JP4786904B2 - 配列変化検出及び発見用の断片化をベースとする方法及びシステム - Google Patents
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Description
2002年11月27日に出願された「Fragmentation-based Methods and Systems for Sequence Variation Detection and Discovery」との表題の米国仮特許出願第60/429,895号に対する優先権の利益を主張する。
すべての生物(例えば、動物、植物、及び微生物)の遺伝子情報は、デオキシリボ核酸(DNA)にコードされている。ヒトにおいて、完全なゲノムは24個の染色体上に位置する約100,000個の遺伝子からなる(The Human Genome, T. Strachan, BIOS Scientific Publishers, 1992)。各遺伝子は、転写及び翻訳を介して発現した後に生細胞内で特定の生物化学機能を果たす特異的なタンパク質をコードする。
非常に正確なSNP、変異、及び他の配列変化の検出及び発見用の方法及びシステムを本明細書中に提供する。本明細書での方法及びシステムによって、迅速で正確なSNP、変異、及び配列変化の検出及び発見が可能となる。
A.定義
B.フラグメントの生成方法
C.多型、変異、及び配列変化の発見技術
D.適用
E.システム及びソフトウェア方法
F.実施例
別に定義しない限り、本明細書中で用いる技術及び科学用語はすべて、本発明が属する当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書中の開示全体にわたって言及される特許、特許出願、公開された出願、及び公表物、遺伝子バンク配列、ウエブサイト、並びに他の公表された資料はすべて、注記しない限り、参照により本明細書に全部取り入れる。本明細書中の用語について複数の定義がある場合には、本セクションの用語が優先する。URL又は他のそのような識別子若しくはアドレスを参照する場合、識別子は変わることができ、かつ、インターネット上の特定の情報が現れては消えることができるが、インターネットを検索することによって等価な情報を見出すことができると理解する。それらの参照は、そのような情報の有用性及び公衆への普及を立証するものである。
核酸の断片化
核酸の断片化は当該技術分野で既知であり、多くの方法で達成することができる。例えば、標的核酸中の特異的部位における開裂によって断片化が得られる限り、DNA、RNA、DNA及びRNAのアナログ、又はそれらの組み合わせからなるポリヌクレオチドを、物理的、化学的、又は酵素的に断片化することができる。フラグメントは、(i)開裂試薬の塩基特異性(例えば、A、G、C、T、若しくはU、又は修飾された塩基若しくはヌクレオチドの認識);又は(ii)標的核酸の構造;、又は(iii)双方の組み合わせに基づき、標的核酸配列中の特異的位置で開裂することができ、標的核酸から生じる。フラグメントはサイズが種々異なることができ、好適なフラグメントは、典型的には、約2000個未満の核酸である。好適なフラグメントは、約1000未満の塩基、約100〜約500個の間の塩基、又は約25〜約200個の塩基を含むが限定するものではない、いくつかのサイズ範囲に属することができる。ある態様では、約1個の核酸のフラグメントが望ましい。
NY2A:5’...RAG...3’
3’...YTC...5’(R=又はGであり、Y=C又はTである)
NYS1:5’...CC[A/G/T]...3’
3’...GG[T/C/A]...5’
ニッカーゼ反応からの生成物を引き続き化学的処理することによって、リン酸骨格が開裂され、フラグメントが生成する。
プロテオミクスへの関心が研究分野で増大するにつれ、タンパク質配列決定で使用するためのタンパク質断片化について多くの技術が開発されている。これらの中の1つは、化学的加水分解及び酵素加水分解、並びにイオン化エネルギーによる断片化である。
タンパク質又は核酸のイオン化断片化は、質量分光計(MS)のイオン化区域中でより高い電圧を用いてフラグメント化することにより、あるいはイオントラップ中で衝突誘起解離を用いたタンデム型MSにより、質量分析による分析中に行われる(例えば、Bieman, Methods in Enzymology, 193: 455-479(1990)を参照のこと)。アミノ酸又は塩基配列は、MSでの個々のアミノ酸残基又はヌクレオチド残基と関連する公表された質量を用いて、ペプチド又は核酸の得られたMS断片化パターンで観察される分子量の違いから推定する。
参照配列と相対的な標的配列中の変異、多型、又は他の配列変化を検出することができるスピードを増す技術を本明細書中に提供する。参照配列と相対的な標的配列中の既知の又は未知の配列変化を発見するための従前の方法は、参照配列のすべての可能な標的配列変化(置換、挿入、欠失、多型、及び種依存性変化を含む)について、その特定の標的配列のための所与の開裂試薬又は開裂試薬の組によって生じるであろう特定の断片化スペクトルをシミュレーションすることを伴うものであった。そのような従前の方法では、次いで、参照配列と相対的な標的配列中のすべての可能な配列変化によって生じるシミュレーションの各々を標的配列について得られる実際の断片化スペクトルに対して比較し、標的配列中に存在する実際の配列変化を決定する。そのような手法での問題は、すべての可能な配列変化のシミュレーションを生ずるために費やされる時間及び供給源が法外であり得ることである。
これは、標的核酸配列の1つ以上の特異的開裂反応の結果を分析するために用いる基礎技術である。第1の工程は、同じ参照核酸開裂反応と相対的な標的核酸開裂反応で生じる各異なるフラグメントの実際の質量とは十分に小さい質量の違いより小さいかそれと等しい値だけ質量が異なるすべての可能なコンポマーを同定する。これらのコンポマーを「コンポマー・ウィットネス」と呼ぶ。例えば、異なるフラグメントピークが2501.3Daで検出されると仮定する。例えば、+/−2Daのピーク質量間隔内の質量を有する天然のコンポマーだけが2502.6DaでA1C4G2T1である。認識される塩基(ここではT)が開裂部位で除去されない開裂反応の場合には(例えば、UDGは開裂される塩基を除去するが、RNAseAは除去しない)、該認識塩基を差し引いて、コンポマーA1C4G2となる。このようにして検出されるすべてのコンポマーをコンポマー・ウィットネスと呼ぶ。
c(b)>0のbではd+(c):=Σ{A、C、G、T}中のbc(b)、
c(b)<0のbではd-(c):=Σ{A、C、G、T}中のbc(b)、
と定義され、関数d(c)は、d(c):=最大{d+(c),d-(c)}、及びd(c,c’):=d(c−c’)と定義される。これは、あるフラグメント、例えば、参照フラグメントを別のもの、例えば、標的フラグメントに変異させるのに必要である挿入、欠失、置換、及び他の配列変化の数をより低い結合に与える測量用関数である。f、f’がフラグメントであり、かつ、c、c’が対応するコンポマーである場合、fをf’に変換するために少なくともd(c,c’)配列変化が必要である。
D(c’,c,b):=d(c’,c)+#b、
と定義される。関数D(c’,c,b)は、コンポマー・ウィットネスc’を生ずるために必要である参照配列と相対的な配列変化の最小数を測定する。
・b[i,j]:={L,R}(sがiの前及びjの後で直接開裂されない場合)
・b[i,j]:={R}(sがiの前で直接開裂されるがjの後で直接開裂されない場合)
・b[i,j]:={L}(sがjの後に直接開裂されるがiの前に直接開裂されない場合)
・b[i,j]:={}(sがiの前及びjの後で直接開裂される場合)。
#b[i,j]は、組b[i,j]の要素の数を表す。
入力:参照配列s(又は2つ以上の参照配列)、修飾ヌクレオチド又はアミノ酸を配列のすべて又は一部に導入するかの開裂反応の記載、異なるフラグメントに対応するピークのリスト(消失シグナル、又は追加シグナル、又は参照配列と相対的な標的配列の定性的違いのいずれか)、最大の配列変化位数k。
・bがLである場合には位置iの直前で開裂された塩基又はアミノ酸に直接に挿入/置換し、
・bがRである場合には位置jの直後で開裂された塩基又はアミノ酸に直接に挿入/置換するように、挿入、欠失、及び置換を多くてもk個用いて、sのすべての配列変化を計算処理して新しい参照配列s’にする。
・bがLである場合には位置iの直前の開裂された塩基又はアミノ酸に直接に挿入/置換し;
・bがRである場合には位置jの直後の開裂された塩基又はアミノ酸に直接に挿入/置換し;
・対応するコンポマーcを有するフラグメントf=s[i,j]を対応するコンポマーc’を有するs’のいくつかのフラグメントf’に変換する#bの挿入、欠失、及び挿入を多くてもk個用いる
ように、挿入、欠失、及び置換を多くてもk個用いて、sのすべての配列変化を計算処理して新しい参照配列s’にすることを伴う操作を表す。
・b[i,j]:={L,R}(sがiの前及びjの後で直接開裂されない場合)
・b[i,j]:={R}(sがiの前で直接開裂されるがjの後で直接開裂されない場合)
・b[i,j]:={L}(sがjの後に直接開裂されるがiの前に直接開裂されない場合)
・b[i,j]:={}(sがiの前及びjの後で直接開裂される場合)。
#b[i,j]は、組b[i,j]の要素の数を表す。
第2のアルゴリズムを用いて、計算処理された各出力配列変化候補についてシミュレーションしたスペクトルを生ずる。以下に記載する第3の(スコア付け)アルゴリズムを用いて、各配列変化候補についてシミュレーションしたスペクトルを実際の標的スペクトルに対してスコア付けし、参照配列に参照スペクトルを適用する。次いで、スコアの値(スコアが高いほどマッチングが良好であり、最も高いスコアは、通常、最も存在する可能性の高い配列変化である)を用いて、標的核酸配列中に実際に存在する配列変化候補を決定する。
入力:参照配列s、1つ以上の開裂反応、すべての開裂反応についてのシミュレーションした又は実際の参照断片化スペクトル、すべての開裂反応についての対応する試料スペクトル中に見出されるピークのリスト、最大の配列変化位数k。
スコア付け用アルゴリズムであるSNPのスコア付けの代表的な実行は、以下の通りである。
SNPのスコア付け
入力:参照配列に対応するピークリスト(Lと表される)、修飾参照配列に対応するピークリストs’(L’と表される)、及び試料スペクトルに対応するピークリスト(LSと表す)
1.多型の検出
本明細書での目的は、疾患のゲノム主成分及びそれらのマーカーを同定するための改良方法を提供することである。本明細書中に提供する方法におよって同定される配列変化候補には、多型である配列変化を含む配列が含まれる。多型には、天然に存在する体細胞性配列変化及び変異から生ずるもの双方が含まれる。多型には、局在領域中の2個以上のヌクレオチドが個体ごとに種々異なる配列微小変異体、1個のヌクレオチドから数百万の塩基までサイズが種々異なる挿入及び欠失、及びマイクロサテライト又は多数のリピートによって種々異なるヌクレオチドリピートが含まれるが、限定するものではない。ヌクレオチドリピートには、ジヌクレオチドリピート、トリヌクレオチドリピート、テトラヌクレオチドリピート、又はより大きいリピートなどの同じ配列が複数回繰り返される均一なリピートが含まれ、配列モチーフが繰り返されているのが見られるへテロヌクレオチドリピートも含まれる。所与の座では、ヌクレオチドリピートの数は個体に依って種々異なる。
微生物株の同定プロセス又は方法を本明細書中で提供する。微生物は、限定するものではないが細菌、真菌、原生動物、繊毛虫類、及びウイルスを含む種々の生物から選択される。微生物は、特定の属、種、株、又は血清型に限定されない。1又は複数の参照配列と相対的な標的微生物配列中の配列変化を決定することによって、微生物を同定することができる。参照配列は、例えば、同じ又は異なる属、種株、若しくは血清型由来の他の微生物、又は宿主原核生物若しくは真核生物から得ることができる。
本明細書中に提供する方法を用いて、1つ以上の参照配列と相対的なウイルス又は細菌核酸配列中に存在する配列変化を同定することより、感染を示すウイルス又は細菌核酸配列の存在を決定する。参照配列には、関連する非感染性生物から得られる配列又は宿主生物由来の配列が含まれるが、限定するものではない。
本明細書中に提供する特異的開裂断片化パターンの分析は、抗生物質耐性を含む薬物耐性に関与するヌクレオチド変化の検出スピード及び精度を向上させる。イソニアジド、リファンピン、ストレプトマイシン、フルオロキノロン、及びエチオナミドに対する耐性に関与する遺伝子座が同定されている[Heym et al., Lancet 344:293 (1994) and Morris et al., J. Infect. Dis. 171:954 (1995)]。ピラジナミド及びエタンブトール又はストレプトマイシンとともに用いるイソニアジド(inh)及びリファンピン(rif)の組み合わせは、結核菌(M. tuberculosis)が確認された場合に対する最初の攻撃系として日常的に用いられる[Banerjee et al., Science 263:227 (1994)]。そのような耐性株の発生が増加しているため、それらを検出し、かつ、それにより非効率的でおそらく有害な治療を推し進める費用及び地域健康被害を減らすための迅速なアッセイの開発が必要にする。薬物耐性に関与するいくつかの遺伝子座の同定は、薬物耐性を生ずるヌクレオチド変化を迅速にスクリーニングするための変異検出技術の採用を促進している。
疾患の予後を診断又は決定するために用いることができる疾患の遺伝子マーカーである配列変化の迅速で正確な同定方法を本明細書中に提供する。遺伝子マーカーによって特徴付けられる疾患には、アテローム性動脈硬化症、肥満、糖尿病、自己免疫疾患、及び癌が含まれるが、限定するものではない。すべての生物における疾患は、遺伝されたものであろうと環境ストレスに対する体の応答から生じたものであろうと、ウイルス及び毒素などの遺伝成分を有する。進行中のゲノム研究の最終目的は、この情報を用いてこれらの疾患を同定、治療、及び潜在的に治癒する新たな方法を開発することである。第1の工程は、疾患組織をスクリーニングし、個々の試料のレベルでゲノム変化を同定することである。これらの「疾患」マーカーの同定は、誤った遺伝子又は多型を同定するためには、ゲノムマーカーの変化を検出する能力に依存する。ゲノムマーカー(単一ヌクレオチド多型(SNPs)、マイクロサテライト及び他の非コードゲノム領域、タンデムリピート、イントロン及びエキソンを含むすべての遺伝子座)をヒトを含むすべての生物の同定に用いることができる。これらのマーカーにより、集団を同定するだけではなく、疾患に対する反応、薬物治療、環境作用因子への耐性、及び他の要因に従って集団を階層に分けることも可能とする方法が提供される。
本明細書中に提供する方法を用いてハプロタイプを検出することができる。任意の二倍体細胞には、少なくとも1つの特徴的な変化を含む任意の遺伝子又は他の染色体セグメントにおいて2つのハプロタイプがある。多くのよく研究された遺伝系では、ハプロタイプは単一ヌクレオチド変化よりも強く表現型と相関している。したがって、ハプロタイプの決定は、疾患の素因又は感受性、治療介入に対する反応、並びに薬剤、動物畜産、及び農業におけるその他の対象の表現型を含む種々の表現型の遺伝の基礎の理解に有益である。
断片化をベースとした本明細書中に提供する方法により、マイクロサテライトである配列変化の迅速で明確な検出が可能となる。マイクロサテライト(可変数タンデムリピート又はVNTRと称することもある)は、1〜7個以上の塩基の直列的に反復する短いヌクレオチド単位であり、それらの中で最も著名なものはジヌクレオチドリピート、トリヌクレオチドリピート、及びテトラヌクレオチドリピートである。マイクロサテライトは、ゲノムDNA中に100,000bp毎に存在している(J. L. Weber and P. E. Can, Am. J. Hum. Genet. 44,388(1989); J. Weissenbach et al., Nature 359, 794 (1992))。CAジヌクレオチドリピートは、例えば、ヒトミトコンドリア外ゲノムの約0.5%を構成する。CT及びAGリピートは一緒に、約0.2%を構成する。CGリピートは、ほぼおそらくCpG島の調節機能が原因となって、非常に少ない。マイクロサテライトは、長さに関して非常に多型であり、非コード配列内に主に存在しつつも全体ゲノムにわたって広範に分布しており、ゲノム内でのその機能は不明である。
本明細書中に提供する方法を用いて、例えばSTR領域を含まないヒトゲノム中の参照配列と相対的なヒトゲノムのある標的配列中のショートタンデムリピート(STR)領域を同定することができる。STR領域は、疾患又は状態のいずれとも関連しない多型領域である。ヒトゲノム中の多くの座は、多型のショートタンデムリピート(STR)領域を含む。STR座は、長さが3〜7塩基対の短い反復配列エレメントを含む。ヒトゲノム中に15kb毎に1つの頻度で存在する200,000個の予測される三量体及び四量体STRがあると推測されている(例えば、国際PCT出願第WO9213969A1号、Edwards et al., Nucl. Acids Res. 19: 4791 (1991); Beckmann et al. (1992) Genomics 12: 627-631を参照のこと)。これらのSTR座のほぼ半分は、遺伝子マーカーの豊富な供給源を提供する多型である。特定の座における反復単位の数の変化は、可変ヌクレオチドタンデムリピート(VNTR)座(Nakamura et al. (1987) Science 235: 1616- 622);及びより長いリピート単位を含むミニサテライト座(Jeffreys et al. (1985) Nature 314: 67-73)、並びにマイクロサテライト又はジヌクレオチドリピート座(Luty et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19: 4308; Litt et al. (1990) Nucleic Acids Res. 18: 4301; Litt et al. (1990) Nucleic Acids Res. 18 : 5921;Luty et al. (1990) Am. J. Hum. Genet. 46: 776-783; Tautz (1989) Nucl. Acids Res. 17: 6463-6471; Weber et al. (1989) Am. J. Hum. Genet. 44: 388-396; Beckmann et al. (1992) Genomics 12: 627-631)を連想させる観察される多型の原因となっている。
多型STR座及び他の遺伝子多型領域は、ヒトの同定、父及び母であることの試験、遺伝子マッピング、移入及び遺伝論争、双子における接合生殖性試験、ヒトでの同系交配についての試験、ヒト培養細胞の品質管理、ヒト遺体の同定、並びに精液試料、血痕、並びに法医学における他の物質の試験に非常に有用なマーカーである配列変化である。そのような座は、商業的な動物の飼育及び血統分析並びに商業的な植物の育種において有用なマーカーでもある。植物作物及び動物における経済上重要な形質を、多型DNAマーカーを用いた連鎖分析によって同定することができる。そのような座の同一性を決定するための効率的かつ正確な方法を本明細書中に提供する。
本明細書中に提供する方法により、対立遺伝子変異体の迅速かつ正確なハイスループット検出が可能となる。対立遺伝子変化の研究は、複雑なバックグランド中での特定配列の検出のみならず、数個又は単一のヌクレオチドの違いを有する配列間の区別も伴う。PCRによる対立遺伝子特異的変異体の1つの検出方法は、鎖鋳型及びプライマーの3’末端の間にミスマッチがある場合にはTaqポリメラーゼがDNA鎖を合成することは難しいとの事実に基づく。可能な対立遺伝子のうち1つだけと完全にマッチングするプライマーを用いることにより、対立遺伝子特異的変異体を検出することができる。他の対立遺伝子に対するミスマッチはプライマーの伸長を妨げるように作用し、それによりその配列の増幅が妨げられる。この方法は、ミスマッチの塩基組成がミスマッチを超える伸長を妨げる能力に影響を与え、かつ、ある種のミスマッチは伸長を妨げないか最小限の効果だけを有するという点において、実質的な制限を有している(Kwok et al., Nucl. Acids Res., 18: 999[1990]))。本明細書中に提供する断片化をベースとした方法は、プライマー伸長法の制限を克服するものである。
本明細書に記載される方法は、年齢、人種集団、性、又はある他の基準の関数として頻度が集団内で変わる1又は数個の遺伝子マーカーの同定に有益である。例えば、ApoE遺伝子型の年齢依存型の分布は当該技術分野で既知である(Schichter et al. (1994) Nature Genetics 6 : 29-32を参照のこと)。疾患とあるレベルで関連することが知られる多型の頻度を用いて、疾患状態の進行を検出又はモニタリングすることもできる。例えば、アミノ酸コドン291においてセリンがアスパラギンに置き換えられたリポタンパク質リパーゼ遺伝子のN291S多型(N291S)は、男性の動脈硬化症、特に具体的には心筋梗塞の危険性の増加と関連がある高密度リポタンパク質コレステロール(HDL−C)のレベルを減少させる。(Reymer et al. (1995) Nature Genetics 10: 28-34を参照のこと)。さらに、対立遺伝子頻度の変化を決定することによって、従前には不明であった多型の同定が可能となり、疾患の開始及び進行に関与する遺伝子又は経路の同定が最終的には可能となる。
本明細書中に提供する方法を用いて、配列(例えば、核酸又はタンパク質の天然に存在する単量体単位である塩基又はアミノ酸の同一性)に基づかない参照核酸又はタンパク質と相対的な標的核酸又はタンパク質の変化を研究することができる。例えば、本明細書中に提供する方法で用いる特異的開裂試薬は、メチル化パターンなどの配列に依存しない特徴の違い、修飾塩基又はアミノ酸の存在、又は標的分子及び参照分子間のより高次の構造の違いを認識し、配列に依存しない部位で開裂されるフラグメントを生じさせることができる。後生学は、遺伝子配列の違いではなく遺伝子発現の違いに基づく情報の遺伝に関する研究である。後成的変化とは、遺伝子機能の有糸分裂(mitotically)及び/又は減数分裂による遺伝性変化又は核酸配列の変化によって説明することができないより高次の核酸構造の変化をいう。後生的変化又は変化を受ける特徴の例には、動物でのDNAメチル化パターン、ヒストン修飾、及びポリコーム−トリソラックス群(Pc−G/tx)タンパク質複合体(例えば、Bird, A., GenesDev., 16: 6-21 (2002)を参照のこと)が含まれるが、限定するものではない。
本明細書中に提供する方法を用いて、標的配列中のメチル化パターンの変化などの標的配列中の後生的変化である配列変化を検出することができる。細胞のメチル化の分析は、新たに生起した研究学問分野である。メチル基のシトシンへの共有結合による結合は、主にCpGジヌクレオチド(マイクロサテライト)に存在する。プロモーター領域に位置していないCpG島の機能は調査が継続されているが、プロモーター領域中のCpG島は、そのメチル化状態が関連する遺伝子の転写及び発現を調節するので、特に関心がある。プロモーター領域のメチル化により、遺伝子発現のサイレンシングが生じる。このサイレンシングは、永続的であり、有糸分裂プロセスを介して継続する。遺伝子発現におけるその有意な役割に起因して、DNAメチル化は、発達プロセス、インプリンティング、及びX染色体不活化、並びに腫瘍の発生、老化、及びさらに寄生虫DNAの抑制に影響を与える。メチル化は、肺癌、乳癌、及び大腸癌などの多くの広範な腫瘍の発癌性、及び白血病に関与すると考えられている。メチル化及びタンパク質機能不全(長時間Q−T症候群)又は代謝疾患(一過性新生児糖尿病、二型糖尿病)の間にも関連がある。
種々の生物由来の利用可能なゲノム配列情報量が劇的に増大したことによって、配列情報を機能、表現型、又は同一性に関連づけるための大規模な比較配列分析を可能する技術の必要性が増している。SNP発見及び病原体の配列特異的同定を含む比較配列分析のためのそのような技術の用途は広範にわたることができる。したがって、再配列決定及びハイスループット変異スクリーニング技術は、疾患の元になる変異及び差次的な薬物反応の元になる遺伝変異性の同定に非常に重要である。
本明細書中に提供する方法によって、1つ又は複数の参照配列と相対的な複数の標的配列中の配列変化のハイスループット検出又は発見が可能になる。多重処理とは、2つ以上の多型又は配列変化の同時検出をいう。特に質量分析と組み合わせた多重処理反応の実施方法が既知である(例えば、米国特許第6,043,031号、第5,547,835号、及び国際PCT出願第WO97/37041号を参照のこと)。
標的核酸若しくはタンパク質中の配列変化の決定方法又は本明細書中に提供する検出方法を本明細書中に提供する方法に基づいて配列変化を同定するためにプログラミングされたコンピュータを用いて自動化するシステムも提供する。例えば、以下のコンピュータシステムを用い、かつ、以下の計算、システム、及び方法を用いることによって、本明細書での方法を実行ことができる。
RNAの塩基特異的開裂
対象標的核酸の配列変化を分析するために、RNA転写を含む1つの管反応及び代表的なRNAseであるRNaseT1によるG特異的ヌクレオチド結合分解性開裂反応の半自動化プロトコルを本明細書中で提供する。本明細書中に提供するRNAse開裂方法によって生成されるフラグメントを本明細書中に提供する方法に従って分析することができる。RNaseT1反応を行い、標的核酸上のGヌクレオチド部位で約100%開裂させる。この開裂によって、対象標的配列中の配列変化を示すフラグメント質量の特徴的なパターンを生成する。
オリゴヌクレオチドは、メタビオン社(Metabion)(ドイツ)から購入した。5−メチルシチジン5’−三リン酸リチウム塩(Me−CTP)及び5−メチルウリジン5’−三リン酸リチウム塩(Me−UTP)をトリリンク社(Trilink)(米国)から得た。
PCR反応物5μlは、ゲノムDNA5ng、ホット・スター(Hot Star)TaqDNAポリメラーゼ(キアジェン社(Qiagen)、ドイツ)0.1単位、フォワード及び逆プライマー 各1pmol、0.2mM 各dNTP、及び酵素製造元(キアジェン社(Qiagen)、ドイツ;1.5mM MgCl2、Tris−HCl、KCl、及び(NH4)2SO4(pH8.7)を含有する)から供給される1×ホット・スター(Hot Star)TaqPCR緩衝液を含有した。酵素活性及び最初の変性を94℃で15分間行い、続いて45増幅サイクル(94℃で20秒間、56℃で30秒間、及び72℃で60秒間)を行い、及び72℃で3分間最終伸長を行った。
PCR増幅後、PCR産物2.4μlを、1×転写緩衝液(6mM MgCl2、10mM DTT、10mM NaCl、10mM スペルミジン、及び40mM Tris−HCl(pH7.9、20℃)を含有する)中にT7(又はSP6)RNAポリメラーゼ(エピセントレ社(Epicentre))10単位、及び0.5mM 各NTPを含有する転写反応物6μl中で用いた。Me−UTP又はMe−CTPを用いて転写を行ったときに、UTP又はCTPが修飾メチルヌクレオチドに完全に置き換わった。転写反応物を37℃で2時間インキュベーションした。転写反応を行った後、RNaseT1 20単位を添加し、反応混合物を30℃で30分間インキュベーションした。30℃でのインキュベーションにより、3’−リン酸基に対する開裂反応を起こさせることが見出され、質量スペクトル中での所与の各親フラグメントについての複数の質量シグナルによって生じる複雑さを失くなった。
転写及び開裂後、21μlのH2Oを添加することによって各試料を希釈した。スペクトロ・クリーン(Spectro CLEAN)(登録商標)カチオン樹脂(アンモニウムイオンが充填されたカチオンイオン交換樹脂;セケノム社(Sequenom)、米国)6mgにより、リン酸骨格のコンディショニングを行った。次に、得られた溶液16nlをシリコンチップ(スペクトロ・チップ(Spectro CHIP)(登録商標)、セケノム社(Sequenom))上にロボットにより分配した。すべての質量スペクトルは、ビフレックスIII(Biflex III)質量分光計(ブルカー・ダルトニック社(Bruker Daltonik)、ドイツ)により記録された。陽イオンを分析し、約50のシングルショットスペクトルを蓄積した。ディレイド・イオン・エクストラクション及び合計加速電圧20kVを用い、直線飛行時間型の形式ですべての試料を分析した。
RNaseT1開裂は完全に行った。十分なRNase濃度を有する反応条件は、検体/マトリクス結晶化を妨げる低量の変性試薬(尿素又はホルムアミドなど)さえも回避するように最適化した。限定的な/不完全な消化より優れた提示した均一手法の1つの利点は、より高い質量範囲(>12000Da)でシグナルが失くなることなく500nt以上の鋳型領域までそれを伸長することができることである。完全消化では、2つのG位置間の最大距離によって決定される通り、最も高い質量のフラグメントは配列依存性であるが、最も高い質量のフラグメントはRNA転写物の長さに依存しない。
フォワードプライマー(配列番号6):
5’CAGTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGCTCCCCAGCAAGACGGACTT−3’
逆プライマー(配列番号7):
5’−AGGAAGAGAGCGCCTCGGCAAAGTACAC−3’
単位複製配列(配列番号8):
5’−GGGAGAAGGC TCCCCAGCAA GACGGACTTC TTCAAAAACA TCATGAACTT CATAGACATT GTGGCCATCA TTCCTTATTT CATCACGCTG GGCACCGAGA TAGCTGAGCA GGAAGGAAAC CAGAAGGGCG AGCAGGCCAC CTCCCTGGCC ATCCTCAGGG TCATCCGCTT GGTAAGGGTT TTTAGAATCT TCAAGCTCTC CCGCCACTCT AAGGGCCTCC AGATCCTGGG CCAGACCCTC AAAGCTAGTA TGAGAGAGCT AGGGCTGCTC ATCTTTTTCC TCTTCATCGG GGTCATCCTG TTTTCTAGTG CAGTGTACTT TGCCGAGGCG CTCTCTTCCT−3’。
各反応に転写混合物2μl及び増幅DNA試料2μlが必要であった。T特異的開裂ためには、転写混合物は、40mM Tris−酢酸(pH8)、40mM 酢酸カルシウム、10mM 酢酸マグネシウム、8mM スペルミジン、1mM 各ATP、GTP、及びUTP、2.5mM dCTP、5mM DTT、及びT7R&Dポリメラーゼ(Epicentre)20単位を含有する。T特異的部分開裂のためには、dTTPとUTPと4:1の比を用いる。転写反応を37℃で2時間行った。転写後、RNaseA2μl(0.5μg)を各転写反応物に添加した。RNase開裂反応を37℃で1時間行った。
RNase開裂後、ddH2O20μlを添加することにより、各反応混合物を管又は384ウェルのプレート内で希釈した。カチオン交換樹脂(スペクトロ・クリーン(Spectro CLEAN)、セケノム社(Sequenom))6mgを各ウェルに添加し、5分間回転を行い、640×gで5分間遠心分離することによって(2000rpm、遠心機IEC Centra CL3R、ローターCAT.244)、リン酸骨格のコンディショニングを行った。遠心分離後、圧電ピペットを用いて試料15nlをスペクトロ・チップ(Spectro CHIP)に移した。試料をビフレックス(Biflex)直線TOF質量分光計(ブルカー・ダルトニック社(Bruker Daltonik)、ブレーメン)上で分析した。
DNAの塩基特異的開裂
以下の実施例は、核酸中のU残基の存在に従う標的核酸の断片化方法を記載し、ウラシルDNAグリコシラーゼ酵素による消化及びNH3を用いたリン酸骨格の開裂によって該方法を行う。本明細書中に提供する断片化方法を用いて、塩基特異的に開裂された標的DNAフラグメントを生じさせることができ、次いで、該標的DNAフラグメントを本明細書中に提供する参照DNAと相対的な標的DNA中の配列変化の同定方法によって分析することができる。
PCRプライマー及び単位複製配列
フォワードプライマー(配列番号9):
5’−BioCCCAGTCACGACGTTGTAAAACG−3’
逆プライマー(配列番号10):
5’−AGCGGATAACAATTTCACACAGG−3’
単位複製配列(配列番号11):
5’−CCCAGTCACG ACGTTGTAAA ACGTCCAGGG AGGACTCACC ATGGGCATTT GATTGCAGAG CAGCTCCGAG TCCATCCAGA GCTTCCTGCA GTCACCTGTG TGAAATTGTT ATCCGCT−3’
DNA開裂後、試料15nlを圧電ピペットを用いてスペクトロ・チップ(Spectro CHIP)(登録商標)(セケノム社(Sequenom))に移した。ブルカービフレックス(Bruker Bilex)質量分光計(ブルカー・ダルトニック社(Bruker Daltonik)、ブレーメン)上で分析を行った。
増幅DNAの塩基特異的断片化によるSNPの発見
SNPsを含有する標的配列の塩基特異的に開裂されたフラグメントを本明細書中に提供する既知SNPsの検出又は未知SNPsの発見方法によって分析することができる。商標マス・アレイ(Mass Array)(登録商標)によって表される系などの系を用い、Rodi et al, Bio Techniques, 32: S62-S69 (2002)(これを参照により本明細書に取り入れる)に従って、ハイスループット塩基特異的断片化を行い、続いて質量分析による分析を行うことができる。マス・アレイ(Mass Array)(登録商標)は、小型化アレイ及びMALDI−TOF(マトリクス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型)質量分析と組み合わせた質量スペクトル分析に依り、迅速に結果を出す。本明細書中に提供する方法に従って生じた及びRodi et al, Bio Techniques, 32: S62-S69 (2002)で生じたフラグメントシグナルを本明細書中に提供する方法に従って分析することができる。
本明細書中に提供する配列変化候補の減少した組の分析方法(「自動化」方法)をC++で実行した。該実行には、本明細書中に提供する方法による洗練されたSNPスコア付けスキーム及び反復SNP選択プロセスが含まれる。ある場合では、以下に提供する通り、C++で実行されるアルゴリズムによる分析を候補SNPsリストの手動アセンブリと比較した。手動アセンブリは、相補的な開裂反応物の間の一致性及び/又は試料の組の中の表示フラグメントの回復(recurrence)を調べ、次いで、配列変化を含まない参照配列のすべての可能な配列変化について変異体質量スペクトル又は他の質量指数(ゲル電気泳動の場合には移動性など)をシミュレーションする(本明細書中に提供する方法に従って配列変化候補の減少した組を得るということではない)ことにより行った。手動による手法においては、次いで、特定の配列変化又は配列変化の組に対応するシミュレーションした各変異体スペクトルを実際の変異体質量スペクトルに対してマッチングし、最も起こり得そうな配列変化又は変異体スペクトルを生ずる変化を決定する。
T7RNAポリメラーゼによるRNA転写を行い、続いて本明細書中に提供するRNAse開裂を用いて塩基特異的開裂を行った。すべてのPCRプライマーをその5’末端にいてT7プロモーターで標識した。40個の単位複製配列(その配列は、配列リスト中で配列番号45〜84として提供される)の5’末端及び3’末端における18〜22塩基と同一又は相補的な配列を有する2組のPCRプライマーを各単位複製配列がセンス又はアンチセンス鎖のいずれかの転写が可能となるようした。センス転写物を用いてT特異的及びC特異的開裂を得るためにRNaseAを用い、アンチセンス転写物を用いてA特異的及びG特異的開裂を得るためにその等量を用いた(C(T)残基に対するRNaseAの活性は、dCTP(dTTP)を転写物に導入することでRNaseAをU又はC残基のいずれかに特異的にすることにより遮断した)。このようにして、等量のすべての4つの塩基特異的開裂を分析した。
配列変化候補の減少した組を生じさせ、減少した組をシミュレーションし、本明細書中に提供する方法に従ってスコア付けする自動化分析により、SNPsを同定した。ソフトウェアにおいて報告されている追加及び消失シグナルの手動分析により、結果をさらに検証した。同定したSNPsはすべて、続いて行われた鎖終結用プライマーの伸長反応によって有効であることが確認された。塩基特異的反応でSNPの位置を正確に位置づけできなかった場合には、プライマー伸長反応を用いてSNPの位置づけを行った。
以下の表は、第1組の10個の単位複製配列中で同定されたSNPs(単位複製配列中の塩基の変化及び位置)を提供する。
SNPs(単位複製配列中の塩基の変化及び位置)を第2組の30個の単位複製配列中で度同様に同定した。さらに、本明細書中に提供する方法に従って配列変化候補の減少した組を生じさせて分析する自動化によって同定されたSNPsを、4つの相補的な塩基特異的開裂反応によって得られた開裂パターンの手動検査及び分析(すべての可能な配列変化候補の構築、シミュレーション、及びスコア付け)によって同定したSNPsと比較した。すべてSNPsは、手動分析により検出するかあるいは自動分析により検出するかに関わらず、鎖終結用プライマーの伸長反応によって本物の陽性であるか偽陽性であるかを検証した。
塩基特異的断片化による細菌タイピング
この実施例は、細菌株の塩基特異的断片化方法を提供する。本明細書中に提供する断片化方法に従って及びvon Wintzingerode et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A. 99(10): 7039-7044(2002)(これを参照により本明細書に取り入れる)で生成されるフラグメントを本明細書中に提供する方法によって分析し、標的細菌株を同定することができる。
細菌株
ジャーマン・コレクション・オブ・マイクロオーガニズム・アンド・セル・カルチャー(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)(DSMZ、ブラウンシュワイク、ドイツ)及びインスティチュート・フォー・スタンダライゼーション・アンド・ドキュメンターション・イン・メディカル・ラボラトリー(Institute for Standardization and Documentation in Medical Laboratory reg. ass)(Instand e. V.、デュッセルドル、ドイツ)によって提供されるマイコバクテリウム種の12個の参照株(「基準」株)、及び24個のマイコバクテリアの臨床分離株を本研究に用いた。強化サプリメント(MGIT系オレイン酸−アルブミン−デキストロース−クエン酸)及び抗菌サプリメント(MGIT系PANTA(ポリミキシンB、ナリジクス酸、トリメトプリム、及びアズロシリン))を有する液体培地(MGIT液体培地;ベクトン・ディッキンソン・ヨーロッパ社(Becton Dickinson Europe)、フランス)中でマイコバクテリアを増殖させた。30℃で培養したマイコバクテリウム・マリナム(Mycobacterium marinum)を除き、マイコバクテリアを37℃で培養した。細菌の増殖が示されたとき、3300×gで20分間遠心分離することによってマイコバクテリアをブロス0.5ml中で濃縮した。
市販のキット(呼吸性検体調製キット(Respiratory Specimen Preparation Kit)、AMPLICOR:ロッシュ・モレキュラー・システムズ社(Roche Molecular Systems, Inc.)、ブランチバーグ(Branchburg)、ニュージャージー州、米国)を用いてDNAを抽出した。簡単に言えば、再懸濁したマイコバクテリアのペレット100μlをポリプロピレン管1.5mlに移し、キットによって提供される洗浄溶液(500μl)で洗浄し、10分間遠心分離した(14,000×g)。上清を捨て、細菌ペレットを溶解試薬(100μl)に再懸濁した。60℃の加熱区画中で45分間インキュベーションした後、溶解物を与えられた中和試薬(100μ1)で中和し、得られたDNA溶液を4℃で保存した。
12個のマイコバクテリウム参照株(配列番号14〜25を参照のこと)由来の全長16SrRNA遺伝子の配列決定を記載の通りにして分析した(von Wintzingerode et al., Appl. Environ. Microbiol. 65: 283-286 (1999)を参照のこと)。簡単に言えば、真正細菌のプライマーTPU1(大腸菌の位置8〜27に対応するAGA GTT TGA TCM TGG CTC AG(配列番号39)及びRTU8(大腸菌の位置1541〜1522に対応するAAG GAG GTG ATC CAK CCR CA(配列番号40)(大腸菌由来の16SrRNA遺伝子配列についての配列番号29を参照のこと))を用いて16SrDNAをPCR増幅した。PCR生成物をベクターpCR2.1(TAクローニングキット、インビトロゲン社(Invitrigen)、デ・シェルプ(de Schelp)、ネザーランド(Netherlands))と連結し、製造元の指示に従って大腸菌に形質転換した。GFXプラスミド調製キット(アマシャム・ファルマシア社(Amersham Pharmacia)、フライブルク、ドイツ)を用いて、組換えプラスミドDNAを精製し、テルモセキエナーゼ(Thermosequenase)蛍光標識プライマーサイクル配列決定キット(アマシャム・ファルマシア社(Amersham Pharmacia)、フライブルク、ドイツ)によるサイクルシーケンシングに直接用いた。配列決定反応物をLICOR4000L自動化DNAシーケンサー(MWG−バイオテック社(MWG-Biotech)、エーバースベルク、ドイツ)上で分析し、アラインメントをARB−ソフトウェア(http://www.arb-home.de//)を用いて生成した。12個の参照株の全長16SrRNA遺伝子配列をEMBLヌクレオチド配列データベースに寄託し(EMBL受託番号第AJ536031−AJ536042を参照のこと)、配列番号14〜25として配列リスト中に提供した。
すべてのマイコバクテリア株について3ッ組でPCR及びMALDI−TOF分析を行った。PCR増幅混合物は、全体積50μl中に最終MgCl2濃度2.5mM、200μM (各)デオキシヌクレオシド三リン酸、ホット・スター(Hot Star)Taq(キアジェン社(Qiagen)GmbH、ヒルデン、ドイツ)1単位、プライマーMyko109−T7(5’−gtaatacgactcactatagggACG GGT GAG TAA CAC GT−3’(配列番号41)10pmol;大腸菌16SrRNAの位置105〜121に対応する)、プライマーR259−SP6(5’−atttaggtgacactatagaaTTT CAC GAA CAA CGC GAC AA−3’(配列番号42)10pmol;大腸菌16SrRNAの位置609〜590に対応する)、及びDNA5μlを有するPCR緩衝液(Tris−HCl、KCl、(NH4)2SO4、MgCl2(pH8.7))を含有した。ホット・スター(Hot Star)Taq活性(15分、95℃)の最初の工程後における40サイクルの変性(1分、95℃)、アニーリング(1分、58℃)、及び伸長(1分30秒、72℃)のサーマルサイクラー(ゴールドブロック(Goldblock);バイオメトラ社(Biometra)、ゲッティンゲン、ドイツ)を用いて、PCR増幅を行った。増幅をアガロースゲル電気泳動によって検証した。
1×転写緩衝液(6mM MgCl2、10mM DTT、10mM NaCl、10mM スペルミジン、40mM Tris)(pH7.9)20℃)中のPCR生成物2.4μl、T7(又はSP6)RNAポリメラーゼ(エピセントレ社(Epicentre))10単位、0.5mM 各ATP、GTP、UTP、及び5−メチルリボ−CTPを37℃で2時間インキュベーションすることにより、フォワード鎖RNA転写を行った。リボ−CTPを化学修飾されたアナログである5−メチルリボ−CTP(Trilink、USA)に置き換えて、U及びC間の質量の違いを生じさせた。転写を行った後、RNaseT1 20単位及びエビアルカリホスファターゼ(SAP)1単位を添加し、30℃で30分間インキュベーションすることにより、完全なG特異的開裂が達成された。
水21μlを添加することによって各試料を希釈した。スペクトロ・クリーン(Spectro CLEAN)TM樹脂(アンモニウムイオンが充填されたカチオンイオン交換樹脂;セケノム社(Sequenom)、米国)6mgを添加することによって、リン酸骨格のコンディショニングを行った。コンディショニング後、試料10nlを、3−HPAマトリクスで予め充填したスペクトロ・チップ(Spectro CHIP)(登録商標)シリコンチップ(セケノム社(Sequenom)、米国)上にピンツール装置を用いて自動的に移した。質量スペクトルはすべて、ビフレックスIII(Biflex III)質量分光計(ブルカー・ダルトニック社(Bruker Daltonik)、ブレーメン、ドイツ)を用いて記録した。専ら正に荷電したイオンを分析し、試料あたり約50のシングルショットスペクトルを蓄積した。ディレイド・イオン・エクストラクション及び合計加速電圧20kVを用いた直線飛行時間型式で、すべての試料を分析した。スペクトル処理及びピーク評価は、製造元(ブルカー・ダルトニック社(Bruker Daltonik))によって提供されるソフトウェアパッケージXMASS5.0、又は検出された質量シグナルパターンを参照配列に由来する基準株のイン・シリコ(in silico)パターンと比較し、かつ、公表された16SrDNA配列のイン・シリコ(in silico)質量パターンと比較することによって臨床分離株の株を同定するためのベースライン修正、ピークの同定、及び校正のための社内ソフトウェアを用いて行った。
マイコバクテリウムの単離
大腸菌16SrDNAの位置105〜609(配列番号29)に対応する16SrRNA遺伝子の約500bpの領域をすべての基準株及び臨床分離株からPCR増幅した。RNA転写及び塩基特異的開裂によって、すべての試験した基準株について特有のMALDI−TOF質量スペクトルが生じた。
3個の既知のボルデテラ種であるボルデテラ・アビウム(Bordetella avium)、ボルデテラ・テレマタム(Bordetella trematum)、及びボルデテラ・ペトリ(Bordetella petrii)、及びさらに嫌気性かつ有機塩素によって減少する微生物共同体の6個の未だ培養していない細菌(von Wintzingerode et al (Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99(10) : 7039-7044 (2002)を参照のこと)を、真正細菌のプライマーTPU1(配列番号39)及びRTU8(配列番号40)を用いてそれらの可変16SrRNA遺伝子領域(配列番号30〜38を参照のこと)を増幅することにより、上記の方法によって分析した。記載の通り、リボ−CTP及びリボ−UTPヌクレオチドの間の1Daの質量の違いは、転写収率の検出可能な損失なく、いずれかのピリミジン塩基をその5Me−アナログに置き換えることによって増した。RNAseT1によるG特異的開裂により、個々の16SrRNA遺伝子標的配列を示すフラグメント質量の特徴的なパターンが生じた。未だ培養してない6個のボルデテラ株すべてが明瞭に同定され、結果は標準の蛍光ジデオキシ配列決定によって得られるものと一致した。
塩基特異的断片化によるメチル化パターンの検出
メチル基のシトシンへの共有結合による結合が、CpGジヌクレオチドで主に観察される。これらのCpG島は、他のジヌクレオチドよりも観察される頻度が少なく、ランダム核酸配列について予測されるよりも観察される頻度が少ない。多数のCpGジヌクレオチドが、プロモーター領域及び遺伝子の5’末端で観察される。配列中のメチル化パターン標的を研究するための断片化分析の使用のための代表的なプロトコルを本明細書中に提供する。本明細書中での代表的なプロトコルに従って生じたフラグメントを、参照配列と相対的な標的配列メチル化パターンの変化を研究するための本明細書中に提供する方法に従って分析することができる。
RNAseA開裂
フォワード転写物:
メチル化試料のスペクトルは、非メチル化試料とはっきりと区別された。CpGメチル化のすべての場合で、それらのフラグメント中のメチル化に帰属することができる新たなフラグメントが作り出された。それらのフラグメントのうち5つは2CpG部位を含み、2つのシグナルがCpG部位を1つ含む2つのフラグメントによって作り出された。ある場合には、CpG部位のどちらの1つが検出シグナルの原因であるかをはっきりと区別できず、それらの場合において、非メチル化CpG島から生じるシグナルが存在していないことは、メチル化状態の同定に役立った。
メチル化及び非メチル化試料は、はっきりと区別できた。フォワード転写とは対照的に、すべてのメチル化事象によって、対応するシグナルの質量がシフトした。シグナル強度は、フォワード反応物と比較してわずかに良好であった。
全シグナル強度は、RNAseA開裂試料の場合より低かった。転写の結果は、野生型T7ポリメラーゼを用いたときが最良であった。SAPを開裂反応に添加すること及びagaagg標識をプライマーに組み入れることによって、効率は改善しなかった。
フォワード反応物では、メチル化試料は非メチル化試料とはっきり区別できた。メチル化試料での13dの質量シフトは、ピークが互いに近いゆえにシグナル群中で検出することが時々困難であった。
逆反応物は、他の転写と比較して、非メチル化試料においてより複雑であった。フォワード鎖中にシトシンがないので、逆転写物中にグアノシンがなく、したがって、酵素が切断する認識部位がなかった。したがって、シグナル強度は弱かった。
m32053領域のメチル化パターンは、メチル化及び非メチル化DNAではっきり区別できた。分析試料は、完全にメチル化したかあるいはメチル化しないかのいずれかとした。先行文献は、生殖系列でのメチル化及び非メチル化DNAの完全な分離及びさらに成熟段階を記載している。位置470におけるDNAのCpG部位は、メチル化とはっきりタイピングされた。データにより、位置347におけるCpNpG部位のメチル化も確認された。
DNA試料中のメチル化の割合を決定するために、異なる量のメチル化及び非メチル化DNAをプールした。プラスミドDNAの濃度の決定をピコ・グリーン(Pico Green)蛍光アッセイで行った。
分析によって、メチル化及び非メチル化クローンが50/50の割合であることが示された。これは、ゲノムDNA中のメチル化及び非メチル化対立遺伝子のPCR増幅が等しいことを示している。
理論では、各メチル化CpGは、同じ質量スペクトルにおいて少なくとも1つの表示質量シグナルを生ずる特異的フラグメントを生ずることができる。これらのシグナルのいくつかは、それらの質量が高い又は低い質量カットオフに属するので、検出可能ではないであろう。MALDI−TOF装置により、長さがフラグメント約3〜35個のヌクレオチドに等しい1000〜11000Daの質量を有する開裂生成物の検出が可能となる。標的核酸配列に依存して、1つの反応のみで、例えば、標的核酸内のすべてのCpG部位の約75%のメチル化状態の決定が可能となる。ほぼすべてのCpG部位に関する情報を得るため、反応がフォワード又は逆転写産物のC又はT特異的開裂を含むことができる2〜4つの反応を用いることができる。逆鎖上のC特異的開裂はフォワード鎖上のG特異的開裂と等しく、逆鎖上のT特異的開裂はフォワード鎖上のA特異的開裂と等しいので、この組み合わせによってフォワード鎖上のすべてのヌクレオチドにおいて塩基特異的開裂が可能となる。2〜4つの開裂反応からの情報を合わせることによって、正確なメチル化パターンを編集すること可能となる。IGF2/H19領域については、各CpG部位についてのメチル化状態を得るのに2つ反応でも十分である。4つの反応を用いることにより、すべてのCpG部位の92%が2超のシグナルによって表される重複した情報が提供された。したがって、各メチル化の事象は、1つ以上の観察によって独立して確認された。
試料混合物中の配列変化の分析
この研究の目的は、異なるDNA比の野生型及び変異体DNAを有する試料での塩基特異的断片化により参照配列と相対的な標的配列中の配列変化の分析を行い、検出感度を評価することであった。
DNAは、腫瘍遺伝子K−Ras(配列番号44)に由来する269bp単位複製配列であった。DNA試料は、野生型配列又は腫瘍細胞系に由来するK−Ras変異体配列のいずれかを含有していた。DNA試料(試料A、B、C、D、及びE)を野生型及び異型接合変異DNAの異なる比で混合した。以下の表に示す通り、混合物中の変異DNAの比は試料あたり0%〜50%で変動した。
位置216におけるG/A置換を変異体単位複製配列中で検出した。G対立遺伝子中の2313dからA対立遺伝子中の2297dへのC特異的フォワード反応物での質量シフトによって、変異を確認した。このシグナルの検出は、変異体配列中のSNPの存在を同定するのに必要であった。2297d(A対立遺伝子に対応する)におけるシグナルは、変異体対立遺伝子がたった5%のレベルで存在するときでさえ(DNA試料B)、すべてのDNA試料A、B、C、及びDで検出された。
Claims (12)
- 標的核酸中の1又は複数の配列変化のある配列を決定する方法であって:
a)(i)標的核酸及び参照核酸をフラグメントに開裂し、(ii)フラグメントの質量シグナルを決定することに起因するフラグメントの質量シグナルを提供する工程;
b)標的核酸フラグメントと参照核酸フラグメントとの間の質量シグナルの差を同定し、それにより異なるフラグメントを決定する工程;
c)工程b)において同定された各異なるフラグメントに対応する1又は複数のコンポマー・ウィットネスを生じさせる工程;
d)コンポマー・ウィットネスに対する、参照配列と相対的な標的配列中に含まれる可能な配列変化を表す全ての配列を決定することによって配列変化候補の減少した組を同定する工程;及び
e)標的配列に対応する候補配列変化を決定するための候補配列変化をスコア付けし、標的核酸における1又は複数の配列変化を決定する工程
を含む方法。 - 工程b)における質量シグナルの違いが、消失シグナル、追加シグナル、強度が異なるシグナル、及び異なるシグナル対ノイズ比を有するシグナルからなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記質量シグナルを質量分析によって決定する、請求項1に記載の方法。
- (i)標的核酸及び参照核酸を提供する工程;(ii)特異的開裂によって標的核酸及び参照核酸のフラグメントを生じさせる工程;及び(iii)前記フラグメントの質量シグナルを決定する工程をさらに含み、ここで、(iii)の質量シグナルが(a)において提供される、請求項1に記載の方法。
- 1つの特異的開裂試薬が、フラグメントを生じさせるために利用される、請求項4に記載の方法。
- コンポマー・ウィットネスが、異なるフラグメントの質量、質量がタイプ又は長さで単一ヌクレオチドだけ異なるフラグメント間のピーク分離、及び質量分光計の分解能からなる群から選択されるパラメータに基づいて生じる、請求項3に記載の方法。
- 標的及び参照核酸をフラグメントに切断することが、特異的開裂試薬との接触によって生じる、請求項1に記載の方法。
- 配列変化候補の減少した組からの配列が、スコア付けアルゴリズムによって同定される、請求項1に記載の方法。
- 標的核酸中の1又は複数の配列変化を決定する方法であって:
(a)(i)複数の開裂反応によって、核酸混合物中にある標的核酸を含む試料の特異的開裂、及び同じ開裂反応によって参照核酸の特異的開裂;ならびに(ii)該断片の質量シグナルを決定すること、に起因する複数の断片化パターンを提供する工程;
(b)標的核酸フラグメントの複数の断片化パターンと参照核酸フラグメントの複数の断片化パターンとの間の質量シグナルにおける違いを同定し、それにより異なるフラグメントを同定する工程;
(c)標的核酸中の特定の配列変異と一致する異なるフラグメントを同定する工程;
(d)(c)の一致した異なるフラグメントを組み合わせて、異なるフラグメントのスペクトルを得る工程;
(e)(d)の異なるフラグメントのスペクトルから、異なるフラグメントの各々に対応する1又は複数のコンポマー・ウィットネスを生じさせる工程;
(f)コンポマー・ウィットネスに対応する、参照配列と相対的な標的配列中に含まれる可能な配列変化を表す全ての配列を決定することによって候補配列である配列変化を決定する工程;
(g)(f)の候補配列をスコア付けする工程;及び
(h)標的核酸における1又は複数の配列変化を決定する工程
を含む方法。 - コンポマー・ウィットネスが、異なるフラグメントの質量、質量がタイプ又は長さで単一ヌクレオチドだけ異なるフラグメント間のピーク分離、及び質量分光計の分解能からなる群から選択されるパラメータに基づいて生じる、請求項9に記載の方法。
- (f)の配列変化が、多くともk個の配列変化を有する1又は複数の候補配列に従って決定され、ここで、kは、1、2、3又はそれ以上である、請求項9に記載の方法。
- 各異なるフラグメントについての1又は複数のコンポマー・ウィットネスが、異なるフラグメントの実際の質量との質量差の範囲内の質量を有する、請求項9に記載の方法。
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