JPS63501053A - 異種タンパク質の生産方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

異種タンパク質の生産方法 発明の分野 本発明は、生産された異種タンパク質が宿主細胞から細胞外培地中へ輸送される ような細菌宿主細胞中で異種タンパク質を生産する新規方法に関する。 本明細書を通して、いろいろな文献が参考として引用されるこれらの文献の完全 な引用は本明細書の終わりに掲載する。これらの文献の内容は、本発明と関係す る現在の技術水準をより詳しく示すために、参考としてここに引用される。 発明の背景 細胞分子生物学の進歩により、いくつかの場合に、意図するタンパク質をコード する遺伝子を同定し、その遺伝子を単離しその遺伝子を宿主細胞内に挿入し、そ して挿入した遺伝子を宿主細胞内で発現させて目的のタンパク質を生産させるこ とが可能となった。細菌、特に大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）お よび枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔ１１ｉｓ）は宿主細胞として広く研究 されている。しかしながら、この異種遺伝子発現のために細菌を宿主細胞として 使用する場合、２つの問題にしばしば直面する。 大部分の細菌発現系は細胞内にタンパク質を生産する。高レベル発現が達成され る場合、タンパク質は往々にして不溶性であることがわかっている〔マーストン （Ｍａｒｓｔｏｎ）ら、１９８４．ウィリアムス（Ｗｌｌｌｌａｍｓ）ら、１９ ８２；ショーナー（Ｓｃｈｏｎｅｒ）ら。 １９８５を参照されたい〕。この不溶性物質から活性タンパク質を得るには、き わめて費用のかかる可溶化および再生方法を必要とする。タンパク質が細胞内で 可溶性の活性型として生産される場合、その単離は何百もの他の可溶性細胞内タ ンパク質を放出させる細胞溶解（ｃｅｌｌ　Ｉｙｓｆｓ）を必要とする。これは 目的とする生産物の精製にきわめて困難な問題を提供する。 不溶性、不活性タンパク質に伴う問題および精製の困難性に伴う問題は双方とも 、細菌に目的タンパク質を増殖培地中へ分泌させることによって克服することが できる。タンパク質を分泌させるための、十分な資料によって裏付けられた１つ の方法は分泌シグナル配列の使用である〔ランダル（Ｒａｎｄａｌ　Ｉ）および ハープイー　（Ｈａｒｄｙ）、　１９８４　；シルヘビー（Ｓｉ　１ｈａｖｙ） ら、１９８３；ウイックナ−（ν１ｃｋｎｅｒ）、　１９７９を参照されたい〕 。シグナルペプチドが異種タンパク質のアミノ末端に融合されると、それは異種 タンパク質を細胞膜の分泌機構へ導く。その後、異種タンパク質は細胞膜を通り 抜け、そして“シグナルペプチダーゼと呼ばれる特定のプロテアーゼによってシ グナルペプチドを切り離して異種タンパク質を放出させる。大腸菌での分泌はべ りプラズム空間（ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ　５ｐａｃｅ）に異種タンパク質を蓄 積させるが、枯草菌のようなダラム陽性菌での分泌は生産物を培地中に蓄積させ る。この方法は細菌において異種タンパク質を分泌させるために使用された〔フ レーザー（Ｆｒａｓｅｒ）およびブルース（Ｂｒｕｃｅ）、　１９７８；パルバ （Ｐａｌｖａ）ら、１９８３．タルマジ（Ｔａｌｍａｄｇｅ）ら、　１９８１） 。これらおよび他の研究の結果として、この特定方法を使用する際に予測され且 つ認められた問題が発見された。シグナルペプチダーゼによるシグナルペプチド の切断は効率的でなく、さらに正確でない。その結果、異種タンパク質の分泌集 団はプロセッシングされなかった又は誤ってプロセッシングされたサブ集団を含 みうる。さらに、分泌される異種タンパク質の量は通常きわめて少なく、また大 腸菌および枯草菌は両方ともプロテアーゼ類を分泌するので、有意量の異種タン パク質が分泌後に分解される。 この後者の問題点ゆえに、枯草菌による培地中への異種タンパク質の分泌および 蓄積は、宿主細胞によるタンパク質分解酵素の発現および分泌を最小限に抑える か又は排除しない限りそこなわれる。分泌タンパク質のプロテアーゼによる分解 作用を最小限に抑える１つの方法は、プロテアーゼ生産が欠損した突然変異株を 利用するものである。突然変異遺伝子は組換え法によってアルカリ性および中性 プロテアーゼ構造遺伝子の両方が単離された〔スタール（Ｓｔａｈｌ）およびフ エラリー（Ｆｅｒｒａｒｉ）。 １９８４　；ヤング（Ｙａｎｇ）ら、１９８４；カワムラ（Ｋａｗａｍｕｒａ） およびトイ（Ｄｏｔ）、　１９８４を参照されたい〕。現在までに単離された他 のプロテアーゼ欠損突然変異遺伝子は多面発現性であり、また成熟内生胞子の形 成を妨げる〔ミケル（Ｍｉｃｂｅｌ）およびミレット（Ｍｉｌｌｅｔ）　、　１ ９７０を参照されたい〕。これらの突然変異遺伝子の多くは、培養物が定常生長 期にあるとき細胞を溶解させるので、異種タンパク質の発現および分泌のために 枯草菌を使用する際に望ましくない。現存するプロテアーゼ欠損突然変異株の使 用は生産物の不安定性の問題を軽減するが、最大の生産物安定性を得るためには 他のプロテアーゼ遺伝子の突然変異遺伝子を単離することが必要であるだろう。 枯草菌の突然変異株を使用することのほかに、内生胞子の発生開始およびプロテ アーゼの分泌は、２次代謝の始まりを阻止する物質（例えばグルコース）を培地 に加えるだけで有意に減じられる〔ホッホ（Ｈｏｃｈ）　、　１９７６を参照さ れたい〕。グルコースの存在下で、多（のプロテアーゼの分泌および細胞溶解は 妨げられる。細胞溶解は細胞内タンパク質（そのうちのいくつかはプロテアーゼ でありうる）の放出が生産物のさらにそれ以上の分解をもたらし、また精製をよ り困難かつ高価なものにするので、避けるべきである。 本発明者らは、今や、シグナルペプチドによる分泌および定常生長期中の分泌と 関連した諸問題を回避する目的タンパク質の微生物による新しい生産・輸送方法 を開発した。本発明方法は鞭毛細菌からのタンパク質の輸送をもたらし、対数生 長期の期間中にグルコースのような抑制物質の存在下で行われるものである。分 泌された生産物はプロテアーゼによる分解の問題を受けずに済むと思われる。こ の分泌方法とプロテアーゼ欠損突然変異株を組み合わせると、生産物の安定性を より一層高めることができる。本方法は、タンパク質フラジェリン（ｆｌａｇｅ ｌ　ｔｉｎ）を輸送する際に宿主細胞によって通常用いられる輸送系を利用する ものである。 本発明の詳細な説明する前に、フラジェリンについての背景情報を手短かに説明 することが役に立つであろう。 鞭毛繊維のモノマータンパク質成分であるフラジェリンは、多くの細菌における 主な細胞外タンパク質産物である。とりわけ、それはバシラス属（Ｂａｃｉ　Ｉ 　Ｉｕｓ）が最小塩類およびグルコースの存在下で生育する場合の対数生長期お よび初期定常期における主要な細胞外タンパク質である。フラジェリンの輸送機 構は知られていない。タンパク質のアミノ末端から切断されるシグナル配列を使 用することによって輸送されるとは思われない〔シルヘビー（Ｓｔ　Ｉｈａｖｙ ）ら、　１９８３を参照〕。例えば、カラロバフタ−・フレセンラス（Ｃａｕｌ ｏｂａｃｔｅｒ　ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ）からの精製フラジェリンのアミノ末端 は、そのクローン化構造遺伝子の推定上の翻訳開始に対応する配列を有する〔ギ ル（Ｇｉｌｌ）およびアグビアン（Ａｇｇｂｉａｎ）、　１９８２．１９８３を 参照〕。ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）か らの精製フラジェリンのアミノ末端は、そのクローン化構造遺伝子の翻訳開始に 続く第２番目のアミノ酸に対応するアラニンから始まる〔ジョイス（Ｊｏｙｓ） およびランキス（Ｒａｎｋｌｓ）　、　１９７２　；ジープ（Ｚｉｅｇ）および シモン（Ｓｉｍｏｎ）、　１９８０を参照〕。従って、プロセッシングされたリ ーダー配列がバシラス菌、サルモネラ菌またはカラロバフタ−菌のような細菌に おいてフラジェリンの輸送を仲介しているとは考えられない。 フラジェリンおよび数種の他のタンパク質は鞭毛の中心部を通って細胞から放出 されると思われる〔イイノ（Ｉｉｎｏ）　、　１９７７　；シルバーマン（Ｓｉ 　ｌｖｅｒｍａｎ）およびシモン（Ｓｉｍｏｎ）、　１９７７を参照〕。これら のタンパク質は約８０Ｋｄはどの大きさであるので、オルガネラ中心部の物理的 寸法がこの系を不当に制限するとは考えられない。この系によって輸送されるタ ンパク質の分泌機構および構造上の必要性は知られていないが、この系および大 腸菌の関連した系についての多くの情報がイイノ（１９７７）およびシルバーマ ンとシモン（１９７７）によって収集され、再調査された。この系の１つの注目 すべき特徴はその効率である。 鞭毛大腸菌細胞は約ｅｏ、ｏｏｏのフラジェリン分子をもち〔コメダ（Ｋｏｍｅ ｄａ）　、　１９８２）　、こうして１×１０９細胞／ｍｌを含む培養物は約５ １Ｔ１ｇ／ｇのフラジェリンを輸送すると述べれば十分である。 現在までに、大腸菌の運動性と明らかに関係のある少なくとも４０個の遺伝子が 大腸菌において同定され、２９個の遺伝子は鞭毛オルガネラの合成に関与してい た（イイノ、１９７７；シルバーマンおよびシモン、　１９７７を参照）。鞭毛 の形成経路はスズキおよびコメダ（１９８１）によって提案された。鞭毛形成の 中心的定説は、その構造が細胞膜から外側へ形成され、新しい構成成分がオルガ ネラの中心部を通って輸送されるタンパク質から誘導され、成長しつつあるオル ガネラの先端で構成されるというものである。フラジェリンの構造遺伝子は鞭毛 オルガネラの合成中に転写・翻訳される最後の鞭毛遺伝子の１つである。従って 、フラジェリン遺伝子を欠失した菌株は完全な基体とフック構造をもつが、繊維 を欠くであろう。本発明の対象となる突然変異遺伝子は、この菌株がグルコース の存在下で生育するときに構成的鞭毛合成の表現型をもつ肛突然変異遺伝子であ る。（シルバーマンおよびシモン、　１９７７を参照）。この特定の突然変異遺 伝子を保有する大腸菌株はまた野生型菌株よりも５倍以上のフラジェリンを生産 する。 グランド（Ｇｒａｎｔ）およびシモン（Ｓｉｍｏｎ）、　１９６９は低温でなく 高温でバクテリオファージＰＢＳＩに耐性の突然変異株を単離することにより、 枯草菌の温度感受性（ｔｓ）旦し突然変異株を単離した。現在までに、枯草菌の ｈａｇ位置（フラジェリンタンパク質であるいわゆる“ｈ−抗原”をコードする ）の３種の対立遺伝子が開示されている。野生型枯草菌１６８はｈａｇ−１対立 遺伝子を含み、枯草菌Ｗ２３はｈａｇ−２を有し、そしてｈａｇ−３はｈａｇ− １の“直線型”突然変異である。本発明の対象となる他の突然変異遺伝子は、よ り優れた運動性と増加したフラジェリン生産の表現型を示すｉｆｍ突然変異遺伝 子である〔グラン″トおよびシモン、１９６９；プーリー（Ｐｏｏｌｅｙ）およ びカラマタ（Ｋａｒａｍａｔａ）　、１９８４を参照〕。 本発明を実施するために、本発明者らは枯草菌のｈａｇ遺伝子を単離してその塩 基配列を決定し；いくつかの実施態様において、宿主細胞のゲノムからその遺伝 子の一部または全部を欠失させ；タンパク質の細胞外輸送に関与する配列の不可 欠な成分を同定し；目的タンパク質をコードする異種遺伝子を、宿主細胞ゲノム 内すなわち宿主細胞ゲノムのフラジェリン遺伝子位置内のある部位へ、もしくは 染色体外プラスミドとして挿入し；そして輸送にとって不可欠なフラジェリン部 分に融合された目的タンパク質を含む融合タンパク質を発現させて、細胞外に輸 送させた。この実験計画を実行するための方法および物質は以後に詳しく説明す る。 発明の概要 本発明は、生産された異種タンパク質が宿主細胞から培地中へ輸送されるような 細菌宿主細胞中で異種タンパク質を生産する方法に関する。本方法は細菌培地中 で、フラジェリンクンバク質の少なくともＮ末端部分をコードする第１ヌクレオ チド配列および異種タンパク質をコードする第２ヌクレオチド配列から成る融合 ＤＮＡ配列を含む遺伝子工学的に処理された細菌株を培養することを伴う。第１ ヌクレオチド配列はその３′末端が第２ヌクレオチド配列の５′末端に連結され 、そしてその融合ＤＮＡ配列はそれ自体が発現調節配列に操作可能に連結される 。融合ＤＮＡ配列を構成する２つの連結されたヌクレオチド配列は、全融合ＤＮ Ａ配列のコード領域が翻訳されてコード化タンパク質をもたらすように、互いに “同じ読み枠内で（ｉｎｆｒａｍｅ）”連結される。いくつかの実施態様では、 第１および第２ヌクレオチド配列が選択的に切断しうるポリペプチドをコードす るリンキングヌクレオチド配列によって連結される。これらの実施態様では、輸 送された生成融合タンパク質を化学的または酵素的方法により選択的に切断して 、融合ＤＮＡ配列の第２ヌクレオチド配列によってコードされる異種タンパク質 を生産する。その缶、異種タンパク質はフラジェリンのあらゆるポリペプチド断 片または他のタンパク質系物質から分離・回収される。 ４、

【図面の簡単な説明】

第１図はクローンｐ４Ａおよびｐ８Ａの制限地図およびクローンｐ４Ａのヌクレ オチド配列決定の範囲を示す。 表１はクローンｐ４Ａの利用可能なヌクレオチド配列データを示す。 表２は６５Ｍプロインシュリン遺伝子のヌクレオチド配列および対応するタンパ ク質のアミノ酸配列を示す。 表３は大腸菌フラジェリン遺伝子のヌクレオチド配列を示す。 発明の詳細な説明 本発明は、異種タンパク質が細菌によって細菌増殖培地中へ輸送されるような鞭 毛細菌中で異種タンパク質を生産する方法に関する。本方法は適当な細菌増殖培 地中で、異種遺伝子（すなわち、フラジェリン以外のタンパク質をコードする遺 伝子）に連結されたフラジェリンタンパク質の少なくともＮ末端部分をコードす るヌクレオチド配列から成る“融合”　ＤＮＡ配列をその遺伝物質の一部として 含む細菌株を培養することを伴う。 その融合ＤＮＡ配列は発現調節配列（好ましくは宿主細菌のフラジェリン遺伝子 の発現調節配列）に適切に連結され、且つ異種遺伝子成分の３′側に翻訳終止シ グナルを含む。 適当な宿主細胞は例えば大腸菌、カラロバフタ−・フレセンラスおよび枯草菌を 含めた広範囲の鞭毛細菌種から選ばれる。 宿主細胞はフラジェリンタンパク質をコードする既知のまたは同定可能なヌクレ オチド配列を含まねばならない。フラジェリンをコードするＤＮＡがこれまでに 同定されていない細菌も本発明の実施に使用し得ることに注意すべきである。そ の場合、適当なヌクレオチド配列は、タンパク質のアミノ酸配列決定のために細 菌から適量のフラジェリンを回収して十分に精製し、フラジェリンタンパク質の アミノ酸配列を決定し、このようにして決定されたアミノ酸配列に対応するオリ ゴヌクレオチドプローブをつくり、そのプローブとハイブリダイズし得るヌクレ オチド配列の存在について細菌から誘導されたＤＮＡライブラリーをスクリーニ ングし、そしてこのように同定されたＤＮＡのヌクレオチド配列および／または 細菌ゲノム内でのその位置を決定することにより慣用技術を用いて同定しうる。 例えば、枯草菌のフラジェリン遺伝子は表１に示した塩基配列の一部または全部 に相補的なオリゴヌクレオチドプローブを使用する慣用方法により２．５Ｋｂの ＰｓｔＩフラグメントとして枯草菌ゲノムから容易に得ることができる。同様に 、大腸菌のフラジェリン遺伝子は大腸菌遺伝子ストックセンター［Ｅ、ｃｏｌｉ 　ＧｅｎｅｔｉｃＳｔｏｃｋ　Ｃｅｎｔｅｒ　；コネチカット州二二一ヘブン、 セダーストリート３３３．エール大学人類遺伝学部、バーバラ・バックマン（Ｂ ａｒｂａｒａ　Ｂａｃｈｍａｎｎ）館長〕からクラーク（Ｃ１ａｒｋ）およびカ ーボン（Ｃａｒｂｏｎ）ライブラリーのプラスミドｐＬＣ２４−１６として入手 可能である。この遺伝子の一部または全部は表３に示した塩基配列に相補的なオ リゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションにより容易に同定できる。 野生型宿主細胞は少なくとも１本の鞭毛、好ましくは枯草菌や大腸菌の場合のよ うに複数の鞭毛をもたねばならない。１つの実施態様において、宿主細胞はフラ ジェリン生産および運動性が増大した枯草菌のｉｆｍ菌株である。ｉｆｍ突然変 異遺伝子を保有する菌株は野生型宿主細胞よりも有意にに多量のフラジェリンを 生産し、輸送する。また、この菌株は“運動能寒天（ｍｏｔｉｌｉｔｙ　ａｇａ ｒ）”と呼ばれる半固体培地上で接種地点から最も遠くへ移動する細胞を培養コ ロニーから繰り返し選択することによって慣例的に得られる。このようにして得 られた枯草菌のｉｆｍ菌株は野生型枯草菌よりも約２０倍多くのフラジェリンを 生産し、輸送する。以下に詳しく説明するように、枯草菌ｉｆｍ菌株のゲノムに 融合ＤＮＡ配列を適切に挿入すると、遺伝子工学的に処理されたｉｆｍ菌株は同 様に処理された野生型菌株よりも約２０倍多くの異種タンパク質を生産し、かつ 輸送した。 本発明の実施において、フラジェリンのＮ末端部分をコードするＤＮＡ配列（例 えば、枯草菌のｈａｇ遺伝子の一部）は、例えばプロモーター、リポソーム結合 部位および翻訳開始コドンを含む発現調節配列に適切に連結される。好ましくは 、使用する発現調節配列は宿主細胞のフラジェリンのための発現調節配列である 。こうして、血の実施態様では、好適な発現調節配列はｈａｇ遺伝子の発現調節 配列である。 異種遺伝子に融合されるフラジェリンＤＮＡのｉおよび性質に応じて、生産およ び輸送される異種タンパク質は一般に異種遺伝子によりコードされるタンパク質 に連結されたフラジェリンタンパク質の少なくとも一部から成る融合タンパク質 であるだろう。本発明のいくつかの実施態様において、融合ＤＮＡ配列は異種遺 伝子の５′末端にその３′末端が結合した全長フラジェリン−コード化ヌクレオ チド配列を含む。他の実施態様では、フラジェリン−コード配列がその３′末端 で切断される。従って、１つの実施態様では、融合ＤＮＡ配列は異種配列の５′ 末端にヌクレオチド６３３を介して連結されたフラジェリン−コード遺伝子のヌ クレオチド１−８３３を含む。別の実施態様では、ヌクレオチド１−４３２を含 むフラジェリン遺伝子の一部が使用される。その他の実施態様はフラジェリン遺 伝子の４３２−９１２ヌクレオチド領域内のいろいろな長さの欠失を含みうる。 ヌクレオチド４３２の５′側のヌクレオチドがさらに欠失した配列は、融合タン パク質の輸送を可能にしまた最適化する残りのフラジェリン配列の正確な長さが まだ決定されていないが、本発明の実施において有用であると期待される。実際 に、特定の場合にはフラジェリン−コード配列はその鎖長が約７５、５０．２５ または１０個のコドンのみでありうる。もっと短いフラジェリン−コード配列で さえも本発明において使用することができ、そしてフラジェリン遺伝子の５′非 翻訳領域（フラジェリン−コード化ヌクレオチド配列を含まない）単独がいくつ かの場合に異種タンパク質の輸送を可能にするであろう。 本明細書で使用する“異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）　’なる用語はフラジ ェリンタンパク質またはフラジェリンタンパク質をコードするＤＮＡ配列以外の タンパク質またはＤＮＡ配列を含む。 ある実施態様では、フラジェリン遺伝子部分と異種遺伝子とを連結する追加のヌ クレオチド配列が融合ＤＮＡ配列に含まれる。好ましくは、そのリンキング配列 は慣用の化学的または酵素的方法によって選択的に切断もしくは消化しうるポリ ペプチドをコードする。従って、この実施態様の融合タンパク質はそれが選択的 に切断される切断部位を含むであろう。融合タンパク質の切断は異種遺伝子によ ってコードされる゛成熟”タンパク質をもたらす、その後、成熟タンパク質はそ れが連結されていたフラジェリンのポリペプチド断片を含まない、精製された形 で得られるだろう。 好ましくは、遺伝子工学的に処理された宿主細胞は、プロテアーゼの分泌が最低 状態にある生長期の間に、異種タンパク質を生産し、輸送する。枯草菌の場合が そうであり、異種タンパク質の生産および輸送は対数生長期／初期の定常生長期 の間に起こる。また、遺伝子工学的に処理された宿主細胞は、プロテアーゼ類の 輸送レベルをさらに低下させる物質（例えば、枯草菌の場合はグルコース）の存 在下で異種タンパク質を生産し輸送することが好ましい。 本発明は特定の種類の異種ＤＮＡに限定されないが、例えばホルモン、細胞毒、 成長因子または抑制因子、機能的な酵素、および修飾された天然タンパク質また は完全合成タンパク質のようなヒトや動物の治療または診断用途のために有用な タンパク質を含めた広範囲の異種タンパク質が本発明方法によって生産される。 さらに、種々の組換え遺伝子構築物は本発明の主な目的、すなわち細菌によるフ ラジェリンの生産および輸送に通常使用される細菌機構を利用して鞭毛細菌から 異種タンパク質の生産および輸送を行わしめること、を達成するのに有用である と理解すべきである。実際に、組換え法のいくつかの例が以下に示される。従っ て、本発明はその目的を達成する組換え法の特定のいずれか１つの方法に限定さ れないことを理解すべきである。 本発明の遺伝子工学的に操作された細菌をつくる方法は、宿主細菌の染色体から フラジェリン遺伝子の一部または全部を欠失させ、そのフラジェリン欠失位置ま たは他の染色体位置にプラスミド由来の異種遺伝子を単一組換え現象によって挿 入することを包含する。１ｎ　ｖｉｔｒｏで構築された欠失変異形と宿主フラジ ェリン遺伝子との置換は確立された方法を用いて行われる〔スタール（Ｓｔａｈ ｌ）およびフエラーリ（Ｆｅｒａｒｒｉ）、　１９８４　；ヤング（Ｙａｎｇ） ら、１９８４；カワムラおよびトイ、　１９８４を参照〕。 枯草菌における“組込み可能なプラスミド°または“組込みベクター”の使用も 十分な資料によって裏付けられている〔フエラーリ（Ｆｅｒｒａｒｉ）ら、　１ ９８３を参照〕。この特定の組込みベクターは選択可能な抗生物質耐性遺伝子お よび枯草菌ではなく大腸菌内での染色体外複製を可能にするプラスミド複製起点 を含む。さらに、このベクターは宿主ゲノム内の配列に相同性の配列を含まねば ならず、この配列は宿主ゲノムから欠失されていないフラジェリン遺伝子の一部 であり得、あるいはこの配列は他の宿主遺伝子の一部または全部であり得るだろ う。このプラスミドはまた異種タンパク質の発現および輸送を可能にするために フラジェリン遺伝子の一部に融合された異種遺伝子を含む。 上記のような組込みベクターで枯草菌を形質転換すると、プラスミド由来の抗生 物質耐性遺伝子を保有する形質転換細胞が選ばれる０このプラスミドは染色体外 で複製できず、それゆえにプラスミドは染色体とプラスミド上の相同配列間での 単一組換え現象によりゲノム内に組込まれる。得られる染色体構造は相同配列の 重複コピーによってはさまれたプラスミドを含む。抗生物質選択が維持される限 り、プラスミド誘導配列は細菌ゲノムの一部として複製され、かつ受け継がれる 。いくつかの場合に、恐らく抗生物質耐性遺伝子がこのプラスミド上のどこに置 かれるかに応じて、組込まれたプラスミドまたはそのコピー数は初期組込みの選 択に使用したよりも高レベルの抗生物質中でそのプラスミドを保有する菌株を生 育させることにより“増幅”させることができる〔ガッダーリン（Ｇｕｔｔｅｒ ｓｏｎ）およびコシランド（Ｋｏｓｈｌａｎｄ）　、　１９８３を参照〕。これ は異種タンパク質の発現および輸送を増加させる異種遺伝子のコピー数の増幅を もたらす。異種タンパク質の発現および輸送のそれ以上の増加は、増幅の如何に かかわりなく、■し突然変異遺伝子を保有する宿主菌株をそのプラスミドで形質 転換することにより達成される。 第２の方法はフラジェリン欠損菌株（好ましくはｉｆｍ突然変異遺伝子を含むも の）にプラスミドを安定して挿入することを包含１し、その場合プラスミドは先 に述べたような融合ＤＮＡ配列と、さらに枯草菌内での染色体外複製を可能にす る機能的複製起点を含む。このプラスミドはまた形質転換によるプラスミドの遺 伝的継承を選択したりあるいは培養増殖中のプラスミドの保持を確認するために 使用しうる選択可能な遺伝子（例えば、抗生物質耐性遺伝子）を含まねばならな い。異種タンパク質の発現および輸送を最大限にするために、その遺伝子を異な るプラスミド中に挿入することによって異種遺伝子の用量またはコピー数を調節 することが有効である。例えば、枯草菌の分子生物学の分野でしばしば使用され る黄色ブドウ球菌のプラスミドであるプラスミドｐＵ　Ｂ　１１０は有用な高コ ピー数プラスミドである〔グリクザン（Ｇｒｙｃｚａｎ）ら、　１９７ｇを参照 〕。この特定プラスミドは細胞当たり約４０のコピー数をもつ。他のプラスミド ｐＥ１９４は枯草菌中での低コピー数プラスミドとして有用である〔グリクザン （Ｇｒｙｅｚａｎ）およびダブナラ（Ｄｕｂｎａｕ）　、　１９７ｇを参照〕。 このプラスミドで枯草菌を形質転換すると、細胞当たり約５〜ｌＯのコピー数が 維持される。 遺伝子工学的に操作された本発明細菌を作るための第３の方法は、転写および翻 訳調節配列を欠きさらにフラジェリン遺伝子のＮ末端領域をコードする遺伝子の 一部を欠いていてもよいフラジェリン遺伝子の一部の３′末端に融合された異種 遺伝子を含むプラスミドを、完全なフラジェリン遺伝子および好ましくは肛突然 変異遺伝子を含む枯草菌宿主中に組込むことである。この組込み可能なプラスミ ドもまた抗生物質耐性遺伝子および枯草菌ではなく大腸菌内での染色体外複製を 可能にするプラスミド複製起点を含む。このプラスミドで枯草菌を形質転換する 場合、選択は抗生物質耐性遺伝子の遺伝的継承について行われ、染色体内への組 込みはプラスミド上のフラジェリン配列と染色体中のフラジェリン遺伝子の対応 する相同配列との間の単一組換え現象によって仲介される。組込みの結果として 、異種遺伝子は宿主フラジェリン遺伝子の転写および翻訳調節配列ならびに、そ のコード配列の全部または一部に融合される。 フラジェリン遺伝子と異種遺伝子の間の融合接合点は、輸送にとって必要なフラ ジェリン配列の３′側に存在するコドンでなければならない。もしそうであるな らば、このプラスミドの組込みは異種タンパク質の発現および輸送をコードする 完全に機能する遺伝子の１つのコピーを生成する。組込みはまた転写および翻訳 調節配列を欠き且っＮ末端部分をコードする配列を含む又は含まないフラジェリ ン遺伝子と、同じ配列を欠くフラジェリン−異種遺伝子融合物との、２つの頭部 切断された非機能的遺伝子をもたらした。この特定組込み法を用いると、後者の 頭部切断遺伝子はプラスミド配列を増幅させることによって増幅される。従って 、このプラスミドで枯草菌を形質転換すると、宿主フラジェリン遺伝子が妨害さ れ、同時に染色体当たり１のコピー数でフラジェリン遺伝子と異種遺伝子との目 的とする遺伝子融合物が導入される。 本発明の多くの側面および利点は前記の記載ならびに以下で述べる実験実施例、 結果および議論を考慮することにより当業者にとって明らかになるであろう。 実験実施例 物質および方法 細菌株およびプラスミド：大腸菌ＭＭ２９４（Ｅ’　、５ｕｐＥ４４゜ｅｎｄ　 Ａ　１．　ｔｈｉ−１、ｈｓｄ　Ｒ４）はプラスミドの作製のための、およびｐ Ｕ　Ｃ１ｇに基づく枯草菌１６８のゲノムライブラリーをスクリーニングするた めの宿主として使用した。大腸菌はダシヤード（Ｄａｇｅｒｔ）およびエールリ ッヒ（Ｅｈｒｌｉｃｈ）　（１９７９）の方法により形質転換し、そして１５Ｍ ｇ／ｍｌネオマイシン、１５Ｍｇ／ｍｌクロラムフェニコールまたは５０μｚ／ ｒｎｌアンピシリンを含むし寒天平板上で選択した。枯草菌株はアナグツストポ ーロス（Ａｎａｇｎｏｓｔｏｐｏｕｌｏｓ）およびスピジゼン（Ｓｐｉｚｉｚｅ ｎ）（１９６１）の方法により形質転換し、５μｇ／ｍｌネオマイシンまたは５ μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含むＬ寒天平板上で選択した。栄養要求性マ ーカーは５０Ｍｇ／ｍｌの量で適当なアミノ酸類を補充した最少グルコース平板 上で選択した（スピジゼン、１９５８を参照）。枯草菌ＧＩＢＩは枯草菌１６８ 　ｔｒｐ　Ｃ２を枯草菌Ｗ２３ＤＮＡで形質転換し、Ｔｒｐ　形質転換体を選択 することにより作製した。肛突然変異遺伝子はグランド（Ｇｒａｎｔ）およびシ モン（Ｓｉｍｏｎ）　（１９６９）の方法を用いて運動能寒天上で運動能冗進に ついて繰り返し選択することによりこのに菌株から選択した。 プラスミドｐＢＲ３２２、ｐＪ　ＨＩＯＩ　、ｐＵｃｌｇ、ｐＵｃ１９およびｐ Ｕ　Ｂ　１１０はすべて以前に開示されている〔ポリバー（Ｂｏｌｉｖａｒ）ら 、１９７７；ヤニシーペロン（Ｙａｎｉｓｅｂ　−Ｐｅｒｒｏｎ）ら。 １９８５　、フエラーリ（Ｆｅｒｒａｒｉ）ら、１９８３；グリクザン（Ｇｒｙ ｃｚａｎ）ら、１９７８を参照〕。プラスミドｐＡＬＩ△５Ｍはｉｎ　ｖｉｔｒ ｏで酵素的なおよび化学的手段によりインシュリンに変換し得るプロインシュリ ンをコードするように特異的に突然変異誘発されたヒトプロインシュリン遺伝子 を含む（米国特許出願第６４８５７３号および国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ８５１ ０１８７３　；第３図参照）。 試薬および培地：制限酵素、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ。 Ｂａ１−３１エキソヌクレアーゼ、および大腸菌ＤＮＡポリメラーゼエのＫｌｅ ｎｏｗフラグメントは市販源から購入し、そして製造者の説明書に従って使用し た。運動能欠損突然変異株は運動能寒天上でスクリーニングおよび試験した（グ ランドおよびシモン、　１９６９を参照）。相同および異種タンパク質の発現お よび輸送のために、培養物は２％グルコース、０．１％工業級カザミノ酸（ジフ コ）、および５０Ｍｇ／ｍｌの適当なアミノ酸類を補充した最少塩類（スピジゼ ン、　１９５８を参照）を含む発現培地中で増殖させた。いくつかの実験では、 全タンパク質は上記培地に１０μＣｉ／ｍｌを加えることによりＬ　−（３５Ｓ ）　−メチオニン（＞４００Ｃｉ／ミリモル；ニューイングランド・ヌクレアー ）で標識した。 ＤＮＡおよびタンパク質の同定ニブラスミドＤＮＡはバーンボイム（Ｂｉ　ｒｎ ｂｏｉｍ）およびドリー（Ｄｏｌｙ）　（１９７９）のアルカリ溶菌法により大 腸菌形質転換体から得た。枯草菌の染色体ＤＮＡは？　？　−（Ｍａｒｍａｒ） 　（１９６１）の方法を用いて調整した。 ポリアクリルアミド−アガロースゲル上での制限フラグメントの分離およびＤＮ Ａフラグメントの電気溶離は従来の方法を用いて実施した〔ローン（Ｌａｗｎ） ら、　１９８１を参照〕。すべてのプラスミドの構築はゲルからの電気溶離によ り精製したＤＮＡフラグメントを用いて行った。制限フラグメントはジデオキシ 法（サンガーら、　１９７７を参照）による塩基配列決定のためにＭ１３ファー ジベクターｍｐ１８またはｍｐ１９　（ビエイラ（Ｖｉｅｉｒａ）およびメッシ ング（Ｍｅｓｓｉｎｇ）、　１９８２　；ヤニシーベロンら、　１９８５を参照 〕の適当な部位に連結した。ＤＮＡ制限フラグメントはニック−トランスレーシ ョンにより〔α−３２Ｐ）ＣＴＰで標識することによってプローブとして使用し た〔リグビー（Ｒｉｇｂｙ）ら。１９７１を参照〕。合成オリゴヌクレオチドは ホスホトリエステル法で合成し〔フレア（Ｃｒｅａ）および（Ｈｏｒｎ）　、　 １９８０を参照〕、〔γ−”Ｐ）ＡＴＰおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを 用いて末端標識した〔リチャードソン（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ）　。 １９７１を参照〕。標識オリゴヌクレオチドプールのためのハイブリダイゼーシ ョン条件はＩ　Ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、０．１　ｍＭ　ＡＴＰ。 １ｍＭ　Ｎａ　Ｃρ、０．５％ノニデットＰ　−４０（Ｎｏｎｉｄｅｔ　；商標 名、非イオン洗剤、シグマ）　、２００ｎｇ　／ｍｌ可溶性タイプのパン用酵母 ＲＮＡ　（シグマ）、９０ｍＭトリス−ＯＨ（ｐＨ７，５）、および６ｍＭ　Ｅ ＤＴＡを含む溶液中３７℃であった。洗浄は６×Ｓ　Ｓ　Ｃ（Ｉ　Ｘ５ＳＣは０ ．１５Ｍ　Ｎａ　Ｃｐ十０．０１５　Ｍクエン酸ナトリウムである）中にて３７ ℃であった。サザンハイプリダイゼーション分析のために、消化したＤＮＡフラ グメントは１％アガロース上で分離し、ワール（Ｗａｈｌ）ら（１９７９）の方 法でプリンを除き、サザン（１９７５）の方法によりニトロセルロースに移した 。サザンプロットとニック−トランスレーションしたプローブとのハイブリダイ ゼーションおよび洗浄はマニアラス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら（１９７８）が開示 するごとく行った。 相同または異種タンパク質の発現および輸送のために、単離したコロニーを画線 平板（Ｓｔｒｅａｋ　ｐｌａｔｅ）または形質転換平板から採取し、Ｌｉ２．メ チオニンを含む又は含まない発現培地に接種した。培養物は中間対数生長期（Ｏ Ｄ　＝　０．５）５０ｎｍ まで増殖させ、この時点でフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）および ＥＤＴＡをそれぞれ１ｍＭの最終濃度で培養物に加えた。ＰＭＳＦおよびＥＤＴ Ａはそれぞれセリンプロテアーゼおよびメタロプロテアーゼの阻害剤であり、そ れらの添加は培地中の異種タンパク質の安定性を高める。プロテアーゼ阻害剤の 添加後１時間して、１ｍｌのアリコートを取り出し、試験すべき菌株が野生型フ ラジェリン遺伝子をそのまま含む場合は、培養物試料を８０℃で１０分間加熱し て鞭毛繊維をフラジェリンモノマーに解重合する。フラジェリン−異種融合タン パク質が発現・輸送される場合は、熱処理を必要としない。その後、培養物アリ コートは１．５　ｍｌエッペンドルフ管中でエッペンドルフ遠心機を用いて３分 間遠心し、９００μｇの上清を取り出し、１００％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）１ ００μｇを含む別の管に加えた。ＴＣＡ沈澱を氷上で２０分間行わせ、次いで５ 分間遠心し、沈澱物を冷アセトンの１ｍｌアリコートで３回洗浄した。細胞沈澱 物は洗浄緩衝液（１００ｍＭ　トリスｐＨ８，１５０ｍＭ　Ｎａ　ＣΩ。 １ｍＭ　ＥＤＴＡ）１ｍｌ中で洗浄し、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ）リスｐＨ８，１ ｍＭ　ＥＤＴＡ）５０μΩ中に再懸濁した。その後、細胞を超音波処理により破 壊した。細胞沈澱物および上清分画からのタンパク質はその後レムリ（Ｌａｅｍ ｍｌｉ）　（１９７０）の方法に従って５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分 離し、バーネット（Ｂｕｒｎｅｔｔｅ）　（１９８１）の方法によりウェスター ンプロット分析のために電気泳動的にニトロセルロースに移行させた。 枯草菌１６８のフラジェリンはマルタンズ（Ｍａｒｔｉｎｅｚ）　（１９６３） の方法により精製した。ひとたび単離されると、この物質は分離用５ＤＳ−ポリ アクリルアミドゲル上で少量の汚染物質から分離した。フラジェリンを含むバン ドを切り出し、凍結乾燥し、そしてウサギにおけるフラジェリン特異的抗体の生 産のための抗原として使用した。この方法はウェスターンプロット分析によるフ ラジェリンおよびフラジェリン−異種融合タンパク質検出用の高度に特異的な抗 体の生産をもたらした。 結　果 ｉｆｍ突然変異遺伝子の同定：枯草菌ＧＩＢＩおよび枯草菌ＧＩＢ１ｉｆｍはＬ −３５訃メチオニンを含む発現培地中で中間対数生長期まで増殖させた。方法の セクションで述べたようにして培養物からの試料を処理し、２つの菌株から生産 されフラジェリンのレベルを比較した。ｆｍｆ突然変異遺伝子を含む菌株からは 約１０倍以上のフラジェリンが輸送された。抗フラジェリン抗体を用いるウェス ターンプロット法により、このタンパク質がフラジェリンであることを確かめた 。 枯草菌ｈａｇ遺伝子のクローニング：枯草菌ＧＩＢＩのｈａｇ遺伝子のハイブリ ダイゼーションによるクローニングのために、１７−　ｍｅｒオリゴヌクレオチ ドプローブプールを、発表されたフラジェリンのアミノ酸配列に基づいて考案し た〔プランジ（Ｄｅｌａｎｇｅ）ら、　１９７Ｂを参照〕。１２種の１７−　ｍ ａｒオリゴヌクレオチドから成る２つのプールは、配列（Ａｓｎ−１１ｅ　−Ｇ （ｌｕ　−ＡＳ＋）−Ｍｅｔ−Ｇρｙ）のアミノ酸１７０−１７４およびアミノ 酸１７５のグリシンコドンの最初の２つの塩基の縮重（ｄｅｇｅｎｅｒａｃｙ） を完全に包含していた。プール番号１のオリゴヌクレオチドの配列は５°−Ａ− Ａ−Ｔ／Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｔ／Ｃ，／Ａ−Ｇ−Ａ−Ａ／Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｇ −Ｇ−Ｇ−３°であり、プール番号２　ハ５−Ａ−Ａ−Ｔ／Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｔ／Ｃ ／Ａ−Ｇ−Ａ−Ａ／Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−３°である。 ゲノムライブラリーは枯草菌ＧＩＢＩ由来のＤＮＡを使用してｐＵＣ１ｇ中に作 製した。ベクターはＳａ、ＱＩで消化し、５′重複末端に相補的な最初の２つの 塩基をＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメントおよびｄＴＴＰとｄＣ ＴＰで処理することにより修復した。細菌ＤＮＡは５ａｕ３Ａで部分消化し、分 離用アガロースゲルで大きさに基づいて分画化した。大きさが２〜５Ｋｂの範囲 にあるＤＮＡフラグメントを切り出し、ゲルから電気溶離し、その後Ｋ　Ｉ　ｅ ｎｏｗフラグメントおよびｄＧＴＰとｄＡＴＰで処理して重複末端に相補的な最 初の２つの塩基を修復した。次に、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて挿入物とベクタ ーＤＮＡとを連結した。この方法はベクターにただ１つの挿入物を組み入れ、２ つまたはそれ以上の挿入物ＤＮＡフラグメントの直列連結またはベクターＤＮＡ フラグメント同士の連結を防止するものであった〔ハング（Ｈｕｎｇ）およびウ エンシク（Ｗｅｎｓｉｋ）　、　１９８４を参照〕。大腸菌ＭＭ２９４を上記の 連結ＤＮＡで形質転換し、そしてグルンスタイン（Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ）および ホグネス（Ｈｏｇｎｅｓｓ）　（１９７５）の方法に従ってニトロセルロースへ 移行させることにより、フラジェリン遺伝子を含む挿入物をもつプラスミドにつ いて細菌コロニーをスクリーニングした。ハイブリダイゼーション陽性として同 定された２つのクローンｐ４Ａおよびｐ８Ａの大まかな制限地図を第１図に示す 。ｐ４Ａおよびｐ８Ａの両方に含まれるオープン・リーディング・フレームの完 全配列は３０４個のアミノ酸から成るタンパク質をコードすることが判明し、２ 個のアミノ酸を除くすべてが枯草菌１６８フラジエリンの発表されたタンパク質 配列と相同であった〔プランジ（Ｄｅｌａｎｇｅ）ら、　１９７８を参照〕。例 外はグリシン−１０１およびトレオニン−１０２の１対のアミノ酸であり、発表 された配列ではこれらのアミノ酸が逆になっている。 塩基配列が決定されたクローンｐ４Ａの範囲を第１図に示し、その塩基配列自体 を表１に示す。 大腸菌−枯草菌シャトルベクターの作製二大腸菌−枯草菌シャトルベクターｐＢ Ｅ３はｐＵｃ１８（ポリリンカー（Ｌ４７ｂｐのＥｅｏＲＩ　−ＰｖｕＩＩ制限 フラグメント）、ｐＢＲ３２２複製起点（１１６ＥｆｂｐのＰｖｕＩｒ　−Ａｈ ａｍ制限フラグメント）、およびｐｔｙ　Ｂ　１１０由来のネオマイシンヌクレ オチジルトランスフエラーゼ遺伝子および複製起点（３５２９ｂｐのＰｖｕＵ− ＥｃｏＲＩ制限フラグメント）を含む。円形地図における時計回りの方向でのこ れらのフラグメントの順序はＥｃｏＲＩ・・ポリリンカー・・ＰｖｕＩＩ／　Ｐ ｖｕＩＩ−ｐＢ　Ｒ３２２複製起点＝Ａｈａ　ｍ／　Ｐ　ｖｕＩＩ　−・ｐＵ　 Ｂ　１１０複製起点・・ネオマイシン遺伝子・・ＥｃｏＲＩである。 このプラスミドは自律的に複製し、大腸菌と枯草菌の双方にネオマイシン耐性を 与える。 組込みベクターｐｌＥＶ１は大腸菌内で自律的に複製する１）ＪＨＩＯＩの誘導 体であるが、枯草菌を形質転換する場合には染色体のフラジェリン位置に組込ま れねばならない。このプラスミドはｐＪ）（ｌｏｔ由来のクロラムフェニコール アセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子および複製起点（３２２４ｂｐの Ｐｓｔ−ＡｖａＩ制限フラグメント）、ｐＵ　Ｃ１ｇポリリンカーの一部（２０ ０ｂｐのＰｖｕＩＩ　−ＸｂａＩ制限フラグメント）、およびｈａｇプロモータ ー領域のちょうど５′側の枯草菌染色体由来の４００ｂｐのＨｉｎｄ　ｍ　−Ｐ ｓｔ　Ｉ制御フラグメント（第１図参照）を含む。ＡｖａＩ、ＸｂａＩおよびＨ ｉｎｄｍ末端の５′重複部分は連結の前にＤＮＡポリメラーゼＩのＫ　Ｉ　ｅｎ ｏｗフラグメントおよび４種すべてのｄＮＴＰを使用して修復した。円形地図に おける時計回りの方向でのこれらの制限フラグメントの順序はＰｓｔＩ・・複製 起点−ＣＡＴ遺伝子・・Ａｖａ　Ｉ　／　ＰｖｕＩＩ・・ポリリンカー・・Ｘｂ ａ　Ｉ　／　Ｈｉｎｄ　ｍ・−４００ｂｐ染色体フラグメント＝ＰｓｔＩである 。 ｐｌＥＶｌｆ　１ａ３０４ＰＩ△Ｃの作製ニブラスミドｐｌＥＶｌｆ　１ａ３０ ４円△ＣはプラスミドｐＢＥ３．ｐＡＬΔ５Ｍ、ｐ４Ａおよびｐｔ　ＥＶｌの誘 導体であり、ｐＢＲ３２２複製起点、大腸菌と枯草菌の双方にクロラムフェニコ ール耐性を与えるＣＡＴ遺伝子、フラジェリンのアミノ酸１４４−３０４をコー ドする配列（表１を参照）、４個の接合アミノ酸（ＧΩｙ−Ｍｅｔ−ＧΩｎ−Ａ ｆｌａ）、および△５Ｍプロインシュリン遺伝子（表２を参照）を含む。 後者のコード配列は転写および翻訳を開始させる調節配列を含んでいない。枯草 菌ＧＩＢ１ｉｆｍを形質転換する場合、それは相同なプラスミド由来のフラジェ リン配列と染色体のフラジェリン配列の間の単一組換え現象により組込まれ、そ してフラジェリンの１−３０４アミノ酸、４個の接合アミノ酸および△５Ｍプロ インシュリン配列を含む融合タンパク質をコードする機能的遺伝子の再構成をも たらす。この遺伝子は宿主のフラこのプラスミドは次のように構築された。ｐＢ Ｅ３由来の４７５０ｂｐ　Ｈｌｎｄ　ｍ　−ＰｖｕＩＩ制限フラグメント（Ｈｉ ｎｄ　ｍ５’重複部分の最初の３つの塩基はｄＡＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＣＴＰ を用いてＫ　ｌ　ｅｎｏｗフラグメントにより修復した）を、ｐＡＬＴΔ５Ｍ由 来の４７０ｂｐ　Ｓｐｈ　Ｉ　−Ｎｄｅ　Ｉ制限フラグメント（Ｓｐｈ　Ｉ部位 の３′重複部分はＫ　Ｉ　ｅｎｏｗフラグメントを用いて除き、そしてＮｄｅＩ ５’重複部分の最初の塩基はｄＴＴＰを用いてｋｌｅｎｏｗフラグメントにより 修復した）と連結してｐＦＰｌｌを作製した。ｐＦＰ１１由来の５２００ｂｐ　 ＢａｍＨｌ　−Ｐｓｔ　Ｉ制限フラグメント（ＰｓｔＩの３′重複部分はＫ　Ｉ 　ｅｎｏｗフラグメントを使用して除いた）はｐ４Ａ由来の２６３２ｂｐ　Ｂａ ｍＨＩ　−Ａｈａ　ｍ制限フラグメントと連結してｐＦＰＩ　ｆ　１ａ３０４を 作製した。ｐ４Ａ由来のフラグメントのＡ　ｈａｍ末端は連結の前に“遅い（Ｓ ｌｏｗ）”ｂａｉ）　−３１エキソヌクレアーゼで処理し、そして適当なｐＦＰ 　Ｉ　ｆｌａ３０４構築物は正しい連結接合点に架かるオリゴヌクレオチド（５ ′−Ｔ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ａ− Ａ−３”）を用いるコロニーハイブリダイゼーションによりスクリーニングした 。適当な構築物を確かめるために、ハイブリダイゼーション陽性の塩基配列を決 定した。 ｐＰＰＩｆｌａ３０４由来の１６２１ｂｐ　ＢａｍＨＩ　−Ｂ　ｇＩＩ制限フラ グメン）　（ＢｇＮ　Ｉ５’重複部分はＫｌｅｎｏｖフラグメントと４種すべて のｄＮＴＰを用いて修復した）はｐｌＥＶ１由来の３８２７ｂｐＢａｍＨＩ　− ＥｃｏＲＩ制限フラグメント（ＥｃｏＲＩ　５’重複部分はＫｌｅｎｏｗフラグ メントと４種すべてのｄＮＴＰを用いて修復した）と連結してｐＩＥＶｌｆｌａ ３０４Ｐ　Ｉを作製した。プラスミドｐｌＥＶ１ｆｌａ３０４円△ＣはｍＥＶ１ ｆｌａ３０４ＰＩをＣ，ＱａＩで消化し、４５００ｂｐフラグメントを精製し、 同じフラグメントを再連結することにより作製した。 枯草菌ＧＩＢ１ｉｆｍによるフラジェリン−プロインシュリン融合タンパク質の 発現および輸送ニブラスミドｐｌＥＶｌｆ　Ｉａ３０４円△Ｃを用いて枯草菌Ｇ ＩＢＩユバを形質転換し、単離したコロニーを２５０　ｍｌバッフル付きオルシ ンマイヤーフラスコ中のし−（３５３３−メチオニン含有発現培地１０ｍ１に接 種した。培養物は２５Ｏｒｐｍで作動する回転振盪器上にて３７℃でインキュベ ーションした。中間対数生長器（ＯＤ　＝０．５）にプ５０ｎｍ ロチアーゼ阻害剤を添加し、１時間後試料を取り出して方法のセクションで述べ たように処理した。３５訃メチオニンでの全標識化およびウェスターンプロット オートラジオグラムの試験の後、フラジェリン−プロインシュリン融合タンパク 質は抗フラジェリン抗体が結合し且つフラジェリンの泳動と比較した場合に予測 された分子曾で泳動するバンドとして同定された。培養物アリコートの上清分画 中にこのバンドが出現することは、有意量のフラジェリン−プロインシュリン融 合タンパク質が培地中に輸送されたことを示している。 議　論 枯草菌ＧＩＢ１ｉｆｍのフラジェリンは、細胞外プロテアーゼの分泌を最小限に 抑えるグルコースの存在下で対数生長期の間に総細胞タンパク質の１０〜２０％ までの量で輸送される。本発明では、このフラジェリン輸送経路が培地中へ異種 融合タンパク質を輸送するために利用された。この系の特定の実施態様では、組 換えフラジェリン−プロインシュリン融合タンパク質がフラジェリン輸送経路を 経て輸送された。この同じ実験方法は他のフラジェリン−異種融合タンパク質（ すなわち、フラジェリン−ＴＥＭβ−ラクタマーゼ融合物）を輸送するために首 尾よく使用された。この特定β−ラクタマーゼはプラスミドｐＵｃ１ｇ（ヤニシ ーペロンら、　１９８５を参照）由来のものであり、大腸菌を含めた種々のグラ ム陰性菌にアンピシリン耐性を与える。フラジェリン−β−ラクタマーゼ遺伝子 融合物はバシラス菌内で発現され、そしてこのバシラス菌は培地中ヘフラジエリ ンーβ−ラクタマーゼ融合タンパク質を蓄積させた。この融合タンパク質はβ− ラクタマーゼ活性を有し、また抗フラジェリン抗体および抗β−ラクタマーゼ抗 体と交差反応する。さらに、フラジェリン−β−ラクタマーゼ遺伝子融合物を保 有する菌株はアンピシリン耐性であった。これらの結果はフラジェリン輸送系が 多くの相同および異種タンパク質の生産にとって有用であることを示している。 フラジェリン−プロインシュリン融合タンパク質は、フラジェリンアミノ酸残基 とプロインシュリン残基の間の接合点にメチオニン残基を含み、こうしてプロイ ンシュリンは臭化シアンによりフラジェリンから切断されるだろう。従って、臭 化シアンによる融合タンパク質の処理およびシュードモナス・フラボ（Ｐｓｅｕ ｄｏｍｏｎａｓ　ｆｒａｇｉｉ）からの特定プロテアーゼによる処理を組み合わ せることによって、適切に折りたたまれた活性インシュリンが得られるだろう。 従って、多種多様の相同または異種タンパク質をフラジェリン経路を経て輸送す るための方策は、タンパク質“Ｘ”のコード配列をフラジェリンコード配列の一 部または全部に融合し、且つその接合点に目的とする配列を化学的または酵素的 方法によって除去しうるような特定の切断部位を導入することである。メチオニ ン残基のカルボキシ側で切：断する臭化シアンのほかに、アスパラギン酸とプロ リン残基の間を切断する蟻酸も使用し得る〔エルシン（Ｎｉ　ｌ５ｓｏｎ）ら、 １９８５を参照〕。高“度に特異的なプロテアーゼ類も部位特異的切断に有用で ある。２つの例は配列（Ａｓｐ）　４−　Ｌｙｓ）のカルボキシ側で切断する” ブタエンテロペプチダーゼ〔マロー（Ｍａｒｏｕｘ）ら、１９７１を参照〕、お よび配列Ｉρｅ−Ｇρｕ　−Ｂｊ７ｙ　−Ａｒｇのカルボキシ側で切断するＸａ 因子〔ナガイ（Ｎａｇａｉ　）およびトガ−セン（Ｔｈｏｇｅｒ、５ｅｎ）、　 １９８４を参照〕である。これらまたは他の特定プロテアーゼのための特定認識 部位のいずれかをコードするヌクレオチド配列は、慣用の組換え法により、フラ ジェリン−タンパク質“Ｘ″コード配列接合点に配置することができる。フラジ ェリン経路を通って輸送された融合タンパク質を切断するために特定のプロテア ーゼを使用すると、そのＮ末端にｆ−ＭｅｔまたはＭｅｔ残基を含まないタンパ ク質“Ｘ”が放出されるであろう。 フラジェリン経路を経る輸送がフラジェリンコード配列の一部または全部を必要 とするという事実は、フラジェリン−タンパク質“Ｘ“融合タンパク質の精製に 関して有利である。フラジェリンは精製が簡単であり且つ高度に抗原性であるの で、融合タンパク質はフラジェリン抗体を用いたアフィニティークロマトグラフ ィーにより精製し、その後適当な化学的または酵素的手段によってプロセッシン グすることができる。 フラジェリン融合タンパク質として輸送された多くの相同または異種タンパク質 は、成熟した活性形となるために上記のような特定の化学的または酵素的手段に よるプロセッシングを必要とするであろう。この型のタンパク質の例にはインシ ュリン、コロニー刺激因子、ヒト成長ホルモン、またはヒトへの用途を意図した その他の医薬品が含まれる。他のタンパク質、例えばプロテアーゼやアミラーゼ のような酵素または動物成長ホルモンのようなタンパク質はフラジェリン融合タ ンパク質として活性であり、そのまま使用するのに適している。このような場合 には、フラジェリンコード配列の除去に必要とされる特定の化学的または酵素的 プロセッシング工程を必要としないであろう。 フラジェリン輸送経路を経る相同または異種タンパク質の輸送は、宿主細胞、ベ クター、およびプロモーター−ベクターの組合せを変更することによってさらに 改良されるだろう。少なくとも２つの一般的カテゴリーの宿主細胞突然変異体は 、この方法で得られるフラジェリン−タンパク質“Ｘ″融合タンパク質の最終収 量をさらに高めうる。培地中に輸送されたタンパク質の安定性を高めるために、 プロテアーゼ活性の低下した突然変異宿主が使用される。大多数のプロテアーゼ 活性は単に培養物を過剰のグルコースの存在下で生育させることにより最小限に 抑えることができるが、それ以上の改良は多面発現性であり且ついくつかのプロ テアーゼの発現低下をもたらす狂％０突然変異遺伝子のような調節遺伝子の突然 変異体を単離することによって得られる〔ミケル（Ｍｉｃｈｅｌ）およびミレッ ト（Ｍｉｌｌｅｔ）　。 １９７０　、ホッホ（Ｈｏｃｈ）　、　１９７６を参照〕。組換え法を使用して 、アルカリ性および中性プロテアーゼ遺伝子の場合に達成されたように、他のプ ロテアーゼ構造遺伝子のｉｎ　ＶｉｔｒＯ誘導突然変異遺伝子を単離することも できる〔スタール（Ｓｔａｈｌ）およびフエラーリ（Ｆｅｒｒａｒｉ）、　１９ ８４　；ヤング（Ｙａｎｇ）　、　１９８４　；カワムラおよびトイ、　１９８ ４を参照〕。 フラジェリンそれ自体のコード配列内の突然変異は若干のフラジェリン−タンパ ク質“Ｘ″融合タンパク質の輸送効率を高めうる。恐らく、これらの突然変異は 融合タンパク質の輸送を導くのに重要なフラジェリンのその部分をコードする配 列内で起こるだろう。 目的の融合タンパク質をコードする遺伝子と宿主のフラジェリン遺伝子の同一細 胞内での共存が同じ輸送部位機構に対して融合タンパク質とフラジェリンとの間 に競合をもたらす場合、宿主フラジェリン遺伝子はフラジェリン融合タンパク質 のより効率的な輸送を得るために不活性化することができる。方法および結果の セクションで述べた例において、これは発現ベクターｐｌＥＶ１ｆ　Ｉａ３０４ ＰＩ△Ｃを宿主フラジェリン遺伝子に組込むことにより達成された。組込み現象 は活性なフラジェリン−プロインシュリン遺伝子融合物を生成させ、同時に固有 のフラジェリン遺伝子を不活性化した。宿主フラジェリン遺伝子の不活性化はま たその遺伝子をｉｎ　ｖｉｔｒｏ誘導欠失変異遺伝子と取り換えることにより達 成しうる（スタールおよびフエラーリ、１９８４；ヤングら、１９８４；カワム ラおよびトイ、　１９８４を参照）。これは最終的に目的生産物の収量を増大し うるベクター−プロモーター組合せの使用頻度を高めるであろう。以下の例はフ ラジェリン遺伝子の全部または一部が欠失された宿主菌株の使用が生産物の収量 増加にとって有用である場合の例である。これらの例におけるフラジェリン−タ ンパク質“Ｘ”遺伝子融合物の転写および翻訳を開始させる調節配列はフラジェ リン遺伝子からのものであるか、または転写および翻訳が構成性である他の遺伝 子からのものであり得、あるいはこれらの配列は調節されるが故に制御しうる遺 伝子からのものであり得る。後者の型の調節配列は培養密度が高くなるまで遺伝 子発現を抑制することが望まれる場合に使用され、培養密度が高くなった時点で 転写および翻訳が開始されて培地中への生産物の蓄積が生じる。上記の調節配列 のいずれか１つによって制御される異種または相同タンパク質をコードする遺伝 子の発現は、組込み可能なプラスミド（フエラーりら、　１９８３を参照）また は染色体外で複製するｐＥ１９４　（グリクザン（Ｇｒｙｃｚａｎ）およびダブ ナラ（Ｄｕｂｎａｕ）　。 １９７８を参照〕のような低コピーベクター、あるいは染色体外で複製するｐＵ Ｂｌｌｏ　（グリクザンら、１９７８を参照）およびｐＢ　Ｅ　３のような高コ ピーベクター上でありうる。組込みベクターは染色体中のいずれかの遺伝子に挿 入される。特に興味ある挿入部位は中性プロテアーゼ構造遺伝子のような正常な 生長にとって必ずしも必要でない遺伝子である（ヤングら、　１９８４を参照） 。この遺伝子はクローニングされて、そのコード配列の一部は組換えによる組込 みにとって必要な組込み可能なプラスミド上の相同配列として使用されるだろう 。 鞭毛の他のタンパク質（例えば、フックや基体のタンパク質）の遺伝子またはそ の一部をフラジェリン遺伝子の代わりに使用して、異種タンパク質の生産および 輸送を達成することもできる。このような場合にはタンパク質を回収し、精製し 、そして全体的にまたは部分的にそのアミノ酸配列を決定する。そのタンパク質 をコードする遺伝子は例えばオリゴヌクレオチドプローブを用いるハイブリダイ ゼーションにより同定し得る。 本発明によるこのような遺伝子の同定および使用は、フラジェリンに関する実施 態様においてここで述べた方法と類似の方法により達成することができる。 大腸菌は確かにフラジェリン輸送系での使用にとって興味をそそる宿主である。 フラジェリン遺伝子は本明細書で上述したように容易にクローニングすることが でき、フラジェリン−異種遺伝子融合物は低コピーまたは高コピープラスミドベ クターの一部として、あるいは染色体内に組込まれた配列として発現される。突 然変異遺伝子ｃｆｓが単離され、これは菌株内に導入したとき５倍のフラジェリ ン過剰生産をもたらし且つその菌株を構成的に運動性にする（シルバーマンおよ びシモン、　１９７７を参照）。５倍以上のフラジェリン−異種融合タンパク質 は、その遺伝子融合物を含む適当なベクターをこの突然変異株の中に導入する場 合に生産されるだろう。 引用文献 Ａｎａｇｎｏｓｔｏｐｏｕｌｏｓ、　Ｃ，およびＪ、　５ｐｉｚｉｚｅｎ、　１ ９６１．枯草菌形質転換のための必要条件、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　８ １　：　７４１−７４６゜Ｂｉｒｎｂｏｉｍ、　Ｈ，Ｃ，、およびＪ、　Ｄｏｌ ｙ、　１９７９．組換えプラスミドＤＮＡをスクリーニングするための迅速なア ルカリ抽出法。 Ｎｕｃｌｃｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、７　二　１５１３　−１５２３゜Ｂｏｌ ｉｖａｒ、　Ｆ、、　Ｒ，Ｌ、　Ｒｏｄｒｌｇｕｅｚ、　Ｐ、　Ｊ、　Ｇｒｅｅ ｎｅ、　Ｍ、　Ｃ。 Ｂｅｔｌａｃｈｙ、　Ｈ，Ｌ、　Ｈｅｙｎｅｃｋｅｒ、　Ｈ，Ｗ、　Ｂｏｙｅｒ 、　Ｊ、　Ｈ，Ｃｒｏｓａ、およびＳ　、　Ｆａｌｋｏｗ、　１９７７、新しい クローニングベヒクルＨの構築および同定、多目的クローニング系、　Ｇｅｎｅ 　２　：　９５−　１１３゜Ｂｕｒｎｅｔｔｅ、　Ｗ、　Ｎ、　１９８１．　“ ウェスターンブロッティング：ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲ ルから未変性ニトロセルロースへのタンパク質の電気泳動移行および抗体と放射 性ヨウ素化プロティンＡによる放射線検出、　Ａｎａｌ。 Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１１２　：　１９５−２０３゜Ｃｒｅａ、　Ｒ，、およびＴ 、　Ｈｏｒｎ、　１９８０．ホスホトリエステル法によるセルロース上でのオリ ゴヌクレオチドの合成、　ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、　８　：　２３ ３１−２３４８゜Ｄａｇｅｒｔ、　Ｍ、、およびＳ、　Ｄ、　Ｅｈｒｌｉｃｈ、 　１９７９．塩化カルシウム中での長期インキュベーションは大腸菌細胞の受容 能力を高める。　Ｇｅｎｅ　６　：　２３−２８゜Ｄｃｌａｎｇｃ、　Ｒ，Ｊ、 、　Ｙ、　Ｃｈａｎｇ、　Ｊ、　Ｈ、５ｈａｐｅｒ、およびＡ、　Ｍ。 Ｇｌａｚｅｒ、　１９７６、枯草菌１６８のフラジェリンのアミノ酸配列。 Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２５４ニア０５−７１１゜Ｐｅｒｒａｒｉ、　 Ｆ、　Ａ、　Ａ、　Ｎｇｕｙｅｎ、　Ｄ、　Ｌａｎｇ、およびＪ、　Ａ、　Ｈｏ ｃｈ。 １９８３、枯草菌用の組込み可能なプラスミドの構築および性質。 Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　’１５４　：　１５１３−１５１５゜Ｆｒａｓｅ ｒ、　Ｔ、　Ｈ，、およびＢ、Ｊ、　Ｂｒｕｅｅ、　１９７８．鶏の卵アルブミ ンは大腸菌により合成されかつ分泌される。　Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａ ｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　７５　：　５８３６　−５９４０゜Ｇ１１ １．　Ｐ、　Ｒ，、およびＮ、　Ａｇａｂｉａｎ、　１９８２．　カラロバフタ −・フレセンラスのフラジェリンモノマーの比較構造分析はこれらのタンパク質 が２つの遺伝子によってコードされることを示した。　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏ ｌ、　１５０　：　９２５−９３３゜Ｇ１１１．　Ｐ、　Ｒ，、およびＮ、　Ａ ｇａｂｉａｎ、　１９８３．　カラロバフタ−・フレセンラスのＭｒ＝２８５０ ０フラジェリン遺伝子のヌクレオチド配列、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　 ２５８ニア３９５−７４０１゜Ｇｒａｎｔ、　Ｇ、　Ｆ、およびＭ、　１．　Ｓ ｉｍｏｎ、　１９６９．細菌鞭毛■の合成、枯草菌中の鞭毛特異的マーカーのＰ ＢＳＩ　）ランスダクション、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　９９　：　１１ Ｂ　−１２４゜Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ、　Ｍ、、　ａｎｄ　Ｄ、　Ｈｏｇｎｃｓｓ 、　１９７５．　コロニーハイブリダイゼーション：特定遺伝子を含むクローン 化ＤＮＡの単離方法、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｅａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、 　Ｓ、　Ａ、　７２　：　３９６１−３９８５゜Ｇｒｙｃｚａｎ、　Ｔ、　Ｊ、 、　Ｓ、　Ｃｏｎｔｅｎｔｅ、およびり、　Ｄｕｂｎａｕ、　１９７８゜枯草菌 の形質転換により導入された黄色ブドウ球菌プラスミドの同定、　Ｊ、　Ｂａｃ ｔｅｒｉｏｌ、　１３４　：　３１ｇ　−３２９゜Ｇｕｔｔｅｒｓｏｎ、　Ｎ、 　１．、およびり、　Ｅ、　Ｋｏｓｈｌａｎｄ、　Ｊｒ、　１９８３．１ｎｖｉ ｔｒｏで改変した配列と細菌遺伝子との置換および増幅。 Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　８０　： 　４８９４−４８９ＬＨｏｃｈ、　Ｊ、　Ａ、　１９７６、細菌の胞子形成の遺 伝学、　Ａｄｖ、　Ｇｅｎｅｔ。 １８　：　６９　−９８゜ Ｈｕｎｇ、　Ｍ−Ｃ，、およびＰ、　Ｃ，Ｗｅｎｓｉｃｋ、　１９８４．異なる 制限酵素により生じた接着ＤＮＡ末端はｉｎ　ｖｉｔｒｏで接合しうる。 Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１２　：　１８６３−１８７４゜１ｉ ｎｏ、　Ｔ、　１９７７、細菌鞭毛の構造および機能の遺伝学、　Ａｎｎ。 Ｒｅｖ、　Ｇｅｎｅｔ、　１１　：　１６１−１８２゜Ｊｏｙｓ、　Ｔ、　Ｍ、 、およびＶ、　Ｒｏｕｋｉｓ、　１９７２．ネズミチフス菌の相−１鞭毛タンパ ク質の１次構造、トリブチツクペプチド。 Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２４７　：　５１８０−５１９３゜Ｋａｗａｍ ｕｒａ、　Ｐ、、およびＲ，Ｈ，Ｄｏｔ、　１９８４．細胞外アルカリ性および 中性プロテアーゼが欠損した枯草菌２重変異株の作製。 Ｊ、　Ｂａｃｔｃｒｉｏｌ、　１８０　：　４４２−４４４、Ｋｏｍｃｄａ、　 Ｙ、　１９８２．　Ｍｕｄ　ｌａｃ　バクテリオファージ上のラクトース遺伝子 への鞭毛オペロンの融合、　Ｊ、　Ｂａｃｔｃｒｉｏｌ、　１５０：１Ｂ−２６ ゜ Ｌａｅｍｍｌｉ、　Ｌｌ、　Ｋ、　１９７０．　バクテリオファージＴ４の頭部 形成中の構造タンパク質の切断、　Ｎａｔｕｒｅ　２２７　：　６８０−６８５ ゜Ｌａｗｎ、　Ｒ，Ｍ、、　Ｊ、　Ａｄｅｌｍａｎ、　Ｓ、　Ｃ、Ｂｏｃｋ、　 Ａ、　Ｅ、　Ｆｒａｎｋｅ、　Ｃ。 Ｍ、　Ｈｏｕｅｋ、　Ｒ，Ｃ，Ｎａｊａｒｉａｎ、　Ｐ、　Ｈ，Ｓｅｅｂｕｒｇ 、および、　Ｋ、　Ｌ。 Ｗｉｏｎ、　１９８１．ヒト血清アルブミンｅＤＮＡの配列および大腸菌による その発現、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　９　：　６１０３−６１ １４゜Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、、　Ｒ，Ｃ，Ｈａｒｄｉｓｏｎ、　Ｅ、　Ｌｕ ｃｙ、　Ｊ、　Ｌａｎｅｒ、　Ｃ。 ０°Ｃｏｎｎｅ１１．　Ｄ、　Ｑｕａｎ、　Ｇ、　Ｋ、　Ｓｉｍ、およびＡ、　 Ｅｆｓｔｒａｔｉａｄｉｓ。 １９７８、真核生物ＤＮＡのライブラリーからの構造遺伝子の単離。 Ｃｅ１ｌ　１５　：　６８７−７０１゜Ｍａｒｍｕｒ、　Ｊ、　１９６１．　微 生物からのデオキシリボ核酸の単離方法、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　３　 ：　２０８−２１８゜Ｍａｒｏｕｘ、　Ｓ、、　Ｊ、　Ｂａｒａｔｔｌ、および 、　Ｐ、　Ｄｅｓｎｕｅｌｌｅ、　１９７１゜ブタエンテロキナーゼの精製およ び特異性、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｃｍ。 ２４６　：　５０３１−５０３９゜ Ｍａｒｓｔｏｎ、Ｐ、Ａ、　Ｏ，、Ｐ、Ａ、Ｌｏｗｅ、　Ｍ、　Ｔ、　Ｄｏｅｌ 、Ｊ、　Ｍ。 Ｓｃｈｏｅｍａｋｅｒ、　Ｓ、　Ｗｈｉｔｅ、およびＳ、　Ａｎｇａｌ、　１９ ８４．大腸菌内で合成されたウシプロキモシン（プロレンニン）の精製。 Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　２　：　８００−８０４゜Ｍａｒｔｉｎｅｚ、　 ・Ｒ，Ｊ、　１９６３．イオン交換クロマトグラフィーによる細菌鞭毛の精製方 法、　Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　３３　：　１１５−１２０゜Ｍ ｉｃｈｅｌ、　Ｊ、　Ｐ、および、　Ｊ、　Ｍｉｌｌｅｔ、　１９７０．　枯草 菌の初期遮断胞子形成変異株の生理学的研究、　Ｊ、　Ａｐｐｌ、　Ｂａｃｔｅ ｒｉｏｌ。 ３３　：　２２０−２２７゜ Ｍｉｌｌｅｔ、　Ｊ、　１９７０．　胞子形成中に枯草菌マーバーブ株から分泌 されたプロテアーゼの同定、　Ｊ　、　Ａｐｐｌ　、　、Ｂａｅｔｅｒｔｏｌ。 ３３　：　２０７−２１９゜ Ｎａｇａｉ、　Ｋ、、およびＨ，Ｃ，Ｔｈｏｇｅｒｓｅｎ、　１９８４．大腸菌 により生産されたハイブリッドタンパク質の配列特異的加水分解によるβ−グロ ビンの生成、　Ｎａｔｕｒｅ　３０９　：　８１０−８１２゜Ｎｉ１ｓｓｏｎ、 　Ｂ、、　Ｅ、　Ｈｏｌｍｇｒｅｎ、　Ｓ、　Ｊｏｓｅｐｈｓｏｎ、　Ｓ、　Ｇ ａｔｅｎｂｅｃｋ。 １、　ｐＨ１１１ｐｓｏｎ、およびＭ、　Ｕｈｌｅｎ、　１９８５．　ブドウ球 菌中の遺伝子融合ベクターによるヒトインシュリン様生長因子Ｉの効率的分泌お よび精製、、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１３　：　１１５１− １１６２゜Ｐａ１ｖａ、　１．、　Ｐ、、　Ｌｅｈｔｏｖａａｒａ、　Ｌ、　Ｋ ａａｒｉａｉｎｅｎ、　Ｍ、　５ｉｂａｋｏｖ。 Ｋ、　Ｃａｎｔｅｌｌ、　、Ｃ，Ｈ，５ｅｈｅｉｎ、　Ｋ、　Ｋａｓｈｌｗａｇ ｉ、およびＣｏＷｅｉｓｓｍａｎ、　１９８３．枯草菌によるインターフェロン の分泌。 Ｇｅｎｅ　２２　：　２２９−２３５゜Ｐｅｒｌｍａｎ、　Ｄ、、および、　Ｈ ，Ｏ，Ｈａｌｖｏｒｓｏｎ、　１９８３．　真核生物および原核生物シグナルペ プチドにおける推定上のシグナルペプチターゼ認識部位および配列、　Ｊ、　Ｍ ｏ１．　Ｂｉｏｌ、　１６７　：３９１−４０９゜ Ｐｏｏｌｅｙ、　Ｈ，Ｍ、、およびり、　Ｋａｒａｍａｔａ、　１９８４．枯草 菌の自己溶菌酵素欠損および無鞭毛突然変異株の遺伝学的分析。 Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１６０　：　１１２３−１１２９゜Ｒａｎｄａｌ ｌ、　Ｌ、　Ｌ、およびＳ、　Ｊ、　Ｓ、　Ｈａｒｄｙ、　１９８４．　細菌に おけるタンパク質の輸送、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｒｅｖ、　４８　：　２９ ０−２９８゜Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ、　Ｃ，Ｃ，１９７１，バクテリオファージ Ｔ４に感染した大腸菌からのポリヌクレオチドキナーゼ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎｕｃ ｌｅｉｃＡｃｉｄ　Ｒｅｓ、　２　：　８１５−８２８゜Ｒｉｇｂｙ、　’Ｐ、 　Ｗ、　Ｊ、、　Ｍ、　Ｄｉｅｃｋｍａｎｎ、　Ｃ，Ｒｈｏｄｅｓ、およびＰ、 　Ｂｅｒｇ、　１９７７、ＤＮＡポリメラーゼＩを用いるニックトランスレーシ ョンによるデオキシリボ核酸の高比活性へのｉｎ　ｖｉｔｒｏ標識化、　Ｊ、　 Ｈｏｔ、　Ｂｉｏｌ、　１１３　：　２３７−２５１゜Ｓａｎｇｅｒ、　Ｆ、、 　Ｓ、　Ｎ１ｃｋｌｅｎ、およびＡ、　Ｒ，Ｃｏｕｌｓｏｎ、　１９７７゜鎖成 長停止阻害剤によるＤＮＡの塩基配列決定、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。 Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　７４　：　５４６３−５４６７゜５ ｃｈｅｒｅｒ、　Ｓ、、およびＲ，Ｗ、　Ｄａｖｉｓ、　１９７９．　ｉｎ　ｖ ｌｔｒｏで構築した改変ＤＮＡ配列と染色体セグメントとの置替、　Ｐｒｏｃ、 　Ｎａｔｌ。 Ａｅａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　７６　：　４９５１−４９５５゜５ ｅｈｏｎｅｒ、　Ｒ，Ｇ、、　Ｌ、　Ｆ、　Ｅｌｌｉｓ、および１３．　Ｅ、　 ５ｃｈｏｎｅｒ。 １９８５、ウシ成長ホルモンを過剰生産する大腸菌細胞からのタンパク質顆粒の 単離および精製、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　３　：　１５１−１５４゜ ５ｈｏｒｔｌｅ、　Ｄ、、　Ｊ、　Ｅ、　Ｈａｂｅｒ、およびり、　Ｂｏｔｓｔ ｅｉｎ、　１９８２゜組込みＤＮＡ形質転換による酵母アクチン遺伝子の到死破 壊。 ５ｃｉｅｎｃｅ、　２１７　：　３７１−３７３゜５ｉｌｈａｖｙ、　Ｔ、　Ｊ 、、　Ｓ、　Ａ、　Ｂｅｎ５ｏｎ、およびＳ、　Ｄ、　Ｅ＋ｏｒ、　１９８３゜ タンパク質局在化の機構、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｒｅｖ、　４７　：　８１ ３−３４４゜Ｓｔ　Ｉｖｅｒｍａｎ、　’Ｍ、　、およびＭ、　Ｓｉｍｏｎ、　 １９７７、細菌の鞭毛。 Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　３１：３９７−４１９゜５ｏｕｔ ｈｅｒｎ、　Ｅ、　Ｍ、　１９７５．ゲル電気泳動により分離されたＤＮＡフラ グメントのうちの特定配列の検出、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｌｏｌ。 ９８　：　５０３−５１７゜ ５ｐｉｚｉｚｅｎ、　Ｊ、　１９５８．　デオキシリボヌクレエートによる枯草 菌の生化学的欠損株の形質転換、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅ ｔ。 Ｌｌ、Ｓ、Ａ、　４４　：　１０．７２−１０７８゜５ｔａｈ１．　Ｍ、　Ｌ、 、およびＥ、　Ｆｅｒｒａｒｉ、　１９８４．　枯草菌スブチリシン構造遺伝子 とｉｎ　ｖ１ｔｒｏ誘導欠失変異遺伝子との置換、Ｊ。 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１５８　：　４１１−４１８゜５ｕｚｕｋｉ、　Ｔ、、 および、　Ｙ、　Ｋｏｍｅｄａ、　１９８１．　大腸菌突然変異株の不完全な鞭 毛構造、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１４５　：　１０３Ｂ　−１０４１゜ Ｔａｌｍａｄｇｅ、　Ｋ、、　Ｊ、　Ｂｒｏｓｉｕｓ、およびＷ、　Ｇ１１ｂｅ ｒｔ、　１９８１．　内部シグナル配列は細菌におけるプロインシュリンの分泌 およびプロセッシングを導＜　、　Ｎａｔｕｒｅ、　２９４　：　１７Ｂ　−１ ７８゜■１ｅｉｒａ、　Ｊ、、およびＪ、　Ｍｅｓｓｉｎｇ、　１９８２．　ｐ ＵＣプラスミド、および挿入突然変異誘発および合成共通プライマーによる塩基 配列決定のためのＭ１３ａ＋ｐ？誘導系、　Ｇｅｎｅ、　１９　：　２５９−２ ６８゜Ｖａｈｌ、　Ｇ、　Ｎ６．　Ｍ、　５ｔｅｒｎ、および、　Ｇ、　Ｒ，５ ｔａｒｋ、　１９７９゜アガロースゲルからジアゾベンジルオキシメチル紙への 大型ＤＮＡフラグメントの効率的移行およびデキストラン硫酸を使用する迅速な ハイブリダイゼーション、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｅａｄ。 Ｓｃ１．　Ｌｌ、Ｓ、Ａ、　７６　：　３６８３−３６８７゜Ｗａｔｓｏｎ、　 Ｍ、　Ｐ、　Ｆ、　１９８４．　発表されたシグナル配列の編集。 Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１２　：　５１４５−５１６４゜Ｗｉ ｃｋｎｅｒ、　Ｗ、　１９７９．生物学的膜中のタンパク質のアセンブリー：膜 トリガー仮説、　Ａｎｎｕ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　４８　：　２３− ４５゜Ｗｉｌｌｉａｍｓ、　Ｄ、　Ｃ，、Ｒ，Ｍ、　Ｖａｎ　Ｆｒａｎｋ、　Ｗ 、　Ｌ、　Ｍｕｔｈ、およびＪ、　Ｐ、　Ｂｕｒｎｅｔｔ、、１９８２．　生合 成ヒトインシュリンタンパク質を生産する大腸菌中の細胞封入体、　５ｃｉｅｎ ｃｅ　２１５　：　［３８７−６８８゜Ｙａｎｇ、　Ｍ、　Ｙ、、　Ｅ、　Ｆｅ ｒｒａｒｉ、およびり、　Ｊ、　Ｈｅｎｎｅｒ、　１９８４゜枯草菌の中性プロ テアーゼ遺伝子のクローニングおよびｉｎ　ｖｉｔｒｏ誘導欠失変異遺伝子を作 るためのクローン化遺伝子の使用、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１６０　： 　１５−２１゜Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ、　Ｃ，、Ｊ、　Ｖｌｅｉｒａ、 およびＪ、　Ｍｅｓｓｉｎｇ。 １９８５、改良されたＭ１３ファージクローニングベクターおよび宿主菌株：　 Ｍ１３ｍｐ１ｇおよびｐＵｃ１９ベクターのヌクレオチド配列。 Ｇｅｎｅ　３３　：　１０３−１１９゜Ｚｅｌｇ、　Ｊ、、およびＭ、　Ｓｉｍ ｏｎ、　１９８０．　可逆的制御要素のヌクレオチド配列の分析、　Ｐｒｏｃ、 　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｌｌ、Ｓ、Ａ、　７７　：４１９６−４ ２００゜

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. １．異種タンパク質が宿主細胞から培地中ヘ輸送されるような細菌宿主細胞内で 異種タンパク質を生産する方法であって、細菌培養培地中で、フラジェリンタン パク質の少なくともＮ末端部分をコードする第１ヌクレオチド配列および異種タ ンパク質をコードする第２ヌクレオチド配列から成る融合ＤＮＡ配列を含む遺伝 子工学的に操作された細菌株を培養することから成り、その際第１ヌクレオチド 配列はその３′末端が第２ＤＮＡ配列の５′末端に連結され、且つ融合ＤＮＡ配 列は発現制御配列に操作可能に連結される上記方法。
2. ２．輸送されたタンパク質を培地から回収することをさらに含む、請求の範囲第 １項記載の方法。
3. ３．融合ＤＮＡ配列の第１および第２ヌクレオチド配列は、輸送されたタンパク 質が選択的切断部位を含むように、選択的に切断しうるポリペプチドをコードす るリンキングヌクレオチド配列によって連結される、請求の範囲第１項記載の方 法。
4. ４．輸送されたタンパク質を選択的切断部位で切断して、融合ＤＮＡ配列の第２ ヌクレオチド配列によってコードされる異種タンパク質を生産することをさらに 含む、請求の範囲第３項記載の方法。
5. ５．フラジェリンのあらゆるポリペプチド断片または他のタンパク質系物質から 異種タンパク質を回収することをさらに含む、請求の範囲第４項記載の方法。
6. ６．遺伝子工学的に操作された細菌細胞はプロテアーゼ類の生産または輸送を抑 制する物質の存在下で培養する、請求の範囲第１項記載の方法。
7. ７．融合ＤＮＡ配列は宿主細胞の染色体の中に組込まれる、請求の範囲第１項記 載の方法。
8. ８．融合ＤＮＡ配列は宿主細胞内の染色体外プラスミド中に含まれる、請求の範 囲第１項記載の方法。
9. ９．遺伝子工学的に操作された宿主細胞は天然フラジェリン生産のための機能的 遺伝子を欠く、請求の範囲第１項記載の方法。
10. １０．輸送されたタンパク質は抗フラジェリン抗体を用いる免疫アフィニティー クロマトグラフィーにより回収する、請求の範囲第２項記載の方法。
11. １１．請求の範囲第１項記載の方法により生産されたタンパク質。
12. １２．請求の範囲第３項記載の方法により生産されたタンパク質。