JPS59501694A - シグナルｄｎａ配列を含むｄｎａ断片、その製造方法およびそれにより形質転換された微生物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 シグナルＤＮＡ配列を含むＤＩＶＡ断片、その製造方法およびそｎに工９形質転 換された微生物本発明は、遺伝子工学に関し、さらに詳しくは、新規なブドウ林 球薗１５ｔａｐｈｙＬｏｃｏｃｃａＬ　ｌ信号配列、及び細胞膜を通して分秘さ れうる蛋白質及びポリペプチドを生産するために、組換えｍＡテクノロジーにお ける七扛らの利用に関するものである。

原核微生物並びに真核微生物の細胞内で合成さｎる蛋白質及びポリペプチドの中 でも、他のものが細胞膜ヲ通して排出される、いわゆる細胞外蛋白質及びポリペ プチドであるのに対して、幾つかは細胞内に保留さするものがある。従って、細 胞は、細胞内に保留さ几るべき蛋白質及びポリペプチドと、排出ないし分秘され るべきものの２つを認識する能力を有する。この能力は、一般に、蛋白質またげ ポリペプチドのリーディング禾端、すなわちｍ’ＲｈＡの翻訳中に細胞内で最初 に合成された末端における代謝的に短命の“シグナル”ペプチドによるものとさ れている。正確な機構は完全に理解されているわけではないけれども、シグナル ペプチドが細胞膜に作用し、そｎ、’ｌ浸透可能とし、それを通して蛋白質又は ポリペプチドの残ｖｔ導くものと信じらｎている。分秘プロセスの開始は翻訳中 に起こる。シグナルペプチドは七のプロセスの間に割裂され、細胞外には見い出 さｎない。

上記のことは、例えば細胞質１　ｃｙｔｏｐｌａｓｍａ　ｌ　ｆ包被する誰−の 膜を有する杆菌（Ｂａｃｉｌｌｔｂｓ　）種などのグラム陽性細菌については真 実である。しかしながら、例えば大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　（ Ｅ＋ｃｏｌｉ　ｌなどのグラム陰性細菌においては、細胞質膜は外層膜により囲 まれており、外層膜及び内層膜が共にそれらの間の細胞周辺腔を規定している。

シグナルペプチドは内ル膜の浸透のみを行ない、それらを通して分秘される蛋白 質及びポリペプチドは２つの膜の間に捕捉される。細胞周辺腔に排出されるこの 工うな蛋白質及びポリペプチドはべりブラズム蛋白質及びペリプラズムポリペプ チドと呼ばれる。

上記に工れば、細胞外−もしくはべりプラズムー蛋白質もしくは−ポリペプチド は、そのアミン末端に結合したシグナルペプチドを有する成熟蛋白質もしくはポ リペプチドからなるプレペプチドもしくは前駆体の分割生成物である。

これまで知られている原核シグナルペプチドは、アミノ酸配列に関して多くの共 通した％徴を有している。かように、この工うなシグナルペプチドは通常的１５ 〜３５のアミノ酸を有し、その数及び配列は比較的に規則的なパターンに従って いる。最初のアミノ酸、すなわちリーディングにあるものもしくはアミノー不端 は塩基である。

この塩基配列には約１０〜２５のアミノ酸の疎水性配列が玩いており、これらの 幾つがはＧｌｙ及びｐｒｏなどの１フレキシブル”である。最後に、成熟蛋白質 からのシグナルペプチドの分離のための分割部位があり、これは通常Ａｔａもし くはＧＬｙなど小さな側基を有するアミノ酸からなる。

比較的に新しい組換えＤＩＶＡ技術によると、一つの菌株又は塊からの遺伝子は 他のものに導入されることができ、それに工ってそれらに所望の特性を転移でき る。成功した遺伝子転移の例としては、成長ホルモン、ンマトスタチン、インシ ュリン及びインターフェロンをコードするｌ　ｃｏｄｉｎｇ　ｆｏｒ　ｌヒト遺 伝子のＥ、ｃｏハ　などの細菌への導入を挙げることができる。しかしながら、 挿入された染色体外性遺伝子が細胞内蛋白質もしくはポリペプチドをコードする 場合には、細胞内で合成された蛋白質もしくはポリペプチドは公租されず、培養 され形質転換された微生物の細胞は蛋白質もしくはポリペプチドが回収されつる 前に破壊もしくは破裂されねばならない。この工うな細胞破裂は、成熟蛋白質も しくはポリペプチドをコードする遺伝子のリーテイング宋端を、適当なシグナル ペプチドをコードするｍＡ配列、いわゆるシグナルもしくはリーダー配列に結合 することに工って避けることができる。所望の蛋白質もしくはポリペプチドの前 駆体は、そこで細胞内で合成されるだろうし、また前駆体の分割中に成熟蛋白質 もしくはポリペプチドは細胞膜を通って公租される。これにより、蛋白質もしく はポリペプチド生成物の回収及び精製が実質的に簡素化され、改善されるだろう 。何故ならば、もはや細胞破裂は必要でなく、またそれに１９望ましくない細菌 蛋白質の遊離は避けられるからである。他の利点は、宿主の生存率に悪影響を及 ぼす宿主細胞内の非特異性宿主蛋白質の濃度が高くなるのが避けられることにあ る。何故ならば、このような非対応蛋白質は直ちに公租されるからである。さら に、このような速やかな公租は、生成物がこの工つなメカニズムに敏感である場 合に生成物合成の全ゆるフィードバック阻害を防ぐ。

しかしながら、同定されまた組換えＤ）ＷＡ技術に用いるのに有用とされたＤＮ Ａ配列の数は比較的少なく、またそれらの種特異性についても殆んど知られてお らず、他の梅に２けるそれらの作用のほんのわずかの例が研究されているのみで ある。

本発明の目的は、組換えＤＩＶＡ技術に有用であり、また関係のないＤ！ＶＡ物 質とも機能的であり、新規に同定されたシグナルもしくはリーダー配列を含むＤ ＮＡ断片を提供することにある。シグナル配列に加えて、さらにＤＪ’／Ａ断片 は、選択された蛋白質もしくはポリペプチドをコードするＤＩＶＡ配列のため挿 入部位を具備することができ、これにより上記ｍＡ配列と共にシグナル配列は上 記蛋白質もしくはポリペプチドの前駆体をコードする。本発明のＤＩＶＡ断片は 、上記シグナル配列が、黄色ブドウ状球菌（５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｔＬｓ　 ａｕｒａｔｃｚ　ｌなどのブドウ状球菌ｌ　５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｌ 　種あるいは化学的に合成されたそれらの相当物のプロティンＡをコードする遺 伝子のシグナル配列であることを特徴とするものである。本発明はまた、このよ うなりＩＶＡ　Ｍ片の製造にも関するものである。

プロティンＡシグナルペプチドの正確なアミノ酸配列は、ブドウ状球菌の各種菌 株及び変異株の間で異なりうる。しかしながら、本発明は、ブドウ状球菌プロテ ィンＡ遺伝子あるいは化学的に合成されたそれらの全ゆる相当物から得られたシ グナル配列を含む全てのＤＮＡ　［！１１片を包含しようとするものである。

本発明の他の側面は、ｍ、４断片を含有するこの工うなシグナル配列を含むクロ ーニング担体（シーｈｉｃｌｅ　＋もしくはベクター並びにその製造方法にある 。

本発明の他の側面は、このようなりローニング担体により形質転換された微生物 並びにその製造方法にある。

本発明のさらに他の側面は、選択された蛋白質もしくはポリペプチドをコードす るそれらの遺伝子または部分が挿入されたこのようなりローニング担体な含む組 換えＤＮＡ分子並びにこのような組換えＩ）ＮＡ分子の製造方法にある。

さらに不発明の他の側面は、この工うな組換えｍＡ分子に＝９形質転換された微 生物にある。

本発明はまた、このような形質転換された微生物の培養からなる選択された蛋白 質もしくはポリペプチドの製造方法にも関するものである。

本発明のＤＮＡ断片に含有され得るシグナル配列を含む同定されたブドウ状球菌 ＤＮＡ配列の一例を、それから演繰するとして示される相当するアミノ酸配列と 共に以下に示す。〔本明ＭＵ書ではＩＵｐＡＣのアミノ酸略号を用いるｉ　Ｊ　 、ＢＬｏＬ、Ｃｈｇｍ、２４Ｉ　＊　５２７及び２４９＋　１１９６６１１上記 ４２のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は、前述した原核シグナルペプチドの 一般的特徴を有する。従って、これは１つのチロシン、１つのアルギニン及ヒ４ つのりシン残基を含有する１１のアミノ酸の塩基性アミン末端領域を含む。これ に、幾つかのフレキシブル残基、すなわち５つのグリシンと１つのプロリン残基 を含む２３のアミノ酸の疎水性鎖長が続く。疎水性領域の下流ｌ　ｄｏｖｕｒＬ ｚｔｒｅａｍ　ｌには、プロテアーゼに対する分割部位となり得る幾つかのアラ ニンがある。可能な分割部位は矢印（↑）で示されている。現在のところ、どこ が実際の分割部位かは知られていないが、幾つかの理由にエリ、多分この部位は ２つのＡｌａ残基３６と３７との間である。これは、式中の最初の３６のアミノ 酸残基からなるシグナルペプチドを与えるだろう。

本発明のＤＩＶＡ断片を特殊のクローニング担体もしくはベクターに導入するた めの、並びに制限部位をＤＩＶＡ断片に導入するための特殊の技法は工〈知られ ており、ここにさらに説明する必要はないだろう。この工うな方法は、適当な制 限酵素によるベクターの分割、シグナル−配列を含有するＮＡ断片のベクターへ の挿入、及び、もしＤＩＷＡ断片が上記に従ってシグナル配列の下流に適当な制 限部位を有しな°い場合にはそれらへのこのような部位の挿入からなすうる。シ グナル配列を含むＤ）ＮＡ断片のベクターへの挿入方法は、例えばジエームズ、 クロイヤー（Ｊａｍｓ　ｚＫｒｏｙｇｒ　ｌとシン、チャｙ　ｌ　５ｈｉｎｙ　 Ｃｈａｎｇ　）、Ｇａｎｇ　１５　＊３４３−３４７　（１９８１１に記載され ておｒ）、ＤＮＡ断片への制限部位の挿入は例えばギラムｌ　ＧｉＬｌａｍ、Ｓ 、ｌ　とスミスｌ　Ｓｍ１ｔｈ、Ｍ、ｌ　、　Ｇｅｎｇ　８　、８１　９７　（ １９７９１に記載されている。これらの引用文献の開示内容はここに引用文献と して引照する。

本発明に従って、シグナル配列を含むＩ）ＮＡ断片を提供できるクローニング担 体もしくはベクターは、中でも形質転換されるべき宿主細胞の性質に依存する。

有用なり成のＤＩＶＡ配列、例えば各種公知の細菌性プラスミド、例えばρＥＲ ３２２ｅ含むＥ、ｃｏｌｉ　からのプラスミド及びそれらの誘導体、λ−ファー ジの誘導体などファージ五Ａ１プラスミドとファージ五Ａの組合せから得られる ベクター、イースト・グラスミド、複合プラスミドなど、のセグメントからなる ものである。特定の宿主に関して特定のクローニング担体を選択することは、当 業者にとってなしつるであろう。

本発明のＤＮＡ断片を含むクローニング担体により形質転換されつる宿主微生物 は、好ましくはグラム陽性細菌であるが、酵母及び他の菌類、培養における植物 細胞など、他の適当な宿主も使用できる。

好ましい態様においては、本発明のＤＩＶＡ　ｆｆＨ片は、本発明のＤＮＡ断片 を含有するクローニング担体においてプロモーターが機能的であるように、ブド ウ状球菌ドナーから得られるプロティンＡをコードする遺伝子のプロモーターも 含むものである。好１しくは、プロモーターは、シグナル配列としてプロティン Ａをコードする１百」じ遺伝子イから得られる。さらに好まｌ、い態様において は、本発明のＤＮＡ断片は、プロティンＡをコードする遺伝子の全表現コントロ ール領域を含むものである。

上述したように、プロティンＡ前駆体のシグナルペプチドをコードするシグナル 配列を含む本発明のＩ）ＮＡ断片は、それ自体公知の方法にエリ、全ゆるプロテ ィンＡ生産ブドウ軟球菌種のＤＮＡから得ることができる。この工うなりＮＡ断 片はまた、化学的合成、あるいは化学的に合成されたＤＮＡ配列とブドウ状球菌 ドナーから得られた１）ＮＡ配列との組合せによっても製造できる。

１プロテインＡをコードする遺伝子１ｐｒｏｔｅｉｎＡ　ｃｏｄｉｎ、ｇｇａｎ ｇ　ｌ”及び１プロティンＡ前駆体”という表現における用語１プロテインＡ” は、黄色ブドウ状球菌ｌ５ｔａｐｈｙｌりｃｏｃｃｔｔｒａｕｒｅｗｓ　ｌ々ど のブドウ状球菌種により生産される高ｆ子を指す。この蛋白質は、免疫グロブリ ン、タイプＧのＦｃ　部分に結合していることを％徴とし、さらに詳細はのスウ ェーデン特許出願Ａ　８２０４８１０−９に記載されており、これらの開示内容 はここに引用文献として引照する。

上述し、九本発明のＤＮＡ断片における遺伝子のための挿入部位あるいはそれら の部分は、シグナル配列のすぐ後に存在しうるが、さらにその下流にあっても工 い。後者の場合、形成された前駆体は、挿入され次遺公子または遺伝子部分に相 当するポリペプチド配列とシグナルペプチドとの間の多くの１余剰−ｘｔｒａ　 ”ペプチド単位を含むだろう。従って、シグナルペプチドが分割された後に得ら れる成熟蛋白質もしくはポリペプチドは、同様にそのろう。これは、一般には、 生成物にいかなる損害をも及ぼさない。従って、′蛋白質もしくはポリペプチド の前駆体”という表現は、同様にこのような分子をも含むことを意味し、ここで 、シグナルペプチドはこの：〜うな余剰ペプチド配列によＶ％定の蛋白質もしく はポリペプチドから離れている、 以下に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明する？　が、これらの実施例は 説明のためのみのものであり、本発明がこれらに何ら限定されるものでないこと はもとよりである。この詳細な説明（並びに前記説明）においては、以下の定義 を適用する： ヌクレオチド−糖部分（ペントース）、燐酸エステルお工び含窒素複素環式塩基 から成るＤＩＷＡ又はＲｌｖＡの単量体単位。塩基はグリコシドの炭素（ペント ースの１′炭素）によって糖部分に結合しており、塩基と糖との組み合わせがヌ クレオシドである。塩基がヌクレオチドを特徴づける。４　ＤＩ、４塩基は、ア テニン（“Ａ“）、グアニン鬼″Ｇ“）シトシン（Ｃ“）お工びチミン（“Ｔ” ）である。Ａ　ＲＮＡ塩基はＡ、Ｇ、Ｃお工びウラシル（Ｕ”）である。

ＤＮＡ配列−隣Ｖ会うペントレースの３′および５′炭素間のホスホジエステル 結合によって互いに連結し合ったヌクレオチドの線状列。

コドン−メツセンジャー肪Ａ　ｔ　ｍ＃Ａ＃）に工って、アミノ酸、翻訳開始信 号又は翻訳終了信号を暗号にする、３ケのヌクレオチド（トリプレット）のｍＡ 配列。？＋Ｊ　エばヌクレオチドトリプレットＴＴＡ　、　ＴＴＧ　、　ＣＴＴ 　、　ＣＴＣ。

ＣＴＡおよびＣＴＧはアミノ酸ロイシン（“Ｌ＃ｕ〃）、ＴＡＧ　。

ＴＡＡおよびＴＧＡは翻訳終止信号、そしてＡＩ″Ｇは翻訳開始信号の暗号であ る。

プラスミド−非染色体性二重鍋ＤＮＡ配列であって、そのプラスミドが宿主細胞 中で複製されるような完全無傷の６レプリコン”から成る非染色体性二重鎖ＤＮ Ａ配列。

プラスミドが単細胞性宿主生物に挿入されると、プラスミドのＤＮＡの結果とし てその生物の特徴は変るか又は形質転換される。例えばテトラサイクリン耐性（ Ｔｅｔｌの遺伝子を担うプラスミドは、それまでテトラサイクリンに感受性をも っていた宿主細胞を、それに抵抗する細胞に変えてしまう。プラスミドによって 形質転換された宿主細胞を“形質転換細胞”と呼ぶ。

ファージ又はバクチリオファージー細菌ウイールス、その多くは蛋白質エンヴエ ロープ又はコートに包み込まれたＩ）ＭＡ配列を含む。

クローニング担体−宿主細胞中でａ製可能のプラスミド、ファージＤＩＶＡ又は 他のＤＩｖＡ配列であって、ＤＮＡの本質的生物学的機能−例えば複製、コート 蛋白質の生成−の付随的損失又はプロモーター又は結合部位の喪失なしに、決定 的方法でＤＮＡ配列が切断される部位である。１ケ又は少数のエンドヌクレアー ゼ識別部位又は制限部位によって特徴づけられ、形質転換された細胞の確認のた めに適したマーカー、例えばテトラサイクリン耐性又はアンピシリン耐性を含む 、前記プラスミド、ファージＤＮＡ又はその他のＤＩＶＡ配列。クローニング担 体は、ベクターとしても知られる。

宿　主−クローニング担体による形質転換時に、七のクローニング担体の複製を 可能ならしめ、その他の生物学的機能、例えばポリペプチド又は蛋白質の生産、 をプラスミドの遺伝子の表現によって達成することができる　゛生物。

クローニング−１個の生物個体又は配列から無性的生殖によりふえた生物集団又 はＤＩＶＡ配列集団を得るプロセス。

表　現−ポリペプチド又は蛋白質を生産するために遺伝子が行うプロセス。それ は転写と翻訳との組み合わせである。

転　写−遺伝子からｍＲＩＶＡ　を生成する過程。

翻　訳−ｍＲＮＡから蛋白質又はポリペプチドを形成する過程。

プロモーター−ＲＮＡポリメラーゼが結合し、転写をはじめる遺伝子ＤＩＶＡ上 の領域。プロモーターは、遺伝子のリポソーム結合部位の前に位置する。

リポソーム結合部位−ｍＲＩＶＡがリポソームに結合する−その結果翻訳が始ま る−のを助けるｍＲＮＡ上の部位をコードする、遺伝子ＲＡ上の領域。リポソー ム結合部位は、プロモーターの後、遺伝子の翻訳開始信号の前に位は蛋白質の特 性を示すアミノ酸配列を暗号化するＤＩＶＡ配列。遺伝子はプロモーター、リポ ソーム結合部位、翻訳開始信号お工び構造ＤＩＶＡ配列を含む。輸出−又は公租 蛋白質又はポリペプチドの場合には、遺伝子はシグナル配列配列も含む。

表現コントロール配列−操作にエリクローニング担体の遺伝子に結合して、これ ら遺伝子の表現をコントロールおよび調節するクローニング担体上のＤ！ＶＡ配 列。

シグナル７１２／ｖＡ配列−ｍＲＩＶＡの鋳型として、ポリペプチド又は蛋白質 のＡ床端の疎水性アミノ酸配列、即ち“シグナル配列２又は”疎水性リーダー配 列”をコードする、ポリペプチド−又は蛋白質−遺伝子中にあるＤＮＡ配列。

シグナルＤＮＡ配列は、ポリペプチド又は蛋白質の遺伝子において、遺伝子の構 造ＤＮＡ配列の直前および遺伝子の翻訳開始シグナルｔ　、４７Ｇ＋の後に位置 する。シグナルＤＮＡ配列は、前駆体ポリペプチド又は蛋白質の特性を有するポ リペプチド又は蛋白質のシグナル配列をコードする。

前駆体−宿主細胞内でシグナル配列をもって台底されるようなポリペプチド又は 蛋白質。

下流お工び上流−暗号Ｄ！ｖＡ配列で、下流は転写の方向、組換えＤＮＡ分子又 はハイブリッドＤ７ｖＡ−生活細胞の外部で端から端まで結合したところの、成 る宿主細胞に感染してそこに保持される性質を有する、異なるゲノムから得たＤ ＮＡセグメントから成る分子。

構造Ｄ）ｄＡ配列−ｍＲｌＷＡの鋳型として、特殊の成熟したポリペプチド又は 蛋白質、即ち活性型ポリペプチド又は蛋白質を特徴づけるアミノ酸配列を暗号化 する、遺伝子内のＤＮＡ配列。

添附図面において： 第１図はプロティンＡをコードするプラスミドＤＩＷＡｔ　ｐｓＰＡ　ｌ　ｌの 環状制限地図の図式的説明図である。地図のサイズはキロペースで与えられ、１ ２時にＥｃｏＲＩ制限部位で開始し、これはベクターｐ　Ｂ　Ｒ３２２内の制限 部位である。Ｅｃｏ　Ｒ１、Ｅｃｏ　ＲＶ　、　Ｈａｎｄ　ｌ　、　ｐｓｔ　Ｉ 　お工びＢａｍ　Ｈｌ　制限部位の位置が示されている。ベクターと挿入ＤＮＡ 間の結合は矢印で示す。

第２Ａ図はプロティンＡをコードする遺伝子の図式的説明図で、種々の領域を示 している。太い線はベクターｐ　Ｂ　Ｒ３２２のＤＩｖＡ＠あられす。Ｓはシグ ナル配列、Ａ−りはあらかしめ確認されたＩダＧ　結合領域、ＥＶｉ＃−ＤＶｃ 同類の領域、セしてＸは、ＩｇＧ結合活性のない、プロティンＡのＣ宋端部であ る。

第２Ｂ図は、第２Ａ図に対応するＤＮＡ配列の詳細な゛ＢｃＬ　Ｉ　、　Ｓａμ ３Ａの制限部位が示されている。サイズはキロペースで与えられ、第１０に記載 したのと同じｈｃ、ｙＲｌ　制限部位で出発する。ベクターｐ　Ｂ　Ｒ３２２と 挿入ＤＮＡ断片との結合部位を矢印で示す。ベクター配列内のＴａｑＩ（２）お 工びＲｓａｌ（Ｉｔのための制限部位は省略した。

第３Ａ−Ｄ図は構造プロティンＡ遺伝子の塩基配列を示す。二つのあり得るプロ モーター（−３５および−１０）と、可能性のあるシャインーダルカルノの配列 Ｉ　Ｓｈｉルｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ　ｚｅｑｔｂｇｎｃｔ）（“−“に工って示 す）を示した。

七のＤ）ｆＡ配列に白米するアミノ酸配列も示すＩ　ＩＵＰＡＣアミノ酸省略記 号を用いである；　Ｊ　、　ＢｉｏＬ　、（、’Ａｇｍ　。

２４１　、５２’７および２４９１１１９６６１１゜スジエダーｋ　（Ｓｊ６ｄ ａｈｌ　ｌが以前報告したアミノ酸配列と比較して異なる５つのアミノ酸（残基 Ｃ１９、１０１、１２０、１９９および２７３）を記載し、同時に、領域りの相 当するアミノ酸と異なる領域Ｅの８つの残基（５０残基中１も記載し穴、、Ｓ、 Ｅ、Ｄ。

Ａ、Ｂ、Ｃお↓びＸ領域の開始残基は矢印で示す。

第４図は、第３図の領域り、Ｅ間の連結を示すヌクレオチド配列ゲルのオートラ ジオグラフである。塩基配列決定Ｉ　Ｍａｘａｍ等による、Ｐ、７ｖ、Ａ、Ｓ、 １４．５６０−５６４１１９７７１１は、第２図のα９　ＡＡ　の位置のＢｃｌ 　Ｉサイトを標識化したＤａＡＵ片で行なわれ次。部分的に化学的に分解した産 物を８チポリアクリルアミド塩基配列決定用ゲルニ溶かした（　Ｍａｉｚｔｌ　 Ｓ’　、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　１ｒＬＶｉｒ。

の５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を示す。・−ｐＢＲ３２２お工びｐ ｓｐＡ　ｌは、七れぞれのプラス゛ミドを担っているＥ　、ｃｏｌｉ細胞抽出物 を示す。ＳＰＡは市販のＳ　ａｔｂｒｅｔｂｓからのプロティンＡである（ファ ーマシア社、スウエーテン国　ウプサラ）。アゾン２　（ＡＤ２１蛋白質をサイ ズマーカーとして用いた。

第６図はプラスミドｐｓＰＡ　ｌ　５と、アンピシリンおよびクロラムフェニコ ール耐性をコードする遺伝子をあられすＡＭＦお工びＣＭＬとの図式的地図であ り、Ｏｒｉは複製起原であり、ＳＰＡは構造プロティンＡ遺伝子を示ラスミドの 構造の図式的説明図である。二、三の制限部位が示されている。ボックスは構造 遺伝子を示し、矢印は方向を示す（開始コドンから停止コドンまで）。複製起原 はＯｒｉで示される。ＡＭＰお工びＴＥＴは、七れぞれアンピシリンおＬびテト ラサイクリン耐性をコードする遺伝子である。ＰＲＯＴ　Ａはプロティンｌをコ ードする遺伝子で、ＬａｃＺはβ−ガラクトシダーゼの八−末端をコードする遺 伝子であるｔ　Ｒｉｉｔｈｇｒ　５　、核酸研究（７ｖｔＬＣＬ。

Ａｃ１ｔｉ　Ｒａｇ、　ｌ　９　ＡＯ８７−４０９８＋　１９８１１゜第８図は プラスミドｐｓＰ、４１６の構造の図式的説明図である。用い喪省略記号は第６ 図と同じである。Ｓ、Ｅ。

Ｄお工びＢは第２図のそれと同じで、Ａ′お工びＣはそれぞれ、プロティンＡを コードする遺伝子のＩｇＧ結合領域Ａお工びＣの部分を示す。

第９図は、プラスミドＰＳＰΔ１６におけるプロティンＡ遺伝子の３′一端末周 辺のヌクレオチド配列と、それに対応するアミノ酸配列を示したものである。ｘ ｘｘは、新しい停止コドンを示す。

第１ＱＡ−Ｃ図は、第２図と同様に、プラスミドｐｓＰＡ１５（ＡおよびｐＳＰ Ａ　ｌ　６　（（、’ｉを対応する制限地図（Ａと組み合わせ九説明図である。

太い直線はプロティンＡ構造遺伝子をあら°わす。

第１１図は、プロティンＡをコードする遺伝子（ロ）を含むｌ、　３　Ｋｂ　の Ｔａｑ　Ｉ　−ＥｃｏＲＶ　Ｄ　Ｎ　Ａ　’ｇ＋片（荀ヲ塩基配列決定して第３ 図に示す配列を得るために用いた塩基配列決定戦略（Ｃ’ｌの図式的説明である 。

実施例における出発材料、緩衝液、細胞培地お工び実験室的方法の段階は次の工 うである。

出　発　材　料 細菌性宿主：実施例ではＥ、ｃｏｌｉ　Ｋ　ｌ　２の４菌株を用いｆｃ；＃ＢＩ Ｏｌ−ボイアｔ　Ｂｏｙｇｒ　ｌらが／　ｌＭｏ１　Ｂｉｏｌ。

Ａ　Ｉ　Ａ５９−４７２１１９６９１　に記載し喪もの；　２５９−マコフ（Ｉ ａｃＯｂ　Ｆ、ｌお工びウオ／ｌ／　−ｑ　ｙ　（ｊｌ’ｏｌｌｒｎａｎ　Ｅ　 、Ｃ，１に記載；ＧＭＩ６１−１リウスｔ　Ｍａｒｉｕ、、？Ｍ　、Ｇ　、　ｌ 　がＭｏ１ｅｃ　、　ｙｅｎ　、Ｉｇｎｅｔ　、ｌ　２７　４７−５５　＋　１ ９７３１に記載ＨＲＲＩ　ｄｇＡＪｌ　５　（ランゲイｌ　Ｌａｎｇｅｙ、ｌ− ら、ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ　、Ａｃａｄ　、　Ｓｃｉ、ＵＳ　Ａ　、７２　１２５４−　１２５７ ｔ１９７５１１゜〔これら菌株はスウェーデン国つプサラの生体医学センター微 生物学部Ｌ／Ｖｌで入手できる〕。

又、次の４つのブドウ状球菌株も用いた：ｇｐｉｔａｒｍｉｄｉｚ　２４７１− 　ｏ−ゼンドルフｌ　Ｒｏｓｔｎｔｔｏｒｆ　ｌらがＪ　、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ 、Ｉ　２０　二６７９−６８６　ｔ　１９７４１に記載、スイス国のチューリッ ヒ大学医学部微生物学研究所から入手； 一スタフィロコッカス・キシロサスＫＬ、　＋１７（Ｓ　。

ｘｙｌｏｓｗｓ　Ａ”　Ｌ　、Ｉ　１７１　’；’−’−ライフ　ｘ　ルｌ　５ ｃｈｌｔｉ　−ｆａｒ　１らＩｎｔ、　／　、５ｙｓｔ　、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ 　、２５　：　５０−６１ｔ１９７５１１お工びシュライフエルら、ａｒｃｈ　 ０Ｍ１ｃｒｏｈｉｏＬ　、Ｉ　２２　：９３−１０１１　＋９７９　］に記載； ドイツ連邦共和国、ムユニツヒエ科大学微生物学研究所から入手；−スタフィロ コッカス、アウレウス５ＡＩＩ３（Ｓ。

ａｔＬｒｇｗｓ　ＳＡ　１１３１−イオルダネスクｌ　ＩｏｒｒＬａｎａｓｃｕ 、、　ｌらが記載ｔ　／　０ｇｔｎ　０Ｍ１ｃｒｏｂｉｏＬ　、９６　：　２７ ７−２８１１１９７６目−スタフイロコツカス、アウレウス３２０１　Ｓ、ａｔ Ｌｒｇｗｚ３２０）−スウェーデン国つプサラの生体医学センターマイナス変異 体；ジョンソン（Ｊｏｎｎｒｏｎ　ｌらにエフ記載される、ＣＩＬｒｒ　０Ｍ１ ｃｒｏｂｉｏｌ　、　８　：　−（１９８３１゜は、ボリヴア−（ｆ３ｏ１ｉｖ ｅｒ　ｌらかつ＜ｖＸ報告したｐＢＲ３２２（遺伝子２．２９−１１３　ｔ　１ ９７７１ｉソベロン（５ｏｂｔｒｏｎ　ｌらがつくり、報告したｐＢＲ３２８（ 遺伝子らがつくり、報告したＰＴＲ２６２を遺伝子−Ｌノー１２３−１２７＋　 １９８０１）　ｉエールリッヒ（Ｅｈｒハｃｈ　Ｓ、Ｄ、ｌがツ＜す、報告し７ たｐＨＶ　ｌ　４　（ｐｒｏｃ、ｋＪｔ５　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、Ｕ　Ｓ　Ａユ 免。

３２４０−３２４４１１９’７ｇ　ｌ　；　ｈ−工びブリムローズＶｒｉｍｒｏ ｓｅ　。

Ｓ　、Ｄ、ｌがつくり報告したｐＨＶ　３３１プラスミド土、１９３−２０１　 ＋　１９８１１；ルータ−Ｉ　ＲＱｔｈｇｒ　ｌらがツ＜り、報告ＥＷＡお工び ２０１′ｒＬＭトリス（ｐＨ８，Ｏｌ）　ＩＪ　スＥＩｆｒＡ　Ｉａｍｅ　（Ｔ Ｅ”）：０、　ＯＯ１Ｍ　ＥＤＴＡ　＋　Ｏ，ＯＩ　Ｍ　）リスｔｐＨ７，８１ 酵母抽出液１％およびブドウ糖０．５　％　ｉｌ、５．Ｍグ１１セリン燐酸４ｍ ｔを　Ｃ”Ｙブイヨン１００ｍｔ　に加える。

コーティング緩衝液（炭酸塩−重炭酸塩−ｐＨ９，６１：１、５９　ｆ　Ｎａｘ 　ＣＯｘ　、２９３　ｔ　ｈａＨｃＯｓ　。

α２　ｆ　ＩＶａｌＶｓ　、これに蒸溜水を加えて１ｔ８、　Ｏｔ　ＮａＣＬ　 、　０．２　ｋＪｔ　ＰＯ４，２９ｔｈａｔ　ＨＰＯ＋　ＸＩ　２　Ｈｔ　Ｏ， α２　ｔ　ＫＣＩ　、α５ｍｌ■ ＴｗｅｔｒＬ２０およびα２　ｔ　ＩＶａｈ８．　コれに蒸溜水を加えて１ｔに する。ｐＨ７，４゜ジェタノールアミンＩｌｌ衝液＋　ｏ％：９７　ｍｔ　ジェ タノールアミン、５ｏｏｒｒＬｔ蒸溜水、０．２　ｆ　ＩＶａＩｖｓ、お工び１ ００　Ｑ　ＭＳ’Ｃ４×６属Ｏｉ　ｐＨを１描Ｃｔで９８に調節する；蒸溜水を 加えて１ｔにする。

ルリアーブイヨ７　（ＬＢ　ｌ　（ＬｔｔｒｉＯ−１６ｒ（１１！Ａ　、　’Ｌ Ｂ“）：１０ｆＤげＣＯトリプトン、ＳｔＤ番ｆｃｏ酵母抽出液、α５　ｔ　Ｎ ａＣＬ　２　ｒｎＬ　Ｉ　Ｍ　）ＷａＯＨ：１　Ｍ　ＩＷａＯＨでｐＨ１，０に 調節；圧熱滅茜株１０　ｍｔ　２０チ　ブドウ糖を加える。

お工びＯ，ＯＯ２Ｍ　Ｅｆｆ４゜ 実験室的方法 実施例では成る方法を繰返し実施した。別に説明しない限り、それは毎回正確に 次の工うに行われ罠。

形質転換ニブラスミドＤＩＶＡＶＣＬるＥｃｏｌｉ　Ｋ　ｌ　２の形質転換は、 モ１１ソンｔ　Ｍｏｒｒｉｓｏｎ　、　Ｄ、Ａ、　ｌが６酵素学における方法１ 　ｋｆｔｔｈｏｄｓ　ｉｎ’　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　ｌ”　（ａｃａｄｅｒａ ｉｃｐｒｅｓｓ　６　Ｂ　、　３２６−３３１　ｆ　１９７９１１に記載した通 りを正確に行った。形質転換する細胞は、適当な抗生物質、即ち３５μｆ／ｍｔ のアンピシリン又は２５μｆ／／７７Ｌｔのクロラムフエニコールヲ含むＬＡプ レート上で単一コロニーを平板培養することにＬｖ、一般的方法でプレート上で 選択力、Ｔお工びワイスブルム（ＷｅｉｓｂｌＬＬｍ　、　Ｂ　ｌの記載通り正 確に行゛つた（　／　、Ｂａｃｔｇｒｉｏｌ、　ｌ　２　ｌ　、　３５４−３６ ２ｔ１９７５１゜プラスミドのための多数のクローンを数えるためには、バーン ホイム（Ｂｉｒルｂｏｉｍ　Ｈ，Ｃ，ｌお工びドリー１１）ｏｌｙ　／、　ｌが 記載した”メニアルカリ法”を正確に用いた（核酸研究７　、１５１３−１５２ ３　＋　１９７’？　＋１゜ＤＩＶＡの制限酵素による消化二ニューイングラン ドＢｉｏ、Ｌａｂｚ　、　Ｗａｌｔｈａｒｎ　Ｍ　Ａ　、　Ｕ　Ｓ　Ａ　、から 購入した通常の制限酵素でＤＩＶＡを切断した。制限酵素を、通常の濃度および 温度で、ニューイングランドＥｉｏ　Ｌａｂｚ　が推せんする緩衝液と共にＤＮ Ａに加えた。

ＤＩＶＡ断片の連結：すべてのＤＩＶＡ断片は、１４℃で一晩、ニューイングラ ンドＥｉｏ　Ｌａｈｓ、Ｗａｌｔｈａｍ　、Ｍ　Ａ　、。

ＵＳＡ、から購入したＴ４ＤＩＷＡ＋４カーゼで、この販売会社が推せんする緩 衝液中で連結反応させた。

スーパーコイルプラスミド、およびマクレオチド１０００〜１０．０００の長さ のＤＮＡ断片を分離するために、０．７　％アガロースゲル電気泳動をヘリング （Ｂｅｌｌｉｎｇ　１等の記載通り正確ニ行ったＩ　Ｊ　、Ｖｉｒ、Ｉ　４　、 １２３５−１２４４〜４０００　の長さのＤ７ＶＡＷ１片を分離するために、５ チポリアクリルアミドゲル電気泳動を、マクサム（Ｍａｘａｍ　ｌＳ］記載通り 正ｉＫ行ツｉ　ｔ　Ｐ、ｈ、Ａ、Ｓ、　７４　、５６０−５６４１１９７７１１ ゜分子量５．０００〜１２０．０００の蛋白質を分離するために１３係ポリアク リルアミドゲル電気泳動をマイラエル（Ｍａｉｚｅｌ　＋等の記載通り正確に行 ったＩＭｅｔｈｏｄｓｉｎＶｉｒ、５．　１７９−２４６１１９７０１１゜ゲル 浴出：ＤＮＡ断片は、ポリアクリルアミドか又はアカロースのゲル細片から、マ クサムｌ　Ｍａｘａｒｎ　１等の記ｔ！り正ｉＫ溶ｔｔｌｔＬ７’ｊｌＰ、＃、 、４．．５．７４．５６０−５６４　＋　１９７７１１゜ し、それらのＤ！ＶＡ配列を、マクサム（・Ｗａｘａｍ　１等が記載した通Ｖ（ 同上）正確に決定した。エンドヌクレアーゼにより生成ｌまたＤＮＡ断片の５′ 末端を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ベーリンガー、マンノ１イム、西ドイ ツｌ　Ｂｏｄｈｒｉｎｇｔｒ　、　ＭａｒＬｎｈｅｉｍ　、　Ｗｅｓｔ　１ｅｒ ｎａｎｙ　１１を用い２ て、（γ−ｐ＋Ａｒｐにューイングランド・ヌクレアー、Ｕ　Ｓ　Ａ　ｉ　２７ ００　Ｃｉ／ｍｍｏｌｒで標識化した。

プロティンＡ検出のための細胞溶解物の生成：　Ｅ、ｃｏｌｉクローンを３７℃ で５０ｍｔ　ルリアブイヨンｔＬＢｌ中で３５μｆ／ｍＬのアンピシリンを加え て、−晩増殖させた。

遠心分離後、細胞を５７７！Ｌ）リス−ＥＩＪｒＡ１０．０５Ｍ。

ｐＨｇ、　５　、０．０５　Ｍ　ｌ　に懸満させ、遠心分離した。その細胞を同 じ緩衝液５　ｍｌ　に再懸濁させ、リゾチームを最終濃度２■／ｍｔになるよう に加えた。３７℃で１時間おイア’（後、溶解産物を５ｏｒｖａｌｌ　Ｓ５−３ ４　回転器で１５．００Ｏｒｐｍで、１５分間遠心分離した。上澄液を集め、プ ロティンＡのアツセーを行った。

ＥＬＩＳＡ試験（ｅｎｚｙｒＩＬｅ　１ｉｎｋｅｄ　ｉｍｍｕ、ｎｏ　−５ｏｒ ｂｅｔｂｔ　ａｓｓａｙ’　１を用いた。そのテストには、実効電荷をもたない （中性）特殊のミクロタイタープレート（タイターチックＩＴｉｔｔｒｔｇＡア ムステルダム、オランダ国）を用いる。このプレートの凹みはヒトＩ！ＩＧ（カ ビ（Ｋａｂｉ　ｌ、スウェーデン国）でロチインＡを１９０分子のＦｃ一部分に 結合させる。残る遊離ＦＣ−サイトの量を、プロティンＡに結合したアルカリ性 ホスファターゼを加えることによって滴定する。

凹みを洗った後、Ｐ−ニトロフェニール燐酸塩を、アルカリ性ホスファヂーゼの 基質として加える。

アツセー：ミクロタイタプレートの凹みに、コーチング緩衝液に５００μｙｉｍ ｔの割で溶かしたヒトＩダＧｌカビ＋Ｋａｈｉ）、スウェーデン）溶液′５０μ ｔを満たし、七のプレート室温で１時間インキュベートした。凹みを七〇〇 後３回７’ＢＳ＋０．０５％Ｔｖｕｇａｎ２０で洗った（アツセーにおいて洗浄 する時は必ずこれで洗った）。そしてテストすべき細胞分解産物をＰ　Ｂ　Ｓ　 ＋　０．０５％Ｔｗｅａｎ”２０　テｅ） 二倍逓減稀釈した。ｐＢｓ＋Ｑ、　ｌ　％　Ｔｗａｇｎ　２０をそれから加え、 １時間室温でインキュベーションを行った。それから凹みｆ：３回洗い、プロテ ィンＡ−アルカリホスファターゼ抱合体（″免疫化学”−ｐｔｒｇａｍｏｒＬＰ ｒｅｓｓ　１９６９　。

ＶＯＬ、６　、Ｐ　、４３−５２　、に記載の通り正確に生成した）５０μｔを 加えた。室温で１時間インキュベーションした後、凹みを再び３回洗い、アルカ リホスファターゼ基質Ｉ　Ｓｉｇｍａ　ｌ　Ｏ４＝Ｐ−ニトロフェニルーホスフ ェｋｌ、）、Ｉ　”Ｉ／ｍｌ　ｌ　Ｉ　ＯＯ１１ｔ　を加えた。酵素反応は、３ ０分後３　Ｍ　ＮａＯＨＩ　Ｏμを加えることによって中断された。

結果を肉眼で調べた。プラスの結果、即ちプロティンＡの存在は、無色の反応混 合物である。なぜならば、七の抱合体と結合すべき１９Ｇ上の遊離Ｆａミーサイ トないからである。マイナスの結果−即ち蛋白質が存在しないこと−は、黄色と して観察される。この黄色は結合した抱合体のアルカリホスファターゼの活性に よる。プロティンＡの定量は、濃度既知のプロティンＡ標準溶液とテスト試料と を平行して逓減２倍稀釈法を用いることにニジ行われた。

（以下余白） 実施例Ｉ ｎｏｖ　−１４２ＣＳ）ａｓｔｒａｍ　Ｊ、　Ｅ、らによりＪ、　Ｂａｃｔｅｒ ｉｏｌ。

ン国、ウプサラの生体医学センター、微生物学部（＃）ｉ＼ら入手〕をＣｙブイ ヨン中で０Ｄ５４ｏ＝０．２になる１で培養した。ｉｉ培養液１１を５ｏｒｖａ ｌｌ　ＧＳＡ回転回転器　０００　ｒｐｍＴａ心分離ｔ、　”ｒ収ｓ　Ｌ、　０ ．９　％　ＮａＣ１１００ｍｌおよび１０ｍＭ　）リス、　ｐＨ７，２、中にＦ ＬＢ濁し、　５ｏｒｖａｌｌ　ＧＳＡ回転回転器＋ＯＯＯｒｐｙ（で遠心分離し た。細胞ペレットを最終的に１ｏｄ２５ｑｂスクロース、５０ｍＭトリスｐＨ１ ，２に再懸濁し、３７℃で３０分間、リゾスタフィン処理（１５μｙｍｔ）をす ることにより、グロトプラストを作製した。その７゛ロトグラストは１０−トリ トン混液および５ｄｌＨ，Ｏの冷加により溶解（ＺｙＳｇ）Ｌ７’ｃｏその混合 物を氷上に放置し、完全に溶解するまで時々おだやかに振とうし７１ｃｏＤＮＡ をプロテイナーゼＫ　（０，１■／−）および５ＤＳ（ラウリル硫酸ナトリウム ）（０，５チ）で１時間３７℃で処理し１等容量のフェノールで５回抽出を行な い、最後に２回クロロホルム抽出を行なう。酢酸ナトリウム、ｐＨ１，０を０． ３Ｍまで加えた。セして１）ＩＶＡを２谷菫の冷エタノ９９％の冷エタノールで 洗った。沈澱物をＴＥｙ衝液に。

３７℃でゆっくり混合しながら溶かした。最後にＩ）Ｎｉ４をＴＥ９衝液に対し て透析した。

Ｂ、染色体ＤＮＡの部分的消化および供与体断片の分取：１段階で得られた精製 ブドウ状球菌ＤＮＡを種々濃度の制限酵素μ＋ｏ　ｆで消化した。各反応は１μ ダＤＮ、４を含む５０μノ容量で行なわれ、６５℃、１０分間の加熱不活性化に よって反応は停止した。消化程度をアカロースゲル電気泳動によって調べた。５ 一中ブドウ状球薗Ｄ　Ｎ　、４１００μダを実験的に消化して、５〜２０キロベ ースの大きい部分的切断産物を与えるＭｈｏｌの濃度を選んた。この消化物を熱 で不活性化し、エタノールで沈澱させ、ＴＥ１００μｔに浴かし、ＴＥ緩衝液中 で１０−３０％スクロース勾配によって沈降させた。ペックフッ５ｗ４９回転器 を５℃。

３５τｐｒｎ　、　２０時間使用した。勾配フラクションを０５一つつのフラク ションにしてとり、その各々をアカロースゲル電気泳動によって分析した。８− １０Ｋｂ断片を含むフラクションを集め、２容如゛のエタノールで沈澱させ。

ＴＥ緩衝液に溶解した０ 消化し、酵素を６５℃、１０分間加熱により不活性化した。５′−燐酸を取り除 くために、ＤＮＡをアルカリホスファターゼで処理した。この処理によって、ベ クターに再連結する可能性は除去された。反応は、５０ｍＭト＋Ｊス。

ｐＨ’１．９．５％ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキサイド）、２よひ仔つシ腸アル カリホスファターゼ１単位を１−とじて、そこで３７℃、３０分間行なわれた。

０，５％ＳＤＳを加え、ＤＮ、４をフェノールで２回抽出した。痕跡のフェノー ルをエーテルで除去し、ＤＮＡを２容量のエタノールで沈澱さゼた。

菌ＤＮΔのオリジナル・クローニングのために選はれたベクターｐＢＲ３２２は 、テトラサイクリン（ｔｅｌ　）およびアンピシリン（αｍｐ　）耐性をコード する。Ｃ段階に述べたように、旦ＨＩ消化によってｐＢＲ３２２が開かれ、ｎｔ ｖ断片が挿入されると、テトラサイクリン耐性の遺伝子は不活性化される。テト ラサイクリン感受性に関して形質転換細胞をテストすることにより１組換型を見 出すことができる。いわゆる負の淘汰（ｎｅｇａｔｉｖｇ　５ｅｌｅｃｔｉｏｎ ’）である。Ｃ段階によって処理したｐＢＲ３２２の０．５μダと、Ｄ段階によ って処理したブドウ状球菌ＤＮＡ２μｙとを混合し、全量２５μｔにして一晩１ ４℃で連結を行なった。その混合物を用いて、アンピシリン耐性（３５μｇ／ｍ ｅ）に関して選択したＥ、ｃｏｔｉ　２５９を形質転換した０形質転換細胞を取 り出し、テトラサイクリン１０μｔ／ｍｅを含むプレートと、アンピシリン３５ μｆ／−を含むプレートとにそれぞれ線条接種した０アンピシリン上では増殖す るがテトラサイクリン上では増舛しない形質転換細胞を組換型と考えた。

Ｅ、プロティンＡのプラスのｐ：、ｃｏｌｉクローンの恢出：Ｄ段階から侍だ５ ００ケのテトラサイクリン感受性クローンを、アンピシリン（３５μｔ／ｍｌ） を含むＬＡプレート（Ｌ、４−培地で作製）上で個々のコロニーとして増殖させ た。２５コロニーからなる群（複数）を集めて、３５μｔアンピシリンを含むＬ Ｂブイヨン５０ｍ１に接種し、−晩培養した。リゾチーム＋ＥＤＴＡ処理により 細胞抽出液をつくり（実験室的方法の項に記載）、実験室的方法の頂に記載した エライザ（ＥＬＩＳｉ４　）テストによってプロティンＡを試験した０これらク ローン群の一つはプラスであった。そしてこのプラスの群を更に、５クローンか ら反る５群に分け、上記のように増殖させ、処理した。

遂に、最後の試験系列で、１ケのプロティンＡ生産クローン、プラスミドｐｓＰ ／１１を含むＥ、ｃｏｌｉ　Ｓ　Ｐ　／ｌ　ｌ　ｌが見出された。このクローン の培養物は、ドイツ微生物収集所（ＩＴＥＭ）（ドイツ連邦共和国、３４００ケ ンチンケングリ−セパツバ　シュトラーセ８）のコレクションに１９８２年７月 １２日に寄託され、　／ＶｉＬ）ＳＭ　２４３４と指定子のサブクローニングお よび塩基配列決定のための情報を得るために、Ｅ段階で得られたｐｓＰＡ　ｌの 制限地図を作った。これは第１および２図に示した酵素で、１回、２回および／ 又は３回消化を行なうことにより達成された。

第２図は、プロティンＡをコードする領域のより詳細な地図を示す。柚々の制限 断片のサイズを総割すると。

ｐｓＰ、４１では総サイズ１２に６となり、従って与えられたグトウ状球菌断片 は約″７．６　ＫＡになる。

遺伝子の位置を定めるためにいくつかのサブクローンがつくられ、プロティンＡ 活性について試験された。Ｅ段階のプラスはドｐｓＰＡＩ　２μｔおよびｐＨＲ ３２Ｂの１μｔを制限給および形仙転換は先に災験βワ方法の項に示したように 行なった。組換型を言ひコロニーは、Ｄ段階に記したのと同ａな方伝で、クロラ ムフェニコール耐性シ・よぴテトラサイクリン感受性であるように運んだ。Ｄ段 階による制限分析の結果は、８クローンすへてか、第１区のｐｓＰＡＩ制限地叱 のｏ、　１．；　−ｚｓ３ｘｂに和光する断片に白米する’１１５Ａｂ　Ｅｃｏ 　ＲＶ挿入配列（１ｎｓｅｒｔ　）をもツｐＢＲ３２８を含んでいることがわか った。すへてのクローンは同方向に挿入配列をもち、挿入された遺伝子に機能的 −←ブーフロモーター・読み取りを与える０ このｐＳＰＡ３と呼ばれるプラスξドを含む一つのクローンを今後の研究のため に選んた。プロティンＡ遺伝子がそれ自身のプロモーターから転写され得るのか どうかを調べるために、プラスばドｐｓＰＡ３を、それをプラスばドｐＥＶ　＋ 　４に入れて再クローニングを行なうための源泉として用いた。ｐＢＲ３２２に 白米するこのプラスばドはグｖ≠−■制限部位にｚ８ｘｂ挿入配列を有し、この ために９？プロモーターを不活性化している。従ってこのプラスミドのＥｃｏ　 ＲＶ制限部位にある挿入配夕１ｊはすべて、　ｂ、ｃｏｔｉＲＮＡポリメラーゼ によって転写されるためにはそれ自身の機能的プロモーターをもだなけれはなら ない。１μｔのｐｓｐＡ３と１μｔのｐｌｉＶ　Ｉ　４を供アＲＶで切断し、混 合し。

Ｔ４−リカゼで処理し、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｅ　Ｂ　１０１を形質転換するために用 いた。切断、連結および形質転換は前述のように行なった。コロニーは、Ｄ段階 に記述したように。

アンピシリン耐性で、テトラサイクリン感受性であるように選んだ。

これら５２のコロニーからのプラスばドを実験室的方法の項に引用した１ミニア ルカリ法”によって分離し。

０、７％アカロースケル電気体動にかけることによって試験した。これらのクロ ーンの中の一つは前に述べた。

ｐｓＰＡ３からの２１５入り竺ＲＶ挿入配列をもつ、　ｐＨＶ　ｌ　４の組換型 であることがわかった。この、　ｐｓＰ、４５と呼はれるプラスミドを含むクロ ーンは、　ＥＬＩＳＡ法を用いてテストした時、プロティンｌプラスであること がわかった。

結論として、その挿入配列は、　Ｅ、ｃｏｌｉ、　ＩＩ　ＢＩＯＩにおいても機 能的であるところの、プロティンｌ遺伝子中にブドウ状球菌プロモーター読み取 りを含むに違いない。

サブクローリングの結果は、ＤＮＡ−塩基配列決定は。

地図の１．４Ｌの位置、　Ｂｉｎｄ■サイトで開始され１時計の針と逆方向に行 くことを示した（第１図）。塩基配列決定分析のためのＤＮΔ材料は精製ｐｓＰ Ｉ３であった。プロティンｌの部分的に知られているアミノ酸配列（Ｓ）　６ｄ ａｈｌが以前報告した）を、得られたＤＮ、４配列と比較すると、遺伝子のＩＩ ＩＮＤｍ−サイトの位置が定位できるであろう。

第２．第３図に示したように、この制限部位はプロティンＡの領域ｌ内にある。

Ｆ段階に従い、史に分析すると。

ついて、制限部位が決定された（第２図）０これらの部位を用いて１又は両方向 に塩基配列決定を行ない、大抵の揚台１両ストランドのヌクレオチド配列が明ら かにされる。ｋＡ基配列決定のために用いる戦略全量ＩＩ図に大１かに示した。

ＢｃｌｌはＥ、ｃｏｌｉ　ＨＢ　ｌｏｔがら精製された１）　Ｎ　Ａ　ｔ　切ｋ 　Ｌ、　’ｌ　イカラ、　ｐｓＰ４３　Ｂ　、　鉢Ｘ　１）　−７２二７メチラ ーセに欠けるＥ、ｃｏｌｉ　ＧＭ　１６１株に入れて形質転換させた。この株か ら精製した。ｐＳＰＡ３１ｚ　Ｂｃｌ　Ｉで切断し。

塩基配列決定をした。

第３図は全ブドウ状球菌プロティンＡ遺伝子のＤＮＡ配列を示す。ＤＩＶ４配列 から引き出されたアミノ酸配列も、５ｌＱｄａｈＬにより提案された配列と比較 して異なるアミノ酸と共に示されるＯＳノｔ３ｃｔａｈｌはＳ、αｕｒｇｕｌ　 の別の菌＆ヲ用いた（　Ｃｏｗａｎ　Ｉ　）　０第３図に示したＩ）ＮＡ配列は 、Ｅと呼ばれるＮ−末端部分が、ＳノＱｄ、ａｈｌが報告した反復領域Ｄ−Ａ− Ｂ−Ｃに似ていることをあられした。この５０のアばノ酸から成る領域には、領 域りと一致する４２のアミノ酸がある。

領域Ｅにはシグナルペプチドの特徴をもったリーダー配列が先行し、このシグナ ルペプチドは１１のアミノ酸から成る塩基性領域を含み、それに続いて２３のア ミノ酸から成る疎水性部分が延ひる。正確な切断部位は未知でるる、しかし考え られる部位は、アラニン残基３６゜３７又は４２、多分３６の部位であろう。も しそうならは３７−４２のアミノ酸配列がプロティン１分子の領域Ｅに−する。

翻訳の開始コドンはグラム陽性−で報告されたその他の二、三の開始コドンに知 似したＴＴＧ″′Ｃるる。６ケのヌクレオチド上流ＴＴＧ％シャインーダルカル ノの配夕１１　（５ｈｉｎｅ　’Ｊ、２工ひＩ）ａｌｇａｒｎｏ　Ｌ、により定 義された：　Ｎａｔｕｒｅ（ロンドン）　２５４　、３４−３８　（１９７５） ：］が見出され、これは他のグラム陽性リポソーム結合部位と共通する特徴を多 く有する。その他の上流の２ケの（多分）プロモーターが−３５２よひ−１０に 見出される（第３図）。

全蛋白質をコードするのに必要な塩基数を計算すると（！：　Ｋ　ヨッテ、　ｐ ｓＰＩＩ　モｐｓＰＡ３も完全なプロティンｌ構造遺伝子を含むと思われる。

を担持するＥ、ｃｏｌｉ細胞を、アンピシリンを３５μｔ／−の割合で加えたＬ 　Ｂ　４０Ｏｒｎｌ中で一晩増殖させた。細胞培養液を５ａｒｖａｌｌ　ＧＳＡ −回転器で６００　Ｏｒｐｍで１０分間遠沈し、細胞ペレットを２０ｙ７Ｅ（０ ，０５Ｍ、７＋Ｈ８，５’、０．０５Ｍ　ＥＤＴ　Ｉ　）中で洗い、再び上記の ように遠沈した。今度は細胞ペレットを１５ｄのプロテアーゼインヒビター緩衝 液ＣＯ，０２／Ｖ　燐酸カリウム、　ｐＨ７，５、Ｏ，Ｉ　Ｍ　ＮａＣ１。

０．５％デオキシコール酸ナトリウム、１％トリトンＸ−１００、Ｏ，Ｉ％ドア ’シＡ（ｉｔ酸ナト！ＪつＡ　（Ｓ　ＤＳ　）　、　１ｍＭ沸化フェニルメチル スルフォニル（ＰＭＳＦ）Ｅ　中に再ａ濁した。それから細胞を１ｑＳＥ、〉′ 二ケータ−で、氷上で４×４０秒間音波処理をし＋　１５．００Ｏｒ７ｍ　（５ ｏｒｖａｌｌ　５５−３４回転器）、１０分間遠心分離した。上澄液を集め。

酢酸ナトリウム緩衝’／Ｉｆ、　（０，Ｉ　Ｍ酢酸ナトリウム、２チＮαＣｔ、 　ｐＥ　５．５　）で平衡状態にした１９Ｇ−セファローズ■４Ｂ　カラム（フ ァーマンア社、ヌウェーテン国つプサラ）を通過させた（：ｌｉ）ｇｌｍら、Ｆ ＥＢ　Ｓ　Ｌｇｔｔ、２８７３−７６（１７２））。それがらカラムを前記のよ うに同じ緩衝液で洗い、吸看さｎた蛋白質をグリセリン緩衝液で浴出した（　０ ．　ｌ　Ａｆグリシン、　２　％　ＮａＣ１，ｐＨ３，０）　ｏ　溶出７　ラク ションに１７．容量の１００％トリクロロ酢酸（ｒ　Ｃ，４−）を加えた。

その試料を６時間、＋４℃で沈澱させ、エッペンドルフ遠心分離器で、１，２０ ０Ｏｒ７ｍで１５分間遠沈した。ペレットを１耐冷アセトン中で１回洗い、前記 のように遠沈した。残るペレットを乾かし、ＴＥに溶かし、プールして全量４０ ０μｌとした。

蛋白質濃度を測定し、２０μｔを１３％ｓｎｓ・ポリアクリルアミドゲル上で１ ００　Ｖで１２時間分析した。そのケルをアミドブラック（０，１％、４５％メ タノール、１０％醋酸）で染色した。

ｐＢＲ３２２を担持する細胞からの抽出物を平行してつくす。

上記と同量をケル上で分析した。ケル電気泳動の結果を第５図に示す。これはｐ ｓｐＡｌを担持するＥ、ｃｏｈ中に生成したプロティン４が、　Ｓ、ａｔＬｒｇ ｕｓｉｈらの純粋プロティンＡ（ファーマシア社）と同じように移動することを 示している。ｐＢＩｔ　３２２プラスεドを担持する＃胞からの抽出物はこれに 札当する蛋白質をもたなかった。

Ｅ、ｃｏｌｉ中のプロティンｌの局在の分析：グラム陽性菌では細胞外にあると ころの酵素は、グラム陰性菌では、いわゆるペリ１ラズム又は細胞周辺腔の。

内側膜と外側膜の間に局在すると七がよくるる。プロティンＡは細胞壁にあり１ 例えばＳ、αｕｒｇｕｌ　の細胞膜の外側にあるから、　ｐｓｐＡｌを含む形質 転換Ｅ、ｃｏｌｉ細胞におけ＋４５５（１９６７）’）滲透衝撃法を用いた。こ の方法は。

蛋白質を細胞周辺腔からは放出するが、細胞内酵素は放出させない。細胞周辺腔 に見出される蛋白質の例としてアルカリホスファターゼを用い、ａ砲門蛋白質の 例としてフェニルアラニン−ｔＲＮΔ合成酵素を用いた０ｐｓＰ４１を含むＥ、 ｃｏｌｉの培養は、アルカリホスファターゼの合成を抑制解除（ｃｔｇｒｇｐｒ ｇｚｓ　）するために、低燐酸塩培地（Ｎｅｔｔ、　Ｂｏｇ、およびＩｈｐｐｇ ｌ、　Ｌ、　４の記載通り正確に；　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｇｍ、　２４０　；３ ６８５−３６９２　（１９６５）　）で行なった。−晩培養した培養液（７）１ １（約７．５　Ｘ　Ｉ　Ｏ’Ｃｆ１Ｕ、４ｗ）を２部分に分けた。１部は冷０． ０１　Ｍ　トＩＪスーＢＣｔ　緩衝液、ｐＨ８，ｌ　Ｔ　Ｂ回洗イ、細胞を２０ ％０％スフ−ス−０，０３Ｍ　）リス−１１ｃ１．　ｐＨ８，１、ｌ　ｍＭＥＬ ｆｌ’Δ　２，０−中に懸濁した。

室温で１０分間回転振とり器にかけた後、混合物をＳＯｒυα１１遠心分離器で １３．０００りで１０分間遠心分離した。上獣液を除去し、よく水気を切ったペ レットを速や〃・に２０ｔｎｔの冷５　Ｘ　Ｉ　Ｏ−’　Ｍ　ＭｇＣ１，溶液と 混合した。その懸濁液を水浴上で回転振と９器を用いて１０分間よく混会し、遠 沈した。＠會透面撃洗浄液”（ｏｚｍｏｔｉｃｓｈｏｃｋ　ｗａｓｈ）と呼はれ る上と液を来めてその後のテストのために用いる。比較のために、他の部分の細 胞を遠沈し、洗浄し、５−のポリミックス−緩衝液（１）　（Ｊｇｌｇｎｃｐ、 　ｃ、の報告による。　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｇｍ、　１０５；３６９−３７ ４（１９８０））に懸濁させた。細胞は、製造者（バイオチック社、スウェーデ ン国ストックホルム）の推せんしたようにＸ　−ｐｒｔｘｚ中で分解した。５ｏ ｒｖａＬｌ　５５−３４回転遠心分離器で１３，０ＯＯｒｐｒｎで１５分間遠沈 することにより細胞残骸を除去し、上ｔｉ１．ｇ、を果め、その後のテストのた のに用いた。

ペリプラズム蛋白質、および全細胞蛋白質をそれぞれ含む、倫られた２種類の抽 出液について、以下に示す酵素アツセーにより、アルカリホスファターゼおよび フェニルアラニツーｔＭＡ８成酵素を測定し、前記の実験室的方法でプロティン ｌを測定した。

酵素的アツセー アルカリホスファターゼをトリス緩衝液、　０．０５　Ｍ　、　ｐＨ８，０中で 、基ｔｉｔｉ＜ｓすＴｎＣＬ　１０４　）としてＰ−ニトロフェニル−燐酸（４ Ｘ　Ｉ　Ｏ”−’　Ｍ　）を用いてアツセーを行なった。

Ｐ−ニトロフェニル燐酸の加水分解物をスペクトロフォトメーターで４１０Ｆ１ １μで測定した０活性１単位は、４１０ｍμにおける吸光度の１．　Ｏ／　ｍの 変化を示した０（Ｈｇｐｐｇｌ。

Ｌ、　Ａ、、　ｌ１ａｒｋｎａｓｚ、　Ｉ）、　Ｒ，およびＢｉｌｍｏｇ　、　 Ｒ，Ｊ、　、　Ｊ、Ｈｉｏｌ。

アッセーは総量１００μｔに次のものケ含む混合物中で行なわれたｓ　５　ｍＭ 　４’（０／４ｃ）ｔ　、　Ｇ、　５ｍＭＣａＣ４９５ｍＭＫＣｌ’＋５　ｖｄ ｂｌ　ＮＨ，Ｃ１、８ｍＭプトレｙシ：ｙ、１ｍＭｘベルｉジン、５ｍＭ９Ａｆ ｉｉカリ、　ｐｌｉ’１．５　、　１ｍＭジチオエリスリトール、ｌ　ｔｎＭＡ ＴＰ。

６ｍＭホスフォエノールピルビン酸、１μｔピルビン酸キナーゼ（シグマ社、セ ントルイス％ＵＳＡ）、ｉオキナーゼ１単位（シグマ社）、１００μ１Ｍ（”Ｃ ）−フェニルアラニン（４ｃｐｍ　／　ｐ７７！ｏｌ）　（放射化学でフタ−。

英国アマースハム）　＊　３００ａｐ総Ｅ、ｃｏｌｉ　ｔ　ＲｌＩＩ（ベーリン ガー社、ドイツ連邦共和国マンハイム）。

Ｘ　−ｐｒｔｘｚを行なった細胞抽出液および滲透衝撃洗浄液を、連光な稀釈液 １０μｔを刃口えることによって試゛験した。酵素アッセーを３７℃で１５分間 行なった。冷１゜ｑ４ＴｃＡを加えて反応を中断し、フェニルアラニン−ｔ　１ ｄＶｉ４を沈澱させた。沈澱物をガラス繊維フィルター（ＧＦｉ４．　ホ’）７ ト−ｒ７社）上に集め、１０％冷ＴＣＩ　Ｓｐよひ冷７０％エタノールで洗い、 放射能を測定した。１分間にフェニルアラニン−ｔ　ＲＮＡ　ｌ　ｐｍｏｌ　を 生成する時。

それを１単位の活性と定義する。（ｌｉ’ａｇｎｇｒ、　ｂ、　Ｇ、　Ｉｌ、。

結果を次の第１表にろられす。表中の全数字はａＩ＠培養液５００献（約７．５ ｘ　ＩＯ’ＣｊＵ／ｌｎｔ、）についてりられしてりる。

第　１　衣 ｐｓＰ、４１を含むＥ、ｃｏｌｉ細胞の酵素活性およびプロティンｌ含忙ぎＣ１ 辰は、細胞を壽透衝撃にさらした時、プロティンＡおよびア°ルカリホスファタ ーゼが放出されるのに対し。

細胞内酵素、フェニールアラニン−ｔ　ＲＮ４合成酵素の活性は滲透＠撃洗浄； 夜中に検出されないことを示している。

この結果は、配列テーク（第３図）によって、クローン化ＤＮ、４中に存在する Ｓ、ａｕｒｔｔｔｓ　シグナル配列がＥ、ｃｏｔｉに表現され、シグナルペプチ ドが膜によって識別されたことを示す。外信１膜のないグラム陽性細菌１例えは Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｚｕｈｔｉＬｉｓで、シグナルペプチドがプロティンΔの増 殆培地甲への分泌をおこす可能性は最も大きい０ｐｓＰ４　ｌを担うり、ｃｏｔ ｉ　ｉ４ｇ胞によって生産されるプロティンｌの量は約１−２１９　／　１ｉｔ ｅｒ培地で必る０ニング プロティンｌ遺伝子を含む２種類のシャトルベクターを、　Ｅ、ｃｏｌｉ、　Ｓ 、ａ塾ｒａｕｚ　および凝固促進酵素マイナスのブドウ状球菌のいづれでも複製 可能であるようにつくった。ブドウ状′ｆ５Ｆ菌プラスミドｐｃＩ９４を基にし たプラスミドベクターｐＨＶ　３３を用いた。これＪｄＥ、ｃｏｌｉ　において アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性を我現し、ブドウ状球菌においてクロ ２ムフエニコール耐性を表現する。

第一のシャトルベクターは、実施例１のＧ段階に記載したプロティンＡ遺伝子を 含むＺ　ｌ　Ｋｈ　ＥｃｏｌｔＶ　ｌｌｒ片をプラスミドｐＢＶ　３３のＥｃｏ ＲＪ／部位に入れてクローニングすることによってつくった。実施例ＩのＧ段階 からのプラスミドｐｓＰ４３の２ｘｐｍ　ｉｐ’よひｐＨＶ　３３のｌμｐをｂ ｃｏＲＪ’で切断し、混合し、Ｔ４−リカーセで処理し、Ｅ、ｃｏｌｉＨＨｌｏ Ｉの形質転侯のために用いた。切断、連結２よび形質転換は、先に実験室的方法 の項で記載したように行なわれた。

組換型を含むコロニーを、央ＴｈｆｌＪＩのＤ段階と同様の方法で、アンピシリ ン耐性で、テトラサイクリンとクロラムフェニコールに感覚性があるように辿ん た。実施例ＩのＦ段階による制限分析は、扱験クローン８の中すべてが、第６図 に一式的に示したプラスミドを含んでいることを明らかにした。すべてのクロー ンは、プラスばドＰＳＰイ３と同方向に挿入配列をもっていた（実施例１．Ｇ段 階参照）。この７′ラスミド−ｐｓＰ、４　Ｉ　５　と名つけられる−を含む１ つのクローンを選んでその後の研究に用いた。このプラスミドは、４４７のアミ ノ酸て予想分子量４９．６０４　の成熟蛋白質をコ、−ドするプロティンｌ全構 造遺伝子を含むことがわかった。

８１　プラスミドｐｓＰ１？を侍るために、　ｐｓｐＡｌからのブー■曇−祷― 譬陽−―＋−−醤一曇−−一一一一輪・−一―−リーーー優−嚇−−−−−−− 優曇轡−−紳−−陽呻鈴一轡−−―−−―ロチインＡ遺伝子のダー末端をプラス ｆ）ｐＴＲ２６２に入−−１曇励−一輪畳一一中鍔−−曇一蝉＋赫神−−−鐙− −器−−一儒鋤−−慟−・−−−陽一轡−−−陽―尋−・・優−一崎・―・−一 一一一一一一一一れてサブクローニングすること０ 実施例ＩのＬ“段階から付られるｐｓＰＩＩ　（第１図参照）１μｔ３よびプラ スミドｐＴＲ２６２１μｔを制限酵素μｎｄ（５およびｐｚｔｌで切断し、混会 し、Ｔ４−’）カーセで処理し。

Ｅ、ｃｏｌｉ　ＨＢ　１０１の形貴転侠のために用いる０切断、連結および形賀 転侠は、先に実験室的方法の項に記載した方法で行なわれた０ フ゛ラスミドｐＴＲ２６２はλ−リプレッサー遺伝子を含み。

これは社机時にテトラサイクリン耐性の遺伝子を不活性化する。λ−リプレッサ ー遺伝子はＩｌｉｎｔｔｍサイトヲもち。

ＤＮＡ配列をここに挿入するとλ−リプレッサー遺伝子は不活性化され、テトラ サイクリン耐性遺伝子が活性化される。こうしてプラスミドｐＴＲ２６２はテト ラサイクリン耐性組換型に対して正の選択を行なうことかで−きる。

こうして組換型を含むコロニーを、テトラサイクリン耐性であるように選択した 。これら組換型２０の中の１のコロニーは、プロティンΔプラスであることが発 見された：この場合前述の実験室的方法の項のＥＬＩＳ’Ａ法を用いた。制限分 析の結果、それは第１図および第２図のｐＳＰＡ　ｌ制限地図のα０−２１Ｘｈ に相当する断片に由来する２、ＩＡＡプロティンＡ遺伝子挿入配列をもつベタタ ープ２スミドｐＴＲ２６２を含むことがわかった。この１ラスミドはｐｓＰＡ２ と名づけられ、第７図に図式的に示される。

それはプロティンｌ遺伝子断片の３′−木端に、臀異なｐｚｔｌ制限部位をもち 、これは次の８５段階で利用される。

り二つのＤＮ／１断片がつくられた。即ち第２図のＱ、２Ｋｂと２．ｉ、６との 間の位置のプロティンＡ遺伝子（２，ｌ＆）を含む・挿入されたＤＮＡ向ｆ片” １ひ６クタＰ”Ｖ＋４（７，２人ｂ）でるる。この消化物を加熱により不活性化 し。

エタノールで沈澱させ、１００ＡｔのＴＥに浴かし、ＴＥ緩衝液中の１０−３０ ％スクロース勾ｌＩＣによって沈降さゼた。ベック？　７　Ｓ　Ｆ　４０回転器 を５℃、　３５．ＯＯＯｒｐｍで２０分間用いた。勾配（液）を０５−っつのフ ラクションに分画化し、その各々をアカロースケルを気泳動によって分析した。

２１人す断片を含むフラクションを合一シ、２各νのエタノールで沈澱させ、Ｔ Ｅ緩衝液に溶解した。

第２Ａおよび８図かられかるように、その断片は、全プロティンΔ遺伝子の他に プラスばドｐＢＲ３２２に由来するす、ｃｏハ自「列およびブドウ状球菌遺伝子 残基を含む。

８２段階からの精製ｚｌＡｂ断片５μｔを制限酵素５ａｕ３１で１時間３′７℃ で切断した。消化物１ｉ、ＴＥＨ粉衝液甲で８％ボリアクリルアばドゲル篭気泳 動にかけた。そのケルを臭化エチジウム（１μｙ／−）で染色し、約６００塩基 対のＤＮ、４断片を切りとった。この断片は、第２囚の１、ｌ５ＫＡと１．８Ａ ｂとの間の遺伝子部分に相当する。Ｉ）ＮＡは３７℃で１晩かかってＴ　Ｅ　＋ 　０．３　Ｍ　ＮａＣ１”ｎｄで浴出された。その溶出液をｓ５ｍｅＴＥで平衡 状態にした。沈降ＤＥ−５２Ｃホワットマン社、英国）を約３００μｌ含むカラ ムを通した。　Ｔ　Ｅ　＋　０．３　＃　ＮａＣ１２−で洗った後、　Ｉ）ＮＡ は２各賞の各０．５　ｍｅ　Ｔ　Ｅ　＋　０．６　Ｍ　ＮａＣｔ　で浴出された 。

１）ＩＶＡ断片を含む浴出液を１容量のＴＥで稀釈し、エタノールで沈澱させ、 ＴＥＢ緩衝液に浴かした。侍られた精製プロティンＡ遺伝子断片は、　Ｓａｕ　 ３　Ａ制限部位２よ４４　特表昭５９−５ｏ１６９４（１３）ひ中間工Ｈｉ　２ 〆■部位に相当する付着端をもつ。

プラスミドｐ（ＪＲ２２２は酵素β−カラクトシダーセ（ｌａｃＺ）をコードす る遺伝子を含む市販のベクターである。

つな数ケの制限部位をもつマルチ−リンカ−から成る。

β−カラクトシダーセは酵素アッセーによって容易に検出されるから、制限部位 の一つに挿入されたＤＮＡ断片をもつ組換型は、適当な宿主菌株の使用によって 容易に記録される。しはしはＸ１αｌプレートが用いられる（Ｘｐａｌは色素原 性基質、５−ブロモ−４−クロル−３−インドリル−β−Ｄ−カラクトシドであ って、β−カラクトシターセによって切町芒ｆると青色のインドリル齢導体を放 出する）。このプレート上にβ−カラクトシダーセーマイナスー組組換ｔユ白い コロニーとしてあられれ。

挿入配列のないグラスミドを含むコロニーは青緑色をめられす。

β−力２クトシダーセをコードする遺伝子におけるプラスミドｐＵｈ　２２２を 切断して、Ｂ３段階のプロティンＡ断片の付着端以外に補足的に付着端ｔっくっ てそれをプラスずドに挿入するためには、１ミＩｉｌ制限部位を用いた。ドイツ 連邦共和国マンハイムのベーリン力−社から供給されたｐＵＲ２２２１μｔを制 限酵素牟ψ−ｈノで１時間３７℃で消化した。それ〃・ら１０分間６５℃にして その酵素を不活性化した。この切り試料を１次の５段階で、プロティンｌ断片と 連結するために用いた。

Ｂ５　ｐｓＰＡ２　＆よびｐＴＲ２６２を含むハイブリッドプラスミド７１）Ｓ ＰＡ　Ｉ　Ｏの作製（第７図）ＦＩ４段階で配したよりに苅ミＥｌで消化したｐ ＵＲ２２２の２００ｎｌと、８２段階で記した浴出プロティンＡ断片の２００ｎ ｐを混合し、全量２０μｌにしてＩａＡ＋＋４℃で連結した。１０分間６５℃で 酵素を不活性化し、エタノールで沈澱させ、ＴＥ緩衝液に溶解した。中でもβ− カラクトシダーゼ遺伝子にプロティンｌ挿入配列を弔する組換えプラスミドを含 む全ＤＮＡ混合物を、酵素２仏り４■にすいぜＸ７される緩衝液中で、制限酵素 １１ｉｎｄ■によびｐｓｔ　７で、１時曲３７℃で切断した。これはβ−カラク トシターセ遺伝子（ｐｓｉ　Ｉ　）と、プロティンｌ遺伝子（１ｌｉｎｄｆＪＪ ）における組換えグラスミドを切断して二つの断片を生成結し、た小さいβ−ン グラクトシターゼＤＩＶＡｆ３Ｑ列から取る連結した。β−カラクトシターセ遺 伝子の主部分を含んで取る１組換えプラスミドの残部からなる大きい断片である 。第７図かられかるように、β−カラクトシターゼ断片は、プロティンＡ断片と の融合点（Ｂａｍ　Ｉｉ　１部位）に近い、ＥｃｏＲＩ制限部位をもっている。

８１段階からのグラスミドｐｓｐＡ２の２００ｎｔを前記の方法で制限酵素Ｅｉ ｎｃｔ１５およびｐｓｔｌで切断し、そのプラスばドを３つの断片（第７図参照 ）にした、即ちＴｅ１−遺伝子とプロティン４遺伝子５′−末端との的に位置す る１１ｉｎｄ■部位から、プロティンｌ遺伝子内のｆｌｉｎｄｍ部位まで廷びる 断片、稜者のより１ｎｄ（ｑ部位からプロティンＡ遺伝子の３′末端にあるｐｅ ｔ　１部位まで延びるプロティンΔ遺伝子断片、そしてプラスミドの残りから成 るｐＴＲ２６２起原のより大きい断片である。

上でつくった二つの消化物を６５℃で１０分間不活性化し、混合してエタノール で沈澱させた。ＤＮＡを連結緩衝液に溶解し、Ｔ４−’）カーセで処理した。所 望の組換えプラスミドは、　ｐｓＰＡ２におけるプロティンｌ遺伝子内のＢｉｎ ｄｆｆＪと、−Ｌ１２との出１に挿入されたｐＵＲ２２２組換え挿入配夕１：の 切断で付られ、プロティンＡ遺伝子の５′−末端を含み、その一部は従ってＰＳ ＰΔ２に由来し、他はｐＵＲ２２２組換型に起原する。という上記記載の大きい 断片から承る。その上そのツーラスミドはアンピシリンおよびテトラザイクリン 耐性で、以下に説明するようにＸ１ａｌグレートで青色を呈する筈でりる。

従って、壜給した１）ＮＡ混台物を用いてす、ｃｏｌｉ　ＲＲＩｄｅ１Ｍ１５を 転換した。切断、迎鮎３よひ形負転侠は前述のように行なった。組換型をアンピ シリンおよびテトラサイクリンを含むＸｇαｌプレート上にとる０クローンの一 つは明青色を呈し、そのプラスミドについて制限分析を行なった０この結果、そ れはｐｓＰ、４＋ＯＣ第７図）と名つけられたプラスミドであることがわかった ；これはプラスミドｐＵＲ２２２とプラスミドｐＴＲ２６，２と、　ｐｓＰＡＩ 起原のプロティンＡ遺伝子とから成り、遺伝子の下流端に。

％異的Ｅｃｏ　Ｒ１部位をもっている。

プラスｉドＰＳＰΔ１哨、β−カラクトシターセをコードする全ｌａｃ　Ｚ遺伝 子を含まないで、そのα−断片をコードする遺伝子のみを含むとはいえ、それは 前記の条件下でＸｇａｌ基質を活溌に切断して宵色を呈する０これは、このプラ スミドによってコードされるα−断片と、活性酵素を生ずるβ−カラクトシター ゼ中のカルボキシ宋端部分を含む染色体性遺伝子産物との闇の相補性（ｃｏｍｐ ｌｅ−ｍｔｎｔａｔｉｏｎ　）による。上に用いたＥ、ｃｏｌｉ　ｈＲＩ　ｄｔ ｌ　Ｍ１５宿主菌株は、このような染色体性遺伝子産物でるり、従ってρＳＰ５ 引０　プラスミドによって生産されたα−断片を宿性β−カラクトシターセ分子 に補う。

性−イ°−２−憂−メー：ｉ−ｐ又烈−９渡上夕恣−シーへ−乙ヲゴーイーと− ４２（コードする遺伝子をプラスミドｐＢＲ−ｐ−２ｇ−９エアー乙−名一二− ニングすること（第７図） Ｂ２段階からの；消裂せるＩＩＡＡプロティンＡ揶１片１μｔを制限酵素Ｉ゛α ｑＩを用い、ブドウ状琢餉起原のＤＮＡ内で切断されるように、６０℃１時向切 断した０等量のフェノールで抽出することにより酵素を不活性化し、エーテル抽 出を繰返し、最黴にＤＮＡをエタノールで沈澱させ、ＴＥ綴衝液に俗解した。グ ラスばドｐＢＲ３２２１μｔを制限酵素Ｃ１ａ　ＩおよびＥｃｏ　ＲＶ　（これ らは同じ方法で切断し、その結果相補的付着端ができる）を用いて、　ＢａｍＢ Ｉ緩衝液中で１時間３７℃で切り、その後１０分間６５℃で加熱不活性化した。

これらのＤＮＡ試料を混合し。

連結し、前記のように実験室的条件下でＥ、ｃｏｌｉ　ＨＢ　１０１を形質転換 するために用いた。形貴転換細胞をアンピシリン（３５μｙ７ｍｉ）上に線条接 種した。コロニーをとり出し、１０μｔ／ｍ１テトラサイクリンおよび３５μｔ ／−アンピシリンそれぞれ含むプレート上に置いた。アンピシリンでは増殖する がテトラサイクリンでは増殖しない形ノー転換軸胞を組俟型と考えた０これらの 組候型の１２の中、４個のコロニーは実験室的方法の項で述べたＥＬＩＳＡ法に よって、プロティン４クラスであることが発見６れた。鞘層プラスミドを１．２ 又は３制御１１ｉＩ酵素で切断する制し分析が、これらクローンの１つで行なわ れた。ｐｓＰＡ８と名つけられるとのグラスばドの制限地図を第７図に示す。こ うしてつくられたグラスばドにはプロティンＡ遺伝子のＥ、ｃｏＬｉ　プロモー ター上流かなく、ノロティンＡ遺伝子断片はそれ自身のフドウ状球菌グロモータ ーのみ先端を断ち切られたプロティン／４（即ちＸ領域がない）をコードする第 二のシャトルベクターをつくった０その作製を第８図に図式的にかいた。８５段 階からのプラスミドｐｓＰ、４１０の５μＩをＥｃｏ　ＲＩ　２よひ１ｉｉｎｄ ■で切断し。

５チホリアクリルアミドゲル軌気泳動を行なった後、そのポリアクリルアミドケ ルから０．４Ａｂ１片を切りとった。

実験室的方法の現に記載したように断片を浴出して、精製した。８６段階からの プラスミドＰＳＰΔｇの５μｔを四分に処理し、０．７八す断片を分離して鞘製 しｆｃｏ最後に２μｔのプラスミドｐＥＶ　３３をＥｃｏ　ＲＩで消化し、アル カリホスファターゼで処理しＳ精義した２個のＤ　ＮＡ断片と混合した０ｒ−４ −ＩＪカーゼで処理した彼、そのＤＩＶＡを用いてＥ、ｃｏｌｉＨＢ　１０１を 形追鴨余した。切向、アルカリホスファターゼ処理、連結２よび形質転換に前述 の拠諭室的方法により行なった０　１２ケのアンピシリン耐性クローンの制限分 析で、ＥｃｏＲ１部位に１．１Ａｂの挿入口Ｃ列をもつプラスミドｐＥＶ　３３ 　’（ｒ含む１クローンか明らかにされた。ＰＳＰイ１６と呼はれるプラスはド を第８図に図式的に示す。第９図はこの先端を断ち切られたプロティンＡ遺伝子 の１苧止コドンの前にあるヌクレオチド配夕１ｊとそれに対応するアミノ酸を示 す。このようにして生理された。

Ｘ領域のない成熟した蛋白質は２７４のアミノ酸を含み。

推定分子量３０，９３８　でめる。第１０図に図式的に示したこの先端のないプ ロティンＡ分子は、鎖酸ＣのＣ−末端部分を除いて、プロティンＡのすべての１ ００結合部分を前記１節で作製したシャトルベクターＰＳＰΔ１５およびｐｓＰ ＩＩ６を、１節におけるようにアンピシリン（αｍｐ　）耐性（５０μｆ／−） に関する選択で、　Ｅ、ｃｏｌｉ　ＨＢ　１０１に入れて形質転換を行なった。

実験室的方法の項で耐１載したＥＬＩＳＡテストによって、形仰転換細胞のプロ ティンＡ分子を試験した。プラスミドＤＮＡは、それぞれのプラスでドを含むプ ロティンＡプラスクローンから分喘した０これも実験室的方法に記されている。

ブドウ状球菌の異なる釉、東には異なる株でさえも。

異なる制限系および修飾系を含む。そして大部分の菌株はそれらを数棟類担持し ている（参照：　５ｔｏｂｂｅｒｉｒ５ｑｈ、Ｅ。

Ｅ、９人遜’１ｎｋＬｅｒ：Ｊ、Ｇｔｎ、Ｍｉｃｒｏｈｉｏｌ　、ユ９：３５９ −３６７（１９７７）＆よびＳ）Ｏｓｔｒｔ３ｍ　Ｊ、−Ｅ、ｚｔａｌ、、　Ｊ 、Ｈａｃｔｔｒｉｏｌ、１３３：１１４４−１１４’？　（＋９７８）　）。

このため、　Ｅ、ｃｏｌｉ　から分離した７ラスミドを形質転換によってブドウ 状球菌−（５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ　）に導入しようとする時、問題がおこ る。そこでその制限問題を克服するために、イオルダネスク（Ｉｏｒｄａｎｅｓ ｃｕ）ら（／。

Ｇｇｎ、Ｍｉｃｒｏｈｉｏｌ、　９６：２７７−２８１　（１９７６））が始め て分離した。　Ｓ、ａｕｒｅｕｓ　８３２５の制限欠乏侯異体−，５，４１１３ とＰｌ−はれるーを用いて、　Ｅ、ｃｏｌｉ　ＨＢＩＯＩ　から分離したプラス はドＬ）ＮＡの、　Ｓ、ａｕｒｔｕｓ　甲での形７転侠を行なった。元の菌体〕 υ−ジ１まプロファージφ１１．φ１２．φＩ３に対して清涼性（ｌｙｓｏｇｅ ｎｉｃ　）であり、その上ファージ８３Δでも溶原化した。その固体は次のよう な標準ファージ型をもつ：　２９　／　４７　／　７５　／　ｇ　５　／　ｏ　 ＠ｌｌ限を更に蓼らすためにプロトプラストを、ＤＮ、４添加直前に５６℃で３ ０秒間加熱した（　ｕｈ　：　１ｓｋｔｓｈｏｖ、ａｔ　ａｌ、Ｊ、Ｇｅｎ、Ｍ ｉｃｒｏｂｉｏｌ。

グロトプラスト作製のための方法２よひ培地は、主としてライリック（Ｗｙｒｉ ｃｋ’）およびロジャース（Ｒｏｇｔｒｚ）がＢａｃｉｌｌａｚ　、？ｕｈｔｉ ｌｉｓ用に、　Ｊ、Ｂａｃｔｇｒｉｏｌ、　１１６：４５６−４６５　（１９７ ３）　上に報告し、チャンク（Ｃｈａｎｇ　）　ｉ？よひコーｘ　：ｙ　（Ｃｏ ｈｔｍ　）が修正した（　Ｍｏ１．Ｇｇｎ、Ｇｔｎｔｔ、　１６８　：Ｉｌｌ　 −１１５（＋９７９））方法でめった。しｗ−Ｌブドウ状琢菌（ｓｔａｐ　ｈｙ ｔｏｃｏｃｃｉ　）に用いるためにはリンドベルグ（ＬｉｎｃＬｂｇｒｇ）等お よびケツツ（Ｇδｔｚ）等により若干修正がなされた：　（Ｌｉｎｄ７！Ｉｇｒ ｌ、　Ｊ、Ｊｇすａｃｅｖｕｉｃｚ；　遅知球凶２よりブドウ状球狛感染ｆｉ、 Ｚｂｌ、Ｂａｋｔ、５ｕｐｐ１．ＩＯ：　５３５−５４１；クメタフフイッシャ ー出版社、シュッッヵルトーニューヨークＣＩ’、Ｓｌ）、　ＧＱｔｚ　ら：　 Ｊ、Ｂａｃｔｇｒｉｏｌ、Ｉ４５　ニア４−ｓ　ｌ　（１９８１）） トリブチカーゼ・ンイーブイヨン（Ｔｒｙｐｔｉｃａｓｇ　５ａｙＢｒｏｔｈ　 ）　（Ｂ　Ｂ　Ｌ　、　Ｃｏｃｋｔｙｓｖｉｌｌｅ、ＡＩｔｔ、、　Ｕ　Ｓ　Ａ 　）で定常状神まで増殖させたＳ、ａｕｒｇｕｓ　Ｓ、４１１３　（約２Ｘ１０ ９コロニー形成単位／−）の１０ゴ試トを回収し、間貸の高張緩衝培地（ＩｉＨ Ｍ　）にぞ濁させた。８８Ｍは、０．７Ｍスクロー　ス＊　ｏ、ｏ２　Ｍ　マレ イン酸−Ｎａおよび０．０２　Ｍ　ＡｊｑＣ’ｔ２ｆ　Ｎａ０１！−（’　ｖｆ ｊ　６．５に調節しこれにＤｉｆｃｏ　ｐｇｎａｓｓａｙ　ブイヨンパラｊ−（ ＤＬｆｃｏ　Ｌａｂ、、デトロイト、ミシガン、ＵＳＡ）を４３　Ｉｌｌの割で 加えたものから敗る。リゾスタフィン（！　７　）　ｋ　イス、　Ｍｏ　、、　 ＵＳ４’）をそれぞれ２０およヒフ０ｏＯμシ′−最終濃度で加えた。そして細 胞懸濁液をゆるやかに倣とうしながら３７℃で培養した。リゾチームは細胞の無 傷細胞のように集合顔向をもつプロトプラストを分けるのに役立つ。この培養は ５４０ｎｍの吸光度が一足になるまで続けられた。それは普通は３時間以内でめ った。

残った無傷細−および帷胞残骸は２，５００．ｒｔで１０分間遠沈することによ りペレットとなった。上澄液を集め。

１６．０００　、ｒｙで１０分間再び遠沈した。ペレットとなったプロトプラス トを最初の培養液量の１０分の１の量のＥＢＨに再懸濁した。つくられた、５， ４１１３プｏ）プラストＨＢＭ　＃濁液（１−につき約２ＸＩＯ７ａ胞壁再生プ ロトプラスト）０．４−を、先の■笥のＥ、ｃ　ｏ　ｌ　ｉ　プラスミドＤＮ、 ４で次のように形乃鼾揄し７た０ プロティンイブラスのフ゛ラスミドＤＮΔｌ　０−２０μｔを最大量２０μｌに 、おだやかに混合しながら加えた。２−の４０％ＰＥＧ６０００　〔分子を６０ ００　のポリエチレングリコール（ＰＥＧ６０００　’）　４０　ｔを高張緩衝 液（ＢＢ　）＋００−に溶解して調製した。１ポリエチレングリコールのストッ ク溶液。ＩＩ　Ｂ　：　０．７　Ｍスクロース、０．０２Ｍマレイン酸−Ｎ（Ｌ 、　０．０２　Ｍ　Ｍｇ（１”１２をＮ　ａ　ＯＩＩでｐＨ６，５に調節したも の〕を直ちに加え、２分後にＥＢＨ８−を加えた０慰濁液を４８．２００　ｘｉ で１５分間遠沈した。ペレットとなったフ′ロトプラストをそれから１−〇ＨＢ 、υに再懸濁し、ＥＢＭで適当に稀釈した佐、細胞壁再生のため平板培養した。

再生培地はＤＮ３である。これはカサミノ識−酵母エキスー仔ウシ血渭アルプｉ ン培地で、０．５Ｍコノ・り酸ナトリウムおよび８を寒天Ｈｚを含む培地でめる （　ＣｈａｎｇおよびＣＯＡ　ｔ　ｎによる。　Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｔｎｅｔ、 　１６８：　Ｉｌｌ　−１１５（１９７９））。クロラムフェニコール耐性形質 転換細胞を選択するために、ＣＹフイヨン（ＩＶｏυｉｃｋ、ｌイ、Ｐ、、　Ｊ 、Ｇｇｎ、Ｍ；ｃｒｏＡｉｏｌ、　３３　；　１２１−１３６（１９６３））を 、０．５Ｍコノ・り酸す４１ｔＲ天／ｌと共に用いて、クロラムフェニコールを 官む軟寒天培地をつくった。クロラムフェニコールの最終す度は１０μｐ　／　 ｍｅ全寒天培地でそった。衣玩型発現な。

クロラムフェニコールを自む軟寒天を刃口える前に、３７℃で３時届行なった。

フレ′−トを３７Ｃで３日間培養した。クロシムフェニコール１４性形質転茨細 胞を、クロラムフェニコール’ａ：、　含＆　（Ｉ　Ｏμｔｙ’　＋ｍ　）　７ ’　Ｓ　ｔｌ−フレート（Ｔｒｙｐｔばαｓｇ　Ｓａｙ　寒天）上に丹線条接種 した。

Ｂ、プロティンｌの検出 プロティンＡの定性試験を、１％大血清を含む脳心臓浸出物（ＢＨＩ）−寒天（ Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂ、、デトロイト、ミシカン、ＵＳＡ）プレート上に形質転換 細胞を線条接種することにより行なった。プロティンＡの生産は、コロニーの周 囲に、沈＃　ＩｙＧ−プロティンＡＭ合体の量輪（ｈａｌｏ）として検出された （　Ｋｒｏｎ−ｖａｌｌ、Ｇ、ｇｔａｌ、、　／。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１０４：　１４０（１９７０））ｏ受容菌株Ｓ、ａｕｒｔｕ ｚｓＡＩＩ３は非常に少量のプロティンＡしか生産せず、コロニー周囲には横出 し得る１輪はほとんどなかった。

Ｃ，プラスミドＤＮＡの作製 プラスミドＤＮＡを、Ａ段階において侍られたプロティンΔ生産Ｓ／１１１３形 質転換細胞から、ホルメス（Ｈｏｌｍｅｚ）らｏｗ告した急速沸騰法（Δｎａ１ ．Ｂｉｏｃｈａｍ、　１１４　：　１９３（＋９１５１））によって（但しリゾ チームの代りに最終＠友５０μν／−のりシスタフインを用いた）作製した０Ｄ 、ブドウ状球茜の形ｆ！！転換 Δ段階でＳ、αＵγｅｘｔｓ　ＳΔ１１３について記述した方法で。

次のブドウ状球菌株をプラスばドア’５ＰＡＩ５２よひｐｓＰ４１６で形質転換 した： 田ｕｂｌ　ｏ　ｃ　ｏ　ｃ　ｃｕ　ｓαｕｒｅｕｓ　Ｕ　３２０、−スウエーテ ン国つプサラの生体医学センター微生物字面で分明されｔ、５．ｃｕ１”Ｅｕｒ 、５．４１１３株のプロティンΔマイナスＦ　０体。

５ｔａｐ、’ｈｙｌｏｃｏｃｃｔｔｓ　ｇｐｉｄｔｒｍｉｄｉｓ２４７−プロテ ィンＡを生産しない、凝固（促進）因子マイナスブドウ状琢菌。

５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｘｙｌｏｓｕＪＩＫＬ　ｌ　１７−プロティン Ａを生産しない、凝固（促進）因子マイナスブドウ状球菌。

前記の段階■イお上びＤで得られた形質転（Ｐ細胞を。

サイアミン（１■／ｌ）、ニコチン酸（１，５ｍ９／ｌ）およびＣα−パントテ ン酸（１，５■／ｌ）を富化したトリフーチカーゼンイブロス中で増殖させ、細 胞外プロティンｌ亜ひに細胞壁結合プロティンｌの生産を測定した。＃ｌｆｌ＠ 壁結合プロティンＡは、定常期（約８　Ｘ　Ｉ　Ｏ９ＣＦＵ／　−）における洗 浄細胞１−を全部俗解した後に放出されたプロティンｌの童であり、細胞外フー ロテインｌは増殖培地中のプロティンＡの量でめる。

細胞壁−結合−プロティンｌの定量は１２５７−標識ヒト１３Ｇの細胞への粘合 をテストすることにより〔人ｒｏｎｖａｌｌ　。

Ｇ、、　Ｊ、ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１０４：２７３−２７８（１９７０）　 〕又はリゾスタフィンで細胞を完全に俗解した後、実験室的方法の部に記歌した ＥＬＩＳＩテストを用いることにより行なった。

細胞外プロティンｌはＥＬＩＳ、４テストを用いて測定した。

Ｓ、ａｔｔｒｇｕ、？　株、　Ｃｏｗａｎ　Ｉ　ｉｓ’よひイ６７６を、そｎそ れ軸＠壁結合プロティンＡ−および細胞外グロテ１′ンＡ−生産の対照様として 用いた。

菌株Ｃｏｗａｎ　Ｉは細胞壁結合プロティンＡ研究の基準菌株であった［　Ｎｏ ｖｄｚｔｒｏｍ　Ａ、　、　Ａｃｔａ　ＵｎｉｔｉｔｒｚｉｔａｔｉｓＵｐｚａ ｌｉｔｎｓｉｓ　、医学部学位論文要覧２７１（１９７７）　）　ｏ少量の蛋白 質、即ち細胞外プロティンｌが増殖培地に見出された。多分自己消化によるもの でろろう。

菌体、（６７６Ｆｉ細胞外プロティンｌのみを生産する（　Ｌｉｎｄｍａｒｋ　 ら、Ｅｕｒ、Ｊ、Ｉｉｉｏｃｈｇｍ、７４二６２３−６２８（１９７７）上そし てファルマシアＡＢ社はこれを用いてフロティンΔの工業的生産を行なっている 。

結果を以下の第２表および第３表に示す。表中の全数値は細胞密度について補正 してあり、従って直接比較できる。

以下余白 第　２　表 プラスミドｐｓＰ、４１５によりコードされる種々のブドウ状球菌種における細 胞壁結合プロティンＡの生産 細菌株　細胞壁結合　糺　胞　外 プロティンＡ％　プロティン／４チ Ｃｏｗａｎ　Ｉ　１００　１２ １１３　１．５　０ １　ｌ　３　（ｐｓＰＡＩ５＞　３　０．３Ｕ３２０　０　０ Ｕ３２０　（ｐＳＰΔ１５）　５０　６２４７　０　０ ２４７　（ｐｓｐΔ１５）　３　０．３ｊｕｌ＋７　０　０ ＫＬ　Ｉ　Ｉ　７　（ｐｓＰＡＩ５）　３　０．３第２衣において、　Ｃｏｗａ ｎ　１株における細胞壁結合プロティンＡの量を、　ＥＬＩＳＡテヌトにおける ’／２５６の稀釈に相当する１００％とした。これは１２０■蛋白質／１ｔリゾ スタフイン処理培地に等しい。表中のすべての他の数値はこの数を標準にしたも のである。

第３表 プラスミドｐｓＰｉ４　＋６によってコードされる独々のフ下つ状琢黴棟におけ る細胞外プロティンΔの生産 細菌株　細　胞　外　細胞壁結合 プロティン／１％　プロティン、４％ 、４６７６　１００　０ １１３　０　１．５ Ｉ　１３　（ｐＳ／’７ｆ１６）　３　１．５ｖ３２０　０　０ Ｕ　３２０（ＰＳＰ、４１６）　ｌ　００　０２４７（Ｐ、ｓＰ、４Ｉ６）　１ ２　０人Ｌ　Ｉ　Ｉ　７ＣｐＳＰＡＩ６）　２５　０第３弄では増殖培地中のプ ロティンＡ（７）量（即ち細胞外プロティンＡ）を１００％とした。これはＥＬ ＩＳＡテストの稀釈’／２５６に相当し、９０ｑプロテインＡ　／　を培地に等 しい。表中の他のすべての数字はこの数を標準にしである。

上記第２表および第３表かられかるように、プラスミドｐＳｐｌ　１５によって コードされるプロティン、４はほとんど細胞壁に結合しており、一方グラスｉド ｐＳＰＡ　１６によってコードされる先端が断ち切られてＸ領域のないプロティ ンｌは、増殖培地に分泌される。

上記第３表から、　Ｓ、ｔｐｉｄ、ｔｒｍｉｄｉｚ及びＳ、ｘｙｌｏｓｕｓなと 、シグナル配列が機能的であることもわかる。

生産のための出発培養菌として用いられ［Ｌｉｅｐｇ、Ｉｌ、Ｕ、。

Ｆｏｒｕｍ　Ｍｉｃｒｏｈｉｏｌｏｇｙ　５；　ｌ　Ｏ−１５Ｃｌ９８２＞、Ｉ ”１ｓｃｈｅｒら。

Ｆｔｔｉｓｃｈｗｉｒｔｓｃｈａｆｔ　６０：１０４６−１０５１（１９８０） ）　、従って非病原性のブドウ状球菌種と考えてよい０この理由から、クローン 化プロティンＡ遺伝子を含むジ五りだとはプロティンＡの工業的生産のためにＳ 、αｔｔｒａｔｔｓに代る菌株となるであろう。

プラスミドｐｓＰ４１６　ｋ含む５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｔｔｓ　ｘｙｌｏｔ ｔｔｉＡＬ１１７のプロティンＡ生産クローンは、ドイツ微生物収集所（ＤＳＭ ）（ドイツ連邦共和国、３４００ケツチンケン。

クリーゼバツハシュトラーセ　８）のコレクションに１９８３年８月１５日に寄 託され、そこではＡＤＳＭ２１０６と指定された。

前記の実施例で生オされるプロティン４０量は決して最大収量ではないことは理 解される。そこで１例えは栄養培地の適当な選択等によって収量を上けることは 、熟練せる当業者の腕次第である。

本発明の実施例を上に示したが１本発明はこれに限定されず１本発明のプロセス および組侠え要素の数多の変更および変形が、後に請求する発明の範囲から逸脱 することなく可能であることは勿論である。

以下宗白 国際出願番号：ＰＣＴ／５ＥＥ３１００２９８微　生　物 明細書第１５頁第１２〜１６行に引照された微生物に関する随時シート Ａ、寄託の同定 寄託楼閣の名称 ドイツ微生物収集所 寄託機関の住所 寄託日　受託番号 １９８２年７月１２日（＋２−７−８２）　ＤＳＭ　２４３４Ｅ、このシートは 、出願されたときに国際出願と共に受領した（受理官庁によりチェックされるこ と）（署名） 事務官 特許手続上の微生物の寄託の 国際的承認に関するプダベス、計条約 国　際　様　式 マーテン、リンドペルグ　本頁下部に示された国際寄託機関■微生物の同定 ■科学的性質及び／又は生物分類学上の指示科学的性質 提案された生物分類学上の指示 ■受領及び受託 この国際寄託機関は上記！に同定された微生物を受託し、これは１９８２年７月 １２日（原寄託日）Ｋ受領した０■国際寄託機関 ８１９８２年７月１３日 特許手続上の微生物の寄託の 国際的承認に関するブダペスト条約 国　際　様　式 スーテン、リンドベルグ　本頁下部に示された国際寄託機関生体医学センター、 微生物学部　により、規則１０．２に従って発行Ｉ寄託者 氏　名　マーテン、リンドベルグ 生体医学センター、微生物学部 ■微生物の同定 国際寄託機関により付与された受託番号　ＤＳＭ　２４３４寄託又は移転の日　 １９８２年７月１２日■生存能力声明書 上記■に同定された微生物の生存能力は試験された。

その期日に、上記微生物は生存していた。

■国際寄託機関 ８１９８２年７月１３日 Ａ　５ＥＤＡＢＣＸ ＦＩＧ、２ ｎ、　７：（同容÷こ変更なし） ＦＩＧ、５ ＥｃｏＲＶ ＦＩ６．６ ンｒ・書（同容、こ□］ビ更なし） 手続補正書（方式） 昭和５９年７月１３日 特許庁長官　志　賀　学　殿 １、事件の表示 ＰＣＴ／５ＥＦ３３１０　Ｏ２９８ ２発明の名称 シグナルＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片、その製造方法およびそれにより形質転換 された微生物λ補正をする者 事件との関係　特許出願人 名称　ファーマシア、エイ、ビイ−９ 代表者　スジエペルグ、カールーエ＋）り５、補正命令の日付 昭和５９年６月１４日（発送日昭和５９年６月１９日）６補正の対象 図面の訓訳文（ＦＩＧ４，７及び８） ７補正の内容 別紙のとおり 国際調査報告

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １．シグナルペプチドをコードするシグナルＤＮＡ配列を有し、またその下流が 遺伝子のための挿入部位または選択された蛋白質もしくはポリペプチドをコード するそれらの部分を有しあるいは具備できるＤＮＡ断片において、上記シグナル 配列がブドウ状球菌プロティンＡをコードする遺伝子あるいは化学的に合成され たそれらの相当物のシグナル配列であることを特徴とするＤＮＡ断片。 ２　黄色ブドウ状球菌（５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｙ　ａｔｃｒｇｕｓ　、） の菌株から得られたものであることを特徴とする請求の範囲第１項に記載のＤＩ ＶＡ断片。 １　次のアミノ酸配列： Ｌｅｕ　−Ｌｙｓ−Ｌｙｅ−Ｌｙｓ−Ａｇｎ−１１ｇ−Ｔｙｒ−５ｓｒ−Ｉｔｔ 　−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｔｕ、−Ｇ１．ｙＪｌａｌ−Ｇｌ、ｙ−１１ｇ−７ｉ１ ．ｔｚ−５ｅｒ＃ａｌ−Ｔｈｒ−Ｌｍ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−１，ｇａ−Ｌｇｕ−１ ｔｔ−５ｔｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ→’／ａｔ−７ｈｒ−Ｐｒｏ−Ｊα−Ｊα逮か− Ｘ （ココで、ＸはＡＬａ　、　ＡＬａ−ＡｂｅｔもしくはＡｔａ　−ＡＬａ　−Ｇ ｌｎ　−１１ｉｓ　−Ａｓｐ　−Ｇｌａ　−Ａｌａである。）のポリペプチドを コードするＤＮＡ配列を含むことを特徴とする請求の範囲第１項または第２項に 記載のＤＮＡ断片。 ４　ＸがＡｌｃＬであることを特徴とする請求の範囲第３項に記載のＤＮＡ断片 。 ５　シグナルＤＮＡ配列が ＴＴＧＡＡＡＡＡＧＡＡＡ　ＡＡＣＡＴＴＴＡＴＴＣＡ　ＡＴＴＣＧＴ兄心１ｃ ＴＡ　ＧＧＴＧＴＡＧＧＴＪσＴ（：；ｔ：ＴＧＣＡＡＡＴＧＣＴ。 であることを特徴とする請求の範囲第１項に記載のＤＮＡ断片。 ＆　シグナル配列の前にブドウ状球菌プロティンＡをコードする遺伝子のプロモ ーターが先行することを特徴とする請求の範囲第１項乃至第５項のいずれかに記 載のＤＮＡ断片。 ７　ブドウ状球菌プロティンＡをコードする遺伝子の全表現コントロール領域を 含むことを特徴とする請求の範囲第６項に記載のＤＮＡ断片。 ８、Ｅ、ｃｏｌｉ　ＳＰＡ　Ｉ　Ｉ　、ＤＳＭ　Ａ２４３４　、それらの変異体 もしくは変異株から得られたものであることを特徴とする請求の範囲第１項乃至 第７項のいずれかに記載のＤＮＡ断片。 ９、　ブドウ状球菌ＤＮＡからプロティンＡをコードする遺伝子のシグナル配列 を含むＤＮＡ断片を抽出し、必要に応じてシグナル配列の下流に遺伝子の挿入部 位もしくはそれらの部分を導入することを特徴とする請求の範囲第１項乃至第８ 項のいずれかに記載のＤＮＡ断片の製造方法。 １０、請求の範囲第１項乃至第８項のいずれかに記載のＤＮＡ断片を含み、好ま しくはプラスミドであることを特徴とするクローニング担体。 Ｉｌ、制限酵素によりクローニング担体を分割し、ＤＮＡ断片を分割部位に挿入 することを特徴とする請求の範囲第１０項に記載のクローニング担体の製造方法 。 １２　請求の範囲第１０項に記載のクローニング担体により形質転換された微生 物。 １３、請求の範囲第１０項に記載のクローニング担体で宿主生物を形質転換する ことを特徴とする請求の範囲第１２項忙記載の微生物の製造方法。 １４　選択された遺伝子またはそれらの部分と共にシグナルＤＮＡ配列の表現が 蛋白質またはポリペプチドの前駆体を生産するように、選択された蛋白質または ポリペプチドをコードする遺伝子またはそれらの部分がその中に挿入された請求 の範囲第１０項に記載のクローニング担体を含むことを特徴とする組換えＤＩＶ Ａ分子。 は　選択された蛋白質またはポリペプチドをコードする遺伝子またはそれらの部 分を、請求の範囲第９項に記載ノクローニング担体中に、そのシグナルＤＮＡ配 列の下流は挿入することを特徴とする請求の範囲第１４項に記載のＤＮＡ分子の 製造方法。 １６　請求の範囲第１４項に記載の組換えＤＮＡ分子により形質転換された微生 物。 ＋７．　細菌であることを特徴とする請求の範囲第１６項に記載の微生物。 １８、請求の範囲第１４項に記載の組換えＤＮＡ分子で宿主生物を形質転換する ことを特徴とする請求の範囲第１６項または第１７項に記載の微生物の製造方法 。 ＋９．　請求の範囲第１５項に記載の形質転換された微生物リペブテドの製造方 法。