個よシなる疎水性の領域をコー
ドするものである。
ド残基例えばテンダミスタットを表わす式（Ｉ［）のペ
プチドに関するものでりる。本発明の他の一つの局面で
は、テンダミスタットを産生じ、好適には予め亜致死量
のアクリフ２ビンで処理されたストレプトミセス・テン
ダニ菌株からＤＮＡ全量単離、Ｐａｔ Ｉ Ｋよる分解
、ＤＮＡ配列配列表わち５’−（５２Ｐ−）ＣＯＴ Ｔ
ＯＡ ＯＴＧ ＴＯＧ ＴＯＴ ＴＯＧＴＡ−３’との
サチンハイプリダイ２セーシヨン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ
ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）、２．３ｋｂのＰａｔ
Ｉ断片の単離、ａａｍＨＩによる切断、配列Ａ（ｓｅｑ
ｕｅｎｃｅ Ａ）とのサザンハイプリダイゼーション、
（１９４ｋｂのＰｓｔ Ｉ Ｂａｎ Ｈｌ小断片の単離
、 ８ａｕ ３ａ Ｋよる切断、配夕ＩＩＡとのサザン
ハイブリダイゼーション、［１，５２５ｋｂのＢａｎ
Ｈ７ｓａｕ ３ａ小断片の単離およびＤＮＡの配列決定
によって得られ、下記の特性を有する対応するＤＮＡ配
列忙関する。すなわちａ）テンダミスタット構造遺伝子
のすぐ上流に位置し、 ｂ）それはアミノ末端において Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａ
ｒｇをコードし、 ｃ）ソれはカルボキシ末端において Ａｌａ−３ｅｒ−Ａｌａ をコードし、また ｄ）それは中央部においてアミノ酸１０ないし２５個、
好適には１７ないし２０個よシなる疎水性の領域をコー
ドするものである。
このＤＮＡ配列は、以後の本明＃書中においてＢ配列ま
たは信号ペプチドとよばれる。
たは信号ペプチドとよばれる。
標準マーカーとの比較によ＃）算定されたｋｂ数値は通
常の精度を有する。
常の精度を有する。
Ａ配列の代わシに、テンダミスタット遺伝子またはそれ
に対応するＤＮＡ鎖に対して相補的な所要のいずれの配
列をも、サザンハイプリダイゼーションによ＃）選択す
ることが可能でるる。
に対応するＤＮＡ鎖に対して相補的な所要のいずれの配
列をも、サザンハイプリダイゼーションによ＃）選択す
ることが可能でるる。
ＤＮＡのＢ配列の％徴づけのために、いずれの場合の実
施法においても、ＤＮＡ＃ｉ適当なベクターに導入され
、後者は宿生細胞中において形質転換され、そζにおい
て増幅され、形質転換体はＡ配列とのコｏ＝−交雑によ
り判別され、そしてＤＮＡが再単離される。これらの操
作＆階は自体が既知である。
施法においても、ＤＮＡ＃ｉ適当なベクターに導入され
、後者は宿生細胞中において形質転換され、そζにおい
て増幅され、形質転換体はＡ配列とのコｏ＝−交雑によ
り判別され、そしてＤＮＡが再単離される。これらの操
作＆階は自体が既知である。
ＤＮＡの０配列祉、そのコードする鎖が附着体に表わさ
れておル、ストレプトミ・セス・テンダニよシのテンダ
ミスタット構造遺伝子を有する。
れておル、ストレプトミ・セス・テンダニよシのテンダ
ミスタット構造遺伝子を有する。
従って上記の遺伝子構造は、読み枠内Ｋ ＤＮＡのＢ配
列を、例えばテンダミスタット、好適にはＤＩＪＡの０
配列をコードする構造遺伝子とともに含有する。
列を、例えばテンダミスタット、好適にはＤＩＪＡの０
配列をコードする構造遺伝子とともに含有する。
本発明はまた、読み枠内にＤＮＡのＢ配列を、例えばテ
ンダミスタット、好適にはＤＮＡの０配列をコードする
構造遺伝子とともに包有するプラスミドに関する。これ
らのプラスミドは、大腸菌において有効なレプリコンを
含有することができ、従って大腸菌内においてＤＮＡを
増幅し、また多分発現することが可能である。
ンダミスタット、好適にはＤＮＡの０配列をコードする
構造遺伝子とともに包有するプラスミドに関する。これ
らのプラスミドは、大腸菌において有効なレプリコンを
含有することができ、従って大腸菌内においてＤＮＡを
増幅し、また多分発現することが可能である。
好適なプラスミド′は、これに加えて放線菌中において
有効なレプリコンを含有する。もしあるストレプトミセ
ス菌がこの型のプラスミドによシ形質転換きれれば、そ
の菌は構造遺伝子によシ決定されるペプチドを弐Ｈの原
イプチドの形において発現することが可能になシ、七の
原択プチドは産生の途中で信号イブチダーゼにより分解
され、所望のペプチドが培地中に排出される。
有効なレプリコンを含有する。もしあるストレプトミセ
ス菌がこの型のプラスミドによシ形質転換きれれば、そ
の菌は構造遺伝子によシ決定されるペプチドを弐Ｈの原
イプチドの形において発現することが可能になシ、七の
原択プチドは産生の途中で信号イブチダーゼにより分解
され、所望のペプチドが培地中に排出される。
大腸菌中において有効なレプリコンおよび放線菌中にお
いて有効なレプリコンと共に含有するいわゆるシャトル
・ベクターもまた有利である。これらのシャトル・ベク
ターは大腸菌中において増幅され再単離した後に放線菌
内で形質転換せしめることが可能で、その後には所望の
ポリペプチドの産生が起こる。
いて有効なレプリコンと共に含有するいわゆるシャトル
・ベクターもまた有利である。これらのシャトル・ベク
ターは大腸菌中において増幅され再単離した後に放線菌
内で形質転換せしめることが可能で、その後には所望の
ポリペプチドの産生が起こる。
本発明はまた、前記のベクターにより形質転換された宿
主生物、特にストレプトミセス属の宿主生物、殊にスト
レプトミセス・テンダニ種、さらに特別にはストレプト
ミセス・リビダンスの宿主生物に関する。
主生物、特にストレプトミセス属の宿主生物、殊にスト
レプトミセス・テンダニ種、さらに特別にはストレプト
ミセス・リビダンスの宿主生物に関する。
さらにまた、本発明は一般式（ＩＩＩ）Ｈ２Ｎ−Ｒ（［
１） （式中Ｒは式（Ｉｆ）に示された意味を有する）で示さ
れるポリペプチドを、式（ｒｌ）の原ペプチドを分解す
る信号にブチダーゼを宮有し所望のポリペプチドを培地
中に分泌する、上述の形質転換された宿主生物を用いて
調製する方法に関する。
１） （式中Ｒは式（Ｉｆ）に示された意味を有する）で示さ
れるポリペプチドを、式（ｒｌ）の原ペプチドを分解す
る信号にブチダーゼを宮有し所望のポリペプチドを培地
中に分泌する、上述の形質転換された宿主生物を用いて
調製する方法に関する。
ダラム隘性細菌についてはｑ！ｒａのベクターが利用可
能であるのに対し、グラＡｗ＃性細陳、特に放線菌類に
ついてはごく少数のベクターのみしかこれまで記述され
ていない。細菌の種ストレプトミセス・テンダニのため
のベクターは現在にいたるまで開示されたことがない。
能であるのに対し、グラＡｗ＃性細陳、特に放線菌類に
ついてはごく少数のベクターのみしかこれまで記述され
ていない。細菌の種ストレプトミセス・テンダニのため
のベクターは現在にいたるまで開示されたことがない。
従って、ストレプトミセス・テンダニを宿生生物として
利用する方策は、本発明によって可能となった。
利用する方策は、本発明によって可能となった。
本発明の特別な有利性は、形質転換されたストレプトミ
セス類の菌株、％にストレプトミセス・リビダンスの菌
株は最適に胞子形成する、すなわち組換えプラスミドの
含有はこれらの菌株のけん殖期に有害な影響を及はさな
い。従って形３＆１′転換された生物は、例えば胞子の
オリ用をも含む代謝突然変異体の生成および選抜のよう
な菌株の改良を重ねるのにも適する。
セス類の菌株、％にストレプトミセス・リビダンスの菌
株は最適に胞子形成する、すなわち組換えプラスミドの
含有はこれらの菌株のけん殖期に有害な影響を及はさな
い。従って形３＆１′転換された生物は、例えば胞子の
オリ用をも含む代謝突然変異体の生成および選抜のよう
な菌株の改良を重ねるのにも適する。
ストレプトミセス・テンダニの形質転換されない菌株に
比較して、形質転換された菌株を特にストレプトミセス
・リビダンスは、メラニンを形成しない。従ってそれを
除去する必要がないので、例えばテンダミスタットのよ
うな所望のにプチドの単離な著しく容易ならしめ、収量
のロスを防止する。
比較して、形質転換された菌株を特にストレプトミセス
・リビダンスは、メラニンを形成しない。従ってそれを
除去する必要がないので、例えばテンダミスタットのよ
うな所望のにプチドの単離な著しく容易ならしめ、収量
のロスを防止する。
本発明の一層の有利性は、ストレプトミセス・リビダン
スにおいて外米の遺伝子が発現され、それに対応するポ
リペプチドが排出され、それが菌株の改良および生産さ
れるポリペプチドの修飾のための多様なる可能性を提供
す、ることである。
スにおいて外米の遺伝子が発現され、それに対応するポ
リペプチドが排出され、それが菌株の改良および生産さ
れるポリペプチドの修飾のための多様なる可能性を提供
す、ることである。
また本発明によれば、ストレプトミセス属の１色の＄１
１．＠例え−ばストレプトミセス・ガーナエンシスまた
はオーレオファシェンスを形質転換することが可能であ
る。
１．＠例え−ばストレプトミセス・ガーナエンシスまた
はオーレオファシェンスを形質転換することが可能であ
る。
プラスきドを含有せず、また特定の信号ペプチダーゼを
合成し得る菌株が、本発明による雌株プラスミドによシ
形質転換された場合に仲、コードされたペプチドを発現
して分泌する安定な形質転換体が得られる。
合成し得る菌株が、本発明による雌株プラスミドによシ
形質転換された場合に仲、コードされたペプチドを発現
して分泌する安定な形質転換体が得られる。
本発明の特に好適なＨ様は下記の実施例中に詳述される
。これらの実施例において、パーセントデータは特に記
すもの以外はすべて重量ベースでるる。４４ｍプラスミ
ドを示す図中において、数字は実際のスケール通シの制
限切断位置を示す。
。これらの実施例において、パーセントデータは特に記
すもの以外はすべて重量ベースでるる。４４ｍプラスミ
ドを示す図中において、数字は実際のスケール通シの制
限切断位置を示す。
実施例中では１文献によシ既知の、下記の各種ベクター
すなわちメツシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ） ｉ等による「
ジーンＪ （Ｇｏｎｏ）第１９巻（１９８２年）第２６
９頁の一点頗７アージＭ ｉ３ ｍｐ ８およびＭ １
３ ｍｐ ９１ ビエラ（Ｖｉｅｒｒａ）氏等による「
ジーンＪ （Ｇｅｎｅ） 第１９巻（１９８２年）第２
５９頁のｐＵｏ １３、チャン（Ｏｈａｎｇ） Ｅｋ、
等による、「ジエイ。
すなわちメツシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ） ｉ等による「
ジーンＪ （Ｇｏｎｏ）第１９巻（１９８２年）第２６
９頁の一点頗７アージＭ ｉ３ ｍｐ ８およびＭ １
３ ｍｐ ９１ ビエラ（Ｖｉｅｒｒａ）氏等による「
ジーンＪ （Ｇｅｎｅ） 第１９巻（１９８２年）第２
５９頁のｐＵｏ １３、チャン（Ｏｈａｎｇ） Ｅｋ、
等による、「ジエイ。
バクテリオロジーｊ （Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇ７
）ｉ １３４巻（１９７８年）第１１４１頁のｐａ０１
７７および１８４、キーサー（Ｋｉθ８θｒ）氏寺によ
る「ツエイ。
）ｉ １３４巻（１９７８年）第１１４１頁のｐａ０１
７７および１８４、キーサー（Ｋｉθ８θｒ）氏寺によ
る「ツエイ。
モル、ジエン、ジネットＪ （Ｊ、Ｍｏ１．Ｇ＠ｎ、（
）ｅｎｅｔ、）第１８５巻（１９８２年）第２２３頁の
ｐ工Ｊ１０２および３５０を用いた。
）ｅｎｅｔ、）第１８５巻（１９８２年）第２２３頁の
ｐ工Ｊ１０２および３５０を用いた。
ストレプトミセス・テンダニ繭株の維持法は、米国特許
第４．２２６．７６４号に記載されている。原理的には
、テンダミスタット遺法子はテンダミスタットを産生ず
るいずれの菌株からでも単離され得る。しかし西独特許
出願Ｐ・３３３１８５０．３号の操作法が特に有利であ
シ、 ＤＮＡの単離法はその実施例３中に記載されてい
る。単離された完全ＤＮＡは、下記の実施例１の出発物
質でおる。
第４．２２６．７６４号に記載されている。原理的には
、テンダミスタット遺法子はテンダミスタットを産生ず
るいずれの菌株からでも単離され得る。しかし西独特許
出願Ｐ・３３３１８５０．３号の操作法が特に有利であ
シ、 ＤＮＡの単離法はその実施例３中に記載されてい
る。単離された完全ＤＮＡは、下記の実施例１の出発物
質でおる。
実施例 １
５μｇのＤＮＡは制限＃素Ｆａｔ ｌによ）完全に分解
すれ、０．８％アガロースゲル中で分画の後にニトロセ
ルロースフィルターに移された（サザン転移）。結合さ
れ変性されたＤＮＡをＳむフィルターは、予備交雑媒液
（０，６モルＮａ０６ｔ ［１，０６モルＮａ ＦｉＤ
ＴＡ ｓ Ｏ，１％ドデシル硫酸ナトリウム溶液、１０
０μｇ／ｍｔの超音波処理子牛胸腺ＤＮＡ 。
すれ、０．８％アガロースゲル中で分画の後にニトロセ
ルロースフィルターに移された（サザン転移）。結合さ
れ変性されたＤＮＡをＳむフィルターは、予備交雑媒液
（０，６モルＮａ０６ｔ ［１，０６モルＮａ ＦｉＤ
ＴＡ ｓ Ｏ，１％ドデシル硫酸ナトリウム溶液、１０
０μｇ／ｍｔの超音波処理子牛胸腺ＤＮＡ 。
および４倍濃縮のデンハルト氏溶液）５−において６時
間予備交雑された。それは次に予め５００、０００ ａ
ｐｍ／ｍＡの放射能標識付ＤＮＡを添加した予備交雑媒
液５−で再び処理された。この放射能標識付プローブは
’Ｆ記のようにして得られる。
間予備交雑された。それは次に予め５００、０００ ａ
ｐｍ／ｍＡの放射能標識付ＤＮＡを添加した予備交雑媒
液５−で再び処理された。この放射能標識付プローブは
’Ｆ記のようにして得られる。
ＤＮＡＱＡ配列は亜燐酸法によシ化学的に合成される。
それはヌクレオチド２０個（分子量約１３．０００）を
言弔゛シ、大腸−によシ琺好賂れる二連記号を用い℃テ
ンダミスタットの第６７番アミノ酸よシ始まるテンダミ
スタットのアミノ酸配列から誘導されたテンダミスタッ
トの推定ＤＮＡ配列に対して相補性である。このＤＮＡ
のＡ配列は、ｒ−’２ｐ−ｈｒｐおよびヌクレオチドキ
ナーゼを用いて５′末端に放射能標猷される。
言弔゛シ、大腸−によシ琺好賂れる二連記号を用い℃テ
ンダミスタットの第６７番アミノ酸よシ始まるテンダミ
スタットのアミノ酸配列から誘導されたテンダミスタッ
トの推定ＤＮＡ配列に対して相補性である。このＤＮＡ
のＡ配列は、ｒ−’２ｐ−ｈｒｐおよびヌクレオチドキ
ナーゼを用いて５′末端に放射能標猷される。
この放射性プローブを完全なりＮＡ中の相補性ＤＮＡ配
列と交雑させるために、混合液ｕ３７℃に２４８＃間靜
置される。つぎに結合されなかった放射性ＤＮＡは除去
され、フィルターは３７℃において毎回２００−の交雑
媒液中で５回洗抄され、ついでラジオオートグアフィー
に付される。２４時間露出の後に、交雑信号は遺伝子の
所在が２．３ｋｂのＰａｔ ｌ断片上にあることを示す
。
列と交雑させるために、混合液ｕ３７℃に２４８＃間靜
置される。つぎに結合されなかった放射性ＤＮＡは除去
され、フィルターは３７℃において毎回２００−の交雑
媒液中で５回洗抄され、ついでラジオオートグアフィー
に付される。２４時間露出の後に、交雑信号は遺伝子の
所在が２．３ｋｂのＰａｔ ｌ断片上にあることを示す
。
この断片は、Ｐｓｔで分解された全ＤＮＡが分画された
調製用アガロースゲルから切シ取られたこの断片のサイ
ズに対応する切片の電気俗離により得られる。俗離され
たＤＮＡは、プラスミドｐＵｏ ８のＰｅｔ Ｉ制限切
断部位においてクローニングされる。
調製用アガロースゲルから切シ取られたこの断片のサイ
ズに対応する切片の電気俗離により得られる。俗離され
たＤＮＡは、プラスミドｐＵｏ ８のＰｅｔ Ｉ制限切
断部位においてクローニングされる。
これらの雑種プラスミドは大腸菌７）ＪＭ１０３株に尋
人され増幅される。所望のテンダミスタット遺伝子な言
む挿入部を有するクローンは、放射性ＤＮＡプローブＡ
を用いるコロニー変雑法によシ検出される。こうして得
られる雑種プ２スミドｐＫＡ工１ａおよび１に＋ｉｌｊ
第１ａおよび１ｂ図に示される。
人され増幅される。所望のテンダミスタット遺伝子な言
む挿入部を有するクローンは、放射性ＤＮＡプローブＡ
を用いるコロニー変雑法によシ検出される。こうして得
られる雑種プ２スミドｐＫＡ工１ａおよび１に＋ｉｌｊ
第１ａおよび１ｂ図に示される。
遺伝子の所在は、単離された２、３ｋｂのＰｓｔ Ｉ断
片およびその小断片に対してサザンハイブリダイゼ−７
ヨンを重ねて行うことによシ正確に決定される（第２ａ
〜２０図）。
片およびその小断片に対してサザンハイブリダイゼ−７
ヨンを重ねて行うことによシ正確に決定される（第２ａ
〜２０図）。
実施例 ２
ストレプトミセスｅテンダニよシの２．３ｋｂのＰａｔ
Ｉ ＩＩ！ｌｒ片は、プラスミドル工Ｊ１０２中の％
有のＰｓｔ Ｉ制限切断部位にクローニングされる。こ
うして得られた雑種プラスミドｐＡＸ １ａおよび１ｂ
は、挿入部分の方向性が異なっているが、ストレプトミ
セス・リビダンスの菌株に導入された後には、その菌株
にテンダミスタットを産生ずる能力を付与する。第３図
は、プラスミドｐＡＸ１ａを示す。
Ｉ ＩＩ！ｌｒ片は、プラスミドル工Ｊ１０２中の％
有のＰｓｔ Ｉ制限切断部位にクローニングされる。こ
うして得られた雑種プラスミドｐＡＸ １ａおよび１ｂ
は、挿入部分の方向性が異なっているが、ストレプトミ
セス・リビダンスの菌株に導入された後には、その菌株
にテンダミスタットを産生ずる能力を付与する。第３図
は、プラスミドｐＡＸ１ａを示す。
実施例 ３
ストレプトミセス・リビダンスの市販の菌株ＴＫ ２４
（英国ノーリッジ市所在、ジョン・インネス研究所）
は、既知方法によシブ目ドプラストに変えられ、プロド
ブ２スト’ １０８ 個カ２０％のポリエチレングリコ
ール６０００の存在下で雑種プラスミドｐＡＸ １ａの
１μｇに加えられる。形質転換されたプロトプラストは
再生用培地（’ｒｈｏｍｐｓｏｎ氏等Ｎａｔｕｒｅ第２
８６巻、１９８０年、渠５２５頁）上で３０℃、５日間
加温される。
（英国ノーリッジ市所在、ジョン・インネス研究所）
は、既知方法によシブ目ドプラストに変えられ、プロド
ブ２スト’ １０８ 個カ２０％のポリエチレングリコ
ール６０００の存在下で雑種プラスミドｐＡＸ １ａの
１μｇに加えられる。形質転換されたプロトプラストは
再生用培地（’ｒｈｏｍｐｓｏｎ氏等Ｎａｔｕｒｅ第２
８６巻、１９８０年、渠５２５頁）上で３０℃、５日間
加温される。
細胞外アミラーゼ不活性化物質の生成は平板培地テスト
によシ証明される。
によシ証明される。
α４〜１．Ｏｑ／−の／ぞンクレアチンを含有する水溶
液が再生したコロニーの上へ注加され。
液が再生したコロニーの上へ注加され。
混合物は３７℃に１時間保温される。溶液は除去され、
２％のデンプン寒天５１１１ｔと交換される。
２％のデンプン寒天５１１１ｔと交換される。
平板培地を３７℃に２時間保温した後に、ヨード／ヨウ
化カリウム溶液５−を注加して発色せしめる。青色の光
背を有するコロニーは、そのクローンがテンダミスタッ
トを合成し排出することを示す。
化カリウム溶液５−を注加して発色せしめる。青色の光
背を有するコロニーは、そのクローンがテンダミスタッ
トを合成し排出することを示す。
照合のために、テンダミスタットを産生し、かつよく胞
子形成する菌株のプラスミドＤＮＡが単離され遺伝子地
図化される。テンダミスタットを産生ずるすべての菌株
はｐＡＸ ｌプラスミドＤＩＪＡを保有する。
子形成する菌株のプラスミドＤＮＡが単離され遺伝子地
図化される。テンダミスタットを産生ずるすべての菌株
はｐＡＸ ｌプラスミドＤＩＪＡを保有する。
実施例 ４
操作は実施例２に従って行われたが、ストレプトミセス
類における選択可能なマーカーとしてチオストレプトン
耐性遺伝子を保有するプ２スミドｐ工Ｊ３５０が用いら
れる。こうして雑種プ２スミ）’ ｐＡＸ 、３５０
ａおよびｂ（両者は挿入部分の方向性が異なる）が得ら
れる。ｍ４図は、プラスミドｐＡＸ ３５０ ａを示す
。
類における選択可能なマーカーとしてチオストレプトン
耐性遺伝子を保有するプ２スミドｐ工Ｊ３５０が用いら
れる。こうして雑種プ２スミ）’ ｐＡＸ 、３５０
ａおよびｂ（両者は挿入部分の方向性が異なる）が得ら
れる。ｍ４図は、プラスミドｐＡＸ ３５０ ａを示す
。
実施例３に従って形質転換せしめた後に、耐性のクロー
ンは５０μｇ／ｍＬのチオストレプトンの存在下におい
て最少培地（ホップウッド（Ｈｏｐｗｏｏｄ）氏、「バ
クテリオロジカル・レビューズＪ （Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ）第３１巻１１９６７
年、第３７３〜４０３頁）上で選択され、テンダミスタ
ットの産主について最少培地上で直接Ｋまたは非選択性
のＲ２Ｙ］！！寒天上においてテストされる。
ンは５０μｇ／ｍＬのチオストレプトンの存在下におい
て最少培地（ホップウッド（Ｈｏｐｗｏｏｄ）氏、「バ
クテリオロジカル・レビューズＪ （Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ）第３１巻１１９６７
年、第３７３〜４０３頁）上で選択され、テンダミスタ
ットの産主について最少培地上で直接Ｋまたは非選択性
のＲ２Ｙ］！！寒天上においてテストされる。
実施例 ５
２．３ｋｂのＰｓｔ Ｉ ＠片を含有し、さらにストレ
プトミセスのレプリコンに加えて大１ｍ ｉｌｌのレプ
リコンを含有する雑種プラスミドは、シャトルベクター
として故多くの有利点を有する。すなわち大腸菌のレプ
リコンおよび大腸菌において有効な耐性マーカーがある
ために、それらはこの生物中においてよぐ増＠される。
プトミセスのレプリコンに加えて大１ｍ ｉｌｌのレプ
リコンを含有する雑種プラスミドは、シャトルベクター
として故多くの有利点を有する。すなわち大腸菌のレプ
リコンおよび大腸菌において有効な耐性マーカーがある
ために、それらはこの生物中においてよぐ増＠される。
単離およびストレプトミセス類％にストレプトミセス・
リビダンスの導入の後にはそれらは高度の安定性を有す
る。ストレプトミセス類において有効な選択マーカーお
よびストレプトミセスレプリコンの存在によシ、それら
はこの生物中でよく増幅され、テンダミスタットを発現
しまた分泌する。
リビダンスの導入の後にはそれらは高度の安定性を有す
る。ストレプトミセス類において有効な選択マーカーお
よびストレプトミセスレプリコンの存在によシ、それら
はこの生物中でよく増幅され、テンダミスタットを発現
しまた分泌する。
シラスミドｐＡ０１８４は、制ｗｉ酵Ｊ８ａｌｌにょシ
完全に分解され、酵素はフェノール／クロロホルム液を
用いる抽出により除去される。突出している５′末端は
％ＡＴＰ％ＯＴＰ％ＧＴＰおよびＴＴＰの存在下で酵素
ＤＮＡポリメラーゼ（クレノー断片（Ｋ’ｌｅｎｏｗ
ｆｒａｇｍｅｎｔ））を用いて充填される。
完全に分解され、酵素はフェノール／クロロホルム液を
用いる抽出により除去される。突出している５′末端は
％ＡＴＰ％ＯＴＰ％ＧＴＰおよびＴＴＰの存在下で酵素
ＤＮＡポリメラーゼ（クレノー断片（Ｋ’ｌｅｎｏｗ
ｆｒａｇｍｅｎｔ））を用いて充填される。
５’ＴＯＧ ＡＧＯＴＧＯＡＧＯＴＯＧ Ａ ３″３’
ＡＯＧ ＴＣ！Ｇ ＡＣＧ ＴＯＧ ＡＧＯＴ ５’な
る構造のＰｓｔ Ｉ ｍ絖体は、２２℃におけるリガー
ゼ反応（ＤＮＡ ａ４μｇに対して接続体２μｇ）Ｋよ
シ空白の末端に接続される。ＤＮＡはフェノール／クロ
ロホルム液で抽出され、沈殿の後。
ＡＯＧ ＴＣ！Ｇ ＡＣＧ ＴＯＧ ＡＧＯＴ ５’な
る構造のＰｓｔ Ｉ ｍ絖体は、２２℃におけるリガー
ゼ反応（ＤＮＡ ａ４μｇに対して接続体２μｇ）Ｋよ
シ空白の末端に接続される。ＤＮＡはフェノール／クロ
ロホルム液で抽出され、沈殿の後。
接続され得るＰａｔ末端を得るために酵素Ｐｓｔ ｌに
よシ分解される。ベクターのＰａｔ末端は次に脱燐酸さ
れ、再びフェノール７クロロホルムで抽出され、予めＰ
ａｔ ｌで部分的に分解されたプラスミドｐＡＸ ｌと
接続された。接続反応混合液は大腸Ｍ （ＨＪ３１ａ１
株また＃”１１Ｍ０１０６１株）中へ転換導入される。
よシ分解される。ベクターのＰａｔ末端は次に脱燐酸さ
れ、再びフェノール７クロロホルムで抽出され、予めＰ
ａｔ ｌで部分的に分解されたプラスミドｐＡＸ ｌと
接続された。接続反応混合液は大腸Ｍ （ＨＪ３１ａ１
株また＃”１１Ｍ０１０６１株）中へ転換導入される。
クロラムフェニコール耐ａＯクローンが平板培地から洗
い取って集められ、シラスミドＤＮＡが単離される。ス
トレプトミセス・リビダンスのＴＫ ２４株は１〜２μ
ｇのシラスミドＤＮＡで形質転換され、テンダミスタッ
トの産主についてテストされる。
い取って集められ、シラスミドＤＮＡが単離される。ス
トレプトミセス・リビダンスのＴＫ ２４株は１〜２μ
ｇのシラスミドＤＮＡで形質転換され、テンダミスタッ
トの産主についてテストされる。
テンダミスタットテストにおいて反応陽性を示すクロー
ンが単離され、プラスミドＤＮＡは迅速アルカリ分解法
により単離きれ、逆形質転換によシ大腸陳のＨＢｌｏｌ
またはＭＣ１０６１株に導入される。増幅の後に再＃Ｌ
離されたプラスミドは、ストレプトミセス・リビダンス
の菌株から単離されたプラスミドと異ならない。組侠え
プラスミドは、テンダミスタットｉｌ伝子な保育ｊる挿
入部分の方向性によりｐｓＡ ２ａまたはｂ（第５ａお
よび５ｂ図）と指足される。
ンが単離され、プラスミドＤＮＡは迅速アルカリ分解法
により単離きれ、逆形質転換によシ大腸陳のＨＢｌｏｌ
またはＭＣ１０６１株に導入される。増幅の後に再＃Ｌ
離されたプラスミドは、ストレプトミセス・リビダンス
の菌株から単離されたプラスミドと異ならない。組侠え
プラスミドは、テンダミスタットｉｌ伝子な保育ｊる挿
入部分の方向性によりｐｓＡ ２ａまたはｂ（第５ａお
よび５ｂ図）と指足される。
実施例 ６
操作は実施例５に従って行われるが、プラスミドｐＡＸ
３５０ ａから出発し、大腸菌中においてクロラムフ
ェニコール耐性について選別し、ストレプトミセス・リ
ビダンス中においてチオストレプト耐性およびテンダミ
スタット産生について選別し、プラスミドｐ８Ａ ３５
’１ ａおよびｂ（第６＆および６ｂ図）が得られる。
３５０ ａから出発し、大腸菌中においてクロラムフ
ェニコール耐性について選別し、ストレプトミセス・リ
ビダンス中においてチオストレプト耐性およびテンダミ
スタット産生について選別し、プラスミドｐ８Ａ ３５
’１ ａおよびｂ（第６＆および６ｂ図）が得られる。
実施例 ７
操作は実施例５に従って行われるが、プラスミドｐＡ０
１８４に代えてｐＡｏ １７７から出発し、プラスミド
ｐ８Ａ ５１Ｌおよびｂ（第７ａおよび７ｂ図）が得ら
れる。
１８４に代えてｐＡｏ １７７から出発し、プラスミド
ｐ８Ａ ５１Ｌおよびｂ（第７ａおよび７ｂ図）が得ら
れる。
この目的のために、プラスミドｐＡＸ １ ａはＰｓ＋
ｔ ］で部分的に切断され、酵′累は６８℃に１５分間
加熱することによシ熱不活性化される。ＤＩＪＡは、予
めＰａｔ Ｉで切断され、脱燐・酸および脱蛋白された
シラスミドｐＡ０１７７に接続される。大腸５Ｉ！１Ｈ
Ｂ１０１またはＭＯ１０６１株の形質転換後にカナマイ
シン耐性クローンが平板培地から洗い取って集められ、
プラスミドＤＮＡが単離され、ストレプトミセス・リビ
ダンスのＴＫ ２４株がこのＤＮＡによシ形質転換され
る。テンダミスタットを産生ずるクローンが選別され、
シラスミドの特徴が決定される。
ｔ ］で部分的に切断され、酵′累は６８℃に１５分間
加熱することによシ熱不活性化される。ＤＩＪＡは、予
めＰａｔ Ｉで切断され、脱燐・酸および脱蛋白された
シラスミドｐＡ０１７７に接続される。大腸５Ｉ！１Ｈ
Ｂ１０１またはＭＯ１０６１株の形質転換後にカナマイ
シン耐性クローンが平板培地から洗い取って集められ、
プラスミドＤＮＡが単離され、ストレプトミセス・リビ
ダンスのＴＫ ２４株がこのＤＮＡによシ形質転換され
る。テンダミスタットを産生ずるクローンが選別され、
シラスミドの特徴が決定される。
実施例 ８
操作は実施例７に従って行われるが、プラスミドｐＡＸ
ｊに代えてプラスミドＩ）ＡＸ ３５０が用いられ、
ストレプトミセス・リビダンスにおいてチオストレプト
ン耐性について選別が行われ、プラスミドｐｓＡ ３５
２ ａおよびｂ（ｉ８ａおよび８ｂ図）が得られる。
ｊに代えてプラスミドＩ）ＡＸ ３５０が用いられ、
ストレプトミセス・リビダンスにおいてチオストレプト
ン耐性について選別が行われ、プラスミドｐｓＡ ３５
２ ａおよびｂ（ｉ８ａおよび８ｂ図）が得られる。
実施例 ９
第２図によシ明かな通シ、テンダミスタットおよび信号
配列をコードする遺伝子は〜Ｑ、３ｋｂの長さがある。
配列をコードする遺伝子は〜Ｑ、３ｋｂの長さがある。
上に詳述した実施例中に用いられる２、３ｋｌ：＋の断
片は従ってテンダミスタットの産生を引ぎ起こす雑種プ
ラスミドの＃を成のために短縮した形で用いることがで
きる。
片は従ってテンダミスタットの産生を引ぎ起こす雑種プ
ラスミドの＃を成のために短縮した形で用いることがで
きる。
すなわちプラスミドｐＫＡＸ １はＢａ１１により分解
され１再接続される。この方法によル約７５０塩基対分
短縮されたプ２スミドｐＫＡ工２が得られる。それ□ｒ
ｒｓ＊離され、りｐ−ニングされ、Ｐ＠ｔＩによシ切断
される。そのＤＮＡは子牛の腸よシのアルカリ性ホスフ
ァターゼによシ脱燐酸され、フェノール／クロロホルム
によシ脱蛋白される。
され１再接続される。この方法によル約７５０塩基対分
短縮されたプ２スミドｐＫＡ工２が得られる。それ□ｒ
ｒｓ＊離され、りｐ−ニングされ、Ｐ＠ｔＩによシ切断
される。そのＤＮＡは子牛の腸よシのアルカリ性ホスフ
ァターゼによシ脱燐酸され、フェノール／クロロホルム
によシ脱蛋白される。
プラスミドル工Ｊ１０２はＰｒｔ ｌにより完全に切断
され、酵素が熱不活性化された後、断片はｐＫＡＫ２Ｏ
２ｓｔ Ｉによる制限切断部位に接続される。接続反応
混合液は、大腸菌のｉｒｇｌｏｌｔたはＭＯ１０６１株
中へ転換導入される。゛プラスミドＤＮＡ ｄ（７ンピ
シリン酎性のクローンかう迅速アルカリ分解法により単
離され、ストレプトミセス・リヒ゛ダンスＴＫ ２４
ＡＤＳ コｏ ＤＮＡ １〜２μｇを用いて形質転換さ
れる。テンダミスタットを産生ずるクローンが選別され
、それらからプラスミドＤＮＡが迅速アルカリ分解法に
よシ単離される。大ｔＩＩ菌ＨＢ１０１またはＭ０１０
６１株中へ再転換尋人の後、および形質転換された大腸
菌株Ｊ、シブラスミドＤＮＡの単離の後に、プラスミド
ｐ８Ａ１が得られ、その脣徴か制限切断分析によシ決定
される（第９図）６プ２スミドは、ストレプトミセス・
リビダンスの株よシ単離されたプラスミドとの間に差は
ないが、大腸菌よシのＤＮＡ後処理はよシ生産的でろシ
、短時間円に可能である。
され、酵素が熱不活性化された後、断片はｐＫＡＫ２Ｏ
２ｓｔ Ｉによる制限切断部位に接続される。接続反応
混合液は、大腸菌のｉｒｇｌｏｌｔたはＭＯ１０６１株
中へ転換導入される。゛プラスミドＤＮＡ ｄ（７ンピ
シリン酎性のクローンかう迅速アルカリ分解法により単
離され、ストレプトミセス・リヒ゛ダンスＴＫ ２４
ＡＤＳ コｏ ＤＮＡ １〜２μｇを用いて形質転換さ
れる。テンダミスタットを産生ずるクローンが選別され
、それらからプラスミドＤＮＡが迅速アルカリ分解法に
よシ単離される。大ｔＩＩ菌ＨＢ１０１またはＭ０１０
６１株中へ再転換尋人の後、および形質転換された大腸
菌株Ｊ、シブラスミドＤＮＡの単離の後に、プラスミド
ｐ８Ａ１が得られ、その脣徴か制限切断分析によシ決定
される（第９図）６プ２スミドは、ストレプトミセス・
リビダンスの株よシ単離されたプラスミドとの間に差は
ないが、大腸菌よシのＤＮＡ後処理はよシ生産的でろシ
、短時間円に可能である。
実施例 １０
操作は実施例９に従って行われたが、プラスミドル工Ｊ
１０２に代えてｐ工Ｊ５５Ｑが用いられ、従ってストレ
プトミセス・リビダンスにおいてチオストレプトン耐性
を選別することが付加的に可能になシ、プラスミドｐｓ
Ａ ３５０ ａ訃よびｂが得られる。Ｎ１０図はプラス
ミドｐｓＡ ３５０ ａを示す。振盪培養において、こ
のプラスミドは、テンダミスタット遺伝子が逆方向に８
Ｍされる挿入部分を有するプラスミドｐｓＡ ３５０
ｂよシもテンダミスタットの商い収瀘をもたらす。これ
と反対に１挿入部分のサイズを１．５ ｋｂにまで縮小
しても、産物の形成Ｋｇめ得べき影響はない。
１０２に代えてｐ工Ｊ５５Ｑが用いられ、従ってストレ
プトミセス・リビダンスにおいてチオストレプトン耐性
を選別することが付加的に可能になシ、プラスミドｐｓ
Ａ ３５０ ａ訃よびｂが得られる。Ｎ１０図はプラス
ミドｐｓＡ ３５０ ａを示す。振盪培養において、こ
のプラスミドは、テンダミスタット遺伝子が逆方向に８
Ｍされる挿入部分を有するプラスミドｐｓＡ ３５０
ｂよシもテンダミスタットの商い収瀘をもたらす。これ
と反対に１挿入部分のサイズを１．５ ｋｂにまで縮小
しても、産物の形成Ｋｇめ得べき影響はない。
実施例 １１
テンダミスタット＆伝子の構造およびヌクレオチド配列
を決定するために、０．９４ ｋｂｏＰｓｔ１／Ｂａｎ
Ｈ１小断片（第２ａおよｃ／２ｂ図）ならびに２９５
塩基対の８ａｕ ３ａ／ＢａｒｎＨ７小断片（ａ！２０
図）が−重鎮の７７一ジＭ １５ｎｐ ８ｈヨＵＭ１５
ｍｐ ９中にクローニングされる。ジデオキシ配列決
定反応に用いられるプライマーは２ｏヌクレオチドのＤ
ＮＡ Ａ配列および市販（ノイ・イセンブルグ市所在ベ
セスダリサーチラボラトリーズ株式会社）の１５塩基対
プライマーである。
を決定するために、０．９４ ｋｂｏＰｓｔ１／Ｂａｎ
Ｈ１小断片（第２ａおよｃ／２ｂ図）ならびに２９５
塩基対の８ａｕ ３ａ／ＢａｒｎＨ７小断片（ａ！２０
図）が−重鎮の７７一ジＭ １５ｎｐ ８ｈヨＵＭ１５
ｍｐ ９中にクローニングされる。ジデオキシ配列決
定反応に用いられるプライマーは２ｏヌクレオチドのＤ
ＮＡ Ａ配列および市販（ノイ・イセンブルグ市所在ベ
セスダリサーチラボラトリーズ株式会社）の１５塩基対
プライマーである。
ＤＮＡの０配列が発見された。
このＤＮＡの０配列社次のとおりである。
ＤＮＡの０配列（コーディング鎮）
５１０
５’−ＧＡＯＡのＡＯＯＧＴＯＴｏｏ Ｇ灼Ｃｏｏ Ｇ
弘ａＣＯπＣ旗ＧＴＧＮＨ２−Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｔｈｒ
Ｖａｌ Ｓａｒ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ａｌａ ＆ｏ ８
ｅｒ Ｏｙｓ Ｖａ１１５ ’ ２０ ＡＯｆ） ＯＴＯＴＡＯＯＡＧ ＡＧＯ’ＩＮＩ （Ｘ
）Ｇ ＴＡＧ ＴＯＡ ＯＡＧ ＧＣｊＯＧＡＣＴｈｒ
Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ｓａｒ Ｔｒｐ Ａｒｇ
Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ｇｕｎ Ａｌａ Ａｓｐ２５ ３０
３５ ＡＡＯＧＧＯ’ＪＵＴ ｆ）ｃＯ（）ＡＧ ＡＯＧ Ｇ
’ｌｌＧ ＡＯＯＧ’ＩＧ ＡＡＧ ＧＴＯＧＴＯＡｓ
ｎ Ｇｌｙ Ｏｙａ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｖａｌ
’Ｉｈｒ Ｖａｌ Ｉｙｓ Ｖａｌ Ｖａ１０４５ ＴＡＯＧＡＧ ＧＡＯＧＡＣＡＯＯＧＡＡ ＧＧＯＧｒ
Ｇ ’ＩＧＯＴＡＯＧＯＣＧＴＯＴｙｒ Ｇｌｕ Ａｓ
ｐ Ａｇｐ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｃｊｙ
ｇ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｖａ１５０ ５５ ６０ （）ＯＡ ０ＣＸ） ＧＧＯＣＲＡＧ ＡＴＯＡＯＯＡ
ＯＯＧＴＯＧＧＯＧＡＯ頁ＴＡＣＡｌａ Ｐｒｏ Ｇｌ
ｙ Ｇｌｎ ＩＩｓ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｇｌｙ
Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｔｙｒ５７０ ＡＴＯＧＧＯ’ＩＹＸ） ＯＡＣＧＧＯＯＡＯＧＯＧα
）ＯＴＡＯ（％ ＧＯＴ ＯＧＯ工ｌｅ Ｇｌｙ Ｓｅ
ｒ Ｈｌｅ Ｇｕｙ Ｈｌｓ Ａｌａ ＡｒＢ Ｔｙｒ
Ｉａｕ Ａｌａ Ａｒｇ地Ｘ石ｍ−５’ Ｏｙｓ Ｌｅｕ Ｓｔｐ 実施例 １２ テンダミスタット構造遺伝子の上流のＤＮＡ上に、テン
ダミスタットのアミン末端の直上流に位置する蛋白質の
コドンＡＴＧ（Ｍｅｔ）を開始する開放読み枠が存在す
る。この信号はプチドはＤＮＡのＢ配列に対応する。
弘ａＣＯπＣ旗ＧＴＧＮＨ２−Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｔｈｒ
Ｖａｌ Ｓａｒ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ａｌａ ＆ｏ ８
ｅｒ Ｏｙｓ Ｖａ１１５ ’ ２０ ＡＯｆ） ＯＴＯＴＡＯＯＡＧ ＡＧＯ’ＩＮＩ （Ｘ
）Ｇ ＴＡＧ ＴＯＡ ＯＡＧ ＧＣｊＯＧＡＣＴｈｒ
Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ｓａｒ Ｔｒｐ Ａｒｇ
Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ｇｕｎ Ａｌａ Ａｓｐ２５ ３０
３５ ＡＡＯＧＧＯ’ＪＵＴ ｆ）ｃＯ（）ＡＧ ＡＯＧ Ｇ
’ｌｌＧ ＡＯＯＧ’ＩＧ ＡＡＧ ＧＴＯＧＴＯＡｓ
ｎ Ｇｌｙ Ｏｙａ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｖａｌ
’Ｉｈｒ Ｖａｌ Ｉｙｓ Ｖａｌ Ｖａ１０４５ ＴＡＯＧＡＧ ＧＡＯＧＡＣＡＯＯＧＡＡ ＧＧＯＧｒ
Ｇ ’ＩＧＯＴＡＯＧＯＣＧＴＯＴｙｒ Ｇｌｕ Ａｓ
ｐ Ａｇｐ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｃｊｙ
ｇ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｖａ１５０ ５５ ６０ （）ＯＡ ０ＣＸ） ＧＧＯＣＲＡＧ ＡＴＯＡＯＯＡ
ＯＯＧＴＯＧＧＯＧＡＯ頁ＴＡＣＡｌａ Ｐｒｏ Ｇｌ
ｙ Ｇｌｎ ＩＩｓ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｇｌｙ
Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｔｙｒ５７０ ＡＴＯＧＧＯ’ＩＹＸ） ＯＡＣＧＧＯＯＡＯＧＯＧα
）ＯＴＡＯ（％ ＧＯＴ ＯＧＯ工ｌｅ Ｇｌｙ Ｓｅ
ｒ Ｈｌｅ Ｇｕｙ Ｈｌｓ Ａｌａ ＡｒＢ Ｔｙｒ
Ｉａｕ Ａｌａ Ａｒｇ地Ｘ石ｍ−５’ Ｏｙｓ Ｌｅｕ Ｓｔｐ 実施例 １２ テンダミスタット構造遺伝子の上流のＤＮＡ上に、テン
ダミスタットのアミン末端の直上流に位置する蛋白質の
コドンＡＴＧ（Ｍｅｔ）を開始する開放読み枠が存在す
る。この信号はプチドはＤＮＡのＢ配列に対応する。
なお参考のために次にここで用いたＤＮＡの単離法につ
いて、西独特許用＠ ｐ ３３３１８６α３号の実施例
１（参考実施例１）および６（参考実施例２）に基づい
て説明する。
いて、西独特許用＠ ｐ ３３３１８６α３号の実施例
１（参考実施例１）および６（参考実施例２）に基づい
て説明する。
参考実施例 １
矢線変異操作：予めオートミール摩天培塩欧州％許出願
Ａ４９，８４７号）上で培養されたＤＳＭ２７２７株の
胞子形成した菌糸約０．２５ｃＩｎ２を、下記の培地２
５−を貧有する１０〇−容量のコニカルフラスコ中に移
す。すなわち 大豆粉 ２％ グルコース ３％ コーンスターチ ０．２％ 尿 素 ０，１％ くえん酸アンモニウム ０．１％ 麦芽エキス ０．５％ ＫＨ２ＰＯ４０，２％ 培地は１２１℃１パール下において５０分オートクレー
ブきれ、声は約ＺＯである。接種されたフラスコは３０
℃で振盪機上で２日間保温される。予め生育した前培養
２ゴが１０〇−容量の一コニカルフラスコ中の主培養液
２０＃＋７！中に移される（欧州特許出願Ａ４９，８４
７号）：すなわち 可溶性殿粉 ２〜４％ 大豆粉 ０．４％ コーンステイープ・リカー ０．４％ 脱脂粉乳 ０．７％ グルコース １ ％ （ＮＨ４）２ＨＩ’０４ 、 １２％ オートクレーブ殺菌の後培地の声はＺ６である。
Ａ４９，８４７号）上で培養されたＤＳＭ２７２７株の
胞子形成した菌糸約０．２５ｃＩｎ２を、下記の培地２
５−を貧有する１０〇−容量のコニカルフラスコ中に移
す。すなわち 大豆粉 ２％ グルコース ３％ コーンスターチ ０．２％ 尿 素 ０，１％ くえん酸アンモニウム ０．１％ 麦芽エキス ０．５％ ＫＨ２ＰＯ４０，２％ 培地は１２１℃１パール下において５０分オートクレー
ブきれ、声は約ＺＯである。接種されたフラスコは３０
℃で振盪機上で２日間保温される。予め生育した前培養
２ゴが１０〇−容量の一コニカルフラスコ中の主培養液
２０＃＋７！中に移される（欧州特許出願Ａ４９，８４
７号）：すなわち 可溶性殿粉 ２〜４％ 大豆粉 ０．４％ コーンステイープ・リカー ０．４％ 脱脂粉乳 ０．７％ グルコース １ ％ （ＮＨ４）２ＨＩ’０４ 、 １２％ オートクレーブ殺菌の後培地の声はＺ６である。
アクリフラビンが突然変異誘発剤としてこの培地に１０
〜２５μｇ／ｍｌの濃腿に添加される。
〜２５μｇ／ｍｌの濃腿に添加される。
培養は毎分２２０回転で５日間２８℃において振盪され
る。次に培養液は遠心にかけられ（１，３００ＸＩＦ、
５分間）、細胞沈降物は主培養液で洗浄される。洗浄
された細胞は、ガラス製ホモゲナイザーを用いて分散さ
れ、下記の組成の寒天平板培地上に接糧される。
る。次に培養液は遠心にかけられ（１，３００ＸＩＦ、
５分間）、細胞沈降物は主培養液で洗浄される。洗浄
された細胞は、ガラス製ホモゲナイザーを用いて分散さ
れ、下記の組成の寒天平板培地上に接糧される。
しよｓ ０１３％
デキストリン １．５％
Ｎａ０４ ０．０５％
に２ＨＰＯ４０，０５％
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２００，００１％
トリプトン大豆液 ｌ１１５％
（オキシイド社ｌＩＩり
培養液の州は７．１ （オートクレーブ殺菌の条件は前
記と同じ）である。
記と同じ）である。
平板培地は２８′Ｃにおいて５日間保温され、個々のコ
ロニー燻オートミール寒天を含有する試験管斜面培地に
移される。それらは上記の過少に菌糸が胞子形成するま
で保温される。胞子形成した一系は、前記の通シに前培
養および生培養により増殖され、５日を経た生培養Ｐ液
祉テンダミスタンドの含有ｔＫついてテストされる（欧
州％ｆＦｂｍＡ４９，８４７号参ｊｆｆｌ）、 こ（Ｄ
方法によ）、前記の条件下において生育の期間中に培養
液１を当シ約９０，０００〜１０１１ＯＯＯＩＵＯテン
ダきスタットすなわち不活性化物ｘ１．５〜１．８ｔμ
に相当する量を産生ずるｌ−９３５３，１〜９５６２、
ｌ−９４０およびｌ−９４１８株を選別することが可能
であった。
ロニー燻オートミール寒天を含有する試験管斜面培地に
移される。それらは上記の過少に菌糸が胞子形成するま
で保温される。胞子形成した一系は、前記の通シに前培
養および生培養により増殖され、５日を経た生培養Ｐ液
祉テンダミスタンドの含有ｔＫついてテストされる（欧
州％ｆＦｂｍＡ４９，８４７号参ｊｆｆｌ）、 こ（Ｄ
方法によ）、前記の条件下において生育の期間中に培養
液１を当シ約９０，０００〜１０１１ＯＯＯＩＵＯテン
ダきスタットすなわち不活性化物ｘ１．５〜１．８ｔμ
に相当する量を産生ずるｌ−９３５３，１〜９５６２、
ｌ−９４０およびｌ−９４１８株を選別することが可能
であった。
参考５ｉＩ！施例 ２
ストレプトミセス・テンダニよｆｉ ＤＮＡの阜離およ
びその分子生物学的％徴の決定 細胞は参考実施例ＩＫ従って培養される。主培養培地で
３日間生育の後に、コ°ニカ＃７２スコ中のＭＪＩ＃１
は５，０ＱＱＸｆ、４℃において５分間の遠心によシ集
虐されｓ５０５０ミリのトリス／塩酸＊衡剤、１ＤＯミ
リモルのＮａ０Ａおよび２５ミリモルのＭＤテムの浴液
５０−で２回洗浄される。
びその分子生物学的％徴の決定 細胞は参考実施例ＩＫ従って培養される。主培養培地で
３日間生育の後に、コ°ニカ＃７２スコ中のＭＪＩ＃１
は５，０ＱＱＸｆ、４℃において５分間の遠心によシ集
虐されｓ５０５０ミリのトリス／塩酸＊衡剤、１ＤＯミ
リモルのＮａ０Ａおよび２５ミリモルのＭＤテムの浴液
５０−で２回洗浄される。
典型的な調製法において蝶、遠沈によシ固められ九ａ胞
５ｔが一１９８℃の液体窒素によ）瞬間に凍結され、Ｈ
２の存在下でプレードホモゲナイザ−（ウオリング社製
業務用プレンダー）を用いて細粉化される。この細粉紘
前記の緩衝液１０−中に入れられ、氷上で溶解され、リ
ゾチーム溶液（３０ｑ／ｄ）（Ｌ８ｍと共に２０分間２
８℃においてゆるやかに振盪しつつ保温される。
５ｔが一１９８℃の液体窒素によ）瞬間に凍結され、Ｈ
２の存在下でプレードホモゲナイザ−（ウオリング社製
業務用プレンダー）を用いて細粉化される。この細粉紘
前記の緩衝液１０−中に入れられ、氷上で溶解され、リ
ゾチーム溶液（３０ｑ／ｄ）（Ｌ８ｍと共に２０分間２
８℃においてゆるやかに振盪しつつ保温される。
次にプロテイナーゼ１＃ｌ液（１５８９／ａＩｇ）α８
−およびＮ−ラクロイルサルフシンナトリウム塩の２０
％ｌｒＩ液（Ｌ８ｍｇが＠濁液に添加される。
−およびＮ−ラクロイルサルフシンナトリウム塩の２０
％ｌｒＩ液（Ｌ８ｍｇが＠濁液に添加される。
注意深く混合の後に、混合液は氷上に３０分間。
その後室温に１５分間保たれる。固形の塩化セシウム２
２ｆの添加および溶解の後に、赦を蝶前記の緩衝液を用
いて２２ｄとされ５ｊｌｌ！ｉ濁液鉱１２．０００Ｘｆ
および４℃において２５分間遠心される。臭化エチジウ
ムが透明な遠心液に添加され、屈折率は０ａＯＬで屈折
針を用いてｎ−１，３９２０に調整される。調製用遠心
（１２０，０００ｘｆ１３６時間％１５℃）の後染色体
ＤＮＡのバンドは遠心管から除去され、同じ条件下で再
遠心される。
２ｆの添加および溶解の後に、赦を蝶前記の緩衝液を用
いて２２ｄとされ５ｊｌｌ！ｉ濁液鉱１２．０００Ｘｆ
および４℃において２５分間遠心される。臭化エチジウ
ムが透明な遠心液に添加され、屈折率は０ａＯＬで屈折
針を用いてｎ−１，３９２０に調整される。調製用遠心
（１２０，０００ｘｆ１３６時間％１５℃）の後染色体
ＤＮＡのバンドは遠心管から除去され、同じ条件下で再
遠心される。
臭化エチジウムは、阜＃Ｉされたバンドからｎ”ブタノ
ール抽出によシ除去され、バンドは全部の０ｎＯＬを除
去する丸めに透析される。ヒリして得られたＤＮＡ ｈ
、例えば酵素Ｐｓｔ １ ％ Ｂａｍ Ｈｌ、Ｂａｎ
ＭＡ ％ Ｇｌａ ｌ、Ｂｇｌ ｌおよびＭｈｏ ｌ
ｊｒｃよ・シ切断されるが、例えばエンドヌクレアー
ゼＢｏｏ Ｒ１ν および１ｎｎａ ＩＩによっては切断され得ない。
ール抽出によシ除去され、バンドは全部の０ｎＯＬを除
去する丸めに透析される。ヒリして得られたＤＮＡ ｈ
、例えば酵素Ｐｓｔ １ ％ Ｂａｍ Ｈｌ、Ｂａｎ
ＭＡ ％ Ｇｌａ ｌ、Ｂｇｌ ｌおよびＭｈｏ ｌ
ｊｒｃよ・シ切断されるが、例えばエンドヌクレアー
ゼＢｏｏ Ｒ１ν および１ｎｎａ ＩＩによっては切断され得ない。
ムＴｏ０３１２１０株およびＤ８Ｍ ２７２７株よシの
ＤＮＡに比べて、例えに突然変異株１−’９３５３およ
び１−９３６２よシ得られるＤＮＡは増幅された遺伝要
素を有し、その断片は螢光色素臭化エチジウムで染色後
には明らかに可視性で、背景となる断片から突出する。
ＤＮＡに比べて、例えに突然変異株１−’９３５３およ
び１−９３６２よシ得られるＤＮＡは増幅された遺伝要
素を有し、その断片は螢光色素臭化エチジウムで染色後
には明らかに可視性で、背景となる断片から突出する。
増幅された要素のサイズおよび制限エンドヌクレアーゼ
による分解後の特徴のある個々の断片は下記に示される
。
による分解後の特徴のある個々の断片は下記に示される
。
１ ９、０ １３．５ ７．２
２ ７，０ １１．５ ＆１
３゛ 瓜８ ９．５ ５．３
４ ４、６ ２．８ ２．９
５ 五４ ａ７ ２．６
６ ＡＩ ２．５
７ ２．３ ２．１５
８ １、１ ２．１
９１．５
１０ １２
１１ −１．１
１２ １．０
１３ Ｇ、８
１４ ａ５
合計 ５７．５ ３７．８ ５７．４、
第１ａ図およびｍｌｂ図は、雑種プラスはドｐＫＡ工１
ａおよびｐＫＡ工１ｂを、ｉｊｇ ２ ａ図ＪＺｂ図、
および第２ｃ図は、 Ｐｓｔ Ｉ断片における遺伝子の
所在を、第３図はプラスミドｐｊｋｌ １ａを、第４図
はプラスミドｐＡＸ ３５０ ！Ｌを、＠５ ａ図およ
びＭ Ｓ ｂ図はプラスミドｐ８Ａ ２＆およびシラス
ミドｐｇム２ｂを、Ｍｂａ図および第６ ’ｂ図はプラ
スミドル８ム３５１ａおよびプラスミドｐ８Ａ ３５１
ｂを、第７ａ図およびｕＺ ｂ図はプラス・ミドル８
ム３ａおよびプラスミドｐｓＡ ３ｂを、第８ａ図およ
び第８ｂ図はプラスミドル８ム３５２ ａ ＞よびプラ
スミドｐ１３Ａ ３５２ ｂを、第９図はプラスミドｐ
８Ａ １をそして＃！１０図はプラスミドｐｓＡ ３５
０ ＆を示す。 特許出願人 ヘキスト・アクチェンゲゼルシャフト外・
２名 第１０図 第１ｂ図 党２ｂ図 第２ｃ図 書ｒミ７−’Ｅ↑箔ｎ１陶Ｕ諷１ 莞３図 鬼４図 児５ｑ図 集５ｂ図 第６０図 箆６ｂ図 ｌｃｌ ｌ 免７ｏ図 党７ｂ図 第８０図 箆８ｂ図 ｌｃｌ ｌ 究９図 ｙｓｔ ＋
ａおよびｐＫＡ工１ｂを、ｉｊｇ ２ ａ図ＪＺｂ図、
および第２ｃ図は、 Ｐｓｔ Ｉ断片における遺伝子の
所在を、第３図はプラスミドｐｊｋｌ １ａを、第４図
はプラスミドｐＡＸ ３５０ ！Ｌを、＠５ ａ図およ
びＭ Ｓ ｂ図はプラスミドｐ８Ａ ２＆およびシラス
ミドｐｇム２ｂを、Ｍｂａ図および第６ ’ｂ図はプラ
スミドル８ム３５１ａおよびプラスミドｐ８Ａ ３５１
ｂを、第７ａ図およびｕＺ ｂ図はプラス・ミドル８
ム３ａおよびプラスミドｐｓＡ ３ｂを、第８ａ図およ
び第８ｂ図はプラスミドル８ム３５２ ａ ＞よびプラ
スミドｐ１３Ａ ３５２ ｂを、第９図はプラスミドｐ
８Ａ １をそして＃！１０図はプラスミドｐｓＡ ３５
０ ＆を示す。 特許出願人 ヘキスト・アクチェンゲゼルシャフト外・
２名 第１０図 第１ｂ図 党２ｂ図 第２ｃ図 書ｒミ７−’Ｅ↑箔ｎ１陶Ｕ諷１ 莞３図 鬼４図 児５ｑ図 集５ｂ図 第６０図 箆６ｂ図 ｌｃｌ ｌ 免７ｏ図 党７ｂ図 第８０図 箆８ｂ図 ｌｃｌ ｌ 究９図 ｙｓｔ ＋
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １）次の式 ％式％ （式中、Ｒはヒドロキシ基または遺伝的にコード可能な
はプチドの残基を表わし、ＸはアミノｒＩｉ、１０〜２
５個よシなる疎水性の領域を表わすものとする）で示さ
れるペプチド。 ２）テンダミスタットを産生じ、また予め亜致死量のア
クリ７ラビンで処理されたストレプトミセス・テンダニ
の菌株から、完全ＤＮＡ。 単離、Ｐｓｔ Ｉによる分解、ＤＮＡ ｃＤＡ配列すな
わち ５’（ＩＰ−）ＯＯＴ ＴＯＡ ＧＴＧ ＴＯＧ ＴＯ
Ｔ ＴＯＧ ＴＡ−３’ ＴＡ）とのサザンハイプリダ
イゼーション、２．３ｋｂのＰｓｔ Ｉ断片の単離、
Ｂａｎ Ｈｌによる切断、Ａ配列とのサザンノ１イプリ
ダイゼーション、ａ９４ｋｂＯＰｓｔ ’ｌ Ｂａｎ
Ｍｌ小断片の単離、８ａｕ ３ａによる切断、ム配列と
のサザンハイブリダイゼー゛ジョン％ Ｑ、５２５ ｋ
ｂのＢａｍ Ｈｌ １３ａｎ ’３ａ小断片の単離、お
よびＤＮＡの配列決定によって得られ、かつ ａ）テンダミスタット構造遺伝子のすぐ上流 。 Ｋ位置し、 ｂ）アミン末端において Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｈａ−Ｌｅｕ−Ａ
ｒｇをコードし、 Ｃ〕 カルボキシ末端において Ａｌａ −Ｂｏｒ ＝Ａｌａ をコードし、ｄ）中央部
にお（・てアミノ酸１０〜２５個よ）なる疎水性領域を
コードする、 ＤＮＡ Ｑ Ｂ配列。 ３） ＤＮＡのＢ配列を含有する遺伝子構造。 ４）構造遺伝子を有する読み枠内Ｋ ＤＮＡのＢ配列を
特徴する特許請求の範囲第３項記載の遺伝子構造。 ５）構造遺伝子がテンダミスタットを特徴とする特許請
求の範囲第３項または第４項記載の遺伝子構造。 ６） ＤＮＡの０配列を有する、特許請求の範囲第５項
記載の遺伝子構造。 ７）特許請求の範囲第２〜第６項記戦のＤＮＡ配列を有
するプラスミド。 ８）ストレプトミセス１Ｍ中において有効なレプリコン
を有する、特許請求の範囲第７項記載のプラスミド。 ９）大腸−中において有効なレプリコンを有する％特許
請求の範囲第７または第８項記載のプラスミド。 １０）％許請求の範囲第７〜第９項記載のプラスミドを
含有する、宿主生物。 １１）ストレプトミセス属に属する、特許請求の範囲第
１０項記戦の宿主生物。 １２）種ストレプトミセス・テンダニま九はストレプト
ミセス・リビダンスに属する、特許請求の範囲第１１項
記載の宿主生物。 １３） ＤＮＡのＢ配列に対応する前ペプチドを切除す
る信号ペプチダーゼを含有する特許請求の範囲第１０〜
第１２．］ｊｉ記載の宿主生物を使用することよシなる
、ポリペプチドの調製方法。 １４）用いられる宿生生物が特許請求の範囲′ＩＩＬ５
項記載の遺伝子構造を含有するプラスミドを特徴する特
許請求の範囲第１３項記載の分法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19843418274 DE3418274A1 (de) | 1984-05-17 | 1984-05-17 | Signalpeptid fuer die exkretion von peptiden in streptomyceten |
| DE3418274.8 | 1984-05-17 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60260598A true JPS60260598A (ja) | 1985-12-23 |
| JPH0797993B2 JPH0797993B2 (ja) | 1995-10-25 |
Family
ID=6236073
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60102801A Expired - Lifetime JPH0797993B2 (ja) | 1984-05-17 | 1985-05-16 | ポリペプチドの製造方法 |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0161629B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0797993B2 (ja) |
| AT (1) | ATE36167T1 (ja) |
| AU (1) | AU580062B2 (ja) |
| CA (1) | CA1309674C (ja) |
| DE (2) | DE3418274A1 (ja) |
| DK (1) | DK172458B1 (ja) |
| ES (1) | ES8704540A1 (ja) |
| FI (1) | FI81113C (ja) |
| GR (1) | GR851184B (ja) |
| HU (1) | HU197351B (ja) |
| IE (1) | IE58385B1 (ja) |
| IL (1) | IL75214A (ja) |
| NO (1) | NO173452C (ja) |
| NZ (1) | NZ212085A (ja) |
| PT (1) | PT80483B (ja) |
| ZA (1) | ZA853672B (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63301793A (ja) * | 1987-05-05 | 1988-12-08 | ヘキスト，アクチエンゲゼルシャフト | ストレプトミセス菌類における外来性タンパク質の製造法 |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1295563C (en) * | 1985-11-01 | 1992-02-11 | Robert T. Garvin | Production of active proteins containing cystine residues |
| CA1295566C (en) * | 1987-07-21 | 1992-02-11 | Robert T. Garvin | Characterization and structure of genes for protease a and protease b from streptomyces griseus |
| DE3707150A1 (de) * | 1987-03-06 | 1988-09-15 | Hoechst Ag | Tendamistat-derivate |
| US5426036A (en) * | 1987-05-05 | 1995-06-20 | Hoechst Aktiengesellschaft | Processes for the preparation of foreign proteins in streptomycetes |
| DE4012818A1 (de) | 1990-04-21 | 1991-10-24 | Hoechst Ag | Verfahren zur herstellung von fremdproteinen in streptomyceten |
| DE3837271A1 (de) * | 1988-11-03 | 1990-05-10 | Hoechst Ag | Verfahren zur selektiven spaltung von fusionsproteinen |
| ES2081826T3 (es) * | 1988-11-03 | 1996-03-16 | Hoechst Ag | Procedimiento para la preparacion de un producto previo de insulina en estreptomicetos. |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3331860A1 (de) * | 1983-09-03 | 1985-03-21 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Verfahren zur herstellung von tendamistat |
-
1984
- 1984-05-17 DE DE19843418274 patent/DE3418274A1/de not_active Withdrawn
-
1985
- 1985-05-08 AT AT85105610T patent/ATE36167T1/de not_active IP Right Cessation
- 1985-05-08 EP EP85105610A patent/EP0161629B1/de not_active Expired
- 1985-05-08 DE DE8585105610T patent/DE3564118D1/de not_active Expired
- 1985-05-10 HU HU851786A patent/HU197351B/hu unknown
- 1985-05-14 ES ES543120A patent/ES8704540A1/es not_active Expired
- 1985-05-15 ZA ZA853672A patent/ZA853672B/xx unknown
- 1985-05-15 FI FI851929A patent/FI81113C/fi not_active IP Right Cessation
- 1985-05-15 CA CA000481600A patent/CA1309674C/en not_active Expired - Fee Related
- 1985-05-15 GR GR851184A patent/GR851184B/el unknown
- 1985-05-15 NO NO851971A patent/NO173452C/no not_active IP Right Cessation
- 1985-05-15 DK DK198502172A patent/DK172458B1/da not_active IP Right Cessation
- 1985-05-15 NZ NZ212085A patent/NZ212085A/xx unknown
- 1985-05-16 IL IL75214A patent/IL75214A/xx not_active IP Right Cessation
- 1985-05-16 IE IE122585A patent/IE58385B1/en not_active IP Right Cessation
- 1985-05-16 AU AU42640/85A patent/AU580062B2/en not_active Ceased
- 1985-05-16 JP JP60102801A patent/JPH0797993B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1985-05-17 PT PT80483A patent/PT80483B/pt not_active IP Right Cessation
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63301793A (ja) * | 1987-05-05 | 1988-12-08 | ヘキスト，アクチエンゲゼルシャフト | ストレプトミセス菌類における外来性タンパク質の製造法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES8704540A1 (es) | 1987-04-01 |
| EP0161629A1 (de) | 1985-11-21 |
| DK217285D0 (da) | 1985-05-15 |
| DE3418274A1 (de) | 1985-11-21 |
| IL75214A (en) | 1991-03-10 |
| ZA853672B (en) | 1985-12-24 |
| FI81113C (fi) | 1990-09-10 |
| PT80483B (pt) | 1987-09-30 |
| PT80483A (de) | 1985-06-01 |
| ATE36167T1 (de) | 1988-08-15 |
| JPH0797993B2 (ja) | 1995-10-25 |
| NO173452C (no) | 1993-12-22 |
| ES543120A0 (es) | 1987-04-01 |
| HU197351B (en) | 1989-03-28 |
| DK172458B1 (da) | 1998-08-24 |
| DK217285A (da) | 1985-11-18 |
| HUT38670A (en) | 1986-06-30 |
| AU4264085A (en) | 1985-11-21 |
| IL75214A0 (en) | 1985-09-29 |
| NZ212085A (en) | 1989-03-29 |
| CA1309674C (en) | 1992-11-03 |
| FI81113B (fi) | 1990-05-31 |
| IE851225L (en) | 1985-11-17 |
| NO851971L (no) | 1985-11-18 |
| DE3564118D1 (en) | 1988-09-08 |
| FI851929A0 (fi) | 1985-05-15 |
| IE58385B1 (en) | 1993-09-08 |
| EP0161629B1 (de) | 1988-08-03 |
| NO173452B (no) | 1993-09-06 |
| GR851184B (ja) | 1985-11-25 |
| FI851929L (fi) | 1985-11-18 |
| AU580062B2 (en) | 1988-12-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JPH01501755A (ja) | 合成ｄｎａの構成および大ポリペプチドの合成におけるその使用 | |
| JPH05504067A (ja) | 大腸菌及びマイコバクテリアのためのシャトルプラスミド | |
| WO1984004541A1 (en) | Expression and secretion vectors and method of constructing vectors | |
| EP0143834A1 (en) | Heat regulated production of selected and fused proteins in yeast | |
| JPH07503844A (ja) | 顆粒球コロニー刺激活性を有する新規なポリペプチド，それらの調製およびそれらを含有する医薬組成 | |
| AU643511B2 (en) | Bacterial vectors | |
| WO1991018101A1 (fr) | Procede de production d'une proteine | |
| JPH0376580A (ja) | 大腸菌発現ベクターとそれを利用した抗ウイルス性タンパク質の製造方法 | |
| JPH10500565A (ja) | ｏｓｍＢ プロモータで制御される発現プラスミド | |
| EP0224294B1 (en) | Regulatory region cloning and analysis plasmid for bacillus | |
| JPS60260598A (ja) | ポリペプチドの製造方法 | |
| EP0073029B1 (en) | Recombinant plasmid and microorganism containing same | |
| JPS59501694A (ja) | シグナルｄｎａ配列を含むｄｎａ断片、その製造方法およびそれにより形質転換された微生物 | |
| JPH04507045A (ja) | 誘導性発現ベクター | |
| CA2730741C (en) | Self-replicating vector lacking an antibiotic-resistance gene | |
| JP2903414B2 (ja) | 抗酸菌分泌発現ベクター及び抗酸菌 | |
| EP0148552A1 (en) | Streptomyces expression sequence and methods for expressing DNA sequences in streptomyces | |
| EP0229712A2 (en) | The production of human serum albumin in bacillus | |
| US6319692B1 (en) | Methods for transferring gene into chromosome | |
| EP0342658B1 (en) | Biosynthetic process for the preparation of chemical compounds | |
| Roytrakul et al. | A Rapid and Simple Method for Construction and Expression of a Synthetic | |
| KR920000117B1 (ko) | 새로운 세라티오펩티다제와 그 제조방법 | |
| JPH08103278A (ja) | 活性型ヒトａｌｔの製造方法 | |
| EP0471514A2 (en) | Improved bacteriophage lambda pL promoters | |
| EP0493926A1 (en) | A method for enhancing the structural stability of recombinant DNA expression vectors |