JPH07505292A

JPH07505292A - 枯草菌内における異種遺伝子の発現：融合方法

Info

Publication number: JPH07505292A
Application number: JP5517662A
Authority: JP
Inventors: パワー，スコット　ディー; ヴァン　キメナーデ，ヨハナ　エム　エー; カーロマグノ，ルーアン　ピー
Original assignee: ジェネンコア　インターナショナル　インコーポレーテッド
Priority date: 1992-03-30
Filing date: 1993-03-30
Publication date: 1995-06-15
Anticipated expiration: 2018-08-04
Also published as: EP0646177A1; JP3432224B2; CA2133338C; CA2133338A1; FI944524A0; US5429950A; DK0646177T3; FI944524A; EP0646177B1; DE69333341D1; DE69333341T2; WO1993020214A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】１２、前記グラム陽性リパーゼがシュードモナス　リパーゼであることを特徴とする請求の範囲第１０項記載の形質転換バシラス属細胞。

１３、５’末端で枯草菌ａｐｒＥのプロ配列の１番目から９番目までのアミノ酸のうちの１つに対応するコドンに融合するシュードモナス　メンドシナ　リパーゼをコード化する異種ＤＮＡを含み、前記枯草菌ａｐｒＨのプロ配列がそれ自身のシグナル配列に結合していることを特徴とする請求の範囲第１０項記載の形質転換枯草菌属細胞。

１４、前記シュードモナス　メンドシナ　リパーゼをコード化する異種ＤＮＡが前記枯草菌ａｐｒＥプロ配列の３番目のアミノ酸に対応するコドンに融合していることを特徴とする請求の範囲第１３項記載の形質転換枯草菌属細胞。

１５、前記シュードモナス　メンドシナ　リパーゼをコード化する異種ＤＮＡが前記枯草菌ａｐｒＥプロ配列の６番目のアミノ酸に対応するコドンに融合していることを特徴とする請求の範囲第１３項記載の形質転換枯草菌属細胞。

１６、　Ｎ末端で枯草菌ＢｐｒＥプロ配列の１番目力１ら９番目までのアミノ酸のうちの１つに対応するコドンに融合する成熟シュードモナス　メンドシナ　１ノパーゼ遺伝子を含む組換えＤＮＡ構築物。

１７、請求の範囲第１６項記載の組換えＤＮＡ構築物を含むプラスミド。

１８、Ｎ末端で枯草菌Ｂｐ　ｒＥプロ配列の３番目のアミノ酸１こ対応するコドンに融合している成熟シュードモナス　メンドシナ　Ｉ）ｔ＜−ゼ遺伝子を含む組換えＤＮＡ構築物。

１９、請求の範囲第１８項記載の組換えＤＮＡ構築物を含むプラスミド。

２０、　Ｎ末端で枯草菌ＢｐｒＥプロ配列の６番目のアミノ酸１こ対応するコドンに融合している成熟シュードモナス　メンドシナ　１ノノクーゼ遺伝子を含む組換えＤＮＡ構築物。

２、特許請求の範囲第２０項記載の組換えＤＮＡ構築物を含むプラスミド。

明　細　書枯草菌内における異種遺伝子の発現：融合手法関連出願についてのクロス・リファレンス本出願は、１９８７年５月２９日に出願された米国特許出願第０７１０５６．５００号（今では放棄されている）に基づいて３５Ｕ　Ｓ　Ｃセクション１２０の元で優先権を主張している、１９８８年５月３１に出願されたＰＣＴ出願第ｐＣＴ／ＵＳ８８１０１８４４号から派生した、１９８９年３月２９日に出願し、今では米国特許第４．９８１．６１１号となっている米国特許出願第０７／３４１．２００号の継続出願である、１９９０年１０月２２日に出願された米国特許出願第０７／６００．８３６号の一部継続出願である、１９９１年１１月２７日に出願された米国特許第０７／８００．３６５号に関連している。上記した特許および特許出願の各々の全てをここ本発明は、バシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の微生物からのリパーゼ（クチナーゼ：Ｃｕｔｉｎａｓｅ）の発現、および発酵ブイヨン（ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｂｒｏｔｈ）からのクチナーゼの精製に関するものである。

発明の背景宿主の種類はなんであれ、その宿主から異種タンパク質を分泌させるのには、シグナルペプチドと成熟標的遺伝子を正確に対応させることが必要である。ダラム陽性のシグナル配列はグラム陰性系においても良好に機能することが知られているが、その逆は成り立たない［１Ｉｏｕｎｔａｉｎ、　Ａ、　（１９８９）　Ｂａｃｉｌｌｕｓ（ＢｉｏｔｈｅｃｂｎｏｌｏｇｙＨａｎｄｂｏｏｋｓ　２．　Ｃ０Ｒ，バーウッド等、　ｅｄ、　）　、　Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ、　７３− １１４頁コ。枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｌｉｓ）においては、他のグラム陽性微生物由来のタンパク質を分泌することがある。しかしながら、そのような場合であっても、最良の産生結果は雑種配列により得られている。バシラス属がそれ自身のシグナル配列を用いてグラム陰性由来のタンパク質を大量に発現した成功例はまだ見られておらず、さらに、雑種配列により成功も最小ゲントのものである［Ｍｏｕｎｔａｉｎ、Ａ、　（１９８９）　Ｂａｃｉｌｌｕｓ（Ｂｉｏｔｈｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ｌ１ａｎｄｂｏｏｋｓ　２．　Ｃ，Ｒ，バーウッド等、　ｅｄ、　）　、　Ｐｌｅｎｕｍ　oｒｅｓｓ、７３−１．１４頁コ　。

シグナルペプチドと成熟遺伝子との融合（ｆｕｓｉｏｎ）を最適なものとする様々な試みが文献に記載されている（トイ、Ｒ，Ｈ，、ウォン、Ｓ、およびカワムラ、Ｆ、　（１９８６）Ｔｒｅｎｄｓ　ＢｉｏｔｅｃｈｎｏＬ　５ｅｐｔ、　：２３２−２３５　ｒファーネスドック、Ｓ、Ｒ，およびフィッシャー、Ｋ、Ｅ、　（１９８６）Ｊ、　Ｂａｃｔ、１６５ニア９６−８０４　；ファーネスドック、Ｓ、　Ｒ６およびフィッシャー、Ｋ、Ｅ、　（１９Ｂ？）Ａｐｐｌ、　Ｅｎｖ、　１１ｉｃｒｏｂｉｏ１．５３：３７９−３８４　；サーバス、Ｍ、（１９８６）Ｃｕｒｒ、　ＴｏｐｉｃｓＭｉｃｒｏ、　Ｉｍｍｕｎ、１２５：１０３−１２５；ウルマネン、■、ランドストロム、Ｋ５、レートパーラ、Ｃ８、サーバス、Ｍｌ、ルオーネン、Ｍ、およびパルバ、１．　（１９８５）１６２：１７６− １８２　；バサンタ、Ｎ、およびトンプソン、Ｌ、　Ｄ、　（１９８６）Ｊ、　Ｂａｃｔ、１６５：８３７−８４２を参照のこと）。しかしながら、どの場合においても、融合する箇所は、都合のよい制限部位に基づいて、またはシグナル切断部位（ｓｉｇｎａｌ　ｃｌｅａｖａｇｅ　５ｉｔｅ）で直接グラム陽性シグナル配列を標的遺伝子に接合させることのみにより選択されていた。

本発明は、グラム陽性微生物である枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ　）内でグラム陰性のシュードモナス　メンドシナ（Ｐｓｅｄｏｍｏｎａｓ　ｍｅｎｄｏｃｉｎａ）リパーゼ（クチナーゼ）を発現させることに関するものである。酵素は、ａｐｒＥ　（プリプロ枯草菌サブチリシン、ｐｒｅｐｒｏ　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓｉｎ　）による融合体（ｆｕｓｉｏｎ）として産生される。ポリメラーゼ連鎖反応技術を用いて、ここに引用した米国特許出願０７／９３２．９５０号に記載されているように、プロ配列（ｐｒｏｓｅｑｕｅｎｃｅ　）残留物Ａ　（−１）　、ＡＩ、Ｇ２、Ｋ３、Ｓ４、Ｓ５、Ｔｏ、Ｃ７、Ｋ８、Ｋ９．１１１およびに２７にて（およびそれを含む）ａｐｒＥのプロ配列にリパーゼの成熟暗号配列を融合した。得られた構築物を枯草菌産生宿主（Ｂ　Ｂ　８）の染色体中に組み込み、５ａｃＵ（Ｈｙ）表現型に形質導入才たは形質転換した後、各々の菌株の生産効率を、ここに記載するように測定した。

発明の概要本発明はバシラス属微生物内での異種遺伝子の発現に関し、１つ以上の融合（ｆｕｓｉｏｒｌｓ　）が続いて行なわれ、その融合が宿主シグナル配列、宿主プロ配列（ｈｏｓｔ　ｐｒｏ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　）および標的遺伝子配列からなるものである。

本発明はまた、枯草菌由来のプロモーターおよびバシラス　アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）由来のターミネータ−を用いたバシラス属内でのリパーゼ（クチナーゼ）の発現に関するものである。

本発明はまた、枯草菌ａｐｒＥ遺伝子による成熟リパーゼ遺伝子の特異的な融合に関するものである。これらの特異的な融合を、枯草菌中に形質転換されるプラスミドベクター内に導入してもよい。

図面の簡単な説明第１図は、シグナル配列二次構造の鍵となる要素を示した配列の概略図である。

第２図は、枯草菌内のある融合（Ｇ２およびに３）のリパーゼ生産速度を示すグラフである。

第３図は、枯草菌内のシュードモナス　メンドシナ　リパーゼの発現を示すグラフである。

第４図は、ｐＡｐｒ−ｃｕｔ−１（第４ａ図）；ｐＡＫ−に３（第４ｂ図）；りＡＫ−Ｇ２、ｐＡＫ−Ａｌ、ｐＡＫ−Ａ　（−１）（第４ｃ図）；ｐＡＫ−に９、ｐＡＫ−に２７　（第４ｄ図）；ｐＡＫ−３４、ｓ５、Ｔｏ、Ｃ７、Ｋ８．１１１（第４ｅ図）の構築を説明する概略図である。

第５図は、ｐＡＫ−に３のプラスミド地図を示す概略図である。

細菌からのタンパク質の分泌は、プレタンパク質（ｐｒｅ−ｐｒｏｔｅｉｎ　）が成熟酵素にトランスロケーションし、それに続いて膜の外面上にあるプレタンパク質が成熟酵素にタンパク質分解切断する工程を含むＡＴＰ依存性プロセスである。プレタンパク質は、Ｎ末端、２０から４０までの範囲のアミノ酸のシグナルペプチド（グラム陰性）［マウンテン、Ａ、　（１９８９）Ｂａｃｉｌｌｕｓ　（Ｃ６Ｒ，バーウッド、ｅｄ、　）、プレナム、ニューヨーク、７３−１１４］およびＣ末端成熟タンパク質からなる。単独の微生物内においてさえも、どの −欠配列の相同性が第１図に示したような二次構造相同性をまだ保存する場合でも、シグナル配列は制限のみを示している。シグナルペプチドの３つの領域は、正に荷電した領域であるＮ末端、疎水性中央領域、および非螺旋のカルボキシ末端領域である。以下に記載するように、グラム陽性微生物は、はぼ同じ長さの中央疎水コアを維持しながら、大腸菌のようなグラム陰性微生物より大きなＮ末端およびＣ末端を有する傾向にある。このシグナル配列は、トランスロケーションを行なうために、膜をタンパク質の標的とするのに必要な情報の全てを含有していると考えられる［マウンテン、Ａ、　（１９８９）Ｂａｃｉｌｌｕｓ　（Ｃ，Ｒ，バーウッド、ｅｄ、　）　、プレナム、ニューヨーク、７３−１１４　；ウイックナー、Ｗ３、ドリーセン、Ａ、Ｊ、Ｍ、　およびハードル、Ｆ、Ｕ、（１９９１）Ａｎｎｕ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、６０：１０１−１２４　：シヤフラ、Ｐ、Ｊ、およびベックウィズ、Ｊ。

（１９８３）Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１５４＋２５３−２６０を参照のこと］。

分泌の最初の段階において、グラム陰性大腸菌について記載したように、もしかするとチャペロニン（ｃｈａｐｅｒｏｎｉｎ）　（ｓ　ｅ　ｃ　Ｂ、　ｇ　ｒ　ｏ　Ｅ　Ｌ等）を有するかもしれない新たに合成したプレタンパク質は、膜結合受容体ＡＴＰアーゼ（ｓｅｃＡ）により認識されると考えられている。この膜結合受容体ＡＴＰアーゼは、膜内の膜複合体（ｉｎｔｅｇｒａｌ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｃｏ＋ｎｐｌｅｘ　）　（ｓ　ｅ　ｃ　Ｅ　／Ｙ）によるタンｄり質のトランスロケーションにＡＴＰの加水分解を関連付けている［マウンテン、Ａ、（１９８９）Ｂａｃｉｌｌｕｓ　（Ｃ，Ｒ，バーウッド、ｅｄ、　）　、プレナム、ニューヨーク、７３−１１４　、ウィックナー、Ｗｏ、ドリーセン、Ａ、Ｊ、Ｍ、およびハードル、Ｆ。

Ｕ、　（１９９１）Ａｎｎｕ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、６０二１０１−１２４　；シャツ゛ソ、Ｐ、Ｊ、およびベックウィズ、Ｊ、　（１９９０）Ａｎｎｕ、　Ｒｅｖ、　Ｇｅｎｅｔ、２４：２１５−２４８およびそれらの参照文献を参照のこと］。プレ酵素の鍵となる特性は、このプレ酵素が、おそらくはゆるく折り重ねられ、チャペロニンタンパク質との相互作用により維持できるトランスロケーション応答能のある形状になければならないことである［ウイツクナー、児、ドリーセン、Ａ、Ｊ、　Ｍ、およびハードル、Ｆ、　Ｕ、　（１９９１）Ａｎｎｕ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、６０：１０１−１２４　；クマモト、Ｃ，Ａ、　、およびベックウィズ、Ｊ、　（１９８３）Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１５４：２５３−２６０　：クマモト、Ｃ，Ａ、　およびシールド、Ａ、に、　（１９８９）Ｇｅｎｅ７５・１６７−１７５を参照のこと〕。分泌器官によるタンパク質のトランスロケーションおよび認識のための情報をすべて有さなければならないのはこの複合体である。

シグナル配列の潜在的な役割は、酵素が最終的に成熟形状に折り重なるのを防ぐことによりチャペロニン結合を促進させることにあるのかもしれない［パーク、Ｓｏ、リュー、Ｇ１、トッピング、Ｔ、Ｂ、　、カバー、Ｗ、比およびランダル、Ｌ、Ｌ、　（１９８ｇ）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３９：１０３３−１０３５　：ラミネット、Ａ、　Ａ、およびプラクサン、Ａ、（１９８９）ＥＭＢＯＪ、　Ｉｌｌ：１４６９−１４７７３゜Ｂ、グラム陽性微生物における異種分泌枯草菌における分泌は大腸菌における分泌はど理解されていないが、同一の機構により開始するものと一般的に推測されている［セイアー、Ｍ、Ｈ，、Ｊｒ、、ウェーナー、Ｐ、　Ｋ、およびミューラー、Ｍ、　（１９８９）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｒｅｖ、　５３：３３３−３６６；オバーホフ、Ｃ３、クライン、Ｍｌ、スビーズ、Ｍ、およびフロイドル、Ｒ９（１９９１）Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、　２２８：４１７−４２３１　。２組の分泌されたタンパク質の間の１つの違いは、グラム陽性のタンパク質のシグナルペプチドの長さが、このタンパク質に対応するグラム陰性のタンパク質よりも２ｏまでの範囲のアミノ酸だけ長い傾向にあることである。グラム陽性のシグナルペプチドはグラム陰性系において機能するが、その逆は成り立たない［マウンテン、Ａ、　（１９８９）Ｂａｃｉｌｌｕｓ　（Ｃ，Ｒ。

バーウッド、６ｄ、　）　、プレナム、ニューヨーク、７３−１１４　、ボーチャート、Ｔ、　Ｖ。

およびナガラジャン、Ｖ、　（１９９１）Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１７３：２７６−２８２　Ｈパールマン、Ｄ。

おヨヒハルハーソン、Ｈ，Ｏ，（１９８３）Ｊ、　１ｌｏｌ、　Ｂｉｏｌ、　１６７：３９１−４０９１．したがって、枯草菌のようなグラム陽性微生物において異種タンパク質を発現する一般的な方法には、標的タンパク質を宿主の分泌器官に接合させることが必要である（マウンテン、Ａ、（１９８９）Ｂａｃｉｌｌｕｓ　（Ｃ，Ｒ，バーウッド、ｅｄ、　）　、プレナム、ニューヨーク、７３− １１４を参照のこと）。一般的に、うまくいった実験においては、主要な外酵素プロモーターおよびシグナル配列を標的の成熟領域に接合していた。

そのような系を、アルファアミラーゼからの要素を用いて枯草菌のために考案した（シロザ、Ｔｏ、ナヵザヮ、Ｋ１、タシロ、Ｎ１、ヤマネ、Ｋ８、ヤナギ、Ｋ。

、ヤマサキ、Ｍｌ、タムラ、Ｇ１、サイトウ、Ｈｌ、カヮデ、Ｙ、およびタニグチ、Ｔ、　（１９８５）Ｇｅｎｅ　３４：１−８　；ヤマネ、Ｋｏ、ナカザヮ、Ｋ１、ナヵムラ、Ｋｏ、ミネクラ、Ｈｌ、そり、Ｔｏ、タカノ、Ｊｌ、シロザ、Ｔｏ、ンーマ、Ａ、およびフジタ、Ｔ、（１９８６）Ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ａｎｄ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ａｐｐｌ奄■ ａｔｉｏｎｓ　（Ａ、　Ｔ、ガネサンおよびＪ、Ａ、ホックスｅｄｓ、　）アカデミツクプレス、ニューヨーク、４１１−４２２頁；パルバ、１．　（１９８２）Ｇｅｎｅ　１９：８１−８７　；アルマネン、Ｉｌ、ランドストロム、Ｋｏ、レートパーサ、Ｐｌ、サーバス、Ｍｌ、ローホーネン、Ｍｌ、およびパルバ、１．　（１９８５）Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１６２：１７６−１８２）　、アルカリ性および中性プロテアーゼ（ファーネスドック、Ｓ、　Ｒ，およびフィッシャー、Ｋ、Ｅ、（１９８６）Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ　１６５ニア９６−８０４；バサンサ、Ｎ、およびトンプソン、Ｌ、Ｄ、　（１９８６）Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１６５：８３７−８４２　；ウオン、Ｓ、　Ｌ、　、カワムラ、Ｆ。

およびトイ、Ｒ，Ｈ，（１９８６）Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１６８：１００５−１００９　）　、ペニシリナーゼ（チャン、Ｓｏ、グレイ、Ｏｌ、ホー、Ｄｌ、クローヤー、Ｊｌ、チャン、Ｓ。

Ｙ、　、？ｙツクーリン、Ｊ、およびマーク、Ｄ、　（１９８４）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄＧｅｎｅ　Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｂａｃｉｌｌｉ　１５９−１６９頁）およびレノくンスクラーゼ（ポルチェート、Ｔ、　Ｖ、およびナガラジャン、Ｖ、　（１９９１）Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１７３：２７６−２８２）、成熟標的遺伝子により供与体プロモーターとシグナル配列との融合を位置付ける際には、シグナルペプチド、ペプチド切断部位および成熟遺伝子の線状の組織化を一般的に検討し、多くの場合、タンパク質分解接合部（第１図参照）またはちょうどその後の部位で標的を供与体シグナル配列に直接連結させて、シグナル配列供与体の成熟遺伝子からのアミノ酸をせいぜい１つか２つ加えていた（マウンテン、Ａ、（１９８９）Ｂａｃｉｌｌｕｓ　（Ｃ，Ｒ，バーウッド、ｅｄ、　）　、ブレナム、ニュー　Ｅｌ−り、７３−１１４およびその参照文献）。一般的に、結果は平凡であり、非ダラム陽性の異種タンパク質の累積レベルはｍｇ／ｌの量をめったに超えなかった（マウンテン、Ａ、（１９８９）Ｂａｃｉｌｌｕｓ　（Ｃ，Ｒ，／％−ウッド、ｅｄ、）、プレナム、ニューヨーク、７３−１１４）。

これらの方法では、成熟タンパク質とシグナルペプチドとの潜在的な関連力（考慮されていない。上述したように、シグナルペプチドの潜在的な役割の１つは、分泌器官によるトランスロケーション並びに獲得（ａｑｕｉｓｉｔｉｏｎ）の前に所望のチャペロニンの結合を促進させることである。この必要条件並びに能率的なトランスロケーションに必要な他のありうる構造の結果として、成熟タンノ々り質と特異的に相互作用するシグナルペプチドが必要とされている。異なる成熟配列（ＴＥＭペニシリナーゼおよび黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ　）ヌクレアーゼＡ）は大腸菌中の同一の異種シグナル（ＯｍｐＡ）およびその変異体で非常に異なって機能することを示したシンハードおよびその同僚の作業により、このことは決定的に示唆されている（レンツ１− ド、Ｓｏ、ポリット、Ｓ、およびイノウニ、Ｍ、（１９ｇ？）Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６２：１７１６−１７１９）　、さらに、ブリートリングおよびその同僚は、スタフィロキナーゼおよび枯草菌アルファアミラーゼ分泌ベクターを用いて、枯草菌中にヒトインターフェロンアルファ１の分泌について同様な観察を行なっている（ブリートリング、Ｒｏ、ジャーラック、Ｄ９、ハートマン、Ｍ、およびベーンク、Ｄ、　（１９８９）ｉｄｏｌ、　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、　２１７：３８４−３９１）　。上述した観察にもかかわらず、供与体遺伝子と標的成熟遺伝子との間の融合接合を系統的に変化させることにより、異種分泌を能率的に行なう試みはなされていない。

実　験以下の実施例は全て、枯草菌内におけるシュードモナス　メンドシナＡＴＣＣ５３５５２リパーゼ（クチナーゼ）の発現に関するものであるが、それらの実施例は本発明を説明することを意図したものであり、本発明の範囲を制限するものとして考えるべきではない。

この実施例において、ここに引用した米国特許第４．９３３．２８７号に記載されているシュードモナス　メンドシナ　リパーゼ（クチナーゼ）の枯草菌内の発現を、シグナル配列の最後の残基（Ａｌａ−１）からａｐｒＥプロ配列（ｐｒｏｓｅｑｕｅｎｃｅ　）の９番目の残基（Ｋ９）までの枯草菌ａｐｒＥと成熟リパーゼ遺伝子との融合により行なう。さらに、位置１１１およびに２７でも融合物が得られた。

専門語：この実施例において、ここに引用する、１９８６年１１月１９日に出願された米国特許出願第９３２．９５０号に記載されたシュードモナス　メンドシナ　リパーゼ（クチナーゼ）についての全長成熟遺伝子が、枯草菌ａｐｒＥプロモーター／シグナル／プロ配列内のいくつかの位置に枠内で融合されている。ａｐｒＥ、シグナル／プロ配列接合は、コドン２９（Ａｌａ）と３０（Ａｌａ）との間で生じる。成熟リパーゼ（クチナーゼ）のａｐｒＥコドン２９への融合はｐＡＫ−Ａ　（−１）と呼ばれており、これは、リパーゼ（クチナーゼ）がシグナルペプチドの最後の残基に融合されたことを示している。同様に、成熟リパーゼ（クチナーゼ）のａｐｒＥコドン３０への融合はｐＡＫ−Ａｔと呼ばれており、これは、リパーゼ（クチナーゼ）がプロ配列の最初の残基に融合されたことを示している。

ａｐｒＥとリパーゼ（クチナーゼ）との融合の構築以下の合成プライマーを突然変異誘発に用いた：１Ａ、５°　ＧＣＡＧＧＣＴＧＣＡにＧＡＡＡＡＡＧＣＡ　３　’　配ダ１番号　ＩＢ、５響　ＣＣＡＣＴＧＴＣＧＣＴにＣＡＧＧＡＡＡＡＧＣＴＣＣＣＣＴＧＣコ１　配列番号　２２、　５’　ＧＧＣＴＧＣＣＧＧｋＧＣＴＣＣＣＣＴＣ：Ｃ３’　１７１１１号：　３３、　５’　ＧＣＡＣＧＣＴＧＣＣＧＣＴＣＣＣＣＴにＣ３’　配列番号、４４、　５’　ＴＧＣＣＣＡＧＧＣＴにＣＴＣＣＣＣＴＧＣ３’　配列番号：５６Ａ、５’　ＣＴＧＣＣＣＧＭＡＧＡＧＣ′ＴＣＴＡＣＡＧＡＡＡＡＧ　コ’　配列３１ｑ、５Ｂ、５′　↑ＧＴＣＧＣＧＧＣＣ，ＧＡＧＣＴＣＴｋＣ入ＧｋｋＡＡＧｋＡＡＧＣＴＣＣＣＣＴＧＣ３’　配列番号・７７Ａ、５’　ＧＴＧＣＣＡＴＧＡＧＣＴＣＣＧＣＣＡＡＧＡ　３’　配列番号ヨ８Ｂ、５’　ＴＧＴＣＧＣＧＧＣＧＧＡＧＣＴＣＣＧＣＣＡＡＧＡＡＡＡＡＧＧＣＴＣＣＣＣＴＧＣ３’　配列番号、９８Ａ、５・　ＧＧＴＧＴＡＴＣＣＧＧＣＡＧＧＧＣ；ＡＧＣにＣＴＴＴＴＴＣＣ（１；にＣＡＧＣＣＴＧＣＧＣ３’　配列番号：１０Ｂ、５’　ＧＣＧＣｋＧＧＣＴＧＣＣＧＧＡＡＡＡＡ（、ＣαゴＣＣＣＣＴＧＣＣＧＧＡＴＡＣＡＣＣ３’　配列番号・１１９Ａ、５’　ＧＧＴＧＴＡＴＣＣＧＧＣＡＧＧＧＧＡＧＣＡＣＴＧＣＴＴＴＴＴＣＣＧＧＣＡＧＣＣＴＧ　３’　配Ｆ１１番号、１２Ｂ、５’　ＣＡＧにＣＴＧＣＣＧＧＡＡＡＡＡＧＣＡＧＴＧＣＴＣＣＣＣＴＧＣＣにＧＡＴＡＣＡＣＣ３’　配列番号°１３１０Ａ、５’　ＣＧＴＧＴＡＴＣＣＧＧＣＡＧＧＧＧＡＧＣＴＧＴＡＣＴＧｅＣＣＧＧＣＡＧＣ３’　配列番号　１４Ｂ、５’　ＧＣＴＧＣＣＧＧＡＡＡＡＡＧＣＡＧＴＡＣＡＧＣＴＣＣＣＣＴＧＣＣＧＧＡＴＡＣＡＣＣ３’ 　配列番号：１５１１Ａ、５’　ＧＧＴＧＴＡＴＣＣＧＧＣＡＧＧ（１，ＧＡＧｃｃＴＴＩ”ｒＣＴＧＴＡｃＴＧｃＴＴＴＴＴｃｃ　３’　配列番号・１６Ｂ、５’　ＧＧＡＡＡＡＡＧＣＡＧＴＡＣＡＧＡＡＡＡＧＧＣＴＣＣＣＣＴにＣＣＧＧＡＴＡＣＡＣＣ３’　配ｌす番号：１７１２八、５’　ＧにＴＧＴＡＴＣＣＧＧＣＡＧＧＧＧＡＧＣＡＡＴＧＴＡＴＴＴＣＴＴＴＴＣＴＧＴＡＣＴ　コ１　配列番号゛１８Ｂ・　５’　ＡＧＴＡＣＡＧＡＡＡＡＧＡＡＡＴＡＣＡＴＴＧＣＴＣＣＣＣＴＧＣＣにＧＡＴＡＣＡＣＣ〕・　配列番号・１９Ｄ、５’　ＡＡＧＣＣＴＡＴにＡＡＴｒＣＣＴＣＣＡＴＴＴｒＣＴＴＣＴ　コ１　配列番号＝２０１４、　５’　ＴＴＣＣＣＧＣＣＣＧＧＴＡＣＣＧＧＣＡＴＴＧＧ　１’　配列番号工２２１５Ａ、５’　ＧＧＴにＴＡＴＣＣＧにＣＡＧＧ（１；ＧＡＧＣＴＴＣＴＣ；ＴＡＣＴＧＣＴＴＴＴＴＣＣＧＧＣ１’　ＦＪ１番号′２３Ｂ・　５’　ＧＣＣ（、ＣＡＡＡＡＡＧＣＪＸＩ：ＴＡＣＡＧＡＡＧＣＴＣＣＣＣＴＧＣＣＧＧＡＴＡＣＡＣＣ：ｌｌ　配列番号−２４リパーゼ（クチナーゼ）遺伝子（全てを引用する米国特許第４．９３３．２８７号および同第５．０３０．２４０号並びに米国特許出願第６２９．３０８号に記載されたような）を、ＨｉｎｄｌＩＩ　５ｐｈＩ断片としてのＭ１３プラスミド中にクローニングした（Ｍ１３１ｉｐ）；−重鎖合成プライマーＩＢ（配列番号２）を用いて、位置指定突然変異誘発（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｇ　）　（Ｔ、　Ａ、クンケル、ＰＮＡＳ（１９８５）、８２巻、４８８−４９２頁）によりＰｓｔ１部位および３つのコドン（ＡＳＧ。

Ｋ）を成熟暗号配列の最初の部分に導入した。ｐｓ１６８からのａｐｒＥ遺伝子（Ｍ、　Ｌ、スタール等、Ｊ、　Ｂａｃｔ、（１９８４）、１５８巻、４１１− ４１８頁）をＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄｌｌＩ断片としての別のＭ１３プラスミド中にクローニングしくＭ１３ａｐｒ）、同様の技術を用いて一本積合成プライマーＩＡ（配列番号１）によりコドン位置Ａｌａｌ　（シグナル配列切断部位の後の最初のアミノ酸）に導入した。

ＤＮＡ断片をクローニングする方法は、サムプルツク等の１ｌｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　。

ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ（１９８９）　１．５３−１．７３頁および４．３−４．５１頁に記載されている。

ａｐｒＥのＥｃｏＲＩ−Ｐｓ　ｔ　Ｉ断片およびリパーゼのＰｓｔｌ−８ｐｈＩ断片をＭ１３プラスミドから単離し、ＥｃｏＲＩ　５ｐｈＩにより切断したｐＪＭ１０２中にクローニングしくＥ、フェラリ等、Ｊ、　Ｂａｃｔ、（１９８３）１５４巻、１５１３−１５１５頁）　、ｐＡｐ　ｒ−ｃｕ　ｔ−１を産生じた。

強い転写ターミネータ−を導入するために、ｐＡｐｒ−ｃｕｔ−１からのａｐｒＥ−リパーゼ融合物を、バシラス　アミロリケフアシエンス　サブチリシン転写ターミネータ−（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓｉｎ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）を含有するように構築されたｐＪＨｌｏｌ　（Ｅ、フエラリ等、Ｊ、　Ｂａｃｔ、　１５４巻、１５１３−１５１５頁）中にクローニングした（ウェルズ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ　ＡｃｉｄＲｅｓｅａｒｃｈ（１９ｇ３）　、１１巻、７９１１− ７９２５頁、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片（ｐＪＨｌｏｌ−ｔｅｒｍ）について）。リパーゼ遺伝子の５′末端、シグナル配列およびａｐｒＥプｏ−ｔ−一ターを含有するＥｃｏＲＩ−ＰｖｕｌＩ　ＤＮＡ断片、並びにリパーゼ遺伝子の３′末端を含有するＰｖｕｌｌ−Ａｖａｌ　ＤＮＡ断片をｐＡｐ　ｒ　−ｃｕｔ −１から単離した。Ｐｖｕｌｌによる切断の前に、Ｔ４ポリメラーゼにより、リパーゼ遺伝子のＰｖｕｌｌ−Ａｖａｌ断片のＡｖａＩ　５’懸垂（ｏｖｅｒｈａｎｇ）をフィルイン（ｆｉｌｌ　ｉｎ　）　した（サムプルツク等、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　、　Ｌａｂｏｌａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　ｓ前出）。プラスミドｐＪＨ１０１−ｔｅｒｍ　（ターミネータ−を有する）をＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩ　Ｉにより切断し、Ｅ　ｃ　ｏ　ＲＩ　ｌ：よる切断の前に、Ｔ４ポリメラーゼによりＨｉｎｄｌｌＩ　５’懸垂もまたフィルインした。ＥｃｏＲＩ−Ｐｖｕ　Ｉ　Ｔ断片、ＰｖｕＩＩ−Ａｖａｌ断片およびＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄｌＩＩ切断ベクターを連結してｐＡＫ−に３を産生じた。

融合物Ｇ２、Ａ１およびＡ（−１）の構築：ｐＡＫ−に３からのＥｃｏＲＩ−Ａｓｐ７１８　ＤＮＡ断片をＭ１３プラスミド中にクローニングした。ａｐｒＥのプロ配列の３番目のアミノ酸であるＫ（Ｋ３）；ａｐｒＥのプロ配列の２番目と３番目のアミノ酸であるＧおよびＫ（Ｇ２−に３）；ａｐｒＥのプロ配列の１番目と２番目と３番目のアミノ酸であるＡｌＧおよびＫ（Ａ１−６２−に３）；をコード化するコドンを、それぞれ−重鎖合成プライマー２．３および４（配列番号はそれぞれ３．４および５）を用いて位置指定突然変異誘発により欠失させた。欠失部を含むＭ１３プラスミドからのＥｃｏＲＩ−Ａｓｐ７１８断片を、ＥｃｏＲＩ−Ａｓｐ７１８切断ｐＡＫ−に３ベクター中にクローニングし、それぞれｐＡＫ−Ｇ２、ｐＡＫ−ＡｔおよびｐＡＫ−Ａ　（−１）を構築した。

融合物に９の構築リパーゼ（クチナーゼ）遺伝子をＨｉｎｄｌｌ　ｌ−８ａｃｌ断片（Ｍ１３１ｉｐ）としてのＭ１３プラスミド中にクローニングした。突然誘発変異方法によりプラスミド６Ｂ（配列番号７）を用いて、成熟リパーゼ遺伝子の前に、５つのコドン（ＳＳＴ、Ｅ、ＫＳＫ）および５ａｃｌ部位を導入した。ｐｓｔｓｓ−ｔからのａｐｒＥ遺伝子（Ｍ、Ｌ、スタール等、Ｊ、　Ｂａｃｔ、（１９８４）、１５８巻、４１１−４１１＋頁）をＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎｄｌｌ　Ｉ断片としてのＭ１３プラスミド（Ｍ１３ａｐｒ）中にクローニングした。突然変異誘発方法によりオリゴヌクレオチドプライマー６Ａ（配列番号６）を用いて、５ａｃｌ部位をａｐｒＥプロ配列のコドン３−５　（Ｋ３−３４−３５）内に導入した。

得られたａｐｒＥ遺伝子のＥｃｏＲＩ−３ａｃｌ断片およびり／々−ゼ（クチナーゼ）の５ａｃｌ−Ａｓｐ７１８断片をＭ１３プラスミドから単離し、ＥｃｏＲＩ−Ａｓｐ７１８切断ｐＡＫ−に３ベクター中にクローニングした。得られたプラスミド（ＡＫ−に９）は、ａｐｒＥ遺伝子のプロ配列内の９番目のアミノ酸（Ｋ９）に融合された成熟リパーゼ（クチナーゼ）遺伝子を有している。

融合物に２７の構築に９融合物について上述したのと同一のＭ１３プラスミドを用いて、同様な方法によりこの融合物を作成した。−重鎖合成プライマー７Ａ（配列番号８）を用いて、５ａｃｌ部位をａｐｒＥのプロ配列の２２番目のコドン（Ｓ　２２）に導入した。−重鎖合成プライマー７Ｂ（配列番号９）を用いて、５つのコドン（Ｓ。

ＡＳＫ、ＫＳＫ）および５ａｃｌ部位を成熟リパーゼ遺伝子の前に導入した。

得られたＥｃｏＲＩ−８ａｃｌ断片およびリパーゼ（クチナーゼ）の５ａｃｌ− Ａｓｐ７１８断片をＭ１３プラスミドから単離し、ＥｃｏＲＩ−Ａｓｐ７１８切断ｐＡＫ−に３ベクター中にクローニングした。得られたプラスミド（ＡＫ−に２７）は、ａｐｒＥ遺伝子のプロ配列内の２７番目のアミノ酸（Ｋ２７）に融合された成熟リパーゼ（クチナーゼ）遺伝子を有している。

融合物Ｓ４、Ｇ５、Ｔ６、Ｅ７、Ｋ８およびＩｌｌの構築これらの構成は融合ＰＣＲ法により行なった（Ｒ，Ｍ、ホートン等（１９８９）Ｇｅｎｅ７７巻、６１ −６８頁）。各々のプライ？−５０ｐｍｏｌおよび２．５１ニツトのＴａｑポリメラーゼ（パーキンエルマー／セタス）を含有している１００　ｕ　ｌのＰＣＲ緩衝液（パーキンエルマー／セタス）中でポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行なった。反応混合物を鉱物油で覆い、蒸発を防いだ。温度プログラムは、９５℃ で１０分間、５０℃で１分間、７０℃で１分間を１サイクル；９５℃で１分間、５０℃で１分間、７０℃で１分間を２８サイクル；９５℃で１０分間、５０℃で１分間、７０℃で１５分間を１サイクルから構成されるものであった。２０ｂｐの下流リパーゼ（クチナーゼ）遺伝子配列の後に２１ｂｐの上流ａｐｒＥ遺伝子配列を有する、融合接合をコード化する２つの相補的な二本鎖合成りＮＡ鎖を各々の構築物のために合成した。陰性鎖（ｐｏｓｉｔｉｖｅ　５ｔｒａｎｄ　）をコード化する一本積合成プライマーであるプライマー１３（配列番号２０）は、ａｐｒＥプロモーターに対して相補的であり、ＥｃｏＲ１部位を有している。陰性鎖（ｎｅｇａｔｉｖｅ　５ｔｒａｎｄ　）をコード化する一本積合成プライマーであるプライマー１４（配列番号２１）は、リパーゼ（クチナーゼ）遺伝子に対して相補的であり、Ａｓｐ７１８部位を有している。プライマー１３（配列番号２０）および１４（配列番号２１）を全ての構築物に用いた。

一連の３つのＰＣＲ反応を以下のように行なった。プライマー１３（配列番号２０）および融合接合の陰性鎖をコード化する一本積合成プライマーを用いて、プロモーターと融合点との間のＤＮＡを増幅した（Ａ）；テンプレートは、ｐＳ１６８−１からのＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉ断片であり、成熟遺伝子の５′ 、ａｐｒＥプロモーター、シグナル配列およびプロ配列を有していた（反応１）。

プライマー１４（配列番号２１）および融合接合の陰性鎖をコード化する一本積合成プライマーを用いて、融合点と成熟リパーゼ遺伝子との間のＤＮＡを増幅した（Ｂ）；テンプレートは、プラスミドｐＡＫ−に３の標準ＤＮＡミニスクリーン（＋＋＋１ｎｉｓｃｒｅｅｎ）の１：１００の希釈物であった（反応２）。反応１および２各々のｌｕｌを用いて、プライマー１３（配列番号２０）および１４（配列番号２１）を使用した増幅による反応２からのＤＮＡ断片に反応１からのＤＮＡ断片を融合させた（反応３）。３０のサイクル後、増幅したＤＮＡの半分をフェノールとクロロホルムによる抽出を行なって洗浄し、その後、製造者の説明書にしたがって回転カラム精製（ｓｐｉｎ−ｃｏｌｕｍｎ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）　（ワーシントンミニスピン）を行なった。ＥｃｏＲＩ−Ａｓｐ７１Ｂ断片を、増幅したＤＮＡから単離し、Ｈ１３−ｍｐ１９　ＥｃｏＲＩ−Ａｓｐ７１８切断ベクター中にクローニングした。配列確認後（サンガー等、１９７７）　、ＥｃｏＲＩ−Ａｓｐ７１８断片を、ＥｃｏＲＩ−Ａａｐ７１８切断ｐＡＫ−に３ベクター中にクローニングした。

Ｇ４、Ｇ５、Ｔ６、Ｋ８．１１１およびＥ７の構築に用いた融合プライマーのＡおよびＢ対は、それぞれ８Ａ＆Ｂ、９Ａ＆Ｂ、１０Ａ＆Ｂ、１１Ａ＆Ｂ、１２Ａ＆Ｂおよび１５Ａ＆Ｂの番号であった（それぞれ、配列番号１０−１９および２２並びに２３）。

枯草菌中への形質転換異なる融合物を含有するプラスミドを枯草菌中に形質転換しくアナグネストポロス、Ｃ，、Ｊ、　Ｂａｃｔ、（１９６１）　８１ニア４１−７４６　）　、キャンベル型の機構によりａｐｒＥ座内の染色体に特異的に組み込んだ（ヤング、Ｍ、　、Ｊ、　Ｇｅｎ、　１１ｉｃｒｏｂｉｏ１．（１９８４）　１３０・１６１３−１６２１）。バシラス属菌株（Ｂ　Ｂ　８）は、５つのプロテアーゼ、およびｅｓｔＢ（デルタａｐｒ、デルタｎｐｒ、デルタｂｐＦ、デルタｅｐｒ、１ｓｐ−１、デルタ６　ｓ　ｔ　Ｂ）が欠失した１１６８の誘導体であった。スタール、Ｍ。

Ｌ、　、Ｊ、　Ｂａｃｔ、（１９８４）　１５ｇ＋４１１−４１８に記載されている方法を用いて、表示した遺伝子が欠失したものを導入した。融合遺伝子による形質転換後、形質転換またはＰＢＳ−１媒介形質導入のいずれかにより（ホッチ、Ｊ、　Ａ、　、バラッド、Ｍ。

およびアナグノストポロス、Ｃ，、Ｊ、　Ｂａｃｔ、　（１９８３）　１５４：１５１３−１５１５）　、ｓ　ａ　ｃ　Ｕ（Ｈｙ）（ヘンナ−１Ｄ、Ｊ、、フエラリ、Ｅｏ、ペレゴ、Ｍ、およびホツチ、Ｊ、　Ａ、　、Ｊ、　Ｂａｃｔ、（１９８８）　１７０：２９６−３００）突然変異を導入し、異なる融合物を担持する異なる最終的な枯草菌株を産生じた。

ａ　ｒＥ／リパーゼ融合菌株の培養および評価以下の検定を用いて、培養上澄中のリパーゼ（クチナーゼ）の産生について、最終的な枯草菌株を検定した。

検定：シュードモナス　メンドシナ　リパーゼ（クチナーゼ）を、ｐＨ７，０の０．２Ｍヘペス緩衝液（Ｈｅｐｅｓ　ｂｕｆｆｅｒ）中で１ｍＭのｐ−ニトロフェニルブチレートにより検定する。活性は、１ｍｌの反応容量中の１分当たりで１０ｕｌの試料当たりの４１０ｎｍでの吸収における変化として表す。１ユニット＝１ｍｌの反応容量中の１分当たりで１０ｕｌの試料当たりの４１０ｎｍでのＩＡＵの変化。結果を、０．０６０（ｍｇ／ｍｌ）／ユニットの特異的活性に基づいてｍｇ／ｍｌに添加した。

パシラス属の菌株を３７℃で振とうさせながら培地Ａ中で一晩成長させ、５％を培地Ｂに接種し、上記検定を用いてリパーゼ（クチナーゼ）の産生を検定した。

培地ＡおよびＢを表■に記載する。最初の線形産生間隔を上回る産生速度に基づいて菌株を評価しく第２図）、ｍｇ／ｍｌ／時間で表した。

表　Ｉ培地Ａペンアッセイブイヨン（Ｐｅｎａｓｓａｙ　ｂｒｏｔｈ）　（ディフコ）培地Ｂ栄養物ブイヨン（ディフコ）０，８％ＣａＣ１ｚ　１ｍＭＦ　ｅ　Ｓ　Ｏａ　０．００１　ｍＭＭｎ　Ｃ１２０，０１ｍＭＫＣｌ　０．１％ＭｇＳＯ４０，０２５％マルトデキストリン（ＣＰＣＭ１５０）　０．１％第３図に示したように、異なる融合物が、著しく異なる発現レベルで産生された。相対的な生産速度は５倍（Ｋ３／８４）までの範囲におよび、最良のもの（Ｋ３）は、単純直接シグナル配列接合連結（ｓｉｍｐｌｅ　ｄｉｒｅｃｔ　ｓｉｇｎａｌ　５ｅｑｕｅｎｃｅｊｕｎｃｔｉｏｎ　ｈｏｏｋｕｐ　）　（Ａ−１）より５倍多く産生された。

口Ｇ、　１ＦＩＧ、　４Ａ口Ｇ、　４Ｂ特表平７−５０５２９２　（７）ＦＩＧ、　５国際調査報告　。ｒＴ／ｌｌｅ　Ｑｊ／ｌｌ、ｌｌ１６フロントページの続き（５１）　Ｉｎｔ、　ｃｔ、　６　識別記号　庁内整理番号Ｃ１２Ｒ１：１２５）（Ｃ１２Ｎ　１／２１Ｃ１２Ｒ１：１２５）（７２）発明者　ヴアン　キメナーデ、ヨハナ　エム　ニーアメリカ合衆国　カリフォルニア州９４０６６　サンプルーツ　リンデン　アヴ工ニュ−５２７Ｉ（７２）発明者　カーロマグノ、ルーアン　ピーアメリカ合衆国　カリフォルニア州９５４７６　ソノマ　クレーブ　アヴエニュ−

Claims

【特許請求の範囲】

１．バシラス属徴生物内でグラム陰性リパーゼを発現させる方法であって、ａ）各々のプラスミドがバシラス属のプロ配列の１番目から９番目までのアミノ酸のうちの１つに対応するコドンに成熟リパーゼのＮ末端に相当する遺伝子を融合してなる複数のプラスミドを構築し、前記バシラス属のプロ配列がそれ自身のシグナル配列に結合しており、ｂ）適切な条件下でバシラス属宿主微生物を前記工程ａ）で得られたプラスミドにより形質転換して該プラスミドを前記バシラス属宿主徴生物の染色体に組み込み、ｃ）必要に応じて、該バシラス属宿主徴生物中に分泌過多突然変異を導入し、ｄ）前記工程ｂ）または工程ｃ）で得られた形質転換体を前記リパーゼの発現の有無について検定する、各工程からなることを特徴とする方法。
２．前記バシラス属宿主微生物が枯草菌であることを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。
３．前記バシラス属のプロ配列およびシグナル配列が、枯草菌ａｐｒＥプロ配列およびシグナル配列であることを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。
４．前記成熟リパーゼ遺伝子がシュードモナス属の微生物由来のものであることを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。
５．前記成熟リパーゼ遺伝子がシュードモナスメンドシナ、ＡＴＣＣ５３５５２由来のものであることを特徴とする請求の範囲第４項記載の方法。
６．枯草菌ａｐｒＥプロモーターの使用を含むことを特徴とする請求の範囲第３項記載の方法。
７．前記工程ａ）で得られるプラスミドが、枯草菌ａｐｒＥのプロ配列の３番目のアミノ酸に対応するコドンに各自のＮ末端で融合する成熟シュードモナスメンドシナリパーゼ遺伝子を含み、前記枯草菌ａｐｒＥのプロ配列が枯草菌ａｐｒＥシグナル配列に結合していることを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。
８．前記工程ａ）で得られるプラスミドが、枯草菌ａｐｒＥのプロ配列の６番目のアミノ酸に対応するコドンに各自のＮ宋端で融合する成熟シュードモナスメンドシナリパーゼ遺伝子を含み、前記枯草菌ａｐｒＥのプロ配列が枯草菌ａｐｒＥシグナル配列に結合していることを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。
９．前記バシラス属宿主徴生物内に導入された分泌過多突然変異がＳａｃＵ（Ｈｙ）突然変異であることを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。
１０．グラム陰性リパーゼをコード化する異種ＤＮＡを含む形質転換バシラス属細胞であって、前記異種ＤＮＡがその５′末端でバシラス属のプロ配列の１番目から９番目までのアミノ酸のうちの１つに対応するコドンに融合し、前記バシラス属のプロ配列がそれ自身のシグナル配列に結合していることを特徴とする形質転換バシラス属細胞。
１１．枯草菌であることを特徴とする請求の範囲第１０項記載の形質転換バシラス属細胞。
１２．前記グラム陰性リパーゼがシュードモナスリパーゼであることを特徴とする請求の範囲第１０項記載の形質転換バシラス属細胞。
１３．５′末端で枯草菌ａｐｒＥのプロ配列の１番目から９番目までのアミノ酸のうちの１つに対応するコドンに融合するシュードモナスメンドシナリパーゼをコード化する異種ＤＮＡを含み、前記枯草菌ａｐｒＥのプロ配列がそれ自身のシグナル配列に結合していることを特徴とする請求の範囲第１０項記載の形質転換枯草菌属細胞。
１４．前記シュードモナスメンドシナリパーゼをコード化する異種ＤＮＡが前記枯草菌ａｐｒＥプロ配列の３番目のアミノ酸に対応するコドンに融合していることを特徴とする請求の範囲第１３項記載の形質転換枯草菌属細胞。
１５．前記シュードモナスメンドシナリパーゼをコード化する異種ＤＮＡが前記枯草菌ａｐｒＥプロ配列の６番目のアミノ酸に対応するコドンに融合していることを特徴とする請求の範囲第１３項記載の形質転換枯草菌属細胞。
１６．Ｎ末端で枯草菌ａｐｒＥプロ配列の１番目から９番目までのアミノ酸のうちの１つに対応するコドンに融合する成熟シュードモナスメンドシナリパーゼ遺伝子を含む組換えＤＮＡ構築物。
１７．請求の範囲第１６項記載の組換えＤＮＡ構築を含むプラスミド。
１８．Ｎ末端で枯草菌ａｐｒＥプロ配列の３番目のアミノ酸に対応するコドンに融合してい成熟シュードモナスメンドシナリパーゼ遺伝子を含む組換えＤＮＡ構築物。
１９．請求の範囲第１８項記載の組換えＤＮＡ構築物を含むプラスミド。
２０．Ｎ未端で枯草菌ａｐｒＥプロ配列の６番目のアミノ酸に対応するコドンに融合している成熟シュードモナスメンドナリパーゼ遺伝子含む組換えＤＮＡ構築物。
２１．請求の範囲第２０項記載の組換えＤＮＡ構築物を含むプラスミド。