JP3432224B2 - 枯草菌内における異種遺伝子の発現：融合方法 - Google Patents
枯草菌内における異種遺伝子の発現：融合方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】
関連出願についてのクロス・リファレンス
本出願は、1987年５月29日に出願された米国特許出願
第07/056,500号（今では放棄されている）に基づいて35
USCセクション120の元で優先権を主張している、1988年
５月31日に出願されたPCT出願第PCT/US88/01844号から
派生した、1989年３月29日に出願し、今では米国特許第
4,981,611号となっている米国特許出願第07/341,200号
の継続出願である、1990年10月22日に出願された米国特
許出願第07/600,836号の一部継続出願である、1991年11
月27日に出願された米国特許第07/800,365号に関連して
いる。上記した特許および特許出願の各々の全てをここ
に引用する。
第07/056,500号（今では放棄されている）に基づいて35
USCセクション120の元で優先権を主張している、1988年
５月31日に出願されたPCT出願第PCT/US88/01844号から
派生した、1989年３月29日に出願し、今では米国特許第
4,981,611号となっている米国特許出願第07/341,200号
の継続出願である、1990年10月22日に出願された米国特
許出願第07/600,836号の一部継続出願である、1991年11
月27日に出願された米国特許第07/800,365号に関連して
いる。上記した特許および特許出願の各々の全てをここ
に引用する。
産業上の利用分野
本発明は、バシラス属（Bacillus）の微生物からのリ
パーゼ（クチナーゼ:cutinase）の発現、および発酵培
養液（fermentation broth）からのクチナーゼの精製に
関するものである。
パーゼ（クチナーゼ:cutinase）の発現、および発酵培
養液（fermentation broth）からのクチナーゼの精製に
関するものである。
発明の背景
宿主の種類はなんであれ、その宿主から異種タンパク
質を分泌させるのには、シグナルペプチドと成熟標的遺
伝子を正確に対応させることが必要である。グラム陽性
のシグナル配列はグラム陰性系においても良好に機能す
ることが知られているが、その逆は成り立たない［Moun
tain,A.（1989）Bacillus（Biothechnology Handbooks
2,C.R.ハーウッド等,ed.）,Plenum Press,73−114
頁］。枯草菌（Bacillus subtillis）においては、他の
グラム陽性微生物由来のタンパク質を分泌することがあ
る。しかしながら、そのような場合であっても、最良の
産生結果は雑種配列により得られている。バシラス属が
それ自身のシグナル配列を用いてグラム陰性由来のタン
パク質を大量に発現した成功例はまだ見られておらず、
さらに、雑種配列により成功も最小限度のものである
［Mountain,A.（1989）Bacillus（Biothechnology Hand
books 2,C.R.ハーウッド等,ed.）,Plenum Press,73−11
4頁］。
質を分泌させるのには、シグナルペプチドと成熟標的遺
伝子を正確に対応させることが必要である。グラム陽性
のシグナル配列はグラム陰性系においても良好に機能す
ることが知られているが、その逆は成り立たない［Moun
tain,A.（1989）Bacillus（Biothechnology Handbooks
2,C.R.ハーウッド等,ed.）,Plenum Press,73−114
頁］。枯草菌（Bacillus subtillis）においては、他の
グラム陽性微生物由来のタンパク質を分泌することがあ
る。しかしながら、そのような場合であっても、最良の
産生結果は雑種配列により得られている。バシラス属が
それ自身のシグナル配列を用いてグラム陰性由来のタン
パク質を大量に発現した成功例はまだ見られておらず、
さらに、雑種配列により成功も最小限度のものである
［Mountain,A.（1989）Bacillus（Biothechnology Hand
books 2,C.R.ハーウッド等,ed.）,Plenum Press,73−11
4頁］。
シグナルペプチドと成熟遺伝子との融合（fusion）を
最適なものとする様々な試みが文献に記載されている
（ドイ、R.H.、ウォン、S.およびカワムラ、F.（1986）
Trends Biotechnol.Sept.:232−235;ファーネストッ
ク、S.R.およびフィッシャー、K.E.（1986）J.Bact.16
5:796−804;ファーネストック、S.R.およびフィッシャ
ー、K.E.（1987）Appl.Env.Microbiol.53:379−384;サ
ーバス、M.（1986）Curr.TopicsMicro.Immun.125:103−
125;ウルマネン、I.ランドストロム、K.、レートバー
ラ、P.、サーバス、M.、ルオーネン、M.およびパルバ、
I.（1985）162:176−182;バサンタ、N.およびトンプソ
ン,L.D.（1986）J.Bact.165:837−842を参照のこと）。
しかしながら、どの場合においても、融合する箇所は、
都合のよい制限部位に基づいて、またはシグナル切断部
位（signal cleavage site）で直接グラム陽性シグナル
配列を標的遺伝子に接合させることのみにより選択され
ていた。
最適なものとする様々な試みが文献に記載されている
（ドイ、R.H.、ウォン、S.およびカワムラ、F.（1986）
Trends Biotechnol.Sept.:232−235;ファーネストッ
ク、S.R.およびフィッシャー、K.E.（1986）J.Bact.16
5:796−804;ファーネストック、S.R.およびフィッシャ
ー、K.E.（1987）Appl.Env.Microbiol.53:379−384;サ
ーバス、M.（1986）Curr.TopicsMicro.Immun.125:103−
125;ウルマネン、I.ランドストロム、K.、レートバー
ラ、P.、サーバス、M.、ルオーネン、M.およびパルバ、
I.（1985）162:176−182;バサンタ、N.およびトンプソ
ン,L.D.（1986）J.Bact.165:837−842を参照のこと）。
しかしながら、どの場合においても、融合する箇所は、
都合のよい制限部位に基づいて、またはシグナル切断部
位（signal cleavage site）で直接グラム陽性シグナル
配列を標的遺伝子に接合させることのみにより選択され
ていた。
本発明は、グラム陽性微生物である枯草菌（Bacillus
subtilis）内でグラム陰性のシュードモナス メンド
シナ（Psedomonas mendocina）リパーゼ（クチナーゼ）
を発現させることに関するものである。酵素は、aprE
（プレプロ枯草菌サブチリシン、prepro Bacillus subt
ilis subtilisin）との融合体（fusion）として産生さ
れる。ポリメラーゼ連鎖反応技術を用いて、ここに引用
した米国特許出願07/932,950号に記載されているよう
に、プロ配列（prosequence）残留物Ａ（−１）、A1、G
2、K3、S4、S5、T6、E7、K8、K9、I11およびK27にて
（およびそれを含む）aprEのプロ配列にリパーゼの成熟
暗号配列を融合した。得られた構築物を枯草菌産生宿主
（BB8）の染色体中に組み込み、SacU（Hy）表現型に形
質導入または形質転換した後、各々の菌株の生産効率
を、ここに記載するように測定した。
subtilis）内でグラム陰性のシュードモナス メンド
シナ（Psedomonas mendocina）リパーゼ（クチナーゼ）
を発現させることに関するものである。酵素は、aprE
（プレプロ枯草菌サブチリシン、prepro Bacillus subt
ilis subtilisin）との融合体（fusion）として産生さ
れる。ポリメラーゼ連鎖反応技術を用いて、ここに引用
した米国特許出願07/932,950号に記載されているよう
に、プロ配列（prosequence）残留物Ａ（−１）、A1、G
2、K3、S4、S5、T6、E7、K8、K9、I11およびK27にて
（およびそれを含む）aprEのプロ配列にリパーゼの成熟
暗号配列を融合した。得られた構築物を枯草菌産生宿主
（BB8）の染色体中に組み込み、SacU（Hy）表現型に形
質導入または形質転換した後、各々の菌株の生産効率
を、ここに記載するように測定した。
発明の概要
本発明はバシラス属微生物内での異種遺伝子の発現に
関し、１つ以上の融合（fusions）が続いて行なわれ、
その融合が宿主シグナル配列、宿主プロ配列（host pro
sequence）および標的遺伝子配列からなるものであ
る。
関し、１つ以上の融合（fusions）が続いて行なわれ、
その融合が宿主シグナル配列、宿主プロ配列（host pro
sequence）および標的遺伝子配列からなるものであ
る。
本発明はまた、枯草菌由来のプロモーターおよびバシ
ラス アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquef
aciens）由来のターミネーターを用いたバシラス属内で
のリパーゼ（クチナーゼ）の発現に関するものである。
ラス アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquef
aciens）由来のターミネーターを用いたバシラス属内で
のリパーゼ（クチナーゼ）の発現に関するものである。
本発明はまた、成熟リパーゼ遺伝子の枯草菌aprEとの
特異的な融合に関するものである。これらの特異的な融
合を、枯草菌中に形質転換されるプラスミドベクター内
に導入してもよい。
特異的な融合に関するものである。これらの特異的な融
合を、枯草菌中に形質転換されるプラスミドベクター内
に導入してもよい。
図面の簡単な説明
第１図は、シグナル配列二次構造の鍵となる要素を示
した配列の概略図である。
した配列の概略図である。
第２図は、枯草菌内のある融合（G2およびK3）のリパ
ーゼ生産速度を示すグラフである。
ーゼ生産速度を示すグラフである。
第３図は、枯草菌内のシュードモナス メンドシナ
リパーゼの発現を示すグラフである。
リパーゼの発現を示すグラフである。
第４図は、pApr−cut−１（第4a図）;pAK−K3（第4b
図）;pAK−G2、pAK−A1、pAK−Ａ（−１）（第4c図）;p
AK−K9、pAK−K27（第4d図）;pAK−S4、S5、T6、E7、K
8、I11（第4e図）の構築を説明する概略図である。
図）;pAK−G2、pAK−A1、pAK−Ａ（−１）（第4c図）;p
AK−K9、pAK−K27（第4d図）;pAK−S4、S5、T6、E7、K
8、I11（第4e図）の構築を説明する概略図である。
第５図は、pAK−K3のプラスミド地図を示す概略図で
ある。
ある。
発明の詳細な説明
A. 細菌からのタンパク質の分泌
細菌からのタンパク質の分泌は、プレタンパク質（pr
e−protein）が成熟酵素にトランスロケーションし、そ
れに続いて膜の外面上にあるプレタンパク質が成熟酵素
にタンパク質分解切断する工程を含むATP依存性プロセ
スである。プレタンパク質は、Ｎ末端、20から40までの
範囲のアミノ酸のシグナルペプチド（グラム陰性）［マ
ウンテン、A.（1989）Bacillus（C.R.ハーウッド、e
d.）、プレナム、ニューヨーク、73−114］およびＣ末
端成熟タンパク質からなる。単独の微生物内においてさ
えも、どの一次配列の相同性が第１図に示したような二
次構造相同性をまだ保存する場合でも、シグナル配列は
制限のみを示している。シグナルペプチドの３つの領域
は、正に荷電した領域であるＮ末端、疎水性中央領域、
および非螺旋のカルボキシ末端領域である。以下に記載
するように、グラム陽性微生物は、ほぼ同じ長さの中央
疎水コアを維持しながら、大腸菌のようなグラム陰性微
生物より大きなＮ末端およびＣ末端を有する傾向にあ
る。このシグナル配列は、トランスロケーションを行な
うために、膜をタンパク質の標的とするのに必要な情報
の全てを含有していると考えられる［マウンテン、A.
（1989）Bacillus（C.R.ハーウッド、ed.）、プレナ
ム、ニューヨーク、73−114;ウィックナー、W.、ドリー
セン、A.J.M.およびハートル、F.U.（1991）Annu.Rev.B
iochem.60:101−124;シャッツ、P.J.およびベックウィ
ズ、J.（1983）J.Bacteriol.154:253−260を参照のこ
と］。
e−protein）が成熟酵素にトランスロケーションし、そ
れに続いて膜の外面上にあるプレタンパク質が成熟酵素
にタンパク質分解切断する工程を含むATP依存性プロセ
スである。プレタンパク質は、Ｎ末端、20から40までの
範囲のアミノ酸のシグナルペプチド（グラム陰性）［マ
ウンテン、A.（1989）Bacillus（C.R.ハーウッド、e
d.）、プレナム、ニューヨーク、73−114］およびＣ末
端成熟タンパク質からなる。単独の微生物内においてさ
えも、どの一次配列の相同性が第１図に示したような二
次構造相同性をまだ保存する場合でも、シグナル配列は
制限のみを示している。シグナルペプチドの３つの領域
は、正に荷電した領域であるＮ末端、疎水性中央領域、
および非螺旋のカルボキシ末端領域である。以下に記載
するように、グラム陽性微生物は、ほぼ同じ長さの中央
疎水コアを維持しながら、大腸菌のようなグラム陰性微
生物より大きなＮ末端およびＣ末端を有する傾向にあ
る。このシグナル配列は、トランスロケーションを行な
うために、膜をタンパク質の標的とするのに必要な情報
の全てを含有していると考えられる［マウンテン、A.
（1989）Bacillus（C.R.ハーウッド、ed.）、プレナ
ム、ニューヨーク、73−114;ウィックナー、W.、ドリー
セン、A.J.M.およびハートル、F.U.（1991）Annu.Rev.B
iochem.60:101−124;シャッツ、P.J.およびベックウィ
ズ、J.（1983）J.Bacteriol.154:253−260を参照のこ
と］。
分泌の最初の段階において、グラム陰性大腸菌につい
て記載したように、もしかするとチャペロニン（chaper
onin）（secB、groEL等）を有するかもしれない新たに
合成したプレタンパク質は、膜結合受容体ATPアーゼ（s
ecA）により認識されると考えられている。この膜結合
受容体ATPアーゼは、膜内の膜複合体（integral membra
ne complex）（secE/Y）によるタンパク質のトランスロ
ケーションにATPの加水分解を関連付けている［マウン
テン、A.（1989）Bacillus（C.R.ハーウッド、ed.）、
プレナム、ニューヨーク、73−114;ウィックナー、W.、
ドリーセン、A.J.M.およびハートル、F.U.（1991）Ann
u.Rev.Biochem.60:101−124;シャッツ、P.J.およびベッ
クウィズ、J.（1990）Annu.Rev.Genet.24:215−248およ
びそれらの参照文献を参照のこと］。プレ酵素の鍵とな
る特性は、このプレ酵素が、おそらくはゆるく折り重ね
られ、チャペロニンタンパク質との相互作用により維持
できるトランスロケーション応答能のある形状になけれ
ばならないことである［ウィックナー、W.、ドリーセ
ン、A.J.M.およびハートル、F.U.（1991）Annu.Rev.Bio
chem.60:101−124;クマモト、C.A.、およびベックウィ
ズ、J.（1983）J.Bacteriol.154:253−260;クマモト、
C.A.およびノールト、A.K.（1989）Gene 75:167−175を
参照のこと］。分泌器官によるタンパク質のトランスロ
ケーションおよび認識のための情報をすべて有さなけれ
ばならないのはこの複合体である。シグナル配列の潜在
的な役割は、酵素が最終的に成熟形状に折り重なるのを
防ぐことによりチャペロニン結合を促進させることにあ
るのかもしれない［パーク、S.、リュー、G.、トッピン
グ、T.B.、カバー、W.H.およびランダル、L.L.（1988）
Science 239:1033−1035;ラミネット、A.A.およびプラ
クサン、A.（1989）EMBO J.8:1469−1477］。
て記載したように、もしかするとチャペロニン（chaper
onin）（secB、groEL等）を有するかもしれない新たに
合成したプレタンパク質は、膜結合受容体ATPアーゼ（s
ecA）により認識されると考えられている。この膜結合
受容体ATPアーゼは、膜内の膜複合体（integral membra
ne complex）（secE/Y）によるタンパク質のトランスロ
ケーションにATPの加水分解を関連付けている［マウン
テン、A.（1989）Bacillus（C.R.ハーウッド、ed.）、
プレナム、ニューヨーク、73−114;ウィックナー、W.、
ドリーセン、A.J.M.およびハートル、F.U.（1991）Ann
u.Rev.Biochem.60:101−124;シャッツ、P.J.およびベッ
クウィズ、J.（1990）Annu.Rev.Genet.24:215−248およ
びそれらの参照文献を参照のこと］。プレ酵素の鍵とな
る特性は、このプレ酵素が、おそらくはゆるく折り重ね
られ、チャペロニンタンパク質との相互作用により維持
できるトランスロケーション応答能のある形状になけれ
ばならないことである［ウィックナー、W.、ドリーセ
ン、A.J.M.およびハートル、F.U.（1991）Annu.Rev.Bio
chem.60:101−124;クマモト、C.A.、およびベックウィ
ズ、J.（1983）J.Bacteriol.154:253−260;クマモト、
C.A.およびノールト、A.K.（1989）Gene 75:167−175を
参照のこと］。分泌器官によるタンパク質のトランスロ
ケーションおよび認識のための情報をすべて有さなけれ
ばならないのはこの複合体である。シグナル配列の潜在
的な役割は、酵素が最終的に成熟形状に折り重なるのを
防ぐことによりチャペロニン結合を促進させることにあ
るのかもしれない［パーク、S.、リュー、G.、トッピン
グ、T.B.、カバー、W.H.およびランダル、L.L.（1988）
Science 239:1033−1035;ラミネット、A.A.およびプラ
クサン、A.（1989）EMBO J.8:1469−1477］。
B. グラム陽性微生物における異種分泌
枯草菌における分泌は大腸菌における分泌ほど理解さ
れていないが、同一の機構により開始するものと一般的
に推測されている［セイアー、M.H.、Jr.、ウェーナ
ー、P.K.およびミューラー、M.（1989）Microbiol.Rev.
53:333−366;オバーホフ、B.、クライン、M.、スピー
ズ、M.およびフロイドル、R.（1991）Mol.Gen.Genet.22
8:417−423］。２組の分泌されたタンパク質の間の１つ
の違いは、グラム陽性のタンパク質のシグナルペプチド
の長さが、このタンパク質に対応するグラム陰性のタン
パク質よりも20までの範囲のアミノ酸だけ長い傾向にあ
ることである。グラム陽性のシグナルペプチドはグラム
陰性系において機能するが、その逆は成り立たない［マ
ウンテン、A.（1989）Bacillus（C.R.ハーウッド、e
d.）、プレナム、ニューヨーク、73−114;ボーチャー
ト、T.V.およびナガラジャン、V.（1991）J.Bacteriol.
173:276−282;パールマン、D.およびハルバーソン、H.
O.（1983）J.Mol.Biol.167:391−409］。したがって、
枯草菌のようなグラム陽性微生物において異種タンパク
質を発現する一般的な方法には、標的タンパク質を宿主
の分泌器官に接合させることが必要である（マウンテ
ン、A.（1989）Bacillus（C.R.ハーウッド、ed.）、プ
レナム、ニューヨーク、73−114を参照のこと）。一般
的に、うまくいった実験においては、主要な外酵素プロ
モーターおよびシグナル配列を標的の成熟領域に接合し
ていた。そのような系を、アルファアミラーゼからの要
素を用いて枯草菌のために考案した（シロザ、T.、ナカ
ザワ、K.、タシロ、N.、ヤマネ、K.、ヤナギ、K.、ヤマ
サキ、M.、タムラ、G.、サイトウ、H.、カワデ、Y.およ
びタニグチ、T.（1985）Gene 34:1−8;ヤマネ、K.、ナ
カザワ、K.、ナカムラ、K.、ミネクラ、H.、モリ、T.、
タカノ、J.、シロザ、T.、ソーマ、A.およびフジタ、T.
（1986）Bacillus Molecular Genetics and Biotechnol
ogy Applications（A.T.ガネサンおよびJ.A.ホックスed
s.）アカデミックプレス、ニューヨーク、411−422頁；
パルバ、I.（1982）Gene 19:81−87;アルマネン、I.、
ランドストロム、K.、レートバーサ、P.、サーバス、M.
ローホーネン、M.、およびパルバ、I.（1985）J.Bacter
iol.162:176−182）、アルカリ性および中性プロテアー
ゼ（ファーネストック、S.R.およびフィッシャー、K.E.
（1986）J.Bacteriol 165:796−804;バサンサ、N.およ
びトンプソン、L.D.（1986）J.Bacteriol.165:837−84
2;ウォン,S.L.、カワムラ、F.およびドイ、R.H.（198
6）J.Bacteriol.168:1005−1009）、ペニシリナーゼ
（チャン、S.、グレイ、O.、ホー、D.、クローヤー、
J.、チャン、S.Y.、マックローリン、J.およびマーク、
D.（1984）Molecular Cloning and Gene Regulation in
Bacilli 159−169頁）およびレバンスクラーゼ（ボル
チェート、T.V.およびナガラジャン、V.（1991）J.Bact
eriol.173:276−282）。成熟標的遺伝子により供与体プ
ロモーターとシグナル配列との融合を位置付ける際に
は、シグナルペプチド、ペプチド切断部位および成熟遺
伝子の線状の組織化を一般的に検討し、多くの場合、タ
ンパク質分解接合部（第１図参照）またはちょうどその
後の部位で標的を供与体シグナル配列に直接連結させ
て、シグナル配列供与体の成熟遺伝子からのアミノ酸を
せいぜい１つか２つ加えていた（マウンテン、A.（198
9）Bacillus（C.R.ハーウッド、ed.）、プレナム、ニュ
ーヨーク、73−114およびその参照文献）。一般的に、
結果は平凡であり、非グラム陽性の異種タンパク質の累
積レベルはmg/lの量をめったに超えなかった（マウンテ
ン、A.（1989）Bacillus（C.R.ハーウッド、ed.）、プ
レナム、ニューヨーク、73−114）。
れていないが、同一の機構により開始するものと一般的
に推測されている［セイアー、M.H.、Jr.、ウェーナ
ー、P.K.およびミューラー、M.（1989）Microbiol.Rev.
53:333−366;オバーホフ、B.、クライン、M.、スピー
ズ、M.およびフロイドル、R.（1991）Mol.Gen.Genet.22
8:417−423］。２組の分泌されたタンパク質の間の１つ
の違いは、グラム陽性のタンパク質のシグナルペプチド
の長さが、このタンパク質に対応するグラム陰性のタン
パク質よりも20までの範囲のアミノ酸だけ長い傾向にあ
ることである。グラム陽性のシグナルペプチドはグラム
陰性系において機能するが、その逆は成り立たない［マ
ウンテン、A.（1989）Bacillus（C.R.ハーウッド、e
d.）、プレナム、ニューヨーク、73−114;ボーチャー
ト、T.V.およびナガラジャン、V.（1991）J.Bacteriol.
173:276−282;パールマン、D.およびハルバーソン、H.
O.（1983）J.Mol.Biol.167:391−409］。したがって、
枯草菌のようなグラム陽性微生物において異種タンパク
質を発現する一般的な方法には、標的タンパク質を宿主
の分泌器官に接合させることが必要である（マウンテ
ン、A.（1989）Bacillus（C.R.ハーウッド、ed.）、プ
レナム、ニューヨーク、73−114を参照のこと）。一般
的に、うまくいった実験においては、主要な外酵素プロ
モーターおよびシグナル配列を標的の成熟領域に接合し
ていた。そのような系を、アルファアミラーゼからの要
素を用いて枯草菌のために考案した（シロザ、T.、ナカ
ザワ、K.、タシロ、N.、ヤマネ、K.、ヤナギ、K.、ヤマ
サキ、M.、タムラ、G.、サイトウ、H.、カワデ、Y.およ
びタニグチ、T.（1985）Gene 34:1−8;ヤマネ、K.、ナ
カザワ、K.、ナカムラ、K.、ミネクラ、H.、モリ、T.、
タカノ、J.、シロザ、T.、ソーマ、A.およびフジタ、T.
（1986）Bacillus Molecular Genetics and Biotechnol
ogy Applications（A.T.ガネサンおよびJ.A.ホックスed
s.）アカデミックプレス、ニューヨーク、411−422頁；
パルバ、I.（1982）Gene 19:81−87;アルマネン、I.、
ランドストロム、K.、レートバーサ、P.、サーバス、M.
ローホーネン、M.、およびパルバ、I.（1985）J.Bacter
iol.162:176−182）、アルカリ性および中性プロテアー
ゼ（ファーネストック、S.R.およびフィッシャー、K.E.
（1986）J.Bacteriol 165:796−804;バサンサ、N.およ
びトンプソン、L.D.（1986）J.Bacteriol.165:837−84
2;ウォン,S.L.、カワムラ、F.およびドイ、R.H.（198
6）J.Bacteriol.168:1005−1009）、ペニシリナーゼ
（チャン、S.、グレイ、O.、ホー、D.、クローヤー、
J.、チャン、S.Y.、マックローリン、J.およびマーク、
D.（1984）Molecular Cloning and Gene Regulation in
Bacilli 159−169頁）およびレバンスクラーゼ（ボル
チェート、T.V.およびナガラジャン、V.（1991）J.Bact
eriol.173:276−282）。成熟標的遺伝子により供与体プ
ロモーターとシグナル配列との融合を位置付ける際に
は、シグナルペプチド、ペプチド切断部位および成熟遺
伝子の線状の組織化を一般的に検討し、多くの場合、タ
ンパク質分解接合部（第１図参照）またはちょうどその
後の部位で標的を供与体シグナル配列に直接連結させ
て、シグナル配列供与体の成熟遺伝子からのアミノ酸を
せいぜい１つか２つ加えていた（マウンテン、A.（198
9）Bacillus（C.R.ハーウッド、ed.）、プレナム、ニュ
ーヨーク、73−114およびその参照文献）。一般的に、
結果は平凡であり、非グラム陽性の異種タンパク質の累
積レベルはmg/lの量をめったに超えなかった（マウンテ
ン、A.（1989）Bacillus（C.R.ハーウッド、ed.）、プ
レナム、ニューヨーク、73−114）。
これらの方法では、成熟タンパク質とシグナルペプチ
ドとの潜在的な関連が考慮されていない。上述したよう
に、シグナルペプチドの潜在的な役割の１つは、分泌器
官によるトランスロケーション並びに獲得（aquisitio
n）の前に所望のチャペロニンの結合を促進させること
である。この必要条件並びに能率的なトランスロケーシ
ョンに必要な他のありうる構造の結果として、成熟タン
パク質と特異的に相互作用するシグナルペプチドが必要
とされている。異なる成熟配列（TEMペニシリナーゼお
よび黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）ヌクレ
アーゼＡ）は大腸菌中の同一の異種シグナル（OmpA）お
よびその変異体で非常に異なって機能することを示した
レンハードおよびその同僚の作業により、このことは決
定的に示唆されている（レンハード、S.、ポリット、S.
およびイノウエ、M.（1987）J.Biol.Chem.262:1716−17
19）。さらに、ブリートリングおよびその同僚は、スタ
フィロキナーゼおよび枯草菌アルファアミラーゼ分泌ベ
クターを用いて、枯草菌中にヒトインターフェロンアル
ファ１の分泌について同様な観察を行なっている（ブリ
ートリング、R.、ジャーラック、D.、ハートマン、M.お
よびベーンク、D.（1989）Mol.Gen.Genet.217:384−39
1）。上述した観察にもかかわらず、供与体遺伝子と標
的成熟遺伝子との間の融合接合を系統的に変化させるこ
とにより、異種分泌を能率的に行なう試みはなされてい
ない。
ドとの潜在的な関連が考慮されていない。上述したよう
に、シグナルペプチドの潜在的な役割の１つは、分泌器
官によるトランスロケーション並びに獲得（aquisitio
n）の前に所望のチャペロニンの結合を促進させること
である。この必要条件並びに能率的なトランスロケーシ
ョンに必要な他のありうる構造の結果として、成熟タン
パク質と特異的に相互作用するシグナルペプチドが必要
とされている。異なる成熟配列（TEMペニシリナーゼお
よび黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）ヌクレ
アーゼＡ）は大腸菌中の同一の異種シグナル（OmpA）お
よびその変異体で非常に異なって機能することを示した
レンハードおよびその同僚の作業により、このことは決
定的に示唆されている（レンハード、S.、ポリット、S.
およびイノウエ、M.（1987）J.Biol.Chem.262:1716−17
19）。さらに、ブリートリングおよびその同僚は、スタ
フィロキナーゼおよび枯草菌アルファアミラーゼ分泌ベ
クターを用いて、枯草菌中にヒトインターフェロンアル
ファ１の分泌について同様な観察を行なっている（ブリ
ートリング、R.、ジャーラック、D.、ハートマン、M.お
よびベーンク、D.（1989）Mol.Gen.Genet.217:384−39
1）。上述した観察にもかかわらず、供与体遺伝子と標
的成熟遺伝子との間の融合接合を系統的に変化させるこ
とにより、異種分泌を能率的に行なう試みはなされてい
ない。
実験
以下の実施例は全て、枯草菌内におけるシュードモナ
ス メンドシナATCC53552リパーゼ（クチナーゼ）の発
現に関するものであるが、それらの実施例は本発明を説
明することを意図したものであり、本発明の範囲を制限
するものとして考えるべきではない。
ス メンドシナATCC53552リパーゼ（クチナーゼ）の発
現に関するものであるが、それらの実施例は本発明を説
明することを意図したものであり、本発明の範囲を制限
するものとして考えるべきではない。
この実施例において、ここに引用した米国特許第4,93
3,287号に記載されているシュードモナス メンドシナ
リパーゼ（クチナーゼ）の枯草菌内の発現を、シグナ
ル配列の最後の残基（Ala−１）からaprEプロ配列（pro
sequence）の９番目の残基（K9）までの枯草菌aprEと成
熟リパーゼ遺伝子との融合により行なう。さらに、位置
I11およびK27でも融合物が得られた。
3,287号に記載されているシュードモナス メンドシナ
リパーゼ（クチナーゼ）の枯草菌内の発現を、シグナ
ル配列の最後の残基（Ala−１）からaprEプロ配列（pro
sequence）の９番目の残基（K9）までの枯草菌aprEと成
熟リパーゼ遺伝子との融合により行なう。さらに、位置
I11およびK27でも融合物が得られた。
専門語：
この実施例において、ここに引用する、1986年11月19
日に出願された米国特許出願第932,950号に記載された
シュードモナス メンドシナ リパーゼ（クチナーゼ）
についての全長成熟遺伝子が、枯草菌aprEプロモーター
／シグナル／プロ配列内のいくつかの位置に枠内で融合
されている。aprE、シグナル／プロ配列接合は、コドン
29（Ala）と30（Ala）との間で生じる。成熟リパーゼ
（クチナーゼ）のaprEコドン29への融合はpAK−Ａ（−
１）と呼ばれており、これは、リパーゼ（クチナーゼ）
がシグナルペプチドの最後の残基に融合されたことを示
している。同様に、成熟リパーゼ（クチナーゼ）のaprE
コドン30への融合はpAK−A1と呼ばれており、これは、
リパーゼ（クチナーゼ）がプロ配列の最初の残基に融合
されたことを示している。
日に出願された米国特許出願第932,950号に記載された
シュードモナス メンドシナ リパーゼ（クチナーゼ）
についての全長成熟遺伝子が、枯草菌aprEプロモーター
／シグナル／プロ配列内のいくつかの位置に枠内で融合
されている。aprE、シグナル／プロ配列接合は、コドン
29（Ala）と30（Ala）との間で生じる。成熟リパーゼ
（クチナーゼ）のaprEコドン29への融合はpAK−Ａ（−
１）と呼ばれており、これは、リパーゼ（クチナーゼ）
がシグナルペプチドの最後の残基に融合されたことを示
している。同様に、成熟リパーゼ（クチナーゼ）のaprE
コドン30への融合はpAK−A1と呼ばれており、これは、
リパーゼ（クチナーゼ）がプロ配列の最初の残基に融合
されたことを示している。
aprEとリパーゼ（クチナーゼ）との融合の構築
以下の合成プライマーを突然変異誘発に用いた：
融合物K3の構築：
リパーゼ（クチナーゼ）遺伝子（全てを引用する米国
特許第4,933,287号および同第5,030,240号並びに米国特
許出願第629,308号に記載されたような）を、Hind III
Sph I断片としてのM13プラスミド中にクローニングし
た（M13lip）；一本鎖合成プライマー1B（配列番号２）
を用いて、位置指定突然変異誘発（site−directed mut
agenesis）（T.A.クンケル、PNAS（1985）、82巻、488
−492頁）によりPst I部位および３つのコドン（Ａ、
Ｇ、Ｋ）を成熟暗号配列の最初の部分に導入した。ps16
8からのaprE遺伝子（M.L.スタール等、J.Bact.（198
4）、158巻、411−418頁）をEcoR I−Hind III断片とし
ての別のM13プラスミド中にクローニングし（M13ap
r）、同様の技術を用いて一本鎖合成プライマー1A（配
列番号１）によりコドン位置Ala1（シグナル配列切断部
位の後の最初のアミノ酸）に導入した。DNA断片をクロ
ーニングする方法は、サムブルック等のMolecular Clon
ing、a Laboratory Manual（1989）1.53−1.73頁および
4.3−4.51頁に記載されている。aprEのEcoR I−Pst I断
片およびリパーゼのPst I−Sph I断片をM13プラスミド
から単離し、EcoR I Sph Iにより切断したpJM102中に
クローニングし（E.フェラリ等、J.Bact.（1983）154
巻、1513−1515頁）、pApr−cut−１を産生した。
特許第4,933,287号および同第5,030,240号並びに米国特
許出願第629,308号に記載されたような）を、Hind III
Sph I断片としてのM13プラスミド中にクローニングし
た（M13lip）；一本鎖合成プライマー1B（配列番号２）
を用いて、位置指定突然変異誘発（site−directed mut
agenesis）（T.A.クンケル、PNAS（1985）、82巻、488
−492頁）によりPst I部位および３つのコドン（Ａ、
Ｇ、Ｋ）を成熟暗号配列の最初の部分に導入した。ps16
8からのaprE遺伝子（M.L.スタール等、J.Bact.（198
4）、158巻、411−418頁）をEcoR I−Hind III断片とし
ての別のM13プラスミド中にクローニングし（M13ap
r）、同様の技術を用いて一本鎖合成プライマー1A（配
列番号１）によりコドン位置Ala1（シグナル配列切断部
位の後の最初のアミノ酸）に導入した。DNA断片をクロ
ーニングする方法は、サムブルック等のMolecular Clon
ing、a Laboratory Manual（1989）1.53−1.73頁および
4.3−4.51頁に記載されている。aprEのEcoR I−Pst I断
片およびリパーゼのPst I−Sph I断片をM13プラスミド
から単離し、EcoR I Sph Iにより切断したpJM102中に
クローニングし（E.フェラリ等、J.Bact.（1983）154
巻、1513−1515頁）、pApr−cut−１を産生した。
強い転写ターミネーターを導入するために、pApr−cu
t−１からのaprE−リパーゼ融合物を、バシラス アミ
ロリケファシエンス サブチリシン転写ターミネーター
（Bacillus amyloliquefaciens subtilisin transcript
ional terminator）を含有するように構築されたpJH101
（E.フェラリ等、J.Bact.154巻、1513−1515頁）中にク
ローニングした（ウェルズ等、Nucleic Acid Research
（1983）、11巻、7911−7925頁、Hind III−BamH I断片
（pJH101−term）について）。リパーゼ遺伝子の５′末
端、シグナル配列およびaprEプロモーターを含有するEc
oR I−Pvu II DNA断片、並びにリパーゼ遺伝子の３′
末端を含有するPvu II−Ava I DNA断片をpApr−cut−
１から単離した。Pvu IIによる切断の前に、T4ポリメラ
ーゼにより、リパーゼ遺伝子のPvu II−Ava I断片のAva
I ５′懸垂（overhang）をフィルイン（fill in）し
た（サムブルック等、Molecular Cloning、Labolatory
Manual、前出）。プラスミドpJH101−term（ターミネー
ターを有する）をEcoR I−Hind IIにより切断し、EcoR
Iによる切断の前に、T4ポリメラーゼによりHind III
５′懸垂もまたフィルインした。EcoR I−Pvu II断片、
Pvu II−Ava I断片およびEcoR I−Hind III切断ベクタ
ーを連結してpAK−K3を産生した。
t−１からのaprE−リパーゼ融合物を、バシラス アミ
ロリケファシエンス サブチリシン転写ターミネーター
（Bacillus amyloliquefaciens subtilisin transcript
ional terminator）を含有するように構築されたpJH101
（E.フェラリ等、J.Bact.154巻、1513−1515頁）中にク
ローニングした（ウェルズ等、Nucleic Acid Research
（1983）、11巻、7911−7925頁、Hind III−BamH I断片
（pJH101−term）について）。リパーゼ遺伝子の５′末
端、シグナル配列およびaprEプロモーターを含有するEc
oR I−Pvu II DNA断片、並びにリパーゼ遺伝子の３′
末端を含有するPvu II−Ava I DNA断片をpApr−cut−
１から単離した。Pvu IIによる切断の前に、T4ポリメラ
ーゼにより、リパーゼ遺伝子のPvu II−Ava I断片のAva
I ５′懸垂（overhang）をフィルイン（fill in）し
た（サムブルック等、Molecular Cloning、Labolatory
Manual、前出）。プラスミドpJH101−term（ターミネー
ターを有する）をEcoR I−Hind IIにより切断し、EcoR
Iによる切断の前に、T4ポリメラーゼによりHind III
５′懸垂もまたフィルインした。EcoR I−Pvu II断片、
Pvu II−Ava I断片およびEcoR I−Hind III切断ベクタ
ーを連結してpAK−K3を産生した。
融合物G2、A1およびＡ（−１）の構築：
pAK−K3からのEcoR I−Asp718 DNA断片をM13プラス
ミド中にクローニングした。aprEのプロ配列の３番目の
アミノ酸であるＫ（K3）;aprEのプロ配列の２番目と３
番目のアミノ酸であるＧおよびＫ（G2−K3）;aprEのプ
ロ配列の１番目と２番目と３番目のアミノ酸であるＡ、
ＧおよびＫ（A1−G2−K3）；をコード化するコドンを、
それぞれ一本鎖合成プライマー２、３および４（配列番
号はそれぞれ３、４および５）を用いて位置指定突然変
異誘発により欠失させた。欠失部を含むM13プラスミド
からのEcoR I−Asp718断片を、EcoR I−Asp718切断pAK
−K3ベクター中にクローニングし、それぞれpAK−G2、p
AK−A1およびpAK−Ａ（−１）を構築した。
ミド中にクローニングした。aprEのプロ配列の３番目の
アミノ酸であるＫ（K3）;aprEのプロ配列の２番目と３
番目のアミノ酸であるＧおよびＫ（G2−K3）;aprEのプ
ロ配列の１番目と２番目と３番目のアミノ酸であるＡ、
ＧおよびＫ（A1−G2−K3）；をコード化するコドンを、
それぞれ一本鎖合成プライマー２、３および４（配列番
号はそれぞれ３、４および５）を用いて位置指定突然変
異誘発により欠失させた。欠失部を含むM13プラスミド
からのEcoR I−Asp718断片を、EcoR I−Asp718切断pAK
−K3ベクター中にクローニングし、それぞれpAK−G2、p
AK−A1およびpAK−Ａ（−１）を構築した。
融合物K9の構築
リパーゼ（クチナーゼ）遺伝子をHind III−Sac I断
片（M13lip）としてのM13プラスミド中にクローニング
した。突然誘発変異方法によりプラスミド6B（配列番号
７）を用いて、成熟リパーゼ遺伝子の前に、５つのコド
ン（Ｓ、Ｔ、Ｅ、Ｋ、Ｋ）およびSac I部位を導入し
た。pS168−１からのaprE遺伝子（M.L.スタール等、J.B
act.（1984）、158巻、411−418頁）をEcoR I−Hind II
I断片としてのM13プラスミド（M13apr）中にクローニン
グした。突然変異誘発方法によりオリゴヌクレオチドプ
ライマー6A（配列番号６）を用いて、Sac I部位をaprE
プロ配列のコドン３−５（K3−S4−S5）内に導入した。
片（M13lip）としてのM13プラスミド中にクローニング
した。突然誘発変異方法によりプラスミド6B（配列番号
７）を用いて、成熟リパーゼ遺伝子の前に、５つのコド
ン（Ｓ、Ｔ、Ｅ、Ｋ、Ｋ）およびSac I部位を導入し
た。pS168−１からのaprE遺伝子（M.L.スタール等、J.B
act.（1984）、158巻、411−418頁）をEcoR I−Hind II
I断片としてのM13プラスミド（M13apr）中にクローニン
グした。突然変異誘発方法によりオリゴヌクレオチドプ
ライマー6A（配列番号６）を用いて、Sac I部位をaprE
プロ配列のコドン３−５（K3−S4−S5）内に導入した。
得られたaprE遺伝子のEcoR I−Sac I断片およびリパ
ーゼ（クチナーゼ）のSac I−Asp718断片をM13プラスミ
ドから単離し、EcoR I−Asp718切断pAK−K3ベクター中
にクローニングした。得られたプラスミド（AK−K9）
は、aprE遺伝子のプロ配列内の９番目のアミノ酸（K9）
に融合された成熟リパーゼ（クチナーゼ）遺伝子を有し
ている。
ーゼ（クチナーゼ）のSac I−Asp718断片をM13プラスミ
ドから単離し、EcoR I−Asp718切断pAK−K3ベクター中
にクローニングした。得られたプラスミド（AK−K9）
は、aprE遺伝子のプロ配列内の９番目のアミノ酸（K9）
に融合された成熟リパーゼ（クチナーゼ）遺伝子を有し
ている。
融合物K27の構築
K9融合物について上述したのと同一のM13プラスミド
を用いて、同様な方法によりこの融合物を作成した。一
本鎖合成プライマー7A（配列番号８）を用いて、Sac I
部位をaprEのプロ配列の22番目のコドン（S22）に導入
した。一本鎖合成プライマー7B（配列番号９）を用い
て、５つのコドン（Ｓ、Ａ、Ｋ、Ｋ、Ｋ）およびSac I
部位を成熟リパーゼ遺伝子の前に導入した。
を用いて、同様な方法によりこの融合物を作成した。一
本鎖合成プライマー7A（配列番号８）を用いて、Sac I
部位をaprEのプロ配列の22番目のコドン（S22）に導入
した。一本鎖合成プライマー7B（配列番号９）を用い
て、５つのコドン（Ｓ、Ａ、Ｋ、Ｋ、Ｋ）およびSac I
部位を成熟リパーゼ遺伝子の前に導入した。
得られたEcoR I−Sac I断片およびリパーゼ（クチナ
ーゼ）のSac I−Asp718断片をM13プラスミドから単離
し、EcoR I−Asp718切断pAK−K3ベクター中にクローニ
ングした。得られたプラスミド（AK−K27）は、aprE遺
伝子のプロ配列内の27番目のアミノ酸（K27）に融合さ
れた成熟リパーゼ（クチナーゼ）遺伝子を有している。
ーゼ）のSac I−Asp718断片をM13プラスミドから単離
し、EcoR I−Asp718切断pAK−K3ベクター中にクローニ
ングした。得られたプラスミド（AK−K27）は、aprE遺
伝子のプロ配列内の27番目のアミノ酸（K27）に融合さ
れた成熟リパーゼ（クチナーゼ）遺伝子を有している。
融合物S4、S5、T6、E7、K8およびI11の構築
これらの構成は融合PCR法により行なった（R.M.ホー
トン等（1989）Gene77巻、61−68頁）。各々のプライマ
ー50pmolおよび2.5ユニットのTaqポリメラーゼ（パーキ
ンエルマー／セタス）を含有している100ulのPCR緩衝液
（パーキンエルマー／セタス）中でポリメラーゼ連鎖反
応（PCR）を行なった。反応混合物を鉱物油で覆い、蒸
発を防いだ。温度プログラムは、95℃で10分間、50℃で
１分間、70℃で１分間を１サイクル;95℃で１分間、50
℃で１分間、70℃で１分間を28サイクル;95℃で10分
間、50℃で１分間、70℃で15分間を１サイクルから構成
されるものであった。20bpの下流リパーゼ（クチナー
ゼ）遺伝子配列の後に21bpの上流aprE遺伝子配列を有す
る、融合接合をコード化する２つの相補的な二本鎖合成
DNA鎖を各々の構築物のために合成した。陽性鎖（posit
ive strand）をコード化する一本鎖合成プライマーであ
るプライマー13（配列番号20）は、aprEプロモーターに
対して相補的であり、EcoR I部位を有している。陰性鎖
（negative strand）をコード化する一本鎖合成プライ
マーであるプライマー14（配列番号21）は、リパーゼ
（クチナーゼ）遺伝子に対して相補的であり、Asp718部
位を有している。プライマー13（配列番号20）および14
（配列番号21）を全ての構築物に用いた。
トン等（1989）Gene77巻、61−68頁）。各々のプライマ
ー50pmolおよび2.5ユニットのTaqポリメラーゼ（パーキ
ンエルマー／セタス）を含有している100ulのPCR緩衝液
（パーキンエルマー／セタス）中でポリメラーゼ連鎖反
応（PCR）を行なった。反応混合物を鉱物油で覆い、蒸
発を防いだ。温度プログラムは、95℃で10分間、50℃で
１分間、70℃で１分間を１サイクル;95℃で１分間、50
℃で１分間、70℃で１分間を28サイクル;95℃で10分
間、50℃で１分間、70℃で15分間を１サイクルから構成
されるものであった。20bpの下流リパーゼ（クチナー
ゼ）遺伝子配列の後に21bpの上流aprE遺伝子配列を有す
る、融合接合をコード化する２つの相補的な二本鎖合成
DNA鎖を各々の構築物のために合成した。陽性鎖（posit
ive strand）をコード化する一本鎖合成プライマーであ
るプライマー13（配列番号20）は、aprEプロモーターに
対して相補的であり、EcoR I部位を有している。陰性鎖
（negative strand）をコード化する一本鎖合成プライ
マーであるプライマー14（配列番号21）は、リパーゼ
（クチナーゼ）遺伝子に対して相補的であり、Asp718部
位を有している。プライマー13（配列番号20）および14
（配列番号21）を全ての構築物に用いた。
一連の３つのPCR反応を以下のように行なった。プラ
イマー13（配列番号20）および融合接合の陰性鎖をコー
ド化する一本鎖合成プライマーを用いて、プロモーター
と融合点との間のDNAを増幅した（Ａ）；テンプレート
は、pS168−１からのEcoR I−Hind III断片であり、成
熟遺伝子の５′、aprEプロモーター、シグナル配列およ
びプロ配列を有していた（反応１）。プライマー14（配
列番号21）および融合接合の陽性鎖をコード化する一本
鎖合成プライマーを用いて、融合点と成熟リパーゼ遺伝
子との間のDNAを増幅した（Ｂ）；テンプレートは、プ
ラスミドpAK−K3の標準DNAミニスクリーン（miniscree
n）の1:100の希釈物であった（反応２）。反応１および
２各々の1ulを用いて、プライマー13（配列番号20）お
よび14（配列番号21）を使用した増幅による反応２から
のDNA断片に反応１からのDNA断片を融合させた（反応
３）。30のサイクル後、増幅したDNAの半分をフェノー
ルとクロロホルムによる抽出を行なって洗浄し、その
後、製造者の説明書にしたがって回転カラム精製（spin
−column purification）（ワーシントンミニスピン）
を行なった。EcoR I−Asp718断片を、増幅したDNAから
単離し、M13−mp19 EcoR I−Asp718切断ベクター中に
クローニングした。配列確認後（サンガー等、1977）、
EcoR I−Asp718断片を、EcoR I−Asp718切断pAK−K3ベ
クター中にクローニングした。
イマー13（配列番号20）および融合接合の陰性鎖をコー
ド化する一本鎖合成プライマーを用いて、プロモーター
と融合点との間のDNAを増幅した（Ａ）；テンプレート
は、pS168−１からのEcoR I−Hind III断片であり、成
熟遺伝子の５′、aprEプロモーター、シグナル配列およ
びプロ配列を有していた（反応１）。プライマー14（配
列番号21）および融合接合の陽性鎖をコード化する一本
鎖合成プライマーを用いて、融合点と成熟リパーゼ遺伝
子との間のDNAを増幅した（Ｂ）；テンプレートは、プ
ラスミドpAK−K3の標準DNAミニスクリーン（miniscree
n）の1:100の希釈物であった（反応２）。反応１および
２各々の1ulを用いて、プライマー13（配列番号20）お
よび14（配列番号21）を使用した増幅による反応２から
のDNA断片に反応１からのDNA断片を融合させた（反応
３）。30のサイクル後、増幅したDNAの半分をフェノー
ルとクロロホルムによる抽出を行なって洗浄し、その
後、製造者の説明書にしたがって回転カラム精製（spin
−column purification）（ワーシントンミニスピン）
を行なった。EcoR I−Asp718断片を、増幅したDNAから
単離し、M13−mp19 EcoR I−Asp718切断ベクター中に
クローニングした。配列確認後（サンガー等、1977）、
EcoR I−Asp718断片を、EcoR I−Asp718切断pAK−K3ベ
クター中にクローニングした。
S4、S5、T6、K8、I11およびE7の構築に用いた融合プ
ライマーのＡおよびＢ対は、それぞれ8A＆Ｂ、9A＆Ｂ、
10A＆Ｂ、11A＆Ｂ、12A＆Ｂ、および15A＆Ｂの番号であ
った（それぞれ、配列番号10−19および22並びに23）。
ライマーのＡおよびＢ対は、それぞれ8A＆Ｂ、9A＆Ｂ、
10A＆Ｂ、11A＆Ｂ、12A＆Ｂ、および15A＆Ｂの番号であ
った（それぞれ、配列番号10−19および22並びに23）。
枯草菌中への形質転換
異なる融合物を含有するプラスミドを枯草菌中に形質
転換し（アナグネストポロス、C.、J.Bact.（1961）81:
741−746）、キャンベル型の機構によりaprE座内の染色
体に特異的に組み込んだ（ヤング、M.、J.Gen.Microbio
l.（1984）130:1613−1621）。バシラス属菌株（BB8）
は、５つのプロテアーゼ、およびestB（デルタapr、デ
ルタnpr、デルタbpF、デルタepr、isp−１、デルタest
B）が欠失したI168の誘導体であった。スタール、M.
L.、J.Bact.（1984）158:411−418に記載されている方
法を用いて、表示した遺伝子が欠失したものを導入し
た。融合遺伝子による形質転換後、形質転換またはPBS
−１媒介形質導入のいずれかにより（ホッチ、J.A.、バ
ラット、M.およびアナグノストポロス、C.、J.Bact.（1
983）154:1513−1515）、sacU（Hy）（ヘンナー、D.
J.、フェラリ、E.、ペレゴ、M.およびホッチ、J.A.、J.
Bact.（1988）170:296−300）突然変異を導入し、異な
る融合物を担持する異なる最終的な枯草菌株を産生し
た。
転換し（アナグネストポロス、C.、J.Bact.（1961）81:
741−746）、キャンベル型の機構によりaprE座内の染色
体に特異的に組み込んだ（ヤング、M.、J.Gen.Microbio
l.（1984）130:1613−1621）。バシラス属菌株（BB8）
は、５つのプロテアーゼ、およびestB（デルタapr、デ
ルタnpr、デルタbpF、デルタepr、isp−１、デルタest
B）が欠失したI168の誘導体であった。スタール、M.
L.、J.Bact.（1984）158:411−418に記載されている方
法を用いて、表示した遺伝子が欠失したものを導入し
た。融合遺伝子による形質転換後、形質転換またはPBS
−１媒介形質導入のいずれかにより（ホッチ、J.A.、バ
ラット、M.およびアナグノストポロス、C.、J.Bact.（1
983）154:1513−1515）、sacU（Hy）（ヘンナー、D.
J.、フェラリ、E.、ペレゴ、M.およびホッチ、J.A.、J.
Bact.（1988）170:296−300）突然変異を導入し、異な
る融合物を担持する異なる最終的な枯草菌株を産生し
た。
aprE/リパーゼ融合菌株の培養および評価
以下の検定を用いて、培養上澄中のリパーゼ（クチナ
ーゼ）の産生について、最終的な枯草菌株を検定した。
ーゼ）の産生について、最終的な枯草菌株を検定した。
検定：
シュードモナス メンドシナ リパーゼ（クチナー
ゼ）を、pH7.0の0.2Mヘペス緩衝液（Hepes buffer）中
で1mMのｐ−ニトロフェニルブチレートにより検定す
る。活性は、1mlの反応容量中の１分当たりで10ulの試
料当たりの410nmでの吸収における変化として表す。１
ユニット＝1mlの反応容量中の１分当たりで10ulの試料
当たりの410nmでの1AUの変化。結果を、0.060（mg/ml）
／ユニットの特異的活性に基づいてmg/mlに添加した。
ゼ）を、pH7.0の0.2Mヘペス緩衝液（Hepes buffer）中
で1mMのｐ−ニトロフェニルブチレートにより検定す
る。活性は、1mlの反応容量中の１分当たりで10ulの試
料当たりの410nmでの吸収における変化として表す。１
ユニット＝1mlの反応容量中の１分当たりで10ulの試料
当たりの410nmでの1AUの変化。結果を、0.060（mg/ml）
／ユニットの特異的活性に基づいてmg/mlに添加した。
バシラス属の菌株を37℃で振とうさせながら培地Ａ中
で一晩成長させ、５％を培地Ｂに接種し、上記検定を用
いてリパーゼ（クチナーゼ）の産生を検定した。培地Ａ
およびＢを表Ｉに記載する。最初の線形産生間隔を上回
る産生速度に基づいて菌株を評価し（第２図）、mg/ml/
時間で表した。
で一晩成長させ、５％を培地Ｂに接種し、上記検定を用
いてリパーゼ（クチナーゼ）の産生を検定した。培地Ａ
およびＢを表Ｉに記載する。最初の線形産生間隔を上回
る産生速度に基づいて菌株を評価し（第２図）、mg/ml/
時間で表した。
表 Ｉ
培地Ａ
ペンアッセイブイヨン（Penassay broth） （ディフ
コ） 培地Ｂ 栄養物ブイヨン（ディフコ） 0.8％ CaCl2 1mM FeSO4 0.001mM MnCl2 0.01mM KCl 0.1％ MgSO4 0.025％ マルトデキストリン（CPC M150） 0.1％ 第３図に示したように、異なる融合物が、著しく異な
る発現レベルで産生された。相対的な生産速度は５倍
（K3/S4）までの範囲におよび、最良のもの（K3）は、
単純直接シグナル配列接合連結（simple direct signal
sequence junction hookup）（Ａ−１）より５倍多く
産生された。
コ） 培地Ｂ 栄養物ブイヨン（ディフコ） 0.8％ CaCl2 1mM FeSO4 0.001mM MnCl2 0.01mM KCl 0.1％ MgSO4 0.025％ マルトデキストリン（CPC M150） 0.1％ 第３図に示したように、異なる融合物が、著しく異な
る発現レベルで産生された。相対的な生産速度は５倍
（K3/S4）までの範囲におよび、最良のもの（K3）は、
単純直接シグナル配列接合連結（simple direct signal
sequence junction hookup）（Ａ−１）より５倍多く
産生された。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ
(Ｃ１２Ｎ 9/56
Ｃ１２Ｒ 1:125）
(72)発明者 ヴァン キメナーデ，ヨハナ エム エ
ー
アメリカ合衆国 カリフォルニア州
94066 サンブルーノ リンデン アヴ
ェニュー 527
(72)発明者 カーロマグノ，ルーアン ピー
アメリカ合衆国 カリフォルニア州
95476 ソノマ クレーグ アヴェニュ
ー821
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12N 15/00 - 15/90
C12N 1/21
C12N 9/56
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ
ｅｎｅＳｅｑ
ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (18)
- 【請求項１】枯草菌内でグラム陰性リパーゼを発現させ
る方法であって、 ａ） 各々のプラスミドが枯草菌aprEプロ配列の１番目
から９番目までのアミノ酸のうちの１つに対応するコド
ンに成熟リパーゼのＮ末端に相当する遺伝子を融合して
なる複数のプラスミドを構築し、前記枯草菌aprEプロ配
列がそれ自身のシグナル配列に結合しており、 ｂ） 適切な条件下で枯草菌を前記工程ａ）で得られた
プラスミドにより形質転換して該プラスミドを前記枯草
菌の染色体に組み込み、 ｃ） 必要に応じて、前記枯草菌に分泌過多突然変異を
導入し、 ｄ） 前記工程ｂ）または工程ｃ）で得られた形質転換
体を前記リパーゼの発現の有無について検定する、 各工程からなることを特徴とする方法。 - 【請求項２】前記成熟リパーゼ遺伝子がシュードモナス
属の微生物由来のものであることを特徴とする請求の範
囲第１項記載の方法。 - 【請求項３】前記成熟リパーゼ遺伝子がシュードモナス
メンドシナ、ATCC53552由来のものであることを特徴
とする請求の範囲第２項記載の方法。 - 【請求項４】枯草菌aprEプロモーターの使用を含むこと
を特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項５】前記工程ａ）で得られるプラスミドが、枯
草菌aprEプロ配列の３番目のアミノ酸に対応するコドン
に各自のＮ末端で融合する成熟シュードモナス メンド
シナ リパーゼ遺伝子を含み、前記枯草菌aprEプロ配列
が枯草菌aprEシグナル配列に結合していることを特徴と
する請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項６】前記工程ａ）で得られるプラスミドが、枯
草菌aprEプロ配列の６番目のアミノ酸に対応するコドン
に各自のＮ末端で融合する成熟シュードモナス メンド
シナ リパーゼ遺伝子を含み、前記枯草菌aprEプロ配列
が枯草菌aprEシグナル配列に結合していることを特徴と
する請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項７】前記枯草菌内に導入された分泌過多突然変
異がSacU（Hy）突然変異であることを特徴とする請求の
範囲第１項記載の方法。 - 【請求項８】グラム陰性リパーゼをコード化する異種DN
Aを含む形質転換枯草菌細胞であって、前記異種DNAがそ
の５′末端で枯草菌aprEプロ配列の１番目から９番目ま
でのアミノ酸のうちの１つに対応するコドンに融合し、
前記枯草菌aprEプロ配列がそれ自身のシグナル配列に結
合していることを特徴とする形質転換枯草菌細胞。 - 【請求項９】前記グラム陰性リパーゼがシュードモナス
リパーゼであることを特徴とする請求の範囲第８項記
載の形質転換枯草菌細胞。 - 【請求項１０】５′末端で枯草菌aprEプロ配列の１番目
から９番目までのアミノ酸のうちの１つに対応するコド
ンに融合するシュードモナス メンドシナ リパーゼを
コード化する異種DNAを含み、前記枯草菌aprEプロ配列
がそれ自身のシグナル配列に結合していることを特徴と
する請求の範囲第８項記載の形質転換枯草菌細胞。 - 【請求項１１】前記シュードモナス メンドシナ リパ
ーゼをコード化する異種DNAが前記枯草菌aprEプロ配列
の３番目のアミノ酸に対応するコドンに融合しているこ
とを特徴とする請求の範囲第10項記載の形質転換枯草菌
細胞。 - 【請求項１２】前記シュードモナス メンドシナ リパ
ーゼをコード化する異種DNAが前記枯草菌aprEプロ配列
の６番目のアミノ酸に対応するコドンに融合しているこ
とを特徴とする請求の範囲第10項記載の形質転換枯草菌
細胞。 - 【請求項１３】Ｎ末端で枯草菌aprEプロ配列の１番目か
ら９番目までのアミノ酸のうちの１つに対応するコドン
に融合する成熟シュードモナス メンドシナ リパーゼ
遺伝子を含む組換えDNA構築物。 - 【請求項１４】請求の範囲第13項記載の組換えDNA構築
物を含むプラスミド。 - 【請求項１５】Ｎ末端で枯草菌aprEプロ配列の３番目の
アミノ酸に対応するコドンに融合している成熟シュード
モナス メンドシナ リパーゼ遺伝子を含む組換えDNA
構築物。 - 【請求項１６】請求の範囲第15項記載の組換えDNA構築
物を含むプラスミド。 - 【請求項１７】Ｎ末端で枯草菌aprEプロ配列の６番目の
アミノ酸に対応するコドンに融合している成熟シュード
モナス メンドシナ リパーゼ遺伝子を含む組換えDNA
構築物。 - 【請求項１８】請求の範囲第17項記載の組換えDNA構築
物を含むプラスミド。
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