JPH0829091B2 - ハイブリッドｐｍａ配列の製造方法及び該方法に使用するベクター - Google Patents

ハイブリッドｐｍａ配列の製造方法及び該方法に使用するベクター

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JPH0829091B2 JP61157163A JP15716386A JPH0829091B2 JP H0829091 B2 JPH0829091 B2 JP H0829091B2 JP 61157163 A JP61157163 A JP 61157163A JP 15716386 A JP15716386 A JP 15716386A JP H0829091 B2 JPH0829091 B2 JP H0829091B2
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Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はハイブリッド酵素とその合成プロセスについ
て示したものである。特に、本発明は、新しいポリペプ
チド配列と新しい物理的性質を有するハイブリッド酵素
を発現することができるハイブリッドDNA配列を製造す
る方法を提供する。
〔従来の技術〕
組み換えDNA技術の分野における進歩は種々の天然DNA
配列のクローニングとその基礎となる組み換えDNAの発
現によって生物学的に活性のある組み換えポリペプチド
を生成させてきている。例えば、ヒトの成長ホルモンは
大腸菌（E.coli）中で、大腸菌（E.coli）のプロモータ
ーに、このタンパク質のコード配列を融合することによ
り生成されている（１）。第２の例としては、組織プラ
スミノーゲン活性因子、その他の微量ヒトタンパク質も
大腸菌（E.coli）中で作られている（２）。
ある組み換えポリペプチドの変異は、その変異ポリペ
プチドの性質を研究する目的で作られている。このた
め、天然DNA配列がクローニングされ、例えば米国特許N
o.4,518,584に公開されているような部位特異的突然変
異によって、天然のポリペプチドのアミノ酸残基の欠
失、置換を起こすべく変異されて、天然の組み換えポリ
ペプチドの物理的性質を変化させている。
また、組み換えポリペプチドは組み換えDNA配列を融
合させることにより変異されている。例えば、プラスミ
ド誘導のベータ・ラクタマーゼのシグナル配列は、プロ
インシュリンの分泌をうながすために、共通の制限部位
を通じて、プロインシュリンのアミノ末端に付けられ
た。（３） ワイズマン（Weissman）により述べられているよう
に、２つの異なるヒトのアルファ・インターフェロンDN
A配列が共通の制限部位によって結合され、アルファ−
１インターフェロンとアルファ−２インターフェロンか
らの配列を含むDNA配列がつくられている（４）。しか
し、このような融合アルファ・インターフェロンDNA配
列によって発現したアルファ・インターフェロンは限ら
れた生物学的活性しか示さなかった。
１ケ所の制限部位か、橋かけ合成オリゴヌクレオチド
によって１ケ所以上の制限部位でその基礎となるDNAを
結合するか、全部変異したDNA配列を作るために合成オ
リゴヌクレオチドを結合することによって変異ポリペプ
チドを生成させることへの最大の制限は、特別の変異組
み換えポリペプチドを生成するためには、莫大な働力が
必要となることである。たとえば、そのような変異には
DNAやポリペプチドの配列を知る必要があり、もしその
データが入手できない場合は、それを決定しなければな
らない。さらに、そのような配列がたとえわかっていて
も、変異ポリペプチドの生成の仕事は複雑で、生物学的
に不活性な分子を生じてしまうかもしれない。
ウェバー（Weber）等（５）は、アルファ−１とアル
ファ−２のヒト・インターフェロン配列をコードするDN
A間での生体内組み換えによって、変異遺伝子を作る方
法を公開した。５′側にアルファ−２インターフェロン
遺伝子、３′側にアルファ−１インターフェロン遺伝子
の一部をもつプラスミドベクターを含む線状DNA配列を
大腸菌（E.coli）のレック・Ａプラス（recA+）株にト
ランスフェクトした。
部分的に相同的なインターフェロン遺伝子配列の間で
の生体内組み換えによる、その線状プラスミドの環状化
は、アルファ−１とアルファ−２のインターフェロン遺
伝子配列の種々の部分を含む、いくつかの変異インター
フェロン遺伝子を生成した。それらの変異アルファイン
ターフェロン遺伝子のいくつかは未変異アルファ−２イ
ンターフェロンと同様な生物学的活性を有する変異アル
ファ・インターフェロンを発現したとウェバー（Webe
r）は報告している。
ウェバー（Weber）（５）が公開しているように、線
状プラスミドの生体内環状化（組み換え）による変異遺
伝子及びポリペプチドの生成効率は、環状プラスミドに
比べ、線状プラスミドは微生物へのトランスフェクトの
効率が低いことにより制限されている。さらに、２つの
異なるが関連している遺伝子は、そのような線状プラス
ミド配列上で複製可能なプラスミド配列によって常に分
離されている。環状化は、その２つの遺伝子を含むベク
ターの端が、２つの遺伝子が互いに近く接するようにオ
ーバラップすることを要求する。それゆえ、組み換えの
効率はそのようなプラスミド構造の線型によって制限さ
れることになる。
従って、ここでは、複製可能なDNA配列と少なくとも
２つの異なる親ポリペプチドをコードするDNA配列を含
む環状ベクター、そして上記の複製可能なDNA配列と各
親ポリペプチドの１部分に対応するハイブリッドポリペ
プチドをコードするハイブリッドDNA配列を含んでいる
組み換え環状ベクターを提供することを目的としてい
る。
また、本発明の目的は、そのような組み換え環状ベク
ターやハイブリッドポリペプチドを作るための効率的方
法を提供することである。
さらに、本発明の目的は、そのような組み換え環状ベ
クターを単離するための付加的方法を提供することであ
る。
さらに本発明の目的は、少なくとも２つの親ポリペプ
チドからのポリペプチド配列のセグメントを含む生物学
的に活性ハイブリッド酵素を提供することである。
さらに、本発明の目的はハイブリッドアミラーゼやハ
イブリッドプロテアーゼのような生物学的に活性なハイ
ブリッド酵素を提供することである。
〔問題点を解決するための手段〕
複製可能なDNA配列と少なくとも２つの別々な親ポリ
ペプチドの全部か又は一部をコードした親DNA配列を含
む新しい環状ベクターを公開する。そのようなベクター
を上記の複製可能なDNA配列と（１）第１親ポリペプチ
ド配列の第１部分に対応するハイブリッド酵素のアミノ
末端部分をコードする第1DNA配列は、（２）第２親ポリ
ペプチド配列の第１部分に対応する上記ハイブリッド酵
素のカルボキシル末端部分をコードする第2DNA配列、を
含むハイブリッドDNA配列を含有する組み換え環状ベク
ターを作るために新しい方法中で使用する。
第１及び第２の親ポリペプチド配列の全て又は一部を
コードする第１及び第２の親DNA配列は複製可能なDNA配
列と結合され、上記の親DNA配列が互いに隣接するよう
に環状ベクターを形成する。レック・プラス（rec+）微
生物をそのように形成されたベクターで形質転換し、そ
こでレック・プラス微生物の自然組み換えメカニズムに
よって、上記の環状ベクターの少なくとも１つが交叉組
み換えをおこすような、多数の上記環状ベクターを含む
細胞集団を形成する。そのようなベクターの交叉組み換
えは上記の第１及び第２の親ポリペプチド配列の各第２
部分をコードする第3DNA配列を切り出し、上記複製可能
DNA配列及び、第１と第２の親ポリペプチド配列の各第
１部分をコードする上記のハイブリッドDNA配列を含有
する組み換え環状ベクターを形成する。そのような組み
換えベクターは新しいハイブリッド酵素を発現すること
ができるし、またそのような発現をさせる為にさらに変
異される。
種々の上記方法では上記の第3DNA配列中に含まれる１
ケ所切断制限部位を利用する。第3DNA配列の切り出しは
もはや１ケ所切断制限部位を含まない組み換え環状ベク
ターを作る。単離した環状ベクターと組み換え環状ベク
ターを、上記の１ケ所切断制限部位に対するエンドヌク
レアーゼで処理すると線状ベクターと環状組み換えベク
ターが生成する。その環状組み換えベクターは、それら
ベクターを微生物にさらし、組み換え環状ベクターをそ
の微生物に形質転換することによって線状ベクターから
単離される。
また、第2DNA配列の発現を阻止するDNA配列を第3DNA
配列が含むようなプロセスも公開している。そのような
配列は典型的には転写終止配列である。機能性プロモー
ター配列は上記の第1DNA配列と実施可能な形で結合して
いる。第3DNA配列がレック・プラス微生物によって切り
出されたとき、ハイブリッドポリペプチドは発現する。
そのような発現は組み換えベクターを含む形質転換体を
同定するのに使われる。
この後者の方法はさらに、上記の第2DNA配列の３′側
に第４のDNA配列を位置させることにより変異すること
ができる。この第4DNA配列は、テトラサイクリン耐性の
ような特定の選択特性をコードしており、上記の第3DNA
配列の切り出しの結果のような特定の選択特性を発現す
る組み換えベクターを含む形質転換体を単離するのに使
われる。
特定の生物学的活性を有する新しいハイブリッドポリ
ペプチドを環状ベクター中に含まれるDNA配列の相同的
交叉組み換えによって作ることができることを発明者は
示している。少なくとも２の異なるポリペプチドの全部
又は一部をコードする親DNA配列を複製可能なDNA配列と
結合して環状ベクターを形成する。親DNA配列は、上記
の配列が非常に近接するように並んで結合させてもよい
し、又種々の近接度をもつように環状ベクター内の種々
の位置に挿入させてもよい。そのような近接度の変化は
組み換えの効率を制御するのに有用であるし、組み換え
が起こるそのような親DNA配列中の領域に制限を与える
物理的抑制う負わせている。このように結合した環状ベ
クターで形質転換したレック・プラス微生物はその親DN
A配列間の配列相同的領域で交叉組み換えを起こすと信
じられている。組み換え環状ベクターは各親DNA配列の
種々の部分を含むハイブリッドDNA配列を含むように形
成された。相同性は交叉組み換えを起こすのに必要であ
るだけで、実際の交叉点が相同的な親DNA配列のそれら
の領域に必ずしも対応しているわけではない。これらの
ハイブリッドDNA配列は、各親ポリペプチドからの種々
のアミノ末端とカルボキシル末端を含む生物学的に活性
なポリペプチドをコードしていた。
ここで用いられているように、“ハイブリッドポリペ
プチド”とは少なくとも２つの親アミノ酸配列から引き
出された部分配列の組み合せであるアミノ酸配列を有す
る組み換えポリペプチドのことである。ここで公開され
ている種々の好ましい具体例のいくつかでは、ハイブリ
ッドポリペプチドは特にB.ステアロサーモフィラス（B.
Stearothermophilus）のアルファ・アミラーゼからの種
々の量のアミノ末端ペプチド配列と特にB.リチェニホル
ミス（B.licheniformis）のアルファ・アミラーゼから
のカルボキシル末端を含んでいる。また他の具体例は特
に枯草菌（B.subtilis）のアルカリ・プロテアーゼから
の種々の量のアミノ末端配列と、特にB.アミロリクエフ
ァシエンス（B.amyloliquefaciens）のアルカリ・プロ
テアーゼからのカルボキシル末端アミノ酸配列を含むハ
イブリッドポリペプチドを公開している。
これら特別な具体例は例として示されているもので、
本発明の範囲を制限するものではない。特に、ここで特
別に公開したもの以外のものからのアルファ・アミラー
ゼ又はアルカリ・プロテアーゼは、本発明を実施するの
に用いることができる。そのような親ポリペプチドに
は、たとえば、B.コアグランス（B.coagulans）（たと
えばATCC7050）、B.アミロリクエファシエンス（B.amyl
oliquefaciens）（たとえば、ATCC23842）、B.メガテリ
ウム（B.megaterium）（たとえば、ATCC6458）、B.アル
カロフィラム（B.alcalophilus）（たとえば、ATCC2159
1）、そしてB.セレアル（B.cereus）（たとえば、ATCC2
1768）から誘導されるアルファ・アミラーゼを含んでい
る。他のアルカリ・プロテアーゼの例には、B.リチェニ
ホルミス（B.licheniformis）（たとえば、ATCC2141
5）、B.アルカロフィラス（B.alcalophilus）（たとえ
ば、ATCC21522）及びB.セレアス（B.cereus）（たとえ
ば、ATCC21768）から誘導されるものを含む。
一般に、本発明はまた関連もしくは非関連のポリペプ
チドからのアミノ酸配列を結合することによってハイブ
リッドポリペプチドを生成するのにも使うことができ
る。関連するアミノ酸配列を含むハイブリッドポリペプ
チドは独特な物理的性質を示し、一方、非関連ポリペプ
チドのハイブリッドは二つの機能性を備えたハイブリッ
ドポリペプチドを作ることができる。親ポリペプチドを
選択する上での制限は機能だけである。各親ポリペプチ
ドをコードする、その基礎となるDNA配列は、生体内で
の組み換えを許すに十分な配列相同性を有さなくてはな
らない。
本発明に従って結合することができる種々の親ポリペ
プチドの例には、プラスミノーゲン活性化因子、成長ホ
ルモン、インターフェロン、リンフォトキシン、アスパ
チル・プロテアーゼ、B.サリンジエンシス（B.thuringi
ensis）のトキシン、セルロース及びクルコアミラーゼ
等が含まれる。
“ハイブリッドDNA配列”とは上記のハイブリッドポ
リペプチドをコードするDNA配列である。いくつかの公
開した具体例の中では、、そのようなハイブリッドDNA
配列はさらに、その基礎となるハイブリッドDNAによっ
てコードされるハイブリッドポリペプチドが発現できる
ように、上記ハイブリッドDNAに実施可能な状態で結合
した機能性プロモーターを含んでいる。そのようなプロ
モーターは親DNA配列の元のプロモーターでもよいし、
その分野に熟練した人に知られている源から誘導される
か、ハイブリッドポリペプチドがうまく発現できるよ
う、よく知られている方法により機能的に挿入されても
よい。いくつかの具体例の中では、プロモーターはハイ
ブリッドDNA配列を作るのに必要としない。プロモータ
ー配列は組み換えの後に、そのハイブリッドDNA配列が
発現できるようそのような組み換えベクター内に導入す
ることができる。
“親DNA配列”とは特別なポリペプチド配列の全部又
は一部をコードするDNA配列のことである。ここで公開
されているように、少なくとも２つの親DNA配列からの
第１部分がハイブリッドポリペプチドをコードするハイ
ブリッドDNAを形成するように生体内で組み換えられ
る。特別な具体例によっては、各親DNA配列の第２部分
は上記ハイブリッドDNA配列の形成の間に切り出され
る。
“レック・プラス微生物”とは、組み換え可能で、特
に本発明の環状ベクターの組み換えを媒介することがで
きる原核及び真核微生物の遺伝子型である。一般にその
ような微生物には、バチルス（Bacillus）、大腸菌（E.
coli）やエンテロバクテリアシアエ（Enterobacteriaci
ae）細菌のその他の種、シュードモナス（Pseudomona
s）、コリネバクテリア（Corynebacteria）、ラクトバ
シリ（Lactobacilli）、ストレプトマイセス（Streptom
yces）、アグロバクテリウム（Agrobacterium）のよう
な原核生物と、サッカロマイセス・セレビシアエ（Sach
aromyces cerevisiae）や他のイースト、アスペルギラ
ス（Aspergillus）や他の繊維状カビ、そして鳥類又は
ホ乳類由来の組織培養細胞の真核生物が含まれている。
本発明の環状ベクター及び組み換えベクターの一部を
形成する“複製可能なDNA配列”とは、生体内組み換え
を媒介するのに用いられる特別なレック・プラス微生物
に適合するベクター種から誘導された複製及び制御配列
のことである。通常そのような複製可能DNA配列配列は
形質転換した細胞中で発現型の選択を与えることが可能
なプロテインをコードする配列と同様な複製部位を有し
ている。例えば、レック・プラス大腸菌（E.coli）が生
体内組み換えのために選択されたときには、pBS42（1
7）（ATCC＃37279）、pBR322（25）（ATCC＃37017）、p
UCシリーズプラスミド（26）、及びRSF1010（44）から
引き出されるDNA配列が使用される。サッカロマイセス
（Sacharomyces）、アスペルギラス（Aspergillus）又
はホ乳類の組織培養細胞のようなレック・プラス真核生
物が使われるときには、複製可能DNA配列には、それぞ
れ、イースト２−μベクター（35）、アスペルギラス
（Aspergillus）組込みベクターp3SR2（36）及びSV40
（37）から引き出される。
ここで用いられているように、コード化したDNA配列
と実施可能な形で結合している機能性プロモーターと
は、コード化した配列の転写及び翻訳を制御するプロモ
ーターのことである。そのプロモーター配列は、発現の
ために選ばれた微生物中で機能的であるように選ばれ
る。たとえば、ラムダPL（38）から導入されたプロモー
ター配列は、trp（39）やtac（40）プロモーターと同様
に、大腸菌（E.coli）中でポリペプチドを発現すべく、
コード化配列と実施可能な形で結合している。枯草菌
（B.subtilis）が発現宿主である場合には、枯草菌（B.
subtilis）のアルカリ、プロテアーゼプロモーター（3
2）又はB.アミロリクエファシエンス（B.amyloliquefac
iens）（41）のアルファ・アミラーゼ・プロモーターが
使われる。イースト中での発現はS.セレビシアエ（S.ce
revisiae）のGAPDMに対するプロモーターの制御下にあ
り、一方、繊維状カビ中での発現は、アスペルギラス・
ニガー（Aspergillus niger）（43）からのＢ−グルコ
ジダーゼに対するプロモーターにより媒介される。SV40
（37）の初期のプロモーターがホ乳類細胞中での発現に
とって好ましい。
DNAの“消化”とはDNA中のある位置にのみ働く酵素
で、DNAを触媒的な切断のことである。そのような酵素
は制限酵素と呼ばれ、各々の特異的部位を制限部位と呼
ぶ。“部分”消化とは制限酵素による不完全消化のこと
で、すなわち、DNA基質中の、ある与えられた制限エン
ドヌクレアーゼに対する部位が完全には切断されないよ
うな条件が選択される。ここで使用れている種々の制限
酵素は市販されており、それらの反応状件、補因子、酵
素提供者により設定されている他の必要物が用いられ
る。一般に、プラスミドもしくはDNAフラグメント約１
マイクログラムが約１ユニットの酵素と約20マイクロリ
ットルの緩衝溶液とともに用いられる。特定の制限酵素
に対する適切な緩衝液と基質量は製造業者によって指定
されている。通常、37℃で約１時間のインキュベーショ
ン時間がつかわれているが供給者の指定に従って変化す
ることもある。インキュベーション後、タンパク質をフ
ェノールとクロロホルムで抽出することにより除き、消
化した核酸をエタノール沈殿によって水層から回収す
る。制限酵素による消化の後に、DNAフラグメントの二
つの制限切断末端が閉環ループを作って、制限部位への
他のDNAフラグメントの挿入を阻止することがないよう
に、末端５′リン酸をバクテリアル・アルカリ・ホスフ
ァターゼによって加水分解する。
制限消化物からDNAの所定のフラグメントの“回収”
又は“単離”は、その消化物のポリアクリルアミドゲル
電気泳動による分離、分子量既知のマーカーDNAフラグ
メントに対する泳動度の比較による目的フラグメントの
同定、望ましいフラグメントを含むゲル区分の切り出し
及び一般的には電気流出によるDNAのゲルからの分離を
意味する。（６、７） “連結”とは２つの二本鎖核酸フラグメント間でホス
ホジエステル結合を形成する過程をいう（８）。特に記
述がない場合は、連結は既知緩衝液をつかって、連結す
るDNAフラグメントとほぼ等モル量の、DNA0.5マイクロ
グラム当り、10ユニットのT4DNAリガーゼ（“リガー
ゼ”）という条件を行なう。
“形質転換”とは生体内にDNAを導入し、染色体外要
素として、もしくは染色体組み込み物として、そのDNA
が複製可能となることである。特に記述がない場合は大
腸菌（E.coli）の形質転換に対し、ここで使う方法はマ
ンデル（Mandel）（９）の塩化カルシウム法であり、バ
チルス（Bacillus）に対してはアナグノストポラス（An
agnostopolous）の方法である。
“オリゴヌクレオチド”とは短かい一本鎖又は二本鎖
ポリヌクレオチドのことでクレア（Crea）等の方法によ
って化学的に合成し（11）、さらにポリアクリルアミド
ゲルにより精製する。
形質転換体からのDNAの“調製”とは微生物培養物か
らプラスミドDNAを単離することである。特に記述がな
い場合は、アルカリ/SDS法が用いられる。（12） 次に掲げる特別な例は、本発明の範囲を制限するもの
ではなく、本発明の性格を十分に説明するためのもので
ある。
〔実施例〕
好ましい具体例の１つの中で、B.ステアロサーモフィ
ラス（B.Stearothermophilus）のアルファ・アミラーゼ
をコードする全DNA配列に実施可能な形で結合した、B.
ステアロサーモフィラス（B.Stearothermophilus）のア
ルファ・アミラーゼに対する本来のプロモーターを含む
B.ステアロサーモフィラス（B.Stearothermophilus）の
アルファ・アミラーゼのDNA配列をクローニングし、単
離した。B.リチェニホルミス（B.licheniformis）のア
ルファ・アミラーゼをコードするDNA配列も同様にクロ
ーン化した。
B.リチェニホルミス（B.licheniformis）のアルファ
・アミラーゼをコードする構造DNA配列の５′近傍のPst
I制限部位と、B.ステアロサーモフィラス（B.Stearothe
rmophilus）のアルファ・アミラーゼをコードする構造D
NA配列の３′近傍のPstI制限部位は、環状ベクター上に
おいて各親アミラーゼをコードするDNA配列を並んで連
結させるのに用いた。
アルファ・アミラーゼDNA配列間での相同交叉組み換
えはレック・プラス微生物により媒介され、B.リチェニ
ホルミス（B.licheniformis）とB.ステアロサーモフィ
ラス（B.Stearothermophilus）から誘導されるいくつか
のハイブリッドアミラーゼをコードするハイブリッドDN
A配列を形成した。
他の具体例においては、相同交叉組み換えを行なわな
いベクターはPstIの消化により線状化した。ハイブリッ
ド・アルファ・アミラーゼをコードしているハイブリッ
ドDNA配列を形成する組み換えられたベクターは、２つ
のアルファ・アミラーゼDNA配列を結合するのに使われ
るPstI部位をもはや持たない。そのようなPstI部位は構
築されたベクター内には１ケ所しかないので、組み換え
ベクターは線状化に対して耐性がある。そのような非線
状組み換えベクターを第２の微生物への形質転換によ
り、線状ベクターから分離する。
両具体例においては、B.ステアロサーモフィラス（B.
Stearothermophilus）とB.リチェニホルミス（B.lichen
iformis）のアルファ・アミラーゼをコードするDNA配列
の相同的配列で開始する交叉組み換えは、B.ステアロサ
ーモフィラス（B.Stearothermophilus）のアルファ・ア
ミラーゼのプロモーター、B.ステアロサーモフィラス
（B.Stearothermophilus）のアルファ・アミラーゼのア
ミノ末端配列の種々の部分、B.リチェニホルミス（B.li
cheniformis）のアルファ・アミラーゼのカルボキシル
末端の種々の部分をコードするハイブリッドDNA配列を
含む突然変異ベクターを形成する。そのようなハイブリ
ッドDNA配列により発現する種々のハイブリッドアルフ
ァ・アミラーゼはB.ステアロサーモフィラス（B.Stearo
thermophilus）とB.リチェニホルミス（B.licheniformi
s）の親アルファ・アミラーゼと比較して独自の性質を
示した。その他の好ましい具体例も合せて公開する。
実施例 A.バチルス・リチェニホルミス（Bacillus licheniform
is）とバチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus S
tearothermophilus）のアルファ・アミラーゼ遺伝子の
クローニング B.リチェニホルミス（B.licheniformis）又はB.ステ
アロサーモフィラス（B.Stearothermophilus）のDNAをS
au3Aで部分分解し、6kb（キロベース）以上のDNAフラグ
メントをショ糖勾配中で分画する。遺伝子DNA源として
用いるB.リチェニホルミス（B.licheniformis）株は、
スコットランド、アバディーン（Aberdeen）のトリー
（Torrey）研究所、国立産業細菌コレクション（Nation
al Collection of Industrial Bacteria）から入手した
菌株MCIB8061である。遺伝子DNA源として用いたB.ステ
アロサーモフィラス（B.Stearothermophilus）株は受理
番号39536で米国培養コレクション（American Type Cul
ture Collection）にアシグニー（Assignee）によって
保存された菌株NZ−３である。バクテリオファージ・ラ
ムダ・ベクターλ1059（13）をBamH1で完全分解し、自
己連結を少なくするために、仔牛の腸ホスファターゼで
処理した。500ngのベクターと500ngの細菌DNAフラグメ
ントを20μｌ反応体積中、T4DNAリガーゼで連結した。
その反応中に含まれるDNAを市販（プロメガ・バイオテ
ク）（Promega・Biotec）（マジソン市（Madison）WI）
のパッキング・イクストラクトを用いて試験管内でパッ
キングし、大腸菌（E.coli）Q358（15）、（６）とQ359
（Q359のP2溶原体）（15）に感染させた。典型的には、
組み換え体プラークの数は約2.5×103個であった。アル
ファ・アミラーゼ活性によるスクリーニングのため、約
５×103ケのプラークを0.5％でんぷんを含むLBプレート
の大腸菌（E.coli）Q359上にまいた。これらのプレート
をでんぷんを染めるヨウ素蒸気にさらした（16）。透明
なハローに囲まれた５ケのプラークがB.リチェニホルミ
ス（B.licheniformis）ライブラリー中に発見された。
同様に３ケのプラークがB.ステアロサーモフィラス（B.
Stearothermophilus）ライブラリー中に発見された。DN
Aはアミラーゼ・ポジチィブなB.リチェニホルミス（B.l
icheniformis）ファージ（λ−amy−BLと名付ける）と
B.ステアロサーモフィラス（B.Stearothermophilus）フ
ァージ（λ−amy−BSと名付ける）の各１ケから調製し
た。
さて、図3Bに参照されるように、大腸菌（E.coli）−
枯草菌（B.subtilis）のシャトルベクターpBS42（1
7）、ATCC37272をBamH1又はEcoR1で切断し、自己連結を
防ぐために仔牛の腸アルカリホスファターゼで処理す
る。この切断したシャトルベクターを各々BamH1又はEco
R1で消化したλ−amy−BL由来のDNAと連結する。
大腸菌（E.coli）294、（18）、ATCCNo.31446の形質
転換は多くのクロラムフェニコール耐性形質転換体を生
じ、その多くはヨウ素蒸気で染めると透明なハローを示
す。アミラーゼポジティブ（amy+）なBamH1及びEcoR1サ
ブクローンの各々の消化はそれぞれ9.4kb及び3.2kbのフ
ラグメントが挿入したことを明らかにした。これらの結
果はB.リチェニホルミス（B.licheniformis）のアルフ
ァ・アミラーゼ遺伝子がこれらのフラグメントの各々に
全体として含まれていることを示している。このEcoR1
サブクローンをpBS42−BLと命名し、図3Bに示した。
さらに、プラスミドpBS42−BLを、図１に描いた制限
地図を作るため、種々の制限酵素による消化に課した。
ダイデオキシ・チェーン・ターミネーション法（21）に
より予備的にDNA配列情報を決定するために挿入したDNA
の種々のサブフラグメントをM13シーケンシング・ベク
ター中にサブクローンした。その１カ所切断kpnI部位付
近の配列がB.アミロリクエファシエンス（B.amylolique
faciens）のアルファ・アミラーゼ遺伝子のそれと非常
に相同性が高いことが分った。B.リチェニホルミス（B.
licheniformis）のアミラーゼ遺伝子がB.アミロリクエ
ファシエンス（B.amyloliquefaciens）遺伝子と構造的
に同じであると仮定することによって詳細に配列が適切
なフラグメントを簡単に選ぶことができる。図１は完全
に配列決定した領域を示してある。1536bpのオープン・
リーディング・フレームがB.アミロリクエファシエンス
（B.amyloliquefaciens）の全アルファ・アミラーゼ遺
伝子と高い相同性をもつことが分った。B.リチェニホル
ミス（B.licheniformis）のアルファ・アミラーゼのDNA
配列を図2Aと2Bに示した。
λ−amy−BSのDNAを種々の制限酵素で消化し、１％ア
ガロースゲルで分画し、ニトロセルロース・フィルター
（21）に移し、DNA−DNAハイブリダイゼーションに課し
た。用いたプローブはB.リチェニホルミス（B.lichenif
ormis）アミラーゼ遺伝子（図１）の大部分のコード化
配列を含むPst1−Pst1フラグメントである。このフラグ
メントをニック・トランスレーション法（23）によりγ
−32Pで放射能ラベルした。標準的な高ストリンジェン
ト条件下で（24）、ハイブリダイゼーションさせた。1.
8kbのBamH1フラグメントと1.8kbのSalIフラグメントは
ハイブリダイズするフラグメントであった。これら両方
のフラグメントをpBR322中にサブクローンし、BamH1又
はSalIで切断、BamH1又はSal1で切断したpBR322と連結
して図3Aに示したプラスミドpBR322BS−ＢとpBR322BS−
Ｓを生成した。挿入したフラグメントの詳細な制限地図
を図１に示す。この情報は予備的DNA配列解析のため
の、M13配列決定ベクターへのクローニングに対する種
々のサブフラグメントの単離に使用した。１カ所切断の
Kpn1部位付近の配列はB.アミロリクエファシエンス（B.
amyloliquefaciens）とB.リチェニホルミス（B.licheni
formis）のアルファ・アミラーゼ遺伝子のそれと高い相
同性をもつことが分った。B.ステアロサーモフィラス
（B.Stearothermophilus）のアルファ・アミラーゼ遺伝
子の構造が他の２つのものと類似していると仮定する
と、pBR322BS−ＢとpBR322BS−Ｓ中の挿入したフラグメ
ントの他のサブフラグメントを完全に配列決定するのに
選び出すことが可能であった。B.ステアロサーモフィラ
ス（B.Stearothermophilus）の全配列を図2Aと2Bに示し
た。これらの研究で他のアルファ・アミラーゼ遺伝子の
ものと高い相同性を示す1581bpのオープン・リーディン
グ・フレームが明らかになった。
B.B.ステアロサーモフィラス（B.Stearothermophilus）
のアルファ・アミラーゼ・プラスミドベクターpUC13BS
及びB.ステアロサーモフィラス（B.Stearothermophilu
s）−B.リチェニホルミス（B.licheniformis）のアルフ
ァ・アミラーゼ前駆体プラスミドpUC13BSBLとpBS42BSBL
の構築 図3Aに示したように、pBR322BS−ＢからのDNAをBamH1
で消化し、1.8kbのフラグメント（フラグメントＡ）を
単離した。プラスミドpBR322BS−ＳをBamH1とSal1で二
重消化し、1.8kbのフラグメント（フラグメントＢ）を
単離した。プラスミドpBR322をBamH1とSal1で二重消化
し、より大きいベクターフラグメント（フラグメント
Ｃ）を単離した。フラグメントＡ、Ｂ、Ｃを連結した。
その反応物を大腸菌（E.coli）294に形質転換した。プ
ラスミドpBR322BSを含む１つのアンピリシン耐性コロニ
ーを単離した。このプラスミドをHindIIIで完全消化
し、Sal1で部分消化し、4.2kbのフラグメント（フラグ
メントＤ）を単離した。ベクターpUC13（26）をHindIII
とSal1で消化し、より大きいベクターフラグメント（フ
ラグメントＥ）を単離した。フラグメントＤとＥを連結
し、大腸菌（E.coli）294に形質転換した。プラスミドp
UC13BSを含むアンピリシン耐性コロニーを単離した。こ
のコロニーは、LBデンプン寒天プレート上に透明なゾー
ンを作ることが分った。それゆえ、これはB.ステアロサ
ーモフィラス（B.Stearothermophilus）のアルファ・ア
ミラーゼの全遺伝子をそのプラスミド上に含むと仮定し
た。
図3Bに参照されるように、B.リチェニホルミス（B.li
cheniformis）のアルファ・アミラーゼプラスミドpBS42
BLをSstIとPst1で切断し、そのより小さいフラグメント
（フラグメントＦ）を単離した。また、B.ステアロサー
モフィラス（B.Stearothermophilus）のプラスミドpUC1
3BSをSst1とPst1で消化し、より大きいベクターフラグ
メント（フラグメントＧ）を単離した。フラグメントＦ
とＧを連結し、さらに大腸菌（E.coli）294に形質転換
した。プラスミドpUC13BSBLを含む１つのアンピリシン
耐性コロニーを選択した。このコロニーは、LBデンプン
寒天プレート上に透明なハローをつくれないことから活
性のあるアルファ・アミラーゼを生産していない。この
結果はpUC13BSBLがB.ステアロサーモフィラス（B.Stear
othermophilus）のアルファ・アミラーゼ遺伝子のカル
ボキシル末端コドンとB.リチェニホルミス（B.lichenif
ormis）のアルファ・アミラーゼ遺伝子のアミノ末端コ
ドンを欠失していることから予想される。さらに、後者
の遺伝子コドンは、前者遺伝子コドンと同じ読み枠では
ない。プラスミドpUC13BSBLをBamH1で完全消化し、EcoR
1で部分消化し、フラグメントＨを単離した。大腸菌
（E.coli）−枯草菌（B.subtilis）シャトルベクターpB
S42をBamH1とEcoR1で消化し、より大きいベクターフラ
グメント（フラグメントＩ）を単離した。フラグメント
ＨとＩを連結し、大腸菌（E.coli）294に形質転換し
た。１つのクロラムフェニコール耐性形質転換pBS42BSB
Lを得た。このコロニーは、LBデンプン、寒天プレート
上でデンプンを透明化するハローをつくれないことから
判るようにアルファ・アミラーゼを生成しない。このこ
とは、このプラスミドpUC13BSBLと同じアルファ・アミ
ラーゼ配列をもつことから予想される。
C.ハイブリッド、アルファ・アミラーゼDNA配列の生成
と、それにコード化されたハイブリッド・タンパク質の
発現 10ngのプラスミドpBS42BSBLを大腸菌（E.coli）294
（レックＡプラス）に形質転換するのに用いた。その反
応物を12.5μg/mlのクロラムフェニコールを補ったLB−
デンプンプレート上にまいた。約３×104ケのコロニー
が得られた。これらのうちの６ケがデンプン加水分解に
よるハローを形成した。これらのコロニーは、プラスミ
ド中のB.ステアロサーモフィラス（B.stearothermophil
us）とB.リチェニホルミス（B.licheniformis）のアル
ファ・アミラーゼDNA配列が活性のあるハイブリッド・
アルファ・アミラーゼをコードするハイブリッドDNA配
列が生ずるように相同的組み換えによって組み換えられ
ているようなプラスミドを含むと考えられる。２つのア
ルファ・アミラーゼ遺伝子フラグメント間の相同領域
（組み換えが起こると予想される）は約1.0kbである。
これらのデータはそのような組み換えが起こる頻度が6/
3×104又は２×104であることを示している。
実施例２ pBS42BSBLを含むコロニーのバックグランドを減ずる
ために、pBS42BSBLを形質転換した大腸菌（E.coli）294
からのプラスミド調製物を第２の形質転換前にPst1で消
化した。B.ステアロサーモフィラス（B.stearothermoph
ilus）とB.リチェニホルミス（B.licheniformis）遺伝
子フラグメント間の組み換えが起こる全ての場合に、Ps
t1部位（プラスミド中の１カ所切断）が欠失しているこ
とが証明される。このように、そのようなハイブリッド
組み換えプラスミドはPst1消化に対し耐性であるが、一
方、組み換えられていないプラスミドはPst1消化により
線状化されよう。環状プラスミドの形質転換効率はその
ような線状型のものよりも100から1000倍大きい。それ
ゆえ、形質転換前にPst1でpBS42BSBLを消化すると、組
み換えしていないプラスミドを含むコロニーに対し、組
み換えをおこしてるものを含むものの比率を増加するこ
とが予定される。このように、pBS42BSBLで形質転換し
た大腸菌（E.coli）294からのPst1処理したプラスミド
調製物1000ngが二度目の大腸菌（E.coli）294への形質
転換に用いられた。2032ケのコロニーが得られた。その
うちの517ケ（約25％）は、活性ハイブリッドアルファ
・アミラーゼの合成を示す、LBデンプン寒天プレート上
でのデンプン加水分解によるハローをつくった。
実施例３ A.アルファ・アミラーゼを生成する大腸菌（E.coli）29
4のpBS42BSBL形質転換体中に含まれるハイブリッドDNA
配列の特性化 amy+コロニーは、その配列が相同的な領域での、B.ス
テアロサーモフィラス（B.stearothermophilus）とB.リ
チェニホルミス（B.licheniformis）遺伝子フラグメン
ト間での単一交叉現象がpBS42BSBLプラスミド内で起こ
った結果生じたものであると仮定した。そのような組み
換え遺伝子はB.ステアロサーモフィラス（B.stearother
mophilus）の遺伝子由来の５′配列とB.リチェニホルミ
ス（B.licheniformis）遺伝子由来の３′配列を含んで
いることが理解されよう。この記述が正しいことを示す
ために、次のような実験を行った。約150bpの間隔をも
った16〜18ヌクレオチドの相同性の低い領域を選び出
す。それらの領域中のB.ステアロサーモフィラス（B.st
earothermophilus）の意味をもつ鎖に対応する、図2A及
び2B中のプローブ１〜９として示したオリゴヌクレオチ
ドを合成した（11）。これらのオリゴヌクレオチドをγ
−32P−ATPとT4オリゴヌクレオチド・キナーゼでラベル
し、B.ステアロサーモフィラス（B.stearothermophilu
s）の配列を検出するハイブリダイゼーションプローブ
を作った。交叉部位の５′側の全ての配列がB.ステアロ
サーモフィラス（B.stearothermophilus）由来のもので
あり、それゆえ、対応する（完全に相同的）オリゴヌク
レオチドプローブとハイブリダイズすることが理解でき
よう。交叉部位の３′側の配列はB.リチェニホルミス
（B.licheniformis）の遺伝子由来のものであり、それ
ゆえ、つかわれた条件下では、対応する（相同性が低
い）オリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズする
ことはできない。pUC13BS,pBS42BL,及びpBS42BSBLを含
むコロニーと同様に、組み換えハイブリッドアルファ・
アミラーゼDNA配列を含むと仮定される12ケのamy+コロ
ニーを各々のオリゴヌクレオチドプローブとのDNA−DNA
ハイブリダイゼーションにより選択した。これらのコロ
ニーの全てを各々、９ケのニトロセルロース濾紙小片上
でインキュベートした。これらの小片をLB寒天プレート
上に置き、そのプレートをコロニー生長のため37℃で一
晩インキュベートした。さらにその濾紙を標準法による
（27）ハイブリダイゼーションに供した。各々の容器
中、９ケの小片を低ストリンジェント・ハイブリダイゼ
ーションのための標準法を使って各オリゴヌクレオチド
プレーブとインキュベートした。（２）その濾紙を37℃
で2xSSCと0.1％SDSで洗浄し、さらに空気乾燥してオー
トラジオグラフをとった。その結果を表１に示した。
予想されるように、全てのプローブはB.ステアロサー
モフィラス（B.stearothermophilus）の配列にはハイブ
リダイズするが、B.リチェニホルミス（B.licheniformi
s）の配列にはハイブリダイズしない。このことはB.ス
テアロサーモフィラス（B.stearothermophilus）のアル
ファ・アミラーゼの全遺伝子を含むpUC13BSを有する細
胞からのDNAに対し，全プローブが正のハイブリダイゼ
ーションの信号を与えるが、B.ステアロサーモフィラス
（B.stearothermophilus）の遺伝子からの配列は含まな
いがB.リチェニホルミス（B.licheniformis）の全アル
ファ・アミラーゼの全遺伝子を含むpBS42BLを有する細
胞からのDNAに対しては負のハイブリダイゼーションの
信号を与えることから示される。pBS42BLを含む細胞か
らのDNAはプローブ９以外の全てについて正の信号を与
えるが、これはプローブ９がこのプラスミド中に存在す
るB.ステアロサーモフィラス（B.stearothermophilus）
の３′側の領域に対応しているためである。
14ケの推定されるハイブリッドは種々のハイブリダイ
ゼーションの型を示している。たとえば、ハイブリッド
１、２、３及び４はプローブ１にハイブリダイズするが
他のプローブ（より３′側の）にはハイブリダイズしな
い。これはプローブ１と２に対応する配列の間での交叉
を示している。他の側では、ハイブリッド９はプローブ
１〜４にはハイブリダイズするが、より３′側のプロー
ブ５〜９にはハイブリダイズしない。これはプローブ４
と５に対応する配列の間での交叉を示している。表１に
示されているように、その他の交叉領域も同様に残りの
ハイブリッドの中で同定されている。他の実験において
（示されていないが、）効率には非常にバラツキがある
がいかなるプローブ領域の間にも交叉をもつハイブリッ
ドがみつかっている。例えばプローブ１と２の間での交
叉は非常に一般的（約20％）ではあるが、一方プローブ
領域２と３の間での交叉は全く稀である（約１％）。
上の結果は、アルファ・アミラーゼ遺伝子フラグメン
トの間での交叉は２つの遺伝子間のおよそ1.0kbの相同
的領域に渡って広く分散していることを示している。し
かし、より詳細にこの分布を研究することは興味深い。
このように、我々は、ダイデオキシ・チェーン・ターミ
ネーション法（28）を用いて、水酸化ナトリウムで破壊
したプラスミドを直接配列決定により、それらの交叉領
域中のハイブリッド遺伝子のDNA配列を決定した。所定
のハイブリッドに対して、そのハイブリッドにハイブリ
ダイズする３′側の合成オリゴヌクレオチドを用いて合
成を開始した。12のハイブリッドに対する交叉部位を図
2Aと2Bの点描したボックス中に示した。たとえば、ハイ
ブリッド９（図2A）においては、この領域のB.ステアロ
サーモフィラス（B.stearothermophilus）の５′側由来
の配列と、この領域のB.リチェニホルミス（B.lichenif
ormis）の３′側の配列の存在により示されるように、
交叉はbp585とbp600の間で走っている。
B.プラスミドハイブリッド４、６及びＤにより生成する
ハイブリッド・アルファ・アミラーゼ 酵素の解析 pBS42BLもしくはプラスミドハイブリッド４、６又は
Ｄを含む大腸菌（E.coli）294細胞を12.5μg/mlのクロ
ラムフェニコールを補ったLB培地を含む振とうフラスコ
（120rpm）中で１晩培養した。プラスミドpUC13BSを含
む大腸菌（E.coli）294を、クロラムフェニコールでは
なく50μg/mlのカルベニシリンをLB培地に添加する以外
は同様に培養した。遠心により集菌し、浸透圧ショック
法（29）により、細胞質及びペリプラスマ成分に分画し
た。これらのフラクションをデンプン加水分解を測定す
るミクロ−フェダバス（micro−Phaedabas）検定法（フ
ァルマシア（Pharmacia）、ピスカタウェイ（Piscatawa
y）NJ）により、アルファ・アミラーゼを検定した。全
ての場合において、活性の大部分（80〜85％）はペリプ
ラズマ画分中にみられる。このようにこの画分は５ケの
培養中で生成したアルファ・アミラーゼの精製に使用し
た。
この酵素を精製するために、アルファ・アミラーゼを
デンプンに結合させるために、４℃で、不溶性デンプン
を含むカラムに、ペリプラズマ画分を注いだ。そして、
温度を50℃まで上昇させながらカラムから酵素を流出し
た。デンプンをＰ−２カラム（バイオ・ラッド・ラボラ
トリー（Bio−Rad Labovatories）、リッチモンド（Ric
hmond）、CA）でのゲル浸透クロマトグラフィーと次のD
EAEクロマトグラフィーにより、酵素から除いた。（3
0）各精製アルファ・アミラーゼはSDSポリアクリルアミ
ドゲルでのその均一性によって純粋であると判断した。
各精製タンパク質のタンパク濃度はブラッドフォードの
色素結合法により決定した。（31） その精製アルファ・アミラーゼの熱安定性は次のよう
に測定した。等濃度の酵素を90℃てインキュベートし
た。種々の時間にその一部をとり、ミクロ−フェダバス
（micro−Phaedabas）法により、70℃でのアルファ・ア
ミラーゼ活性を検定した。その結果を図５に示した。pB
S42BLプラスミドから生成した親B.リチェニホルミス
（B.licheniformis）酵素は、90℃で延長したインキュ
ベーション（120分）時間ののちも、その全活性を基本
的に保持しているが、一方、プラスミドpUC13BSから生
成した親B.ステアロサーモフィラス（B.stearothermoph
ilus）酵素はその条件下で約50％の活性を失なう。ハイ
ブリッド４、６及びＤのハイブリッドDNA配列によりコ
ードされている。ハイブリッド酵素は種々の熱安定性を
示す。ハイブリッド４は90℃で120分後でも基本的にそ
の全活性を保持している。図６に示したように、このタ
ンパク質は最初の15ケのアミノ酸がB.ステアロサーモフ
ィラス（B.stearothermophilus）の遺伝子によりコード
されているアミノ末端部分以外、B.リチェニホルミス
（B.licheniformis）の酵素と構造的に一致している。
そのハイブリッド４タンパク質と、B.ステアロサーモフ
ィラス（B.stearothermophilus）タンパク質とのこの強
い類似性が熱失活に対する同様な耐性を説明づける。こ
れに対し、ハイブリッドＤタンパク質は、90℃、120分
のインキュベーション後には僅か10％の活性しか保持し
ていない。このポリペプチドは、その全アミノ末端半分
がほぼB.ステアロサーモフィラス（B.stearothermophil
us）遺伝子によりコードされ、一方、カルボキシル末端
半分はB.リチェニホルミス（B.licheniformis）の遺伝
子由来のDNAによりコードされていること（図６を参
照）において非常にキメラ的である。ハイブリッド４の
タンパク質の熱安定性は各親タンパクのそれよりも劣る
ことから、アルファ・アミラーゼのアミノ末端及びカル
ボキシル末端半分の間の相互作用が熱安定性に対し要求
され、ハイブリッドタンパク質の中ではこの相互作用が
修正されるらしい。ハイブリッド６由来のタンパク質は
90℃で120分のインキュベーション後、その約半分の活
性を保持しており、それゆえ、親のB.ステアロサーモフ
ィラス（B.stearothermophilus）の酵素と同様の熱安定
性を有している。ハイブリッド６タンパク質は、主とし
てB.リチェニホルミス（B.licheniformis）遺伝子によ
りコードされる残基を含んでいるが、アミノ末端・73残
基はB.ステアロサーモフィラス（B.stearothermophilu
s）由来のものである。（図６参照）。この異質アミノ
末端は、親のB.リチェニホルミス（B.licheniformis）
の酵素と比較して、その減ずる安定性に寄与しそうなタ
ンパク質構造への僅かな不安定化効果を有しているらし
い。この結果は、ハイブリッドアルファ・アミラーゼ
が、その親酵素の熱安定性と同じか又は異なるかという
熱安定性の範囲を示すと考えることができることを示し
ている。
親アルファ・アミラーゼと上記の精製ハイブリッドア
ルファ・アミラーゼの比活性も４つの異なる温度で測定
した。これらのデータを図７に示した。親B.ステアロサ
ーモフィラス（B.stearothermophilus）酵素は全ての温
度で高い比活性を有している。一方、親B.リチェニホル
ミス（B.licheniformis）酵素は全ての温度において非
常に活性が低い。上記のように、ハイブリッド４と６
は、B.ステアロサーモフィラス（B.stearothermophilu
s）の遺伝子由来の短かい範囲のアミノ酸残基のみを含
んでおり、その比活性プロィールはB.リチェニホルミス
（B.licheniformis）酵素と非常に類似している。しか
し、ハイブリッドＤアルファ・アミラーゼはその親酵素
の中間の比活性を有している。70℃に比して、90℃での
この酵素の活性の明確な減少は、主に上記のような90℃
での著しい不安定性によるらしい。これらのデータはハ
イブリッド・アルファ・アミラーゼが種々の比活性を有
することを示している。
実施例４ もう１つの好ましい具体例においては、枯草菌（B.su
btilis）とB.アミロリクエファシエンス（B.amylolique
faciens）由来のハイブリッド・アルカリ・プロテアー
ゼを生成した。１つ以上の１カ所切断制限部位を含む合
成オリゴヌクレオチド配列を枯草菌（B.subtilis）とB.
アミロリクエファシエンス（B.amyloliquefaciens）の
アルカリ・プロテアーゼをコードするDNA配列を連結す
るのに用いた。レック・プラス微生物中での組み換えの
後、各々の１カ所切断制限部位に特異的なエンドヌクレ
アーゼでベクターを処理することにより、非組み換えベ
クターによるバックグランド形質転換を減させた。
A.枯草菌（B.subtilis）−B.アミロリクエファシエンス
（B.amyloliquefaciens）アルカリ・プロテアーゼ前駆
体プラスミドpBS42BSBAの構築 図４に記してあるように、枯草菌（B.subtilis）アル
カリ・プロテアーゼ遺伝子を含むプラスミドpS168.1（4
4、32）をEcoR1とNco1で消化した。より小さいフラグメ
ント（フラグメントＡ）を単離した。全てのB.アミロリ
クエファシエンス（B.amyloliquefaciens）・アルカリ
・プロテアーゼ遺伝子を含んでいるプラスミドpS4−５
（44、33）をEcoR1とAva1で消化した。より大きいベク
ターフラグメント（フラグメントＢ）を単離した。Nco1
とAva1の粘着末端と、それら末端間にPst1、Sal1及びKp
n1部位を含む２つの相補的な合成オリゴヌクレオチド
を、90℃に加熱したのち23℃に冷却することによってア
ニールしフラグメントＣを形成した。フラグメントＡ、
Ｂ及びＣを連結し、この連結したベクターを大腸菌（E.
coli）294を形質転換するのに用いた。プラスミドpBS42
BSBAを含むクロラムフェニコール耐性コロニーを確保し
た。枯草菌（B.subtilis）株BG2036（44）は染色体アル
カリプロテアーゼと中性プロテアーゼ遺伝子を欠失して
いる。0.1％のスキムミルクを含むLBプレート上で透明
なハローを作れないことから分るように菌株BG2036はpB
S42BSBAで形質転換されてもプロテアーゼを生成しな
い。この結果は、そのプラスミドが、枯草菌（B.subtil
is）のアルカリプロテアーゼ遺伝子のカルボキシル末端
コドンとB.アミロリクエファシエンス（B.amyloliquefa
ciens）のアルカリプロテアーゼ遺伝子のアミノ末端コ
ドンを欠いていることから予想された。さらに、後者遺
伝子のコドンは前者遺伝子のコドンとその読み枠が同じ
ではない。これに対して、プラスミドpS168.1又はpS4−
５を含む枯草菌（B.subtilis）株・BG2036はLB−スキム
ミルク寒天プレート上に透明なハローを生成することに
より分るように活性のあるアルカリ・プロテアーゼを生
成する。この結果は、これら２つのプラスミドが完全な
アルカリ・プロテアーゼ遺伝子を含有することから予想
されることであった。ここで、pS168.1、pS4−５又はpB
S42BSBAで形質転換した大腸菌（E.coli）294は、LBスキ
ムミルク寒天プレート上でハロー生成ができないことか
ら分るようにアルカリ・プロテアーゼを生成しないこと
に注目すべきである。このことは、他にも説明がつくか
もしれないが、バチル（Bacillus）のアルカリ・プロテ
アーゼプロモーターが大腸菌（E.coli）中では活性をも
たないことを示しているのかもしれない。
B.ハイブリッドアルカリ・プロテアーゼDNA配列の生成
とハイブリッドタンパク質の発現 1ngのプラスミドpBS42BSBAを大腸菌（E.coli）294を
形質転換するのに用いた。この反応物をLBクロラムフェ
ニコール寒天プレート上にまき、約２×103ケのコロニ
ーを得た。アルファ・アミラーゼの場合と違って、アル
カリプロテアーゼは完全な遺伝子からでさえ大腸菌（E.
coli）中では発現されない。プラスミド上に存在する枯
草菌（B.subtilis）とB.アミロリクエファシエンス（B.
amyloliquefaciens）の約1kbのアルカリプロテアーゼ遺
伝子フラグメントを含む相同的領域の間で組み換えが起
っているかどうかを決めるために、ハイブリダイゼーシ
ョン技術を用いることが必要となる。このハイブリダイ
ゼーション実験において、その形質転換体中に含まれる
プラスミド中にフラグメントＣが存在するかどうかをテ
ストした。そのDNA配列間での組み換えがすべての場合
に起こっているならば、フラグメントＣを含む配列は欠
失しているだろうし、一方、組み換えを起こしていない
プラスミドは依然としてそれらのフラグメントを維持し
ているであろうと考えた。ハイブリダイゼーション実験
は次のように行った。コロニーはプレート上からニトロ
セルロースフィルター上につり上げ、さらにそのフィル
ターは標準法によりハイブリダイゼーションに供され
た。（27）、標準法に従って、ハイブリダイゼーション
は低ストリンジェント（stringency）条件で行なわれ
た。使用したプローブはフラグメントＣをγ32PＰ−ATP
とT4ポリヌクレオチドキナーゼで末端ラベルしたセンス
（アッパー）ストランドである。この方法により、約1.
0×103ケのコロニーをテストした。このうちの３つがプ
ローブとハイブリダイズしないことがわかり、それゆえ
２つの部分的に相同的なアルカリプロテアーゼ遺伝子フ
ラグメント間の組み換えが起こっているプラスミドを含
むと考えられた。
実施例５ 他の実験において、多くのそのような推定の組み換え
がBS42BSBAで形質転換した大腸菌（E.coli）294由来の
プラスミド調製物を前消化処理することにより行なわれ
た。プラスミド調製物を、大腸菌（E.coli）294の形質
転換する前に制限酵素Pst1、SalI、KpnIを組み合せて消
化した。このように消化した3ngのプラスミドは８つの
クロラムフェニコール耐性の形質転換体を生じた。これ
らのコロニーに対し、フラグメントＣに含まれるヌクレ
オチド配列の存在を上述のハイブリダイゼーション操作
に従ってテストした。これらのコロニーのうちの７つは
ハイブリダイズしなかったので、２つの部分的に相同的
な遺伝子配列の間で組み換えが起っているプラスミドを
含むと考えられた。ハイブリダイズしなかったコロニー
が活性なハイブリッド・アルカリ・プロテアーゼをコー
ドするハイブリッド遺伝子をもつプラスミドを含むかど
うかをテストするために、これらのプラスミドを単離
し、枯草菌（B.subtilis）BG2036を形質転換させた。こ
の菌株は組み換えアルカリ・プロテアーゼ・ハイブリッ
ド遺伝子を含むと考えられる、いかなるプラスミドで形
質転換されても、LBスキムミルク・クロラムフェニコー
ル寒天プレート上に透明領域をつくった。これに対し、
組み換えを起こしていないと推定されるpBS42BSBAプラ
スミド（テストされた８ケの単離物）は、スキムミルク
プレート上に透明なゾーンを作れないことから示される
ように、活性アルカリ・プロテアーゼを、菌株BG2036形
質転換体については、生成できない。
実施例６ A.大腸菌（E.coli）294のアルカリ・プロテアーゼを生
成するpBS42BSBA形質転換体に含まれるハイブリッドDNA
配列の特性化 アルカリ・プロテアーゼ陽性コロニーは、その配列が
相同的な領域で開始する、枯草菌（B.subtilis）とB.ア
ミロリクエファシエンス（B.amyloliquefaciens）のDNA
配列間でのpBS42BSBAプラスミド内単一交叉現象の結果
として起こると仮定した。そのような組み換え遺伝子は
枯草菌（B.subtilis）遺伝子由来の５′側配列と、B.ア
ミロリクエファシエンス（B.amyloliquefaciens）遺伝
子由来の３′側配列を含んでいることが理解できよう。
初期の交叉は、B.アミロリクエファシエンス（B.amylol
iquefaciens）遺伝子由来の３′側配列を含むことが予
想されよう。一方、B.アミロリクエファシエンス（B.am
ylolique−faciens）遺伝子由来の小さい３′側配列断
片は後期の交叉中に存在するであろう。B.アミロリクエ
ファシエンス（B.amylolique−faciens）のアルカリ・
プロテアーゼをコードする配列内には、pBS42BSBA中に
存在する１カ所切断のPvu11部位がある（図４参照）。
B.アミロリクエファシエンス（B.amyloliquefaciens）
遺伝子由来の３′側領域がPvu11部位の５′側まで伸び
るような交叉は１カ所切断のPvu11部位をもつプラスミ
ドを生ずるであろう。さらに、このPvuII部位は組み換
えられていないpBS42BSBAプラスミド中でよりも１カ所
切断のEcoR1部位（プロモーターの５′側に存在する）
に近く存在することになる。EcoR1とPvuIIで消化した推
定のハイブリッド２、６、７及び８はPvuII部位の存在
を指示する制限パターンを示した。これに対し、B.アミ
ロリクエファシエンス（B.amyloliquefaciens）遺伝子
由来の３′側領域がPvuII部位の５′側まで伸びていな
い交叉はPvuII部位をもたないプラスミドを生ずるであ
ろう。推定のハイブリッド１、３及び４はPvuIIによる
消化に対して耐性を示すことから後者のカテゴリーに属
する。これらのデータは、推定のハイブリッド・アルカ
リ・プロテアーゼ遺伝子を含むプラスミド中に、初期及
び後期の交叉が存在することを示している。
B.ハイブリッド・アルカリ・プロテアーゼのDNA配列に
よりコードされるハイブリッド・アルカリ・プロテアー
ゼの解析 上記のハイブリッド・アルカリ・プロテアーゼ遺伝子
をコードするプラスミドを含む枯草菌（B.subtilis）BG
2036により生成されるハイブリッドタンパク質を予備的
に特徴づけるために、合成基質をつかってKm値を測定し
た。酵素源として、阻培養上清を用いた。つかわれた基
質はサクシニル−Ｌ−ala−Ｌ−ala−Ｌ−pro−Ｌ−tyr
−Ｌ−para−ニトロアナリドである。生成物para−ニト
ロアナリドの放出をコリオメトリカル（coliometrica
l）に、ヒューレット・パッカード（Hewlett Packard）
のダイオード・アレー・スペクトロフォトメーター・モ
デル8451Aを用い、430nmの吸光度を測定することにより
モニターした。
枯草菌（B.subtilis）及びB.アミロリクエファシエン
ス（B.amyloliquefaciens）の親酵素のKm値も測定し
た。この研究結果を表２に示す。
表２ 合成基質 サクシニル−Ｌ−ala−Ｌ−ala−Ｌ−pro−Ｌ−tyr−Ｌ
−para−ニトロアナリドに関する親アルカリプロテアー
ゼとハイブリッド・アルカリ・プロテアーゼのKm値プラスミド Km（Ｍ×105） pS4−５ 2.38（±.09） pS168.1 3.39（±.15） ハイブリッド１ 5.54（±.10） ハイブリッド２ 5.12（±.10） ハイブリッド３ 5.42（±.06） ハイブリッド４ 5.39（±.11） ハイブリッド６ 2.86（±.13） ハイブリッド７ 5.42（±.12） ハイブリッド８ 2.75（±.08） 1.全ての場合について宿主は枯草菌（B.subtilis）BG20
36であった。
ハイブリッド酵素は、基本的に２つに分類されるのは
明らかである。ハイブリッド１、２、３、４及び７に代
表される第１のクラスは各々の親酵素のそれよりいくぶ
ん高いKm値をもっている。ハイブリッド６と８に代表さ
れる第２のクラスは両親酵素の中間のKm値をもってい
る。
これらの結果は、ハイブリッド・アルカリ・プロテア
ーゼは、この合成基質に対し、種々のKm値をとり、それ
らは親酵素のものと異なることを示している。他の合成
基質を用いたKm値の測定も、ある範囲をもつ結果を与え
るだろうし、また、種々のハイブリッド酵素に対して、
好ましい基質が変化することも示されることが予想され
る。
実施例７ 別な好ましい具体例では、ハイブリッド・アルファ・
アミラーゼのDNA配列を含むプラスミドは２つの親アル
ファ・アミラーゼDNA配列間での相同組み換えの結果と
して、転写ターミネーターを欠いてしまったテトラサイ
クリン耐性検体を組み換え後転写法により選択した。
機能的プロモーターをB.リチェニホルミス（B.lichen
iformis）のアルファ・アミラーゼDNA配列に実施可能な
よう連結した。転写ターミネーターはこの遺伝子の３側
で、B.ステアロサーモフィラス（B.stearothermophilu
s）のアルファ・アミラーゼをコードするDNA配列の５′
側にある。それ自身のプロモーターを欠いているテトシ
サイクリン耐性遺伝子をB.ステアロサーモフィラス（B.
stearothermophilus）のDNA配列の丁度３′側に位置す
る。これらの特性をもったプラスミドを含む細胞は、上
流の活性プロモーターから転写の読み通しが転写ターミ
ネーターによって妨害される為にテトラサイクリン感受
性となるであろう。しかしながら、２つのアルファ・ア
ミラーゼDNA配列の間で組み換えが起こるとすると、そ
のターミネーターが切り出され、結果的にテトラサイク
リン耐性遺伝子の転写が行なわれる。この相同的組み換
えを起こすプラスミドを含む細胞を、非組み換えプラス
ミド由来のすべてのバックグランドを除外することによ
り、テトラサイクリン耐性で選択できる。この方法はい
かなる２つの相同的遺伝子フラグメントを組み換えるこ
とに対し完全に応用できる。
B.リチェニホルミス（B.licheniformis）とB.ステア
ロサーモフィラス（B.stearothermophilus）の親遺伝子
由来の組み換えアルファ・アミラーゼ遺伝子の選択に対
し、この方法を使用するために、図８に示したようなプ
ラスミドを構築した。完全なB.リチェニホルミス（B.li
cheniformis）のアルファ・アミラーゼ遺伝子を含むプ
ラスミドpBS42BLをEcoR1とHindIIIで消化した。より小
さいフラグメント（フラグメントＡ）を単離した。プラ
スミドpUC13をEcoR1とPst1で切断し、より大きいフラグ
メント（フラグメントＣ）を単離した。２つの合成オリ
ゴヌクレオチドを合成し、一度95℃に加熱してから23℃
に冷却することによりアニールさせた。生じたフラグメ
ント（フラグメントＢ）は、HindIII部位により５′末
端の、SalI、Pvu1とPst1部位によって３′末端の横に位
置する大腸菌（E.coli）のtrp転写ターミネーター（ボ
ックス内）を含んでいる。フラグメントＡ、Ｂ、Ｃを連
結し、大腸菌（E.coli）294を形質転換するのに用い
た。このプラスミドを含むアンピシリン耐性コロニーを
pUC13BLと命名した。このプラスミドをSalIで完全消化
し、Pvu1で部分分解した。フラグメントＤを単離した。
プラスミドpUC13BSをTaq1とBstX1で切断し、そのフラグ
メント（フラグメントＥ）を単離した。同様のプラスミ
ドをBstX1とPvu1で切断し、より小さいフラグメント
（フラグメントＦ）を単離する。フラグメントＤ、Ｅ、
Ｆを連結し、大腸菌（E.coli）294を形質転換するのに
用いた。アンピシリン耐性の形質転換体はプラスミドpU
C13BLBSを含んでいる。このプラスミドは、最初の８ケ
のコドン以外は完全なB.ステアロサーモフィラス（B.st
earothermophilus）遺伝子のコード配列が引き続き、大
腸菌（E.coli）の転写ターミネーターを従えた、その本
来のプロモーターを含んでいる、全B.リチェニホルミス
（B.licheniformis）のアルファ・アミラーゼ遺伝子を
含有する。さらにプラスミドpUC13BLBSをEcoR1とBstX1
で切断し、より小さいフラグメント（フラグメントＧ）
を単離した。またこのプラスミドをBstX1とHindIIIで切
断し、フラグメントＨを単離した。プラスミドpBR322を
EcoR1とHindIIIで切断し、より大きいベクターフラグメ
ント（フラグメントＩ）を単離した。フラグメントＧ、
Ｈ、Ｉを連結し、大腸菌（E.coli）294に形質転換し
た。アンピシリン耐性形質転換体はプラスミドpBR322BL
BSTCSを含んでいる。このプラスミドはコード化領域
と、テトラサイクリン耐性遺伝子のリボース結合部位
の、B.ステアロサーモフィラス（B.stearothermophilu
s）のアルファ・アミラーゼコード化領域の３′末端へ
の融合によりpUC13BLBSとは非常に異なる。
レックＡプラスの大腸菌（E.coli）294中でのpBR322B
SBLTCSの複製は、２つのアルファ・アミラーゼDNA配列
間での相同的組み換えにより転写ターミネーターの切除
をもたらす。この組み換えプラスミドの発現は、B.リチ
ェニホルミス（B.licheniformis）のアルファ・アミラ
ーゼ遺伝子プロモーターから、ハイブリッド・アルファ
・アミラーゼ遺伝子を通して、テトラサイクリン耐性遺
伝子まで転写を起こし、ハイブリッド・アルファ・アミ
ラーゼとテトラサイクリン耐性のタンパク質を与えるべ
く翻訳されるポリシストロニックmRNAを生じる。このよ
うに、そのような組み換えプラスミドを含む形質転換体
は、再形質転換と５μg/mlのテトラサイクリンを含むLB
寒天プレート上での選択により選らぶことができる。
前述のものは特に好ましい具体化例について言及して
いるが、本発明を制限するものではないことが理解され
よう。種々の修正が公開した具体例に対してなされ、そ
れらの修正が本発明の範囲内にあると考えられるという
ことがこの分野に通常に精通した人々に生ずるであろ
う。次の文献目録にもとめられ、前述本文内に各々カッ
コ付の数字で書かれた参照文献が組み込まれている。
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【図面の簡単な説明】
図１はB.リチェニホルミス（B.licheniformis）とB.ス
テアロサーモフィラス（B.stearothermophilus）由来の
アルファ・アミラーゼDNA配列の部分的制限地図を描い
てある。 図2Aと2Bは、B.ステアロサーモフィラス（B.stearother
mophilus）とB.リチェニホルミス（B.licheniformis）
由来のアルファ・アミラーゼに対するヌクレオチド配列
と双方に共通する配列を記述してある。 図3aはB.ステアロサーモフィラス（B.stearothermophil
us）のアルファ・アミラーゼをコードするDNA配列を含
むプラスミドの構築を示す。 図3bはB.ステアロサーモフィラス（B.stearothermophil
us）のアルファ・アミラーゼの一部と、B.リチェニホル
ミス（B.licheniformis）のアルファ・アミラーゼの一
部をコードするDNA配列を並んだ形で含んでいるプラス
ミドの構築を示している。 図４は、３ケの１カ所切断制限部位を含む１つの合成オ
リゴヌクレオチドにより分離される枯草菌（B.subtili
s）とB.アミロリクエファシエンス（B.amyloliquefacie
ns）由来のアルカリ・プロテアーゼをコードするDNA配
列を含むプラスミドの構築を示す。 図５は時間に対する、90℃での種々のハイブリッド・ア
ルファ・アミラーゼの熱安定性を描いてある。 図６、B.ステアロサーモフィラス（B.stearothermophil
us）とB.リチェニホルミス（B.licheniformis）由来の
アルファ・アミラーゼに対するアミノ酸配列とその各々
に共通したアミノ酸配列を示している。 図７は各温度での種々のハイブリッド・アルファ・アミ
ラーゼの比活性を描いてある。 図８、ひとつの合成転写終止配列により、アルファ・ア
ミラーゼのDNA配列が分離され、テトラサイクリン耐性
をコードするDNA配列がB.ステアロサーモフィラス（B.s
tearothermophilus）由来のアルファ・アミラーゼをコ
ードする配列の３′側に位置するような、B.ステアロサ
ーモフィラス（B.stearothermophilus）とB.リチェニホ
ルミス（B.licheniformis）由来のアルファ・アミラー
ゼをコードするDNA配列を含むプラスミドの構築を示し
ている。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ１２Ｐ 21/00 9282−4Ｂ (Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 9/28 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/52 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:07）

Claims (13)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】複製可能なDNA配列、ハイブリッド酵素の
    アミノ末端部分をコードする第１のDNA配列、ハイブリ
    ッド酵素のカルボキシル末端部分をコードする第２のDN
    A配列、少なくとも１つの１カ所切断制限部位を含み第
    １と第２のDNA配列の間に存在する第３のDNA配列を含む
    環状ベクターを形成し、 レック・プラス（rec+）の第１の微生物を上記ベクター
    で形質転換して多量の上記環状ベクターを含む細胞集団
    を作り、かつ少なくとも１つの上記ベクターを交叉組換
    えして第3DNA配列を切り出し、上記ハイブリッド酵素を
    コードする上記第１と第２のDNA配列を含むハイブリッ
    ドDNAをもつ組換え環状ベクターを形成し、 上記細胞集団からの上記環状ベクター及び組換え環状ベ
    クターを単離し、 上記第3DNA配列中の１カ所切断制限部位に特異的な制限
    エンドヌクレアーゼでその単離した環状ベクター及び組
    換え環状ベクターを処理して上記環状ベクターを線状に
    し、かつ 上記の線状化したベクターと組換え環状ベクターを第２
    の微生物にさらし、上記の組換え環状ベクターをその第
    ２の微生物に形質転換すること、 を含むハイブリッドDNA配列の製造方法。
  2. 【請求項２】第3DNA配列の不在を検出することによっ
    て、組換えベクターが形質転換した第２の微生物を同定
    するステップを含む特許請求の範囲第１項に記載の方
    法。
  3. 【請求項３】ハイブリッド酵素がハイブリッドアミラー
    ゼである特許請求の範囲第１項又は第２項のいずれかに
    記載の方法。
  4. 【請求項４】ハイブリッド酵素がハイブリッドプロテア
    ーゼである特許請求の範囲第１項又は第２項のいずれか
    に記載の方法。
  5. 【請求項５】複製可能なDNA配列、第１の親ポリペプチ
    ド配列の第１の部分に対応するハイブリッド酵素のアミ
    ノ末端部分をコードする配列を切断可能な状態で結合し
    た機能的プロモーターを含む第１のDNA配列、第２の親
    ポリペプチド配列の第１の部分に対応する上記のハイブ
    リッド酵素のカルボキシル末端部分をコードする第２の
    DNA配列、及び上記第１の親ポリペプチド配列の第２部
    分と上記第２の親ポリペプチド配列の第２の部分をコー
    ドする第１と第２のDNA配列の間の第３のDNA配列を含む
    環状ベクターを形成し、 上記環状ベクターでレック・プラス微生物を形質転換し
    て多量の上記環状ベクターを含む細胞集団を作り、かつ
    少なくとも１つの上記環状ベクターの交叉組換えをして
    第3DNA配列を切り出し、上記ハイブリッド酵素をコード
    する上記の第１と第２のDNA配列を含むハイブリッドDNA
    配列を有する組換え環状ベクターを形成し、かつ 上記ハイブリッドDNA配列の発現を検出することによる
    上記組換え環状ベクターを含む形質転換体を同定するこ
    と、 を含むハイブリッドDNA配列の製造方法。
  6. 【請求項６】ハイブリッド酵素がハイブリッドアミラー
    ゼである特許請求の範囲第５項に記載の方法。
  7. 【請求項７】ハイブリッド酵素がハイブリッドプロテア
    ーゼである特許請求の範囲第５項に記載の方法。
  8. 【請求項８】第１の親ポリペプチド配列がB.ステアロサ
    ーモフィラス（B.Stearothermophilus）菌のアルファ・
    アミラーゼの全体もしくは一部であり、第１親ポリペプ
    チド配列の第１部分が上記B.ステアロサーモフィラス
    （B.Stearothermophilus）菌のアルファ・アミラーゼの
    全体もしくは一部であり、第２親ポリペプチド配列がB.
    リチェニホルミス（B.licheniformis）菌のアルファ・
    アミラーゼであり、そして、第２親ポリペプチド配列の
    第１部分が上記B.リチェニホルミス（B.licheniformi
    s）菌のアルファ・アミラーゼのカルボキシル末端部分
    である特許請求の範囲第５項に記載の方法。
  9. 【請求項９】第１親ポリペプチド配列が枯草菌（B.subt
    ilis）のアルカリ・プロテアーゼの全体もしくは一部分
    であり、第１親ポリペプチド配列の第１部分が、上記枯
    草菌（B.subtilis）のアルカリ・プロテアーゼのアミノ
    末端部分であり、第２親ポリペプチド配列がB.アミロリ
    クエファシエンス（B.amyloliquefaciens）のアルカリ
    ・プロテアーゼの全体もしくは一部であり、かつ第２親
    ポリペプチド配列の第１部分がB.アミロリクエファシエ
    ンス（B.amyloliquefacins）のアルカリ・プロテアーゼ
    のカルボキシル末端部分である特許請求の範囲第５項に
    記載の方法。
  10. 【請求項１０】複製可能なDNA配列、第１の親ポリペプ
    チド配列の第１部分に対応するハイブリッド酵素のアミ
    ノ末端部分をコードする第1DNA配列、第２親ポリペプチ
    ド配列のカルボキシル末端部分をコードする第2DNA配
    列、上記第１親ポリペプチド配列の第２部分と上記第２
    親ポリペプチド配列の第２部分をコードし、第１と第2D
    NA配列の間に存在する第3DNA配列を含むベクターであっ
    て上記第3DNA配列の交叉切り出しが可能なベクター。
  11. 【請求項１１】第3DNA配列が少なくとも１つの１カ所切
    断制限部位を含む特許請求の範囲第10項に記載のベクタ
    ー。
  12. 【請求項１２】第3DNA配列が第2DNA配列の発現を妨げる
    DNA配列を含む特許請求の範囲第10項に記載のベクタ
    ー。
  13. 【請求項１３】第2DNA配列の３′側に存在し、第3DNA配
    列を交叉切り出し可能にする、ある決まった選択特性を
    コードする第4DNA配列を更に含む特許請求の範囲第12項
    に記載のベクター。
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