DE69118946T2

DE69118946T2 - Thermostabile Mutanten von neutraler Protease und Vorkehrungen zu deren Herstellung

Info

Publication number: DE69118946T2
Application number: DE69118946T
Authority: DE
Inventors: Susanna Campagnoli; Roberto Gianna; Guido Grandi; Y Ros Immaculada Margarit; Salvatore Toma
Original assignee: Eniricerche SpA
Current assignee: Eni Tecnologie SpA
Priority date: 1990-02-23
Filing date: 1991-02-18
Publication date: 1996-10-31
Anticipated expiration: 2011-02-19
Also published as: US5252478A; EP0443476B1; DK0443476T3; IT9019474A1; EP0443476A2; ATE137262T1; IT9019474A0; IT1239733B; DE69118946D1; EP0443476A3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Mutanten neutraler Protease, die ihre enzymatischen Aktivitäten bei einer Temperatur aufrechterhalten, bei der die neutrale Protease vom Wildtyp inaktiv wird, sowie Maßnahmen und Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung im Nahrungsmittelsektor.
Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung Mutanten neutraler Protease, die dadurch gekennzeichnet ist, daß die Aminosäurereste Gly 189 und/oder Gly 147 der Aminosäuresequenz der neutralen Protease durch andere Reste, die unter den natürlichen Aminosäuren ausgewählt sind, ersetzt sind.
Enzyme stellen die in der Natur am reichlichsten vorhandene Proteinklasse dar. Jedes Enzym katalysiert im allgemeinen eine andere Art von chemischer Reaktion, wobei seine Funktion in hohem Maße spezifisch ist. Ein Enzymmolekül enthält eine aktive Stelle, an die ein spezifisches Substrat während der katalytischen Reaktion bindet.
Lebende Organismen verwenden viele Enzyme, um eine Vielzahl katalytischer Reaktionen aufzuführen. Bis heute wurden jedoch nicht mehr als 2000 Enzyme detailliert charakterisiert, und von diesen sind nur einige wenige im Handel erhältlich.
Die die industrielle Verwendung eines Enzyms limitierenden Faktoren umfassen nicht nur die hohen Produktions- und Reinigungskosten, sondern auch die Tatsache, daß die charakteristischen Eigenschaften von in der Natur vorkommenden Enzymen (Wildtyp-Enzymen), wie ihre Oxidationsbeständigkeit, ihre thermische Stabilität, ihr pH-wert und dgl., bei Verwendung in von ihren ursprünglichen Umweltbedingungen abweichenden Umweltbedingungen nicht notwendigerweise optimiert sind. Tatsächlich benötigt die Industrie im allgemeinen besonders "robuste" Enzyme, da die gewünschten Substrate und/oder Produkte ebenso wie die Reaktionsbedingungen sich oft von den physiologisch auftretenden unterscheiden.
Es kann daher wünschenswert sein, eine oder mehrere natürliche charakteristische Eigenschaften eines Enzyms für eine spezielle Verwendung oder für seine Verwendung in einer speziellen Umgebung zu verändern.
Die Entwicklung gentechnischer Verfahren ermöglichte es, ein Protein durch Eingreifen auf DNA-Niveau an einer oder mehreren Stellen seiner Primärstruktur zu modifizieren, um dadurch ein Produkt zu erhalten, dessen charakteristische Eigenschaften für das interessierende Verfahren besser geeignet sind.
Bei bakteriellen Proteasen handelt es sich um Enzyme, die derzeit in industriellen Verfahren sowohl im Nahrungsmittelsektor als auch im Reinigungsmittelbereich verwendet werden. Die meisten der verwendeten Proteasen werden aus Bazillusstämmen hergestellt. Sie werden in zwei große Kategorien eingeteilt: Serinproteasen, die hauptsächlich als Zusatzstoffe in der Reinigungsmittelindustrie verwendet werden, und neutrale Proteasen, die im Nahrungsmittelsektor und insbesondere in der Brauereiindustrie verwendet werden.
Aus der technischen Literatur und Patentveröffentlichungen sind viele Verfahren zur Herstellung von Serinproteasen mit hoher Beständigkeit gegen Oxidationsmittel (D.A. Estell und Mitarbeiter (1985), J. Biol. Chem: 260, 6518-21), hoher Temperaturbeständigkeit (T. Imanaka und Mitarbeiter, (1986), Nature, 324, 695-697) und mit hoher Beständigkeit gegenüber Denaturierung durch Reinigungsmittel (US-A-4 760 025) bekannt.
Hinsichtlich neutraler Protease ist in der Literatur ein Verfahren zur Verbesserung der thermischen Stabilität von aus B. stearothermophilus durch Ersetzen eines oder mehrerer Aminosäurereste an bestimmten Positionen hergestellter neutraler Protease beschrieben.
Die Verfügbarkeit dieser Verfahren läßt jedoch nicht darauf schließen, daß das Ersetzen des Aminosäurerests oder der Aminosäurereste zum Erreichen der gewünschten Ergebnisse durchgeführt werden sollte.
Darüber hinaus bewirken die in die enzymatischen Proteine zur Veränderung einer oder mehrerer charakteristischer Eigenschaften eingeführten Mutationen häufig eine unerwünschte Verminderung der enzymatischen Aktivität dieser Proteine.
Es wurde nun festgestellt, daß es möglich ist, die Thermostabilität neutraler Protease ohne Veränderung seiner enzymatischen Aktivität durch Ersetzen eines oder mehrerer Aminosäurereste an wohldefinierten Stellen der Aminosäuresequenz der neutralen Protease zu verbessern.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es somit, Mutanten neutraler Protease bereitzustellen, die ihre enzymatischen Aktivitäten bei einer Temperatur aufrechterhalten, bei der die neutrale Protease vom Wildtyp inaktiv wird, wobei die Mutanten dadurch gekennzeichnet sind, daß mindestens einer der Aminosäurereste Gly 189 und Gly 147 der Aminosäuresequenz der neutralen Protease durch einen verschiedenen Rest, der unter den natürlichen Aminosäuren ausgewählt ist, ersetzt ist, wobei die Numerierung durch Ausrichtung der Aminosäuresequenz an der des als Referenz herangezogenen Thermolysins (TLN) erfolgt.
Weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein mutageniertes Gen mit Codierung für eine Mutante der obengenannten neutralen Protease, die ihre enzymatische Aktivität bei einer Temperatur aufrecht erhält, bei der die neutrale Protease vom Wildtyp inaktiv wird, bereitzustellen.
Weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines replizierbaren Expressionsvektors in einem Bazillusstamm, der das obengenannte mutagenierte Gen umfaßt.
Weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines durch den obengenannten Vektor transformierten Bazillusstamms.
Weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung einer Mutante neutraler Protease, die ihre enzymatische Aktivität bei einer Temperatur aufrecht erhält, bei der neutrale Protease vom Wildtyp inaktiv wird, das das Züchten des obigen, durch einen replizierbaren, das mutagenierte Gen mit Codierung für die Mutante enthaltenden Expressionsvektor transformierten Bazillusstamms in einem geeigneten Kulturmedium sowie das Abtrennen und Reinigen des so erhaltenen mutierten Enzyms aus dem Kulturmedium umfaßt, anzugeben.
Weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Angabe der Verwendung der Mutanten neutraler Protease im Nahrungsmittel sektor.
Weitere Aufgaben der vorliegenden Erfindung werden aus der nachfolgenden Beschreibung und den Beispielen ersichtlich.
Erfindungsgemäße Mutanten neutraler Protease sind dadurch gekennzeichnet, daß die Glycin (Gly)-Aminosäurereste in den Positionen 189 und/oder 147 der Aminosäuresequenz der neutralen Protease durch einen verschiedenen bzw. anderen Rest, der unter den natürlichen Aminosäuren ausgewählt ist, ersetzt sind.
Erfindungsgemäß sind Mutanten neutraler Protease, bei denen die Gly-189- und/oder -147-Aminosäurereste durch den Aminosäurerest Alanin (Ala) ersetzt sind, bevorzugt.
Erfindungsgemäß sind die Mutanten neutraler Protease, bei denen beide Gly-Reste 147/189 durch Ala ersetzt sind, besonders bevorzugt.
Erfindungsgemäß ist das herangezogene Numerierungssystem das von Thermolysin, eines Enzyms, das von B. thermoproteoliticus hergestellt wird und neutraler Protease sehr ähnlich ist, wobei die Aminosäuresequenz derselben zueinander ausgerichtet werden (S. Toma und Mitarbeiter, (1989), Pro. Eng., 12: 359-364).
Erfindungsgemäße Mutanten neutraler Protease werden nach einem Verfahren hergestellt, das die folgenden Stufen umfaßt:
a) Einführung einer oder mehrerer Mutationen an spezifischen Stellen des Gens mit Codierung für neutrale Protease unter Verwendung einer in-vitro-Mutagenesetechnik;
b) Klonierung des in Stufe a) hergestellten mutagenierten Gens in einen Klonierungsvektor mit Expression und Sekretion in einem Bazillusstamm;
c) Transformation eines Bazillusstammes durch den in Stufe b) erhaltenen rekombinanten Vektor;
d) Züchten des gemäß Stufe c) transformierten Bazillusstammes in einem geeigneten Kulturmedium und schließlich
e) Abtrennen und Reinigen der hergestellten Mutante neutraler Protease aus dem Kulturmedium.
In Stufe a) des erfindungsgemäßen Verfahrens können die Mutationen unter Verwendung einer der bekannten in-vitro-Mutagenesetechniken an gut definierten Stellen des Gens eingeführt werden. Unter den verschiedenen Techniken zur Herstellung erwünschter Modifikationen in einer DNA-Sequenz werden die Verfahren, die synthetische Einzelhelixoligonucleotide verwenden, am häufigsten verwendet.
Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das von M.J. Zoller und M. Smith ((1982), Nucl. Acid. Res., 10, 6487-6500) beschriebene Verfahren verwendet, das die folgenden Stufen umfaßt:
1) Insertion des Gens neutraler Protease oder eines Teils davon (die Zielsequenz) in einen M13-Phagen oder in ein davon herrührendes Plasmid, und Herstellung desselben in Form eines Einzelstranges, der als eine "Matrize" zur Synthese der Mutante verwendet werden kann;
2) Synthese eines Oligonucleotids, das zu der zu mutagenierenden Sequenz mit Ausnahme eines die Mutation bewirkenden inneren Teils komplementär ist;
3) "Annealing" (Hybridisieren) des synthetischen Cligo nucleotids an die "Matrize". Diese wirkt für die Synthese des zweiten modifizierten Strangs als "Primer";
4) Wiederherstellung der ringförmigen Doppelhelixstruktur, wobei ein Strang der Ausgangsstrang ist und der andere Strang die gewünschte Mutation trägt, mittels eines in vitro durchgeführten Polymerisations- und Ligationsschrittes;
5) Verwendung der Doppelhelixform zur Transformierung von kompetent gemachten Wirtzellen, um so eine Population von Klonen der Mutante und vom Wildtyp herzustellen; und
6) Auswählen der Mutantenklone durch Hybridisierung mit speziellen Oligonudeotiden, durch Sequenzierung der hergestellten Klone oder durch Restriktionsanalyse.
Das Gen neutraler Protease, das mutageniert werden soll, kann aus verschiedenen Bazillusspezies isoliert werden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden das Gen neutraler Protease sowie die seine Expression und Absonderung steuernden Sequenzen aus einem B.-subtilis-Stamm, einem "Overproducer" neutraler Protease, isoliert und in das Plasmid pSM 127 kloniert. Dieses Plasmid, das in der Agricultural Research Service Culture Collection als B. subtilis SMS 108 NRRL B-15900 hinterlegt wurde, umfaßt das Replikon von B. subtilis und das Gen mit Kodierung für eine Resistenz gegen Kanamycin als Marker zur Auswahl der Transformanden.
Erfindungsgemäß wird das aus etwa 1550 Basenpaaren, einschließlich der Nucleotidsequenz mit Kodierung für reife neutrale Protease und einem Teil der Pro-Region des Gens neutraler Protease, bestehende BamHI-HindIII-Fragment aus dem Plasmid pSM 127 NRRL B-15900 durch Verdauung mit BamHI- und HindIII-Restriktionsenzymen isoliert.
Das Fragment wird dann in den zuvor mit den obengenannten Restriktionsenzymen verdauten M13-mp8-Phagen durch Ligation in Ligationsmischung (gemäß bekannter Verfahren) insertiert.
Die Mischung wird dazu verwendet, kompetent gemachte Escherichia-coli (E. coli)-Zellen (vgl. M. Dagert und Ehrlich, (1979), Gene, 6: 23) zu transformieren. Die Transformanden werden daraufhin auf einem geeigneten Kulturmedium ausgewählt. Der Einzelhelix-Strang wird nach seiner Herstellung aus einer der Positivschalen als Matrize zum Einführen der gewünschten Mutationen verwendet.
Eines der dem Fachmann auf dem einschlägigen Fachgebiet bekannten Verfahren kann zu diesem Zweck verwendet werden, beispielsweise das Verfahren von Zoller und Smith ((1983), Methods in Enzymol., 100: 468-500).
Um die Substitution von Gly durch Ala an den Positionen 189 bzw. 147 zu insertieren, werden die folgenden synthetischen Oligonudeotide verwendet:
Diese Oligonudeotide werden mittels bekannter Verfahren unter Verwendung eines automatischen Synthesegeräts synthetisiert.
Die Einzelhelix wird dann an das synthetische Oligonucleotid, das als "Primer" für die Synthese des zweiten modifizierten Stranges wirken soll, "annealed".
Nach Ausführung der gewünschten Mutationen wird die ringförmige Doppelhelixstruktur der Zielsequenz, deren erster Strang der Ausgangsstrang ist und deren weiterer Strang die gewünschte Mutation trägt, mittels eines in vitro durchgeführten Polymerisations- und Ligationsschrittes wiederhergestellt.
Gemäß der vorliegenden Erfindung können die wie oben beschrieben mutagenierten Gene in einen Klonierungsvektor mit Expression und Absonderung in einem Bazillusstamm insertiert werden, wobei das Gen unter der Steuerung von Sequenzen, die seine Expression und Absonderung in dem Wirtstamm regulieren, richtig positioniert wird.
Für diesen Zweck geeignete Vektoren können unter im Handel erhältlichen oder von autorisierten Sammelzentren erhältlichen Plasmiden ausgewählt werden. Vorzugsweise wird das Plasmid pSM 127 NRRL B-15900 verwendet.
In der Praxis wird das Plasmid mit BamHI- und HindIII-Restriktionsenzymen verdaut. Das die Sequenzen zur Steuerung der Expression und Absonderung neutraler Protease enthaltende Plasmid-DNA-Fragment mit 6131 Basenpaaren wird an das das mutagenierte Gen enthaltende Fragment mit 1550 Basenpaaren mittels auf dem Gebiet der rekombinanten DNA bekannten Verfahren ligiert.
Die daraus erhaltenen rekombinanten Plasmide werden dann in einen aus der B.-subtilis-Gruppe ausgewählten Wirtsmikroorganismus insertiert.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird der in der Agricultural Research Service Culture Collection als NRRL B-15898 hinterlegte B.-subtilis Stamm SMS 108 verwendet. Aufgrund der Anwesenheit von Mutationen, die chromosomale Gene mit Kodierung für neutrale Protease inaktivieren, exprimiert dieser Stamm neutrale Protease vom Wildtyp nicht.
In Stufe d) des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die Stämme in einem geeigneten Medium mit Kohlenstoff-, Stickstoff- und Mineralsalzquellen bei einer Temperatur von etwa 37ºC während eines für die Herstellung des gewünschten Produkts notwendigen Zeitraums wachsengelassen.
Typischerweise werden die durch das Plasmid pSM 127 transformierten Stämme von B. subtilis SMS 108 (Vergleichsstämme) und die durch die das mutagenierte neutrale Proteasegen enthaltenden Plasmide transformierten Stämme von B. subtilis SMS 108 in Kalbsinfusionsmedium (DIFCO) bei einer Temperatur von 37ºC 16 h lang wachsengelassen.
Gemäß elektrophoretischer Analyse auf Polyacrylamidgel (U.K. Laemmli, Nature, 227, 680-685, 1970) weisen die nach Zentrifugation der Kultur erhaltenen, überstehenden Flüssigkeiten einen Gehalt an neutraler Protease von 50 bis 100 mg/l auf, was mehr als 80% des gesamten ausgeschiedenen Proteins darstellt.
Erfindungsgemäße Mutanten können unter Verwendung einer oder mehrerer gängiger Chromatographietechniken gereinigt werden.
Erfindungsgemäß liefert das in Beispiel 3 nachfolgend beschriebene Verfahren Mutanten mit Reinheiten höher als 95%.
Die enzymatische Aktivität der erfindungsgemäßen Mutanten wurde durch Überwachen der Hydrolyse sowohl des spezifischen Substrats Casein (gemäß dem Verfahren von M.Kunitz, (1974), J. Gen. Physiol., 30, 291) als auch spezieller synthetischer Peptide bestimmt.
Die erhaltenen Ergebnisse zeigten eine verbesserte enzymatische Aktivität, vergleichbar mit der Aktivität neutraler Protease vom Wildtyp bei der Einzel-189-Mutante und bei der Doppel-147/189-Mutante. Die enzymatische Aktivität der Einzel-147-Mutante war jedoch vermindert (auf nahezu die Hälfte bezüglich Casein).
Des weiteren zeigten bei verschiedenen Temperaturen durchgeführte Studien zur thermischen Inaktivierung, daß die drei Mutanten eine höhere thermische Stabilität als die neutrale Protease vom Wildtyp besaßen.
Tatsächlich trat eine Halbierung der enzymatischen Aktivität der 147-Mutante bei einer Temperaturerhöhung von 4ºC, der 189-Mutante bei einer Temperaturerhöhung von 3ºC und der Doppel-147/189-Mutante bei einer Temperaturerhöhung von 7ºC auf, wenn die Mutanten einen Zeitraum von 30 min bei der jeweiligen Vorinkubationstemperatur gehalten wurden.
Darüber hinaus zeigte eine Untersuchung der Kinetik ihrer thermischen Inaktivierung bei verschiedenen Temperaturen (55ºC, 58ºC und 61ºC) eine mittlere Lebensdauer (wobei dieser Begriff die zur Halbierung der enzymatischen Aktivität erforderliche Zeit bedeutet), die bei der Doppelmutante 147/189 etwa siebenmal, bei der 147-Mutante dreimal und bei der 189-Mutante etwa zweimal so lang war, wie die mittlere Lebensdauer von neutraler Protease vom Wildtyp.
Zusammenfassend gesagt, bewirkt die Einzel-147-Mutation eine Steigerung der thermischen Stabilität, jedoch eine Verminderung der enzymatischen Aktivität; die Einzel-189-Mutation steigert die thermische Stabilität, wenn auch in einem geringeren Ausmaß als die 147-Mutation bei verbesserter katalytischer Wirksamkeit; die 147/189-Doppelmutation bewirkt eine deutlich höhere thermische Stabilität als sie durch die Einzelmutationen erreicht wird (additiver Effekt) und stellt die durch die Einzel-147-Mutation geänderte enzymatische Aktivität wieder her.
Obwohl die Erfindung unter Bezugnahme auf die Herstellung thermostabiler Mutanten der neutralen Protease von B. subtilis beschrieben ist, kann die Erfindung selbstverständlich auch hinsichtlich einer Modifikation homologer neutraler Proteasen, die von anderen Mikroorganismen und insbesondere von anderen Bazillusstämmen erhalten werden, verwendet werden.
Erfindungsgemäß wurden die Plasmide pSM 375 und pSM 376 mit der Einzelmutation Gly 189 bzw. der Doppelmutation Gly 147/189 bei dem Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS) als B. subtilis 108 (pSM 375) CBS 640.89 und B. subtilis 108 (pSM 376) CBS 641.89 hinterlegt.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen:

Fig.1 zeigt die durch Vergleich mit der bekannten Struktur von Thermolysin (Signor und Mitarbeiter, Eur. Biochem. (1990), derzeit im Druck) hergeleitete, dreidimensionale Struktur neutraler Protease und verdeutlicht die Positionen der Aminosäuren 147 und 189.
Der Glycinrest in Position 147 ist in der alpha-Helix des Moleküls, die einen Teil der aktiven Stelle des Enzyms bildet, lokalisiert, wogegen sich der Glycinrest in Position 189 in einer vor der aktiven Stelle selbst positionierten, strukturellen Schleife befindet.
Fig.2 ist eine schematische Darstellung der stellengerichteten Mutagenese des Gens mit Kodierung für die neutrale Protease von B. subtilis. Die Sterne bezeichnen das Kodon, das modifiziert wurde.
MCS = multiple Klonierungsstelle; SS = Einzelhelix-DNA von M13 mp8; LS, PRO und MAT bezeichnen die Leadersequenz oder Absonderungssignalsequenz, die Pro-Region bzw. die reife Region neutraler Protease. Der gestrichelte Pfeil zeigt die Wirkung des Klenow-Fragments von Pol-I-(Pol K)-DNA.
Fig.3 zeigt die elektrophoretische Analyse auf 12,5% Polyacrylamidgel (SDS-PAGE) des gereinigten NP-Enzyms vom Wildtyp (Spur 1), 189 (Spur 2), 147 (Spur 3) und 147/189 (Spur 4).
Die Fig. 4, 5 und 6 zeigen den Verlauf der thermischen Denaturierung von neutraler Protease vom Wildtyp und der 147-, 189- und 147/189-Mutanten bei 55ºC, 58ºC und 61ºC in Prozent der verbleibenden Aktivität in Beziehung zur Vorinkubations zeit.
Die nachfolgenden experimentellen Beispiele sollen die vorliegende Erfindung weiter verdeutlichen, sie jedoch in keiner Weise begrenzen.

Beispiel 1

Konstruktion thermostabiler Mutanten neutraler Protease

A) Klonierung des Bam-HI-Hind-III-Fragments des Gens neutraler Protease von B. subtilis in den Phagen M13 mp8

Das Plasmid PSM 127 (3 µg) wurde 1 h lang bei 37ºC mit fünf Einheiten der Restriktionsenzyme Bam HI und Hind III (Boehringer) verdaut. Nachdem die enzymatische Reaktion durch lominütiges Erwärmen auf 65ºC beendet worden war, wurde die Verdauungsmischung auf 0,8% Agarosegel aufgetragen und 2 h lang bei 100 V laufengelassen. Die 1550 Basenpaare umfassende Bam-HI-Hind-III-Bande, die die Sequenz mit Kodierung für den reifen Teil neutraler Protease und einen Teil der Pro-Region umfaßt, wurde daraufhin unter Verwendung des I.B.I.-Apparats (Modell U.E.A.) entsprechend der Herstelleranleitung elektroeluiert.
500 ng des dieser Bande entsprechenden DNA-Fragments wurde an 750 ng des zuvor mit den Restriktionsenzymen Bam HI und Hind III (5 Einheiten) verdauten Vektors M13 mp8 ligiert. Die Ligationsreaktion wurde in 50 µl einer Ligationsmischung, die 66 mMol Tris-HCl, pH-Wert 7,6, 1 mMol ATP, 10 mMol MgCl&sub2; und 10 mMol Dithiothreitol (DTT) enthielt, in Anwesenheit von 4 Einheiten T4-DNA-Ligase bei 14ºC während einer Nacht durchgeführt.
Die Ligationsmischung wurde daraufhin dazu verwendet, mit 50 mmolarer CaCl&sub2; kompetent gemachte E.-coli-JM-101-Zellen (BRL) zu transformieren (M. Dagert und Ehrlich (1979), Gene, 6: 23).
Die Transformanden wurden daraufhin auf YT-Agarplatten (8 g/l Bacto-Tripton (DIFCO), 5 g/l Bacto-Hefeextrakt (DIFCO), g/l NaCl) mit 40 µg/ml X-Gal (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-D- galactopiranosid) und 125 µg/ml IPTG (Isopropyl-beta-D-thio- galactopiranosid) ausgewählt.
Das oben beschriebene Verfahren lieferte viele Platten von positiven Rekombinanten (weiß), die leicht von den Platten der Nichtrekombinanten (blau) zu unterscheiden waren.
Für die Untersuchung, ob das BamHI-HindIII-Fragment in der gewünschten Orientierung insertiert worden war, wurde die Doppelhelixphagen-DNA (die replikative Form oder RF) aus einigen positiven Platten isoliert und mit BglII-Enzym (Boehringer) verdaut.
Anschließend wurde aus einer der positiven Platten, die die richtige Insertion zur Verwendung als Matrize in der stellenspezifischen Mutagenesestufe zeigten, eine Einzelhelix(SS)-Phagen-DNA hergestellt.

B) Stellenspezifische Mutagenese

Das von Zoller und Smith (Methods in Enzymol. 100 468-500 (1983)) beschriebene Verfahren wurde unter Verwendung der folgenden Oligonudeotide für die Gly T Ala-Mutationen an den Stellen 189 bzw. 147 durchgeführt:
Diese Oligonudeotide wurden unter Verwendung eines "One Plus DNA-Snythezisers" (Beckman) im Rahmen bekannter Verfahren synthetisiert, wobei stromauf der Mutationsstelle eine Restriktionsstelle erzeugt wurde, um die mutierten Klone ohne Schwierigkeiten durch Restriktionsanalyse ihrer DNA auswählen zu können. Die doppelte Mutante wurde unter Verwendung der Einzelhelix-DNA, die die Gly T Ala-Mutation an der Stelle 189 enthielt, als Matrize und des Oligonucleotids Nr. 2 als Primer hergestellt.
Fig. 2 zeigt ein Diagramm, das das Verfahren darstellt, nach dem die Mutagenese durchgeführt wurde.
In der Praxis wurden 44 Picomol (pmol) des als Primer verwendeten Oligonucleotids in 30 µl von 100 mMol Tris-HCl eines pH-Werts von 8,00, 10 mMol MgCl&sub2;, 5 mMol DTT und 0,1 mMol ATP phosphoryliert. Die Phosphorylierungsreaktion erfolgte während 45 min bei 37ºC in Gegenwart von 4,5 U Poly nucleotidkinase (Boehringer). Für die "Verschmelzungs- bzw. Annealing-" und Polymerisationsreaktionen wurden die SS-Phagen-DNA (die Matrize) und der Primer (verwendet in einem Molverhältnis von 1:30) zuerst 5 min bei 55ºC, anschließend weitere 5 min bei 23ºC und schließlich 16 h bei 15ºC in Gegenwart von 0,5 mMol der Desoxynudeotide (dATP, dGTP, dCTP und dTTP), von 2,5 Einheiten Klenow-Fragment (Boehringer) und 2 Einheiten T4-DNA-Ligase in einem Endvolumen von 20 µl inkubiert.
Zum Isolieren der kovalent geschlossenen Doppelhelix-DNA (cccDNA) wurde das Reaktionsgemisch auf einen 5 bis 20% Saccharosegradienten in 1 Mol NaCl, 0,2 N NaOH, 2 mMol EDTA aufgetragen, worauf 4 h mit Hilfe eines SW40-Rotors (Beckman) bei 37.000 Umdrehungen (1/min) eine Ultrazentrifugation durchgeführt wurde.
Die der cccDNA entsprechenden Fraktionen wurden gesammelt und zur Transformation kompetenter E.-coli-JM-101-Zellen verwendet. Die Transformanden wurden anschließend auf YT-Medium, dem wie oben beschrieben X-Gal und IPTG zugesetzt worden war, ausgewählt.
Zur Identifizierung der positiven Platten, die die an den Positionen 189 und/oder 147 eingeführten Gly- T Ala- Mutationen enthielten, wurde die von den Platten extrahierte Doppelhelixphagen-DNA mit den Enzymen Eco RV bzw. Sph I verdaut.
Um die Anwesenheit der eingeführten Mutationen zu bestätigen, wurden die aus den oben beschriebenen positiven Klonen hergestellten Einzelhelix-DNAS nach dem Sanger-Verfahren (F. Sanger und A.R. Coulson (1975), J. mol. Biol., 94: 441-443) unter Verwendung des Oligonucleotids GGTTCATTCTTCTCTCCG als Primer (SEQ. ID. Nr. 3) sequenziert.

Beispiel 2

Das Klonieren des mutierten BamHI-HindIII-Fragments in das Plasmid PSM 127

1,6 µg der mutagenierten Doppelhelixphagen-DNA wurden 1 h bei 37ºC mit den Restriktionsenzymen BamHI und HindIII (5 U) verdaut.
Nach Abstoppen der enzymatischen Reaktion bei 65ºC während 10 min wurde ein Teil des Verdauungsgemisches auf ein 0,8% Agarosegel aufgetragen und 2 h bei 100 V laufengelassen, um die Vollständigkeit der Verdauung zu überprüfen.
Der Rest des Verdauungsgemisches wurde anschließend zur Ligation von 500 ng des zuvor mit den Restriktionsenzymen BamHI und HindIII (5 U) verdauten Plasmids pSM 127 verwendet. Die Reaktion erfolgte in 20 µl des 66 mMol Tris-HCl eines pH-Werts von 7,6, 1 mMol ATP, 10 mMol MgCl&sub2; und 10 mMol Dithiothreit (DTT) enthaltenden Ligationsgemisches in Gegenwart von 1 U T4-DNA-Ligase über Nacht bei 14ºC.
Das Ligationsgemisch wurde zur Transformation von gemäß der Beschreibung von Dubnau und Contente (1979) in Mol. Gen. Genet., 167, 251-258 kompetent gemachten B. subtilis SMS 108 NRRL B-15898 Zellen (npr&supmin;, rec&supmin;) verwendet.
Die Transformanden wurden anschließend auf Platten von agarisiertem VY-Medium (0,8% Bactotripton, 0,5% Hefeextrakt, 0,5% NaCl), das 1% Casein und 5 µg/ml Kanamycin enthielt, ausgewählt.
Die aus einem der so erhaltenen positiven Klone (Kanamycinresistent) isolierten Plasmid-DNAs wurden anschließend durch Analyse mit EcoRV- und/oder SphI-Restriktionsenzymen getestet, um die korrekte Insertion der mutagenierten Fragmente in das Plasmid PSM 127 zu untersuchen.
Die eine einzelne Mutation bei 147 bzw. 189 bzw. die doppelte Mutation bei 147/189 enthaltenden Plasmide wurden als pSM 374, pSM 375 bzw. pSM 376 bezeichnet.

Beispiel 3

Die Charakterisierung der mutierten neutralen Proteasen

A) Expression und Sekretion der mutierten Proteasen

Stämme von B. subtilis SMS-108, die die Plasmide pSM 374 (B. subtilis SMS 263), pSM 75 (B. subtilis SMS 261) und pSM 376 (B. subtilis SMS 262) enthielten, sowie Stämme von B. subtilis (pSM 127) NRRL B-15900 (Vergleich) wurden 16 h bei 37ºC in 3 l eines die folgende Zusammensetzung besitzenden Mediums gezüchtet: 2,5% Kalbsinfusionsbrühe (DIFCO), 0,5% Hefeextrakt, 5 µg/ml Kanamycin.
Die Kulturen wurden anschließend 10 min bei 5000 l/min (Beckman SJ14 Rotor) zentrifugiert, wobei Teile der azellulären Überschichtflüssigkeiten durch Elektrophorese auf Polyacrylamidgel (U.K. Laemmli (1970), Nature, 227, 680-685) zur Bestimmung des Proteingehalts hiervon analysiert wurden.
Es wurden Konzentrationen von 50-100 mg/l erhalten. Diese Werte bedeuten mehr als 80% der gesamten extrazellulären Proteine.

B) Reinigung

Die wie oben in Stufe A beschrieben erhaltenen neutralen Proteasen wurden anschließend im Rahmen des folgenden Vorgehens bei 4ºC gereinigt.

a) Fällung mit Ammoniumsulfat

Die Proteine wurden durch Eintragen in eine schwach gerührte azelluläre Überschichtflüssigkeit aus Ammoniumsulfat bis zu einer 80%igen Sättigung über eine Zeitdauer von etwa 18 h hinweg gefällt. Nach zehnminütigem Zentrifugieren der Suspension von 5000 l/min wurde der proteinhaltige Niederschlag abgetrennt, in 30 ml 25 mMol Tris-HCl eines pH-Werts von 7,5, 2,5 mMol Calciumacetatpuffer resuspendiert und anschließend ausgiebig gegen denselben Puffer dialysiert.

b) Anionenaustauschchromatographie auf DEAE-Sephadex A25

Die wie oben in Stufe a) beschrieben erhaltene Lösung wurde auf eine 200 ml DEAE-Sephadex A25 enthaltende und mit 25 mMol Tris-HCl eines pH-Werts von 7,5, 2,5 mMol Calciumacetatpuffer äquilibrierte Chromatographiesäule (2,6 x 40 cm) (Durchmesser x Höhe) aufgetragen. Die Strömungsrate betrug 30 ml/h. Das Eluieren erfolgte unter Verwendung desselben Puffers wie für das Equilibrieren. Die enzymatische Aktivität zeigenden (bestimmt gemäß der Beschreibung im folgenden Beispiel 3) Fraktionen (je 5 ml) wurden gewonnen und wiedervereinigt.
Unter diesen Bedingungen wurde beinahe die gesamte neutrale Protease aus der Säule eluiert.

c) Gelfiltration auf Sephadex G-100

Die enzymatisch aktiven Fraktionen aus Stufe b) wurden anschließend auf DIAFLO-Ultrafiltern (AMICON YM10) aufkonzentriert und durch Gelfiltration auf 200 ml Sephadex G100 in einer mit 25 ml Tris-HCl eines pH-Werts von 7,5, 2,5 mMol Calciumacetatpuffer äquilibrierten Säule einer Größe von 1,6 x 100 cm unter Eluieren mit demselben Puffer weiter gereinigt.
Die Strömungsrate betrug 6 ml/h, wobei jeweils 3 ml Fraktionen gesammelt wurden.
Die Kalibrierung erfolgte zuvor mit Standards verschiedener Molekulargewichte unter den oben beschriebenen Bedingungen.
Während des Eluierens wurde die Aktivität der neutralen Protease in einem 31 Kd entsprechenden Bereich, der - unter Zulassen eines experimentellen Fehlers - dem vorausgesagten Molekulargewicht der NP-Aminosäuresequenz entspricht (S. Toma und Mitarbeiter, (1986), J. Bacteriol., 167: 740-753), gefunden.
Die enzymatisch aktiven Fraktionen wurden gewonnen und wiedervereinigt.

d) GlV-D-Phe-Affinitätschromatographie

Es wurde das Verfahren von K.A. Walsh und Mitarbeitern (1974) in "Methods Enzymol.", 34: 435-440, das auf der hohen Affinität des kompetitiven Hemmers Z-Gly-D-Phe (N-Carbobenzoxy-glycyl-D-phenylalanin) für Metalloproteinasen basiert, verwendet.
Die maximale Affinität für neutrale Protease wurde bei einem pH-Wert von 5 festgestellt. Dagegen wurde die neutrale Protease bei einem pH-Wert von 9 durch den Hemmer nicht mehr zurückgehalten.
Die proteinhaltigen Fraktionen aus Stufe c) wurden auf eine Chromatographiesäule (2,6 x 14 cm) von kovalent gebundene Gly-D-Phe-Gruppen aufweisender Sepharose 4B, die mit 100 mMol NaCl, 5 mMol Calciumacetatpuffer eines pH-Werts von 5 äquilibriert worden war, aufgetragen. Unter diesen Bedingungen wurde die neutrale Protease vom Wildtyp und die 189-Mutante vollständig in der Säule zurückgehalten, die 147/189- Mutante wurde lediglich teilweise zurückgehalten, während die 147-Mutante nicht zurückgehalten wurde.
Die Proteine wurden von der Säule mit Hilfe von 100 mMol Tris-HCl eines pH-Werts von 7,5, 5 mMol Calciumacetatpuffer eluiert.
Eine elektrophoretische Analyse auf 12,5% Polyacrylamidgel (SDS-PAGE) zeigte, daß die erhaltenen Produkte eine Reinheit von mehr als 95% (Fig. 3) zeigten und die Ausbeute etwa 25% des aufgetragenen Rohmaterials betrug.

Beispiel 3

Bestimmung der enzvmatischen Aktivität auf Casein

Die enzymatische Aktivität der Mutanten wurde mit Hilfe der Überwachung der Hydrolyse des Caseinsubstrat gemäß der Beschreibung von M. Kunitz, (1947), in "J. Gen. Physiol." 30, 291 bestimmt.
In der Praxis wurde eine 0,6%ige Caseinlösung in 50 mMol Tris-HCl eines pH-Werts von 7,0, 2 mMol Calciumacetatpuffer hergestellt. Eine 8 µg gereinigten Proteins entsprechende Enzymmenge wurde anschließend zu 5 ml dieser Lösung zugegeben. Die Proteinkonzentration wurde spektrophotometrisch als Absorptionswert (O.D.) bei 280 nm (mit Hilfe eines Perkin- Elmer-lambda-15-Spektrophotometers) bestimmt. Ein O.D.-Wert von 13,7 entspricht einer Konzentration an neutraler Protease von 1%.
Nach zehnminütiger Inkubation bei 37ºC wurden 5 ml einer 10%igen Trichloressigsäure (TCA) zur Lösung zugegeben, um die enzymatische Reaktion abzustoppen.
Das erhaltene Gemisch wurde 10 min bei 10.000 1/min zentrifugiert, worauf die Absorption der so erhaltenen überstehenden Flüssigkeit spektrophotometrisch bei 275 nm gegen eine Blindprobe, die aus nicht mit dem Enzym hydrolysiertem Casein bestand, bestimmt wurde.
Eine Erhöhung der Absorption (O.D.) von 0,2/10 min wurde beim Wildtypprotein und den 189- sowie 147/189-Mutanten beobachtet. Bei der 147-Mutante wurde eine Erhöhung der Absorption von 0,1/10 min beobachtet. Beide diese Werte fallen in den Bereich einer linearen Kinetik.
Gemäß diesem Verfahren entspricht eine enzymatische Einheit der Enzymmenge, die eine Absorptions (O.D.)-Erhöhung von 0,001/min liefert. Dies entspricht einer Freisetzung von 1 µMol Tyrosin (Tyr) aus dem Caseinsubstrat. Die spezifische Aktivität wurde als Einheiten/mg (U/mg) Protein ausgedrückt.
Die spezifische Aktivität des Wildtypproteins, der einzelnen 189-Mutante und der doppelten Mutante betrug 12.425 U/mg, die der 147-Mutante 7100 U/mg.
Dieser letztere Wert ist nicht auf die Anwesenheit von kontaminierenden Proteinen, sondern auf eine tatsächliche Abnahme der enzymatischen Aktivität zurückzuführen. Der Reinheitsgrad ist in der Tat mit dem, der für die anderen Proteine erhalten wurde (Fig. 3), vergleichbar.

Beispiel 4

Bestimmung der katalytischen Wirksamkeit auf Peptidsubstraten

Die kinetischen Parameter Km und Kcat der neutralen Wildtypprotease und der drei Mutanten wurden auf den synthetischen Peptidsubstraten Z-Phe-Leu-Ala, Z-Ala-Leu-Ala, Z-Gly-Leu-Ala und Z-Val-Leu-Ala (Bachem, Bubendorf, Schweiz) bestimmt.
Die Hydrolysereaktionen erfolgten bei 37ºC in 0,6 ml einer Lösung, die 25 mMol Tris-HCl eines pH-Werts von 7,0 und 2,5 mMol Calciumacetat enthielt, unter Verwendung verschiedener Konzentrationen des Substrats (von 0,2 bis 20,0 mMol) und des Enzyms (von 0,04 bis 5 µg/ml).
100-µl-Teile wurden zu verschiedenen Zeitintervallen aus den Reaktionsgemischen entnommen, worauf diese Teile mit 100 µl einer Lösung von H&sub2;O:CH&sub3;CN:H&sub3;PO&sub4; in einem Volumenverhältnis von 64:34:1 versetzt und die Gemische 5 min bei 14.000 1/min zentrifugiert wurden.
20 µl der so erhaltenen überstehenden Flüssigkeit wurden anschließend auf eine VYDAC 218 TP S415 HPLC-Säule (4,6 x 150 mm, 10-µm-Teilchen) aufgetragen und die Hydrolyseprodukte (Z-Phe, Z-Ala, Z-Val und Z-Gly) durch isokratisches Eluieren bei einer Strömungsrate von 1,5 ml/min unter Verwendung der Lösung A (0,05% H&sub3;PO&sub4;, v/v) und der Lösung B (H&sub2;O:CH&sub3;CN:H&sub3;PO&sub4;, 4,95:95,0:0,05 v/v) in entsprechend dem verwendeten Substrat wechselnden Verhältnissen getrennt.
Die Reaktionsprodukte wurden mit Hilfe ihrer Absorption bei 220 nm bestimmt und durch Integrieren der Eluierpeaks unter Verwendung des System-Gold-Programms (Beckman) quantifiziert.
Für jedes der getesteten Substrate zeigt Tabelle I die Menge der beim Eluieren verwendeten Lösung B als Prozentsatz der Menge der Lösung A, die Konzentration des Enzyms (µg/ml) und des Peptids (mMol), die bei der Reaktion verwendet wurden, die Zeitintervalle zwischen den Entnahmen und die Retentionszeit eines jeden Substrats und Produkts.
Mit Hilfe der Anfangsgeschwindigkeit (vi) und Maximalgeschwindigkeit (Vmax) wurde für jedes der Substrate unter Verwendung der Michaelis-Menten-Gleichung Km und Kcat bestimmt:
v = (E) o (S) Kcat / Km + (S)
Tabelle II zeigt die Werte von Km, Kcat und der katalytischen Effizienz (ausgedrückt als Verhältnis Kcat/Km) für jede der Mutanten und der Substrate, die untersucht wurden.
Die in dieser Tabelle angegebenen Ergebnisse zeigen eine Abnahme der katalytischen Effizienz bei der 147-Mutante (eine Bestätigung der bei Casein erhaltenen Daten), eine Erhöhung der katalytischen Effizienz für die 189-Mutante (vom 7fachen auf das 14fache bei drei der Substrate), die insbesondere der hohen Affinität zum Substrat zuzuschreiben ist (die Km- Werte waren niedriger als beim Wildtyp), und Werte der katalytischen Effizienz der doppelten Mutante 147/189, die mit denjenigen der neutralen Wildtypprotease vergleichbar sind. Tabelle I Substrat Isokratisches Programm (%B) Enzymkonzentration (µg/ml) Entnahmezeit (s) Substratkonzentration (mMol) R.T. Produkt (min) R.T. Substrat (min) Tabelle II

Beispiel 5

Die Kinetik der thermischen Inaktivierung

Untersuchungen bezüglich der thermischen Inaktivierung erfolgten durch Inkubieren der Lösungen einer neutralen Wildtypprotease und der einzelnen Mutanten (1 mg/ml) in 25 mMol Tris-HCl eines pH-Werts von 7,5, 2,5 mMol Calciumacetatpuffer bei verschiedenen Temperaturen.
Jede Probe wurde in ein Durham-Glas-Röhrchen eingebracht und in einem bei vorgewählter Temperatur equilibrierten Bad mit thermostatisch gesteuerter Temperatur vorinkubiert. Durch Verschließen der Röhrchen mit Parafilm wurde ein Verdampfen der Proben verhindert. Zu verschiedenen Zeiten wurden Teile (50 µl) einer jeden Probe entnommen, in 5 ml einer 0,6% Casein enthaltenden Pufferlösung verdünnt und 10 min gemäß der Beschreibung in Beispiel 4 bei 37ºC getestet. Die Messung zur Zeit 0 entspricht der Hydrolyseausbeute von Casein, die bestimmt wurde, bevor die Probe in das Bad mit thermostatisch gesteuerter Temperatur eingetaucht wurde.
Der Graph der verbleibenden prozentualen Aktivität, aufgetragen gegen die Zeit, ist linear. Dies legt die Vermutung nahe, daß die Inaktivierungsreaktion nach einer Kinetik erster Ordnung abläuft.
Die Fig. 4, 5 und 6 zeigen den Aktivitätsverlust der mutierten Proteasen und der Protease vom Wildtyp bei 55ºC, 58ºC und 61ºC.
Die zur Halbierung der enzymatischen Aktivität bei diesen Temperaturen erforderliche Zeit betrug: Tabelle III Wildtyp
Aus der obigen Tabelle ist ersichtlich, daß die mittlere Lebensdauer der Mutante 147 dreimal so groß ist wie die der Wildtypprotease, und daß die Lebensdauer der Mutante 189 etwa doppelt so groß ist, während die Lebensdauer der doppelten Mutante 7mal so groß ist.
Diese Ergebnisse zeigen deutlich, daß das gleichzeitige Ersetzen der Aminosäure Glycin durch Alanin in den Positionen 147 und 189 die thermische Stabilität der Protease ohne Beeinträchtigung ihrer enzymatischen Aktivität deutlich erhöht.

Sequenzlisting

SEQ. ID. Nr.: 1
Sequenz typ: Nucleotid
Sequenzlänge: 33 Basenpaare
Strangform: Einzelstrang
Topologie: Linear
Art des Moleküls: Synthetische DNA
Merkmale: von 10 bis 15 EcoRV-Stelle
SEQ. ID. Nr.: 2
Sequenztyp: Nucleotid
Sequenzlänge: 33 Basenpaare
Strangform: Einzelstrang
Topologie: Linear
Art des Moleküls Synthetische DNA
Merkmale: von 12 bis 15 SphI-Stelle
Eigenschaften: Primer
SEQ. ID. Nr.: 3
Sequenz typ: Nucleotid
Sequenzlänge: 18 Basenpaare
Strangform: Einzeistrang
Topologie: Linear
Art des Moleküls: Synthetische DNA
Eigenschaften: Primer

Claims

1. Mutanten neutraler Protease, die ihre enzymatischen Aktivitäten bei einer Temperatur aufrechterhalten, bei der die neutrale Protease vom Wildtyp inaktiv wird, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens einer der Aminosäurereste Gly 189 und Gly 147 der Aminosäuresequenz der neutralen Protease vom Wildtyp durch einen verschiedenen Rest, der unter den natürlichen Aminosäuren ausgewählt ist, ersetzt ist, wobei die Nummerierung durch Ausrichtung der Aminosäuresequenz an der des als Referez herangezogenen Thermolysins (TLN) erfolgt.

2. Mutanten neutraler Protease nach Anspruch 1, wobei der natürliche Aminosäurerest L-Alanin ist.

3. Mutante neutraler Protease nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Aminosäurerest Gly 189 der Aminosäuresequenz neutraler Protease durch den Aminosäurerest L-Alanin ersetzt ist.

4. Mutante neutraler Protease nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß beide Aminosäurereste Gly 147 und Gly 189 der Aminosäuresequenz neutraler Protease durch den Aminosäurerest L-Alanin ersetzt sind.

5. Mutageniertes Gen neutraler Protease mit Codierung für eine Mutante neutraler Protease nach Anspruch 1.

6. Mutageniertes Gen neutraler Protease nach Anspruch 5 mit Codierung für eine Mutante neutraler Protease, worin der Aminosäurerest Gly 189 der Sequenz der neutralen Protease vom Wildtyp durch den Aminosäurerest Alanin ersetzt ist.

7. Mutageniertes Gen neutraler Protease nach Anspruch 5 mit Codierung für eine Mutante neutraler Protease, worin beide Aminosäurereste Gly 189 und Gly 147 der Aminosäuresequenz der neutralen Protease vom Wildtyp durch den Aminosäurerest L- Alanin ersetzt sind.

8. Plasmid, das zur Expression und Absonderung von Mutanten neutraler Protease nach Anspruch 1 in einem Bazillus führt und das mutagenierte Gen nach Anspruch 5, einen Marker zur Auswahl der Transformanten und ein Replikon, das seine Replikation im Bazillus gewährleistet, umfaßt.

9. Plasmid pSM 375, erhältlich von CBS 640.89 nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das mutagenierte Gen für die Mutante nach Anspruch 3 codiert.

10. Plasmid pSM 376, erhältlich von CBS 641.89 nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das mutagenierte Gen für die Mutante nach Anspruch 4 codiert.

11. Aus der Gruppe Bazillus subtilis ausgewählter Mikroorganismus, der ein Plasmid nach Anspruch 8 bis 10 enthält.

12. Bazillus subtilis SMS 108 (pSM 375) CBS 640.89.

13. Bazillus subtilis SMS 108 (pSM 376) CBS 641.89.

14. Mutanten neutraler Protease nach Anspruch 1, hergestellt nach einem Verfahren, das die folgenden Stufen umfasst:

a) Züchten eines durch ein Plasmid nach Anspruch 8 transformierten Bazillusstamms in einem geeignetem Kulturmedium, das Quellen von Kohlenstoff, Stickstoff und Mineralsalzen enthält, und

b) Abrennen und Reinigen der so erhaltenen Mutanten neutraler Protease aus dem acellulärem Kulturmedium.

15. Mutante neutraler Protease nach Anspruch 14, worin der Bazillus Bazillus subtilis SMS 108 (pSM 375) CBS 640.89 ist.

16. Mutante neutraler Protease nach Anspruch 14, worin der Bazillus Bazillus Subtilis SMS 108 (pSM 376) CBS 641.89 ist.

17. Mutanten neutraler Protease nach Anspruch 1 bis 4 zur Verwendung auf dem Nahrungsmittelsektor.