DE3688920T2

DE3688920T2 - Hybride Polypeptide und Verfahren zu deren Herstellung.

Info

Publication number: DE3688920T2
Application number: DE86305057T
Authority: DE
Inventors: Gregory L Gray
Original assignee: Genencor International Inc
Current assignee: Danisco US Inc
Priority date: 1985-07-03
Filing date: 1986-06-30
Publication date: 1993-12-23
Anticipated expiration: 2006-07-01
Also published as: EP0208491B1; JPS6283891A; DE3688920D1; DE3688920T4; IE861785L; EP0208491A2; EP0208491A3; JPH0829091B2; IE59875B1; AU5945086A; ATE93541T1; US5093257A; CA1312836C

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Hybridpolypeptide und Verfahren zu deren Herstellung. Insbesondere stellt die Erfindung Verfahren zur Erzeugung von DNA-Hybridsequenzen bereit, die Hybridpolypeptide mit neuen Polypeptidsequenzen und neuen physikalischen Eigenschaften exprimieren können.
Fortschritte auf dem Gebiet der rekombinanten DNA-Technologie haben zur Klonierung verschiedener natürlich vorkommender DNA-Sequenzen und zur Expression der zugrundeliegenden rekombinanten DNA geführt, um biologische aktive rekombinante Polypeptide zu erzeugen. Menschliches Wachstumshormon wurde z. B. in E. coli durch Fusion der codierenden Sequenzen für dieses Protein mit einem Ecoli-Promotor erzeugt (1). In einem zweiten Beispiel wurde Gewebs-Plasminogenaktivator, ein weiteres seltenes menschliches Protein, ebenfalls in E. coli erzeugt (2).
Modifikationen bestimmter rekombinanter Polypeptide wurden zur Erforschung der Eigenschaften solcher modifizierter Polypeptide gemacht. Zu diesem Zweck wurden natürlich vorkommende DNA-Sequenzen kloniert und modifiziert, indem Aminosäurereste des natürlich vorkommenden Polypeptids zur Modifizierung der physikalischen Eigenschaften des rekombinanten Polypeptids deletiert oder substituiert wurden, wie z. B. durch stellenspezifische Mutagenese, wie im U.S.-Patent Nr. 4,518,584 beschrieben ist.
Rekombinante Polypeptide wurden auch durch Fusion rekombinanter DNA-Sequenzen modifiziert. Die Signalsequenz einer aus einem Plasmid stammenden beta-Lactamase wurde beispielsweise am Aminoterminus von Proinsulin über eine gebräuchliche Restriktionsstelle eingeführt, um die Ausscheidung von Proinsulin zu erleichtern (3).
Zwei unterschiedliche menschliche alpha-Interferon-DNA-Sequenzen wurden mittels einer gemeinsamen Restriktionsstelle zur Bildung einer DNA-Sequenz kombiniert, die Sequenzen aus alpha-1-Interferon und alpha-2-Interferon enthält, wie von Weissman (4) beschrieben. Die durch eine solche fusionierte alpha-Interferon-DNA-Sequenz exprimierten alpha-Interferone zeigten jedoch eine beschränkte biologische Wirksamkeit.
Eine starke Beschränkung bei der Erzeugung modifizierter Polypeptide durch Kombination der zugrundeliegenden DNA an einer Restriktionsstelle, an mehr als einer Restriktionsstelle mittels eines synthetischen Verbrückungsoligonucleotids oder durch Kombination synthetischer Oligonucleotide zur Bildung der gesamten modifizierten DNA-Sequenz beruht auf dem enormen Arbeitsaufwand, der zur Erzeugung eines bestimmten modifzierten rekombinanten Polypeptids erforderlich ist. Solche Modifikationen erfordern z. B. Kenntnis der DNA- und/oder Polypeptidsequenz, die, sofern sie nicht verfügbar ist, bestimmt werden muß. Weiterhin ist, selbst wenn solche Sequenzen bekannt sind, die Aufgabe der Erzeugung eines modifizierten Polypeptids keineswegs einfach und kann zu einem biologisch inaktiven Molekül führen.
Weber et al. (5) offenbaren ein Verfahren zur Herstellung modifizierter Gene durch in vivo Rekombination zwischen DNA- Sequenzen, die für eine menschliche alpha-1- und alpha-2- Interferon-Sequenz kodieren. Eine lineare DNA-Sequenz, die einen vom alpha-2-Interferon-Gen am 5'-Ende und einem Teil des alpha-1-Interferon-Gens am 3'-Ende flankierten Plasmidvektor enthielt, wurde zur Transfektion eines rec A-positiven E. coli-Stammes verwendet. Die Zirkularisierung des linearen Plasmids durch in vivo Rekombination zwischen den teilweise homologen Interferon-Gensequenzen ergab eine Anzahl modifizierter Interferon-Gene, die unterschiedliche Teile der alpha-1- und alpha-2-Interferon-Gensequenzen enthielten. Weber berichtet, daß einige dieser modifizierten alpha-Interferon-Gene modifizierte alpha-Interferone mit einer biologischen Aktivität exprimierten, die ähnlich wie die von unmodifizierten alpha-2-Interferonen war. Tommassen et al., (1985) The EMBO Journal 4: 1583-1587 offenbaren ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung modifizierter Gene durch in vivo Rekombination zwischen DNA-Sequenzen auf einem linearen Plasmid.
Die Wirksamkeit der Erzeugung modifizierter Gene und Polypeptide durch in vivo Zirkularisierung (Rekombination) linearer Plasmide, wie von Weber (5) offenbart, ist durch die relative Ineffizienz von linearen Plasmiden zur Transfektion von Mikroorganismen im Vergleich zu zirkulären Plasmiden beschränkt. Weiterhin sind die zwei unterschiedlichen, aber verwandten Gene auf solchen linearen Plasmiden immer durch eine replizierbare Plasmidsequenz getrennt. Die Zirkularisierung erfordert, daß die Enden des die beiden Gene enthaltenden Vektors überlappen, so daß die beiden Gene in nahe Nachbarschaft miteinander gebracht werden. Die Wirksamkeit der Rekombination kann daher durch die Linearität solcher Plasmidkonstrukte begrenzt sein.
Schneider et al. (1981) PNAS 7: 2169-2173 offenbaren die Herstellung von Tryptophansynthetase-α-Hybriduntereinheiten, die durch intragene Rekombination zweier unterschiedlicher Gene auf zwei getrennten und separaten Plasmiden gebildet werden.
Wir haben jetzt zirkuläre Vektoren, die replizierbare DNA- Sequenzen und für mindestens zwei unterschiedliche Ausgangspolypeptide codierende DNA-Sequenzen enthalten, und rekombinierte zirkuläre Vektoren entwickelt, welche die replizierbaren DNA-Sequenzen und eine DNA-Sequenz enthalten, die für ein Hybridpolypeptid codiert und einem Teil eines jeden Ausgangspolypeptids entspricht.
Wir haben jetzt wirksame Verfahren zur Herstellung solcher rekombinierter zirkulärer Vektoren und Hybridpolypeptide sowie weitere Verfahren zur Isolierung solcher rekombinierter zirkulärer Vektoren entwickelt.
Wir haben weiterhin biologisch aktive Hybridpolypeptide, die Segmente von aus mindestens zwei Ausgangspolypeptiden stammende Polypeptidsequenzen enthalten, sowie biologisch aktive Hybridenzyme, wie etwa Hybridamylasen und Hybridproteasen bereitgestellt.
Es werden neue zirkuläre Vektoren offenbart, die eine replizierbare DNA-Sequenz und vollständig oder teilweise für mindestens zwei unterschiedliche Ausgangspolypeptide codierende DNA-Ausgangssequenzen enthalten. Solche Vektoren werden in neuen Verfahren zur Erzeugung rekombinierter zirkulärer Vektoren verwendet, welche die replizierbaren DNA-Sequenzen und DNA-Hybridsequenzen enthalten, umfassend: (1) eine erste DNA- Sequenz, die für den aminoterminalen Abschnitt eines Hybridpolypeptids codiert, entsprechend einem ersten Teil einer ersten Polypeptid-Ausgangssequenz und (2) eine zweite DNA- Sequenz, die für einen carboxyterminalen Abschnitt des Hybridpolypeptids codiert, entsprechend einem ersten Teil einer zweiten Polypeptid-Ausgangssequenz.
Erste und zweite DNA-Ausgangssequenzen, die vollständig oder teilweise für eine erste und zweite Polypeptid-Ausgangssequenz codieren, werden mit einer replizierbaren DNA-Sequenz ligiert, um einen zirkulären Vektor zu bilden, worin die DNA- Ausgangssequenzen in Nachbarschaft zueinander sind. Mit dem so gebildeten zirkulären Vektor werden rec-positive Mikroorganismen transformiert, um eine Zellpopulation zu bilden, die eine Vielzahl des zirkulären Vektors enthält, worin eine Crossover-Rekombination von mindestens einem der zirkulären Vektoren durch den natürlich vorkommenden Rekombinationsmechanismen des rec-positiven Mikroorganismus vermittelt wird. Eine solche Crossover-Rekombination des Vektors schneidet eine dritte DNA-Sequenz heraus, welche für einen zweiten Teil von jeder der ersten und zweiten Polypeptid-Ausgangssequenzen codiert, um einen rekombinierten zirkulären Vektor zu bilden, der die replizierbaren DNA-Sequenzen und die DNA-Hybridsequenzen enthält, welche für einen ersten Teil von jeder der ersten und zweiten Polypeptid-Ausgangssequenzen codieren. Solche rekombinierten Vektoren können in der Lage sein, neue Hybridpolypeptide zu exprimieren, oder sie können weiter modifiziert werden, um eine solche Expression zu ermöglichen.
Bei einer Variation des oben beschriebenen Verfahrens verwendet man eine singuläre Restriktionsstelle, die innerhalb der dritten DNA-Sequenz enthalten ist. Das Herausschneiden der dritten DNA-Sequenz erzeugt einen rekombinierten zirkulären Vektor, der die singuläre Restriktionsstelle nicht länger enthält. Eine Behandlung von isoliertem zirkulärem Vektor und rekombiniertem zirkulärem Vektor mit einer für diese singuläre Restriktionsstelle spezifischen Endonuklease erzeugt linearisierten Vektor und zirkulären rekombinierten Vektor. Der zirkuläre rekombinierte Vektor wird vom linearisierten Vektor isoliert, indem ein Mikroorganismus mit solchen Vektoren in Kontakt gebracht wird, um den Mikroorganismus mit dem rekombinierten zirkulären Vektor zu transformieren.
Es wird auch ein Verfahren offenbart, worin die dritte DNA- Sequenz eine DNA-Sequenz umfaßt, welche die Expression der zweiten DNA-Sequenz verhindert. Solche Sequenzen sind typischerweise Transkriptionsterminationssequenzen. Eine funktionelle Promotorsequenz ist operativ mit der ersten DNA-Sequenz verknüpft. Bei Herausschneiden der dritten DNA-Sequenz durch einen rec-positiven Mikroorganismus wird ein Hybridpolypeptid exprimiert. Eine solche Expression kann zur Identifizierung von Transformanten verwendet werden, welchen den rekombinierten Vektor enthalten.
Dieses letztgenannte Verfahren kann weiterhin modifiziert werden, indem man eine vierte DNA-Sequenz in 3'-Position zur zweiten DNA-Sequenz anbringt. Diese vierte DNA-Sequenz codiert für ein definiertes Selektionsmerkmal, wie etwa Tetracyclinresistenz, das zur Isolierung von Transformanten verwendet werden kann, welche den rekombinierten Vektor enthalten und als Ergebnis des Herausschneidens der dritten DNA- Sequenz die definierten Selektionsmerkmale exprimieren.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 zeigt eine partielle Restriktionskarte der aus B. licheniformis und B. stearothermophilus stammenden α-Amylase- DNA-Sequenzen.
Fig. 2A, 2B und 2C neigen die Nucleotidsequenz für die aus B. stearothermophilus und B. licheniformis stammenden α-Amylasen und deren Consensussequenz.
Fig. 3a zeigt die Konstruktion eines Plasmids, das für die α-Amylase von B. stearothermophilus codierende DNA-Sequenzen enthält.
Fig. 3b zeigt die Konstruktion eines Plasmids, das eine Tandemanordnung von DNA-Sequenzen enthält, die für einen Teil der B. stearothermophilus-α-Amylase und einen Teil der B. licheniformis-α-Amylase codieren.
Fig. 4 zeigt die Konstruktion eines Plasmids, das DNA-Sequenzen enthält, die für Alkalische Proteasen aus B. subtilis und B. amyloliquefaciens codieren, die durch ein drei singuläre Restriktionsstellen enthaltende s synthetisches Oligonucleotid getrennt sind.
Fig. 5 zeigt die thermische Stabilität verschiedener Hybridα-Amylasen bei 90ºC als Funktion der Zeit.
Fig. 6A und 6B zeigen die Aminosäuresequenz für die aus B. stearothermophilus und B. licheniformis stammenden α-Amylasen und deren Aminosäure-Consensussequenz.
Fig. 7 zeigt die spezifische Aktivität verschiedener Hybridα-Amylasen bei unterschiedlichen Temperaturen.
Fig. 8 zeigt die Konstruktion eines Plasmids, das DNA-Sequenzen enthält, die für α-Amylasen aus B. stearotherinophilus und B. licheniformis codieren, worin die α-Amylase-DNA-Sequenzen durch eine synthetische Transkriptionsterminationssequenz getrennt sind, und eine für die Tetracyclinresistenz codierende DNA-Sequenz in 3'-Position zu den für die α-Amylase aus B. stearothermophilus codierenden Sequenzen angeordnet ist.

Ausführliche Beschreibung

Der Erfinder hat gezeigt, daß neue Hybridpolypeptide mit einer einzigartigen biologischen Aktivität durch homologe Crossover-Rekombination von auf einem zirkulären Vektor enthaltenen DNA-Sequenzen erzeugt werden können. DNA-Ausgangssequenzen, die vollständig oder teilweise für mindestens zwei unterschiedliche Polypeptide codierten, wurden mit einer replizierbaren DNA-Sequenz zur Bildung eines zirkulären Vektors ligiert. Die DNA-Ausgangssequenzen können in Tandembeziehung verknüpft werden, wobei die Sequenzen sehr nahe beisammen sind, oder sie können an unterschiedlichen Positionen im zirkulären Vektor eingesetzt werden, um ihre Nähe zu variieren. Eine solche Variation in der Nähe kann zur Kontrolle der Wirksamkeit der Rekombination nützlich sein oder physikalische Beschränkungen auferlegen, welche die Bereiche in solchen DNA-Ausgangssequenzen beschränken, in denen eine Rekombination auftreten kann. Es wurde angenommen, daß mit dem so ligierten zirkulären Vektor transformierte rec-positive Mikroorganismen die Crossover-Rekombination in Bereichen von Sequenzhomologie zwischen den DNA-Ausgangssequenzen initiieren. Es wurden rekombinierte zirkuläre Vektoren gebildet, welche DNA-Hybridsequenzen enthalten, die unterschiedliche Teile von jeder DNA-Ausgangssequenz enthalten. Die tatsächliche Crossover-Stelle entsprach nicht notwendigerweise denjenigen Bereichen der DNA-Ausgangssequenzen, die homolog waren, da eine solche Homologie nur notwendig zur Initiierung einer Crossover-Rekombination ist. Diese DNA-Hybridsequenzen codierten für biologisch aktive Polypeptide, die unterschiedliche aminoterminale und carboxyterminale Abschnitte enthielten, die aus jedem der Ausgangspolypeptide stammten.
Wie hier verwendet, bedeutet ein "Hybridpolypeptid" rekombinante Polypeptide mit einer Aminosäuresequenz, die eine Kombination von aus mindestens zwei Aminosäure-Ausgangssequenzen stammenden Teilsequenzen ist. In manchen der offenbarten unterschiedlichen bevorzugten Ausführungsformen enthielten Hybridpolypeptide einen variablen Anteil der aus einer spezifischen B. stearothermophilus-α-Amylase stammenden aminoterminalen Peptidsequenz und einer aus einer spezifischen B. licheniformis-α-Amylase stammenden carboxyterminalen Peptidsequenz. Andere Ausführungsformen offenbaren Hybridpolypeptide, die variable Anteile an aus einer spezifischen Alkalischen Protease von B. subtilis stammenden aminoterminalen Sequenzen und aus einer spezifischen Alkalischen Protease von B. amyloliquefaciens stammenden carboxyterminalen Aminosäuresequenzen enthalten.
Diese spezifischen Ausführungsformen sind zur Veranschaulichung angegeben und sollen den Umfang der vorliegenden Erfindung nicht beschränken. Insbesondere können α-Amylasen oder alkalische Proteasen aus anderen als den spezifisch offenbarten Quellen bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Solche Ausgangspolypeptide umfassen z. B. α- Amylasen, die aus B. coagulans (z. B. ATCC 7050), B. amyloliquefaciens (z. B. ATCC 23842), B. megaterium (z. B. ATCC 6458), B. alcalophilus (z. B. ATCC 21591) und B. cereus (z. B. ATCC 21768) stammen. Beispiele anderer alkalischer Proteasen umfassen diejenigen, die aus B. licheniformis (z. B. ATCC 21415), B. alcalophilus (z. B. ATCC 21522) und B. cereus (z. B. ATCC 21768) stammen.
Allgemein kann die vorliegende Erfindung auch zur Erzeugung von Hybridpolypeptiden verwendet werden, indem Aminosäuresequenzen von verwandten oder nicht-verwandten Polypeptiden kombiniert werden. Verwandte Aminosäuresequenzen enthaltende Hybridpolypeptide können einzigartige physikalische Eigenschaften zeigen, während Hybride von nicht-verwandten Polypeptiden ein bifunktionelles Hybridpolypeptid erzeugen können. Die einzige Beschränkung bei der Auswahl von Ausgangspolypeptiden ist funktionell. Die zugrundeliegenden DNA- Sequenzen, die für jedes der Ausgangspolypeptide codieren, müssen eine ausreichende Sequenzhomologie besitzen, um eine in vivo Rekombination zu ermöglichen.
Beispiele verschiedener Ausgangspolypeptide, die gemäß vorliegender Erfindung kombiniert werden können, umfassen Plasminogenaktivatoren, Wachstumshormone, Interferone, Lymphotoxine, Aspartylproteasen, B. thuringiensis-Toxine, Cellulosen und Glucoamylasen.
Eine "DNA-Hybridsequenz" ist eine DNA-Sequenz, die für die oben beschriebenen Hybridpolypeptide codiert. In manchen offenbarten Ausführungsformen umfassen solche DNA-Hybridsequenzen weiterhin einen funktionellen Promotor, der operativ mit der DNA-Hybridsequenz verknüpft ist, wodurch das von der zugrundeliegenden Hybrid-DNA codierte Hybridpolypeptid exprimiert werden kann. Solche Promotoren können der native Promotor einer DNA-Ausgangssequenz sein, oder sie können aus dem Fachmann bekannten Quellen stammen und durch wohlbekannte Methoden funktionell eingeführt worden sein, um eine Expression des Hybridpolypeptids zu bewirken. In manchen Ausführungsformen ist eine Promotorsequenz zur Erzeugung einer DNA- Hybridsequenz nicht erforderlich. Eine Promotorsequenz kann in solche rekombinierte Vektoren nach Rekombination eingeführt werden, um Expression der DNA-Hybridsequenz zu ermöglichen.
Eine "DNA-Ausgangssequenz" bezeichnet eine DNA-Sequenz, die für eine bestimmte Polypeptidsequenz vollständig oder teilweise codiert. Wie hier offenbart, wird ein erster Teil aus mindestens zwei DNA-Ausgangssequenzen in vivo rekombiniert, um eine für ein Hybridpolypeptid codierende DNA-Sequenz zu bilden. Abhängig von der speziellen Ausführungsform wird ein zweiter Teil jeder DNA-Ausgangssequenz während der Bildung der DNA-Hybridsequenz herausgeschnitten.
Ein "rec-positiver Mikroorganismus" bezeichnet Genotypen von prokaryontischen und eukaryontischen Mirkoorganismen, die zur Rekombination in der Lage sind und insbesondere zur Vermittlung der Rekombination des zirkulären Vektors gemäß vorliegender Erfindung in der Lage sind. Solche Mikroorganismen umfassen im allgemeinen Prokaryonten, wie etwa Bacillus, E. coli und andere Spezies der Enterobacteriaciae-Bakterien, Pseudomonas, Corynebacteria, Lactobacilli, Streptomyces und Aarobacterium und Eukaryonten, wie etwa Saccharomyces cerevisiae und andere bekannte Hefen, Aspergillus und andere filamentartige Pilze und Gewebekulturzellen aus Vogel- oder Säugerquellen.
Die "replizierbaren DNA-Sequenzen", die einen Teil des zirkulären Vektors und rekombinierten Vektors gemäß vorliegender Erfindung bilden, enthalten Replikations- und Kontrollsequenzen, die aus einer Vektorspezies stammen, welche mit dem jeweiligen zur Vermittlung der in vivo Rekombination verwendeten rec-positiven Mikroorganismus kompatibel sind. Solche replizierbaren DNA-Sequenzen enthalten normalerweise eine Replikationsstelle sowie für Proteine codierende Sequenzen, die in der Lage sind, für eine phänotypische Selektion in transformierten Zellen zu sorgen. Wenn man beispielsweise einen rec-positiven E. coli für eine in vivo Rekombination auswählt, können DNA-Sequenzen verwendet werden, die aus pBS42 (17) (ATCC # 37279), pBR322 (25) (ATCC # 37017), Plasmiden der pUC-Serie (26) und RSF1010 (44) stammen. Wenn man einen rec-positiven Eukaryonten wie etwa Saccharomyces, Aspergillus oder Säuger-Gewebekulturzellen verwendet, können replizierbare DNA-Sequenzen aus dem Hefe-2-u-Vektor (35), dem Aspergillus-Integrationsvektor p3SR2 (36) bzw. SV40 (37) stammen.
Wie hier verwendet, bedeutet ein mit einer codierenden DNA- Sequenz operativ verknüpfter funktioneller Promotor eine Promotorsequenz, welche die Transkription und Translation der codierenden Sequenz kontrolliert. Die Promotorsequenz wird so gewählt, daß sie in dem zur Expression gewählten Mikroorganismus funktionell ist. Beispielsweise können Promotorsequenzen (einschließlich ribosomaler Bindestellen), die aus Lambda PL (38) stammen, sowie die trp (39) oder tac (40) Promotoren operativ mit codierenden Sequenzen verknüpft werden, um ein Polypeptid in E. coli zu exprimieren. Wenn B. subtilis der Expressionswirt ist, kann man den B. subtilis-Alkalische Proteasepromotor (32) oder den α-Amylasepromotor von B. amyloliquefaciens (41) verwenden. Die Expression in Hefe kann unter Kontrolle des Promotors für GAPDM von S. cerevisiae (42) erfolgen, während die Expression in filamentartigen Pilzen durch den Promotor für B-Glucosidase aus Aspergillus niger (43) vermittelt werden kann. Der frühe Promotor von SV40 (37) ist zur Expression in Säugerzellen bevorzugt.

Allgemeine Methoden

"Verdau" von DNA bedeutet katalytische Spaltung der DNA mit einem Enzym, das nur an bestimmten Stellen in der DNA wirkt. Solche Enzyme werden als Restriktionsenzyme bezeichnet und die Stellen, für die sie jeweils spezifisch sind, werden als Restriktionsstelle bezeichnet. "Partieller" Verdau bedeutet einen unvollständigen Verdau durch ein Restriktionsenzym, d. h. die Bedingungen werden so gewählt, daß sie zu einer Spaltung von einigen, aber nicht allen Stellen für eine gegebene Restriktionsendonuklease in einem DNA-Substrat führen. Die hier verwendeten verschiedenen Restriktionsenzyme sind kommerziell erhältlich und ihre Reaktionsbedingungen, Cofaktoren und anderen Erfordernisse wurden, wie von den Enzymherstellern angegeben, verwendet. Im allgemeinen wird etwa 1 ug Plasmid oder DNA-Fragment mit etwa 1 Einheit Enzym und etwa 20 ul Pufferlösung verwendet. Geeignete Puffer und Substratmengen für die jeweiligen Restriktionsenzyme sind vom Hersteller angegeben. Normalerweise werden Inkubationszeiten von etwa 1 Stunde bei 37ºC verwendet, sie können aber gemäß den Vorschriften des Herstellers variieren. Nach Inkubation wird Protein durch Extraktion mit Phenol und Chloroform entfernt und die verdaute Nucleinsäure wird aus der wäßrigen Fraktion durch Präzipitation mit Ethanol gewonnen. An den Verdau mit einem Restriktionsenzym kann sich eine Hydrolyse der 5'-terminalen Phosphate durch eine bakterielle Alkalische Phosphatase anschließen, um zu verhindern, daß die beiden Restriktions-gespaltenen Enden eines DNA-Fragment s eine geschlossene Schleife bilden, welche die Insertion eines anderen DNA-Fragments an der Restriktionsstelle erschwert.
"Gewinnung" oder "Isolierung" eines gegebenen DNA-Fragment s aus einem Restriktionsverdau bedeutet Auftrennung des Verdaus durch eine Polyacrylamid-Gelelektrophorese, Identifizierung des interessierenden Fragments durch Vergleich seiner Mobilität mit der von DNA-Markerfragmenten mit bekanntem Molekulargewicht, Entfernung des das gewünschte Fragment enthaltenden Gelabschnitts und Entfernung der DNA aus dem Gel im allgemeinen durch Elektroelution (6, 7).
"Ligation" bezeichnet das Verfahren zur Bildung von Phosphodiesterbindungen zwischen zwei doppelsträngigen Nucleinsäurefragmenten (8). Sofern nichts anderes angegeben ist, erfolgte die Ligation unter Verwendung bekannter Puffer in Bedingungen mit 10 Einheiten T4 DNA-Ligase ("Ligase") pro 0,5 ug etwa äquimolarer Mengen der zu ligierenden DNA-Fragmente.
"Transformation" bedeutet das Einbringen von DNA in einen Organismus derart, daß die DNA replizierbar ist, entweder als extrachromosomales Element oder als chromosomaler Integrant. Sofern nichts anderes angegeben ist, ist die hier verwendete Methode zur Transformation von E. coli die CaCl&sub2;-Methode von Mandel (9) und für Bacillus die Methode von Anagnostopolous (10).
"Oligonucleotide" sind kurze einzel- oder doppelsträngige Polydeoxynucleotide, die chemisch nach der Methode von Crea et al. (11) synthetisiert und dann auf Polyacrylamidgelen gereinigt wurden.
"Präparation" von DNA aus Transformanten bedeutet die Isolierung von Plasmid-DNA aus einer mikrobiellen Kultur. Sofern nichts anderes angegeben ist, wurde die Alkali/SDS-Methode verwendet (12).
Die folgenden spezifischen Beispiele sollen die Natur der vorliegenden Erfindung ausführlicher erläutern, ohne als Beschränkung ihres Umfangs zu wirken.

Beispiele bevorzugter Ausführungsformen

In einem Beispiel einer bevorzugten Ausführungsform wurden B. stearothermophilus-α-Amylase-DNA-Sequenzen, die den nativen Promotor für B. stearothermophilus-α-Amylase in operativer Verknüpfung mit der gesamten für. B. stearothermophilus-α- Amylase codierenden DNA-Sequenz enthalten, kloniert und isoliert. Die für die α-Amylase von B. licheniformis codierende DNA-Sequenz wurde auf ähnliche Weise kloniert.
Es wurden eine PstI-Restriktionsstelle nahe dem 5'-Ende der für B. licheniformis-α-Amylase codierenden DNA-Struktursequenz und eine PstI-Restriktionsstelle nahe dem 3'-Ende der für B. stearothermophilus-α-Amylase codierenden DNA-Struktursequenz zur Ligation von DNA-Sequenzen verwendet, die jeweils für die Ausgangsamylasen in einer Tandemanordnung auf einem zirkulären Vektor codieren.
Durch einen rec-positiven Mikroorganismus wurde eine homologe Crossover-Rekombination zwischen der α-Amylase-DNA-Sequenz unter Bildung von DNA-Hybridsequenzen vermittelt, die für eine Anzahl von aus B. licheniformis und B. stearothermophilus stammender Hybridamylasen codieren. Derartige DNA-Hybridsequenzen enthaltende Transformanten wurden durch Nachweis von Hybrid-α-Amylaseaktivität identifiziert.
In einem Beispiel einer anderen Ausführungsform wurde ein Vektor, der keine homologe Crossover-Rekombination eingegangen war, durch Verdau mit PstI linearisiert. Vektoren, die unter Bildung einer für Hybrid-α-Amylasen codierenden DNA- Hybridsequenz rekombiniert hatten, enthielten nicht mehr die zur Verknüpfung der beiden α-Amylase-DNA-Sequenzen verwendete PstI-Stelle. Da diese PstI-Stelle auf dem hergestellten Vektor singulär war, wurde der rekombinierte Vektor nicht linearisiert. Ein solcher nicht-linearisierter rekombinierter Vektor wurde durch Transformation eines zweiten Organismus vom linearisierten Vektor isoliert.
In beiden Ausführungsformen erzeugte die Crossover-Rekombination, die an homologen Sequenzen der für B. stearothermophilus- und B. licheniformis-α-Amylase codierenden DNA-Sequenzen initiiert wurde, mutierte Vektoren, die DNA-Hybridsequenzen enthalten, die für den Promotor von B. stearothermophilus-α- Amylase, unterschiedliche Abschnitte der aminoterminalen Sequenz von B. stearothermophilus-α-Amylase und unterschiedliche Abschnitte der carboxyterminalen Sequenz von B. licheniformis-α-Amylase codieren. Die unterschiedlichen, durch solche DNA-Hybridsequenzen exprimierten Hybrid-α-Amylasen zeigten im Vergleich zu den Ausgangs-α-Amylasen aus B. stearothermophilus und B. licheniformis neuartige Eigenschaften. Auch andere Beispiele bevorzugter Ausführungsformen werden offenbart.

BEISPIEL 1

A. Klonierung der α-Amylasegene von Bacillus licheniformis und Bacillus stearothermophilus

B. licheniformis- oder B. stearothermophilus-DNA wurde partiell mit Sau3A verdaut, und DNA-Fragmente mit größer als 6 kb (Kilobasen) wurden auf Saccharosegradienten abgetrennt. Der als Quelle für genomische DNA verwendete B. licheniformis-Stamm war der von der National Collection of Industrial Bacteria, Torrey Research Station, Aberdeen, Schottland erhaltene Stamm MCIB 8061. Der als Quelle für genomische DNA verwendete B. stearothermophilus-Stamm war der Stamm NZ-3, der von der Anmelderin bei der American Type Culture Collection unter der Hinterlegungsnummer 39536 hinterlegt wurde. Der Bacteriophage Lambda-Vektor λ1059 (13) wurde mit BamHI vollständig verdaut und zur Minimierung der Selbstligation mit Phosphatase aus Kälberdarm behandelt. 500 ng Vektor und 500 ng bakterielle DNA-Fragmente wurden unter Verwendung von T4-DNA-Ligase in einem Reaktionsvolumen von 20 ul ligiert. Die in der Reaktion enthaltene DNA wurde in vitro unter Verwendung eines kommerziellen (Promega Biotec) (Madison, WI) Verpackungsextrakts (14) verpackt und dann zur Infektion von E. coli Q358 (15) (6) und Q359 (ein P2-Lysogen von Q358) (15) verwendet. Die Anzahl von rekombinanten Plaques war bei typischen Reaktionen etwa 2,5·10³.
Etwa 5·10³ Plaques wurden über E. coli Q359-Bakterien auf LB-Platten mit 0,5% Stärke ausplattiert, um auf α-Amylase- Aktivität zu testen. Diese Platten wurden zur Markierung der Stärke mit Joddämpfen behandelt (16). Es wurden 5 von klaren Halos umgebene Plaques in der B. licheniformis-Bank gefunden. In der B. stearothermophilus-Bank wurden 3 solcher Plaques gefunden. Aus jedem der Amylase-positiven B. licheniformis- Phagen (als λ-amy-BL bezeichnet) und der B. stearothermophilus-Phagen (als λ-amy-BS bezeichnet) wurde DNA präpariert.
Unter Verweisung auf Fig. 3B wurde der E. coli-B. subtilis- Shuttle-Vektor pBS42 (17), ATCC 37279, mit BamHI oder EcoRI gespalten und zur Minimierung von Selbstligation mit Alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm behandelt. Dieser gespaltene Shuttle-Vektor wurde mit DNA aus λ-amy-BL ligiert, die ebenfalls mit BamHI bzw. EcoRI verdaut worden war. Eine Transformation von E. coli 294 (18), ATCC Nr. 31446, führte zum Entstehen von zahlreichen Chloramphenicol-resistenten Transformanten, von denen bei Anfärbung mit Joddämpfen viele klare Halos zeigten. Ein Verdau aller Amylase-positiven (amy+) BamHI- und EcoRI-Subklone ergab insertierte Fragmente von 9,4 kb bzw. 3,2 kb. Diese Ergebnisse zeigen, daß das α-Amylasegen von B. licheniformis vollständig auf jedem dieser Fragmente enthalten war. Der EcoRI-Subklon wurde mit pBS42-BL bezeichnet und ist in Fig. 3B gezeigt.
Das Plasmid pBS42-BL wurde weiteren Verdaus mit unterschiedlichen Restriktionsenzymen ausgesetzt, um die in Fig. 1 gezeigte Restriktionskarte herzustellen. Verschiedene Subfragmente der insertierten DNA wurden in M13-Sequenzierungsvektoren (19) kloniert, um durch die Dideoxykettenterminationsmethode (21) vorläufige DNA-Sequenzinformationen zu erhalten. Es wurde festgestellt, daß Sequenzen nahe der singulären KpnI-Stelle eine hohe Homologie zu denjenigen des α-Amylasegens von B. amyloliquefaciens zeigten. Wenn man annimmt, daß das B. licheniformis-Amylasegen mit dem B. amyloliquefaciens-Gen (41) strukturell ähnlich ist, konnten die entsprechenden Fragmente zur detaillierten Sequenzierung einfach ausgewählt werden. Fig. 1 zeigt die vollständig sequenzierten Bereiche. Es wurde ein offener Leserahmen von 1536 bp gefunden, der einen hohen Homologiegrad zum gesamten α-Amylasegen aus B. amyloliquefaciens hatte. Die DNA-Sequenz von B. licheniformis-α-Amylase ist in den Fig. 2A und 2B gezeigt.
DNA aus λ-amy-BS wurde mit unterschiedlichen Restriktionsenzymen gespalten, auf einem 1% Agarosegel aufgetrennt, auf ein Nitrocellulosefilter transferiert (21) und einer DNA-DNA- Hybridisierung unterzogen (22). Die verwendete Sonde war das PstI-SstI-Fragment, das den Großteil der codierenden Sequenzen des B. licheniformis-α-Amylasegens enthält (Fig. 1). Dieses Fragment wurde unter Verwendung der Nick-Translationsmethode (23) mit γ-³²P radioaktiv markiert. Die Hybridisierung erfolgte unter hochstringenten Standardbedingungen (24). Unter den positiv hybridisierenden Fragmenten waren ein BamHI-Fragment von 1,8 kb und ein SalI-Fragment von 1,8 kb. Diese beiden Fragmente wurden in pBR322 subkloniert und mit BamHI oder SalI gespalten und mit BamHI- oder SalI-verdautem pBR322 ligiert, um, wie in Fig. 3A gezeigt, die Plasmide pBR322BS-B und pBR322BS-S zu erzeugen. Eine detaillierte Restriktionskarte der insertierten Fragmente in Fig. 1 gezeigt. Diese Information wurde zur Isolierung einer Reihe von Subfragmenten für eine Klonierung in M13-Sequenzierungsvektoren für eine vorläufige DNA-Sequenzanalyse verwendet. Es wurden Sequenzen nahe der singulären KpnI-Stelle gefunden, die eine hohe Homologie zu denjenigen der α-Amylasegene sowohl von B. amyloliquefaciens als auch von B. licheniformis zeigten. Unter der Annahme, daß die Struktur des B. stearothermophilus-α-Amylasegens mit den anderen beiden ähnlich ist, war es möglich auszuwählen, welche anderen Subfragmente der insertierten Fragmente in pBR322BS-B und pBR322BS-S vollständig zu sequenzieren waren. Die komplette Sequenz der B. tea thermo hilus-α-Amylase ist in den Fig. 2A und 2B gezeigt. Diese Untersuchungen ergaben einen offenen Leserahmen von 1581 bp, der eine hohe Homologie zu denjenigen der anderen α-Amylasegene zeigte.

B. Herstellung des B. stearothermophilus-α-Amylase-Plasmidvektors pUc13BS und der B. stearothermophilus-B. licheniformis-α-Amylase-Vorläuferplasmide puC13BSBL und pBS4 2BSBL

Wie in Fig. 3A gezeigt, wurde DNA aus pBR322BS-B mit BamHI verdaut, und es wurde ein 1,8 kb Fragment (Fragment A) isoliert. Das Plasmid pBR322BS-S wurde doppelt mit BamHI und SalI verdaut, und es wurde ein 1,8 kb Fragment (Fragment B) isoliert. Das Plasmid pBR322 wurde doppelt mit BamHI und SalI verdaut, und es wurde das größere Vektorfragment (Fragment C) isoliert. Die Fragmente A, B und C wurden durch Ligation verknüpft. Die Reaktion wurde in E. coli 294 transformiert. Es wurde eine Ampicillin-resistente, das Plasmid pBR322BS enthaltende Kolonie isoliert. Dieses Plasmid wurde vollständig mit HindIII und partiell mit SalI verdaut, und es wurde ein 4,2 kb Fragment (Fragment D) isoliert. Der Vektor pUc13 (26) wurde mit HindIII und SalI verdaut, und das größere Vektorfragment (Fragment E) wurde isoliert. Die Fragmente D und E wurden durch Ligation verknüpft und in E. coli 294 transformiert. Es wurde eine Ampicillin-resistente, das Plasmid pUc13BS enthaltende Kolonie isoliert. Es wurde gefunden, daß diese Kolonie auf einer LB-Stärke-Agarplatte einen klaren Bereich erzeugte und daher vermutlich auf ihrem Plasmid das gesamte Gen von B. stearothermophilus-α-Amylase enthielt.
Unter Bezugnahme auf Fig. 3B wurde das B. licheniformis-α- Amylaseplasmid pBS42BL mit SstI und PstI gespalten, und das kleinere Fragment (Fragment F) wurde isoliert. Das B. stearothermophilus-Plasmid puc13BS wurde auch mit SstI und PstI gespalten, und es wurde das größere Vektorfragment (Fragment G) isoliert. Die Fragmente F und G wurden durch Ligation verknüpft und dann zur Transformation von E. coli 294 verwendet. Es wurde eine Ampicillin-resistente, das Plasmid pUC13BSBL enthaltende Kolonie ausgewählt. Diese Kolonie erzeugte keine aktive α-Amylase, was dadurch bestimmt wurde, daß sie keinen klaren Halo auf einer LB-Stärke-Agarplatte erzeugen konnte. Dieses Ergebnis entsprach den Erwartungen, da pUc13BSBL die carboxyterminalen Kodons des B. stearothermophilus-α-Amylasegens und auch die aminoterminalen Kodons des B. licheniformis-α-Amylasegens nicht enthält. Weiterhin sind die Kodons des letztgenannten Gens nicht im gleichen Leserahmen wie diejenigen des erstgenannten Gens. Das Plasmid pUc13BSBL wurde vollständig mit BamHI gespalten und partiell mit EcoRI verdaut. Es wurde das Fragment H isoliert. Der E. coli-B. subtilis-Shuttle-Vektor pBS42 wurde mit BamHI und EcoRI verdaut, und es wurde das größere Vektorfragment (Fragment I) isoliert. Die Fragmente H und I wurden durch Ligation verknüpft und in E. coli 294 transformiert. Es wurde eine Chloramphenicol-resistente Transformante, pBS42BSBL, erhalten. Diese Kolonie erzeugte keine α-Amylase, was dadurch bestimmt wurde, daß sie auf LB-Stärke-Agarplatten keinen Halo von Stärkeklarheit erzeugen konnte. Dies entsprach den Erwartungen, da dieses Plasmid die gleichen α-Amylasesequenzen wie pUc13BSBL enthält.

C. Erzeugung von α-Amylase-DNA-Hybridsequenzen und Expression ihrer codierenden Hybridproteine

Zur Transformation von E. coli 294 (rec A-positiv) wurden 10 ng Plasmid pBS42BSBL verwendet. Die Reaktion wurde auf mit 12,5 ug/ml Chloramphenicol versetzten LB-Stärkeplatten ausplattiert. Es wurden etwa 3·4 Kolonien erhalten. 6 von diesen erzeugten Halos aufgrund einer Stärkehydrolyse. Von diesen Kolonien wurde angenommen, daß sie Plasmide enthalten, in denen die B. stearothermophilus- und B. licheniformis-α- Amylase-DNA-Sequenz innerhalb des Plasmids durch homologe Rekombination rekombiniert hatte, um für aktive Hybrid-α- Amylasen codierende DNA-Hybridsequenzen zu ergeben. Die Homologieregion (in der das Auftreten einer Rekombination erwartet wurde) zwischen den beiden α-Amylase-Genfragmenten in pBS42BSBL ist etwa 1,0 kb. Diese Daten würden somit bedeuten, daß die Frequenz für derartige Rekombinationsvorgänge 6/3·10&sup4; oder 2·10&supmin;&sup4; war.

BEISPIEL 2

Zur Verringerung des Hintergrunds von pBS42BSBL enthaltenden Kolonien wurde eine Plasmidpräparation aus mit pBS42BSBL transformierten E. coli 294 vor einer zweiten Transformation mit PstI verdaut. Es wurde angenommen, daß in allen Fällen, wo Rekombination zwischen den B. stearothermophilus- und B. licheniformis-Genfragmenten aufgetreten war, die (im Plasmid singuläre) PstI-Stelle zerstört sein würde. Somit wären derartige rekombinierte Hybridplasmide gegenüber einem PstI- Verdau beständig, während nicht-rekombinierte Plasmide durch einen PstI-Verdau linearisiert würden. Die Transformationseffizienz zirkulärer Plasmide ist etwa um 2 bis 3 Größenordnungen höher als diejenige für derartige linearisierte Formen. Daher wurde angenommen, daß der Verdau des pBS42BSBL mit PstI vor der Transformation das Verhältnis von Kolonien, welche die rekombinierten Plasmide enthalten, zu denjenigen, welche die nicht-rekombinierten Plasmide enthalten, erhöhen würde. Daher wurden 1000 ng einer PstI-behandelten Plasmidpräparation aus mit pBS42BSBL transformierten E. coli 294 für eine zweite Tranformation von E. coli 294 verwendet. Es wurden 2032 Kolonien erhalten. 517 (etwa 25%) erzeugten Halos einer Stärkehydrolyse auf LB-Stärke-Agarplatten, was auf die Synthese von aktiver Hybrid-α-Amylase hinwies.

BEISPIEL 3

A. Charakterisierung der in α-Amylase erzeugenden pBS42BSBL-Transformanten von E. coli 294 enthaltenen DNA- Hybridsequenzen

Es wurde angenommen, daß die amy+-Kolonien als Ergebnis einzelner Crossover-Vorgänge innerhalb des pBS42BSBL-Plasmids zwischen den B. stearothermophilus- und B. licheniformis- Genfragmenten in einer Region entstanden sind, in der sie Sequenzhomologie zeigen. Es wurde gefolgert, daß solche rekombinierten Gene aus dem B. stearothermophilus-Gen stammende 5'-Sequenzen und aus dem B. licheniformis-Gen stammende 3'- Sequenzen enthalten. Zur Verifizierung dieser Annahme wurde das folgende Experiment durchgeführt. Es wurden Regionen von 16 bis 18 Nucleotiden in Intervallen von etwa 150 bp mit geringer Homologie ausgewählt. Es wurden Oligonucleotide synthetisiert, die in den Fig. 2A und 2B als Sonden 1 bis 9 bezeichnet sind und dem Sense-Strang des B. stearothermophilus-Gens in diesen Regionen entsprechen (11). Diese Oligonucleotide wurden mit γ-³²P-ATP und T4-Polynucleotidkinase endmarkiert, um Hybridisierungssonden zum Nachweis von B. stearothermophilus-Sequenzen zu erzeugen. Es wurde vermutet, daß alle 5'-seitig des Crossover-Locus befindlichen Sequenzen aus dem B. stearothermophilus-Gen stammen und daher mit den entsprechenden (perfekt homologen) Oligonucleotidsonden hybridisieren. 3'-seitig des Crossover-Locus befindliche Sequenzen würden aus dem B. licheniformis-Gen stammen und daher nicht mit den entsprechenden (gering homologen) Oligonucleotidsonden unter den verwendeten Bedingungen hybridisieren. Es wurden 12-amy+-Kolonien, von denen postuliert wurde, daß sie rekombinierte α-Amylase-DNA-Hybridsequenzen enthalten, sowie pUc13BS, pBS42BL und pBS42BSBL enthaltende Kolonien für eine DNA-DNA-Hybridisierung mit jeder dieser Oligonucleotidsonden ausgewählt. All diese Kolonien wurden jeweils auf 9 Nitrocellulose-Filterpapierstreifen inokuliert. Diese Streifen wurden auf eine LB-Agarplatte gegeben. Die Platte wurde zur Ermöglichung eines Koloniewachstums über Nacht bei 37ºC inkubiert. Die Filter wurden nach Standardmethoden (27) zur Hybridisierung vorbereitet. Die neun Streifen wurden in getrennten Gefäßen mit jeder der Oligonucleotidsonden unter Verwendung von Standardmethoden für Hybridisierung mit geringer Stringens inkubiert (2). Die Filter wurden in 2·SSC und 0,1% SDS bei 37ºC gewaschen, dann an Luft getrocknet und autoradiographiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1 Signale mit Oligonucleoidsonden Hybrid Position der Crossover-Loci im B. stearothermophilus-α-Amylase-Gen Die Zahlen sind Nucleoditpositionen der in Fig. 2A und 2B angegebenen B. stearothermophilus-DNA-Sequenz. Es wurde angenommen, daß alle positiven Signale auf das Vorhandensein der gesamten, mit den Hybridisierungssonden komplementären Sequenz zurückzuführen sind.
Wie erwartet hybridisierten alle Sonden mit B. stearothermophilus-Sequenzen, aber nicht mit B. licheniformis-Sequenzen. Dies wird durch positive Hybridisierungssignale aller Sonden mit der DNA aus pUc13BS enthaltenden Zellen, welche das gesamte B. stearothermophilus-α-Amylasegen enthält, und negativen Hybridisierungssignalen mit der DNA aus pBS42BL enthaltenden Zellen, welche das gesamte B. licheniformis-α- Amylasegen, aber keine Sequenzen aus dem B. stearothermophilus-Gen enthält, gezeigt. Die DNA aus pBS42BSBL enthaltenden Zellen ergab positive Signale mit allen Sonden außer Sonde 9, da Sonde 9 einer Region des B. stearothermophilus-Gens entspricht, die 3'-seitig zu der auf diesem Plasmid vorhandenen ist.
Die 14 vermutlichen Hybride zeigten unterschiedliche Hybridisierungsmuster. Die Hybride 1, 2, 3 und 4 hybridisierten beispielsweise mit Sonde 1, aber nicht mit den anderen (mehr 3'-seitigen) Sonden 2 bis 8. Dies wies auf einen Crossover zwischen den Sonden 1 und 2 entsprechenden Sequenzen hin. In einem anderen Beispiel hybridisierte Hybrid 9 mit den Sonden 1 bis 4, aber nicht mit den mehr 3'-seitigen Sonden 5 bis 9. Dies wies auf einen Crossover zwischen den Sonden 4 und 5 entsprechenden Sequenzen hin. Wie aus Tabelle 1 hervorgeht, wurden andere Crossover-Bereiche in den restlichen Hybriden auf ähnliche Weise identifiziert. In anderen Experimenten (nicht gezeigt) wurden Hybride mit Crossovers zwischen jedem Paar von Sondenregionen, obgleich mit stark variablen Frequenzen gefunden, z. B. Crossovers zwischen den Sonden 1 und 2 waren sehr gebräuchlich (etwa 20%), während Crossovers zwischen den Sondenregionen 2 und 3 ziemlich selten waren (etwa 1%).
Die obigen Ergebnisse weisen darauf hin, daß die Crossovers zwischen den α-Amylase-Genfragmenten weit verstreut über etwa 1,0 kb Homologieregion zwischen den beiden Genen waren.
Es war jedoch interessant, diese Verteilung detaillierter zu untersuchen. Daher bestimmten wir die DNA-Sequenz der Hybridgene in ihren Crossover-Regionen durch direkte Sequenzierung von mit Natriumhydroxid denaturierten Plasmiden unter Verwendung der Dideoxykettenterminationsmethode (28). Als Primer für ein gegebenes Hybrid wurde das am meisten 3'-seitig gelegene synthetische Oligonucleotid, das mit dem Hybrid hybridisierte, verwendet. In allen Fällen zeigten die bestimmten Sequenzen klar die Crossover-Loci. Die Crossover-Loci für die 12 Hybride sind in den gepunkteten Kästen von Fig. 2A und 2B gezeigt. Bei Hybrid 9 (Fig. 2A) trat beispielsweise der Crossover zwischen bp 585 und bp 600 auf, was durch das Vorhandensein von aus dem B. stearothermophilus-Gen stammenden Sequenzen 5'-seitig dieser Region und aus dem B. licheniformis-Gen stammenden Sequenzen 3'-seitig dieser Region gezeigt wurde.

B. Analyse der durch die Plasmidhybride 4 6 und D erzeugten Hybrid-α-Amylaseenzyme.

E. coli 294-Zellen, die pBS42BL oder die Plasmidhybride 4, 6 oder 6 enthielten, wurden über Nacht in Schüttelkolben (120 Upm) gezogen, die mit 12,5 pg/ml Chloramphenicol versetztes LB-Medium enthielten. E. coli 294-Zellen, die das Plasmid puC13BS enthielten, wurden auf ähnliche Weise gezogen, außer daß 50 ug/ml Carbenicillin anstelle von Chloramphenicol zum LB-Medium gegeben wurde. Die Zellen wurden durch Zentrifugation gesammelt und durch die osmotische Schockmethode (29) in cytoplasmische und periplasmische Fraktionen fraktioniert. Diese Fraktionen wurden durch den Mikro-Phaedabas-Test (p macia, Inc., Piscataway, NJ) auf α-Amylase-Aktivität getestet, bei dem die Stärkehydrolyse gemessen wird. In alle Fällen wurde festgestellt, daß der Großteil der Aktivität (80 bis 85%) mit der periplasmischen Fraktion assoziiert war. Daher wurde diese Fraktion zur Reinigung der in den fünf Kulturen erzeugten α-Amylasen verwendet.
Zur Reinigung der Enzyme wurden die periplasmischen Fraktionen bei 4ºC über eine unlösliche Stärke enthaltende Säule gegeben, was zur Bindung der α-Amylase an die Stärke führte. Dann wurden die Enzyme durch Erhöhung der Temperatur auf 50ºC aus der Säule eluiert. Die Stärke wurde von den Enzymen durch Gelpermeationschromatographie auf einer P-2-Säule (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA) und anschließender DEAE-Chromatographie (30) entfernt. Jede der gereinigten α-Amylasen war rein, wie durch Beurteilung ihrer Homogenität auf SDS-Polyacrylamidgelen festgestellt wurde. Die Proteinkonzentration für jedes gereinigte Protein wurde durch die Farbbindungsmethode von Bradford (31) bestimmt.
Die Hitzestabilitäten der gereinigten α-Amylasen wurden wie folgt bestimmt. Gleiche Konzentrationen des Enzyms wurden bei 90ºC inkubiert. Zu verschiedenen Zeitpunkten wurden Aliquots entfernt und unter Verwendung des Mikro-Phaedabas-Tests bei 70ºC auf α-Amylase-Aktivität getestet. Die Ergebnisse sind in Fig. 5 dargestellt. Das vom Plasmid pBS42BL erzeugte B. licheniformis-Ausgangsenzym behält im wesentlichen seine gesamte Aktivität sogar nach längerer Inkubation (120 min.) bei 90ºC, während das vom Plasmid pUC13BS erzeugte B. stearothermo hilus-Ausgangsenzym unter diesen Bedingungen etwa 50% seiner Aktivität verliert. Die von den DNA-Hybridsequenzen der Hybride 4, 6 und D codierten Hybridenzyme zeigen unterschiedliche Hitzestabilitäten. Das Hybrid 4 behält nach Inkubation bei 90ºC für 120 min. im wesentlichen seine gesamte Aktivität. Wie in Fig. 6 gezeigt, ist dieses Protein mit dem B. licheniformis-Enzym außer an seinem Aminoterminus strukturell identisch, wo die ersten 15 Aminosäuren durch das B. stearothermophilus-Gen codiert werden. Diese starke Ähnlichkeit zwischen dem Hybridprotein 4 und dem B. stearothermophilus-Protein kann ihre ähnliche Widerstandsfähigkeit gegenüber einer Hitzeinaktivierung erklären. Im Gegensatz dazu behält das Hybridprotein D nur 10% seiner Aktivität nach Inkubation für 120 min. bei 90ºC. Dieses Polypeptid ist stark chimär, da nämlich etwa seine gesamte aminoterminale Hälfte durch das B. stearothermophilus-Gen codiert ist, während die carboxyterminale Hälfte durch DNA aus dem B. licheniformis-Gen codiert ist (siehe Fig. 6). Da die Hitzestabilität des Hybridproteins 4 geringer als die von jedem Ausgangsmaterial ist, kann es sein, daß eine oder mehrere Wechselwirkungen zwischen den aminoterminalen und carboxyterminalen Hälften von α-Amylase für die Hitzestabilität erforderlich sind und daß diese Wechselwirkungen im Hybridprotein verändert sind. Das Protein aus Hybrid 6 behält etwa 50% seiner Aktivität nach Inkubation bei 90ºC für 120 min. und besitzt daher dieselbe Hitzestabilität wie das B. stearothermophilus-Ausgangsenzym. Das Hybridprotein 6 besteht in erster Linie aus Resten, die durch das B. licheniformis-Gen codiert sind, aber die 73 aminoterminalen Reste sind diejenigen des B. stearothermophilus-Proteins (siehe Fig. 6). Dieser heterologe Aminoterminus kann einen leicht destabilisierenden Effekt auf die Proteinstruktur haben und trägt dadurch möglicherweise zu seiner verringerten Stabilität verglichen mit dem B. licheniformis- Ausgangsenzym bei. Diese Ergebnisse lassen erwarten, daß Hybrid-α-Amylasen einen Bereich von Hitzestabilitäten zeigen, der gleich oder unterschiedlich wie derjenige der Ausgangsenyzme ist.
Die spezifischen Aktivitäten der wie oben beschrieben gereinigten Ausgangs- und Hybrid-α-Amylasen wurden auch bei vier unterschiedlichen Temperaturen bestimmt. Diese Daten sind in Fig. 7 gezeigt. Das B. stearothermophilus-Ausgangsenzym hat die höchste spezifische Aktivität bei allen Temperaturen, während das B. licheniformis-Ausgangsenzym bei allen Temperaturen viel weniger aktiv ist. Die Hybride 4 und 6, die wie oben beschrieben nur kurze Bereiche von aus dem B. stearothermophilus-Gen stammenden aminoterminalen Resten enthalten, ähneln in ihren spezifischen Aktivitätsprofilen mehr dem B. licheniformis-Enzym. Die Hybrid-α-Amylase D hat jedoch spezifische Aktivitäten, die zwischen denen der Ausgangsenzyme liegen. Die zu erkennende große Verringerung der Aktivität dieses Enzyms bei 90ºC verglichen mit 70ºC mag wie oben angegeben auf seine bemerkenswerte Instabilität bei 90ºC zurückzuführen sein. Diese Daten weisen darauf hin, daß Hybrid-α- Amylasen unterschiedliche spezifische Aktivitäten zeigen.

BEISPIEL 4

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wurden aus B. subtilis und B. amyloliquefaciens stammende Hybrid-Alkalische Proteasen erzeugt. Zur Verknüpfung von DNA-Sequenzen, die für die B. subtilis- und B. amyloliquefaciens-Alkalischen Proteasen codieren, wurde eine synthetische Oligonucleotidsequenz verwendet, die mehr als eine singuläre Restriktionsstelle enthält. Die Behandlung des Vektors mit für jede singuläre Restriktionsstelle spezifischen Endonucleasen nach Rekombination in einem rec-positiven Mikroorganismus verringerte die Hintergrundtransformation durch einen nicht-rekombinierten Vektor.

A. Konstruktion des B. subitilis-B. amyloliquefaciens-Alkalische Protease Hybrid-Verläuferplasmids pBS42BSBA.

Wie in Fig. 4 gezeigt, wurde das Plasmid pS168.1 (44,32), das das B. subtilis-Alkalische Proteasegen enthält, mit EcoRI und NcoI verdaut. Das kleinere Fragment (Fragment A) wurde isoliert. Das Plasmid pS4-5 (44, 33), das das gesamte B. amyloliquefaciens-Alkalische Proteasegen enthält, wurde mit EcoRI und Aval verdaut. Das größere Vektorfragment (Fragment B) wurde isoliert. Zwei komplementäre synthetische Oligonucleotide, die kohäsive NcoI- und AvaI-Termini und zwischen diesen Termini PstI-, SalI- und KpnI-Stellen enthalten, wurden durch Erhitzen auf 95ºC und Abkühlen auf 23ºC zur Bildung von Fragment C aneinandergefügt. Die Fragmente A, B und C wurden durch Ligation verknüpft. Der so ligierte Vektor wurde zur Transformation von E. coli 294 verwendet. Es wurde eine Chloramphenicol-resistente Kolonie gefunden, die das Plasmid pBS42BSBA enthielt. Der B. subtilis-Stamm BG2036 (44) enthält Deletionen der chromosomalen Alkalische Protease- und Neutrale Protease-Gene. Der Stamm BG2036 erzeugte bei Transformation mit pBS42BSBA keine Protease, was dadurch bestimmt wurde, daß kein klarer Halo auf LB-Platten mit 0,1% Magermilch erzeugt wurde. Dieses Ergebnis war erwartet, da dem Plasmid die carboxyterminalen Codons des Alkalische Protease- Gens von B. subtilis und die aminoterminalen Codons des Alkalischen Protease-Gens von B. amyloliquefaciens fehlen. Weiterhin sind die Codons des letztgenannten Gens nicht im gleichen Leserahmen wie diejenigen des erstgenannten Gens. Im Gegensatz dazu erzeugte der B. subtilis-Stamm BG2036, der entweder Plasmid pS168.1 oder pS4-5 enthielt, aktive Alkalische Protease, was durch die Erzeugung von klaren Halos auf LB-Magermilch-Agarplatten bestimmt wurde. Dieses Ergebnis war erwartet, da diese letztgenannten beiden Plasmide vollständige Alkalische Protease-Gene enthalten. Es ist hier anzumerken, daß mit pS168.1, pS4-5 oder pBS42BSBA transformierter E. coli 294 keine Alkalische Protease erzeugte, was durch ein Fehlen der Haloerzeugung auf LB-Magermilch-Agarplatten bestimmt wurde. Dies kann ein Hinweis darauf sein, daß Alkalische Protease-Promotoren aus Bacillus nicht in E. coli aktiv sind, obwohl andere Erklärungen möglich sind.

B. Erzeugung von Alkalische Protease-DNA-Hybridsequenzen und Expression von Hybridproteinen.

Zur Transformation von E. coli 294 wurde 1 ng Plasmid pBS42BSBA verwendet. Die Reaktion wurde auf LB-Chloramphenicol-Agarplatten ausplattiert. Es wurden etwa 2·10³ Kolonien erhalten. Anders als im Falle der α-Amylasen werden Alkalische Proteasen in E. coli selbst von vollständigen Genen nicht exprimiert. Zur Bestimmung, ob eine Rekombination zwischen den auf dem Plasmid vorhandenen homologen Regionen, die etwa 1 kb der Alkalischen Protease-Genfragmente von B. subtilis und B. amyloliquefaciens enthalten, aufgetreten war, war es notwendig, eine Hybridisierungstechnik zu verwenden. In dem Hybridisierungsexperiment führten wir Tests auf die Anwesenheit von Fragment C in den in den Transformanten enthaltenen Plasmiden durch. Wir nahmen an, daß bei Auftreten einer Rekombination zwischen den DNA-Sequenzen immer die das Fragment C enthaltenden Sequenzen deletiert sein würden, während nicht-rekombinierte Plasmide diese Sequenzen noch enthalten würden. Das Hybridisierungsexperiment wurde wie folgt durchgeführt. Die Kolonien wurden von den Platten auf Nitrocellulosefilter transferiert. Dann wurden die Filter durch Standardmethoden (27) für die Hybridisierung vorbereitet. Die Hybridisierung wurde nach Standardmethoden bei geringer Stringenz durchgeführt. Die verwendete Sonde war der (obere) Sensestrang von mit γ³²P-ATP und T4-Polynucleotidkinase endmarkiertem Fragment C (34). Durch diese Methode wurden etwa 1,0·10&sup4; Kolonien getestet. Es wurden drei gefunden, die nicht mit der Sonde hybridisierten und von denen daher angenommen wurde, daß sie Plasmide enthalten, in denen eine Rekombination zwischen den zwei teilweise homologen Alkalische Protease-Genfragmenten stattgefunden hatte.

BEISPIEL 5

In einem anderen Experiment erfolgte eine Anreicherung solcher vermutlicher rekombinanter Klone durch Vorverdau einer aus mit BS42BSBA tranformierten E. coli 294 stammenden Plasmidpräparation. Die Plasmidpräparation wurde mit einer Kombination der Restriktionsenzyme PstI, SalI und KpnI vor der Transformation von E. coli 294 verdaut. 3 ng von so verdauten Plasmiden führten zum Entstehen von acht Chloramphenicoiresistenten Transformanten. Diese Kolonien wurden durch die oben beschriebene Hybridisierungsprozedur auf die Anwesenheit der in Fragment C enthaltenen Nucleotidsequenz getestet. Sieben dieser Kolonien zeigten keine Hybridisierung und es wurde angenommen, daß sie Plasmide enthalten, in denen eine Rekombination zwischen den beiden teilweise homologen Gensequenzen stattgefunden hatte. Um zu testen, ob die negativ hybridisierenden Kolonien Plasmide enthielten, die für aktive Hybrid-Alkalische Proteasen codierende Hybrid-Gene enthielten, wurden diese Plasmide isoliert und in B. subtilis BG2036 transformiert. Dieser Stamm erzeugte nach Transformation mit jedem der Plasmide, von denen postuliert wurde, daß sie rekombinierte Alkalische Protease-Hybridgene enthalten, eine klare Zone auf LB-Magermilch-Chloramphenicol-Agarplatten. Im Gegensatz dazu konnten die vermutlich nicht rekombinierten pBS42BSBA-Plasmide (8 getestete Isolate) auf Transformanten des Stammes BG2036 nicht die Fähigkeit zur Erzeugung aktiver Alkalischer Protease übertragen, was dadurch gezeigt wurde, daß sie keine klaren Zonen auf Magermilchplatten erzeugen konnten.

BEISPIEL 6

A. Charakterisierung von DNA-Hybridsequenzen die in Alkalische Protease erzeugenden pBS42BSBA-Transformanten von E. coli 294 enthalten sind.

Es wurde die Annahme gemacht, daß die für Alkalische Protease positiven Kolonien als Ergebnis einzelner Crossover-Vorgänge innerhalb des Plasmids pBS42BSBA zwischen den B. subtilis- und B. amyloliquefaciens-DNA-Sequenzen entstanden waren, die in einer Region initiiert wurden, in der sie Sequenzhomologie besitzen. Es wurde vermutet, daß solche rekombinierten Gene aus dem B. subtilis-Gen stammende 5'-Sequenzen und aus dem B. amyloliquefaciens-Gen stammende 3'-Sequenzen enthalten. Von frühen Crossovers wäre zu erwarten, daß sie größere aus dem B. amyloliguefaciens-Gen stammende 3'-Sequenzen enthalten, während in späteren Crossovers kleine Segmente von 3'-Sequenzen des B. amyloliquefaciens-Gens vorhanden wären. In pBS42BSBA gibt es eine singuläre PvuII-Stelle, die sich innerhalb der für B. amyloliquefaciens-Alkalische Protease codierenden Sequenz befindet (siehe Fig. 4). Crossovers, in denen sich die aus dem B. amyloliquefaciens-Gen stammende 3'- Region bis 5'-seitig der PvuII-Stelle erstreckt, würden zu Plasmiden mit einer singulären PvuII-Stelle führen. Weiterhin würde sich diese PvuII-Stelle näher bei der singulären EcoRI- Stelle (die sich 5'-seitig des Promotors befindet) als in pBS42BSBA-Plasmiden, die nicht rekombiniert hatten, befinden. Die mit EcoRI und PvuII verdauten vermutlichen Hybride 2, 6, 7 und 8 zeigten ein Restriktionsmuster, aus dem hervorging, daß die PvuII-Stelle vorhanden war. Im Gegensatz dazu würden Crossovers, in denen die aus dem B. amyloliguefaciens-Gen stammende 3'-Region nicht bis 5'-seitig der PvuII-Stelle reicht, würden zu Plasmiden ohne PvuII-Stellen führen. Die vermutlichen Hybride 1, 3 und 4 gehören zu diesem letztgenannte Kategorie, was aus ihrer Beständigkeit gegenüber einem Verdau mit PvuII hervorgeht. Diese Daten weisen darauf hin, daß in den Plasmiden, die die vermutlichen Alkalische Protease-Hybridgene enthielten, frühe und späte Crossovers vorlagen.

B. Analyse der von Alkalische Protease-DNA-Hybridsequenzen codierten Hybrid-Alkalische Proteasen.

Zur vorläufigen Charakterisierung der Hybridproteine, die von B. subtilis BG2036 mit für die oben beschriebenen Alkalische Protease-Hybridgene codierenden Plasmiden erzeugt wurden, erfolgte eine Bestimmung der Km-Werte unter Verwendung eines synthetischen Substrats. Als Enzymquelle wurden Kultur-Rohüberstände verwendet. Das verwendete Substrat war Succinyl-L- ala-L-ala-pro-L-tyr-L-para-nitroanalid. Die Freisetzung des Produkts para-Nitroanalid wurde unter Verwendung eines Hewlett Packard Diode Array Spectrophotometer Modell 8451A durch Messung der Absorption bei 430 nm colorimetrisch bestimmt. Auch die Km-Werte der B- subtilis- und B. amyloliguefaciens-Ausgangsenzyme wurden bestimmt. Die Ergebnisse dieser Untersuchung sind in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2 Km-Werte von Ausgangs- und Hybrid-Alkalischen Proteasen am synthetischen Substrat Succinyl-L-ala-L-ala-L-pro-L-tyr-L- para-Nitroanalid¹
Plasmid Km (Mx10&sup5;)
pS4-5 2,38 (±0,09)
pS168.1 3,39 (±0,15)
Hybrid 1 5,54 (±0,10)
Hybrid 2 5,12 (±0,10)
Hybrid 3 5,42 (±0,06)
Hybrid 4 5,39 (±0,11)
Hybrid 6 2,86 (±0,13)
Hybrid 7 5,42 (±0,12)
Hybrid 8 2,75 (±0,08) ¹ Die Wirtszelle war in allen Fällen B. subtilis BG2036.
Es ist ersichtlich, daß sich die Hybridenzyme in zwei Grundklassen unterteilen. Die erste Klasse, die von den Hybriden 1, 2, 3, 4 und 7 repräsentiert wird, besitzt Km-Werte, die etwas größer als diejenigen von jedem Ausgangsenzym sind. Die zweite Klasse, repräsentiert durch die Hybride 6 und 8, besitzt Km-Werte, die zwischen denjenigen der Ausgangssubstanzen sind.
Diese Ergebnisse zeigen, daß die Hybrid-Alkalischen Proteasen für ein bestimmtes synthetisches Substrat variierende Km- Werte besitzen und daß sich diese von denen der Ausgangsenzyme unterscheiden. Es wird erwartet, daß die Bestimmung von Km-Werten unter Verwendung anderer synthetischer Substrate ebenfalls einen Bereich von Ergebnissen ergeben würde und auch unterschiedlich begünstigte Substrate für die verschiedenen Hybridenzyme zeigen würde.

BEISPIEL 7

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden Plasmide, die Hybrid-α-Amylase-DNA-Sequenzen enthalten, durch die postrekombinations-Transkription einer Tetracyclin-Resistenz - determinante nach Heraus schneiden eines Transkriptionsterminators als Ergebnis einer homologen Rekombination zwischen zwei α-Amylase-DNA-Ausgangssequenzen selektioniert.
Ein funktioneller Promotor wird operativ mit den B. licheniformis-α-Amylase-DNA-Sequenzen verknüpft. 3 '-seitig dieses Gens und 5'-seitig zu für B. stearothermophilus-α-Amylase codierenden DNA-Sequenzen wird ein Transkriptionsterminator eingefügt. Ein Tetracyclin-Resistenzgen, dem sein eigener Promotor fehlt, wird direkt 3'-seitig zu der B. stearothermophilus-DNA-Sequenz eingefügt. Zellen, die ein Plasmid mit diesen Eigenschaften enthalten, wären für Tetracyclin sensitiv, da das transkriptionale Durchlesen von dem stromaufwärts gelegenen aktiven Promotor durch den Transkriptionsterminator verhindert wird. Wenn jedoch eine Rekombination zwischen den zwei α-Amylase-DNA-Sequenzen eintritt, wird der Terminator herausgeschnitten, wodurch eine Transkription des Tetracyclin-Resistenzgens ermöglicht wird. Zellen, die Plasmide enthalten, in denen diese homologe Rekombination stattgefunden hat, können durch Resistenz gegen Tetracyclin selektioniert werden, wodurch der gesamte Hintergrund aus nicht-rekombinierten Plasmiden eliminiert wird. Diese Methode ist genauso für die Rekombination zweier beliebiger homologer Genfragmente anwendbar.
Um diese Methode zur Selektion von rekombinanten α-Amylase- Genen zu verwenden, die aus den Ausgangsgenen von B. licheniformis und B. stearothermophilus stammen, wird ein Plasmid, wie in Fig. 8 gezeigt, konstruiert. Das Plasmid pBS42BL, welches das vollständige B. licheniformis-α-Amylase-Gen enthält, wird mit EcoRI und HindIII gespalten. Das kleinere Fragment (Fragment A) wird isoliert. Das Plasmid pUC13 wird mit EcoRI und PstI gespalten, und das größere Fragment (Fragment C) wird isoliert. Es werden zwei synthetische Oligonucleotide synthetisiert und dann auf 95ºC erhitzt und auf 23ºC abgekühlt, um eine Aneinanderfügung zu erlauben. Das resultierende Fragment (Fragment B) enthält den E. coli trp-Transkriptionsterminator (in der Box), der am 5'-Ende von einer HindIII-Stelle und am 3'-Ende von SalI-, PvuI- und PstI-Stellen flankiert ist. Die Fragmente A, B und C werden durch Ligation verknüpft und zur Transformation von E. coli 294 verwendet. Ampicillin-resistente Kolonien enthalten das mit puC13BL bezeichnete Plasmid. Dieses Plasmid wird vollständig mit SalI und partiell mit PvuI verdaut. Das Fragment D wird isoliert. Das Plasmid pUC13BS wird mit TaqI und BstXI gespalten, und das Fragment (Fragment E) wird isoliert. Das gleiche Plasmid wird mit BstXI und PvuI gespalten, und das kleinere Fragment (Fragment F) wird isoliert. Die Fragmente D, E und F werden durch Ligation verknüpft und zur Transformation von E. coli 294 verwendet. Ampicillin-resistente Transformanten enthalten das Plasmid pUC13BLBS. Dieses Plasmid enthält das gesamte B. licheniformis-α-Amylase-Gen einschließlich seines nativen Promotors gefolgt vom E. coli Transkriptionsterminator, der anschließend von der codierenden Sequenz des B. stearothermophilus-Gens gefolgt wird, das abgesehen von den ersten 8 Codons vollständig ist. Dann wird das Plasmid pUC13BLBS mit EcoRI und BstXI gespalten, und das kleinere Fragment (Fragment G) wird isoliert. Dieses Plasmid wird ebenfalls mit BstXI und HindIII gespalten, und das Fragment H wird isoliert. Das Plasmid pBR322 wird mit EcoRI und HindIII gespalten, und das größere Vektorfragment (Fragment I) wird isoliert. Die Fragmente G, H und I werden durch Ligation verknüpft und in E. coli 294 transformiert. Ampicillin-resistente Transformanten enthalten das Plasmid pBR322BLBSTCS.
Dieses Plasmid unterscheidet sich im wesentlichsten von puC13BLBS durch die Fusion der codierenden Region und der ribosomalen Bindungsstelle des Tetracyclin-Resistenzgens mit dem 3'-Ende der für die B. stearothermophilus-α-Amylase codierenden Region.
Die Replikation von pBR322BSBLTCS in rec-A-positiven E. coli 294 führt zum Herausschneiden des Transkriptionsterminators durch homologe Rekombination zwischen den beiden α-Amylase- DNA-Sequenzen. Die Expression dieses rekombinanten Plasmids führt zu einer Transkription vom B. licheniformis-α-Amylase- Genpromotor durch das α-Amylasehybridgen in das Tetracyclin- Resistenzgen, was zu einer polycistronischen mRNA führt, die translatiert wird, um sowohl die Hybrid-α-Amylase als auch das Tetracyclin-Resistenzprotein zu ergeben. Daher können derartige rekombinierte Plasmide enthaltende Transformanten durch Retransformation und Selektion auf LB-Agarplatten mit 5 ug/ml Tetracyclin selektioniert werden.
Obwohl sich das Voranstehende auf besonders bevorzugte Ausführungsformen bezieht, ist es ersichtlich, daß die vorliegende Erfindung nicht so beschränkt ist. Dem Durchschnittsfachmann ist klar, daß verschiedene Modifizierungen der offenbarten Ausführungsformen gemacht werden können und daß beabsichtigt ist, daß solche Modifizierungen im Bereich der vorliegenden Erfindung liegen.
Die in der folgenden Bibliographie aufgelisteten und im voran stehenden Text jeweils durch eine Zahl in Klammern zitierten Referenzen werden hiermit durch Bezugnahme aufgenommen.

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Claims

1. Verfahren zur Herstellung einer DNA-Hybridsequenz umfassend:

Bilden eines zirkulären Vektors, der eine replizierbare DNA-Sequenz, eine-für den aminoterminalen Abschnitt eines Hybridpolypeptids codierende erste DNA-Sequenz, eine für den carboxyterminalen Abschnitt des Hybridpolypeptids codierende zweite DNA-Sequenz und eine dritte DNA-Sequenz zwischen der ersten und der zweiten DNA- Sequenz enthält,

Transformieren eines rec-positiven Mikroorganismus mit diesem Vektor, um eine Zellpopulation zu erzeugen, die eine Vielzahl dieses zirkulären Vektors umfaßt, und Ermöglichen einer Crossover-Rekombination von mindestens einem der Vektoren, um die dritte DNA-Sequenz heraus zuschneiden, so daß ein rekombinierter zirkulärer Vektor mit einer DNA-Hybridsequenz gebildet wird, die die für das Hybridpolypeptid codierende erste und zweite DNA- Sequenz umfaßt, wobei diese Crossover-Rekombination durch mindestens teilweise homologe DNA-Sequenzen initiiert wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin die dritte DNA-Sequenz mindestens eine singuläre Restriktionsstelle enthält und das Verfahren die weiteren Schritte umfaßt

(a) Isolieren des zirkulären Vektors und des rekombinierten zirkulären Vektors aus der Zellpopulation,

(b) Behandeln des isolierten zirkulären Vektors und des rekombinierten zirkulären Vektors mit einer Restriktionsendonuclease, die spezifisch für die eine singuläre Restriktionsstelle in der dritten DNA-Sequenz ist, um den zirkulären Vektor zu linearisieren und

(c) Inkontaktbringen eines zweiten Mikroorganismus mit dem linearisierten Vektor und dem rekombinierten zirkulären Vektor und Transformieren des zweiten Mikroorganismus mit dem rekombinierten zirkulären Vektor.

3. Verfahren nach Anspruch 1, worin die erste DNA-Sequenz einen funktionellen Promotor umfaßt, der operativ mit der für den aminoterminalen Abschnitt des Hybridpolypeptids codierenden Sequenz verknüpft ist, die einem ersten Teil einer ersten Polypeptidausgangssequenz entspricht, die zweite DNA-Sequenz für den carboxyterminalen Abschnitt des Hybridpolypeptids codiert, das einem ersten Teil einer zweiten Polypeptidausgangssequenz entspricht, und die dritte DNA-Sequenz für einen zweiten Teil der ersten Polypeptidausgangssequenz und einen zweiten Teil der zweiten Polypeptidausgangssequenz codiert.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, weiterhin umfassend den Schritt des Identifizierens des zweiten Mikroorganismus, der mit dem rekombinierten Vektor transformiert ist, durch Nachweis des Fehlens der dritten DNA-Sequenz.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin die DNA-Hybridsequenz für ein Hybridenzym codiert.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das Hybridenzym eine Hybridamylase ist.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin das Hybridenzym eine Hybridprotease ist.

8. Verfahren nach Anspruch 6, worin die erste Polypeptidausgangssequenz die gesamte oder ein Teil der α-Amylase von B. stearothermophilus ist, der erste Teil der ersten Polypeptidausgangssequenz vollständig oder teilweise ein aminoterminaler Abschnitt der B. stearothermophilus-α- Amylase ist, die zweite Polypeptidausgangssequenz die α- Amylase von B. licheniformis ist und der erste Teil der zweiten Polypeptidausgangssequenz ein carboxyterminaler Abschnitt der B. licheniformis-α-Amylase ist.

9. Verfahren nach Anspruch 7, worin die erste Polypeptidausgangssequenz die gesamte oder ein Teil der Alkalischen Protease von B. subtilis ist, der erste Teil der ersten Polypeptidausgangssequenz ein aminoterminaler Abschnitt der Alkalischen Protease aus B. subtilis ist, die zweite Polypeptidausgangssequenz die gesamte oder ein Teil der Alkalischen Protease von B. amyloliquefaciens ist und der erste Teil der zweiten Polypeptidausgangssequenz ein carboxyterminaler Abschnitt der Alkalischen Protease von B. amyloliguefaciens ist.

10. Verfahren zur Herstellung eines Hybridpolypeptids, umfassend die Herstellung einer DNA-Hybridsequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 9 und weiterhin umfassend die Transkription der DNA-Hybridsequenz zur Erzeugung einer RNA-Hybridsequenz und die Translation der RNA-Hybridsequenz zur Erzeugung des Hybridpolypeptids.

11. Verfahren zur Herstellung eines enzymatisch aktiven Hybridenzyms, umfassend die Herstellung einer DNA-Hybridsequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 9 und weiterhin umfassend die Transkription der DNA-Hybridsequenz zur Erzeugung einer RNA-Hybridsequenz und die Translation der RNA-Hybridsequenz zur Erzeugung des enzymatisch aktiven Hybridenzyms.

12. Enzymatisch aktive Hybridamylase, umfassend eine aus einer ersten Ausgangsamylase stammende aminoterminale Sequenz und eine aus einer zweiten Ausgangsamylase stammende carboxyterminale Sequenz, worin die aminoterminale und die carboxyterminale Sequenz in einer Region verknüpft sind, in der die zugrundeliegende, für die Hybridamylase codierende Hybrid-DNA als Ergebnis eines Rekombinationsvorgangs erhalten worden ist.

13. Enzymatisch aktive Hybridprotease, umfassend eine aus einer ersten Ausgangsprotease stammende aminoterminale Sequenz und eine aus einer zweiten Ausgangsprotease stammende carboxyterminale Sequenz, worin die aminoterminale und die carboxyterminale Sequenz in einer Region verknüpft sind, worin die zugrundeliegende, für die Hybridprotease codierende Hybrid-DNA als Ergebnis eines Rekombinationsvorgangs erhalten worden ist.

14. Enzymatisch aktive Hybrid-α-Amylase, umfassend eine aus der α-Amylase von B. stearothermophilus stammende aminoterminale Sequenz und eine aus der α-Amylase von B. licheniformis stammende carboxyterminale Sequenz, worin die aminoterminale und carboxyterminale Sequenz in einer Region verknüpft sind, in der die zugrundeliegende, für die Hybrid-α-Amylase codierende Hybrid-DNA als Ergebnis eines Rekombinationvorgangs erhalten worden ist.

15. Enzymatisch aktive Hybrid-Alkalische Protease, umfassend eine aus der Alkalischen Protease von B. subtilis stammende aminoterminale Sequenz und eine aus der Alkalischen Protease von B. amyloliquefaciens stammende carboxyterminale Sequenz, worin die aminoterminale und carboxyterminale Sequenz in einer Region verknüpft sind, in der die zugrundeliegende, für die Hybrid-Alkalische Protease codierende Hybrid-DNA als Ergebnis eines Rekombinationsvorgangs erhalten worden ist.

16. Zirkulärer Vektor, umfassend eine replizierbare DNA- Sequenz, eine erste DNA-Sequenz, die für den aminoterminalen Abschnitt eines Hybrid-Amylase- oder Proteaseenzyms entsprechend einem ersten Teil einer ersten Ausgangs-Amylase- oder -Protease-Sequenz codiert, eine zweite DNA-Sequenz, die für den carboxyterminalen Abschnitt der Hybrid-Amylase oder -Protease entsprechend einem ersten Teil eines zweiten Ausgangs-Amylase- oder - Proteaseenzyms codiert, und eine dritte DNA-Sequenz zwischen der ersten und der zweiten DNA-Sequenz, wobei die dritte DNA-Sequenz für einen zweiten Teil des ersten Ausgangs-Amylase- oder -Proteaseenzyms und einen zweiten Teil des zweiten Amylase- oder Proteaseenzyms codiert, worin der Vektor zum Crossover-Herausschneiden der dritten DNA-Sequenz in der Lage ist, wobei das Crossover- Heraus schneiden von mindestens teilweise homologen DNA- Sequenzen zwischen der ersten und zweiten DNA-Sequenz initiiert wird.

17. Zirkulärer Vektor, umfassend eine replizierbare DNA- Sequenz, eine erste DNA-Sequenz, die für den aminoterminalen Abschnitt eines Hybrid-Amylase- oder -Proteaseenzyms entsprechend einem ersten Teil einer ersten Ausgangs-Amylase oder -Protease codiert, eine zweite DNA-Sequenz, die für den carboxyterminalen Abschnitt einer Hybrid-Amylase oder -Protease entsprechend einem ersten Teil einer zweiten Ausgangs-Amylase oder -Protease codiert, und eine dritte DNA-Sequenz zwischen der ersten und der zweiten DNA-Sequenz, wobei die dritte DNA-Sequenz mindestens eine singuläre Restriktionsstelle umfaßt, worin der Vektor zu einem Crossover-Herausschneiden der dritten DNA-Sequenz in der Lage ist, wobei das Crossover-Herausschneiden von mindestens teilweise homologen DNA-Sequenzen zwischen der ersten und zweiten DNA-Sequenz initiiert wird.

18. Hybrid-Amlyase- oder -Proteaseenzym, erhältlich aus einem Vektor nach Anspruch 16 oder 17, das enzymatisch aktiv ist.

19. Zirkulärer Vektor, umfassend eine replizierbare DNA- Sequenz, eine für den aminoterminalen Abschnitt eines Hybridpolypeptids codierende erste DNA-Sequenz, eine für den carboxyterminalen Abschnitt eines Hybridpolypeptids codierende zweite DNA-Sequenz und eine dritte DNA-Sequenz zwischen der ersten und zweiten DNA-Sequenz, wobei die dritte DNA-Sequenz eine DNA-Sequenz umfaßt, welche die Expression der zweiten DNA-Sequenz verhindert, worin der Vektor zum Crossover-Herausschneiden der dritten DNA-Sequenz in der Lage ist, wobei das Crossover-Herausschneiden von mindestens teilweise homologen DNA-Sequenzen zwischen der ersten und zweiten DNA-Sequenz initiiert wird.

20. Zirkulärer Vektor, umfassend eine replizierbare DNA- Sequenz, eine für den aminoterminalen Abschnitt eines Hybridpolypeptids codierende erste DNA-Sequenz, eine für den carboxyterminalen Abschnitt eines Hybridpolypeptids codierende zweite DNA-Sequenz, eine dritte DNA-Sequenz zwischen der ersten und der zweiten DNA-Sequenz, wobei die dritte DNA-Sequenz eine DNA-Sequenz enthält, welche die Expression der zweiten DNA-Sequenz verhindert, und eine vierte DNA-Sequenz 3'-seitig der zweiten DNA-Sequenz, wobei die vierte DNA-Sequenz für ein definiertes Selektionsmerkmal codiert, worin der Vektor zum Crossover-Herausschneiden der dritten DNA-Sequenz in der Lage ist, worin das Crossover-Herausschneiden von mindestens teilweise homologen DNA-Sequenzen zwischen der ersten und zweiten DNA-Sequenz initiiert wird.