ES2577017T3 - Procedimientos y kits para identificar la aneuploidia - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para identificar la presencia o ausencia de una aneuploidia de un cromosoma diana en un sujeto, que comprende: a. preparar una pluralidad de conjuntos de especies de ácidos nucleicos amplificados amplificando una pluralidad de conjuntos de especies de secuencias de nucleótidos a partir del molde de ácido nucleico extracelular de un sujeto, en el que: (i) el molde de ácido nucleico extracelular comprende ácido nucleico derivado del feto y derivado de la madre, (ii) las especies de secuencias de nucleótidos de un conjunto se sitúan en un cromosoma diana y uno o más cromosomas de referencia, en el que un cromosoma de referencia es un cromosoma que no está asociado con la aneuploidia que se va a identificar, (iii) las especies de secuencias de nucleótidos en un conjunto difieren en uno o más nucleótidos con emparejamiento erróneo; (iv) las especies de secuencias de nucleótidos de un conjunto se amplifican de forma reproducible relativamente entre sí, (v) las secuencias de hibridación de cebadores situadas en las especies de secuencias de nucleótidos diana y en las una o más especies de secuencias de nucleótidos de referencia de un conjunto comparten un grado de similitud de secuencia que permite que un único par de cebadores de amplificación se hibride a las secuencias de hibridación de cebadores de modo que las especies de un conjunto se coamplifiquen; y (vi) cada especie de ácido nucleico amplificado en un conjunto comprende una secuencia de nucleótidos que tiene el uno o más nucleótidos con emparejamiento erróneo; b. determinar la cantidad de cada especie de ácido nucleico amplificado en cada conjunto detectando el uno o más nucleótidos con emparejamiento erróneo en cada especie de ácido nucleico amplificado; c. determinar una proporción entre la cantidad relativa de (i) una especie de ácido nucleico diana amplificado y (ii) una especie de ácido nucleico de referencia amplificado, en cada conjunto; y d. identificar la presencia o ausencia de una aneuploidia de un cromosoma diana en base a las proporciones de dos o más conjuntos.

Description

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mecanismo del huso monopolar.

Los términos "monosomía parcial" y "trisomía parcial" como se usan en el presente documento, se refieren a un desequilibrio de material genético provocado por la pérdida o ganancia de parte de un cromosoma. Una monosomía parcial o trisomía parcial puede resultar de una translocación desequilibrada, en la que un individuo lleva un

5 cromosoma derivado formado a través de la rotura y fusión de dos cromosomas diferentes. En esta situación, el individuo podría tener tres copias de parte de un cromosoma (dos copias normales y la parte que existe en el cromosoma derivado) y sólo una copia de parte del otro cromosoma implicada en el cromosoma derivado.

El término "mosaicismo" como se usa en el presente documento se refiere a aneuploidia en algunas células, pero no en todas las células, de un organismo. Determinadas anomalías cromosómicas pueden existir como anomalías 10 cromosómicas en mosaico y no mosaico. Por ejemplo, determinados individuos con trisomía 21 tienen síndrome de Down mosaico y algunos tienen síndrome de Down no mosaico. Diferentes mecanismos pueden dar lugar al mosaicismo. Por ejemplo, (i) un cigoto inicial puede tener tres cromosomas 21, lo que normalmente daría como resultado una trisomía simple 21, pero durante el ciclo de división celular, una o más líneas celulares pierden uno de los cromosomas 21; y (ii) un cigoto inicial puede tener dos cromosomas 21, pero durante el ciclo de división celular, 15 se duplicó uno de los cromosomas 21. El mosaicismo somático se produce muy probablemente a través de mecanismos distintos de los asociados típicamente con los síndromes genéticos que implican aneuploidia completa

o en mosaico. Se ha identificado el mosaicismo somático en determinados tipos de cánceres y en neuronas, por ejemplo: En determinados casos, se ha identificado trisomía 12 en leucemia linfocítica crónica (LLC) y se ha identificado trisomía 8 en leucemia mielógena aguda (LMA). Además, los síndromes genéticos en los que un

20 individuo está predispuesto a la rotura de cromosomas (síndromes de inestabilidad cromosómica) están asociados con frecuencia con un incremento en el riesgo de varios tipos de cáncer, destacando así el papel de la aneuploidia somática en la carcinogénesis. Los procedimientos y kits descritos en el presente documento pueden identificar la presencia o ausencia de anomalías cromosómicas no mosaico y mosaico.

Lo siguiente es una lista no limitante de anomalías cromosómicas que se pueden identificar potencialmente por los 25 procedimientos y kits descritos en el presente documento.

Cromosoma

Anomalía Asociación de enfermedad

X

XO Síndrome de Turner

Y

XXY Síndrome de Klinefelter

Y

XYY Síndrome del doble Y

Y

XXX Síndrome de trisomía X

Y

XXXX Síndrome de X cuádruple

Y

Deleción de Xp21 Síndrome de Duchenne/Becker, hipoplasia suprarrenal congénita, enfermedad granulomatosa crónica

Y

Deleción de Xp22 insuficiencia de esteroide-sulfatasa

Y

Deleción de Xq26 enfermedad linfoproliferativa ligada al cromosoma X

1

monosomía trisomía 1p (somática) neuroblastoma

2

monosomía trisomía 2q retraso del crecimiento, trastornos del desarrollo y retraso mental, y anomalías físicas menores

3

monosomía trisomía (somática) linfoma no hodgkiniano

4

monosomía trisomía (somática) leucemia no linfocítica aguda (LNLA)

5

5p Síndrome del maullido; síndrome de Lejeune

5

5q monosomía trisomía (somática) síndrome mielodisplásico

6

monosomía trisomía (somática) sarcoma de células claras

7

deleción de 7q11.23 síndrome de William

7

monosomía trisomía monosomía 7 síndrome de la infancia; somática: adenomas corticales renales; síndrome mielodisplásico

8

deleción de 8q24.1 síndrome de Langer-Giedon

8

monosomía trisomía síndrome mielodisplásico; síndrome de Warkany; somática: leucemia mielógena crónica

9

monosomía 9p síndrome de Alfi

8

(continuación)

Cromosoma

Anomalía Asociación de enfermedad

9

monosomía 9p trisomía parcial síndrome de Rethore

9

trisomía síndrome de trisomía 9 completa; síndrome de trisomía 9 mosaico

10

monosomía trisomía (somática) LLA o LNLA

11

11p- Aniridia; tumor de Wilms

11

11q- Síndrome de Jacobson

11

monosomía trisomía (somática) linajes mielógenos afectados (LNLA, SMD)

12

monosomía trisomía (somática) LLC, tumor de células granulosas juvenil (TCGJ)

13

13q síndrome de 13q; síndrome de Orbeli

13

deleción de 13q14 retinoblastoma

13

monosomía trisomía síndrome de Patau

14

monosomía trisomía (somática) trastornos mielógenos (SMD, LNLA, LMC atípica)

15

deleción de 15q11-q13 monosomía síndrome de Prader-Willi, síndrome de Angelman

15

trisomía (somática) linajes mielógenos y linfáticos afectados, por ejemplo, SMD, LNLA, LLA, LLC)

16

deleción de 16q13.3 monosomía trisomía (somática) carcinomas de células renales papilares de Rubenstein-Taybi (malignos)

17

17p-(somática) síndrome de 17p en neoplasias malignas mielógenas

17

deleción de 17q 11.2 Smith-Magenis

17

17q13.3 Miller-Dieker

17

monosomía trisomía (somática) adenomas corticales renales

17

17p11.2-12 trisomía síndrome de Charcot-Marie-Tooth tipo 1; NHPP

18

18p síndrome de monosomía parcial 18p o síndrome de GrouchyLamy-Thieffry

18

18q síndrome de Grouchy-Lamy-Salmon

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monosomía trisomía síndrome de Edwards

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monosomía trisomía

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20p síndrome de trisomía 20p

20

deleción de 20p11.2-12 Alagille

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20q somática: SMD, LNLA, policitemia vera, leucemia neutrófila crónica

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monosomía trisomía (somática) carcinomas de células renales papilares (malignos)

21

monosomía trisomía síndrome de Down

22

deleción de 22q11.2 Síndrome de DiGeorge, síndrome de velocardiofacial, síndrome de anomalía conotroncal-facial, síndrome de Opitz G/BBB autosómico dominante, síndrome cardiofacial de Cailor

22

monosomía trisomía síndrome de trisomía 22 completa

En determinados modos de realización, se identifica la presencia o ausencia de una anomalía cromosómica fetal (por ejemplo, trisomía 21, trisomía 18 y/o trisomía 13). En algunos modos de realización, se identifica la presencia o ausencia de una anomalía cromosómica relacionada con una afección de proliferación celular o cáncer. En algunos

5 modos de realización se puede identificar la presencia o ausencia de una o más de las anomalías cromosómicas descritas en la tabla anterior.

Ácido nucleico molde

El ácido nucleico molde utilizado en los procedimientos y kits descritos en el presente documento a menudo se obtiene y se aísla de un sujeto. Un sujeto puede ser cualquier fuente viva o no viva, incluyendo pero sin limitarse a

10 un ser humano, un animal, una planta, una bacteria, un hongo, un protista. Se puede seleccionar cualquier ser humano o animal, incluyendo pero sin limitarse a, no humano, mamífero, reptil, ganado bovino, gato, perro, cabra, porcino, cerdo, mono, simio, gorila, toro, vaca, oso, caballo, oveja, ave de corral, ratón, rata, peces, delfín, ballena y tiburón, o cualquier animal u organismo que puede tener una anomalía cromosómica detectable.

El ácido nucleico molde se puede aislar a partir de cualquier tipo de líquido o tejido de un sujeto, incluyendo, sin 15 limitación, sangre del cordón umbilical, vellosidades coriónicas, líquido amniótico, líquido cefalorraquídeo, líquido de

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lavado (por ejemplo, broncoalveolar, gástrico, peritoneal, ductal, ótico, atroscópico), muestra de biopsia (por ejemplo, de embrión preimplantatorio), muestra de celocentesis, células nucleadas fetales o restos celulares fetales, lavados del aparato reproductor femenino, orina, heces, expectoración, saliva, mucosa nasal, líquido prostático, lavado, semen, fluido linfático, bilis, lágrimas, sudor, leche materna, líquido mamario, células embrionarias y células fetales. En algunos modos de realización, una muestra biológica puede ser sangre, y en ocasiones plasma. Como se usa en el presente documento, el término "sangre" engloba sangre completa o cualquier fracción de sangre, tal como suero y plasma como se define de forma convencional. Plasma sanguíneo se refiere a la fracción de sangre completa resultante de la centrifugación de la sangre tratada con anticoagulantes. Suero sanguíneo se refiere a la parte acuosa de líquido restante después de que se haya coagulado una muestra de sangre. A menudo las muestras de líquido o tejido se recogen de acuerdo con los protocolos estándar que siguen, en general, hospitales o clínicas. Para la sangre, a menudo se extrae una cantidad apropiada de sangre periférica (por ejemplo, entre 3-40 mililitros) y se puede almacenar de acuerdo con procedimientos estándar antes de la preparación adicional en dichos modos de realización. Una muestra de líquido o tejido a partir de la que se extrae el ácido nucleico molde puede ser acelular. En algunos modos de realización, una muestra de líquido o tejido puede contener elementos celulares o restos celulares. En algunos modos de realización, las células fetales o células cancerosas pueden comprender la muestra.

La muestra puede ser heterogénea, por esto se quiere decir que en la muestra está presente más de un tipo de especies de ácidos nucleicos. Por ejemplo, el ácido nucleico heterogéneo puede incluir, pero no se limita a, (i) ácido nucleico fetalmente derivado y maternalmente derivado, (ii) ácido nucleico canceroso y no canceroso, y (iii) más en general, ácido nucleico mutado y natural. Una muestra puede ser heterogénea debido a porque está presente más de un tipo de célula, tal como una célula fetal y una célula materna o una célula cancerosa y no cancerosa.

Para aplicaciones prenatales de la tecnología descrita en el presente documento, se puede recoger una muestra de líquido o tejido de una mujer en una edad gestacional adecuada para pruebas, o de una mujer que se va a someter a prueba por un posible embarazo. La edad gestacional adecuada puede variar dependiendo de la anomalía cromosómica sometida a prueba. En determinados modos de realización, una paciente embarazada está a veces en el primer trimestre del embarazo, a veces en el segundo trimestre del embarazo, o a veces en el tercer trimestre del embarazo. En determinados modos de realización, se recoge un líquido o tejido de una mujer embarazada en las 14, 4-8, 8-12, 12-16, 16-20, 20-24, 24-28, 28-32, 32-36, 36-40, o 40-44 semanas de gestación fetal, y a veces entre 528 semanas de gestación fetal.

El ácido nucleico molde puede ácido nucleico extracelular en determinados modos de realización. El término "ácido nucleico molde extracelular" como se usa en el presente documento se refiere a ácido nucleico aislado de una fuente que no tiene sustancialmente células (por ejemplo, sin células detectables; puede contener elementos celulares o restos celulares). Los ejemplos de fuentes acelulares para ácido nucleico extracelular son plasma sanguíneo, suero sanguíneo y orina. Sin quedar limitados por la teoría, el ácido nucleico extracelular puede ser un producto de apoptosis celular y ruptura celular, lo que proporciona la base para un ácido nucleico extracelular que tenga a menudo una serie de longitudes a través de un gran espectro (por ejemplo, una "escalera").

El ácido nucleico molde extracelular puede incluir diferentes especies de ácidos nucleicos, y por lo tanto se denomina en el presente documento "heterogéneo" en determinados modos de realización. Por ejemplo, el suero o plasma sanguíneo de una persona que tiene cáncer puede incluir ácido nucleico de células cancerosas y ácido nucleico de células no cancerosas. En otro ejemplo, el suero o plasma sanguíneo de una mujer embarazada puede incluir ácido nucleico materno y ácido nucleico fetal. En algunos casos, el ácido nucleico fetal a veces es de aproximadamente un 5 % a aproximadamente un 40 % de todo el ácido nucleico molde, (por ejemplo, aproximadamente un 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 o 39 % del ácido nucleico molde es ácido nucleico fetal). En algunos modos de realización, la mayoría del ácido nucleico fetal en el ácido nucleico molde es de una longitud de aproximadamente 500 pares de bases o menos (por ejemplo, aproximadamente un 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % del ácido nucleico fetal es de una longitud de aproximadamente 500 pares de bases o menos).

Los términos "ácido nucleico" y "molécula de ácido nucleico" se pueden usar de forma intercambiable en toda la divulgación. Los términos se refieren a ácidos nucleicos de cualquier composición de, tal como ácido desoxirribonucleico (ADN, por ejemplo, ADN complementario (ADNc), ADN genómico (ADNg) y similares), ácido ribonucleico (ARN, por ejemplo, ARN mensajero (ARNm), ARN inhibidor corto (ARNip), ARN ribosómico (ARNr), ARN de transferencia (ARNt), microARN, ARN altamente expresado por el feto o placenta, y similares), y/o análogos de ADN o ARN (por ejemplo, que contienen análogos de bases, análogos de azúcares y/o una cadena principal no natural y similares), híbridos de ARN/ADN y ácidos nucleicos de poliamida (PNA), de los que su totalidad puede estar en forma mono o bicatenaria, y a menos que se limite de otro modo, puede incluir análogos conocidos de nucleótidos naturales que puedan funcionar de manera similar a los nucleótidos naturales. Un ácido nucleico puede estar en cualquier forma útil para llevar a cabo procedimientos en el presente documento (por ejemplo, lineal, circular, superhelicoidal, monocatenaria, bicatenaria y similares). Un ácido nucleico puede ser, o puede ser de, un plásmido, fago, se de replicación autónoma (SRA), centrómero, cromosoma artificial, cromosoma, u otro ácido nucleico que se puede replicar o que se replique in vitro o en una célula huésped, una célula, un núcleo celular o citoplasma de una célula en determinados modos de realización. Un ácido nucleico molde, en algunos modos de realización puede ser de un único cromosoma (por ejemplo, una muestra de ácido nucleico puede ser de un cromosoma de una muestra obtenida de un organismo diploide). El término también puede incluir, como

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93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de los conjuntos consisten en dos especies de secuencias de nucleótidos, y en determinados modos de realización, aproximadamente un 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de los conjuntos consisten en tres secuencias de nucleótidos. En un conjunto, a veces las especies de secuencias de nucleótidos están en: el cromosoma 21 y cromosoma 18, o están en el cromosoma 21 y cromosoma 13, o están en el cromosoma 13 y cromosoma 18, o están en el cromosoma 21, y cromosoma 18 y cromosoma 13, o están en el cromosoma X, o están en el cromosoma Y, o están en el cromosoma X e Y, o están en el cromosoma 21, cromosoma 18 y cromosoma 13 y cromosoma X o Y, y aproximadamente en un 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99 % o 100 % de los conjuntos, a veces las especies de secuencias de nucleótidos están en dichos cromosomas designados. En determinados modos de realización, el conjunto utilizado, o cada conjunto cuando se utiliza más de un conjunto, consiste en especies de secuencias de nucleótidos situadas en el cromosoma 21, cromosoma 18 y cromosoma 13.

En algunos modos de realización, las especies de secuencias de nucleótidos están amplificadas y los emparejamientos erróneos de pares de bases se detectan en las especies de ácidos nucleicos amplificados resultantes. En otros modos de realización, las especies de secuencias de nucleótidos no están amplificadas antes de la detección (por ejemplo, si el sistema de detección es suficientemente sensible o si está disponible o se genera una cantidad suficiente de ácido nucleico del cromosoma), y las especies de secuencias de nucleótidos se detectan directamente en el ácido nucleico del cromosoma o fragmentos del mismo.

Identificación de especies de secuencias de nucleótidos

En un aspecto, la tecnología en parte comprende identificar las especies de secuencias de nucleótidos que se amplifican de manera estable y reproducible relativamente entre sí y, de este modo, son útiles junto con los procedimientos de la tecnología. La identificación de especies de secuencias de nucleótidos se puede realizar computacionalmente identificando las secuencias que comprenden una identidad de al menos aproximadamente un 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % sobre una región de secuencia amplificable. En otro modo de realización, las secuencias de hibridación de cebadores en las especies de secuencias de nucleótidos son sustancialmente idénticas. A menudo, las especies de secuencias de nucleótidos comprenden un contenido en GC sustancialmente idéntico (por ejemplo, a veces las secuencias tienen una diferencia menor de aproximadamente un 5 % y a menudo, menor de aproximadamente un 1 % en el contenido en GC).

Los programas de búsqueda de secuencias son bien conocidos en la técnica, e incluyen, pero no se limitan a, BLAST (véase, Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403-410), BLAT (Kent, W.J. 2002. BLAT – The BLAST-Like Alignment Tool. Genome Research 4: 656-664), FASTA y SSAHA (véase, por ejemplo, Pearson, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85(5): 2444-2448; Lung et al., 1991, J. Mol. Biol. 221(4): 1367-1378). Además, los procedimientos de determinación de la significación de alineaciones de secuencias son conocidos en la técnica y se describen en Needleman y Wunsch, 1970, J. of Mol. Biol. 48: 444; Waterman et al, 1980, J. Mol. Biol. 147: 195-197; Karlin et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2204-2268; y Dembo et al., 1994, Ann. Prob. 22: 2022-2039. Aunque en un aspecto, se busca una única secuencia de consulta frente a la base de datos, en otro aspecto, se busca una pluralidad de secuencias frente a la base de datos (por ejemplo, usando el programa MEGABLAST, accesible a través de NCBI).

Existe una serie de bases de datos de secuencias genómicas humanas, incluyendo, pero sin limitarse a, la base de datos NCBI GenBank (en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query:fcgi?db=Genome); http://www.jcvi.org/; la base de datos del Genetic Information Research Institute (GIRI) (en http://www.girinst.org); http://compbio.dfci.harvard.edu/tgi/. Las bases de datos de secuencias expresadas incluyen, pero no se limitan a, la base de datos NCBI EST, la base de datos de secuencias de ADNc aleatorias de Human Genome Sciences, y la base de datos EMEST8 (EMBL, Heidelberg, Alemania).

Aunque a menudo se utilizan procedimientos computacionales de identificación de conjuntos de secuencias de nucleótidos adecuados, se puede usar cualquier procedimiento de detección de secuencias que pueda realizar un emparejamiento de bases significativo para identificar o validar las secuencias de nucleótidos de la tecnología. Por ejemplo, se pueden validar conjuntos de secuencias de nucleótidos usando una combinación de procedimientos basados en hibridación y procedimientos computacionales para identificar las secuencias que se hibridan a múltiples cromosomas. La tecnología no está limitada a las secuencias de nucleótidos que aparecen exclusivamente en cromosomas diana y de referencia. Por ejemplo, los cebadores de amplificación pueden amplificar conjuntamente secuencias de nucleótidos de 2, 3, 4, 5, 6 o más cromosomas siempre que se produzcan las especies de ácidos nucleicos amplificados en una tasa reproducible y la mayoría (por ejemplo, más de un 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 %) de las especies diana provienen del cromosoma diana, permitiendo de este modo una detección exacta de anomalías cromosómicas diana. Como se usa en el presente documento, los términos "diana" y "referencia" pueden tener un grado de ambigüedad puesto que la "diana" puede ser cualquier cromosoma que sea susceptible a anomalías cromosómicas. Por ejemplo, un conjunto que consiste en especies de secuencias de nucleótidos de los cromosomas 13, 18 y 21 tiene el poder para detectar simultáneamente una anomalía cromosómica que se origina a partir de cualquiera de los tres cromosomas. En el caso de una muestra de síndrome de Down (trisomía 21), el cromosoma 21 es el "cromosoma diana" y los cromosomas 13 y 18 son los "cromosomas de referencia".

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Las tablas 3 y 4 proporcionan ejemplos de conjuntos de secuencias de nucleótidos candidatos no limitantes, en los que al menos una especie del conjunto está situada en el cromosoma 21, 18 o 13.

Amplificación

En algunos modos de realización, las especies de secuencias de nucleótidos se amplifican usando un procedimiento de amplificación adecuado. Puede ser deseable amplificar las especies de secuencias de nucleótidos particularmente si una o más de las especies de secuencias de nucleótidos existen en un número de copias bajo. En algunos modos de realización, la amplificación de secuencias o regiones de interés puede ayudar en la detección de desequilibrios de dosificación génica, como se puede observar en trastornos genéticos que implican aneuploidia cromosómica, por ejemplo. Un producto de amplificación (amplicón) de una especie de secuencia de nucleótidos se denomina en el presente documento "especie de ácido nucleico amplificado".

A menudo la amplificación de ácido nucleico implica la síntesis enzimática de amplicones de ácido nucleico (copias), que contienen una secuencia complementaria a una especie de secuencia de nucleótidos que se va a amplificar. La amplificación de especies de secuencias de nucleótidos y la detección de los amplicones sintetizados, pueden mejorar la sensibilidad de un ensayo, puesto que se necesitan menos secuencias diana al principio del ensayo, y puede mejorar la detección de especies de secuencias de nucleótidos.

Se puede utilizar cualquier técnica de amplificación adecuada. La amplificación de polinucleótidos incluye, pero no se limita a, reacción en cadena de la polimerasa (PCR); amplificación por unión (o reacción en cadena de la ligasa (LCR)); procedimientos de amplificación basados en el uso de Q-beta replicasa o polimerasa dependiente del molde (véase la publicación de patente de los EE. UU. número US20050287592); amplificación isotérmica dependiente de helicasa (Vincent et al., "Helicase-dependent isothermal DNA amplification". EMBO reports 5 (8): 795-800 (2004)); amplificación de desplazamiento de hebra (SDA); amplificación basada en secuencias de ácidos nucleicos con SDA termófila (3SR o NASBA) y amplificación asociada a la transcripción (TAA). Los ejemplos no limitantes de procedimientos de amplificación por PCR incluyen PCR estándar, AFLP-PCR, PCR específica de alelo, Alu-PCR, PCR asimétrica, PCR de colonias, PCR de inicio en caliente, PCR inversa (IPCR), PCR in situ (ISH), PCR específica de intersecuencia (ISSR-PCR), PCR larga, PCR múltiple, PCR con cebadores internos, PCR cuantitativa, PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR), PCR en tiempo real, PCR unicelular, PCR en fase sólida, combinaciones de las mismas, y similares. Los reactivos y el soporte físico para llevar a cabo la PCR están comercialmente disponibles.

Los términos "amplificar", "amplificación", "reacción de amplificación" o "amplificando" se refieren a cualquier procedimiento in vitro para multiplicar las copias de una secuencia diana de ácido nucleico. A veces, amplificación se refiere a un incremento "exponencial" en el ácido nucleico diana. Sin embargo, "amplificar" como se usa en el presente documento también se puede referir a incrementos lineales en los números de una secuencia diana seleccionada de ácido nucleico, pero es diferente de una etapa de extensión de cebadores individual de una sola vez. En algunos modos de realización, se puede realizar una reacción de amplificación limitada, también conocida como preamplificación. La preamplificación es un procedimiento en el que se produce una cantidad limitada de amplificación debido a que se está realizando un pequeño número de ciclos, por ejemplo, 10 ciclos. La preamplificación puede permitir algo de amplificación, pero detiene la amplificación antes de la fase exponencial, y típicamente produce aproximadamente 500 copias de la(s) secuencia(s) de nucleótidos deseada(s). El uso de la preamplificación también puede limitar las inexactitudes asociadas con los reactivos eliminados en las reacciones de PCR estándar, y también puede reducir los sesgos de la amplificación debido a la abundancia de secuencias de nucleótidos o especies de la diana. En algunos modos de realización, se puede usar una extensión de cebadores de una sola vez se puede realizar como preludio para la amplificación lineal o exponencial.

En el presente documento se presenta una descripción generalizada de un procedimiento de amplificación. Los cebadores y el ácido nucleico diana están conectados, y las secuencias complementarias se hibridan entre sí, por ejemplo. Los cebadores se pueden hibridar a un ácido nucleico diana, en o cerca de (por ejemplo, adyacente a, contiguo a, y similares) una secuencia de interés. Una mezcla de reacción, que contiene los componentes necesarios para la funcionalidad enzimática, se añade al híbrido cebador – ácido nucleico diana, y se puede producir la amplificación en condiciones adecuadas. Los componentes de una reacción de amplificación pueden incluir, pero no se limitan a, por ejemplo, cebadores (por ejemplo, cebadores individuales, pares de cebadores, conjuntos de cebadores y similares) un molde de polinucleótido (por ejemplo, ácido nucleico diana), polimerasa, nucleótidos, dNTP y similares. En algunos modos de realización, por ejemplo, se pueden usar nucleótidos o análogos de nucleótidos no naturales, tales como análogos que contienen un marcador detectable (por ejemplo, marcador fluorescente o colorimétrico). Las polimerasas se pueden seleccionar por un experto en la técnica e incluyen polimerasas para amplificación con termociclo (por ejemplo, Taq ADN polimerasa; Taq ADN polimerasa Q-Bio™ (forma truncada recombinante de Taq ADN polimerasa que carece de actividad 5’-3'exo); polimerasa SurePrime™ (Taq ADN polimerasa químicamente modificada para PCR de "inicio en caliente"); Taq ADN polimerasa Arrow™ (amplificación de molde larga y de alta sensibilidad)) y polimerasas para la amplificación termoestable (por ejemplo, ARN polimerasa para la amplificación mediada por transcripción (TMA) descrita en la URL de Internet "genprobe.com/pdfs/tma_whiteppr.pdf). Se pueden añadir otros componentes enzimáticos, tales como transcriptasa inversa para reacciones de amplificación mediada por transcripción (TMA), por ejemplo.

Los términos "cerca" o "adyacente a" cuando se hace referencia a una secuencia de nucleótidos de interés se refiere

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a una distancia o región entre el extremo del cebador y la secuencia de nucleótidos o nucleótidos de interés. Como se usa en el presente documento, adyacente está en el intervalo de aproximadamente 5 nucleótidos a aproximadamente 500 nucleótidos (por ejemplo, aproximadamente 5 nucleótidos lejos de nucleótido del interés, aproximadamente 10, aproximadamente 20, aproximadamente 30, aproximadamente 40, aproximadamente 50, aproximadamente 60, aproximadamente 70, aproximadamente 80, aproximadamente 90, aproximadamente 100, aproximadamente 150, aproximadamente 200, aproximadamente 250, aproximadamente 300, aproximadamente 350, aproximadamente 400, aproximadamente 450 o aproximadamente 500 nucleótidos desde un nucleótido de interés). En algunos modos de realización, los cebadores en un conjunto se hibridan dentro de aproximadamente de 10 a 30 nucleótidos de una secuencia de ácidos nucleicos de interés y producen los productos cuantificados.

Cada especie de ácido nucleico amplificado independientemente es de aproximadamente 10 a aproximadamente 500 pares de bases de longitud, en algunos modos de realización. En determinados modos de realización, una especie de ácido nucleico amplificado es de aproximadamente 20 a aproximadamente 250 pares de bases de longitud, a veces es de aproximadamente 50 a aproximadamente 150 pares de bases de longitud y a veces es de aproximadamente 100 pares de bases de longitud. Por tanto, en algunos modos de realización, la longitud de cada uno de los productos de especies de ácidos nucleicos amplificados independientemente es de aproximadamente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450 o 500 pares de bases (pb) de longitud.

Un producto de amplificación puede incluir nucleótidos naturales, nucleótidos no naturales, análogos de nucleótidos y similares y combinaciones de los anteriores. Un producto de amplificación a menudo tiene una secuencia de nucleótidos que es idéntica a o sustancialmente idéntica a una secuencia de nucleótidos de ácido nucleico de muestra o complemento de la misma. Una secuencia de nucleótidos "sustancialmente idéntica" en un producto de amplificación tendrá, en general, un alto grado de identidad de secuencia con la especie de secuencia de nucleótidos que se va a amplificar o complemento de la misma (por ejemplo, una identidad de secuencia de aproximadamente un 75%, 76%, 77%, 78%, el 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de un 99%), y a veces las variaciones son resultado de la falta de fidelidad de la polimerasa usada para la extensión y/o amplificación, o secuencia(s) de nucleótidos adicional(es) añadida(s) a los cebadores usados para la amplificación.

Las condiciones de PCR pueden ser dependientes de las secuencias de cebadores, abundancia de la diana, y la cantidad deseada de amplificación, y por lo tanto, un experto en la técnica puede elegir entre una serie de protocolos de PCR disponible (véase, por ejemplo, la patente de los EE. UU. n.º 4.683.195 y 4.683.202; y PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al., eds, 1990. La PCR digital también es conocida por los expertos en la técnica; véase, por ejemplo, la publicación de solicitud de patente de los EE. UU. número 20070202525, presentada el 2 de febrero de 2007). A menudo la PCR se lleva a cabo como un procedimiento automático con una enzima termoestable. En este procedimiento, la temperatura de la mezcla de reacción se cicla a través de una región de desnaturalización, una región de hibridación de cebadores y una región de reacción de extensión automáticamente. Las máquinas adaptadas específicamente para este propósito están comercialmente disponibles. Un ejemplo no limitante de un protocolo de PCR que puede ser adecuado para los modos de realización descritos en el presente documento es, tratar la muestra a 95 °C durante 5 minutos; repetir cuarenta y cinco ciclos de 95 °C durante 1 minuto, 59 °C durante 1 minuto, 10 segundos, y 72 °C durante 1 minuto 30 segundos; y a continuación tratar la muestra a 72 °C durante 5 minutos. Con frecuencia se realizan múltiples ciclos usando un ciclador térmico comercialmente disponible. También se pueden aplicar procedimientos de amplificación isotérmica adecuados conocidos y seleccionados por el experto en la técnica, en determinados modos de realización.

En algunos modos de realización, se pueden usar procedimientos de amplificación múltiple para amplificar los ácidos nucleicos diana, de modo que múltiples amplicones se amplifican simultáneamente en una única reacción homogénea. Como se usa en el presente documento, "amplificación múltiple" se refiere a una variante de PCR en la que se puede lograr la amplificación simultánea de muchas dianas de interés en un recipiente de reacción usando más de un par de cebadores (por ejemplo, más de un conjunto de cebadores). La amplificación múltiple puede ser útil para el análisis de deleciones, mutaciones y polimorfismos, o ensayos cuantitativos, en algunos modos de realización. En determinados modos de realización, se puede usar la amplificación múltiple para detectar un desequilibrio de secuencia paráloga, aplicaciones de fenotipado en las que se requiere el análisis simultáneo de múltiples marcadores, detección de patógenos u organismos modificados genéticamente, o para análisis de microsatélites. En algunos modos de realización, se puede combinar la amplificación múltiple con otro procedimiento de amplificación (por ejemplo, PCR) (por ejemplo, PCR con cebadores internos o PCR de inicio en caliente, por ejemplo) para incrementar la especificidad y reproducibilidad de la amplificación. En otros modos de realización, se puede realizar una amplificación múltiple por duplicados, por ejemplo, para reducir la varianza introducida por dicha amplificación.

En algunos modos de realización, las especies de ácidos nucleicos de amplificación de los conjuntos de cebadores se generan en un recipiente de reacción. En algunos modos de realización, se puede realizar la amplificación de secuencias parálogas en un único recipiente de reacción. En determinados modos de realización, se pueden amplificar secuencias parálogas (en los mismos o diferentes cromosomas) por un único conjunto o par de cebadores. En algunos modos de realización, se pueden amplificar las especies de secuencias de nucleótidos por

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un único conjunto o par de cebadores. En algunos modos de realización, las especies de secuencias de nucleótidos en un conjunto se pueden amplificar con dos o más pares de cebadores.

En determinados modos de realización, la amplificación de ácidos nucleicos puede generan especies de ácidos nucleicos adicionales de secuencia de ácido nucleico diferente o sustancialmente similar. En determinados modos de realización descritos en el presente documento, las especies de ácidos nucleicos contaminantes o adicionales, que puede contener secuencias sustancialmente complementarias a, o pueden ser sustancialmente idénticas a, la secuencia de interés, pueden ser útiles para la cuantificación de secuencias, con la condición de que el nivel de secuencias contaminantes o adicionales permanezca constante y por lo tanto, pueda ser un marcador fiable con un nivel que se pueda reproducir sustancialmente. Consideraciones adicionales que pueden afectar a la reproducibilidad de la amplificación de secuencia son; condiciones de PCR (número de ciclos, volumen de reacción, diferencia en la temperatura de fusión entre pares de cebadores, y similares), concentración de ácido nucleico diana en la muestra (por ejemplo, ácido nucleico fetal en el historial de ácido nucleico materno, ácido nucleico vírico en el historial del huésped), el número de cromosomas en el que reside la especie de nucleótido de interés (por ejemplo, secuencia paráloga), variaciones en la calidad de la muestra preparada, y similares. Los términos "reproducido sustancialmente" o "reproducible sustancialmente" como se usa en el presente documento se refieren a un resultado (por ejemplo, cantidad cuantificable de ácido nucleico) que, en condiciones sustancialmente similares, se podría producir sustancialmente de la misma manera en aproximadamente un 75 % del tiempo o más, aproximadamente un 80 %, aproximadamente un 85 %, aproximadamente un 90 %, aproximadamente un 95 %, o aproximadamente un 99 % del tiempo o más.

En algunos modos de realización en los que un ácido nucleico diana es ARN, antes de la etapa de amplificación, se puede sintetizar una copia de ADN (ADNc) del transcrito de ARN de interés. Se puede sintetizar un ADNc por transcripción inversa, lo que se puede llevar a cabo como una etapa separada, o en una reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR), una modificación de la reacción en cadena de la polimerasa para amplificar ARN. Los procedimientos adecuados para la amplificación por PCR de ácidos ribonucleicos se describen por Romero y Rotbart en Diagnostic Molecular Biology: Principles and Applications, pp. 401-406; Persing et al., eds., Mayo Foundation, Rochester, Minn., 1993; Egger et al., J. Clin. Microbiol. 33:1442-1447, 1995; u la patente de los EE. UU. n.º 5.075.212. Se puede usar tecnología de ADN ramificado para amplificar la señal de los marcadores de ARN en la sangre materna. Para una revisión de la amplificación de señales de ADN ramificado (ADNb) para la cuantificación directa de secuencias de ácidos nucleicos en muestras clínicas, véase Nolte, Adv. Clin. Chem. 33:201235, 1998.

La amplificación también se puede lograr usando PCR digital, en determinados modos de realización (por ejemplo, Kalinina y colaboradores (Kalinina et al., "Nanoliter scale PCR with TaqMan detection." Nucleic Acids Research. 25; 1999-2004, (1997); Vogelstein y Kinzler (Digital PCR. Proc Natl Acad Sci USA. 96; 9236-41, (1999); publicación de patente PCT n.º WO05023091A2; publicación de patente de los EE. UU. n.º US 20070202525). La PCR digital se aprovecha de la amplificación de ácidos nucleicos (ADN, ADNc o ARN) a un nivel molecular individual, y ofrece un procedimiento altamente sensible para cuantificar el ácido nucleico con bajo número de copias. Están disponibles sistemas para la amplificación digital y el análisis de ácidos nucleicos (por ejemplo, Fluidigm® Corporation).

El uso de una reacción de extensión de cebadores también se puede aplicar en los procedimientos de la tecnología. Una reacción de extensión de cebadores funciona, por ejemplo, discriminando secuencias de ácidos nucleicos en un único emparejamiento erróneo de nucleótido (por ejemplo, un emparejamiento erróneo entre secuencias parálogas). El emparejamiento erróneo se detecta por la incorporación de uno o más desoxinucleótidos y/o didesoxinucleótidos a un oligonucleótido de extensión, que se hibrida a una región adyacente al sitio de emparejamiento erróneo. En general, el oligonucleótido de extensión se extiende con una polimerasa. En algunos modos de realización, se incorpora una marca detectable o marcador detectable en el oligonucleótido de extensión o en los nucleótidos añadidos en el oligonucleótido de extensión (por ejemplo, biotina o estreptavidina). El oligonucleótido extendido se puede detectar por cualquier procedimiento de detección adecuado conocido (por ejemplo, espectrometría de masas; procedimientos de secuenciación). En algunos modos de realización, el sitio de emparejamiento erróneo se extiende sólo por uno o dos desoxinucleótidos o didesoxinucleótidos complementarios que se marcan por un marcador específico o generan un producto de extensión de cebadores con una masa específica, y el emparejamiento erróneo se puede discriminar y cuantificar.

En algunos modos de realización, la amplificación se puede realizar sobre un soporte sólido. En algunos modos de realización, los cebadores pueden estar asociados a un soporte sólido. En determinados modos de realización, el ácido nucleico diana (por ejemplo, ácido nucleico molde) puede estar asociado a un soporte sólido. Un ácido nucleico (cebador o diana) en asociación con un soporte sólido a menudo se denomina un ácido nucleico de fase sólida.

En algunos modos de realización, las moléculas de ácido nucleico proporcionadas para la amplificación y en un "microrreactor". Como se usa en el presente documento, el término "microrreactor" se refiere a un espacio dividido en el que una molécula de ácido nucleico se puede hibridar a una molécula de ácido nucleico de soporte sólido. Los ejemplos de microrreactores incluyen, sin limitación, un glóbulo de emulsión (descrito a continuación en el presente documento) y un hueco en un sustrato. Un hueco en un sustrato puede ser un orificio, un poro o un pocillo (por ejemplo, micropocillo, nanopocillo, picopocillo, microporo o nanoporo) en un sustrato construido a partir de un

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material sólido útil para contener fluidos (por ejemplo, plástico (por ejemplo, polipropileno, polietileno, poliestireno) o silicio) en determinados modos de realización. Los glóbulos de emulsión se dividen por una fase inmiscible como se describe en mayor detalle a continuación en el presente documento. En algunos modos de realización, el volumen del microrreactor es lo suficientemente grande como para acomodar un soporte sólido (por ejemplo, perla) en el microrreactor y lo suficientemente pequeño como para excluir la presencia de dos o más soportes sólidos en el microrreactor.

El término "emulsión" como se usa en el presente documento se refiere a una mezcla de dos sustancias inmiscibles y inmezclables, en la que una sustancia (la fase dispersa) a menudo se dispersa en la otra sustancia (la fase continua). La fase dispersa puede ser una solución acuosa (es decir, una solución que comprende agua) en determinados modos de realización. En algunos modos de realización, la fase dispersa está compuesta predominantemente de agua (por ejemplo, más de un 70 %, más de un 75 %, más de un 80 %, más de un 85 %, más de un 90%, más de un 95%, más de un 97%, más de un 98% y más de un 99% de agua (en peso)). Cada porción discreta de una fase dispersa, tal como una fase dispersa acuosa, se denomina en el presente documento "glóbulo" o "microrreactor". Un glóbulo a veces puede ser de forma esferoide, sustancialmente esferoide o semiesferoide, en determinados modos de realización.

Los términos "aparato de emulsión" y "componente(s) de emulsión" como se usa en el presente documento se refieren a aparatos y componentes que se pueden usar para preparar una emulsión. Los ejemplos no limitantes de aparatos de emulsión incluyen, sin limitación, aparato de contraflujo, contracorriente, tambor giratorio y membrana adecuado para su uso por un experto en la técnica para preparar una emulsión. Un componente de emulsión forma la fase continua de una emulsión en determinados modos de realización, e incluye, sin limitación, una sustancia inmiscible con agua, tal como un componente que comprende o que consiste esencialmente en un aceite (por ejemplo, un aceite termoestable y biocompatible (por ejemplo, aceite de vaselina fluido)). Se puede utilizar un estabilizante de emulsión biocompatible como componente de emulsión. Los estabilizantes de emulsión incluyen, sin limitación, Atlox 4912, Span 80 y otros tensioactivos biocompatibles.

En algunos modos de realización, se pueden incluir componentes útiles para reacciones biológicas en la fase dispersa. Los glóbulos de la emulsión pueden incluir (i) una unidad de soporte sólido (por ejemplo, una perla o una partícula); (ii) molécula de ácido nucleico de muestra; y (iii) una cantidad suficiente de agentes de extensión para alargar el ácido nucleico de fase sólida y amplificar el ácido nucleico de fase sólida alargado (por ejemplo, nucleótidos de extensión, polimerasa, cebador). Los glóbulos inactivos en la emulsión pueden incluir un subconjunto de estos componentes (por ejemplo, un soporte sólido y reactivos de extensión y ningún ácido nucleico de muestra) y algunos pueden estar vacíos (es decir, algunos glóbulos no incluirán soporte sólido, ni ácido nucleico de muestra y ni agentes de extensión).

Se pueden preparar emulsiones usando procedimientos conocidos adecuados (por ejemplo, Nakano et al. "Singlemolecule PCR using water-in-oil emulsion;" Journal of Biotechnology 102 (2003) 117-124). Los procedimientos de emulsification incluyen, sin limitación, procedimientos coadyuvantes, procedimientos contraflujo, procedimientos contracorriente, procedimientos con tambor giratorio, procedimientos con membrana, y similares. En determinados modos de realización, se prepara una mezcla de reacción acuosa que contiene un soporte sólido (a continuación en el presente documento la "modos de reacción") y a continuación se añade a un aceite biocompatible. En determinados modos de realización, la mezcla de reacción se puede añadir gota a gota a una mezcla en rotación de aceite biocompatible (por ejemplo, aceite de vaselina fluido (Sigma)) y se deja emulsionar. En algunos modos de realización, la mezcla de reacción se puede añadir gota a gota en un flujo cruzado de aceite biocompatible. El tamaño de los glóbulos acuosos en la emulsión se puede ajustar, tal como variando el caudal y la velocidad a la que se añaden los componentes entre sí, por ejemplo.

El tamaño de los glóbulos de emulsión se puede seleccionar por el experto en la técnica en determinados modos de realización en base a dos factores competitivos: (i) los glóbulos son lo suficientemente grandes para englobar una molécula de soporte sólido, una molécula de ácido nucleico de muestra, y suficientes agentes de extensión para el grado de elongación y amplificación requerido; y (ii) los glóbulos son lo suficientemente pequeños de modo que se pueda amplificar una población de glóbulos por un equipo de laboratorio convencional (por ejemplo, equipo de termociclado, tubos de ensayo, incubadoras y similares). Los glóbulos en la emulsión pueden tener un diámetro nominal, medio o promedio de aproximadamente 5 micrómetros a aproximadamente 500 micrómetros, de aproximadamente 10 micrómetros a aproximadamente 350 micrómetros, de aproximadamente 50 a 250 micrómetros, de aproximadamente 100 micrómetros a aproximadamente 200 micrómetros, o de aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 300, 400 o 500 micrómetros en determinados modos de realización.

En determinados modos de realización, las especies de ácidos nucleicos amplificados en un conjunto son de idéntica longitud, y a veces las especies de ácidos nucleicos amplificados en un conjunto son de una longitud diferente. Por ejemplo, una especie de ácido nucleico amplificado puede ser mayor que una o más de otras especies de ácidos nucleicos amplificados en el conjunto en de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 nucleótidos (por ejemplo, de aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 o 90 nucleótidos más larga).

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En algunos modos de realización, se puede determinar una proporción para la cantidad de una especie de ácido nucleico amplificado en conjunto con respecto a la cantidad de otra especie de ácido nucleico amplificado en el conjunto (a continuación en el presente documento una "proporción de conjunto"). En algunos modos de realización, la cantidad de una especie de ácido nucleico amplificado en un conjunto es aproximadamente igual a la cantidad de otra especie de ácido nucleico amplificado en el conjunto (es decir, las cantidades de especies de ácidos nucleicos amplificados en un conjunto son de aproximadamente 1:1), que en general es el caso cuando el número de cromosomas en una muestra que lleva cada especie de secuencia de nucleótidos amplificada es aproximadamente igual. El término "cantidad" como se usa en el presente documento con respecto a la especie de ácido nucleico amplificado se refiere a cualquier medida, incluyendo, pero sin limitarse a, número de copias, peso (por ejemplo, gramos) y concentración (por ejemplo, gramos por unidad de volumen (por ejemplo, mililitro); unidades molares). En determinados modos de realización, la cantidad de una especie de ácido nucleico amplificado en un conjunto puede diferir de la cantidad de otra especie de ácido nucleico amplificado en un conjunto, incluso cuando el número de cromosomas en una muestra que lleva cada especie de secuencia de nucleótidos amplificada es aproximadamente igual. En algunos modos de realización, las cantidades especies de ácidos nucleicos amplificados dentro de un conjunto pueden variar hasta un nivel umbral en el que se puede detectar una anomalía cromosómica con un nivel de confianza de aproximadamente un 95 % (por ejemplo, aproximadamente un 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99,

o más de un 99 %). En determinados modos de realización, las cantidades de la especie de ácido nucleico amplificado en un conjunto varían aproximadamente en un 50 % o menos (por ejemplo, aproximadamente en un 45, 40, 35, 30, 25, 20, 10, 5, 4, 3, 2 o 1 %, o menos de un 1 %). Por tanto, en determinados modos de realización, las cantidades de especies de ácidos nucleicos amplificados en un conjunto pueden variar de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 1:1,5. Sin quedar limitados por la teoría, determinados factores pueden dar lugar a la observación de que la cantidad de una especie de ácido nucleico amplificado en un conjunto puede diferir de la cantidad de otra especie de ácido nucleico amplificado en un conjunto, incluso cuando el número de cromosomas en una muestra que lleva cada especie de secuencia de nucleótidos amplificada es aproximadamente igual. Dichos factores pueden incluir diferentes tasas de eficacia de amplificación y/o amplificación de un cromosoma no destinado en el diseño de ensayo.

Cada especie de ácido nucleico amplificado en un conjunto, en general, se amplifica en condiciones que amplifican estas especies, en un nivel sustancialmente reproducible. El término "nivel sustancialmente reproducible" como se usa en el presente documento se refiere a la consistencia de los niveles de amplificación para una especie de ácido nucleico amplificado particular por unidad de ácido nucleico molde (por ejemplo, por unidad de ácido nucleico molde que contiene la especie de secuencia de nucleótidos particular amplificada). Un nivel sustancialmente reproducible varía en aproximadamente un 1 % o menos en determinados modos de realización, después de tener en cuenta la cantidad de ácido nucleico molde que da lugar una especie de ácido nucleico de amplificación particular (por ejemplo, normalizado para la cantidad de ácido nucleico molde). En algunos modos de realización, un nivel sustancialmente reproducible varía entre un 10 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1,5 %, 1 %, 0,5 %, 0,1 %, 0,05 %, 0,01 %, 0,005 % o 0,001 % después de tener en cuenta la cantidad de ácido nucleico molde que da lugar a una especie de ácido nucleico de amplificación particular. De forma alternativa, sustancialmente reproducible quiere decir que cualesquiera dos o más medidas de un nivel de amplificación están dentro de un coeficiente de variación particular ("CV") de una media dada. Dicho CV puede ser de un 20 % o menos, a veces un 10 % o menos y a veces un 5 % o menos. Las dos o más medidas de un nivel de amplificación se pueden determinar entre dos o más reacciones y/o dos o más de los mismos tipos de muestras (por ejemplo, dos muestras normales o dos muestras de trisomía).

Cebadores

Se proporcionan cebadores útiles para la detección, cuantificación, amplificación, secuenciación y análisis de especies de secuencias de nucleótidos. En algunos modos de realización, se usan cebadores en conjuntos, en los que un conjunto contiene al menos un par. En algunos modos de realización, un conjunto de cebadores puede incluir un tercer o un cuarto ácido nucleico (por ejemplo, dos pares de cebadores o conjuntos de cebadores internos, por ejemplo). Una pluralidad de pares de cebadores puede constituir un conjunto de cebadores en determinados modos de realización (por ejemplo, aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 pares). En algunos modos de realización, se puede usar una pluralidad de conjuntos de cebadores, comprendiendo cada conjunto par(es) de cebadores. El término "cebador" como se usa en el presente documento se refiere a un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que puede hibridarse a un ácido nucleico diana, en o cerca de (por ejemplo, adyacente a) una región específica de interés. Los cebadores pueden permitir la determinación específica de una secuencia de nucleótidos de ácido nucleico diana o la detección del ácido nucleico diana (por ejemplo, la presencia o ausencia de una secuencia o número de copias de una secuencia), o característica de la misma, por ejemplo. Un cebador puede ser natural o sintético. El término "específico" o "especificidad", como se usa en el presente documento, se refiere a la unión o hibridación de una molécula a otra molécula, tal como un cebador a un polinucleótido diana. Esto es, "específico" o "especificidad" se refiere al reconocimiento, contacto y formación de un complejo estable entre dos moléculas, en comparación con el reconocimiento, contacto o formación del complejo sustancialmente menor de cualquiera de las dos moléculas con otras moléculas. Como se usa en el presente documento, el término "hibridación" se refiere a la formación de un complejo estable entre dos moléculas. Los términos "cebador", "oligo" u "oligonucleótido" se pueden usar de forma intercambiable en todo el documento, cuando se refieren a cebadores.

Un ácido nucleico de cebador se puede diseñar y sintetizar usando procedimientos adecuados, y puede ser de

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cualquier longitud adecuada para hibridarse a una secuencia de nucleótidos de interés (por ejemplo, cuando el ácido nucleico está en fase líquida o unido a un soporte sólido) y realizar los procedimientos de análisis descritos en el presente documento. Se pueden diseñar cebadores en base a una secuencia de nucleótidos diana. Un cebador, en algunos modos de realización, puede ser de aproximadamente 10 a aproximadamente 100 nucleótidos, de aproximadamente 10 a aproximadamente 70 nucleótidos, de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 nucleótidos, de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 nucleótidos, o de aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 nucleótidos de longitud. Un cebador puede estar compuesto de nucleótidos naturales y/o no naturales (por ejemplo, nucleótidos marcados), o una mezcla de los mismos. Los cebadores adecuados para su uso con los modos de realización descritos en el presente documento, se pueden sintetizar y marcar usando técnicas conocidas. Los oligonucleótidos (por ejemplo, cebadores) se pueden sintetizar químicamente de acuerdo con el procedimiento de fosforamidita-triéster en fase sólida descrito por primera vez por Beaucage y Caruthers, Tetrahedron Letts., 22:1859-1862, 1981, usando un sintetizador automático, como se describe en Needham-VanDevanter et al., Nucleic Acids Res. 12:6159-6168,1984. La purificación de oligonucleótidos se puede efectuar por electroforesis en gel de acrilamida natural o por cromatografía de líquidos de alto rendimiento con intercambio aniónico (HPLC), por ejemplo, como se describe en Pearson y Regnier, J. Chrom., 255:137-149, 1983.

Toda o una porción de una secuencia de ácido nucleico de cebador (natural o sintético) puede ser sustancialmente complementaria a un ácido nucleico diana, en algunos modos de realización. Como se refiere en el presente documento, "sustancialmente complementaria" con respecto a las secuencias se refiere a secuencias de nucleótidos que se hibridarán entre sí. La restricción de las condiciones de hibridación se puede alterar para tolerar cantidades variables de emparejamiento erróneo de secuencia. Se incluyen regiones de secuencias de nucleótidos homólogos, diana y de captura complementarias entre sí en un 55 % o más, 56 % o más, 57 % o más, 58 % o más, 59 % o más, 60% o más, 61% o más, 62% o más, 63% o más, 64% o más, 65% o más, 66% o más, 67% o más, 68% o más, 69% o más, 70% o más, 71% o más, 72% o más, 73% o más, 74% o más, 75% o más, 76% o más, 77%

o más, 78% o más, 79% o más, 80% o más, el 81% o más, 82% o más, 83% o más, 84% o más, 85% o más, 86% o más, 87% o más, 88% o más, 89% o más, 90% o más, 91% o más, 92% o más, 93% o más, 94% o más, 95% o más, 96% o más, 97% o más, 98% o más o 99 % o más.

Los cebadores que son sustancialmente complementarios con una secuencia de ácidos nucleicos diana también son sustancialmente idénticos al complementario de la secuencia de ácidos nucleicos diana. Esto es, los cebadores son sustancialmente idénticos a la hebra antisentido del ácido nucleico. Como se refiere en el presente documento, "sustancialmente idéntica" con respecto a las secuencias se refiere a secuencias de nucleótidos que son idénticas entre sí en un 55% o más, 56% o más, 57% o más, 58% o más, 59% o más, 60% o más, 61%o más, 62% o más, 63% o más, 64% o más, 65% o más, 66% o más, 67% o más, 68% o más, 69% o más, 70% o más, 71%

o más, 72% o más, 73% o más, 74% o más, 75% o más, 76% o más, 77% o más, 78% o más, 79% o más, 80% o más, el 81% o más, 82%o más, 83% o más, 84% o más, 85% o más, 86% o más, 87% o más, 88% o más, 89% o más, 90% o más, 91% o más, 92% o más, 93% o más, 94% o más, 95% o más, 96% o más, 97%

o más, 98 % o más o 99 % o más. Una prueba para determinar si dos secuencias de nucleótidos son sustancialmente idénticas es la de determinar el porcentaje de secuencias de nucleótidos idénticas compartidas.

Las secuencias y la longitud de los cebadores pueden afectar a la hibridación a secuencias de ácidos nucleicos diana. Dependiendo del grado de emparejamiento erróneo entre el cebador y ácido nucleico diana, se pueden usar condiciones de restricción bajas, medias o altas para efectuar la hibridación de cebador/diana. Como se usa en el presente documento, el término "condiciones restrictivas" se refiere a las condiciones para la hibridación y el lavado. Los procedimientos para la optimización de las condiciones de temperatura para la reacción de hibridación son conocidos por los expertos en la técnica, y se pueden encontrar en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y., 6,3.1-6,3.6 (1989). Los procedimientos acuosos y no acuosos se describen en esa referencia y se puede usar cualquiera. Los ejemplos no limitantes de condiciones de hibridación restrictivas son hibridación en 6X cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45 °C, seguido de uno o más lavados en 0,2X SSC, SDS al 0,1 % a 50 °C. Otro ejemplo de condiciones de hibridación restrictivas son hibridación en 6X cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45 °C, seguido de uno o más lavados en 0,2X SSC, SDS al 0,1 % a 55 °C. Otro ejemplo de condiciones de hibridación restrictivas es hibridación en 6X cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45 °C, seguido de uno o más lavados en 0,2X SSC, SDS al 0,1 % a 60 °C. A menudo, las condiciones de hibridación restrictivas son hibridación en 6X cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45 °C, seguido de uno o más lavados en 0,2X SSC, SDS al 0,1 % a 65 °C. Más a menudo, las condiciones de restricción son fosfato de sodio 0,5 M, SDS al 7 % a 65 °C, seguido de uno o más lavados en 0,2X SSC, SDS al 1 % a 65 °C. Las temperaturas de hibridación restrictivas también se pueden alterar (es decir, reducir) con la adición de determinados disolventes orgánicos, formamida por ejemplo. Los disolventes orgánicos, como formamida, reducen la estabilidad térmica de los polinucleótidos bicatenarios, de modo que la hibridación se puede llevar a cabo a temperaturas más bajas; manteniendo al mismo tiempo las condiciones restrictivas y extendiendo la vida útil de los ácidos nucleicos que puede ser termolábiles.

Como se usa en el presente documento, la expresión "hibridación" o variaciones gramaticales de la misma, se refiere a la unión de una primera molécula de ácido nucleico a una segunda molécula de ácido nucleico en condiciones de restricción bajas, medias o altas, o en condiciones de síntesis de ácidos nucleicos. La hibridación puede incluir casos en los que una primera molécula de ácido nucleico se une a una segunda molécula de ácido

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nucleico, en los que la primera y segunda moléculas de ácido nucleico son complementarias. Como se usa en el presente documento, "se hibrida específicamente" se refiere a la hibridación preferente en condiciones de síntesis de ácidos nucleicos de un cebador, a una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia complementaria con el cebador en comparación con la hibridación a una molécula de ácido nucleico que no tiene una secuencia complementaria. Por ejemplo, la hibridación específica incluye la hibridación de un cebador a una secuencia de ácido nucleico diana que es complementaria con el cebador.

En algunos modos de realización, los cebadores pueden incluir una subsecuencia de nucleótidos que puede ser complementaria a una secuencia de hibridación de cebador y ácido nucleico en fase sólida o sustancialmente complementaria a una secuencia de hibridación de cebador y ácido nucleico en fase sólida (por ejemplo, idéntica aproximadamente en un 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de un 99% a la secuencia de hibridación de cebador complementaria cuando se alinean). Un cebador puede contener una subsecuencia de nucleótidos no complementaria a o no sustancialmente complementaria a una secuencia de hibridación de cebador y ácido nucleico en fase sólida (por ejemplo, en el extremo 3' o 5' de la subsecuencia de nucleótidos en el cebador complementaria a o sustancialmente complementaria a la secuencia de hibridación de cebador en fase sólida).

Un cebador, en determinados modos de realización, puede contener una modificación tal como inosinas, sitios abásicos, ácidos nucleicos bloqueados, ligandos del surco menor, estabilizantes dobles (por ejemplo, acridina, espermidina), modificadores de Tm o cualquier modificador que cambia las propiedades de unión de los cebadores o sondas.

Un cebador, en determinados modos de realización, puede contener una molécula o entidad detectable (por ejemplo, un fluoróforo, radioisótopo, agente colorimétrico, partícula, enzima y similares). Cuando se desee, el ácido nucleico se puede modificar para incluir un marcador detectable usando cualquier procedimiento conocido para un experto en la técnica. El marcador se puede incorporar como parte de la síntesis, o añadir antes de usar el cebador en cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento. La incorporación del marcador se puede realizar en fase líquida o bien en fase sólida. En algunos modos de realización, el marcador detectable puede ser útil para la detección de dianas. En algunos modos de realización, el marcador detectable puede ser útil para la cuantificación de ácidos nucleicos diana (por ejemplo, determinando el número de copias de una secuencia o especie particular de ácido nucleico). Cualquier marcador detectable adecuado para la detección de una interacción

o actividad biológica en un sistema se puede seleccionar y utilizar de forma apropiada por el experto. Los ejemplos de marcadores detectables son marcadores fluorescentes tales como fluoresceína, rodamina y otros (por ejemplo,

Anantha, et al., Biochemistry (1998) 37:2709 2714; y Qu & Chaires, Metods Enzymol. (2000) 321:353 388); isótopos radioactivos (por ejemplo, 125I, 131I, 35S, 31P, 32P, 33P, 14C, 3H, 7Be, 28Mg, 57Co, 65Zn, 67Cu, 68Ge, 82Sr, 83Rb, 95Tc, 96Tc, 103Pd, 109Cd y 127Xe); marcadores de dispersión de luz (por ejemplo, la patente de los EE. UU. n.º 6.214.560, y comercialmente disponible de Genicon Sciences Corporation, CA); marcadores quimioluminiscentes y sustratos enzimáticos (por ejemplo, dioxetanos y ésteres de acridinio), marcadores enzimáticos o proteínicos (por ejemplo, proteína verde fluorescente (GFP) o variante de color de la misma, luciferasa, peroxidasa); otros marcadores cromogénicos o tintes (por ejemplo, cianina), y otros cofactores o biomoléculas tales como digoxigenina, estrepdavidina, biotina (por ejemplo, miembros de un par de unión tal como biotina y avidina, por ejemplo), restos de captura de afinidad y similares. En algunos modos de realización, un cebador se puede marcar con un resto de captura de afinidad. También se incluyen en los marcadores detectables los marcadores útiles para la modificación de masas para la detección con espectrometría de masas (por ejemplo, espectrometría de masas de desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI) y espectrometría de masas con electropulverización (ES)).

Un cebador también se puede referir a una secuencia de polinucleótidos que se hibrida con una subsecuencia de un ácido nucleico diana u otro cebador y facilita la detección de un cebador, un ácido nucleico diana o ambos, como con balizas moleculares, por ejemplo. El término "baliza molecular" como se usa en el presente documento se refiere a una molécula detectable, en la que la propiedad detectable de la molécula es detectable sólo en determinadas condiciones específicas, permitiendo de este modo funcionar como una señal específica e informativa. Los ejemplos no limitantes de propiedades detectables son, propiedades ópticas, propiedades eléctricas, propiedades magnéticas, propiedades químicas y el tiempo o la velocidad a través de una abertura de tamaño conocido.

En algunos modos de realización, una baliza molecular puede ser un oligonucleótido monocatenario que puede formar una estructura tallo-lazo, en la que la secuencia del lazo puede ser complementaria a una secuencia de ácido nucleico diana de interés y se flanquea por brazos complementarios cortos que pueden formar un tallo. Los oligonucleótidos se pueden marcar en un extremo con un fluoróforo y en el otro extremo con una molécula desactivadora. En la conformación tallo-lazo, la energía del fluoróforo excitado se transfiere al desactivador, a través de un acoplamiento dipolo-dipolo de largo alcance similar al observado en la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia, o FRET, y se libera como calor en lugar de luz. Cuando la secuencia del lazo se hibrida con una secuencia diana específica, los dos extremos de la molécula se separan y la energía del fluoróforo excitado se emite como la luz, generando una señal detectable. Las balizas moleculares ofrecen la ventaja añadida de que la retirada del exceso de sonda es innecesaria debido a la naturaleza autodesactivadora de la sonda no hibridada. En algunos modos de realización, las sondas de balizas moleculares se pueden diseñar para discriminar o bien tolerar emparejamientos erróneos entre las secuencias del lazo y las diana modulando la fuerza relativa de la hibridación lazo-diana y la formación del tallo. Como se refiere en el presente documento, el término "nucleótido con

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emparejamiento erróneo" o un "emparejamiento erróneo" se refiere a un nucleótido que no es complementario a la secuencia diana en esa posición o posiciones. Una sonda puede tener al menos un emparejamiento erróneo, pero también puede tener 2, 3, 4, 5, 6 o 7 o más nucleótidos con emparejamiento erróneo.

Detección

Las especies de secuencias de nucleótidos o las especies de ácidos nucleicos amplificados o productos detectables preparados a partir de lo anterior, se pueden detectar por un procedimiento de detección adecuado. Los ejemplos no limitantes de procedimientos de detección, cuantificación, secuenciación y similares incluyen detección de masas de amplicones con masa modificada (por ejemplo, espectrometría de masas de desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI) y espectrometría de masas con electropulverización (ES)), un procedimiento de extensión de cebadores (por ejemplo, iPLEX™; Sequenom, Inc.), secuenciación de ADN directa, tecnología de sonda de inversión molecular (MIP)de Affymetrix, polimorfismo de longitud de fragmento de restricción (análisis AFLP), análisis de oligonucleótidos específicos de alelo (ASO), PCR epecífica de metilación (MSPCR), análisis de pirosecuenciación, análisis AcycloPrime, inmunotransferencia por puntos inversa, micromatrices GeneChip, hibridación específica de alelo dinámica (DASH), sondas de ácido nucleico peptídico (APN) y ácidos nucleicos bloqueados (ANB), TaqMan, balizas moleculares, tintes de intercalación, cebadores FRET, AlphaScreen, SNPstream, análisis genético de bits (GBA), minisecuenciación múltiple, SNaPshot, ensayo GOOD, minisec. de micromatrices, extensión de cebadores agrupado (APEX), extensión de cebadores en micromatrices, matrices Tag, microesferas codificadas, incorporación dirigida al molde (TDI), polarización fluorescente, ensayo de unión oligonucleotídica colorimétrica (OLA), OLA codificado por secuencia, unión de micromatrices, reacción en cadena de la ligasa, sondas Padlock, ensayo Invader, hibridación usando al menos una sonda, hibridación usando al menos una sonda marcada de forma fluorescente, clonación y secuenciación, electroforesis, el uso de sondas de hibridación y reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real cuantitativa (QRT-PCR), PCR digital, secuenciación de nanoporos, chips y combinaciones de los mismos. La detección y cuantificación de alelos o parálogos se puede llevar a cabo usando los procedimientos de "tubo cerrado" descritos en la patente de los EE. UU. n.º 11/950.395, que se presentó el 4 de diciembre de 2007. En algunos modos de realización, la cantidad de cada especie de ácido nucleico amplificado se determina por espectrometría de masas, extensión del cebadores, secuenciación (por ejemplo, cualquier procedimiento adecuado, por ejemplo nanoporo o pirosecuenciación), PCR cuantitativa (Q-PCR o QRT-PCR), PCR digital, combinaciones de las mismas, y similares.

Un ácido nucleico diana se puede detectar detectando un marcador detectable o "resto generador de señal" en algunos modos de realización. El término "generador de señal" como se usa en el presente documento se refiere a cualquier átomo o molécula que puede proporcionar un efecto detectable o cuantificable, y que se puede unir a un ácido nucleico. En determinados modos de realización, un marcador detectable genera una única señal lumínica, una señal fluorescente, una señal luminiscente, una propiedad eléctrica, una propiedad química, una propiedad magnética y similares.

Los marcadores detectables incluyen, pero no se limitan a, nucleótidos (marcados o no marcados), compómeros, azúcares, péptidos, proteínas, anticuerpos, compuestos químicos, polímeros conductores, restos de unión tales como biotina, marcas de masas, agentes colorimétricos, agentes emisores de luz, agentes quimioluminiscentes, agentes de dispersión de luz, marcas fluorescentes, marcas radiactivas, marcas de carga (eléctrica o magnética) marcas volátiles y marcas hidrófobas, biomoléculas (por ejemplo, miembros de un par de unión anticuerpo/antígeno, anticuerpo/anticuerpo, anticuerpo/fragmento de anticuerpo, anticuerpo/receptor de anticuerpo, anticuerpo/proteína A

o proteína G, hapteno/antihapteno, biotina/avidina, biotina/estreptavidina, ácido fólico/proteína de unión a folato, vitamina B12/factor intrínseco, grupo reactivo químico/grupo reactivo químico complementario (por ejemplo, sulfhidrilo/maleimida, sulfhidrilo/derivado haloacetilo, amina/isotriocianato, amina/éster de succinimidilo, y amina/haluros de sulfonilo) y similares, de los que algunos se describen adicionalmente a continuación. En algunos modos de realización, una sonda puede contener un resto generador de señal que se hibrida a una diana y altera el paso del ácido nucleico diana a través de un nanoporo, y puede generar una señal cuando se libera del ácido nucleico diana cuando pasa a través del nanoporo (por ejemplo, altera la velocidad o el tiempo a través de un poro de tamaño conocido).

En determinados modos de realización, se introducen marcas de muestra para distinguir entre muestras (por ejemplo, de diferentes pacientes), permitiendo de este modo las pruebas simultáneas de múltiples muestras. Por ejemplo, se pueden introducir marcas de muestra como parte de los cebadores extendidos de modo que los cebadores extendidos se pueden asociar con una muestra particular.

Una solución que contiene amplicones producidos por un procedimiento de amplificación, o una solución que contiene productos de extensión producidos por un procedimiento de extensión, se puede someter a procesamiento adicional. Por ejemplo, una solución se puede poner en contacto con un agente que retira los restos fosfato de nucleótidos libres que no se han incorporado en un amplicón o producto de extensión. Un ejemplo de un agente de este tipo es una fosfatasa (por ejemplo, fosfatasa alcalina). Los amplicones y los productos de extensión también se pueden asociar con una fase sólida, se pueden lavar, se pueden poner en contacto con un agente que retira un fosfato terminal (por ejemplo, exposición a una fosfatasa), se pueden poner en contacto con un agente que retira un nucleótido terminal (por ejemplo, exonucleasa), se puede poner en contacto con un agente que escinde (por ejemplo, endonucleasa, ribonucleasa), y similares.

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El término "soporte sólido" o "fase sólida" como se usa en el presente documento se refiere a un material insoluble con el que se puede asociar el ácido nucleico. Los ejemplos de soportes sólidos para su uso con procedimientos descritos en el presente documento incluyen, sin limitación, matrices, perlas (por ejemplo, perlas paramagnéticas, perlas magnéticas, microperlas, nanoperlas) y partículas (por ejemplo, micropartículas, nanopartículas). Se pueden utilizar partículas o perlas que tienen un diámetro nominal, promedio o medio de aproximadamente 1 nanometro a aproximadamente 500 micrómetros, tales como las que tienen un diámetro nominal, medio o promedio, por ejemplo, de aproximadamente 10 nanómetros a aproximadamente 100 micrómetros; de aproximadamente 100 nanómetros a aproximadamente 100 micrómetros; de aproximadamente 1 micrómetro a aproximadamente 100 micrómetros; de aproximadamente 10 micrómetros a aproximadamente 50 micrómetros; de aproximadamente 1, 5, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 o 900 nanómetros; o de aproximadamente 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 300, 400, 500 micrómetros.

Un soporte sólido puede comprender virtualmente cualquier insolubles o material insoluble o sólido, y a menudo se selecciona una composición de soporte sólido que sea insoluble en agua. Por ejemplo, un soporte sólido puede comprender o consistir esencialmente en gel de sílice, vidrio (por ejemplo vidrio de poro controlado (CPG)), nailon, Sephadex®, Sepharose®, celulosa, una superficie metálica (por ejemplo acero, oro, plata, aluminio, silicio y cobre), un material magnético, un material plástico (por ejemplo, polietileno, polipropileno, poliamida, poliéster, difluoruro de polivinilideno (PVDF)) y similares. Las perlas o partículas pueden ser hinchables (por ejemplo, perlas poliméricas tales como resina Wang) o no hinchables (por ejemplo, CPG). Los ejemplos comercialmente disponibles de perlas incluyen, sin limitación, resina Wang, resina Merrifield y Dynabeads® y SoluLink.

Se puede proporcionar un soporte sólido de una colección de soportes sólidos. Una colección de soportes sólidos comprende dos o más especies de soportes sólidos diferentes. El término "especie de soporte sólido" como se usa en el presente documento se refiere a un soporte sólido junto con una especie de ácido nucleico en fase sólida particular o una combinación particular de especies de ácidos nucleicos en fase sólida diferentes. En determinados modos de realización, una colección de soportes sólidos comprende de 2 a 10.000 especies de soportes sólidos, de 10 a 1.000 especies de soportes sólidos o aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000 o 10000 especies de soportes sólidos únicas. Los soportes sólidos (por ejemplo, perlas) en la colección de soportes sólidos pueden ser homogéneos (por ejemplo, todas son perlas de resina Wang) o heterogéneos (por ejemplo, algunos son perlas de resina Wang y algunos son perlas magnéticas). Cada especie de soporte sólido en una colección de soportes sólidos a veces se marca con una marca de identificación específica. Una marca de identificación para una especie de soporte sólido particular a veces es un ácido nucleico (por ejemplo, "ácido nucleico en fase sólida") que tiene una secuencia única en determinados modos de realización. Una marca de identificación puede ser cualquier molécula que sea detectable y distinguible de las marcas de identificación en otras especies de soportes sólidos.

Las especies de secuencias de nucleótidos, especies de ácidos nucleicos amplificados, o productos detectables generados a partir de las anteriores se pueden someter a análisis de secuencia. El término "análisis de secuencia" como se usa en el presente documento se refiere a la determinación de una secuencia de nucleótidos de un producto de amplificación. Se puede determinar la secuencia completa o una secuencia parcial de un producto de amplificación, y la secuencia de nucleótidos determinada se denomina en el presente documento una "lectura". Por ejemplo, los productos de amplificación lineal se pueden analizar directamente sin amplificación adicional en algunos modos de realización (por ejemplo, usando una metodología de secuenciación de una sola molécula (descrito con mayor detalle a continuación en el presente documento)). En determinados modos de realización, los productos de amplificación lineal se pueden someter a amplificación adicional y a continuación analizarse (por ejemplo, usando metodología de secuenciación por unión o pirosecuenciación (descrito con mayor detalle a continuación en el presente documento)). Las lecturas se pueden someter a diferentes tipos de análisis de secuencia. Se puede utilizar cualquier procedimiento de secuenciación adecuado para detectar, y determinar la cantidad de, especies de secuencias de nucleótidos, especies de ácidos nucleicos amplificados, o productos detectables generados a partir de las anteriores. En un modo de realización, una muestra heterogénea se somete a secuenciación selectiva (o secuenciación selectiva parcial) en la que se secuencian uno o más conjuntos de especies de ácidos nucleicos, y se determina la cantidad de cada especie de ácido nucleico secuenciada en el conjunto, de este modo se identifica la presencia o ausencia de una anomalía cromosómica en base a la cantidad de la especie de ácido nucleico secuenciada. Los ejemplos de determinados procedimientos de secuenciación se describen más adelante.

Los términos "aparato de análisis de secuencia" y "componente(s) de análisis de secuencia" usados en el presente documento se refieren a aparato, y uno o más componentes usados junto con dicho aparato, que se pueden usar por un experto para determinar una secuencia de nucleótidos de productos de amplificación que resultan de los procedimientos descritos en el presente documento (por ejemplo, productos de amplificación lineal y/o exponencial). Los ejemplos de plataformas de secuenciación incluyen, sin limitación, la plataforma 454 (Roche) (Margulies, M. et al. 2005 Nature 437, 376-380), analizador genómico Illumina (o plataforma Solexa) o sistema SOLID (Applied Biosystems) o la tecnología de secuenciación de ADN de una sola molécula Helicos True (Harris TD et al. 2008 Science, 320,106-109), la tecnología en tiempo real de una sola molécula (SMRTTM) de Pacific Biosciences, y secuenciación de nanoporos (Soni GV y Meller A. 2007 Clin Chem 53: 1996-2001). Dichas plataformas permiten la secuenciación de muchas moléculas de ácidos nucleicos aisladas a partir de un espécimen en órdenes altos de

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exitosas adicionales que no estaban presentes en la criba final con sondas de 100 pb y 75 pb coincidentes. Estas secuencias se añadieron al conjunto de secuencias final. El número final de marcadores únicos para el cromosoma 21 y el cromosoma autosómico de referencia fue de 2785. Excluyendo los resultados positivos falsos y resultados positivos de 3+, hubo 1877 marcadores disponibles para la criba del ensayo de T21. Estos 1877 marcadores transfirieron para un diseño de ensayo MassEXTEND de Sequenom adicional.

En la tabla 3, las diferentes versiones (A, B, C, etc.) se refieren a diferentes longitudes de sonda con respecto a coincidencia. Se proporciona el número de secuencias que cumplen los criterios para cada versión así como el número que no los cumplen.

TABLA 3 – Resultados de identificación de especies de secuencias de nucleótidos

Criba de marcadores

versión A B C E F 2FH21F

Chr21 longitud fragmento/ coincidencia

150/50 150/75 100/50 100/75 repetición dbSNP 129 100/75 repetición dbSNP 130 Secuencias finales (100/75 repetición más adicionales de la criba anterior)

región de entrada

3057 3697 6096 12606 12606

sec. SNP simulado de salida

7278 8082 9150 12650 12533

Criba de ensayo diseñable

Fallo por Assay Designer 5375 6060 6922 9912 9885

% fallo

73,9 % 75,0 % 75,7 % 78,4 % 78,9 %

Diseño uniplex

1903 2022 2228 2738 2648 2785

Adicionales

76 48 13 / /

PleXTEND

Número de resultados positivos falsos 1 1 1 3 3

Número de 0 resultados positivos

0 0 0 0 0

Número de 1 resultado positivo

44 66 69 0 0

Número de 2 resultados positivos

1788 1875 2047 2519 2429 1877 (excl H.PCR > 300)

Número de 3+ resultados positivos

70 80 111 216 216

10 Ejemplo 3: Diseño de ensayo para especies de secuencias de nucleótidos útiles para detectar anomalías cromosómicas

Introducción

A continuación se muestra una explicación detallada del procedimiento usado para diseñar ensayos MassEXTEND® para someter a prueba la trisomía del cromosoma 21 (fetal), realizado en la plataforma MassARRAY® de Sequenom.

15 La sección de Antecedentes analizará en primer lugar los problemas del diseño de ensayo generales y sus soluciones semiautomáticas usando un programa informático desarrollado en Sequenom. A continuación, se analizará la similitud y las diferencias en la aplicación de estas soluciones con respecto a la cuantificación de señales de marcadores para regiones altamente homólogas (parálogas). La sección Procedimientos analizará en primer lugar el procedimiento de diseño general, como se desarrolló para el panel de prueba inicial usando ensayos

20 ‘mix-1', y cómo el análisis de los resultados experimentales dio lugar a parametrización adicional. A continuación, se detallarán los procedimientos específicos de los procedimientos de diseño usados para generar los ensayos TypePLEX. La sección Resultados presenta un resumen de los diseños de ensayo TypePLEX 2FH de T21.

Antecedentes

Los ensayos MassEXTEND típicos se diseñan y se realizan para analizar polimorfismos mononucleotídicos (SNP)

25 en muestras de ADN. Con respecto al diseño de ensayo, la primera tarea es la amplificación de una región corta que flanquea el sitio del SNP usando PCR. A continuación, un cebador de sonda específico (alias cebador de extensión) se hibrida a la secuencia amplificada adyacente al sitio de SNP y se extiende por incorporación de una especie de nucleótido que lee (complementa) el nucleótido específico en ese sitio. Los cebadores de sondas extendidos resultantes (analitos) se identifican posteriormente por la intensidad de su señales de masa esperada (máximos) en

30 un espectro de masas de los productos de reacción MassEXTEND cristalizados. Un ensayo de fenotipado típico

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Pocillo

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Claims (1)

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