ES2396245T3 - Método de amplificación y secuenciamiento de ácidos nucleicos - Google Patents

Método de amplificación y secuenciamiento de ácidos nucleicos Download PDF

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Jonathan M. Rothberg
Michael P. Weiner
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Abstract

Un método para secuenciar ácidos nucleicos que comprende: (a) fragmentar moléculas de ácido nucleico plantilla grandes para generar una pluralidad de ácidos nucleicosfragmentados; (b) suministrar una población de los ácidos nucleicos fragmentados de cadena sencilla a un sistema (array) de almenos 10.000 cámaras de reacción sobre una superficie plana, en donde una pluralidad de los pocillos nocomprende más de una partícula y un único ácido nucleico fragmentado de cadena sencilla; (c) amplificar los ácidos nucleicos fragmentados de cadena sencilla en las cámaras de reacción, en donde unapluralidad de copias amplificadas de los ácidos nucleicos fragmentados de cadena sencilla son inmovilizadossobre partículas; y (d) llevar a cabo una reacción de secuenciamiento simultáneamente en una pluralidad de las cámaras dereacción que comprenden las copias amplificadas inmovilizadas de los ácidos nucleicos fragmentados de cadenasencilla.

Description

Métodos de amplificación y secuenciamiento de ácidos nucleicos.
CAMPO DE LA INVENCIÓN
Esta invención se refiere a un método para secuenciar ácidos nucleicos.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
El desarrollo de métodos de secuenciamiento de ácido nucleicos rápidos y sensibles que utilizan secuenciadores de ADN automatizados ha revolucionado la biología molecular moderna. El análisis de genomas completos de plantas, hongos, animales, bacterias y virus es ahora posible mediante el esfuerzo combinado de una serie de máquinas y de un equipo de técnicos. Sin embargo, no se ha podido alcanzar el objetivo de un secuenciamiento rápido y automatizado, o semiautomático, de un genoma en un periodo de tiempo corto. Sigue habiendo problemas técnicos para una preparación, amplificación y secuenciamiento de muestra precisos.
Un problema técnico que ha dificultado el análisis de secuencia de genomas es la incapacidad para amplificar representativamente un genoma a un nivel que sea compatible con la sensibilidad de los métodos de secuenciamiento actuales. Las máquinas de secuenciamiento modernas económicamente viables, aunque sensibles, requieren todavía un exceso de un millón de copias de un fragmento de ADN para el secuenciamiento. Los métodos actuales para proporcionar un elevado número de copias de secuenciamiento de ADN implican variaciones de clonación o amplificación in vitro, que no pueden amplificar el número de clones individuales (600.000
o más, y decenas de millones para un genoma humano) necesarios para secuenciar un genoma completo de forma económica.
Otro problema técnico es la limitación de los métodos de secuenciamiento actuales que como mucho pueden llevar a cabo una reacción de secuenciación por hibridación de cebador de oligonucleótido. La hibridación de cebadores de secuenciamiento a menudo es la etapa limitante que reduce la productividad de los secuenciadores de ADN.
En la mayoría de los casos, la Cadena en Reacción de Polimerasa (PCR de las siglas en inglés; Saiki, R.K. y col., Science 1985, 230, 1350-1354; Mullis, K., y col., Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 1986, 51 Pt 1, 263-273) constituye una parte integral de la obtención de información de secuencias de ADN, amplificando cantidades minúsculas de ADN específico para obtener concentraciones suficientes para el secuenciamiento. Aún así, el escalado de la tecnología de PCR actual para cubrir la demanda creciente de la técnica genética moderna no es económico ni eficiente, especialmente cuando se consideran los requerimientos de un secuenciamiento de genoma completo.
Los esfuerzos para maximizar la eficacia económica y de tiempo se han dirigido habitualmente a dos áreas: la disminución del volumen de reacción requerido para las amplificaciones y el aumento del número de amplificaciones simultáneas llevadas a cabo. La miniaturización confiere la ventaja de una menor utilización de muestra y reactivos, menores tiempos de amplificación y aumento de la escalabilidad de la producción.
Aunque los termocicladores convencionales requieren tiempos de ciclo relativamente largos debido másicas y térmicas (Woolley, A.T. y col., Anal. Chem. 1996, 68, 4081-4086), se pueden ciclar más rápidamente volúmenes de reacción más pequeños. Los dispositivos de PCR de flujo continuo han utilizado microcanales en combinación con zonas de temperatura fija para reducir los volúmenes de reacción hasta niveles de muestra por debajo de microlitros (Lagally, E.T. y col., Analytical Chemistry 2001, 73, 565-570; Schneegas, I. y col., Lab on a Chip – The Royal Society of Chemistry 2001, 1, 42-49).
Los microcapilares de vidrio, calentados por aire (Kalimina, O. y col., Nucleic Acid Res. 1997, 25, 1999-2004) o luz infrarroja (Oda, R.P. y col., Anal. Chem. 1998, 70, 4361-4368; Huhmer, A.F. y Landers, J.P., Anal. Chem. 2000, 72, 5507-5512), también han servido como recipientes eficientes para reacciones a escala de nanolitros. Se han conseguido volúmenes de reacción similares con termocicladores de silicona microfabricados (Burns, M.A. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996, 93, 5556, 5561).
En muchos casos, estas miniaturizaciones han reducido los tiempos de reacción de PCR hasta menos de 30 minutos para elementos de calefacción eléctrica modificados (Kopp, M.U. y col., Science 1998, 280, 1046-1048; Chiou, J., Matsudaira, P., Sonin, A. y Ehrlich, D., Anal. Chem. 2001, 73, 2018-2021) y cicladores de aire caliente (Kalinina, O., y col., Nucleic Acids Res. 1997, 25, 1999-2004), y hasta 240 segundos para algunas reacciones controladas por infrarrojos (Giordano, B.C., y col., Anal. Biochem. 2001, 291, 124-132).
Determinadas tecnologías emplean una producción incrementada y miniaturización simultáneamente; como en el diseño de sistema de 1536 pocillos de Sasaki y col. (Sasaki, N. y col., DNA Res. 1997, 4, 387-391), que mantenía volúmenes de reacción inferiores a 1 μL. Como ejemplo adicional, Nagai y col. (Nagai, H. y col., Biosens. Bioelectron. 2001, 16, 1015-1019; Nagai, H. y col., Anal. Chem. 2001, 73, 1043-1047) presentaron la amplificación de un fragmento de ensayo individual en diez mil pocillos de reacción de 86 pL grabados en una única oblea de silicio. Desafortunadamente, la recuperación y la utilización de la ampliación de estos métodos han demostrado ser A pesar de estas mejoras destacables en los volúmenes de reacción y los tiempos de ciclo, ninguna de las estrategias previas han proporcionado la amplificación masivamente paralela requerida para aumentar de forma drástica la productividad hasta los niveles requeridos para el análisis del genoma humano completo. Los secuenciadores de ADN siguen siendo más lentos y más caros de lo que sería deseable. En los dispositivos de investigación pura quizás es aceptable que un secuenciador sea lento y caro. Pero cuando se desea usar secuenciadores de ADN en un sistema de diagnóstico clínico dichos métodos de secuenciamiento ineficientes son prohibitivos incluso para una institución bien financiada. El secuenciamiento en paralelo a gran escala de miles de dianas amplificadas clonalmente facilitaría enormemente el análisis a gran escala de bibliotecas de genomas completos sin el tedioso proceso de preparación de muestras y los caros procesos de clonación de elevado error. Una amplificación de ADN exitosa de alta capacidad, en fase sólida, clonal, puede usarse para numerosas aplicaciones. Por consiguiente, está claro que existe una necesidad de preparar un genoma o ácidos nucleicos grandes de plantilla para el secuenciamiento, de amplificación de la plantilla de ácido nucleico, y de secuenciamiento de los ácidos nucleicos plantilla amplificados sin la limitación de una reacción de secuenciamiento por hibridación. Además, existe una necesidad de un sistema para conectar estas diversas tecnologías en una máquina de secuenciamiento automática o semiautomática.
La patente EP 0 392 546 describe un proceso para la detección de secuencias de ácido nucleico parcial o entero mediante la hibridación de las muestras en una mezcla que se caracteriza porque moléculas de ADN o ARN multiplicadas o sintetizadas o separadas en reacciones separadas están ligadas a partículas discretas de tamaño microscópico que pueden discriminarse según sus características físicas y químicas.
La patente WO 01/20039 describe un método para pirosecuenciar un ácido nucleico, que comprende proporcionar un complejo cebador ancla imprimado-plantilla circular, que combina el complejo con una polimerasa para generar copias complementarias de plantilla circular y secuenciar el ácido nucleico.
La patente WO 02/077287 describe un método de pirosecuenciamiento, en donde el cebador ancla está unido a un soporte sólido, tanto antes, como después, como durante la formación del cebador de ancla extendido.
La patente WO 98/44152 describe un método en el que se pueden secuenciar en paralelo diferentes moléculas de ácido nucleico presentes en diferentes localizaciones.
La patente WO 02/20837 describe un método para tipificar uno o más ácidos nucleicos que comprende: llevar a cabo simultánea o secuencialmente dos o más reacciones de extensión de cebador, uniéndose cada cebador en una posición pre-determinada diferente dentro de dicha molécula de ácido nucleico, y determinar el modelo de incorporación de ácido nucleico.
RESUMEN BREVE DE LA INVENCIÓN
Esta descripción describe un sistema integrado que comprende métodos nuevos y aparatos nuevos para (1) la preparación de muestras de ácido nucleico, (2) la amplificación de ácido nucleico, y (3) el secuenciamiento de ADN.
De acuerdo con la invención se proporciona un método para secuencia ácido nucleico que comprende:
(a)
fragmentar moléculas plantilla grandes de ácido nucleico para generar una pluralidad de ácidos nucleicos fragmentados;
(b)
suministrar una población de los ácidos nucleicos fragmentados de cadena sencilla a un sistema de al menos
10.000 cámaras de reacción sobre una superficie plana, en donde una pluralidad de pocillos no comprenden más de una partícula y un único ácido nucleico fragmentado de cadena sencilla;
(c)
amplificar los ácidos nucleicos fragmentados de cadena sencilla en las cámaras de reacción, en donde una pluralidad de copias amplificadas de los ácidos nucleicos fragmentados de cadena sencilla son inmovilizados sobre las partículas; y
(d)
llevar a cabo una reacción de secuenciamiento simultáneamente en una pluralidad de las cámaras de reacción que comprenden las copias amplificadas inmovilizadas de los ácidos nucleicos fragmentados de cadena sencilla.
La descripción proporciona un método nuevo para preparar una biblioteca de secuencias de ADN múltiple, particularmente derivadas de ADN plantilla grande o de ADN de genoma total (o parcial). Las secuencias de ADN de cadena sencilla se preparan a partir de una muestra de ADN plantilla grande o de genomas de ADN total o parcial mediante fragmentación, pulido, ligación de adaptadores, reparación de muescas y aislamiento de ADN de cadena sencilla. El método proporciona la generación de una biblioteca de ADNss (de cadena sencilla) ligado a soportes sólidos que comprende: (a) generar una biblioteca de plantillas de ADNss; (b) unir las plantillas de ADNss a soportes sólidos; y (c) aislar los soportes sólidos sobre los que se une una plantilla de ADNss.
La descripción también proporciona un método para amplificar cada miembro individual de una biblioteca de ADN en un tubo de reacción individual mediante, por ejemplo, encapsulamiento de una pluralidad de muestras de ADN individualmente en una microcápsula de una emulsión, llevar a cabo la amplificación de la pluralidad de muestras de ácido nucleico encapsulado simultáneamente, y liberar dicha pluralidad amplificada de ADN de las microcápsulas para las reacciones posteriores. Se pueden hibridar copias individuales de las especies de ácido nucleico plantilla con partículas de captura de ADN, ser suspendidas en una disolución de amplificación completa y emulsionarse en microrreactores (con un diámetro típicamente de 100 a 200 micras), tras lo cual se usa amplificación (por ejemplo, PCR) para incrementar clonalmente el número de copias de las especies de plantilla iniciales hasta más de
1.000.000 copias de una única secuencia de ácido nucleico, preferiblemente entre 2 y 20 millones de copias de un único ácido nucleico. La reacción de amplificación, por ejemplo, puede llevarse a cabo simultáneamente con al menos 3.000 microrreactores por microlitro de mezcla de reacción, y puede llevarse a cabo con más de 300.000 microrreactores en un único tubo de ensayo con un volumen de 100 μL (por ejemplo, un tubo de reacción de PCR). La presente descripción también proporciona un método para enriquecer las partículas que contengan un evento de amplificación de ADN exitoso (es decir, eliminando las partículas que no tienen ADN unido a ellas).
La descripción también proporciona un método de secuenciamiento de ácido nucleico a partir de múltiples cebadores con una única etapa de hibridación de cebador. Se hibridan dos o más cebadores de secuenciamiento con el ADN plantilla que se va a secuenciar. A continuación se protegen todos los cebadores de secuenciamiento menos uno. Se lleva a cabo otra vez el secuenciamiento (por ejemplo, secuenciamiento de pirofosfato) estirando el cebador no protegido. Se permite que el estiramiento llegue a completarse (con polimerasa adicional y dNTPs si fuera necesario) o se finaliza (con polimerasa y ddNTPs). Se retiran los reactivos para completar y/o finalizar la cadena. Entonces se desprotege uno de los cebadores protegidos y se lleva a cabo el secuenciamiento estirando el cebador recién desprotegido. Este proceso se continúa hasta que todos los cebadores de secuenciamiento son desprotegidos y secuenciados. Preferiblemente se usan dos cebadores (uno protegido y uno no protegido) para secuenciar ambos extremos de un ácido nucleico de doble cadena.
La descripción también proporciona un aparato y los métodos para secuenciar ácidos nucleicos usando un pirofosfato basado en una estrategia de secuenciamiento. El aparato tiene una cámara de dispositivo acoplado de carga (CCD, de las siglas en inglés “charge coupled device”), una cámara de microfluidos, un soporte de cartucho de muestra, una bomba y válvulas de flujo. El aparato usa quimioluminiscencia como método de detección, que para el secuenciamiento de pirofosfato presenta un ruido de fondo inherentemente bajo. Preferiblemente, el cartucho de muestra para el secuenciamiento se denomina “placa PicoTiter”, y está formada a partir de una placa frontal de fibra óptica comercial, grabada con ácido para dar lugar a cientos de miles de pocillos muy pequeños, con un volumen por pocillo de 75 pL. El aparato incluye una nueva cubeta de suministro de reactivo adaptada para uso con los sistemas descritos en la presente memoria, para proporcionar reactivos fluidos a la placa picotiter, y un sistema de suministro de reactivos comunicado con la cubeta de suministro de reactivos. Los fotones procedentes de cada pocillo de la placa picotiter son canalizados hacia píxeles específicos de la cámara CCD para detectar las reacciones de secuenciamiento.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1 muestra una representación esquemática del proceso completo de preparación de la biblioteca que incluye las etapas de fragmentación de ADN plantilla (Figura 1A), pulido final (Figura 1B), ligación de adaptador (Figura 1C), reparación de muescas, extensión de cadena y aislamiento de gel (Figura 1D). La Figura 1E muestra una representación esquemática de las etapas de amplificación y secuenciamiento del ADN plantilla (Figura 1E). La Figura 1F muestra un gel de agarosa representativo que contiene una preparación de muestra de una biblioteca de ADN de adenovirus de 180-350 pares base de acuerdo con los métodos de esta invención. La Figura 1G muestra una representación esquemática detallada de la preparación, amplificación y secuenciamiento de la biblioteca.
Figura 2A muestra una representación esquemática del diseño de adaptador universal de acuerdo con la presente invención. Cada adaptador universal se genera a partir de dos oligonucleótidos de ADNss complementarios que son diseñados para contener una secuencia de nucleótidos de 20 pb para imprimación PCR, una secuencia de nucleótidos de 20 pb para imprimación de secuencia y una secuencia única de discriminación de 4 pb que consta de una secuencia de nucleótidos no repetidos (es decir, ACGT, CAGT, etc.). La Figura 2B muestra un par de secuencias de adaptador universal representativas para uso con la invención. Cadena sentido del Adaptador A: SEC ID Nº: 1; cadena antisentido del Adaptador A: SEC ID Nº: 2; cadena sentido del Adaptador B: SEC ID Nº: 3; cadena antisentido del Adaptador B: SEC ID Nº: 4. La Figura 2C muestra una representación esquemática de diseño de adaptador universal para uso con la invención.
Figura 3 muestra el desplazamiento de cadena y la extensión de los fragmentos de ADN de doble cadena mellados de acuerdo con la presente invención. Después de la ligación de adaptadores universales generados a partir de oligonucleótidos sintéticos, se generarán fragmentos de ADN de cadena doble que contengan dos regiones melladas después del tratamiento con T4 ADN ligasa (Figura 3A). La adición de una enzima de desplazamiento de cadena (es decir, Bst ADN polimerasa I) unirá las melladuras (Figura 3B), desplazará la cadena mellada y completará la extensión de nucleótidos de la cadena (Figura 3C) para producir fragmentos de ADN de cadena doble no mellados (Figura 3D).
Figura 4 muestra el aislamiento de ADN de cadena sencilla ligado direccionalmente de acuerdo con la presente invención usando partículas recubiertas de estreptavidina. Después de la ligación con los adaptadores universales A y B (los dos adaptadores diferentes a veces se denominan “primer” y “segundo” adaptador universal), el ADN de cadena doble contendrá adaptadores en cuatro combinaciones posibles: AA, BB, AB y BA. Cuando el adaptador universal B contiene 5’-biotina, se usan soportes sólidos magnéticos recubiertos con estreptavidina para capturar y aislar las poblaciones de AB, BA y BB (la población AA es eliminada por lavado). La población BB es retenida sobre las partículas puesto que cada extremo del ADN de cadena doble está unido a una partícula y no es liberado. Sin embargo, tras lavado en presencia de un tampón de salinidad baja, sólo las poblaciones AB y BA liberarán un fragmento de ADN de cadena sencilla que es complementario a la cadena ligada. Los fragmentos de ADN de cadena sencilla son aislados a partir del sobrenadante y se usan como plantilla para la amplificación y secuenciamiento posteriores. Este método se describe más adelante en detalle.
Figura 5 muestra un esquema de la estructura de una partícula de captura de ADN.
Figura 6 muestra un esquema de una realización de un proceso de amplificación de emulsión de partículas.
Figura 7 muestra un esquema de un proceso de enriquecimiento para eliminar partículas que no tienen ningún ADN unido a ellas.
Figuras 8A-B muestran una representación esquemática de la reacción de secuenciamiento de extremo doble de acuerdo con la presente invención.
Figura 9 muestra una demostración de secuenciamiento de doble extremo sobre un aparato de pirosecuenciamiento de acuerdo con la invención.
Figuras 10A-F muestran un ejemplo de proceso de secuenciamiento de doble extremo.
Figuras 11A-D muestran ilustraciones esquemáticas de amplificación basada en círculos giratorios usando un cebador ancla.
Figura 12 muestra un dibujo de un aparato de secuenciamiento de acuerdo con la presente invención.
Figura 13 muestra un dibujo de una cámara de suministro de reactivo/perfusión de acuerdo con la presente invención.
Figura 14 muestra una micrografía de un haz de fibra óptica con cavidades, denominado Picotiter PlateTM, de la invención.
Figura 15 muestra una micrografía de una placa picotiter tapizada con partículas que tienen ADN de plantilla inmovilizado sobre ellas, y sulfurilasa y luciferasa inmovilizadas sobre ellas.
Figura 16 muestra una ilustración esquemática de la cámara de flujo de reactivos y FORA (Picotiter PlateTM).
Figura 17 muestra un diagrama de un instrumento analítico de la presente invención.
Figura 18 muestra una ilustración esquemática de reacciones de secuenciamiento paralelo microscópico dentro de una Picotiter PlateTM.
Figura 19 muestra una micrografía de las reacciones en un pocillo individual.
Figura 20 muestra un cartucho de carga de una Picotiter PlateTM. “A” se refiere a una Picotiter PlateTM con micropocillos orientados hacia el interior del cartucho, la distancia entre los lados abiertos de los pocillos de la Picotiter PlateTM y la pared del cartucho de carga es de 0,3 mm; “B” se refiere a una junta de sellado de silicio; “C” se refiere a un puerto de entrada; “D” se refiere a un tubo de carga de entrada; “E” se refiere a un puerto de salida y “F” se refiere a un tubo de salida. La placa Picotiter PlateTM se mantiene en el cartucho con pinzas de plástico. El líquido se rellena a través del tubo de carga de entrada D y entra en el espacio entre los lados abiertos de los pocillos de la Picotiter PlateTM y la pared del cartucho de carga a través del puerto de entrada C. El área definida por la junta de sellado de silicio B se rellena y el líquido de exceso sale del cartucho a través del puerto de salida E y del tubo de salida
F.
Figura 21 muestra una cámara de amplificación de Picotiter PlateTM en vista explotada. “A” se refiere a una tapa de cámara de amplificación con seis tornillos de sujeción; “B” se refiere a una almohadilla de espuma aislante de célula cerrada; “C” se refiere a un portaobjetos de microscopio de vidrio estándar de 25 mm por 75 mm; “D” se refiere a una lámina de silicio de 0,25 mm de espesor; “E” se refiere a una Picotiter PlateTM; “F” se refiere a una base de cámara de amplificación; “G” se refiere a una segunda lámina de silicio de 0,25 mm de espesor.
Figura 22 muestra un diagrama esquemático de PCR en fase sólida con Picotiter PlateTM. Las estructuras cilíndricas simbolizan pocillos individuales de la Picotiter PlateTM. Las esferas grises simbolizan partículas con cebadores inmovilizados. Los cebadores directo “F” (del inglés “forward”) (rojo) e inverso “R” (del inglés “reverse”) (azul) se muestran en orientación 5’-3’ tal como indican las flechas. Las secuencias sintetizadas complementarias a los cebadores Directo e Inverso se muestran en barras de color rojo oscuro (complemento de F) y azul oscuro (complemento de R). El ADN plantilla de cadena sencilla se muestra como una línea gris continua, las cadenas de ADN recién sintetizadas como líneas grises discontinuas. Las sondas de hibridación marcadas con fluorescencia se muestran como barras verdes.
Figuras 23A-C muestran la hibridación de sondas fluorescentes con fragmentos de ADN de ensayo inmovilizados sobre partículas. La Figura 23A (parte superior izquierda) y 23B (parte superior derecha) ilustran la especificidad de una población mixta de sondas hibridadas con el fragmento A y el fragmento B inmovilizados sobre partículas de control, respectivamente. Las partículas de fragmento B presentaron la señal de Alexa Fluor 647 (rojo), y las partículas de fragmento A presentaron la señal de Alexa Fluor 488 (verde). La Figura 23C (panel inferior) muestra la fluorescencia de la sonda de las partículas de captura de ADN tras PT-PCR. Las partículas presentaron señales de fragmento A y fragmento B homogéneas, así como mezclas de plantillas, mostradas como varios grados de amarillo.
Figura 24 muestra resultados representativos de BioAnalyzer del análisis de una biblioteca de ADN de cadena sencilla.
Figura 25 muestra un injerto flanqueado por cebadores de PCR y cebadores de secuenciamiento.
Figura 26 muestra el producto truncado producido mediante falta de coincidencia de cebador de PCR en la región de hibridación cruzada (CHR, del inglés “cross-hybridization region”).
Figura 27 muestra el cálculo de los candidatos de cebador basados en la temperatura de fusión.
Figuras 28A-D muestra el montaje del nebulizador usado para los métodos de la invención. Se colocó un tapón de tubo sobre la parte superior del nebulizador (Figura 7A) y el tapón se aseguró con un montaje de pinza de nebulizador (Figura 7B). La parte inferior del nebulizador se unió al suministro de nitrógeno (Figura 7C) y el dispositivo completo se envolvió en parafilm (Figura 7D).
Figura 29A muestra resultados representativos de análisis LabChip de una biblioteca de ADN de cadena sencilla después de nebulización y pulido.
Figura 29B muestra resultados representativos de distribución de tamaños para una única biblioteca de ADN de cadena sencilla ligada a adaptador después de nebulización, pulido y purificación en gel.
Figura 30 ilustración de la rejilla usada para sujetar los tubos sobre la placa de agitación por debajo de la bomba de jeringa vertical. La rejilla fue modificada para sostener tres conjuntos de mezclas de reacción de amplificación de emulsión de partículas. La jeringa se cargó con la mezcla de reacción de PCR y con partículas.
Figura 31 ilustración de la colocación óptima de las jeringas en la bomba de jeringa vertical y orientación de los tubos de emulsión por debajo de las salidas de las jeringas.
Figura 32 ilustración de la colocación óptima del bloque de empuje de la bomba de jeringa frente a los émbolos de jeringa, y orientación óptima de la rejilla sobre la placa de agitación. Al usar esta disposición el contenido de la jeringa fue expelido en la emulsión de aceite agitada.
Figura 33 ilustración de partículas (ver flechas) suspendidas en microrreactores individuales de acuerdo con los métodos de la invención.
Figura 34 ilustración de los resultados de secuenciamiento de doble extremo que muestra que se determina la secuencia de ambos extremos de una plantilla de ADN. SEC ID Nº: 44: atgcacatggttgacacagtggt; SEC ID Nº: 45: atgcacatggttgacacagtgg; SEC ID Nº: 46: atgccaccgacctagtctcaaactt.
Figura 35 ilustra la encapsulación de una partícula que comprende dos secuencias de oligonucleótidos para un secuenciamiento de cadena doble.
Figura 36 ilustra la PCR en fase disolución y conduce a un procedimiento de partícula – una etapa de una realización preferida del secuenciamiento de doble extremo.
Figura 37 ilustra la ruptura de la emulsión y la recuperación de ADN plantilla amplificado sobre una partícula – una etapa de una realización preferida del secuenciamiento de doble extremo.
Figura 38 ilustra una representación esquemática de un método preferido de secuenciamiento de doble extremo.
Figura 40 ilustra las longitudes de lectura promedio de un experimento que implica secuenciamiento de doble extremo.
Figura 41 ilustra el número de pocillos para cada genoma en un experimento de secuenciamiento de doble extremo.
Figura 42 ilustra un resultado típico y una cuerda de alineamiento de un procedimiento de secuenciamiento de
doble extremo. Las secuencias se muestran en orden, desde la parte superior a la inferior: SEC ID Nº:
47 – SEC ID Nº: 60.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
En la presente memoria se describe una plataforma nueva que permite la amplificación simultánea de trescientas mil reacciones de PCR discretas (PTPCR) en volúmenes tan pequeños como 39,5 picolitros. El conjunto de productos de PTPCR de la reacción completa se puede recuperar mediante una etapa de lavado y se puede evaluar mediante PCR en tiempo real para determinar la presencia y la abundancia de plantillas específicas. De mayor interés, en la presente memoria se muestra que dichos productos PTPCR pueden ser llevados a soportes sólidos y detectados mediante hibridación con dos sondas fluorescentes de color, lo que permite una amplificación de ADN clonal en fase sólida de elevada capacidad y un secuenciamiento paralelo a gran escala.
La presente descripción está dirigida a un método y a un aparato para llevar a cabo el secuenciamiento genómico, que satisface los objetivos de (1) preparar un ácido nucleico (por ejemplo, un genoma) de un modo rápido y eficiente para secuenciar, (2) amplificar el ácido nucleico de un modo representativo, y (3) llevar a cabo múltiples reacciones de secuenciamiento con hibridación con un solo cebador. La presente invención y descripción son particularmente adecuadas para el genotipado, la detección y la diagnosis a partir de una pequeña muestra de ácido nucleico de un modo económico. Cada uno de estos objetivos se enumera más adelante.
Definiciones:
A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente memoria tienen el mismo significado usado habitualmente por el especialista en la técnica a la que pertenece esta invención. Para llevar a la práctica la presente invención y descripción se pueden usar métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente memoria, y a continuación se describen ejemplos de métodos y materiales adecuados. Por ejemplo, se pueden describir métodos que comprenden más de dos etapas. En dichos métodos, no todas las etapas pueden ser requeridas para alcanzar un objetivo definido y la descripción contempla el uso de etapas aisladas para alcanzar estos objetivos discretos. Adicionalmente, los materiales, métodos y ejemplos son meramente ilustrativos y no pretender ser limitativos.
Tal como se usa en la presente memoria, la expresión “adaptador universal” se refiere a dos oligonucleótidos complementarios y madurados que se diseñan para contener una secuencia de nucleótidos para imprimación PCR y una secuencia de nucleótidos para imprimación de secuencia. Opcionalmente, el adaptador universal puede incluir adicionalmente una secuencia clave discriminatoria única compuesta de una secuencia de nucleótidos no repetidos (es decir, ACGT, CAGT, etc.). Un conjunto de adaptadores universales comprende dos secuencias de cadena doble únicas y distintas que pueden ser ligadas a los extremos de ADN de cadena doble. Por lo tanto, el mismo adaptador universal o diferentes adaptadores universales pueden ser ligados a cualquier extremo de la molécula de ADN. Cuando se encuentran dentro de una molécula de ADN de mayor tamaño que es de cadena sencilla, o cuando está presente como un oligonucleótido, el adaptador universal puede considerarse un adaptador universal de cadena sencilla.
“ADN diana” significa un ADN cuya secuencia debe determinarse por los métodos y aparato de la invención.
“Par de unión” significa un par de molécula que interaccionan a través de interacciones no covalentes específicas que dependen de las estructuras tridimensionales de las moléculas implicadas. Los pares típicos de compañeros de unión específicos incluyen antígeno-anticuerpo, hapteno-anticuerpo, hormona-receptor, cadena de ácido nucleicocadena complementaria de ácido nucleico, sustrato-enzima, análogo de sustrato-enzima, inhibidor-enzima, carbohidrato-lectina, biotina-avidina y virus-receptor celular.
Tal como se usa en la presente memoria, la expresión “secuencia clave de discriminación” se refiere a una secuencia que consiste en al menos uno de los cuatro desoxirribonucleótidos (es decir, A, C, G, T). Se puede usar la misma secuencia de discriminación para una biblioteca completa de fragmentos de ADN. Alternativamente, se pueden usar diferentes secuencias clave para seguir bibliotecas de fragmentos de ADN derivados de diferentes organismos.
Tal como se emplea en la presente memoria, la expresión “pluralidad de moléculas” se refiere a ADN aislado de la misma fuente, en donde diferentes organismos se pueden preparar separadamente empleando el mismo método. La pluralidad de muestras de ADN puede derivar de segmentos grandes de ADN, de ADN de genoma completo, de Tal como se usa en la presente memoria, el término “biblioteca” se refiere a un subconjunto de especies de ADN de menor tamaño procedentes de una plantilla de ADN individual, tanto segmentada como de genoma completo.
Tal como se usa en la presente memoria, el término “único”, tal como en “regiones de imprimación PCR únicas”, se refiere a una secuencia que no existe o que existe en un nivel de copias extremadamente bajo dentro de las moléculas de ADN que van a ser amplificadas o secuenciadas.
Tal como se usa en la presente memoria, el término “compatible” se refiere a un extremo de ADN de cadena doble al cual se puede unir una molécula de adaptador (es decir, un extremo romo o un extremo cohesivo).
Tal como se usa en la presente memoria, el término “fragmentación” se refiere a un proceso mediante el cual una molécula grande de ADN es convertida en piezas más pequeñas de ADN.
Tal como se usa en la presente memoria, “ADN plantilla grande” sería ADN de más de 25 kb, preferiblemente más de 500 kb, más preferiblemente más de 1 Mb, y lo más preferiblemente más de 5 Mb, o mayor.
Tal como se usa en la presente memoria, la expresión “condiciones de hibridación severas” se refiere a las condiciones en las cuales solo las secuencias complementarias se hibridarán unas con otras.
En la presente memoria se describe un sistema y métodos para procesar ácidos nucleicos. El sistema y los métodos se pueden usar para procesar ácidos nucleicos en una multitud de modos que utilizan el secuenciamiento de ácidos nucleicos. Dicho secuenciamiento se puede llevar a cabo para determinar la identidad de una secuencia de ácidos nucleicos, o para la detección de polimorfismo de nucleótido individual en fragmentos de ácido nucleico, para obtener el perfil de expresión de ácido nucleico (comparando el perfil de expresión de ácido nucleico entre dos o más estados – por ejemplo, comparando entre tejido enfermo y tejido normal, o comparando entre tejido no tratado y tejido tratado con fármacos, enzimas, radiación o tratamiento químico), para haplotipado (comparando genes o variaciones en genes en cada uno de los dos alelos presentes en un sujeto humano), para cariotipado (comparando diagnósticamente uno o más genes en un tejido de ensayo – típicamente entre un embrión/feto antes de la concepción para detectar defectos de nacimiento – con los mismos genes de sujetos cariotipados “normales”), y para genotipado (comparando uno o más genes en un primer individuo de una especie con los mismos genes en otros individuos de la misma especie).
El sistema tiene una serie de componentes. Éstos incluyen (1) la plantilla de ácido nucleico que se va a procesar, (2) una placa picotiter para contener la plantilla de ácido nucleico, (3) una cámara de flujo y un medio de suministro de fluidos que permite el flujo de reactivos de procesado de ácido nucleico sobre la plantilla de ácido nucleico, en donde los reactivos generan luz al procesarse el ácido nucleico, (4) un sistema de captura de luz que detecta luz emitida al procesarse el ácido nucleico y que convierte la luz capturada en datos, y (5) un sistema de procesamiento de datos que procesa los datos para producir información significativa sobre el ácido nucleico que está siendo procesado. Cada uno de estos componentes del sistema será discutido en detalle a continuación.
1. PLANTILLA DE ÁCIDO NUCLEICO Y PREPARACIÓN DE LA MISMA Plantillas de ácido nucleico
Las plantillas de ácido nucleico que se pueden secuenciar de acuerdo con la invención y la descripción de la presente memoria, por ejemplo una biblioteca de ácido nucleico, en general pueden incluir moléculas de ácido nucleico circulares abiertas o circulares cerradas. Un “círculo cerrado” es una molécula de ácido nucleico circular cerrada covalentemente, por ejemplo una molécula de ADN o ARN circular. Un “círculo abierto” es una molécula de ácido nucleico de cadena sencilla lineal que tiene un grupo 5’ fosfato y un grupo 3’ hidroxilo.
El ácido nucleico de cadena sencilla puede contener al menos 100 copias de una secuencia de ácido nucleico específica, cada copia ligada covalentemente extremo con extremo. El círculo abierto puede formarse in situ a partir de una molécula de ácido nucleico de cadena doble. Los extremos de una molécula de ácido nucleico de círculo abierto dada pueden ser ligados mediante ADN ligasa. Las secuencias en los extremos 5’ y 3’ de la molécula de círculo abierto son complementarias a dos regiones de nucleótidos adyacentes en una segunda molécula de ácido nucleico, por ejemplo, una región adaptadora de un cebador ancla (algunas veces denominado adaptador), o a dos regiones que están unidas en proximidad en una segunda molécula de ADN. Por tanto, los extremos de la molécula de círculo abierto pueden ser ligados usando ADN ligasa, o pueden ser extendidos mediante ADN polimerasa en una reacción de llenado de huecos. Los círculos abiertos se describen en detalle en Lizardi, Patente de EE.UU. Nº
5.854.033.
Un círculo abierto se puede convertir en un círculo cerrado en presencia de una ADN ligasa (para ADN) o de una ARN ligasa después de, por ejemplo, maduración del círculo abierto con un cebador ancla.
Si se desea, se pueden proporcionar las plantillas de ácido nucleico como sondas candado. Las sondas candado son oligonucleótidos lineales que incluyen secuencias complementarias a la diana localizadas en cada extremo, y que están separadas por una secuencia eslabón. Los eslabones pueden estar ligados a los extremos de los miembros de una biblioteca de secuencias de ácido nucleico que han sido, por ejemplo, cortados o digeridos con endonucleasas de restricción. Mediante la hibridación con una secuencia diana, las regiones 5’- y 3’-terminales de dichos oligonucleótidos lineales se ponen en yuxtaposición. Esta yuxtaposición permite que los dos segmentos de sonda (si se hibridan apropiadamente) sean unidos covalentemente mediante ligadura enzimática (por ejemplo, con T4 ADN ligasa), convirtiendo así las sondas en moléculas circularmente cerradas concatenadas con las secuencias diana específicas (véase, por ejemplo, Nilsson y col., 1994. Science 265: 2085-2088). Las sondas resultantes son adecuadas para el análisis simultáneo de muchas secuencias génicas, tanto debido a su especificidad como a su selectividad por las variantes de secuencia génica (véase, por ejemplo, Lizardi, y col., 1998. Nat. Genet. 19: 225232; Nilsson y col., 1997. Nat. Genet. 16: 252-255) y debido al hecho de que los productos de reacción resultantes permanecen localizados para las secuencias diana específicas. Además, es de esperar que la unión intramolecular de muchas sondas diferentes sea menos susceptible de reactividad cruzada no específica que las metodologías múltiplex basadas en PCR en las que pares no cognados de cebadores pueden dar lugar a productos de amplificación irrelevantes (véase, por ejemplo, Landegren y Nilsson, 1997. Ann. Med. 29: 585-590).
Se puede construir una biblioteca de ácido nucleico plantilla que comprenda moléculas de ácido nucleico de cadena sencilla o de cadena doble, siempre que la secuencia de ácido nucleico incluya una región que, si está presente en la biblioteca, esté disponible para maduración, o pueda hacerse disponible para maduración, con una secuencia de cebador ancla. Por ejemplo, cuando se usa como plantilla para amplificación de círculo rotatorio, una región de plantilla de cadena doble necesita ser al menos transitoriamente de cadena sencilla para actuar como plantilla para la extensión del cebador ancla.
Las plantillas de biblioteca pueden incluir múltiples elementos, que incluyen, aunque sin limitación, una o más regiones que son complementarias con el cebador ancla. Por ejemplo, las bibliotecas plantilla pueden incluir una región complementaria a un cebador de secuenciamiento, una región de nucleótidos de control, y una secuencia injerto que consta de la plantilla de secuenciamiento que va a ser caracterizada posteriormente. Tal como se explica con más detalles más adelante, la región de nucleótidos de control se usa para calibrar la relación entre la cantidad de subproducto y el número de nucleótidos incorporados. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término “complemento” se refiere a secuencias de nucleótidos que son capaces de hibridarse con una secuencia de nucleótidos específica para formar un dúplex coincidente.
Una biblioteca plantilla puede incluir: (i) dos regiones distintas que son complementarias al cebador ancla, (ii) una región homóloga al cebador de secuenciamiento, (iii) una región de nucleótidos de control opcional, (iv) una secuencia injerto de, por ejemplo, 30-500, 50-200 o 60-100 nucleótidos, que va a ser secuenciada. La plantilla puede, por supuesto, incluir dos, tres o las cuatros características mencionadas.
El ácido nucleico plantilla puede construirse a partir de cualquier fuente de ácido nucleico, por ejemplo, cualquier célula, tejido u organismo y puede generarse mediante cualquier método reconocido en la técnica. Los métodos adecuados incluyen, por ejemplo, sonicación de ADN genómico y digestión con una o más endonucleasas de restricción (ER) para generar fragmentos de un rango deseado de longitudes a partir de una población inicial de moléculas de ácido nucleico. Preferiblemente, una o más de las enzimas de restricción tienen secuencias de reconocimiento de cuatro bases distintas. Los ejemplos de dichas enzimas incluyen, por ejemplo, Sau3A1, MspI y TaqI. Preferiblemente, las enzimas se usan en combinación con cebadores ancla que tienen regiones que contienen secuencias de reconocimiento para las correspondientes enzimas de restricción. Una o las dos regiones de adaptador de los cebadores ancla pueden contener secuencias adicionales que unen secuencias de reconocimiento de enzimas de restricción conocidas, permitiendo con ello la captura o la maduración con el cebador ancla de fragmentos de restricción específicos de interés para el cebador ancla. La enzima de restricción puede usarse con una enzima de restricción de tipo IIS.
Alternativamente, se pueden preparar bibliotecas plantilla generando una biblioteca de ADN complementario (ADNc) a partir de ARN, por ejemplo, ARN mensajero (ARNm). La biblioteca de ADNc puede procesarse adicionalmente, si se desea, con endonucleasas de restricción para obtener un extremo 3’ característico de un ARN específico, fragmentos internos o fragmentos que incluyen el extremo 3’ del ARN aislado. Las regiones de adaptador del cebador ancla pueden ser complementarias a una secuencia de interés cuya existencia sea factible en la biblioteca plantilla, por ejemplo, un polimorfismo de secuencia conocido o que se sospeche que se puede dar dentro de un fragmento generado por digestión con endonucleasa.
Se puede unir un oligonucleótido indexador a los miembros de una biblioteca plantilla para permitir la posterior correlación de un ácido nucleico plantilla con una población de ácidos nucleicos a partir de la cual se deriva el ácido nucleico plantilla. Por ejemplo, se pueden fragmentar una o más muestras de población de ADN de partida por separado usando cualquiera de los métodos descritos previamente (por ejemplo, digestión de restricción, sonicación). Se une una secuencia de oligonucleótidos indexadora específica para cada muestra, por ejemplo, a los extremos de los miembros de la población fragmentada. El oligonucleótido indexador puede actuar como una región para la circulación, amplificación y, opcionalmente, el secuenciamiento, lo que permite que sea usado para indexar,
o codificar, un ácido nucleico de tal modo que se identifique la muestra de partida de la cual deriva.
La descripción incluye un proceso de preparación de muestra que da como resultado un sólido o un sistema de sustrato sólido móvil que contiene una pluralidad de cebadores ancla o adaptadores ligados covalentemente a ácidos nucleicos plantilla.
Cuando el ácido nucleico plantilla es circular, la formación del cebador ancla ligado covalentemente y una o más copias del ácido nucleico diana se produce preferiblemente mediante maduración del cebador ancla con una región complementaria de un ácido nucleico circular, y entonces se extiende el cebador ancla madurado con una polimerasa para dar lugar a la formación de un ácido nucleico que contenga una o más copias de una secuencia complementaria al ácido nucleico circular.
La unión del cebador ancla a un sólido o a un sustrato sólido móvil se puede producir antes, durante o después de la extensión del cebador ancla madurado. Por tanto, se pueden ligar uno o más cebadores al sólido o al sustrato sólido móvil, tras lo cual el cebador ancla es madurado a un ácido nucleico diana y extendido en presencia de una polimerasa. Alternativamente, se puede madurar en primer lugar un cebador ancla con un ácido nucleico diana, y un extremo 3’OH del cebador ancla madurado es extendido con una polimerasa. El cebador ancla extendido es ligado a continuación al sólido o al sustrato sólido móvil. Variando la secuencia de cebadores ancla, es posible amplificar específicamente los distintos ácidos nucleicos diana presentes en una población de ácidos nucleicos.
A continuación se esboza una descripción preferida para la preparación de ácidos nucleicos plantilla para las reacciones de amplificación y secuenciamiento. La descripción incluye un método para preparar la muestra de ADN con siete etapas generales: (a) fragmentar muestras grandes de ADN plantilla o de ADN genómico completo para generar una pluralidad de fragmentos de ADN digeridos; (b) crear extremos compatibles en la pluralidad de muestras de ADN digeridas; (c) ligar un conjunto de secuencias adaptadoras universales sobre los extremos de las moléculas de ADN fragmentadas para obtener una pluralidad de moléculas de ADN ligadas a adaptador, en donde cada secuencia de adaptador universal tiene una secuencia de base conocida y única que comprende una secuencia de cebador de PCR común, una secuencia de cebador de secuenciamiento común y una secuencia clave de cuatro bases discriminatoria, y en donde se une una adaptador a biotina; (d) separar y aislar la pluralidad de fragmentos de ADN ligados; (e) eliminar cualquier porción de la pluralidad de fragmentos de ADN ligados; (f) reparar las melladuras y extender las cadenas de la pluralidad de fragmentos de ADN ligados; (g) unir cada uno de los fragmentos de ADN ligados a un soporte sólido; y (h) aislar poblaciones que comprenden fragmentos de ADN ligados a adaptador de cadena sencilla para los cuales existe un único adaptador en cada extremo (es decir, que proporcionan direccionalidad).
La siguientes discusión resume las etapas básicas implicadas en los métodos de la invención y de la descripción. Las etapas se enumeran en un orden específico, sin embargo, como apreciará el especialista en la técnica, el orden de las etapas puede manipularse para alcanzar el mismo resultado. Dichas manipulaciones son contempladas. Además, algunas etapas se pueden minimizar, como apreciará el especialista en la técnica.
Fragmentación
Al llevar a la práctica los métodos de la presente invención y descripción, la fragmentación de la muestra de ADN se puede realizar mediante cualquier medio conocido por los especialistas en la técnica. Preferiblemente, la fragmentación se lleva a cabo a través de medios enzimáticos o mecánicos. Los medios mecánicos pueden ser la sonicación o la ruptura física. Los medios enzimáticos pueden llevarse a cabo mediante digestión con nucleasas (por ejemplo, Desoxirribonucleasa I (ADNasa I)) o una o más endonucleasas de restricción. Preferiblemente, la fragmentación da como resultado extremos para los que la secuencia no es conocida.
Preferiblemente, el medio enzimático es ADNasa I. La ADNasa I es una enzima versátil que corta de modo no específico ADN de cadena doble (ADNds) para liberar productos de di-, tri- y oligonucleótidos 5’-fosforilados. La ADNasa I tiene una actividad óptima en tampones que contienen Mn2+, Mg2+ y Ca2+, pero no otras sales. El propósito de la etapa de digestión de ADNasa I es fragmentar un genoma de ADN grande en piezas más pequeñas que comprenden una biblioteca. Las características de ruptura de la ADNasa I dará como resultado una digestión aleatoria de ADN plantilla (es decir, no tipo secuencia) y la predominancia de fragmentos de ADNds de extremo romo cuando se usa en presencia de tampones basados en manganeso (Melgar, E. y D.A. Goldthwait. 1968. Deoxyribonucleic acid nucleases. II. The effects of metal on the mechanism of action of deoxyribonuclease I. J. Biol. Chem. 243: 4409). El rango de productos de digestión generados después del tratamiento con ADNasa I de plantillas genómicas depende de tres factores: i) la cantidad de enzima usada (unidades); ii) la temperatura de digestión (ºC); y iii) el tiempo de incubación (minutos). Las condiciones de digestión de ADNasa I descritas más adelantes han sido optimizadas para producir bibliotecas genómicas con un intervalo de tamaños de 50 a 700 pares base (pb).
Preferiblemente, la ADNasa I digiere ADN plantilla grande o ADN de genoma completo durante 1-2 minutos para
Pulido
La digestión de plantillas de ADN genómico (ADNg) con ADNasa I en presencia de Mn2+ producirá fragmentos de ADN que tienen extremos romos o que tienen extremos prominentes con uno o dos nucleótidos de longitud. Preferiblemente, se crea un número incrementado de extremos romos con Pfu ADN polimerasa, Alternativamente, se pueden crear extremos romos con polimerasas de ADN menos eficientes tales como T4 ADN polimerasa o Klenow ADN polimerasa. El “pulido” Pfu o finalización roma se usa para aumentar la cantidad de especies de extremo romo generadas después de la digestión de plantilla genómica con ADNasa I. El uso de Pfu ADN polimerasa para el pulido de fragmentos dará como resultado el llenado de partes salientes 5’. Adicionalmente, la Pfu ADN polimerasa no presenta actividad de ADN extendasa pero sí presenta actividad de 3’ - 5' exonucleasa que dará como resultado la eliminación de extensiones de nucleótidos sencillas o dobles para aumentar aún más la cantidad de fragmentos de ADN de extremo romo disponibles para la ligación a adaptador (Costa, G.L. y M.P. Weiner. 1994a. Protocols for cloning and analysis of blunt-ended PCR-generated DNA fragments. PCR Methods Appl 3(5): S95; Costa, G.L., A. Grafsky y M.P. Weiner. 1994b. Cloning and analysis of PCR-generated DNA fragments. PCR Methods Appl 3(6): 338; Costa, G.L. y M.P. Weiner. 1994c. Polishing with T4 or Pfu polymerase increases the efficiency of cloning of PCR products. Nucleic Acids Res. 22(12): 2423).
Ligación de adaptador
Si las bibliotecas de ácidos nucleicos van a ser unidas al sustrato sólido, entonces preferiblemente las plantillas de ácido nucleico son maduradas con secuencias de cebador ancla usando técnicas reconocidas (véase, por ejemplo, Hatch y col., 1999. Genet. Anal. Biomol. Engineer. 15: 35-40; Kool, Patente de EE.UU. Nº 5.714.320 y Lizardi, Patente de EE.UU. Nº 5.854.033). En general, cualquier procedimiento de maduración de cebadores ancla con las secuencias de ácido nucleico plantilla es adecuado siempre que dé como resultado la formación de complementariedad específica, es decir, perfecta o casi perfecta, entre la región o regiones adaptadora(s) de la secuencia de cebador ancla y una secuencia presente en la biblioteca plantilla.
Preferiblemente, después de la fragmentación y la formación de extremos romos en la biblioteca de ADN, se añaden secuencias de adaptador universal a cada fragmento de ADN. Los adaptadores universales se diseñan para incluir un conjunto de regiones de imprimación PCR únicas que tiene una longitud habitualmente de 20 pb localizadas adyacentes a un conjunto de regiones de imprimación de secuenciamiento únicas que habitualmente tienen una longitud de 20 pb opcionalmente mediante una secuencia clave discriminatoria única que consiste en al menos uno de cada uno de los cuatro desoxirribonucleótidos (es decir, A, C, G, T). Preferiblemente, la secuencia clave discriminatoria tiene una longitud de 4 bases. Alternativamente, la secuencia clave discriminatoria puede ser combinaciones de 1-4 bases. Alternativamente, cada adaptador universal único tiene una longitud de cuarenta y cuatro pb (44 pb). Preferiblemente, los adaptadores universales son ligados, usando T4 ADN ligasa, a cada extremo del fragmento de ADN para generar una adición de nucleótido total de 88 pb para cada fragmento de ADN. Los diferentes adaptadores universales se diseñan específicamente para cada preparación de biblioteca de ADN y por lo tanto proporcionarán un único identificador para cada organismo. El tamaño y la secuencia de los adaptadores universales pueden modificarse, como será evidente para el especialista en la técnica.
Por ejemplo, para preparar dos adaptadores universales distintos (es decir, “primero” y “segundo”), se pueden adquirir oligonucleótidos de cadena sencilla a suministradores comerciales (es decir, Integrated DNA Technologies, IA u Operon Technologies, CA). Las secuencias de oligonucleótido del adaptador universal pueden modificarse durante la síntesis con dos o tres enlaces de fosforotioato en lugar de enlaces fosfodiéster en ambos extremos, 5’ y 3’. Los oligonucleótidos sin modificar son sometidos a una rápida degradación mediante nucleasas y por lo tanto tienen una utilidad limitada. Las nucleasas son enzimas que catalizan la ruptura hidrolítica de una cadena de polinucleótidos mediante la ruptura del enlace fosfodiéster entre dos bases de nucleótidos. Por tanto, la modificación de fosforotioato es una química resistente a nucleasa ampliamente usada y disponible para su uso en aplicaciones de oligonucleótidos. En los fosforotioatos un átomo de azufre reemplaza a un oxígeno que no forma un puente en la cadena principal del oligonucleótido, haciéndolo resistente a todas las formas de digestión por nucleasa (es decir, resistente a digestión tanto de endonucleasa como de exonucleasa). Cada oligonucleótido es purificado mediante HPLC para asegurar que no existe una contaminación o secuencias de oligonucleótidos espurias en la preparación de oligonucleótidos sintética. Los adaptadores universales se diseñan para permitir una ligación direccional al ADN fragmentado de extremo romo. Cada conjunto de adaptadores universales de cadena dobles se diseña con una región de imprimación PCR que contiene salientes 5’ de cuatro bases no complementarios que no se pueden ligar con el fragmento de ADN de extremo romo, así como prevenir la ligación uno con otro en dichos extremos. Por consiguiente, la unión sólo se puede producir entre el extremo 3’ del adaptador y el extremo 5’ del fragmento de ADN, o entre el extremo 3’ del fragmento de ADN y el extremo 5’ del adaptador. Las secuencias de adaptador universal de cadena doble se generan usando oligonucleótidos de cadena sencilla que son diseñados con secuencias que permiten que los oligonucleótidos principalmente complementarios se maduren, y previenen la hibridación cruzada entre dos oligonucleótidos no complementarios. El 95% de los adaptadores universales pueden formarse a partir de la maduración de oligonucleótidos complementarios. Preferiblemente, el 97% de los Uno de los dos adaptadores puede estar ligado a un resto de unión a un soporte. Preferiblemente se añade una biotina 5’ al primer adaptador universal para permitir el posterior aislamiento de ADNss plantilla y el acoplamiento no covalente del adaptador universal a la superficie de un soporte sólido que está saturado con una proteína de unión a biotina (es decir, estreptavidina, neutravidina o avidina). Otros enlaces son bien conocidos en la técnica y se pueden usar en lugar de biotina-estreptavidina (por ejemplo anticuerpo/antígeno-epítopo, receptor/ligando y emparejamiento
o complementariedad de oligonucleótidos). El soporte sólido puede ser una partícula, preferiblemente una partícula de poliestireno. Preferiblemente, la partícula tiene un diámetro de aproximadamente 2,8 μm. Tal como se usa en la presente memoria, dicha partícula se denomina “partícula de preparación de muestra”.
Cada adaptador universal se puede preparar combinando y madurando dos oligonucleótidos de ADNss, uno que contiene la secuencia sentido y el segundo que contiene la secuencia antisentido (complementario). La representación esquemática del diseño de adaptador universal se esboza en la Figura 2.
Aislamiento de productos de ligación
La ligación de adaptador universal da como resultado la formación de ADNs fragmentados con adaptadores en cada extremo, adaptadores individuales no ligados y dímeros de adaptadores. Preferiblemente, se usa electroforesis de gel de agarosa como método de separación y aislamiento de la población de la biblioteca de ADN adaptada a partir de las poblaciones de adaptadores individuales no ligados y de dímeros de adaptadores. Alternativamente, los fragmentos se pueden separar mediante cromatografía de exclusión de tamaño o mediante sedimentación de sacarosa. El procedimiento de digestión de ADN con ADNasa I habitualmente produce una población de biblioteca que oscila entre 50 y 700 pb. Preferiblemente, al llevar a cabo la electroforesis de gel de agarosa en presencia de un marcador de ADN, la adición del conjunto de adaptador universal de 88 pb desplazará la población de biblioteca de ADN a un tamaño mayor y dará como resultado un perfil de migración en el rango de tamaños de aproximadamente 130-800 pb; los dímeros de adaptadores migrarán a 88 pb; y los adaptadores no ligados migrarán a 44 pb. Por lo tanto, se pueden aislar físicamente numerosas bibliotecas de ADN de cadena doble con tamaños que oscilan entre 200 y 800 pb a partir del gel de agarosa, y se pueden purificar usando técnicas de extracción de gel estándares. El aislamiento de gel de la biblioteca de ADN ligada adaptada puede dar como resultado la recuperación de una población de biblioteca que oscila en tamaño entre 200 y 400 pb. El especialista en la técnica conocerá otros métodos para distinguir fragmentos ligados a adaptador.
Reparación de melladuras
Debido a que los oligonucleótidos de ADN para los adaptadores universales no están fosforilados en 5’, habrá huecos presentes en las intersecciones 3’ de los ADNs fragmentados después del tratamiento con ligasa (véase la Figura 3A). Estos dos “huecos” o “melladuras” se pueden rellenar usando una enzima de ADN polimerasa que se una, desplace la cadena y extienda los fragmentos de ADN mellados. Las ADN polimerasas que carecen de actividad de 3’ - 5' exonucleasa pero presentan actividad de 5' -3' exonucleasa tienen la capacidad de reconocer melladuras, desplazar las cadenas melladas y extender la cadena de un modo que dé como resultado la reparación de las melladuras y la formación de ADN de doble cadena no mellado (véase la Figura 3B y 3C) (Hamilton, S.C.,
J.W. Farchaus y M.C. Davis. 2001. DNA polymerases as engines for biotechnology. BioTechniques 31: 370).
Se utilizan varias enzimas modificadoras para la etapa de reparación de melladuras, que incluyen, aunque sin limitación, polimerasa, ligasa y quinasa. Las ADN polimerasas que pueden usarse para esta aplicación incluyen, por ejemplo, E. coli ADN pol I, Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus pol I y bacteriófago phi 29. Preferiblemente, se usa la enzima desplazadora de cadena Bacillus stearothermophilus pol I (Bst DNA polymerase I) para reparar el ADNds mellado y da como resultado ADNds no mellado (véase la Figura 3D). Preferiblemente, la ligasa es T4 y la quinasa es polinucleótido quinasa.
Aislamiento de ADN de cadena sencilla
Después de la generación de ADNds no mellado, se deben aislar los ADNss que comprenden las moléculas de primer adaptador y de segundo adaptador (las poblaciones deseadas se designan a continuación con asteriscos; “A” y “B” corresponden al primer y segundo adaptadores). Las bibliotecas de ADN de cadena doble tendrán adaptadores ligados en las siguientes configuraciones:
Adaptador universal A – fragmento de ADN – Adaptador universal A
Adaptador universal B – fragmento de ADN – Adaptador universal A*
Adaptador universal A – fragmento de ADN – Adaptador universal B*
Adaptador universal B – fragmento de ADN – Adaptador universal B Los adaptadores universales se diseñan de tal modo que solo un adaptador universal tenga un resto de biotina 5’. Por ejemplo, si el adaptador universal B tiene un resto de biotina 5’, se pueden usar partículas de preparación de muestra recubiertas de estreptavidina para unir todas las especies de la biblioteca de ADN de cadena doble con el adaptador universal B. Las poblaciones de la biblioteca genómica que contienen dos especies de adaptador universal A no contendrán un resto de biotina 5’ y no se unirán a las partículas de preparación de muestra que contienen estreptavidina y por tanto se pueden eliminar por lavado. Las únicas especies que permanecerán unidas a las partículas son aquellas con los adaptadores universales A y B, y aquellas con dos secuencias de adaptador universal B. Las especies de ADN con dos secuencias de adaptador universal B (es decir, restos de biotina en cada extremo 5’) se unirán a partículas de preparación de muestra recubiertas de estreptavidina en cada extremo, ya que cada cadena de la doble cadena se unirá. Las especies de ADN de cadena doble con un adaptador universal A y un adaptador universal B contendrán un único resto de biotina 5’ y por tanto se unirán a partículas recubiertas de estreptavidina en un solo extremo. Las partículas de preparación de muestra son magnéticas, por lo tanto las partículas de preparación de muestra permanecerán acopladas a un soporte sólido cuando estén magnetizadas. Por consiguiente, en presencia de una disolución de bajo contenido en sales (“fundida” o desnaturalizante), sólo aquellos fragmentos de ADN que contengan un único adaptador universal A y una única secuencia de adaptador universal B liberarán la cadena complementaria no ligada. Esta población de ADN de cadena sencilla puede ser recolectada y cuantificada, por ejemplo mediante secuenciamiento de pirofosfato, PCR cuantitativa en tiempo real, electroforesis de gel de agarosa o electroforesis de gel capilar.
Unión de plantilla a partículas
Las bibliotecas de ADNss que son creadas de acuerdo con los métodos de la descripción pueden cuantificarse para calcular el número de moléculas por unidad de volumen. Dichas moléculas son maduradas con un soporte sólido (partícula) que contiene cebadores de captura de oligonucleótidos que son complementarios a las regiones de imprimación de PCR de los extremos de adaptador universal de las especies de ADNss. A continuación las partículas son transferidas a un protocolo de amplificación. Entonces, las poblaciones clonales de especies sencillas capturadas sobre partículas de ADN pueden ser secuenciadas. El soporte sólido puede ser una partícula, preferiblemente una partícula de sepharose. Tal como se usa en la presente memoria, dicha partícula es referida como “partícula de captura de ADN”. Las partículas usadas en la presente memoria pueden tener cualquier tamaño conveniente y pueden fabricarse a partir de una serie de materiales conocidos. Los ejemplos de tales materiales incluyen: materiales inorgánicos, polímeros naturales y polímeros sintéticos. Los ejemplos específicos de dichos materiales incluyen: celulosa, derivados de celulosa, resinas acrílicas, vidrio; geles de sílice, poliestireno, gelatina, polivinil pirrolidona, co-polímeros de vinil y acrilamida, poliestireno reticulado con divinilbenceno o similares (véase, Merrifield Biochemistry 1964, 3, 1385-1390), poliacrilamidas, geles de látex, poliestireno, dextrano, caucho, silicio, plásticos, nitrocelulosa, celulosas, esponjas naturales, geles de sílice, vidrio, plástico de metales, celulosa, dextranos reticulados (por ejemplo, SephadexTM) y gel de agarosa (SepharoseTM) y soportes de fase sólida conocidos por el especialista en la técnica. El diámetro de la partícula de captura de ADN puede estar en el rango de 20 a 70 μm. Preferiblemente, el diámetro de la partícula de captura de ADN está en un intervalo de 20 a 50 μm. Más preferiblemente, el diámetro de la partícula de captura de ADN es de aproximadamente 30 μm.
La descripción incluye un método para generar una biblioteca de soportes sólidos que comprende: (a) preparar una población de plantillas de ADNss de acuerdo con los métodos descritos en la presente memoria; (b) unir cada plantilla de ADN a un soporte sólido de tal modo que sólo hay una molécula de ADN por soporte sólido; (c) amplificar la población de plantillas de cadena sencilla de tal modo que la amplificación genera una población clonal de cada fragmento de ADN sobre cada soporte sólido; (d) secuenciar poblaciones clonales de partículas.
El soporte sólido puede ser una partícula de captura de ADN. El ADN puede ser ADN genómico, ADNc o tránscritos inversos de ARN viral. El ADN puede estar unido al soporte sólido, por ejemplo, mediante un enlace biotinaestreptavidina, un enlace covalente o mediante hibridación de oligonucleótidos complementarios. Cada plantilla de ADN puede estar ligada a un conjunto de adaptadores universales. El par de adaptador universal puede comprender una secuencia de cebador de PCR común, una secuencia de cebador de secuenciamiento común y una secuencia clave discriminatoria. Se aíslan ADNs de cadena sencilla que producen extremos únicos; a continuación se unen moléculas de cadena sencilla a un soporte sólido y se exponen a técnicas de amplificación para la expansión clonal de poblaciones. El ADN puede amplificarse mediante PCR.
La descripción proporciona una biblioteca de soportes sólidos preparada mediante los métodos descritos en la presente memoria.
El ácido nucleico plantilla (por ejemplo, ADN plantilla) preparado mediante este método puede usarse para muchos procedimientos biológicos moleculares, tal como extensión lineal, amplificación circular rotatoria, PCR y secuenciamiento. Este método se puede completar en una reacción de enlace, por ejemplo, usando una relación molar elevada de partículas a ADN. La captura de moléculas de ADN de cadena sencilla seguirá una distribución de poisson y dará como resultado un subconjunto de partículas sin ADN unido y un subconjunto de partículas con dos moléculas de ADN unidas. Preferiblemente, habrá una partícula por cada molécula de ADN. Adicionalmente, es posible incluir componentes adicionales en los adaptadores que puedan ser útiles para manipulaciones adicionales de la biblioteca aislada.
2. AMPLIFICACIÓN DE PLANTILLA DE ÁCIDO NUCLEICO
Para secuenciar la plantilla de ácido nucleico de acuerdo con los métodos de esta invención y descripción, el número de copias debe ser amplificado para generar un número suficiente de copias de la plantilla para producir una señal detectable a través de los medios de detección de luz. Se puede usar cualquier método de amplificación de ácido nucleico que sea adecuado.
Se han descrito una serie de técnicas de amplificación de ácido nucleico in vitro. Dichas metodologías de amplificación pueden diferenciarse en los siguientes métodos: (i) los que requieren reacción en cadena de polimerasa (PCR) con ciclos de temperatura (véase por ejemplo Saiki y col., 1995. Science 230: 1350-1354), reacción en cadena de ligasa (véase por ejemplo Barany, 1991. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 189-193; Barringer y col., 1990. Gene 89: 117-122) y amplificación basada en transcripción (véase por ejemplo Kwoh y col., 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173-1177), y (ii) sistemas de amplificación isotermos – autosostenidos, replicación de secuencia (véase por ejemplo Guatelli y col., 1990. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874-1878); el sistema de Q� replicasa (véase por ejemplo Lizardi y col., 1988. BioTechnology 6: 1197-1202); amplificación por desplazamiento de cadena, Nucleic Acids Res. 1992, 11 de abril; 20(7): 1691-6; y los métodos descritos en PNAS 1992, 1 de enero; 89(1): 392-6; y NASBA J Virol Methods. 1991, diciembre; 35(3): 273-86.
Se puede usar amplificación isoterma. La amplificación isoterma también incluye amplificación basada en círculo rotatorio (RCA, del inglés “Rolling-Circle Amplification”). La RCA se discute, por ejemplo, en Kool, Patente de EE.UU. Nº 5.714.320 y Lizardi, Patente de EE.UU. Nº 5.854.033; Hatch y col., 1999. Genet. Anal. Biomol. Engineer. 15: 35
40. El resultado de la RCA es una cadena de ADN sencilla que se extiende desde el extremo 3’ del cebador ancla (y por tanto está unida a la matriz del soporte sólido) y que incluye un concatémero que contiene múltiples copias de la plantilla circular madurada a la secuencia de cebador. Típicamente, con RCA se pueden obtener de 1.000 a 10.000
o más copias de plantillas circulares, cada una de un tamaño de, por ejemplo, aproximadamente 30-500, 50-200 ó 60-100 nucleótidos de intervalo de tamaños.
El producto de la amplificación de RCA después de la maduración de una molécula de ácido nucleico circular con un cebador ancla se muestra esquemáticamente en la Figura 11A. Un ácido nucleico plantilla circular 102 se madura con un cebador ancla 104, que ha sido ligado a una superficie 106 en su extremo 5’ y que tiene un OH 3’ libre disponible para extensión. El ácido nucleico plantilla circular 102 incluye dos regiones adaptadoras 108 y 110 que son complementarias a las regiones de secuencia del cebador ancla 104. También se incluyen en el ácido nucleico plantilla circular 102 un injerto 112 y una región 114 homóloga a un cebador de secuenciamiento, que se usa en las reacciones de secuenciamiento descritas más adelante.
En la maduración, el OH 3’ libre del cebador ancla 104 se puede extender usando secuencias del ácido nucleico plantilla 102. El cebador ancla 102 se puede extender a lo largo de la plantilla múltiples veces, añadiendo cada iteración a la secuencia extendida desde el cebador ancla una secuencia complementaria al ácido nucleico plantilla circular. En la Figura 11A se muestran cuatro iteraciones, o cuatro rondas de replicación circular rotatoria, como el producto de amplificación de cebador ancla extendido 114. La extensión del cebador ancla da como resultado un producto de amplificación unido covalentemente, o si no físicamente, al sustrato 106. Se pueden utilizar una serie de técnicas de amplificación de ácido nucleico in vitro para extender la secuencia de cebador ancla. La amplificación se lleva a cabo típicamente en presencia de una polimerasa, por ejemplo, una polimerasa de ADN o de ADN dirigido por ARN, y uno, dos, tres o cuatro tipos de trifosfatos de nucleótido, y, opcionalmente, proteínas de unión auxiliares. En general, se puede usar cualquier polimerasa capaz de extender un grupo OH 3’ imprimado siempre que carezca de actividad de exonucleasa de 3’ a 5’. Las polimerasas adecuadas incluyen, por ejemplo, las ADN polimerasas procedentes de Bacillus stearothermophilus, Thermus acquaticus, Pyrococcus furiosis, Thermococcus litoralis y Thermus thermophilus, bacteriófago T4 y T7, y el fragmento de ADN polimerasa I Klenow de E. coli. Las polimerasas de ADN dirigidas por ARN adecuadas incluyen, por ejemplo, la transcriptasa inversa del Virus de Mieloblastosis Aviar, la transcriptasa inversa del Virus de Leucemia Murino Moloney, y la transcriptasa inversa del Virus I de Inmunodeficiencia Humana. En la Figura 11B-11D se muestran plantillas circulares y cebadores ancla con más detalle. La Figura 11B ilustra un sustrato lineal de círculo abierto madurado que puede servir, tras ligación, como plantilla para la extensión de un cebador ancla. Se madura una molécula plantilla que tiene la secuencia 5’ – tcg tgt gag gtc tca gca tct tat gta tat tta ctt cta ttc tca gtt gcc taa gct gca gcc a – 3’ (SEC ID Nº: 5) con un cebador ancla que tiene un ligando de biotina en su extremo 5’ y la secuencia 5’ – gac ctc aca cga tgg ctg cag ctt – 3’ (SEC ID Nº: 6). La maduración de la plantilla da como resultado la yuxtaposición de los extremos 5’ y 3’ de la molécula plantilla. El OH 3’ del cebador ancla puede extenderse usando la plantilla circular.
El uso de una plantilla circular y un cebador ancla para la identificación de polimorfismos de nucleótido sencillos se muestra en la Figura 11C. Se muestra un cebador ancla genérico que tiene la secuencia 5’ – gac ctc aca cga tgg ctg cag ctt – 3’ (SEC ID Nº: 7). El cebador ancla se madura con una sonda SNP que tiene la secuencia 5’ – ttt ata tgt att cta cga ctc tgg agt gtg cta ccg acg tcg aat ccg ttg act ctt atc ttc a – 3’ (SEC ID Nº: 8). La sonda SNP a su vez se hibrida con una región de una región que contiene la SNP de un gen que presenta la secuencia 5’ – cta gct cg taca tat aaa tga aga taa gat cct g – 3’ (SEC ID Nº: 9). La hibridación de una secuencia de ácido nucleico que contiene el polimorfismo con el complejo de sonda SNP permite la posterior ligación y circularización de la sonda SNP. La sonda SNP se diseña de tal modo que sus extremos 5’ y 3’ se maduran con la región genómica de tal modo que está contiguo en la región del sitio polimórfico, como se indica en la Figura 11C. La sonda SNP circularizada puede La Figura 11D ilustra el uso de un oligonucleótido de hueco junto con una molécula plantilla circular. Se une un cebador ancla que tiene la secuencia 5’ – gac ctc aca cga gta gca tgg ctg cag ctt – 3’ (SEC ID Nº: 10) a una superficie a través de un enlace biotina. Se madura una molécula plantilla que tiene la secuencia 5’ – tcg tgt gag gtc tca gca tct tat gta tat tta ctt cta ttc tca gtt gcc taa gct gca gcc a – 3’ (SEC ID Nº: 11) con el cebador ancla para dar como resultado una región de cadena parcialmente sencilla, o con huecos, en el cebador ancla flanqueada por una región de cadena doble. Entonces se madura una molécula de hueco que tiene la secuencia 5’ – tgc tac – 3’ con el cebador ancla. La ligación de ambos extremos del oligonucleótido de hueco con la molécula plantilla da como resultado la formación de una molécula de ácido nucleico circular que puede actuar como una plantilla para la amplificación circular rotatoria.
La RCA se puede producir cuando la replicación de la molécula dúplex comienza en el origen. Posteriormente, una melladura abre una de las cadenas, y el resto hidroxilo 3’-terminal libre generado por la melladura es extendido mediante la acción de ADN polimerasa. La cadena recién sintetizada finalmente desplaza la cadena de ADN de partida original. Este tipo mencionado anteriormente de replicación es conocido como replicación circular rotatoria (RCR) debido a que el punto de replicación puede considerarse que “rota alrededor” de la cadena de plantilla circular y, teóricamente, podría continuar haciéndolo indefinidamente. Adicionalmente, debido a que la cadena de ADN recién sintetizada está ligada covalentemente a la plantilla original, la cadena desplazada posee la secuencia genómica original (por ejemplo, gen u otra secuencia de interés) en su extremo 5’. En la RCR, la secuencia genómica original viene seguida de cualquier número de “unidades de replicación” complementarias a la secuencia plantilla original, en donde cada unidad de replicación se sintetiza continuando las revoluciones de dicha secuencia plantilla original. Por lo tanto, cada revolución subsiguiente desplaza el ADN que se sintetiza en el ciclo previo de replicación.
A través del uso de la reacción de RCA, se puede generar una cadena que represente muchas copias tándem del complemento de la molécula circularizada. Por ejemplo, se ha utilizado recientemente la RCA para obtener una reacción de amplificación en cascada isoterma de sondas de candado circularizadas in vitro con el objetivo de detectar genes de copia individual en muestras de ADN genómico humano (véase Lizardi y col., 1998. Nat. Genet.
19: 225-232). Adicionalmente, la RCA también se ha utilizado para detectar moléculas de ADN individuales en un ensayo basado en fase sólida, aunque surgieron dificultades a la hora de aplicar esta técnica a una hibridación in situ (véase Lizardi y col., 1998. Nat. Genet. 19: 225-232).
Si se desea, se puede llevar a cabo la RCA a temperaturas elevadas, por ejemplo, a temperaturas superiores a 37ºC, 42ºC, 45ºC, 50ºC, 60ºC ó 70ºC. Adicionalmente, la RCA se puede llevar a cabo inicialmente a una temperatura más baja, por ejemplo a temperatura ambiente, y a continuación cambiar a una temperatura elevada. La RCA a temperatura elevada se lleva a cabo preferiblemente con polimerasas de ácido nucleico termoestable y con cebadores que puedan madurarse de forma estable con especificidad a temperaturas elevadas.
La RCA también se puede llevar a cabo con oligonucleótidos que no existen de forma natural, por ejemplo, ácidos nucleicos peptídicos. Además, la RCA se puede llevar a cabo en presencia de proteínas auxiliares tales como proteínas de unión de cadena sencilla.
El desarrollo de un método para amplificar moléculas de ADN cortas que han sido inmovilizadas en un soporte sólido, denominado RCA, ha sido descrito recientemente en la bibliografía (véase por ejemplo Hatch y col., 1999. Genet. Anal. Biomol. Engineer. 15: 35-40; Zhang y col., 1998. Gene 211: 277-85; Baner y col., 1998. Nucl. Acids Res. 26: 5073-5078; Liu y col., 1995. J. Am. Chem. Soc. 118: 1587-1594; Fire y Xu, 1995. Proc. Natl. Acad. Sci. USA
92: 4641-4645; Nilsson y col., 1994. Science 265: 2085-2088). La RCA está dirigida a secuencias de ADN específicas a través de hibridación y una reacción de ADN ligasa. A continuación, el producto circular es subsiguientemente como plantilla en una reacción de replicación circular rotatoria.
Otros ejemplos de sistemas de amplificación isoterma incluyen, por ejemplo, (i) replicación de secuencias autosostenida (véase, por ejemplo, Guatelli y col., 1990. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874-1878), (ii) el sistema Q� replicasa (véase, por ejemplo, Lizardi y col., 1988. BioTechnology 6: 1197-1202), y (iii) amplificación basada en secuencia de ácido nucleico (NASBATM; véase Kievits y col., 1991, J. Virol. Methods 35: 273-286).
Amplificación PCR de plantillas de ácido nucleico
Preferiblemente se usa la reacción en cadena de polimerasa (“PCR”) para generar copias adicionales de los ácidos nucleicos plantilla. La etapa de amplificación PCR puede llevarse a cabo antes de la distribución de las plantillas de ácido nucleico sobre la placa picotiter o puede llevarse a cabo después de que las plantillas de ácido nucleico hayan sido distribuidas sobre la placa picotiter.
Preferiblemente, se lleva a cabo una etapa de amplificación PCR antes de la distribución de las plantillas de ácido nucleico sobre la placa picotiter. Preferiblemente, se lleva a cabo un nuevo sistema de amplificación, denominado en la presente memoria “amplificación de emulsión de partículas” uniendo un ácido nucleico plantilla (por ejemplo, ADN) que va a ser amplificado a un soporte sólido, preferiblemente en la forma de una partícula generalmente esférica. Una biblioteca de ADN plantilla de cadena sencilla preparada según los métodos de preparación de muestras descritos en la presente memoria es un ejemplo de fuente adecuada de la biblioteca de plantilla de ácido nucleico de partida que va a ser unida a una partícula para su uso en este método de amplificación.
La partícula se une a un número grande de especies de cebador individuales (es decir, cebador B en la Figura 6) que son complementarias a una región del ADN plantilla. El ADN plantilla se madura con el cebador ligado a la partícula. Las partículas son suspendidas en una mezcla de reacción acuosa y a continuación son encapsuladas en una emulsión de agua-en-aceite. La emulsión está compuesta de microgotas discretas de fase acuosa, de aproximadamente 60 a 200 μm de diámetro, atrapadas en una fase de aceite termoestable. Cada microgota contiene, preferiblemente, disolución de reacción de amplificación (es decir, los reactivos necesarios para la amplificación de ácido nucleico). Un ejemplo de amplificación sería una mezcla de reacción PCR (polimerasa, sales, dNTPs) y un par de cebadores de PCR (cebador A y cebador B). Véase la Figura 6A. Un subconjunto de la población de microgotas también contiene la partícula de ADN que comprende la plantilla de ADN. Este subconjunto de la población de microgotas también contiene la partícula de ADN que comprende la plantilla de ADN. Dicho subconjunto de microgotas es la base de la amplificación. Las microcápsulas que no están dentro de este subconjunto no tienen ADN plantilla y no participarán en la amplificación. La técnica de amplificación puede ser PCR y los cebadores de PCR están presentes en una relación de 8:1 ó de 16:1 (es decir, 8 ó 16 unidades de un cebador por 1 del segundo cebador) para llevar a cabo una PCR asimétrica.
Con esta visión global, el ADN es madurado con un oligonucleótido (cebador B) que está inmovilizado en una partícula. Durante el termociclado (Figura 6B), se rompe el enlace entre la plantilla de ADN de cadena sencilla y el cebador B inmovilizado sobre la partícula, liberando la plantilla a la disolución microencapsulada que la rodea. La disolución de amplificación, en este caso la disolución PCR, contiene la adición de cebador A y cebador B en fase disolución. Los cebadores B en fase disolución se unen fácilmente a la región complementaria b’ de la plantilla, ya que la cinética de unión es más rápida para los cebadores en fase disolución que para los cebadores inmovilizados. En la fase temprana de la PCR, ambas cadenas A y B se amplifican igual de bien (Figura 6C).
En la fase intermedia de la PCR (es decir, entre los ciclos 10 y 30) los cebadores B se agotan, deteniéndose la amplificación exponencial. A continuación la reacción entra en amplificación asimétrica y la población de ampliación empieza a estar dominada por cadenas A (Figura 6D). En la fase tardía de la PCR (Figura 6E), tras 30-40 ciclos, la amplificación asimétrica aumenta la concentración de cadenas A en disolución. El exceso de cadenas A comienza a madurarse con los cebadores B inmovilizados sobre las partículas. A continuación las polimerasas termoestables utilizan la cadena A como plantilla para sintetizar una cadena B ligada a partícula, inmovilizada, de la ampliación.
En la fase final de la PCR (Figura 6F), los ciclos térmicos continuados fuerzan una maduración adicional con los cebadores ligados a partículas. La amplificación en fase disolución puede ser mínima en esta etapa, pero la concentración de cadenas B inmovilizadas aumenta. Entonces, la emulsión se rompe y el producto inmovilizado se vuelve de cadena sencilla mediante desnaturalización (por calor, pH, etc.), lo que elimina la cadena A complementaria. Los cebadores A son madurados a la región A’ de la cadena inmovilizada, y la cadena inmovilizada se carga con enzimas de secuenciamiento, y con cualquier proteína accesoria necesaria. A continuación las partículas son secuenciadas usando técnicas de pirofosfato reconocidas (descritas, por ejemplo, en las Patentes de EE.UU. Nº 6.274.320, 6.258.568 y 6.210.891).
Diseño de plantilla
Preferiblemente, la plantilla de ADN que se va a amplificar mediante amplificación de emulsión de partículas puede ser una población de ADN tal como, por ejemplo, una biblioteca de ADN genómica o una biblioteca de ADNc. Se prefiere que cada miembro de la población tenga una secuencia de ácido nucleico común en el primer extremo y una secuencia de ácido nucleico común en un segundo extremo. Esto se puede lograr, por ejemplo, mediante ligación de una primera secuencia de ADN adaptadora a un extremo, y de una segunda secuencia de ADN adaptadora a un segundo extremo de la población de ADN. Muchas bibliotecas de ADN y ADNc, por la naturaleza del vector de clonación (por ejemplo, Bluescript, Stratagene, La Jolla, CA) se ajustan a esta descripción de presentar una secuencia común en un primer extremo y una segunda secuencia común en un segundo extremo de cada miembro de ADN. La plantilla de ADN puede ser de cualquier tamaño susceptible para una amplificación in vitro (incluyendo las técnicas de amplificación de PCR y PCR asimétrica preferidas). Preferiblemente, la plantilla de ADN tiene un tamaño de entre aproximadamente 150 y 750 pb, un tamaño tal como, por ejemplo, aproximadamente 250 pb.
Unión de ácido nucleico plantilla a partículas de captura
En una primera etapa, se une un ácido nucleico plantilla de cadena sencilla que va a ser amplificado a una partícula de captura. El ácido nucleico plantilla puede unirse al soporte sólido de partícula de captura mediante cualquier modo conocido en la técnica. Existen numerosos métodos en la técnica para unir ADN a un soporte sólido tal como la preferida partícula microscópica. De acuerdo con la presente invención y descripción, la unión química covalente del ADN a la partícula se puede llevar a cabo usando agentes de acoplamiento estándares, tal como carbodiimida soluble en agua, para unir el fosfato-5’ del ADN con partículas de captura recubiertas de aminas a través de un enlace de fosfoamidato. Otra alternativa es primero acoplar ligandos de oligonucleótidos específicos a la partícula usando una química similar, y a continuación usar ADN ligasa para unir el ADN al ligando sobre la partícula. Otros métodos de unión química para enlazar el oligonucleótido a las partículas incluyen el uso de N-hidroxisuccinamida (NHS) y sus derivados. En dicho método, un extremo del oligonucleótido puede contener un grupo reactivo (tal como un grupo amida) que forme un enlace covalente con el soporte sólido, mientras que el otro extremo del ligando contiene un segundo grupo reactivo que se puede enlazar con el oligonucleótido que se pretende inmovilizar. Preferiblemente, el oligonucleótido se une a la partícula de captura de ADN mediante enlace covalente. Sin embargo, también se pueden usar enlaces no covalentes, como la quelación o complejos antígeno-anticuerpo, para unir el oligonucleótido a la partícula.
Se pueden emplear ligandos de oligonucleótidos que se hibridan específicamente con secuencias únicas del extremo del fragmento de ADN, tal como el extremo solapado de un sitio de enzima de restricción o los “extremos pegajosos” de vectores de clonación basados en bacteriófagos lambda, pero también puede ser beneficioso el uso de ligaciones de extremo romo. Estos métodos se describen en detalle en la Patente de EE.UU. 5.674.743. Es preferible que cualquier método usado para inmovilizar las partículas continúe uniendo el oligonucleótido inmovilizado a través de las etapas de los métodos de la invención.
Cada partícula de captura puede diseñarse para tener una pluralidad de cebadores de ácido nucleico que reconozcan una porción de ácido nucleico plantilla (es decir, que sean complementarias a él), y por tanto el ácido nucleico plantilla es hibridado a la partícula de captura. En los métodos descritos en la presente memoria, es deseable la amplificación clonal de las especies plantilla, por lo que es preferible que se una sólo un único ácido nucleico plantilla con cualquiera de las partículas de captura.
Las partículas usadas en la presente memoria pueden tener cualquier tamaño conveniente y fabricarse a partir de cualquier material conocido. Los ejemplos de dichos materiales incluyen: materiales inorgánicos, polímeros naturales y polímeros sintéticos. Los ejemplos específicos de dichos materiales incluyen: : celulosa, derivados de celulosa, resinas acrílicas, vidrio; geles de sílice, poliestireno, gelatina, polivinil pirrolidona, co-polímeros de vinil y acrilamida, poliestireno reticulado con divinilbenceno o similares (véase, Merrifield Biochemistry 1964, 3, 1385-1390), poliacrilamidas, geles de látex, poliestireno, dextrano, caucho, silicio, plásticos, nitrocelulosa, esponjas naturales, geles de sílice, vidrio de porosidad controlada, metales, dextranos reticulados (por ejemplo, SephadexTM), gel de agarosa (SepharoseTM) y soportes de fase sólida conocidos por el especialista en la técnica. Preferiblemente, las partículas de captura son partículas de Sepharose de aproximadamente 25-40 μm de diámetro.
Emulsificación
Las partículas de captura con ácido nucleico plantilla de cadena sencilla ligado son emulsificadas como una emulsión agua-en-aceite estable térmicamente. La emulsión puede formarse de acuerdo a cualquier método adecuado conocido en la técnica. A continuación se describe un método para crear una emulsión, pero se puede usar cualquier método de preparación de una emulsión. Estos métodos son conocidos en la técnica e incluyen métodos con adyuvantes, métodos de contracorriente, métodos de flujo cruzado, métodos de tambor rotatorio y métodos de membrana. Además, se puede ajustar el tamaño de las microcápsulas variando el caudal y la velocidad de los componentes. Por ejemplo, en la adición gota a gota se puede variar el tamaño de las gotas y el tiempo total de alimentación. Preferiblemente la emulsión contiene una densidad de “microrreactores” de partícula de aproximadamente 3.000 partículas por microlitro.
La emulsión se genera preferiblemente suspendiendo las partículas unidas a plantilla en una disolución de amplificación. Tal como se usa en la presente memoria, la expresión “disolución de amplificación” significa una mezcla de reactivos suficiente que es necesaria para llevar a cabo la amplificación del ADN plantilla. En los ejemplos mostrados a continuación se proporciona un ejemplo de disolución de amplificación, una disolución de amplificación PCR – cabe destacar que se pueden realizar diversas modificaciones a la disolución de PCR.
La mezcla de partículas/disolución de amplificación se puede añadir gota a gota en una mezcla de giro de aceite biocompatible (por ejemplo, aceite mineral ligero, Sigma) y se deja emulsificar. El aceite usado puede suplementarse con uno o más estabilizantes de la emulsión. Estos estabilizantes de la emulsión pueden incluir Atlox 4912, Span 80 y otros estabilizantes adecuados reconocidos y disponibles comercialmente. Preferiblemente, el intervalo de tamaño de las gotas formadas va desde 5 micras a 500 micras, más preferiblemente, de entre aproximadamente 50 a 300 micras, y lo más preferiblemente, desde 100 a 150 micras.
No hay limitación en el tamaño de los microrreactores. Los microrreactores deberían ser suficientemente grandes para abarcar suficientes reactivos de amplificación para el grado de amplificación requerida. Sin embargo, los microrreactores deberían ser suficientemente pequeños de tal modo que una población de microrreactores, cada uno con un miembro de una biblioteca de ADN, pueden amplificarse mediante equipamiento convencional de laboratorio (por ejemplo, equipamiento de termociclado de PCR, tubos de ensayo, incubadores, y similares).
Con las limitaciones descritas anteriormente, el tamaño óptimo de un microrreactor puede estar entre 100 y 200 micras de diámetro. Los microrreactores de este tamaño deberían permitir la amplificación de una biblioteca de ADN que comprende aproximadamente 600.000 miembros en una suspensión de microrreactores de menos de 10 mL de volumen. Por ejemplo, si la PCR fuera el método de amplificación elegido, 10 mL cabrían en 96 tubos de un termociclador universal con capacidad para 96 tubos. Preferiblemente, la suspensión de 600.000 microrreactores tendría un volumen de menos de 1 mL. Una suspensión de menos de 1 mL puede ser amplificada en aproximadamente 10 tubos de un termociclador de PCR convencional. Más preferiblemente, la suspensión de
600.000 microrreactores tendría un volumen de menos de 0,5 mL.
Amplificación
Tras encapsulación, el ácido nucleico plantilla puede ser amplificado mediante cualquier método adecuado de amplificación de ADN que incluya sistemas de amplificación basados en transcripción (Kwoh D. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86: 1173 (1989); Gingeras T.R. y col., solicitud PCT WO 88/10315; Davey, C. y col., Publicación de Solicitud de Patente Europea nº 329.822; Miller, H.I. y col., solicitud PCT WO 89/06700, y “race” (Frohman, M.A. en: PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, NY (1990)) y “PCR de una cara” (Ohara,
O. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86: 5673-5677 (1989)). Se pueden usar otros métodos aún menos comunes, tales como la amplificación de “di-oligonucleótidos”, la amplificación isoterma (Walker, G.T. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 89: 392-396 (1992)), y la amplificación circular rotatoria (revisada en el documento 5.714.320).
Preferiblemente, se lleva a cabo la amplificación de ADN mediante PCR. La PCR de acuerdo con la presente invención y descripción pueden llevarse a cabo mediante encapsulamiento del ácido nucleico diana, ligado a una partícula, con una disolución PCR que comprende todos los reactivos necesarios para PCR. A continuación la PCR se puede llevar a cabo exponiendo la emulsión a cualquier régimen de termociclado adecuado conocido en la técnica. Preferiblemente se llevan a cabo entre 30 y 50 ciclos, preferiblemente aproximadamente 40 ciclos, de amplificación. Es deseable, aunque no necesario, que después del procedimiento de amplificación haya uno o más ciclos de hibridación y extensión después de los ciclos de amplificación. Preferiblemente, se llevan a cabo entre 10 y 30 ciclos, preferiblemente aproximadamente 25 ciclos, de hibridación y extensión (por ejemplo, como se describe en los ejemplos). De forma rutinaria el ADN plantilla se amplifica hasta típicamente al menos dos millones a cincuenta millones de copias, preferiblemente se inmovilizan aproximadamente de diez millones a treinta millones de copias del ADN plantilla por partícula.
Ruptura de la emulsión y recuperación de partículas
Después de la amplificación de la plantilla se “rompe” la emulsión (proceso denominado también en la técnica “demulsificación”). Existen muchos métodos de ruptura de una emulsión (véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU.
5.989.892 y las referencias citadas en la misma) y el especialista en la técnica sería capaz de seleccionar el método apropiado. En la presente descripción, un método preferido de ruptura de la emulsión es añadir aceite adicional para provocar que la emulsión se separe en dos fases. Entonces la fase aceite es retirada y se añade un disolvente orgánico adecuado (por ejemplo, hexanos). Tras mezclar, se elimina la fase aceite/disolvente orgánico. Esta etapa se puede repetir varias veces. Finalmente, las capas acuosas sobre las partículas son eliminadas. Entonces las partículas son lavadas con una mezcla de disolvente orgánico / tampón de maduración (por ejemplo, en los ejemplos se describe un tampón de maduración adecuado), y a continuación se vuelve a lavar en tampón de maduración. Los disolventes orgánicos adecuados incluyen alcoholes tales como metanol, etanol y similares.
Las partículas que contienen plantilla amplificada pueden entonces volver a ser suspendidas en disolución acuosa para uso, por ejemplo, en una reacción de secuenciamiento de acuerdo a tecnologías conocidas. (Véase Sanger, F. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75, 5463-5467 (1977); Maxam, A.M. & Gilbert, W. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 560-564 (1977); Ronaghi, M. y col., Science 281, 363-365 (1998); Lysov, I. y col., Dokl Akad Nauk SSSR 303, 15081511 (1988); Bains W. & Smith G.C. J. Theor. Biol. 135, 303-307 (1988); Drnanac, R. y col., Genomics 4, 114-128 (1989); Khrapko, K.R. y col., FEBS Lett 256, 118-122 (1989); Pevzner P.A. J. Biomol. Struct. Dyn. 7, 63-73 (1989); Southern, E.M. y col., Genomics 13, 1008-1017 (1992)). Si las partículas van a ser usadas en una reacción de secuenciamiento basada en pirofosfato (descrita, por ejemplo, en las Patentes de EE.UU. 6.274.320; 6.258.568 y 6.210.891) entonces es necesario eliminar la segunda cadena del producto de PCR y madurar un cebador de secuenciamiento a la plantilla de cadena sencilla que está ligada a la partícula.
Brevemente, la segunda cadena es eliminada por fusión usando una serie de métodos conocidos comúnmente tal como procesamiento con NaOH, fuerza iónica baja (por ejemplo, sal) o calor. Después de esta etapa de fusión, las partículas son peletizadas y el sobrenadante se desecha. Las partículas se vuelven a suspender en un tampón de maduración, se añade el cebador de secuenciamiento y se maduran con la plantilla de cadena sencilla unida a la partícula usando un ciclo de maduración estándar.
Purificación de partículas
En este punto, el ADN amplificado que está sobre la partícula se puede secuenciar bien directamente sobre la partícula o bien en un recipiente diferente. El ADN se puede secuenciar directamente sobre la partícula transfiriendo la partícula a un recipiente de reacción y sometiendo al ADN a una reacción de secuenciamiento (por ejemplo, secuenciamiento de pirofosfato o de Sanger). Alternativamente, las partículas se pueden aislar y el ADN se puede extraer de cada partícula y secuenciarse. En cualquier caso, las etapas de secuenciamiento se pueden llevar a cabo sobre cada partícula individual. Sin embargo, este método, aunque está disponible comercialmente y es técnicamente factible, puede no ser el más efectivo debido a que muchas de las partículas serán partículas
5 negativas (una partícula que no tiene un ADN amplificado unido a ella). Por consiguiente, se puede usar el siguiente método opcional para eliminar partículas que contienen plantilla de ácido nucleico antes de la distribución sobre la placa picotiter.
Un alto porcentaje de las partículas pueden ser “negativas” (es decir, no tienen plantilla de ácido nucleico amplificado unidas a ellas) si la meta de la unión de ADN inicial es minimizar las partículas con dos copias diferentes
10 de ADN. Para un secuenciamiento de pirofosfato útil, cada partícula debería contener múltiples copias de una única especie de ADN. Este requisito se logra con mayor precisión maximizando el número total de partículas con un único fragmento de ADN ligado (antes de la amplificación). Este objetivo se puede lograr mediante la observación de un modelo matemático.
Para el caso general de un número “N” de ADNs distribuidos aleatoriamente entre un número “M” de partículas, la
15 población de partículas relativa que contiene cualquier número de ADNs depende de la relación N/M. La fracción de partículas que contiene N ADNs R(N) se puede calcular usando la distribución de Poisson:
R(N) = exp-(N/M) X (N/M)N/N! (en donde X es el símbolo de multiplicación)
La tabla mostrada a continuación muestra algunos valores calculados para diversas N/M (el promedio de relación de fragmento de ADN a partícula) y N (el número de fragmentos que están ligados realmente a la partícula).
N/M
0,1 0,5 1 2
R(0)
0,9 0,61 0,37 0,13
R(1)
0,09 0,3 0,37 0,27
R(N>1)
0,005 0,09 0,26 0,59
20 En la tabla la fila superior denota las diversas relaciones de N/M. R(0) denota la fracción de partículas sin ADN, R(1) denota la fracción de partículas con un ADN ligado (antes de amplificación) y R(N>1) denota la fracción de ADN con más de un ADN ligado (antes de amplificación).
La tabla indica que la fracción máxima de partículas que contienen un fragmento individual de ADN es 0,37 (37%) y se da a una relación de fragmento a partícula de uno. En esta mezcla, aproximadamente el 63% de la partículas no
25 son útiles para el secuenciamiento debido a que no tienen ADN o tienen más de una especie individual de ADN. Adicionalmente, el control de la relación fragmento a partícula requiere cálculos complejos y la variabilidad podría producir lotes de partículas con una fracción significativamente más pequeña de partículas útiles.
Esta falta de eficacia podría paliarse significativamente si las partículas que contienen el producto de amplificación (originado en la unión de al menos un fragmento) pudiera separarse de las que no contienen el producto de 30 amplificación (originado por las partículas sin fragmento ligados). Se define un amplicón o producto de amplificación como cualesquier moléculas de ácido nucleico producidas mediante una técnica de amplificación nucleica in vitro. La unión se llevaría a cabo a relaciones promedio de fragmento-a-partícula bajas (N/M <1), minimizando la relación de partículas con más de un ADN ligado. Una etapa de separación eliminaría la mayoría o todas las partículas sin ADN dejando una población enriquecida de partículas con una especie de ADN amplificado. Estas partículas se pueden
35 aplicar a cualquier método de secuenciamiento tal como, por ejemplo, secuenciamiento de pirofosfato. Debido a que la fracción de partículas con un amplicón (N=1) ha sido enriquecida, cualquier método de secuenciamiento sería más eficaz.
Como ejemplo, con una relación media de fragmento a partícula de 0,1, el 90% de las partículas no tendrán amplicón, el 9% de las partículas serían útiles con un amplicón y el 0,5% de las partículas tendrán más de un
40 amplicón. Un proceso de enriquecimiento de la descripción eliminará el 90% de las partículas sin amplicón dejando una población de partículas en las que la fracción secuenciable (N=1) es:
1-(0,005/0,09)=94%.
La dilución de la mezcla de fragmento a partícula, junto con la separación de partículas que contienen amplicón, puede dar lugar a un enriquecimiento de 2,5 veces sobre el método no enriquecido óptimo. 94%/37% (véase la tabla 45 anterior para N/M=1) = 2,5. Un beneficio adicional del procedimiento de enriquecimiento de la descripción es que la fracción última de partículas secuenciables es relativamente insensible a la variabilidad de N/M. Por tanto, los cálculos de complejo para derivar la relación N/M óptima son innecesarios o pueden llevarse a cabo con un menor nivel de precisión. Esto hará definitivamente que el procedimiento sea más adecuado para ser llevado a cabo por personal menos entrenado o mediante automatización. Un beneficio adicional del procedimiento es que las 50 partículas sin amplicón pueden ser recirculadas y reusadas. Cuando la recirculación no es necesaria, se puede reducir el coste o la masa total de reactivos que hacen que el método de la invención sea más adecuado para
El procedimiento de enriquecimiento puede usarse para tratar partículas que han sido amplificadas en el método de emulsión de partículas descrito anteriormente. La amplificación se diseña de tal modo que cada molécula amplificada contenga la misma secuencia de ADN en su extremo 3’. La secuencia de nucleótidos puede tener una longitud de 20 meros, pero puede ser cualquier secuencia con una longitud de 15 bases o más, tal como 25 bases, 30 bases, 35 bases ó 40 bases, o más. Naturalmente, aunque los extremos de un oligonucleótido más largo son funcionales, no son necesarios. El especialista en la técnica puede introducir dicha secuencia de ADN en el extremo de un ADN amplificado. Por ejemplo, si se usa PCR para la amplificación del ADN, la secuencia puede ser parte de un miembro del par de cebadores de PCR.
En la Figura 7 se muestra un esquema del proceso de enriquecimiento. En ella, la partícula ligada a amplicón mezclada con 4 partículas vacías representa la mezcla de partículas de amplificación diluida-fragmentos. En la etapa 1, se madura con el amplicón un cebador biotinilado complementario al extremo 3’ del amplicón. En la etapa 2, se añade ADN polimerasa y los cuatro trifosfatos de desoxinucleótidos (dNTPs) naturales a la mezcla de partículas y se extiende el cebador biotinilado. Esta extensión es para potenciar la unión entre el cebador biotinilado y el ADN ligado a partícula. Esta etapa se puede omitir si el enlace cebador biotinilado – ADN es fuerte (por ejemplo, en un entorno altamente iónico). En la etapa 3, se introducen partículas recubiertas de estreptavidina susceptibles de atracción por un campo magnético (referidas en la presente memoria como “partículas de estreptavidina magnéticas”) en las mezclas de partículas. Las partículas magnéticas se encuentran disponibles comercialmente, por ejemplo, en Dynal (M290). Las funciones químicas de captura de estreptavidina se unen a biotinas hibridadas con los amplicones, que a continuación fija específicamente las partículas ligadas a amplicón a las partículas de estreptavidina magnéticas.
En la etapa 5, se aplica un campo magnético (representado por un imán) cerca de la mezcla de reacción, lo que provoca que todos los “complejos de partículas de estreptavidina magnéticas/partículas ligadas a amplicón” se posicionen en el lado del tubo más próximo al campo magnético. También es de esperar que las partículas magnéticas sin partículas ligadas a amplicón se posicionen en el mismo lado. Las partículas sin amplicones permanecen en disolución. La mezcla de partículas es lavada y las partículas no inmovilizadas por el imán (es decir, las partículas vacías) son retiradas y desechadas. En la etapa 6, la cadena de cebador biotinilado extendido se separa de la cadena de amplicón mediante “fusión” – una etapa que puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante calor o un cambio de pH. El calor puede ser 60ºC en condiciones de baja salinidad (por ejemplo, en un entorno iónico bajo tal como 0,1 X SSC). El cambio de pH puede obtenerse mediante la adición de NaOH. A continuación la mezcla se lava y el sobrenadante, que contiene las partículas ligadas a amplicón, se recupera mientras que las partículas magnéticas ahora no ligadas son retenidas por un campo magnético. Las partículas enriquecidas resultantes pueden usarse para secuenciamiento de ADN. Cabe destacar que el cebador sobre la partícula de captura de ADN puede ser el mismo cebador de la etapa 2 anterior. En este caso, la maduración de cadenas complementarias de amplicón-cebador (con o sin extensión) es la fuente de afinidad diana-captura.
El par biotina estreptavidina podría reemplazarse por una variedad de pares captura-diana. En condiciones que se pueden obtener en la práctica dos categorías de pares son aquellos cuya unión puede ser subsiguientemente anulada y los que se unen de manera irreversible. Los pares de unión reversible incluyen tiol-tiol, digoxigenin/antidigoxigenin, -CaptavidinTM si se desea la ruptura del complejo diana-captura.
Tal como se ha descrito anteriormente, la etapa 2 es opcional. Si se omite la etapa 2, puede no ser necesario separar las partículas magnéticas de las partículas unidas a amplicón. Las partículas unidas a amplicón, con las partículas magnéticas pegadas, pueden usarse directamente para el secuenciamiento. Si el secuenciamiento se va a llevar a cabo en un micropocillo, la separación no sería necesaria si el complejo de partícula ligada a amplicónpartícula magnética puede caber en el interior del micropocillo.
Aunque el uso de partículas de captura magnética es conveniente, los restos funcionales de captura se pueden ligar a otras superficies. Por ejemplo, la estreptavidina podría ligarse químicamente a una superficie, tal como la superficie interior de un tubo. En este caso, la mezcla de partículas amplificadas se puede hacer fluir a su través. Las partículas ligadas a amplicón tenderán a ser retenidas hasta “fusión” mientras que las partículas vacías fluirán a su través. Esta disposición puede ser particularmente ventajosa para la automatización del proceso de preparación de partículas.
Aunque la descripción anterior es particularmente útil, se pueden considerar otros métodos para separar partículas. Por ejemplo, las partículas de captura pueden ser marcadas con un resto fluorescente que podría hacer que el complejo diana-partícula de captura fuese fluorescente. El complejo diana-partícula de captura puede separarse mediante citometría de flujo o mediante clasificación de célula de fluorescencia. El uso de partículas de captura grandes permitiría la separación mediante filtración u otras técnicas de separación por tamaño de partícula. Puesto que las partículas de captura y de diana son capaces de formar complejos con una serie de partículas adicionales, es posible aglutinar una masa reticulada de partículas captura-diana. El tamaño grande de la masa aglutinada haría posible la separación mediante un simple lavado de las partículas vacías no aglutinadas. Los métodos descritos se describen con más detalle en, por ejemplo, Bauer, J.; J. Chromatography B, 722 (1999) 55-69 y en Brody y col.,
Las partículas de captura de ADN que contienen cada una copias múltiples de una única especie de ácido nucleico plantilla preparadas de acuerdo con el anterior método son entonces adecuadas para su distribución sobre la placa picotiter.
5 Amplificación de ácido nucleico sobre la placa Picotiter
Alternativamente, la plantilla de ácido nucleico se distribuye sobre la placa picotiter antes de la amplificación y a continuación se amplifica in situ sobre la placa picotiter. Este método se describe en detalle en los Ejemplos.
3. SECUENCIAMIENTO DE LA PLANTILLA DE ÁCIDO NUCLEICO
Se usa secuenciamiento de pirofosfato de acuerdo con los métodos de esta invención y descripción para secuenciar
10 la plantilla de ácido nucleico. Esta técnica está basada en la detección de pirofosfato (Ppi) liberado durante la síntesis de ADN. Véase, por ejemplo, Hyman, 1988. “A new method of sequencing DNA”. Anal Biochem. 174: 42336; Ronaghi, 2001. “Pyrosequencing sheds light on DNA sequencing”. Genome Res. 11: 3-11.
En una cascada de reacciones enzimáticas se genera luz visible proporcionalmente al número de nucleótidos incorporados. La cascada comienza con una reacción de polimerización de ácido nucleico en la que se libera Ppi
15 inorgánico con la incorporación de nucleótidos por polimerasa. El Ppi liberado se convierte en ATP mediante ATP sulfurilasa, lo que proporciona la energía a la luciferasa para oxidar luciferina y generar luz. Debido a que se conoce el nucleótido añadido, se puede determinar la secuencia de la plantilla. El secuenciamiento de pirofosfato en fase sólida utiliza ADN inmovilizado en un sistema de tres enzimas (ver las Figuras). Para aumentar la relación señalruido, la dATP natural ha sido reemplazada por dATPaS. Típicamente, dATPaS es una mezcla de dos isómeros (sp
20 y Rp); el uso de 2’-desoxiadenosina-5’-O’-(1-tiotrifosfato)-Sp-isómero puro en el secuenciamiento de pirofosfato permite lecturas sustancialmente más largas, hasta doblar la longitud de lectura.
4. APARATO PARA EL SECUENCIAMIENTO DE ÁCIDOS NUCLEICOS
Esta descripción proporciona un aparato para el secuenciamiento de ácidos nucleicos, que generalmente comprende una o más cámaras de reacción para llevar a cabo una reacción de secuenciamiento, los medios para
25 administrar reactivos hacia y desde la(s) cámara(s) de reacción, y los medios para detectar un evento de reacción de secuenciamiento. El aparato puede incluir una cubeta de administración de reactivo que contiene una pluralidad de cavidades en una superficie plana. Preferiblemente, el aparato está conectado a al menos un ordenador para controlar los componentes individuales del aparato y para almacenar y/o analizar la información obtenida a partir de la detección del evento de reacción de secuenciamiento.
30 La descripción también proporciona una o más cámaras de reacción dispuestas en un material sustrato inerte, también denominado en la presente memoria “soporte sólido”, que permite la localización discreta de la plantilla de ácido nucleico y de los reactivos en una reacción de secuenciamiento en un espacio definido, así como la detección del evento de reacción de secuenciamiento. Por tanto, tal como se usan en la presente memoria, las expresiones “cámara de reacción” o “cámara de reacción de analito” se refieren a un área localizada sobre el material sustrato
35 que facilita la interacción de reactivos, por ejemplo, en una reacción de secuenciamiento de ácido nucleico. Tal como se discute con mayor detenimiento más adelante, las reacciones de secuenciamiento contempladas en la presente memoria se producen preferiblemente sobre numerosas muestras de ácido nucleico individuales en tándem, en particular secuenciando simultáneamente numerosas muestras de ácido nucleico derivadas de plantillas de ácido nucleico genómico y cromosomal (por ejemplo, ADN).
40 Por lo tanto, el aparato de la descripción comprende preferiblemente un número suficiente de cámaras de reacción para llevar a cabo dichas numerosas reacciones de secuenciamiento individuales. Puede haber al menos 10.000 cámaras de reacción, preferiblemente al menos 50.000 cámaras de reacción, más preferiblemente más de 100.000 cámaras de reacción, incluso más preferiblemente más de 200.000 cámaras de reacción.
Puesto que el número de reacciones de secuenciamiento simultáneas está limitado por el número de cámaras de
45 reacción, la producción puede aumentarse fabricando placas que contengan mayores densidades de pocillos. La tabla presentada a continuación muestra esta progresión para áreas activas de 14 x 43 mm y 30 x 60 mm, derivadas de sistemas de 25 x 75 mm y 40 x 75 mm, respectivamente.
Tabla: Desarrollo de sistemas con un mayor número de pocillos.
Agujero Pocillo Nº de pocillos Nº de pocillos
(μm) Diámetro (μm) (14 x 43 mm) (30 x 60 mm)
50 44 275K 800K
43 38 375K 1,2M
35 31 575K 1,6M
Las cámaras de reacción sobre el sistema normalmente adoptan la forma de una cavidad o pocillo en el material sustrato, que tiene una anchura y profundidad, en el cual se pueden depositar los reactivos. Típicamente, la plantilla de ácido nucleico se distribuye en la cámara de reacción en uno o más soportes sólidos o partículas; los reactivos están en un medio que facilita la reacción y que fluye a través de la cámara de reacción. Cuando se forman como cavidades o pocillos, las cámaras preferiblemente tienen una dimensión suficiente a fin de permitir (i) la introducción de los reactivos necesarios en las cámaras, (ii) que las reacciones tengan lugar dentro de la cámara, y (iii) la inhibición de la mezcla de reactivos entre cámaras. La forma del pocillo o cavidad es preferiblemente circular o cilíndrica, pero pueden tener múltiples lados para aproximarse a una forma circular o cilíndrica. Preferiblemente, la forma del pocillo o cavidad es sustancialmente hexagonal. La cavidad puede tener una superficie de pared lisa.
La cavidad puede tener al menos una superficie de pared irregular. Las cavidades pueden tener un fondo plano o un fondo cóncavo.
Las cámaras de reacción se pueden espaciar entre 5 μm y 200 μm. El espaciamiento se determina midiendo la distancia de centro a centro entro dos cámaras de reacción adyacentes. Típicamente, las cámaras de reacción pueden espaciarse entre 10 μm y 150 μm, preferiblemente entre 20 μm y 100 μm, lo más preferiblemente entre 40 μm y 60 μm. Las cámaras de reacción pueden tener una anchura (diámetro) en una dimensión de entre 0,3 μm y 100 μm, más preferiblemente entre 20 μm y 70 μm y aún más preferiblemente entre aproximadamente 30 μm y 50 μm. La profundidad de las cámaras de reacción está preferiblemente entre 10 μm y 100 μm, preferiblemente entre 20 μm y 60 μm. Alternativamente, las cámaras de reacción pueden tener una profundidad que está entre 0,25 y 5 veces la anchura en una dimensión de la cámara de reacción o, alternativamente, entre 0,3 y 1 vez la anchura en una dimensión de la cámara de reacción.
El sistema puede diseñarse a partir de un haz de fibra óptica cortado (es decir, un haz de cables de fibra óptica fusionada) y las cámaras de reacción se forman grabando una superficie del sistema de reactor de fibra óptica. Las cavidades también se pueden formar en el sustrato mediante grabado, moldeo o micromaquinado.
Cada cavidad o cámara de reacción tiene típicamente una profundidad de entre 10 μm y 100 μm; alternativamente la profundidad está entre 0,25 y 5 veces el tamaño de la anchura de la cavidad, preferiblemente entre 0,3 y 1 veces el tamaño de la cavidad.
Los sistemas descritos en la presente memoria incluyen típicamente una superficie plana superior y una superficie plana de fondo, que opcionalmente es conductora de tal modo que las señales de las cámaras de reacción se puedan detectar a través de la superficie plana del fondo. En estos sistemas, típicamente la distancia entre la superficie superior y la superficie inferior no es superior a 10 cm, preferiblemente no es superior a 2 cm, y habitualmente está entre 0,5 mm y 5 mm, lo más preferiblemente aproximadamente 2 mm.
Preferiblemente, el soporte sólido se denomina placa picotiter, con cámaras de reacción que tienen un espaciado de centro a centro de aproximadamente 43 μm a 50 μm, un diámetro de pocillo de entre 38 μm y 44 μm, y un volumen de pocillo de entre 10 y 150 pL, preferiblemente de entre 20 y 90 pL, más preferiblemente de entre 40 y 85 pL, y lo más preferiblemente de aproximadamente 75 pL.
Cada cavidad o cámara de reacción del sistema puede contener reactivos para analizar un ácido nucleico o proteína. Típicamente las cámaras de reacción que contengan un ácido nucleico (no todas las cámaras de reacción del sistema son requeridas) contienen una única especie de ácido nucleico (es decir, una secuencia única que es de interés). Puede existir una única copia de esta especie de ácido nucleico en cualquier cámara de reacción particular,
o pueden existir copias múltiples. Generalmente se prefiere que una cámara de reacción contenga al menos 100.000 copias de la secuencia plantilla de ácido nucleico, preferiblemente al menos 1.000.000 de copias, y más preferiblemente entre 2.000.000 y 20.000.000 de copias, y lo más preferiblemente entre 5.000.000 y 15.000.000 copias del ácido nucleico. El especialista en la técnica apreciará que los cambios en el número de copias de una especie de ácido nucleico en una cámara de reacción cualquiera afectarán al número de fotones generados en una reacción de pirosecuenciamiento, y se pueden ajustar de forma rutinaria para proporcionar más o menos señal fotónica según se requiera. Las especies de ácido nucleico pueden amplificarse para proporcionar el número deseado de copias usando PCR, RCA, reacción en cadena de ligasa, otra amplificación isoterma, u otros medios convencionales de amplificación de ácido nucleico. El ácido nucleico puede ser de cadena sencilla.
Material soporte sólido
Se puede usar cualquier material soporte sólido, siempre que la superficie permita una unión estable de los cebadores y la detección de secuencias de ácido nucleico. El material soporte sólido puede ser plano o puede presentar cavidades, por ejemplo, un extremo con cavidades de una fibra óptica o un micropocillo grabado, moldeado o micromaquinado de cualquier otra manera en una superficie plana, por ejemplo, usando técnicas usadas habitualmente en la fabricación de sistemas microelectromecánicos. Véase, por ejemplo, Rai-Choudhury, HANDBOOK OF MICROLITHOGRAPHY, MICROMACHINING, AND MICROFABRICATION, VOLUME I: MICROLITHOGRAPHY, Volumen PM39, SPIE Press (1997); Madou, CRC Press (1997), Aoki, Biotech. Histochem.
67: 98-9 (1992); Kane y col., Biomaterials. 20: 2363-76 (1999); Deng y col., Anal. Chem. 72: 3176-80 (2000); Zhu y col., Nat. Genet. 26: 283-9 (2000). El soporte sólido puede ser ópticamente transparente, por ejemplo vidrio.
Se puede construir un sistema de sitios de unión sobre un soporte sólido ópticamente transparente usando técnicas litográficas usadas habitualmente en la fabricación de circuitos electrónicos integrados, tal como se describe en, por ejemplo, en las técnicas de unión descritas en las Patentes de EE.UU. Nº 5.143.854, 5.445.934, 5.744.305 y 5.800.992; Chee y col., Science 274: 610-614 (1996); Fodor y col., Nature 364: 555-556 (1993); Fodor y col., Science 251: 767-773 (1991); Gushin y col., Anal. Biochem. 250: 203-211 (1997); Kinosita y col., Cell 93: 21-24 (1998); Kato-Yamada y col., J. Biol. Chem. 273: 19375-19377 (1988); y Yasuda y col., Cell 93: 1117-1124 (1998). La fotolitografía y la litografía de haz de electrones sensibilizan el soporte o sustrato sólido con un grupo ligando que permite la unión de una biomolécula modificada (por ejemplo, proteínas o ácidos nucleicos). Véase, por ejemplo, Service, Science 283: 27-28 (1999); Rai-Choudhury, HANDBOOK OF MICROLITHOGRAPHY, MICROMACHINING, AND MICROFABRICATION, VOLUME I: MICROLITHOGRAPHY, Volumen PM39, SPIE Press (1997). Alternativamente, se pueden generar sitios sensibilizados usando tecnología de película fina como la descrita en Zasadzinski y col., Science 263: 1726-1733 (1994).
El material sustrato se fabrica preferiblemente en un material que facilite la detección del evento de reacción. Por ejemplo, en una reacción de secuenciamiento típica, se puede monitorizar la unión de un dNTP a una muestra de ácido nucleico que va a ser secuenciada mediante la detección de los fotones generados por acción enzimática sobre el fosfato liberado en una reacción de secuenciamiento. Por tanto, fabricar el material sustrato en un material transparente o conductor de la luz facilita la detección de los fotones.
El soporte sólido se puede acoplar a un haz de fibras ópticas que se usan para detectar y transmitir la luz producida. El número total de fibras ópticas dentro del haz puede variar para adaptarse al número de cámaras de reacción individuales en el sistema utilizado en la reacción de secuenciamiento. El número de fibras ópticas incorporadas al haz se diseña para adaptarse a la resolución de un dispositivo de detección de tal modo que permita una generación de imágenes 1:1. Los tamaños generales de los haces se eligen de tal modo que optimicen el área utilizable del dispositivo de detección a la vez que mantienen las características de reactivo (flujo) deseables en la cámara de reacción. Por tanto, para un sistema CCD (dispositivo de carga acoplada) de 4096 x 4096 píxeles con píxeles de 15 μm, el haz de fibras se elige para que sea aproximadamente de 60 mm x 60 mm o para que tenga un diámetro de aproximadamente 90 mm. El número deseado de fibras ópticas se fusiona inicialmente en un haz o conjunto de fibras ópticas, cuyo extremo puede contarse y pulirse de tal modo que forme una “torta” del espesor requerido (por ejemplo, 1,5 mm). Las tortas de fibra óptica resultantes poseen propiedades de manejo similares a las de un vidrio plano. Las fibras individuales pueden tener cualquier tamaño de diámetro (por ejemplo, de 3 μm a 100 μm).
Se pueden usar dos haces de fibra óptica: un primer haz se une directamente al dispositivo de detección (también denominado en la presente memoria haz de fibras o conector) y un segundo haz se usa como sustrato de cámara de reacción (la torta o sustrato). En este caso los dos se colocan en contacto directo, opcionalmente con el uso de un fluido de acoplamiento óptico, con el objetivo de generar imágenes de los centros de reacción sobre el dispositivo de detección. Si se usa un CCD como dispositivo de detección, la torta podría ser ligeramente más grande a fin de maximizar el uso del área de CCD, o ligeramente más pequeña a fin de adaptarse al formato de un portaobjetos de microscopio típico – 25 mm x 75 mm. Los diámetros de las fibras individuales dentro de los haces se seleccionan de tal modo que se maximice la probabilidad de que una reacción individual genere una imagen sobre un píxel individual del dispositivo de detección, dentro de las limitaciones del estado de la técnica. Los ejemplos de diámetros están entre 6 y 8 μm para el haz de fibras y entre 6 y 50 μm para la torta, aunque se puede usar cualquier diámetro en el intervalo de 3 a 100 μm. Se pueden obtener haces de fibras comercialmente de fabricantes de cámaras CCD. Por ejemplo, la torta se puede obtener de Incorn, Inc. (Charlton, MA) y cortarse y pulirse a partir de una fusión grande de fibras ópticas, normalmente de un espesor de 2 mm, aunque posiblemente entre 0,5 y 5 mm de espesor. La torta tiene propiedades de manejo similares a una lámina de vidrio o un portaobjetos de microscopio de vidrio.
Las cámaras de reacción se pueden formar en el sustrato fabricado en material de fibra óptica. Se generan cavidades en la superficie de la fibra óptica tratando los extremos de un haz de fibras, por ejemplo, con ácido para formar un indentación en el material de fibra óptica. De este modo se pueden formar cavidades a partir un haz de fibras ópticas, preferiblemente se pueden formar cavidades mediante grabado de un extremo del haz de fibras ópticas. Cada superficie con cavidades puede formar una cámara de reacción. Dichos sistemas se denominan en la presente memoria sistemas de reactor de fibra óptica o FORA. La indentación oscila en profundidad entre aproximadamente la mitad del diámetro de una fibra óptica individual y hasta dos o tres veces el diámetro de la fibra. Las cavidades se pueden introducir en los extremos de las fibras colocando un lado de la torta de fibra óptica en un baño de ácido durante un periodo de tiempo variable. La cantidad de tiempo puede variar dependiendo de la profundidad global de la cavidad de reacción deseada (véase, por ejemplo, Walt y col., 1996. Anal. Chem. 70: 1988). Una cavidad de canal amplia puede tener unas dimensiones de velocidad de flujo uniforme de aproximadamente 14 mm x 13 mm. Por tanto, con esta dimensión aproximada y con una densidad de aproximadamente 4,82 x 10-4 cavidades/μm2, el aparato puede tener aproximadamente 290.000 cavidades accesibles para el fluido. En la técnica se conocen varios métodos para unir moléculas (y detectar las moléculas unidas) en las cavidades grabadas en los extremos de los haces de fibra óptica. Véase, por ejemplo, Michael y col., Anal. Chem. 70: 1242-1248 (1998); Ferguson y col., Nature Biotechnology 14: 1681-1684 (1996); Healey y Walt, Anal. Chem. 69: 2213-2216 (1997). También se puede crear una estructura de sitios reactivos en el micropocillo, usando técnicas fotolitográficas El lado opuesto de la torta de fibra óptica (es decir, el lado no grabado) habitualmente está altamente pulido de tal modo que permita el acoplamiento óptico (por ejemplo, mediante aceite de inmersión u otros fluidos de acoplamiento óptico) a un segundo lazo de fibra óptica. Este segundo lazo de fibra óptica se adapta exactamente al diámetro de la torta óptica que contiene las cámaras de reacción, y sirve para actuar como conducto para la transmisión del producto lumínico hasta el dispositivo de detección unido, tal como un sistema de imágenes o una cámara CCD.
Preferiblemente, la torta de fibra óptica se limpia concienzudamente, por ejemplo mediante lavados en serie con H2O2 al 15%/NH4OH al 15% en volumen:volumen en disolución acuosa, a continuación con seis aclarados con agua desionizada, después EDTA 0,5M, después seis veces con agua desionizada, entonces H2O2 al 15%/NH4OH al 15%, después seis veces con agua desionizada (incubaciones de media hora en cada lavado).
La superficie de la torta de fibra óptica preferiblemente se recubre para facilitar su uso en las reacciones de secuenciamiento. Una superficie recubierta preferiblemente es ópticamente transparente, permite una unión fácil de proteínas y ácidos nucleicos, y no afecta de forma negativa a la actividad de las proteínas inmovilizadas. Adicionalmente, la superficie preferiblemente minimiza la absorción no específica de macromoléculas y aumenta la estabilidad de macromoléculas ligadas (por ejemplo, ácidos nucleicos y proteínas unidos).
Los materiales adecuados para recubrir el sistema incluyen, por ejemplo, plástico (por ejemplo poliestireno). El plástico puede estar preferiblemente recubierto por giro o escupido (espesor de 0,1 μm). Otros materiales para recubrir el sistema incluyen capas de oro, por ejemplo oro de 24 quilates, 0,1 μm de espesor, con monocapas autoensambladas adsorbidas de tioalcanos de cadena larga. Entonces se acopla covalentemente biotina a la superficie y se satura con una proteína de unión a biotina (por ejemplo, estreptavidina o avidina).
Los materiales de recubrimiento pueden incluir adicionalmente los sistemas usados para unir un cebador ancla a un sustrato. Para recubrir el sistema también se pueden usar reactivos de organosilanos, que permiten el acoplamiento covalente directo de proteínas a través de grupos amino, sulfhidrilo o carboxilo. Otras sustancias de recubrimiento adicionales incluyen ligandos fotorreactivos, por ejemplo fotobiotina (Amos y col., “Biomaterial Surface Modification Using Photochemical Coupling Technology”, en Encyclopedic Handbook of Biomaterials and Bioengineering, Part A: Materials, Wise y col. (editores), Nueva York, Marcel Dekker, páginas 895926, 1995).
Otros materiales de recubrimiento adicionales incluyen geles poliméricos hidrofílicos (poliacrilamida, polisacáridos), que preferiblemente se polimerizan directamente sobre la superficie o cadenas poliméricas unidas covalentemente tras la polimerización (Hjerten, J. Chromatogr. 347, 191 (1985); Novotny, Anal. Chem. 62, 2478 (1990), así como los polímeros pluronic (copolímeros tribloque, por ejemplo PPO-PEO-PPO, también conocido como F-108), adsorbido específicamente sobre superficies de poliestireno o de vidrio silanizado (Ho y col., Langmuir 14: 3889-94, 1998), así como capas adsorbidas pasivamente de proteínas de unión a biotina. La superficie también puede estar recubierta con un epóxido que permita el acoplamiento de reactivos a través de un enlace de amina.
Adicionalmente, cualquiera de los anteriores materiales puede derivatizarse con uno o más grupos funcionales, conocidos comúnmente en la técnica para la inmovilización de enzimas y nucleótidos, por ejemplo grupos quelantes de metales (por ejemplo, ácido nitrilotriacético, ácido iminodiacético, quelante de pentadentato), que se unirán a proteínas y ácidos nucleicos marcados con 6xHis.
Se pueden usar recubrimientos superficiales que aumenten el número de sitios de unión disponibles para tratamientos posteriores, por ejemplo la unión de enzimas (discutido más adelante), más allá de la capacidad de unión teórica de una superficie 2D.
Preferiblemente, las fibras ópticas individuales utilizadas para genera el haz/torta de fibra óptica fusionada tienen un diámetro mayor (es decir, de 6 μm a 12 μm) que las utilizadas en los sistemas de generación de imágenes ópticas (es decir, 3 μm). Por tanto, es pueden utilizar varias de las fibras de generación de imágenes ópticas para obtener la imagen de un único sitio de reacción.
Preferiblemente, el cartucho de muestra para el secuenciamiento de plantilla de ácido nucleico, denominado “placa PicoTiter” está formado a partir de una placa frontal de fibra óptica comercial, grabada con ácido para producir estructuras de pocillos. Cada núcleo de fibra óptica tiene aproximadamente 44 micras de diámetro, con un revestimiento de 2-3 micras, cada pocillo formado mediante grabado con ácido para formar un volumen de pocillo de reacción de aproximadamente 65 pL a 85 pL, lo más preferiblemente de aproximadamente 75 pL. El uso de pocillos grabados sobre la superficie de la placa frontal de fibra óptica sirve a triple propósito; i) retrasar la difusión de la luminiscencia para emitir luz en una región diferente a la del sistema, ii) aislar las cámaras de reacción (“tubos de ensayo”) que contienen las moléculas de plantilla amplificadas, y iii) un acoplamiento óptico de apertura a la CCD altamente numérico y muy eficiente. Finalmente, cuanto mayor sea la cantidad de plantilla de secuenciamiento inmovilizada dentro de un pocillo, mayor es la señal óptica que es capaz de lograr.
Medio de administración
Un ejemplo de los medios de administración de reactivos a la cámara de reacción es la cámara de perfusión de la presente invención ilustrada en la Figura 13. La cámara de perfusión incluye un compartimento sellado con lados superior e inferior transparentes. Se diseña para permitir el flujo de disolución a través de la superficie del sustrato y para permitir un rápido intercambio de reactivos. Por tanto, es adecuado para llevar a cabo, por ejemplo, las reacciones de secuenciamiento de pirofosfato. La forma y las dimensiones de la cámara se pueden ajustar para optimizar el intercambio de reactivos para incluir el intercambio de flujo en masa, el intercambio difusivo, o ambos tanto en régimen de flujo laminar como turbulento.
La cámara de perfusión se separa preferiblemente del sistema de imagen cuando se está preparando y solo se coloca sobre el sistema de imagen cuando se lleva a cabo el análisis de secuenciamiento. El soporte sólido (es decir, un chip de ADN o un portaobjetos de vidrio) puede mantenerse en su sitio mediante una sujeción metálica o de plástico, que puede montarse o desmontarse para permitir la sustitución de dicho soporte sólido. El lado inferior del soporte sólido de la cámara de perfusión lleva el sistema de cámaras de reacción y, con un sistema focal tradicional basado en óptica, se usa un elevado número de lentes de objetivo de apertura para enfocar la imagen del sistema de centro de reacción sobre el sistema de imagen CCD.
De este modo se pueden analizar en paralelo muchas muestras. Usando los métodos de la invención y descripción, se pueden analizar muchas plantillas de ácido nucleico de esta forma permitiendo que la disolución que contiene las enzimas y un nucleótido fluya sobre la superficie y a continuación detectando la señal producida por cada muestra. Este procedimiento se puede repetir entonces. Alternativamente, se pueden distribuir varios oligonucleótidos diferentes complementarios a la plantilla sobre la superficie, seguidos de la hibridación de la plantilla. La incorporación de desoxinucleótidos o didesoxinucleótidos se puede monitorizar para cada oligonucleótido a través de la señal producida usando los diversos oligonucleótidos como cebador. Combinando las señales procedentes de diferentes áreas de la superficie, se pueden llevar a cabo análisis basados en secuencia mediante cuatro ciclos de reacciones de polimerasa usando los diversos didesoxinucleótidos.
Cuando el soporte se encuentra en la forma de un sistema con cavidades, por ejemplo, en los extremos de una placa picotiter u otro sistema de micropocillos, los sistemas de administración de reactivos adecuados incluyen el flujo y el lavado y también, por ejemplo, flujo, pulverización, electropulverización, administración por chorro de tinta, sellado, atomización ultrasónica (Sonotek Corp., Milton, NY) y rodillo. Cuando se usa la pulverización, los reactivos se pueden suministrar a la placa picotiter en una capa fina homogénea producida mediante boquillas de pulverización de tipo industrial (Spraying Systems, Co., Wheaton, IL) o atomizadores usados en cromatografía de capa fina (TLC, del inglés “thin layer chromatography”), tales como CAMAG TLC Sprayer (Camag Scientific Inc., Wilmington, NC). Estos pulverizadores atomizan reactivos en partículas pulverizadas de aerosol en el intervalo de tamaños de 0,3 a 10 μm.
Las sucesivas etapas de administración de reactivo se separan preferiblemente mediante etapas de lavado que usan técnicas conocidas comúnmente en la técnica. Dichos lavados se pueden llevar a cabo, por ejemplo, usando los métodos descritos anteriormente, que incluyen pulverizadores de alto flujo o mediante flujo líquido sobre la placa picotiter o la superficie del sistema de micropocillos. Los lavados se pueden producir en cualquier periodo de tiempo después de que el material de partida haya reaccionado con el reactivo para formar un producto en cada cámara de reacción, pero antes de que el reactivo suministrado a cada una de las cámaras de reacción se haya difundido fuera de la cámara de reacción hacia cualquier otra cámara de reacción. Cualquier cámara de reacción es independiente del producto formado en cualquier otra cámara de reacción, pero se genera usando uno o más reactivos comunes.
Un aparato completo se ilustra en la Figura 12. El aparato incluye un conducto de entrada 200 comunicado con una cámara de perfusión desmontable 226. El conducto de entrada 200 permite la entrada de los reactivos de secuenciamiento a través de una pluralidad de tubos 202-212, que están comunicados con una pluralidad de recipientes de dispensación de reactivos de secuenciamiento 214-224.
Los reactivos se introducen a través del conducto 200 en la cámara de perfusión 226 usando un sistema presurizado
o bombas de desplazamiento positivo. Típicamente, los caudales son de 0,05 a 50 mL/minuto (por ejemplo, de 1 a 50 mL/min) con volúmenes de 0,100 mL hasta flujo continuo (para lavado). Las válvulas se controlar por ordenador para permitir un ciclo de nucleótidos y reactivos de lavado. Los reactivos de secuenciamiento, por ejemplo, la polimerasa, pueden pre-mezclarse con los nucleótidos o se pueden añadir en línea. Un colector recoge los seis tubos 202-212 en un conducto para la entrada a la cámara de perfusión. Por tanto, varios puertos de administración de reactivos permiten el acceso a la cámara de perfusión. Por ejemplo, uno de los puertos puede utilizarse para permitir la entrada de los reactivos de secuenciamiento acuosos, mientras que otro puerto permite que dichos reactivos (y cualquier producto de reacción) sea retirado de la cámara de perfusión.
Preferiblemente, se suministra uno o más reactivos a un sistema inmovilizado o unido a una población de soportes sólidos móviles, por ejemplo, una partícula o microesfera. La partícula o microesfera no tiene porqué ser esférica, también se pueden usar partículas de forma irregular. Típicamente se construyen a partir de numerosas sustancias, por ejemplo, plástico, vidrio o cerámica y los tamaños de partícula oscilan desde nanómetros a milímetros dependiendo de la anchura de la cámara de reacción. Se pueden usar varias químicas de partículas, por ejemplo, metilestireno, poliestireno, polímero acrílico, látex, paramagnético, disolución de óxido de torio, carbono grafito y dióxido de titanio. La construcción o la química de la partícula se pueden elegir para facilitar la unión del reactivo Los agentes bioactivos se pueden sintetizar en primer lugar y a continuación se unen covalentemente a las partículas. Como apreciará el especialista en la técnica, esto se hará dependiendo de la composición de los agentes bioactivos y de las partículas. La funcionalización de las superficies de soporte sólido tales como determinados polímeros con grupos químicamente reactivos tales como tioles, aminas, carboxilos, etc., generalmente es conocida en la técnica.
Preferiblemente, la plantilla de ácido nucleico se suministra a la placa picotiter sobre las partículas. Igualmente, las enzimas luciferasa y sulfurilasa se suministran a cada pocillo sobre partículas (véase la Figura), al igual que la ADN polimerasa. Cabe destacar que la plantilla, una o más, de ácido nucleico, la luciferasa y la sulfurilasa se pueden suministrar sobre partículas separadas, o juntas sobre la misma partícula. Para permitir el secuenciamiento de ADN a altas temperaturas, hemos clonado y modificado la sulfurilasa termoestable de Bacillus steareothermophilus. También hemos clonado y modificado varias enzimas de luciferasa para mejorar la actividad enzimática en fase sólida, que incluyen la de P. pennsylvanica y la de P. pyralis. Preferiblemente se usa la luciferasa de P. pyralis.
Se pueden usar partículas de “blanco” que tengan una química superficial que facilite la unión de la funcionalidad deseada por el usuario. Los ejemplos adicionales de estas químicas superficiales para partículas blanco incluyen, aunque sin limitación, grupos amino que incluyen aminas alifáticas y aromáticas, ácidos carboxílicos, aldehídos, amidas, grupos clorometilo, hidrazide, grupos hidroxilo, sulfonatos y sulfatos.
Estos grupos funcionales se pueden usar para añadir cualquier número de diferentes agentes candidatos a las partículas, generalmente usando químicas conocidas. Por ejemplo, se pueden unir agentes candidatos que contengan carbohidratos a un soporte funcionalizado con grupos amino, el aldehído del carbohidrato se prepara usando técnicas estandarizadas, y a continuación se hace reaccionar el aldehído con un grupo amino de la superficie. Alternativamente, se puede usar un ligando de sulfhidrilo. Existe una serie de ligandos reactivos de sulfhidrilo conocidos en la técnica, tal como SPDP, maleimidas, a-haloacetilos y disulfuros de piridilo (véase, por ejemplo, el catálogo de 1994 de Pierce Chemical Company, sección técnica sobre reticulantes, páginas 155-200) que pueden usarse para unir agentes proteínicos que contengan cisteína al soporte. Alternativamente, se puede usar un grupo amino del agente candidato para la unión a un grupo amino de la superficie. Por ejemplo, en la técnica se conoce un gran número de grupos bifuncionales estables, que incluyen ligandos homobifuncionales y heterobifuncionales (véase Pierce Catalog and Handbook, páginas 155-200). Los grupos carboxilo (tanto de la superficie como del agente candidato) pueden derivatizarse usando ligandos bien conocidos (véase el catálogo Pierce). Por ejemplo, las carbodiimidas activan grupos carboxilo para el ataque por buenos nucleófilos tales como las aminas (véase Tochilin y col., Critical Rev. Therapeutic Drug Carrier Systems, 7(4): 275-308 (1991)). También se pueden unir agentes candidatos proteínicos usando otras técnicas conocidas en la técnica, por ejemplo para la unión de anticuerpos a polímeros; véase Slinkin y col., Bioconj. Chem. 2: 342-348 (1991); Torchilin y col., ver más arriba; Trubetskoy y col., Bioconj. Chem. 3: 323-327 (1992); King y col., Cancer Res. 54: 6176-6185 (1994); y Wilbur y col., Bioconjugate Chem. 5: 220-235 (1994). Debe entenderse que los agentes candidatos pueden unirse en una variedad de formas, que incluyen aquellas enumeradas antes. Preferiblemente, la manera de unión no altera significativamente la funcionalidad del agente candidato; es decir, el agente candidato debería estar unido de un modo flexible que permita su interacción con una diana.
Las técnicas específicas para inmovilizar enzimas sobre partículas se conocen en la técnica anterior. En un caso se usan partículas de química superficial de NH2. La activación superficial se logra con un 2,5% de glutaraldehído en disolución salina tamponada de fosfato (10 mM) que proporciona un pH de 6,9 (NaCl 138 mM, KCl 2,7 mM). Esta mezcla se agita sobre un lecho agitado durante aproximadamente 2 horas a temperatura ambiente. A continuación las partículas se enjuagan con agua ultrapura más 0,01% de Tween 20 (tensioactivo)-0,02%, y se aclara de nuevo con un PBS de pH 7,7 más 0,01% de Tween 20. Finalmente, se añade la enzima a la disolución, preferiblemente después de ser prefiltrada usando un filtro Amicon Micropure de 0,45 μm.
La población de soportes sólidos móviles se dispone en las cámaras de reacción. Del 5% al 20% de las cámaras de reacción pueden tener un soporte sólido móvil con al menos un reactivo inmovilizado sobre él, del 20% al 60% de las cámaras de reacción pueden tener un soporte sólido móvil con al menos un reactivo inmovilizado sobre él, o del 50% al 100% de las cámaras de reacción pueden tener un soporte sólido móvil con al menos un reactivo inmovilizado sobre él Preferiblemente, al menos una cámara de reacción tiene un soporte sólido móvil que tiene al menos un reactivo inmovilizado sobre él, y el reactivo es adecuado para uso en una reacción de secuenciamiento de ácido.
El reactivo inmovilizado sobre el soporte sólido móvil puede ser un polipéptido con actividad de sulfurilasa, un polipéptido con actividad de luciferasa o un polipéptido quimérico que tenga actividad de sulfurilasa y de luciferasa. Puede ser una proteína de fusión ATP sulfurilasa y luciferasa. Puesto que el producto de la reacción de sulfurilasa es consumido por la luciferasa, la proximidad entre estas dos enzimas puede lograrse mediante la unión covalente de las dos enzimas en forma de una proteína de fusión. Esta descripción sería útil no solo en la canalización del sustrato sino también para reducir los costes de producción y potencialmente doblar el número de sitios de unión sobre las partículas recubiertas de estreptavidina.
Preferiblemente, la sulfurilasa termoestable es activa a temperaturas por encima de la ambiental (hasta al menos 50ºC). La ATP sulfurilasa puede proceder de un termófilo.
El soporte sólido móvil puede tener un primer reactivo y un segundo reactivo inmovilizados sobre él, el primer reactivo es un polipéptido con actividad de sulfurilasa y el segundo reactivo es un polipéptido con actividad de luciferasa.
El reactivo inmovilizado sobre el soporte sólido móvil puede ser un ácido nucleico; preferiblemente el ácido nucleico es un concatámero de cadena sencilla. Preferiblemente, el ácido nucleico puede usarse para secuenciar un ácido nucleico, por ejemplo, una reacción de pirosecuenciamiento.
La descripción también proporciona un método para detectar o cuantificar actividad de ATP usando un soporte sólido móvil; preferiblemente el ATP puede detectarse o cuantificarse como parte de una reacción de secuenciamiento de ácido nucleico.
En la Figura 15 se muestra una placa picotiter que ha sido “alfombrada” con soportes sólidos móviles con ácido nucleico o enzimas reactivas unidas a ellos.
5. MÉTODOS DE SECUENCIAMIENTO DE ÁCIDOS NUCLEICOS
A continuación se lleva a cabo el secuenciamiento basado en pirofosfato. La muestra de secuencia de ADN y el cebador de extensión son sometidos entonces a una reacción de polimerasa en presencia de un trifosfato de nucleótido, mediante lo cual el trifosfato de nucleótido solo se incorporará y liberará pirofosfato (PPi) si es complementario a la base de la posición diana, añadiéndose el trifosfato de nucleótido a alícuotas separadas de mezcla muestra-cebador o sucesivamente a la misma mezcla muestra-cebador. La liberación de PPi se detecta a continuación para indicar qué nucleótido es incorporado.
Se puede determinar una región de la secuencia producto madurando un cebador de secuenciamiento con una región del ácido nucleico plantilla, y a continuación poniendo en contacto el cebador de secuenciamiento con una ADN polimerasa y un trifosfato de nucleótido conocido, es decir, dATP, dCTP, dGTP, dTTP o un análogo de uno de dichos nucleótidos. La secuencia se puede determinar detectando un subproducto de reacción de secuencia, tal como se describe más adelante.
El cebador de secuencia puede tener cualquier longitud o composición de bases, siempre que sea capaz de madurarse específicamente con una región del ácido nucleico plantilla amplificado. No se requiere una estructura particular para el cebador de secuenciamiento mientras sea capaz de cebar específicamente una región del ácido nucleico plantilla amplificado. Preferiblemente, el cebador de secuenciamiento es complementario a una región de la plantilla que está entre la secuencia que va a ser caracterizada y la secuencia hibridable con el cebador ancla. El cebador de secuenciamiento se extiende con la ADN polimerasa para formar una secuencia producto. La extensión se lleva a cabo en presencia de uno o más tipos de trifosfatos de nucleótido, y si se desea proteínas de unión auxiliares.
La incorporación de la dNTP se determina preferiblemente analizando la presencia de un subproducto de secuenciamiento. Preferiblemente, la secuencia de nucleótidos del producto de secuenciamiento se determina midiendo el pirofosfato inorgánico (PPi) liberado del trifosfato de nucleótido (dNTP) según se incorpora dNMP en un cebador de secuencia extendida. Este método de secuenciamiento, denominado tecnología PyrosequencingTM (PyroSequencing AB, Estocolmo, Suecia) se puede llevar a cabo en disolución (fase líquida) o como una técnica de fase sólida. Los métodos de secuenciamiento basados en PPi se describen de manera general, por ejemplo, en el documento WO 98/13523A1, Ronaghi y col., 1996. Anal. Biochem. 242: 84-89, Ronaghi y col., 1998. Science 281: 363-365 (1998) y USSN 2001/0024790. Véanse también, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. 6.210.891 y
6.258.568.
El pirofosfato liberado en estas condiciones se puede detectar enzimáticamente (por ejemplo, mediante la generación de luz en la reacción de luciferasa-luciferina). Dichos métodos permiten que un nucleótido sea identificado en una posición diana dada, y que el ADN sea secuenciado simple y rápidamente a la vez que se evita la necesidad de usar electroforesis y el uso de radioetiquetas potencialmente peligrosas.
El PPi puede detectarse a través de una serie de metodologías diferentes, y previamente se han descrito varios métodos enzimáticos (véase, por ejemplo, Reeves y col., 1969. Anal. Biochem. 28: 282-287; Guillory y col., 1971. Anal. Biochem. 39: 170-180; Johnson y col., 1968. Anal. Biochem. 15: 273; Cook y col., 1978. Anal. Biochem. 91: 557-565; y Drake y col., 1979. Anal. Biochem. 94: 117-120).
El PPi liberado como resultado de la incorporación de un dNTP mediante una polimerasa puede convertirse a ATP usando, por ejemplo, una ATP sulfurilasa. Se ha identificado que está enzima está implicada en el metabolismo del azufre. El azufre, en sus formas reducida y oxidada, es un nutriente mineral esencial para el crecimiento de plantas y de animales (véase, por ejemplo, Schmidt y Jager, 1992. Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 43: 325-349). En plantas y en microorganismos, la captación activa de sulfato viene seguida de la reducción a sulfuro. Como el sulfato tiene un potencial relativo de oxidación/reducción muy bajo respecto a los reductores celulares disponibles, la etapa principal de la asimilación requiere su activación a través de una reacción dependiente de ATP (véase, por ejemplo, Leyh, 1993. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 28: 515-542). La ATP sulfurilasa (ATP: sulfato adenililtransferasa; EC 2.7.7.4) cataliza la reacción inicial del metabolismo del sulfato inorgánico (SO4-2); véase, por ejemplo, Robbins y Lipmann, 1958. J. Biol. Chem. 233: 686-690; Hawes y Nicholas, 1973. Biochem. J. 133: 541-550). En esta reacción, los SO4-2 son activados a adenosina 5’-fosfosulfato (APS).
La ATP sulfurilasa has sido altamente purificada a partir de diversas fuentes, tales como Saccharomyces cerevisiae (véase, por ejemplo, Hawes y Nicholas, 1973. Biochem. J. 133: 541-550); Penicillium chrysogenum (véase, por ejemplo, Renosto y col., 1990. J. Biol. Chem. 265: 10300-10308); hígado de rata (véase, por ejemplo, Yu y col., 1989. Arch. Biochem. Biophys. 269: 165-174); y plantas (véase, por ejemplo, Shaw y Anderson, 1972. Biochem. J.
127: 237-247; Osslund y col., 1982. Plant Physiol. 70: 39-45). Además, se han clonado los genes de ATP sulfurilasa de procariontes (véase, por ejemplo, Leyh y col., 1992. J. Biol. Chem. 267: 10405-10410; Schwedock y Long, 1989. Mol. Plant Microbe Interaction 2: 181-194; Laue y Nelson, 1994. J. Bacteriol. 176: 3723-3729); eucariontes (véase, por ejemplo, Cherest y col., 1987. Mol. Gen. Genet. 210: 307-313; Mountain y Korch, 1991. Yeast 7: 873-880; Foster y col., 1994. J. Biol. Chem. 269: 19777-19786); plantas (véase, por ejemplo, Leustek y col., 1994. Plant Physiol. 105: 897-902); y animales (véase, por ejemplo, Li y col., 1995. J. Biol. Chem. 270: 29453-29459). La enzima es un homooligómero o un heterodímero, dependiendo de la fuente específica (véase, por ejemplo, Leyh y Suo, 1992. J. Biol. Chem. 267: 542-545).
Se puede usar una sulfurilasa termoestable. Las sulfurilasas termoestables se pueden obtener a partir de, por ejemplo, Archaeoglobus o Pyrococcus spp. Las secuencias de sulfurilasas termoestables están disponibles en la base de datos Acc. Nº 028606, Acc. Nº Q9YCR4 y Acc. Nº P56863.
La ATP sulfurilasa se ha usado para muchas aplicaciones diferentes, por ejemplo, para la detección bioluminométrica de ADP a concentraciones elevadas de ATP (véase, por ejemplo, Schultz y col., 1993. Anal. Biochem. 215: 302-304); para la monitorización continua de actividad de ADN polimerasa (véase, por ejemplo, Nyrbn, 1987. Anal. Biochem. 167: 235-238); y para secuenciamiento de ADN (véase, por ejemplo, Ronaghi y col., 1996. Anal. Biochem. 242: 84-89; Ronaghi y col., 1998. Science. 281: 363-365; Ronaghi y col., 1998. Anal. Biochem.
267: 65-71).
Se han desarrollado varios ensayos para la detección de la reacción directa de ATP sulfurilasa. El ensayo de molibdolisis colorimétrica se basa en la detección de fosfato (véase, por ejemplo, Wilson y Bandurski, 1958. J. Biol. Chem. 233: 975-981), mientras que el ensayo de molibdolisis espectrofotométrica continua se basa en la detección de la oxidación de NADH (véase, por ejemplo, Seubert y col., 1983. Arch. Biochem. Biophys. 225: 679-691; Seubert y col., 1985. Arch. Biochem. Biophys. 240: 509-523). El último ensayo requiere la presencia de varias enzimas de detección. Además, también se han descrito en la bibliografía varios ensayos radioactivos (véase, por ejemplo, Daley y col., 1986. Anal. Biochem. 157: 385-395). Por ejemplo, un ensayo se basa en la detección de 32PPi liberado a partir de ATP marcado con 32P (véase, por ejemplo, Seubert y col., 1985. Arch. Biochem. Biophys. 240: 509-523) y otro en la incorporación de 35S a APS marcado con 35S (este ensayo también requiere APS quinasa purificada como enzima de acoplamiento; véase, por ejemplo, Seubert y col., 1983. Arch. Biochem. Biophys. 225: 679-691); y una tercera reacción depende de la liberación de 35SO4-2 de APS marcado con 35S (véase, por ejemplo, Daley y col., 1986. Anal. Biochem. 157: 385-395).
Para la detección de la reacción inversa de ATP sulfurilasa se han descrito previamente un ensayo espectrofotométrico continuo (véase, por ejemplo, Segel y col., 1987. Methods Enzymol. 143: 334-349); un ensayo bioluminométrico (véase, por ejemplo, Balharry y Nicholas, 1971. Anal. Biochem. 40: 1-17); un ensayo de liberación de 35SO4-2 (véase, por ejemplo, Seubert y col., 1985. Arch. Biochem. Biophys. 240: 509-523); y un ensayo de incorporación de 32PPi (véase, por ejemplo, Osslund y col., 1982. Plant Physiol. 70: 39-45).
El ATP producido mediante una ATP sulfurilasa puede hidrolizarse usando reacciones enzimáticas para generar luz. Las reacciones químicas que emiten luz (es decir, quimioluminiscencia) y las reacciones biológicas que emiten luz (es decir, bioluminiscencia) se usan ampliamente en la bioquímica analítica para realizar mediciones sensibles de diferentes metabolitos. En las reacciones bioluminiscentes, la reacción química que conduce a la emisión de luz está catalizada por una enzima. Por ejemplo, el sistema luciferina-luciferasa permite un ensayo específico de ATP y se puede usar el sistema luciferasa bacteriana-oxidorreductasa para monitorizar NAD(P)H. Ambos sistemas han sido extendidos al análisis de numerosas sustancias por medio de reacciones acopladas que implican la producción o la utilización de ATP o NAD(P)H (véase, por ejemplo, Kricka, 1991. “Chemilumiescent and bioluminescent techniques”. Clin. Chem. 37: 1472-1281).
El desarrollo de nuevos reactivos han hecho posible la obtención de una emisión lumínica estable proporcional a las concentraciones de ATP (véase, por ejemplo, Lundin, 1982. “Applications of firefly luciferase” en Luminescent Assays (Raven Press, Nueva York) o NAD(P)H (véase, por ejemplo, Lovgren y col., “Continuous monitoring of NADH-converting reactions by bacterial luminescence”. J. Appl. Biochem. 4: 103-111). Con dichos reactivos de emisión lumínica estable, es posible hacer ensayos de punto final y calibrar cada ensayo individual mediante la adición de una cantidad conocida de ATP ó NAD(P)H. Además, un sistema emisor de luz estable también permite la Las enzimas adecuadas para convertir ATP en luz incluyen luciferasas, por ejemplo, luciferasas de insecto. Las luciferasas producen luz como producto final de su catálisis. La enzima emisora de luz mejor conocida es la de la luciérnaga, Photinus pyralis (Coleoptera). El gen correspondiente ha sido clonado y expresado en bacterias (véase, por ejemplo, de Wet y col., 1985. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 7870-7873) y plantas (véase, por ejemplo, Ow y col., 1986. Science 234: 856-859), así como en insectos (véase, por ejemplo, Jha y col., 1990. FEBS Lett. 274: 2426) y células de mamíferos (véase, por ejemplo, de Wet y col., 1987. Mol. Cell. Biol. 7: 725-7373; Keller y col., 1987. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 3264-3268). Además, recientemente se han clonado una serie de genes de luciferasa procedentes de escarabajo click jamaiquino, Pyroplorus plagiophihalamus (Coleoptera), y se han caracterizado parcialmente (véase, por ejemplo, Wood y col., 1989. J. Biolumin. Chemilumin. 4: 289-301; Wood y col., 1989. Science 244: 700-702). A veces luciferasas distintas pueden producir luz de diferentes longitudes de onda, que pueden permitir la monitorización simultánea de emisiones lumínicas a diferentes longitudes de onda. Por consiguiente, las características mencionadas anteriormente son únicas y añaden una nueva dimensión a la utilización de los sistemas indicadores actuales.
La luciferasa de luciérnaga cataliza bioluminiscencia en presencia de luciferina, adenosina 5’-trifosfato (ATP), iones magnesio y oxígeno, dando como resultado un rendimiento cuantitativo de 0,88 (véase, por ejemplo, McElroy y Selinger, 1960. Arch. Biochem. Biophys. 88: 136-145). La reacción bioluminiscente de luciferasa de luciérnaga se puede utilizar como ensayo para la detección de ATP con un límite de detección de aproximadamente 1x10-13 M (véase, por ejemplo, Leach, 1981. J. Appl. Biochem. 3: 473-517). Además, el grado general de sensibilidad y conveniencia de los sistemas de detección mediados por luciferasa ha generado un interés considerable en el desarrollo de biosensores basados en luciferasa de luciérnaga (véase, por ejemplo, Green y Kricka, 1984. Talanta
31: 173-176; Blum y col., 1989. J. Biolumin. Chemilumin. 4: 543-550).
Usando las enzimas descritas anteriormente, el cebador de secuencia es expuesto a una polimerasa y a un dNTP conocido. Si el dNTP se incorpora al extremo 3’ de la secuencia de cebador, el dNTP se rompe y se libera una molécula de PPi. A continuación el PPi es convertido en ATP con ATP sulfurilasa. Preferiblemente, la ATP sulfurilasa está presente en una concentración suficientemente alta para que la conversión de PPi se produzca con una cinética de primer orden con respecto al PPi. En presencia de luciferasa, el ATP se hidroliza para generar un fotón. La reacción preferiblemente tiene una concentración suficiente de luciferasa presente dentro de la mezcla de reacción, de tal modo que la reacción, ATP - ADP – PO43- + fotón (luz), se produce con una cinética de primer orden con respecto a ATP. El fotón se puede medir usando métodos y aparatos descritos más adelante. El PPi y una reacción de sulfurilasa/luciferasa acopladas se pueden usar para generar luz para su detección. Tanto la sulfurilasa como la luciferasa, o ambas, pueden ser inmovilizadas sobre uno o más soportes sólidos móviles dispuestos en cada sitio de reacción.
La presente descripción permite de este modo detectar la liberación de PPi durante la reacción de polimerasa dando lugar a una señal en tiempo real. Las reacciones de secuenciamiento se pueden monitorizar en continuo en tiempo real. Por tanto, la presente invención facilita un procedimiento para la detección rápida de la liberación de PPi. Se ha estimado que las reacciones tienen lugar en menos de 2 segundos (Nyren y Lundin, ver más arriba). La etapa limitante de la velocidad es la conversión de PPi en ATP por acción de la ATP sulfurilasa, mientras que la reacción de luciferasa es rápida y ha sido estimada mediante diversos métodos, y se ha descubierto que, por ejemplo, en el caso de la polimerasa Klenow, la incorporación completa de una base puede tardar menos de 0,5 segundos. De este modo, el tiempo total estimado de incorporación de una base y la detección mediante este ensayo enzimático es aproximadamente de 3 segundos. Por lo tanto, se observará que son posibles unos tiempos de reacción muy rápidos, lo que permite una detección en tiempo real. Los tiempos de reacción podrían disminuirse adicionalmente usando una luciferasa más termoestable.
Para la mayoría de las aplicaciones es deseable usar reactivos libres de contaminantes como ATP y PPi. Estos contaminantes pueden eliminarse haciendo fluir los reactivos a través de una pre-columna que contiene apirasa y/o pirofosfatasa ligadas a la resina. Alternativamente, la apirasa o la pirofosfatasa se pueden unir a particular magnéticas y se puede usar para eliminar el ATP y el PPi contaminantes presentes en los reactivos. Además es deseable eliminar por lavado los reactivos de secuenciamiento difusibles, por ejemplo, dNTPs no incorporados, con un tampón de lavado. Se puede usar cualquier tampón de lavado usado en el secuenciamiento de pirofosfato.
La concentración de reactivos en la reacción de secuenciamiento puede incluir 1 pmol de ADN, 3 pmol de polimerasa, 40 picomol de dNTP en 0,2 mL de tampón. Véase Ronaghi y col., Anal. Biochem. 242: 84-89 (1996).
La reacción se secuenciamiento se puede llevar a cabo con los cuatro nucleótidos predeterminados, si así se desea. Un ciclo “completo” generalmente incluye la administración secuencial de reactivos a cada nucleótido dATP, dGTP, dCTP y dTTP (o dUTP), en un orden predeterminado. Los dNTPs no incorporados son eliminados por lavado entre cada adición de nucleótidos. Alternativamente, los dNTPs no incorporados son degradados mediante apirasa (ver más adelante). El ciclo se repite según se desee hasta que se obtiene la cantidad deseada de secuencia del producto de secuencia. Se pueden obtener aproximadamente 10-1000, 10-100, 10-75, 20-50 ó aproximadamente 30 nucleótidos de información de secuencia a partir de la extensión de un cebador de secuenciamiento madurado.
El nucleótido se puede modificar para que contenga un derivado de disulfuro de un hapteno tal como la biotina. La adición del nucleótido modificado al cebador naciente madurado al sustrato anclado se analiza mediante una etapa de post-polimerización que incluye i) la unión secuencial de, en el ejemplo en que la modificación es una biotina, un resto conjugado a avidina o estreptavidina ligado a una molécula de enzima, ii) la eliminación por lavado del exceso de enzima ligada a avidina o estreptavidina, iii) el flujo de un sustrato de enzima adecuado en condiciones que favorezcan la actividad enzimática, y iv) la detección de producto o productos de reacción de sustrato enzimático. El hapteno se puede eliminar a través de la adición de un agente reductor. Dichos métodos permiten la identificación de un nucleótido en una posición diana dada, y el secuenciamiento simple y rápido del ADN a la vez que se evita la necesidad de electroforesis y el uso de radiomarcas potencialmente peligrosas.
Una enzima preferida para detectar el hapteno es la peroxidasa de rábano. Si se desea, se puede usar tampón de lavado entre la adición de los diversos reactivos empleados. Se puede usar apirasa para eliminar el dNTP no reaccionado usado para extender el cebador de secuencia. El tampón de lavado puede incluir opcionalmente apirasa.
Los ejemplos de haptenos, por ejemplo, biotina, digoxigenina, las moléculas de colorante fluorescente cy3 y cy5, y fluoresceína, se incorporan con diferentes eficacias a moléculas de ADN extendidas. La unión del hapteno se puede producir a través de enlaces a través del azúcar, la base y el resto fosfato del nucleótido. Los ejemplos de sistemas para la amplificación de señal incluyen los fluorescentes, electroquímicos y enzimáticos. Preferiblemente, las enzimas, por ejemplo fosfatasa alcalina (AP), peroxidasa de rábano (HRP), beta-galactosidasa, luciferasa, pueden incluir aquellas para las cuales se conocen sustratos generadores de luz, y los sistemas de detección de dichos sustratos generadores de luz (qumioluminiscentes) pueden incluir una cámara CCD.
En un modo preferido, se añade la base modificada, se produce la detección y el resto conjugado a hapteno se retira
o se desactiva mediante el uso de una agente de ruptura o de un agente desactivante. Por ejemplo, si el ligando lábil es un disulfuro, entonces el agente de ruptura puede ser un agente reductor, por ejemplo ditiotreitol (DTT), betamercaptoetanol, etc. Otros sistemas de desactivación incluyen calor, frío, desnaturalizantes químicos, tensioactivos, reactivos hidrofóbicos e inhibidores suicidas.
La luciferasa puede hidrolizar dATP directamente con la liberación concomitante de un fotón. Esto da como resultado una señal de falso positivo debido a que la hidrólisis se produce independientemente de la incorporación del dATP al cebador de secuenciamiento extendido. Para evitar este problema, se puede usar un análogo de dATP que se incorpora a ADN, es decir, es un sustrato para un ADN polimerasa, pero no es un sustrato para luciferasa. Un análogo de este tipo es ela -tio-dATP. Por tanto, el uso de a-tio-dATP evita la generación espuria de fotones que se puede producir cuando se hidroliza dATP sin ser incorporado en una cadena de ácido nucleico en crecimiento.
Típicamente, la detección basada en PPi se calibra mediante la medición de la luz liberada después de la adición de nucleótidos de control a la mezcla de reacción de secuenciamiento inmediatamente después de la adición del cebador de secuenciamiento. Esto permite la normalización de las condiciones de reacción. La incorporación de dos
o más nucleótidos idénticos en sucesión es revelada por un aumento correspondiente de la cantidad de luz liberada. Por tanto, un aumento del 100% de la luz liberada respecto a los nucleótidos de control revela la incorporación de dos dNTPs sucesivos en el cebador extendido.
Si se desea, la apirasa puede “lavarse” o “hacerse fluir” sobre la superficie del soporte sólido para facilitar la degradación de cualquier dNTP remanente no incorporado de la mezcla de reacción de secuenciamiento. La apirasa también degrada el ATP generado y por tanto “desconecta” la luz generada por la reacción. Tras el tratamiento con apirasa, los reactivos remanentes son eliminados por lavado como preparación para las siguientes etapas de incubación de dNTP y de detección de fotones. Alternativamente, la apirasa se puede ligar al soporte sólido o sólido móvil.
Secuenciamiento de extremo doble
En la presente memoria se proporciona un método para secuenciar ambos extremos de una plantilla de ácido nucleico. Tradicionalmente, el secuenciamiento de dos extremos de una molécula de ADN de cadena doble requeriría como mínimo la hibridación de un cebador, el secuenciamiento de un extremo, la hibridación de un segundo cebador y el secuenciamiento del otro extremo. El método alternativo es separar las cadenas individuales del ácido nucleico de cadena doble y secuenciar individualmente cada cadena. La presente descripción proporciona una tercera alternativa que es más rápida y menos intensiva en trabajo que los dos primeros métodos.
La presente descripción proporciona un método de secuenciamiento secuencial de ácidos nucleicos a partir de múltiples cebadores. Las referencias a secuenciamiento de ADN en esta solicitud están dirigidas al secuenciamiento que usa una polimerasa en el que la secuencia se determina según se va incorporando trifosfato de nucleótido (NTP) a la cadena en crecimiento de un cebador de secuenciamiento. Un ejemplo de este tipo de secuenciamiento es el método de piro-secuenciamiento de detección de pirofosfato (véase, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. Nº 6.274.320, 6.274.320 y 6.210.891).
En la presente memoria se proporciona un método para secuenciar dos extremos de un ácido nucleico plantilla de cadena doble. El ADN de cadena doble está compuesto de dos ADN de cadena sencilla; referidos en la presente memoria como primer ADN de cadena sencilla y segundo ADN de cadena sencilla. Se hibrida un primer cebador al primer ADN de cadena sencilla y se hibrida un segundo cebador al segundo ADN de cadena sencilla. Se desprotege el primer cebador a la vez que se protege el segundo cebador. Los términos “protección” y “protegido” se definen en esta descripción como la adición de un grupo químico a sitios reactivos del cebador que evita que el cebador sea polimerizado por ADN polimerasa. Además, la adición de dichos grupos químicos protectores debería ser reversible de tal modo que tras reversión el cebador ahora desprotegido se capaz de nuevo de actuar como cebador de secuenciamiento. La secuencia de ácido nucleico se determina en una dirección (por ejemplo, desde un extremo de la plantilla) alargando el primer cebador con ADN polimerasa usando métodos convencionales tales como el secuenciamiento de pirofosfato. A continuación el segundo cebador es desprotegido, y la secuencia se determina alargando el segundo cebador en la otra dirección (por ejemplo, desde el otro extremo de la plantilla) usando ADN polimerasa y métodos convencionales tales como secuenciamiento de pirofosfato. Las secuencias del primer y segundo cebadores se diseñan específicamente para hibridarse con los dos extremos del ADN de cadena doble o en cualquier localización a lo largo de la plantilla de este método.
También se proporciona en la presente memoria un método de secuenciamiento de un ácido nucleico a partir de múltiples cebadores. En este método se hibrida una serie de cebadores de secuenciamiento al ácido nucleico plantilla que va a ser hibridado. Todos los cebadores de secuenciamiento son protegidos de forma reversible excepto uno. Un cebador protegido es un cebador de oligonucleótido que no puede ser extendido con polimerasa, y habitualmente se usan dNTPs en las reacciones de secuenciamiento de ADN. Un cebador protegido reversiblemente es un cebador protegido que puede ser desprotegido. Todos los cebadores protegidos mencionados en esta invención están protegidos de forma reversible. Tras la desprotección, un cebador protegido reversiblemente actúa como un cebador de secuenciamiento normal y es capaz de participar en una reacción de secuenciamiento normal.
La presente descripción proporciona un método de secuenciamiento secuencial de un ácido nucleico a partir de múltiples cebadores. El método comprende las siguientes etapas: en primer lugar, se proporcionan uno o más ácidos nucleicos plantilla que va a ser secuenciados. En segundo lugar, se hibrida una pluralidad de cebadores de secuenciamiento con el ácido nucleico o ácidos nucleicos de plantilla. El número de cebadores de secuenciamiento puede representarse a través del número n, en donde n puede ser cualquier número positivo superior a 1. Dicho número puede ser, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ó superior. De los n cebadores, n-1 pueden ser protegidos con un grupo protector. Por tanto, por ejemplo, si n es 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10, n-1 sería 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ó 9, respectivamente. El cebador restante (por ejemplo, n número de cebadores – (n-1) número de cebadores protegidos = un cebador restante) está sin proteger. En tercer lugar, el cebador no protegido es extendido y la secuencia de ADN plantilla se determina empleando métodos convencionales tales como, por ejemplo, secuenciamiento de pirofosfato. En cuarto lugar, tras el secuenciamiento del primer cebador, uno de los cebadores protegidos restantes es desprotegido. En quinto lugar, el cebador desprotegido es extendido y se determina la secuencia de ADN plantilla mediante métodos convencionales tales como, por ejemplo, secuenciamiento de pirofosfato. Opcionalmente, el método se puede repetir hasta que el secuenciamiento se lleva a cabo con todos los cebadores protegidos.
En otro aspecto, la presente descripción incluye un método de secuenciamiento secuencial de un ácido nucleico que comprende las etapas de: (a) hibridar 2 o más cebadores de secuenciamiento con el ácido nucleico en donde todos los cebadores excepto uno están protegidos de forma reversible; (b) determinar una secuencia de una cadena del ácido nucleico mediante alargamiento con polimerasa a partir del cebador desprotegido; (c) desproteger uno de los cebadores protegidos reversiblemente en un cebador no protegido; (d) repetir las etapas (b) y (c) hasta que todos los cebadores protegidos reversiblemente sean desprotegidos y usados para determinar una secuencia. Este método puede comprender una etapa adicional entre las etapas (b) y (c), es decir, la etapa de finalizar el alargamiento del cebador desprotegido poniendo en contacto el cebador desprotegido con ADN polimerasa y uno o más de un trifosfato de nucleótido o de un trifosfato de didesoxinucleótido. Este método puede comprender además una etapa adicional entre dicha etapa (b) y (c), es decir, la finalización del alargamiento del cebador desprotegido poniendo en contacto el cebador desprotegido con ADN polimerasa y un trifosfato de didesoxinucleótido procedente de ddATP, ddTTP, ddCTP, ddGTP o una combinación de los mismos.
También se describe en la presente memoria un método de secuenciamiento de un ácido nucleico que comprende:
(a) hibridar un primer cebador desprotegido a una primera cadena del ácido nucleico; (b) hibridar un segundo cebador protegido con una segunda cadena; (c) exponer la primera y segunda cadenas a polimerasa, de tal modo que el primer cebador desprotegido se extienda junto con la primera cadena; (d) completar la extensión del primer cebador de secuenciamiento; (e) desproteger el segundo cebador de secuenciamiento; y (f) exponer la primera y la segunda cadenas a polimerasa de tal modo que el segundo cebador de secuencias es extendido junto con la segunda cadena. Preferiblemente, la finalización comprende el taponamiento o terminación del alargamiento.
También se proporciona en la presente memoria un método para secuenciar dos extremos de un ácido nucleico plantilla de doble cadena que comprende un primer y un segundo ADN de cadena sencilla. Se puede hibridar un primer cebador al primer ADN de cadena sencilla y se hibrida un segundo cebador al segundo ADN de cadena sencilla en la misma etapa. El primer cebador está desprotegido mientras que el segundo cebador está protegido.
Después de la hibridación, la secuencia de ácido nucleico se determina en una dirección (por ejemplo, desde un extremo de la plantilla) alargando el primer cebador con ADN polimerasa usando métodos convencionales tales como el secuenciamiento de pirofosfato. Preferiblemente, la polimerasa está desprovista de actividad de exonucleasa 3’ a 5’. A continuación, se desprotege el segundo cebador y se determina su secuencia alargando el segundo cebador en la otra dirección (por ejemplo, desde el otro extremo de la plantilla) con ADN polimerasa usando métodos convencionales tales como el secuenciamiento de pirofosfato. Tal como se ha descrito anteriormente, las secuencias del primer cebador y del segundo cebador se diseñan para hibridarse a los dos extremos del ADN de cadena doble o en cualquier localización de la plantilla. Esta técnica es especialmente útil para el secuenciamiento de muchos ADNs plantilla que contienen sitios de hibridación de cebador de secuenciamiento únicos en sus dos extremos. Por ejemplo, muchos vectores de clonación proporcionan sitios de hibridación de cebador de secuenciamiento únicos que flanquean el sitio de inserción para facilitar el posterior secuenciamiento de cualquier secuencia clonada (por ejemplo, Bluescript, Stratagene, La Jolla, CA).
Un beneficio de este método es que ambos cebadores pueden hibridarse en una sola etapa. Los beneficios de este y otros métodos son especialmente útiles en sistemas de secuenciamiento en paralelo, en los que las hibridaciones están más implicadas de lo normal. Los ejemplos de sistemas de secuenciamiento paralelos se describen en la Solicitud pendiente de Patente de EE.UU. número 2003-0068629.
Los cebadores de oligonucleótido de la presente descripción pueden sintetizarse mediante tecnologías convencionales, por ejemplo, con un sintetizador de oligonucleótidos comercial y/o ligando sub-fragmentos que han sido sintetizados de ese modo.
La longitud del ácido nucleico diana de cadena doble se puede determinar. Los métodos para determinar la longitud de un ácido nucleico de cadena doble son conocidos en la técnica. La determinación de la longitud puede llevarse a cabo antes o después de secuenciar el ácido nucleico. Los métodos conocidos de determinación de la longitud de moléculas de ácido nucleico incluyen la electroforesis de gel, la electroforesis de gel de campo pulsado, la espectroscopía de masas y similares. Puesto que un ácido nucleico de cadena doble de extremo romo está compuesto por dos cadenas sencillas de longitudes idénticas, la determinación de la longitud de una cadena de un ácido nucleico es suficiente para determinar la longitud de la correspondiente cadena doble.
La reacción de secuencia de acuerdo con la presente descripción también permite una determinación de la longitud del ácido nucleico plantilla. En primer lugar, una secuencia completa desde un extremo del ácido nucleico hasta el otro extremo permitirá determinar la longitud. En segundo lugar, la determinación de la secuencia de los dos extremos puede solapar en el medio permitiendo que las dos secuencias se unan. Se puede determinar la secuencia completa y se puede revelar la longitud. Por ejemplo, si la plantilla tiene una longitud de 100 pb, el secuenciamiento desde un extremo puede determinar las bases 1 a 75; el secuenciamiento desde el otro extremo puede determinar las bases 25 a 100; por tanto existe un solapamiento de 51 bases en el medio, desde la base 25 a la base 75; y a partir de esta información se puede determinar la secuencia completa de 1 a 100, y la longitud, de 100 bases, puede ser revelada por la secuencia completa.
Otro método de la presente descripción está dirigido a un método que comprende las siguientes etapas. Primero se hibrida una pluralidad de cebadores de secuenciamiento, cada uno con una secuencia diferente, con un ADN que va a ser secuenciado. El número de cebadores de secuenciamiento puede ser cualquier valor superior a uno, tal como, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ó más. Todos estos cebadores son protegidos reversiblemente excepto uno. El cebador desprotegido es alargado en una reacción de secuenciamiento y se determina una secuencia. Habitualmente, cuando un cebador es alargado completamente, no puede extenderse y no afectará al secuenciamiento subsiguiente de otro cebador. Si se desea, el cebador secuenciado puede terminarse usando un exceso de polimerasa y dNTP o usando ddNTPs. Si se adopta la etapa de terminación, los reactivos de terminación (dNTPs y ddNTPs) deberían ser retirados después de la etapa. A continuación, uno de los cebadores protegidos reversiblemente es desprotegido y comienza el secuenciamiento desde el segundo cebador. Las etapas de desprotección de un cebador, secuenciamiento desde el cebador desprotegido y, opcionalmente, terminación del secuenciamiento desde el cebador, se repiten hasta que todos los cebadores protegidos son desprotegidos y usados en el secuenciamiento.
Los cebadores protegidos reversiblemente deberían protegerse con diferentes grupos químicos. Eligiendo el método apropiado de desprotección se puede desproteger un cebador sin afectar a los grupos de protección de los otros cebadores. Preferiblemente, el grupo de protección es PO4-. Es decir, el segundo cebador se protege con PO4 y la desprotección se consigue mediante T4 polinucleótido quinasa (utilizando su actividad de 3’-fosfatasa). Preferiblemente, la protección es un grupo tio o un grupo fosforotiol.
El ácido nucleico plantilla puede ser un ADN, ARN o ácido nucleico péptido (PNA). Aunque la plantilla preferida es ADN, el ARN y el PNA se pueden convertir en ADN empleando técnicas conocidas tales como PCR cebada aleatoriamente, de transcripción inversa, RT-PCR, o una combinación de dichas técnicas. Además, los métodos descritos en la presente memoria son útiles para secuenciar ácidos nucleicos de secuencia desconocida y conocida. El secuenciamiento de ácido nucleico de secuencia conocida sería útil, por ejemplo, para confirmar la secuencia del ADN sintetizado o para confirmar la identidad de un patógeno sospechoso con una secuencia de ácido nucleico conocida. Los ácidos nucleicos pueden ser una mezcla de más de una población de ácidos nucleicos. Es sabido que un cebador de secuenciamiento con una especificidad suficiente (por ejemplo, 20 bases, 25 bases, 30 bases, 35 bases, 40 bases, 45 bases o 50 bases) puede usarse para secuenciar un subconjunto de secuencias de un ácido En el caso de que el ácido nucleico plantilla sea de cadena sencilla, se puede hibridar un número de cebadores al ácido nucleico plantilla tal como se muestra a continuación:
5’--cebador 4—3’ 5’-cebador 3 –3’ 5’-cebador 2-3’ 5’-cebador 1-3’
3’-----------------------------------ácido nucleico plantilla--------------------------------------------------------5’
En este caso, es preferible que el cebador desprotegido inicial sea el cebador que se hibrida en el extremo 5’ de la plantilla. Véase el cebador 1 de la anterior ilustración. En esta orientación, el alargamiento del cebador 1 no desplazaría (por desplazamiento de cadena) al cebador 2, 3 ó 4. Cuando finalice el secuenciamiento desde el cebador 1, el cebador 2 puede ser desprotegido y el secuenciamiento del ácido nucleico puede comenzar. El secuenciamiento desde el cebador 2 puede desplazar al cebador 1 o la versión alargada del cebador del cebador uno, pero no tendría efecto sobre el resto de cebadores protegidos (cebadores 3 y 4). Usando este orden, cada cebador puede usarse secuencialmente y una reacción de secuenciamiento desde un cebador no afectaría al secuenciamiento desde un cebador posterior.
Una característica de la descripción es la capacidad para usar cebadores de secuenciamiento múltiples sobre uno o más ácidos nucleicos, y la capacidad para secuenciar a partir de cebadores múltiples usando solo una etapa de hibridación. En la etapa de hibridación, todos los cebadores de secuenciamiento (por ejemplo, el número n de cebadores de secuenciamiento) se pueden hibridar con el(los) ácido(s) nucleico(s) al mismo tiempo. En el secuenciamiento convencional, habitualmente se requiere una etapa de hibridación para el secuenciamiento a partir de un cebador. Una característica de la descripción es que el secuenciamiento a partir de n cebadores (tal como se ha definido anteriormente) se puede llevar a cabo mediante una etapa de hibridación sencilla.
Preferiblemente, las secuencias del número n de cebadores son suficientemente diferentes para que los cebadores no se hibriden de manera cruzada o se autohibriden. La hibridación cruzada se refiere a la hibridación de un cebador con otro cebador debida a complementariedad de secuencia. Una forma de hibridación cruzada se denomina habitualmente “dímero de cebador”. En el caso de un dímero de cebador, los extremos 3’ de dos cebadores son complementarios y forman una estructura que cuando se alarga es aproximadamente la suma de la longitud de los dos cebadores. La autohibridación se refiere a la situación en la que el extremo 5’ de un cebador es complementario al extremo 3’ del cebador. En ese caso, el cebador tiene una tendencia a autohibridarse para formar una estructura de tipo horquilla.
Un cebador puede interaccionar o asociarse específicamente con la molécula plantilla. Mediante los términos “interaccionar” o “asociarse” se pretende indicar en la presente memoria que las dos sustancias o compuestos (por ejemplo, cebador y plantilla; resto químico y nucleótido) se unen (por ejemplo, unidos, ligados, hibridados, juntados, madurados, ligados covalentemente o asociados de cualquier otra forma) uno al otro suficientemente para que el ensayo pretendido se pueda llevar a cabo. Mediante los términos “específico” o “específicamente” se pretende indicar en la presente memoria que los dos componentes se unen selectivamente uno al otro. Los parámetros requeridos para lograr las interacciones específicas se pueden determinar rutinariamente, por ejemplo, usando métodos convencionales en la técnica.
Para lograr más sensibilidad o para ayudar en el análisis de mezclas complejas, los cebadores protegidos se pueden modificar (por ejemplo, derivatizarse) con restos químicos diseñados para producir señales únicas claras. Por ejemplo, cada cebador protegido se puede derivatizar con un aminoácido natural o sintético diferente unido a través de un enlace amida con la cadena de oligonucleótido en una o más posiciones a lo largo de la porción de hibridación de la cadena. La modificación química se puede detectar, por supuesto, tras haber sido sometida a ruptura del ácido nucleico diana, o mientras está asociada al ácido nucleico diana. Permitiendo que cada ácido nucleico diana protegido sea identificado de un modo distinguible, es posible determinar (por ejemplo, someter a escrutinio) un número grande de ácidos nucleicos diana diferentes en un único ensayo. Muchos ensayos de este tipo se pueden llevar a cabo de fácil y rápidamente. Dicho ensayo o conjunto de ensayos se pueden realizar, por tanto, con un elevado rendimiento tal como se define en la presente memoria.
En los métodos descritos en la presente memoria, después de que se alargue un primer cebador y se determine la secuencia de ADN diana, se desprotege y secuencia o segundo cebador. No existe interferencia entre la reacción de secuenciamiento del primer cebador con la reacción de secuenciamiento del segundo cebador, ahora desprotegido, debido a que el primer cebador ha sido alargado completamente o ha sido terminado. Debido a que el primer cebador ha sido alargado completamente, el secuenciamiento a partir del segundo cebador, usando métodos convencionales tales como el secuenciamiento de pirofosfato, no se verán afectados por la presencia del primer cebador alargado. La descripción también proporciona un método para reducir cualquier posible contaminación de señal procedente del primer cebador. La contaminación de señal se refiere a las incidencias en las que el primer cebador no está alargado completamente. En ese caso, el primer cebador continuará alargándose si se desprotege y alarga un cebador posterior. El alargamiento del primer y segundo cebadores puede interferir con la determinación Preferiblemente, la reacción de secuenciamiento (por ejemplo, la reacción de alargamiento de la cadena) desde un cebador se completa o termina primero antes de que comience la reacción de secuenciamiento sobre un segundo cebador. Se puede terminar una reacción de alargamiento de cadena de ADN poniendo en contacto el ADN plantilla con ADN polimerasa y trifosfatos de didesoxinucleótido (ddNTPs) tales como ddATP, ddTTP, ddGTP y ddCTP. Después de la terminación, los trifosfatos de didesoxinucleótido se pueden eliminar lavando la reacción con una disolución sin ddNTPs. Un segundo método para evitar un alargamiento adicional de un cebador es añadir trifosfatos de nucleótido (dNTPs tales como dATP, dTTP, dGTP y dCTP) y ADN polimerasa a una reacción para extender completamente cualquier cebador que no esté completamente extendido. Después de una extensión completa, los dNTPs y la polimerasa son eliminados antes de que el siguiente cebador sea desprotegido. Completando o terminando un cebador antes de desproteger otro cebador se puede mejorar la reacción señal-ruido de la reacción de secuenciamiento (por ejemplo, secuenciamiento de pirofosfato).
Las etapas de (a) terminar o completar opcionalmente el secuenciamiento, (b) desproteger un nuevo cebador, y (c) secuenciar desde el cebador desprotegido, se pueden repetir hasta que se determine la secuencia desde el alargamiento del primer cebador. En este método, la etapa de hibridación comprende un número “n” de cebadores y un cebador desprotegido. El cebador desprotegido es secuenciado en primer lugar y las anteriores etapas (a), (b) y
(c) se pueden repetir.
Preferiblemente, se usa secuenciamiento de pirofosfato para todo el secuenciamiento llevado a cabo de acuerdo con el método de la presente invención.
Preferiblemente, se lleva a cabo el secuenciamiento de doble extremo de acuerdo con el proceso descrito en la Figura 10. Este proceso puede dividirse en seis etapas: (1) creación de una partícula de captura (Figura 10A); (2) amplificación PCR dirigida a partícula (DTB) (Figura 10B); (3) preparación del sistema indicador SL (Figura 10C); (4) secuenciamiento de la primera cadena (Figura 10D); (5) preparación de la segunda cadena (Figuras 10E y 10F); y
(6) análisis de cada cadena (Figura 10G). Este ejemplo de proceso se describe a continuación.
En la etapa 1, se acopla una partícula de captura activada por N-hidroxisuccinimida (NHS) (por ejemplo, Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) a un cebador directo y a un cebador inverso. El acoplamiento NHS forma un enlace amida químicamente estable con ligandos que contienen grupos amino primarios. La partícula de captura también se acopla a biotina (Figura 10A). Las partículas (es decir, soportes sólidos que capturan ácido nucleico) usados en la presente memoria pueden tener cualquier tamaño conveniente y se pueden fabricar en cualquier número de materiales conocidos. El ejemplo de dichos materiales incluye: compuestos inorgánicos, polímeros naturales y polímeros sintéticos. Los ejemplos específicos de estos materiales incluyen: celulosa, derivados de celulosa, resinas acrílicas, vidrio, geles de sílice, poliestireno, gelatina, polivinil pirrolidona, co-polímeros de vinilo y acrilamida, poliestireno reticulado con divinilbenceno o similares (véase Merrifield Biochemistry 1964, 3, 1385-1390), poliacrilamidas, geles de látex, poliestireno, dextrano, caucho, silicio, plásticos, nitrocelulosa, celulosas, esponjas naturales, geles de sílice, vidrio, plásticos metálicos, celulosa, dextranos reticulados (por ejemplo, SephadexTM) y gel de agarosa (SepharoseTM) y soportes en fase sólida conocidos por los especialistas en la técnica. Preferiblemente, las partículas de captura son partículas de Sepharose con un diámetro de aproximadamente 25 a 40 μm.
En la etapa 2 se añade el ADN plantilla que ha sido hibridado con los cebadores directo e inverso, y se amplifica el ADN a través de una estrategia de amplificación de PCR (Figura 10B). El ADN puede amplificarse mediante Reacción en Cadena de Polimerasa en Emulsión, Reacción en Cadena de Polimerasas Dirigida a Partícula, Amplificación de Círculo Rotatorio o Amplificación Isoterma mediada por Lazo. En la etapa 3, se añade estreptavidina después de la adición de sulfurilasa y luciferasa, que se acoplan a la estreptavidina (Figura 10C). La adición de enzimas auxiliares durante un método de secuenciamiento se ha descrito en las Patentes de EE.UU. 2003-0068629 y 6.996.287. El ADN plantilla puede tener un adaptador de ADN ligado a ambos extremos 5’ y 3’. Preferiblemente, el ADN se acopla a la partícula de captura de ADN mediante hibridación de uno de los adaptadores de ADN a una secuencia complementaria sobre la partícula de captura de ADN.
En la primera etapa, el ácido nucleico plantilla de cadena sencilla que va a ser amplificado se une a una partícula de captura. El ácido nucleico plantilla se puede unir a la partícula de captura de cualquier modo conocido en la técnica. Existen numerosos métodos en la técnica para unir el ADN a una partícula microscópica. La unión química covalente del ADN a la partícula se puede llevar a cabo usando agentes de acoplamiento estándares, tales como carbodiimida soluble en agua, para ligar el 5’-fosfato del ADN a las microesferas recubiertas de aminas a través de un enlace de fosfoamidato. Otra alternativa es acoplar primero ligandos de oligonucleótido específicos a la partícula usando una química similar, y a continuación usar ADN ligasa para unir el ADN al ligando de la partícula. Otros métodos químicos de unión incluyen el uso de N-hidroxisuccinamida (NHS) y sus derivados, para juntar el oligonucleótido con las partículas. En dicho método, un extremo del oligonucleótido puede contener un grupo reactivo (tal como un grupo amida) que forma un enlace covalente con el soporte sólido, mientras que el otro extremo del ligando contiene otro grupo reactivo que puede unirse con el oligonucleótido que va a ser inmovilizado. Preferiblemente, el oligonucleótido se liga a la partícula de captura de ADN mediante enlace covalente. Sin embargo, se pueden usar enlaces no covalentes tales como quelación o complejos antígeno-anticuerpo, para unir el oligonucleótido a la partícula.
Se pueden emplear ligandos de oligonucleótido que se hibridan específicamente a secuencias únicas en el extremo del fragmento de ADN, tal como el extremo solapado de un sitio de enzima de restricción o los “extremos pegajosos” de bacteriófago lambda basados en vectores de clonación, pero también se pueden usar de manera beneficiosa ligaciones de extremos romos. Estos métodos se describen en detalle en la Patente de EE.UU. Nº 5.674.743. Es preferible que cualquier método usado para inmovilizar las partículas continúe uniendo el oligonucleótido inmovilizado mediante las etapas de los métodos de la invención. Preferiblemente, el oligonucleótido se liga a la partícula de captura de ADN mediante enlace covalente. Sin embargo, se pueden usar enlaces no covalentes, tales como quelación o complejos antígeno-anticuerpo, para unir el oligonucleótido a la partícula.
En la etapa 4, se secuencia la primera cadena de ADN depositando las partículas de captura sobre la placa PicoTiter (PTP), y secuenciando con un método conocido por el especialista en la técnica (por ejemplo, secuenciamiento de pirofosfato) (Figura 10D). Después del secuenciamiento, se añade una mezcla de dNTPs y ddNTPs a fin de “tapar” o terminar el proceso de secuenciamiento (Figura 10E). En la etapa 5, se prepara la segunda cadena de ácido nucleico añadiendo apirasa para eliminar los ddNTPs y polinucleótido quinasa (PNK) para eliminar el grupo 3’-fosfato de la cadena de cebador bloqueada (Figura 10F). A continuación se añade polimerasa para cebar la segunda cadena, seguida del secuenciamiento de la segunda cadena de acuerdo con un método estándar conocido por el especialista en la técnica (Figura 10G). En la etapa 7, las secuencias de la primera y de la segunda cadenas se analizan de tal modo que se determina una secuencia de ADN contigua.
Sistema de detección
El soporte sólido se liga opcionalmente a un sistema de imagen 230, que incluye un sistema CCD en asociación con una óptica convencional o un haz de fibra óptica.
El sustrato de la cámara de perfusión puede incluir una torta de sistema de fibra óptica de tal modo que la luz generada cerca de la interfase acuosa es transmitida directamente a través de las fibras ópticas hacia el exterior del sustrato de la cámara. Cuando el sistema CCD incluye un conector de fibra óptica, la generación de imágenes se puede lograr colocando el sustrato de la cámara de perfusión en contacto directo con el conector. Alternativamente, se puede usar una óptica convencional para captar la imagen de la luz, por ejemplo, usando un sistema de lentes de apertura numérica de altos aumentos 1-1, a partir del exterior del sustrato de fibra óptica directamente al sensor CCD. Cuando el sustrato no proporciona el acoplamiento de fibra óptica, también se puede usar un sistema de lentes tal como se ha descrito anteriormente, en cuyo caso el sustrato o la cubierta de la cámara de perfusión es ópticamente transparente. Un ejemplo de sistema de imagen CCD se ha descrito anteriormente.
El sistema de imagen 230 se usa para capturar la luz procedente de los reactores de la superficie del sustrato. La luz se puede convertir en imágenes, por ejemplo, en un CCD usando un aparato de bajo ruido y alta sensibilidad conocido en la técnica. Para la generación de imágenes basada en fibra óptica, es preferible incorporar las fibras ópticas directamente en la tira del cubre, o para un FORA para hacer que las fibras ópticas que forman los micropocillos también sean las fibras ópticas que conducen la luz hasta el detector.
El sistema de imagen está unido al sistema de control por ordenador y de recolección de datos 240. En general, se puede usar cualquier hardware y paquete de software disponible habitualmente. El sistema de control por ordenador y de toma de datos también está unido al conducto 200 para controlar el suministro de reactivos.
Los fotones generados en la reacción de secuenciamiento de pirofosfato son capturados por el CCD solo si pasan a través del dispositivo de enfoque (por ejemplo, una lente óptica o una fibra óptica) y son enfocados a un elemento CCD. Sin embargo, los fotones emitidos se escaparán igualmente en todas las direcciones. A fin de maximizar su posterior “captura” y cuantificación cuando se utiliza un sistema plano (por ejemplo, un chip de ADN), es preferible recolectar los fotones lo más próximos posible al punto en el que son generados, por ejemplo inmediatamente en el soporte sólido plano. Esto se logra: (i) utilizando aceite de inmersión entre la tira del cubre y una lente óptica tradicional o un haz de fibra óptica, o preferiblemente, (ii) incorporando fibras ópticas directamente sobre la propia tira del cubre. De forma similar, cuando se usa una superficie plana delgada ópticamente transparente, el haz de fibra óptica también puede colocarse contra su superficie posterior, eliminando la necesidad de “imagen” a través de la profundidad de toda la cámara de reacción/perfusión.
El evento de reacción, por ejemplo, los fotones generados por luciferasa, pueden detectarse y cuantificarse usando una variedad de aparatos de detección, por ejemplo, un tubo fotomultiplicador, un CCD, CMOS, un fotómetro de absorbancia, un luminómetro, un dispositivo de inyección de carga (CID), u otro detector de estado sólido, así como los aparatos descritos en la presente memoria. Preferiblemente, la cuantificación de los fotones emitidos se logra mediante el uso de una cámara CCD ajustada a un intensificador de placa de microcanales. Se puede usar un CCD de fondo afinado para aumentar la sensibilidad. Los detectores CCD se describen, por ejemplo, en Bronks y col., 1995, Anal. Chem. 65: 2750-2757.
Un ejemplo de sistema CCD es una cámara de 4 puertos Spectral Instruments Inc. (Tucson, AZ) Serie 600 con un chip CCD Lockheed-Martin LM485 y un conector de fibra óptica 1-1 (haz) con un diámetro de fibra individual de 6-8 μm. Este sistema tiene 4096 x 4096 píxeles, o más de 16 millones de píxeles y tiene una eficacia cuántica que oscila entre el 10% y > 40%. Por tanto, dependiendo de la longitud de onda, como mucho el 40% de los fotones que Se puede usar un resto fluorescente como marca y la detección de un evento de reacción se puede llevar a cabo usando un microscopio de barrido confocal para escanear la superficie de un sistema con un láser, o se dispone de otras técnicas tales como la microscopía de barrido óptico de campo cercano (SNOM) que son capaces de una menor resolución óptica, permitiendo de este modo el uso de sistemas “más densos”. Por ejemplo, usando SNOM, los polinucleótidos individuales pueden distinguirse cuando se separan una distancia de menos de 100 nm, por ejemplo 10 nm x 10 nm. Adicionalmente, se puede usar la microscopía de barrido de túnel (Binning y col., Helvetica Physica Acta, 55: 726-735, 1982) y la microscopía de fuerza atómica (Hanswa y col., Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct., 23: 115-139, 1994).
Aplicación de haplotipo
Virtualmente se puede lograr la aplicación de cualquier secuenciamiento usando los métodos y el aparato descritos en la presente memoria. Se contempla el mapeado de haplotipo. La diversidad genética humana es un factor importante de variabilidad de la respuesta del paciente frente a productos farmacéuticos. La mediad más precisa de la diversidad es el haplotipo, que es la organización de la variedad polimórfica tal como se encuentra en un cromosoma. Recientemente, investigadores importantes en el campo del genoma, tanto gubernamentales como académicos, en los EE.UU., Canadá y Europa han llegado al acuerdo de que los haplotipos son una herramienta poderosa que puede reducir la complejidad de la información genética de un modo práctico. Los haplotipos se pueden usar en el descubrimiento de fármacos para mejorar el resultado de la validación de dianas y de los estudios de escrutinio de fármacos para el desarrollo de fármacos para mejorar el diseño y la fiabilidad de los ensayos clínicos. Se pueden usar marcadores de haplotipo para predecir la eficacia y la seguridad de fármacos nuevos y aprobados y harán las veces de fundamento para un nuevo paradigma de medicina personalizada que unan pacientes al fármaco adecuado en la dosis adecuada a través de la guía de una base de datos de asociaciones de marcador clínicas.
Numerosos estudios empíricos han demostrado que los alelos SNP cercanos a menudo están en desequilibrio de enlace (LD, del inglés “linkage disequilibrium”) uno con el otro, de tal modo que el estado de un alelo SNP a menudo está altamente correlacionado con el alelo de otro SNP cercano. Estas correlaciones existen debido a la historia compartida de SNP´s ligados estrechamente, que son co-transmitidos de generación a generación. Los modelos de variación de secuencia humana (haplotipos) representan por tanto segmentos de ADN ancestral. Las meiosis históricas han disociado lentamente alelos de alelos vecinos en cromosomas ancestrales, excepto para las variantes ligadas estrechamente. La extensión del desequilibrio de enlace en las poblaciones fundadoras con cuellos de botella recientes había sido el objeto de numerosos estudios – particularmente en la clonación de trastornos Mendelianos simples tales como la fibrosis quística (16), la enfermedad de Huntington (11), la displasia diastrófica (DTD) (8). Mientras que estos estudios de clonación se beneficiaron de grandes segmentos cromosomales que muestran LD en expansión a lo largo de grandes distancias (a menudo en el rango de megabases), se disponía de muy pocos datos empíricos hasta recientemente en relación a LD a lo largo del genoma humano en la población mundial.
Nos centramos en tres ejemplos recientes de encuestas a gran escala de LD (y haplotipos): (véase, por ejemplo, Reich, D.E., Cargill, M., Bolk, S., Ireland, J., Sabeti, P.C., Richter, D.J., Lavery, T., Kouyoumjian, R., Farhadian, S.F., Ward, R. & Lander, E.S. 2001. “Linkage disequilibrium in the human genome”. Nature 411, 199-204.26). Muestreamos 19 regiones de cromosoma para determinar su contenido en SNP. La elevada frecuencia de intervalos de expansión de SNP de 2 a 160 kb fue genotipada por vez primera en muestras caucásicas. En todas las regiones, el LD fue detectable a distancias de aproximadamente 60 kb, con una diferencia significativa entre regiones, puesto que el rango fue de tan solo 6 kb en una localización y de hasta 155 kb en otra. Como era de esperar, el LD estaba significativamente correlacionado con las tasas de recombinación local estimadas. Un análisis adicional en una muestra nigeriana proporcionó evidencia de un LD más corto en esta población – aunque las combinaciones alélicas en distancias cortas fueron similares a las de la muestra caucásica. En general, este trabajo proporcionó evidencias de que grandes bloques de LD son comunes en el genoma humano, y de que el mapeado a nivel de genoma de genes de enfermedad será factible.
Kits
La descripción también comprende kits para uso en los métodos de la invención que podrían incluir uno o más de los siguientes componentes: (a) un cebador específico de ensayo que se hibrida con una muestra de ADN de tal modo que la posición diana está directamente adyacente al extremo 3’ del cebador; (b) una polimerasa; (c) un medio de detección enzimático para identificar la liberación de PPi; (d) desoxinucleótidos que incluyen, en lugar de dATP, un análogo de dATP que es capaz de actuar como sustrato para una polimerasa pero que es incapaz de actuar como sustrato para dicha enzima de detección de PPi; y (e) opcionalmente didesoxinucleótidos, opcionalmente ddATP que está siendo reemplazado por un análogo de ddATP que es capaz de actuar como un sustrato para una polimerasa pero que es incapaz de actuar como un sustrato para dicha enzima de detección de PPi. Si el kit es para uso con una amplificación PCR inicial, también podría incluir los siguientes componentes: (i) un par de cebadores para PCR, en donde al menos un cebador tiene los medios que permiten la inmovilización de dicho cebador; (ii) una polimerasa que es preferiblemente estable térmicamente, por ejemplo polimerasa Taq1; (iii) tampones para la reacción de PCR; En la presente memoria se describe un método para secuenciar ácidos nucleicos. El método implica la fragmentación de moléculas de ácido nucleico plantilla grandes para generar una pluralidad de ácidos nucleicos fragmentados. A continuación, los ácidos nucleicos fragmentados son suministrados a microrreactores acuosos en una emulsión agua-en-aceite de tal modo que una pluralidad de microrreactores acuosos comprende una única copia de un ácido nucleico fragmentado, una partícula individual capaz de unirse al ácido nucleico fragmentado, y la disolución de reacción de amplificación que contiene los reactivos necesarios para llevar a cabo una amplificación de ácido nucleico. En la siguiente etapa, los ácidos nucleicos fragmentados se amplifican en los microrreactores para formar copias amplificadas de los ácidos nucleicos y unir las copias amplificadas a las partículas en los microrreactores. A continuación, las partículas se suministran a un sistema de al menos 10.000 cámaras de reacción en una superficie plana, en donde una pluralidad de cámaras de reacción no comprende más de una partícula individual. Finalmente, se lleva a cabo una reacción de secuenciamiento simultáneamente sobre una pluralidad de cámaras de reacción.
También en la presente memoria se describe un sistema que comprende una superficie plana con una pluralidad de cavidades sobre ella, formando cada cavidad una cámara de reacción de analito, en donde las cámaras de reacción tienen un espaciado de centro a centro de entre 20 y 100 μm y cada cavidad tiene una anchura en al menos una dimensión de entre 20 μm y 70 μm. Además, en el sistema hay al menos 10.000 cámaras de reacción. Cada cámara de reacción puede contener al menos 100.000 copias de una especie individual de ácido nucleico plantilla de cadena sencilla.
En la presente memoria también se describe un sistema que comprende una superficie superior plana y una superficie inferior plana en donde la superficie superior plana tiene al menos 10.000 cavidades sobre ella, formando cada cavidad una cámara de reacción de analito, la superficie inferior plana es ópticamente conductora de tal modo que se pueden detectar las señales ópticas procedentes de las cámaras de reacción a través de la superficie inferior plana, en donde la distancia entre la superficie superior y la superficie inferior no es superior a 5 mm, en donde las cámaras de reacción tiene un espaciado de centro a centro de 20 a 100 μm, y cada cámara tiene una anchura en al menos una dimensión de entre 20 μm y 70 μm. La distancia entre la superficie superior y la superficie inferior, en una realización, no es mayor de 2 mm.
También se describe en la presente memoria un sistema para llevar a cabo reacciones comunes paralelas separadas en un entorno acuoso. El sistema puede comprender un sustrato que comprende al menos 10.000 cámaras de reacción discretas que contienen un material de partida que es capaz de reaccionar con un reactivo, estando dimensionadas cada una de las cámaras de reacción de tal modo que cuando se administra uno o más fluidos que contienen un reactivo a cada cámara de reacción, el tiempo de difusión para que el reactivo difunda fuera del pocillo excede al tiempo requerido para que el material de partida reaccione con el reactivo para formar un producto.
También se describe en la presente memoria un método para administrar un agente bioactivo a un sistema. El método comprende la dispersión sobre el sistema de una pluralidad de soportes sólidos móviles, teniendo cada soporte sólido móvil al menos un reactivo inmovilizado sobre él, en donde el reactivo es adecuado para uso en una reacción de secuenciamiento de ácido nucleico, en donde el sistema comprende una superficie plana con una pluralidad de cámaras de reacción dispuestas sobre ella. Las cámaras de reacción pueden tener un espaciado de centro a centro de entre 20 y 100 μm y cada cámara de reacción tiene una anchura en al menos una dimensión de entre 20 μm y 70 μm.
También se describe en la presente memoria un aparato para monitorizar simultáneamente un sistema de cámaras de reacción para detectar luz que indica que se está produciendo una reacción en un sitio particular. El aparato comprende (a) un sistema de cámaras de reacción formado a partir de un sustrato plano que comprende una pluralidad de superficies horadada, formando cada superficie horadada una cámara de reacción adaptada para contener analitos, y en donde las cámaras de reacción tienen un espaciado de centro a centro de entre 20 y 100 μm, teniendo cada cámara de reacción un volumen de 10 a 150 pL, comprendiendo el sistema más de 10.000 cámaras de reacción discretas; (b) un dispositivo ópticamente sensible dispuesto de tal modo que al usar la luz procedente de una cámara de reacción particular vulnerará una región predeterminada particular del dispositivo ópticamente sensible; (c) un sistema de determinación del nivel de luz procedente de cada una de las regiones predeterminadas; y (d) un sistema para registrar la variación del nivel de luz con el tiempo para cada una de las cámaras de reacción.
También se describe en la presente memoria un sensor analítico, que comprende (a) un sistema formado a partir de un primer haz de fibras ópticas con una pluralidad de superficies horadadas en un extremo del mismo, formando cada superficie horadada una cámara de reacción adaptada para contener analitos, y en donde las cámaras de reacción tienen un espaciado de centro a centro de entre 20 y 100 μm, una anchura de 20 a 70 μm, comprendiendo el sistema más de 10.000 cámaras de reacción discretas; (b) un sistema enzimático o fluorescente para generar luz en las cámaras de reacción; y (c) un sistema de detección de luz que comprende un medio de captura de luz y un segundo haz de fibra óptica para transmitir luz al sistema de detección de luz, estando el segundo haz de fibra óptica en contacto óptico con el sistema, de tal modo que la luz generada en una cámara de reacción individual es También se describe en la presente memoria un método para llevar a cabo reacciones comunes separadas en paralelo en un entorno acuoso. La primera etapa implica suministrar un fluido que contiene al menos un reactivo a un sistema, en donde el sistema comprende un sustrato que comprende al menos 10.000 cámaras de reacción discretas, cada cámara de reacción adaptada para contener analitos, y en donde las cámaras de reacción tienen un volumen de entre 10 y 150 pL, y que contienen un material de partida que es capaz de reaccionar con el reactivo, estando dimensionadas cada una de las cámaras de reacción de tal modo que cuando el fluido es suministrado a cada cámara de reacción el tiempo de difusión para que el reactivo difunda hacia el exterior del pocillo excede al tiempo requerido para que el material de partida reaccione con el reactivo para formar un producto. La segunda etapa implica lavar el fluido del sistema en el periodo de tiempo (i) después de que el material de partida haya reaccionado con el reactivo para formar un producto en cada cámara de reacción, pero (ii) antes de que el reactivo administrado a una cámara de reacción cualquiera se haya difundido fuera de la cámara de reacción hacia cualquier otra cámara de reacción.
También se describe en la presente memoria un método para suministrar enzimas de secuenciamiento de ácido nucleico a un sistema. El sistema tiene una superficie plana con una pluralidad de cavidades sobre ella, formando cada cavidad una cámara de reacción de analito, en donde las cámaras de reacción tienen un espaciado de centro a centro de entre 20 y 100 μm. El método implica la etapa de dispersar sobre el sistema una pluralidad de soportes sólidos móviles que tienen una o más enzimas de secuenciamiento de ácido nucleico inmovilizadas sobre ellos, de tal modo que una pluralidad de las cámaras de reacción contengan al menos un soporte sólido móvil.
También se proporciona en la presente memoria un método para suministrar una pluralidad de plantillas de ácido nucleico a un sistema. El sistema puede tener una superficie plana con una pluralidad de cavidades sobre ella, formando cada cavidad una cámara de reacción de analito, en donde las cámaras de reacción tienen un espaciado de centro a centro de entre 20 y 100 μm y teniendo el sistema al menos 10.000 cámaras de reacción. El método comprende la etapa de dispersar sobre el sistema una pluralidad de soportes sólidos móviles, no teniendo cada soporte sólido móvil más de una especie individual de plantilla de ácido nucleico inmovilizada sobre él, provocando la dispersión que no más de soporte sólido móvil se disponga dentro de una cámara de reacción cualquiera.
También se describe en la presente memoria un método para secuenciar un ácido nucleico. El método comprende la etapa de proporcionar una pluralidad de plantillas de ácido nucleico de cadena sencilla dispuestas dentro de una pluralidad de cavidades sobre una superficie plana, formando cada cavidad una cámara de reacción de analito, en donde las cámaras de reacción tienen un espaciado de centro a centro de entre 20 y 100 μm y la superficie plana tiene al menos 10.000 cámaras de reacción. La siguiente etapa implica llevar a cabo una reacción de secuenciamiento basada en pirofosfato simultáneamente en todas las cámaras de reacción mediante la maduración de una cantidad efectiva de un cebador de secuencia con las plantillas de ácido nucleico, y extender el cebador de secuenciamiento con una polimerasa y un trifosfato de nucleótido predeterminado para dar lugar a un producto de secuenciamiento y, si el trifosfato de nucleótido predeterminado se incorpora sobre el extremo 3’ del cebador de secuenciamiento, un subproducto de la reacción de secuenciamiento. La tercera etapa implica la identificación del subproducto de la reacción de secuenciamiento, determinando con ello la secuencia del ácido nucleico en cada cámara de reacción.
También se proporciona en la presente memoria un método para determinar la secuencia base de una pluralidad de nucleótidos en un sistema. La primera etapa implica proporcionar al menos 10.000 plantillas de ADN, dispuestas cada una por separado dentro de una pluralidad de cavidades sobre una superficie plana, formando cada cavidad una cámara de reacción de analito, en donde las cámaras de reacción tienen un espaciado de centro a centro de entre 20 y 100 μm, y un volumen de entre 10 y 150 pL. La segunda etapa implica añadir un precursor de 5’-trifosfato de nucleótido activado de una base nitrogenada conocida a una mezcla de reacción en cada cámara de reacción, comprendiendo cada mezcla de reacción una polimerasa de nucleótido dirigida por plantilla y una plantilla de polinucleótido de cadena sencilla hibridada con una cadena cebadora de oligonucleótido complementaria al menos un residuo más corta que las plantillas para formar al menos un residuo de nucleótido desparejado en cada plantilla en el extremo 3’ de la cadena cebadora, en las condiciones de reacción que permiten la incorporación del precursor de 5’-trifosfato de nucleósido activado sobre el extremo 3’ de las cadenas de cebador, siempre que la base nitrogenada del precursor de 5’-trifosfato de nucleósido activado sea complementario a la base nitrogenada del residuo de nucleótido desparejado de las plantillas. La tercera etapa implica detectar si el precursor de 5’-trifosfato de nucleósido se incorporó o no a las cadenas de cebador, en donde la incorporación del precursor de 5’-trifosfato de nucleósido indica que el residuo de nucleótido desparejado de la plantilla tiene la composición de bases nitrogenadas que es complementaria a la del precursor de 5’-trifosfato de nucleósido. La cuarta etapa implica repetir secuencialmente las etapas (b) y (c), en donde cada repetición secuencial añade y detecta la incorporación de un tipo de precursor de 5’-trifosfato de nucleósido activado de composición de base nitrogenada conocida. La quinta etapa implica determinar la secuencia de bases de los residuos de nucleótido desparejados de la plantilla en cada cámara de reacción a partir de la secuencia de incorporación de los precursores de nucleósido.
En la presente memoria también se describe un método para identificar la base en una posición diana de una secuencia de ADN de ADN plantilla. La primera etapa implica proporcionar al menos 10.000 plantillas de ADN separadas dispuestas dentro de una pluralidad de cavidades sobre una superficie plana, formando cada cavidad una cámara de reacción de analito, en donde las cámaras de reacción tiene un espaciado de centro a centro de entre 20 y 100 μm, haciendo el ADN de cadena sencilla antes o después de ser dispuesto en las cámaras de reacción. La segunda etapa implica proporcionar un cebador de extensión que se hibrida al ADN de cadena sencilla inmovilizado en una posición inmediatamente adyacente a la posición diana. El ADN de cadena sencilla inmovilizado es sometido a una reacción de polimerasa en presencia de un desoxinucleótido o didesoxinucleótido predeterminado, en donde si el desoxinucleótido o didesoxinucleótido predeterminado se incorpora sobre el extremo 3’ del cebador de secuenciamiento, entonces se forma un subproducto de reacción de secuenciamiento. La cuarta etapa implica identificar el subproducto de reacción de secuenciamiento, determinando con ello el nucleótido complementario a la base en la posición diana de cada una de las 10.000 plantillas de ADN.
También se describe en la presente memoria un aparato para analizar una secuencia de ácido nucleico. El aparato comprende: (a) una cubeta de administración de reactivo, en donde la cubeta incluye un sistema que comprende una superficie plana con una pluralidad de cavidades sobre ella, formando cada cavidad una cámara de reacción de analito, en donde las cámaras de reacción tienen un espaciado de centro a centro de entre 20 y 100 μm, y existe un exceso de 10.000 cámaras de reacción, y en donde la cubeta de administración de reactivo contiene reactivos para uso en una reacción de secuenciamiento; (b) un sistema de administración de reactivos comunicado con la cubeta de administración de reactivos; (c) un sistema de imagen comunicado con la cámara de administración de reactivos; y (d) un sistema de recolección de datos comunicado con el sistema de imagen.
En la presente memoria se proporciona un aparato para determinar la secuencia de bases de una pluralidad de nucleótidos sobre un sistema. El aparato comprende: (a) una cubeta de reactivos que contiene una pluralidad de cavidades sobre una superficie plana, formando cada cavidad una cámara de reacción de analito, en donde hay un exceso de 10.000 cámaras de reacción, que tienen cada una un espaciado de centro a centro de entre 20 y 100 μm y un volumen de entre 10 y 150 pL; (b) un sistema de administración de reactivos para añadir simultáneamente a cada cámara de reacción un precursor de 5’-trifosfato de nucleótido activado de una base nitrogenada conocida a una mezcla de reacción en cada cámara de reacción, comprendiendo cada mezcla de reacción una polimerasa de nucleótido dirigida por plantilla y una plantilla de polinucleótido de cadena sencilla hibridada a una cadena cebadora de oligonucleótido complementaria de al menos un residuo de nucleótido más corta que las plantillas, para formar al menos un residuo de nucleótido desparejado en cada plantilla en el extremo 3’ de la primera cadena, en las condiciones de reacción que permiten la incorporación del precursor de 5’-trifosfato de nucleósido activado sobre el extremo 3’ de las cadenas cebadoras, siempre que la base nitrogenada del precursor de 5’-trifosfato de nucleósido activado sea complementario a la base nitrogenada del residuo de nucleótido desparejado de las plantillas; (c) un sistema de detección para detectar en cada cámara de reacción si el precursor de 5’-trifosfato de nucleósido se ha incorporado o no en las cadenas cebadores, en donde la incorporación del precursor de 5’-trifosfato de nucleósido indica que el residuo de nucleótido desparejado de la plantilla tiene una composición de base nitrogenada que es complementaria a la del precursor de 5’-trifosfato de nucleósido incorporado; y (d) un sistema para repetir secuencialmente (b) y (c), en donde cada repetición secuencial añade y detecta la incorporación de un tipo de precursor de 5’-trifosfato de nucleósido activado de composición de bases nitrogenadas conocida; y (e) un sistema de procesamiento de datos para determinar la secuencia de bases de los residuos de nucleótido desparejados de la plantilla simultáneamente en cada cámara de reacción a partir de la secuencia de incorporación de los precursores de nucleósido.
También se describe en la presente memoria un aparato para procesar una pluralidad de analitos. El aparato comprende: (a) una cámara de flujo que tiene dispuesta sobre ella un sustrato que comprende al menos 50.000 superficies horadadas sobre un haz de fibra óptica, formando cada superficie horadada una cámara de reacción adaptada para contener analitos, y en donde las cámaras de reacción tienen un espaciado de centro a centro de entre 20 y 100 μm y un diámetro de 20 a 70 μm; (b) un medio de fluido para administrar reactivos de procesamiento desde uno o más reservorios a la cámara de flujo de tal modo que los analitos dispuestos en las cámaras de reacción son expuestos a los reactivos; y (c) un sistema de detección para detectar simultáneamente una secuencia de señales ópticas desde cada una de las cámaras de reacción, siendo indicativa cada señal óptica de la secuencia de una interacción entre un reactivo de procesamiento y el analito dispuesto en la cámara de reacción, en donde el sistema de detección está comunicado con las superficies horadadas.
También se proporciona en la presente memoria un método para secuenciar un ácido nucleico. La primera etapa implica proporcionar una pluralidad de plantillas de ácido nucleico de cadena sencilla en un sistema que tenga al menos 50.000 sitios de reacción discretos. La segunda etapa implica poner en contacto las plantillas de ácido nucleico con los reactivos necesarios para llevar a cabo una reacción de secuenciamiento basada en pirofosfatos acoplada a la emisión de luz. La tercera etapa implica detectar la luz emitida desde una pluralidad de sitios de reacción sobre las respectivas porciones de un dispositivo ópticamente sensible. La cuarta etapa implica convertir la luz generada en cada una de las porciones del dispositivo ópticamente sensible en una señal eléctrica que es distinguible de las señales procedentes de los demás sitios de reacción. La quinta etapa implica determinar la secuencia de las plantillas de ácido nucleico en base a la emisión de luz de cada uno de los sitios de reacción discretos a partir de la correspondiente señal eléctrica.
También se describe en la presente memoria un método para secuenciar ácidos nucleicos. La primera etapa implica fragmentar grandes moléculas de ácido nucleico plantilla para generar una pluralidad de ácidos nucleicos fragmentados. La segunda etapa implica unir una cadena de una pluralidad de los ácidos nucleicos fragmentados individualmente a partículas para generar ácidos nucleicos de cadena sencilla unidos individualmente a partículas. La tercera etapa implica administrar una población de los ácidos nucleicos fragmentados de cadena sencilla unidos individualmente a partículas a un sistema de al menos 10.000 cámaras de reacción sobre una superficie plana, en donde una pluralidad de los pocillos no comprende más de una partícula con un único ácido nucleico fragmentado de cadena sencilla. La cuarta etapa implica llevar a cabo una reacción de secuenciamiento simultáneamente sobre una pluralidad de las cámaras de reacción. La reacción de secuenciamiento puede tener las etapas de (a) madurar una cantidad efectiva de un cebador de secuencia a las plantillas de ácido nucleico fragmentado de cadena sencilla y extender el cebador de secuencia con una polimerasa y un trifosfato de nucleótido predeterminado para producir un producto de secuenciamiento y, si el trifosfato de nucleótido predeterminado se incorpora sobre el extremo 3’ del cebador de secuenciamiento, un subproducto de reacción de secuenciamiento; y (b) identificar el subproducto de la reacción de secuenciamiento, determinando con ello la secuencia del ácido nucleico en una pluralidad de las cámaras de reacción. Alternativamente, la reacción de secuenciamiento puede comprender las etapas de: (a) hibridar dos o más cebadores de secuenciamiento a una o una pluralidad de cadenas sencillas de moléculas de ácido nucleico en donde todos los cebadores excepto uno son cebadores bloqueados reversiblemente; (b) incorporar al menos una base sobre la molécula de ácido nucleico mediante alargamiento de polimerasa a partir de un cebador desbloqueado; (c) evitar un alargamiento adicional del cebador desbloqueado; (d) desbloquear uno de los cebadores bloqueados reversiblemente para dar lugar a un cebador desbloqueado; y (e) repetir las etapas (b) a
(d) hasta que al menos uno de los cebadores bloqueados reversiblemente sea desbloqueado y usado para determinar una secuencia.
Ejemplos
Ejemplo 1: Preparación de muestra
Muestra de ADN:
El ADN debería ser de alta calidad y estar libre de contaminantes tales como proteínas, nucleasas, lípidos y otros productos químicos (tal como EDTA residual de la preparación) y sales. Es preferible que el ADN genómico tenga una relación 260/280 de 1,8 o superior. Si se desea secuenciar el genoma solo de un organismo, entonces se debería comprobar la calidad del ADN para asegurar que no hay ADN contaminante. Por ejemplo: una preparación de ADN humano puede comprobarse mediante PCR para asegurar que no está contaminado por moléculas de ADN bacterianas. Otro método para comprobar la contaminación es mediante modelos de digestión de restricción y especialmente digestión de restricción seguida de Southern Blot usando sondas adecuadas que se conozca que son específicas de un organismo (por ejemplo, humano o ratón) y una segunda sonda que se conozca que es específica de un posible organismo contaminante (por ejemplo, E. coli). Si se desea, el ADN debería proceder de un solo clon del organismo (por ejemplo, una colonia si es de bacterias).
Etapa 1: Digestión de ADNasa I
El propósito de la etapa de digestión con ADNasa I es fragmentar un tira grande de ADN tal como un genoma completo o una porción grande de un genoma en trozos más pequeños. Esta población de especies de ADN de tamaño más pequeño generada a partir de una plantilla de ADN individual se denomina “biblioteca”. La desoxirribonucleasa I (ADNasa I) es una endonucleasa que rompe ADN plantilla de cadena doble. Las características de ruptura de la ADNasa I permiten una digestión aleatoria de la plantilla de ADN (es decir, un sesgo mínimo de secuencia) y darán como resultado la predominancia de fragmentos de ADN de cadena doble de extremo romo cuando se usan en presencia de tampones basados en manganeso (Melgar y Goldthwait 1968). La digestión de plantillas genómicas mediante ADNasa I depende de tres factores: i) la cantidad de enzima usada (unidades); ii) la temperatura de digestión (ºC); y iii) el tiempo de incubación (minutos). Las condiciones de digestión de ADNasa I descritas más adelante fueron optimizadas para producir bibliotecas de ADN en un intervalo de tamaños de 50-700 pares base (pb).
1.
Se obtuvo ADN y se preparó a una concentración de 0,3 mg/mL en Tris-HCl (10 mM, pH 7-8). Se necesitó un total de 134 μL de ADN (15 μg) para dicha preparación. Se recomienda no usar preparaciones de ADN diluidas con tampones que contengan EDTA (es decir, TE, Tris/EDTA). La presencia de EDTA inhibe la digestión enzimática con ADNasa I. Si la preparación de ADN contiene EDTA, es importante que el ADN sea “salado” fuera de la disolución y reconstituido con el tampón Tris-HCl apropiado (10 mM, pH 7-8) o con H2O nanopura (pH 7-8).
2.
En un tubo de 0,2 mL, se preparó el tampón de ADNasa I, que comprende 50 μL de Tris pH 7,5 (1 M), 10 μL de MnCl2 (1 M), 1 μL de BSA (100 mg/mL) y 39 μL de agua.
3.
En un tubo de 0,2 mL separado, se añaden 15 μL de tampón de ADNasa I y 1,5 μL de ADNasa I (1 U/mL). El tubo de reacción se colocó en un termociclador fijado a 15ºC.
4.
Los 134 μL de ADN (0,3 mg/mL) se añadieron al tubo de reacción de ADNasa I colocado en el termociclador fijado a 15ºC. Se cerró la tapa y la muestra se incubó durante exactamente 1 minuto. Después de la incubación, se añadieron 50 μL de EDTA 50 mM para detener la digestión enzimática.
5.
El ADN digerido fue purificado usando el kit de purificación PCR QiaQuick. A continuación la reacción de digestión fue dividida en cuatro alícuotas, y se usaron cuatro columnas de giro para purificar cada alícuota (37,5 μL por columna de giro). Cada columna fue eluída con 30 μL de tampón de elución (EB) según el protocolo del fabricante. Los eluatos se combinaron entonces para generar un volumen de reacción de 120 μL.
6.
Se rescató una alícuota de 3 μL de la reacción de digestión para análisis usando un BioAnalyzer DNA 1000 LabChip.
Etapa 2: Pulido con Pfu
La digestión de plantillas de ADN con ADNasa I produce fragmentos de ADN que principalmente tienen extremos romos, sin embargo, algunos fragmentos tendrán extremos que contienen términos protuberantes que tienen una longitud de uno o dos nucleótidos. Se usa el pulido con Pfu para aumentar la cantidad de especies con extremos romos mediante llenado (es decir, “enromado”) de los elementos salientes 5’. Adicionalmente, la Pfu ADN polimerasa tiene una actividad de exonucleasa 3’-5 que dara como resultado la eliminacion de extensiones de nucleótido sencillas y dobles. El pulido con Pfu aumenta la cantidad de fragmentos de ADN de extremo romo disponibles para la ligación de adaptador (Costa 1994a, 1994b, 1994c). Se usó el siguiente protocolo de pulido con Pfu.
1.
En un tubo de 0,2 mL, se añadieron ordenadamente 115 μL de fragmentos purificados digeridos con ADNasa-I, 15 μL de 10X tampón de Pfu clonado, 5 μL de dNTPs (10 mM) y 15 μL de ADN polimerasa de Pfu clonado (2,5 U/μL).
2.
Los componentes de reacción de pulido se mezclaron bien y se incubaron a 72ºC durante 30 minutos.
3.
Tras la incubación, el tubo de reacción se extrajo y se llevó a hielo durante 2 minutos.
4.
A continuación la mezcla de reacción de pulido se dividió en cuatro alícuotas y se purificó usando columnas de purificación de PCR QiaQuick (37,5 μL en cada columna). Cada columna fue eluída con 30 μL de tampón EB según el protocolo del fabricante. Los eluatos fueron combinados a continuación para generar un volumen de reacción final de 120 μL.
5.
Se rescató una alícuota de 3 μL de la reacción de pulido final para análisis usando un BioAnalyzer DNA 1000 LabChip.
Etapa 3: Ligación de adaptadores universales a biblioteca de ADN fragmentado
Después de la fragmentación y pulido de la biblioteca de ADN genómico, se añaden las secuencias de cebador a los extremos de cada fragmento de ADN. Estas secuencias de cebador se denominan “Adaptadores Universales” y están compuestas de oligonucleótidos de cadena doble que contienen regiones cebadoras específicas que posibilitan la amplificación PCR y el secuenciamiento de nucleótidos. Los adaptadores universales se diseñan para incluir un conjunto de regiones de cebado PCR únicas que tienen una longitud de 20 pares base localizadas adyacentes a un conjunto de regiones de cebado de secuenciamiento únicas que tienen una longitud de 20 pares base, seguido de una “llave” única de 4 bases que consiste en uno de cada desoxirribonucleótido (es decir, A, C, G, T). Cada adaptador universal (denominados “adaptador universal A” y “adaptador universal B”) tiene una longitud de cuarenta y cuatro pares base (44 pb). Los adaptadores universales son ligados, usando T4 ADN ligasa, sobre cada extremo del fragmento de ADN para generar una adición total de nucleótidos de 88 pb sobre cada fragmento de ADN. Se diseñan diferentes adaptadores universales específicamente para cada preparación de biblioteca de ADN genómico y por tanto proporcionarán un identificador único para cada organismo.
Para preparar un par de adaptadores universales, se diseñan oligonucleótidos de cadena sencilla en casa y se fabrican a través de un vendedor comercial. Los oligonucleótidos de ADN de adaptador universal se diseñan con dos enlaces fosforotioato en cada extremo del oligonucleótido, que sirven para proteger contra la actividad de nucleasa (Samini, T.D., B. Jolles y A. Laigle. 2001. “Best minimally modified antisense oligonucleotides according to cell nuclease activity. Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 11(3): 129, cuya descripción se incorpora en su totalidad a la presente memoria a modo de referencia). Todos los oligonucleótidos son purificados mediante HPLC para asegurar que no quedan secuencias de oligonucleótido de ADN contaminantes o espurias en la preparación final.
Los adaptadores universales se diseñan para permitir la ligación direccional al ADN genómico fragmentado de extremos romos. Para cada par de adaptador universal, la región cebadora de PCR contiene un saliente 5’ de cuatro bases y una región llave 3’ de extremo romo. La direccionalidad se consigue cuando el lado del extremo romo del adaptador universal se liga al fragmento de ADN de extremo romo, mientras que el saliente 5’ del adaptador no puede ligarse con el fragmento de ADN de extremo romo. Adicionalmente, según se añade biotina 5’ al adaptador universal B para permitir el posterior aislamiento de plantilla ssADN (Etapa 8). Cada adaptador universal se prepara madurando, en un único tubo, los dos oligonucleótidos de ADN complementarios de cadena sencilla (es decir, un oligonucleótido que contiene la secuencia sentido y el segundo oligonucleótido que contiene la secuencia antisentido). Se usó el siguiente protocolo de ligación.
1.
En un tubo de 0,2 mL, se añadieron por orden 39 μL de nH2O (agua de grado biología molecular), 25 μL de
2.
A continuación la reacción de ligación se extrajo y una alícuota de 10 μL de la reacción de ligación se purificó para uso en el BioAnalyzer. Se usó una única columna de giro del kit Qiagen Min-Elute. La columna fue eluida con 10 μL de EB de acuerdo con el procedimiento seguido por el protocolo del fabricante. Se cargó una alícuota de 1 μL de la reacción de ligación purificada usando un BioAnalyzer DNA 1000 LabChip. Esta etapa de purificación está recomendada ya que la reacción de ligación contiene cantidades elevadas de sal y PEG que inhibirán la muestra de correr apropiadamente en el BioAnalyzer.
3.
El resto de la reacción de ligación (190 μL) se usó para aislamiento en gel en la etapa 4.
Etapa 3a: Filtración con Microcon y construcción de adaptador. Tiempo total de preparación: aproximadamente 25 minutos.
La reacción de ligación de adaptador universal requiere un exceso de 100 a 1 de adaptadores. Para ayudar a la eliminación de dichos adaptadores de exceso, la biblioteca de ADNg de cadena doble se filtra a través de un dispositivo de filtración Microcon YM-100. Se pueden usar membranas YM-100 para eliminar el ADN de cadena doble que sea más pequeño de 125 pb. Por tanto, los adaptadores no ligados (44 pb), así como los dímeros de adaptador (88 pb) se pueden eliminar de la población de biblioteca de ADNg ligada. Se usó el siguiente protocolo de ligación:
1.
Los 190 μL de la reacción de ligación de la Etapa 4 se aplicaron en un montaje de dispositivo Microcon YM-100.
2.
El dispositivo se colocó en una centrífuga y se giró a 5.000 x g durante aproximadamente 6 minutos, o hasta que la membrana estuvo casi seca.
3.
Para lavar se añadieron 200 μL de 1X TE.
4.
La muestra se giró a 5.000 x g durante otros 9 minutos, o hasta que la membrana estuvo casi seca.
5.
Para la recuperación, se insertó el reservorio en un nuevo vial y se giró a 3.000 x g durante 3 minutos. Se desechó el reservorio. El volumen recuperado fue de aproximadamente 10 μL. A continuación se añadieron 80 μL de TE.
Los adaptadores (A y B) fueron purificados mediante HPLC y modificados con enlaces fosforotioato antes de su utilización. Para el adaptador A (10 μM), se mezclaron 10 μL de adaptador A 100 μM (44 pb, sentido) con 10 μL de adaptador A 100 μM (40 pb, antisentido), y 30 μL de 1X tampón de maduración (Vf = 50 μL). Los cebadores fueron madurados usando el programa ANNEAL en el ciclador Sample Prep Labthermal (ver más adelante). Para el adaptador B (10 μM), se mezclaron 10 μL de adaptador B 100 μM (44 pb, sentido) con 10 μL de adaptador B 100 μM (40 pb, antisentido), y 30 μL de 1X tampón de maduración (Vf = 50 μL). Los cebadores fueron madurados usando el programa ANNEAL en el ciclador Sample Prep Labthermal. Los conjuntos de adaptadores podrían almacenarse a 20ºC hasta su uso.
ANNEAL-Un programa para la maduración de cebador:
1.
Incubar a 95ºC, 1 minuto;
2.
Disminuir la temperatura hasta 15ºC, a 0,1 ºC/s; y
3.
Mantener a 15ºC.
No se requería una orientación para el fragmento de inserción de ADN genómico y los adaptadores. Los fragmentos se podían ligar en cualquier extremo. Se incluyeron cuatro oligonucleótidos de ADN de cadena sencilla en el conjunto de adaptadores universales. Cada oligonucleótido de cadena sencilla fue sintetizado a una escala de 1 micromol y se purificó con HPCL. Cada oligonucleótido de cadena sencilla incluyó cuatro enlaces de fosforotioato en cada extremo.
Etapa 4: Electroforesis de gel y extracción de biblioteca de ADN adaptada
El protocolo de ligación de adaptador universal produce lo siguiente: 1) ADNs fragmentados con adaptadores en cualquier extremo; 2) adaptadores individuales no ligados; o 3) la formación de dímeros de adaptador. Se usa la electroforesis de gel como método para separar y aislar la población de biblioteca de ADN adaptada a partir de las poblaciones de adaptadores individuales no ligados y de dímeros de adaptador. El procedimiento de digestión con ADNasa I de ADN genómico produce una población de biblioteca que oscila entre 50 y 700 pb (Etapa 1). La adición del conjunto de adaptador universal de 88 pb desplazará la población a un tamaño mayor y dará como resultado un perfil de migración en el intervalo de tamaños de aproximadamente 130-800 pb. Los dímeros de adaptador migrarán a 88 pb y los adaptadores no ligados migrarán a 44 pb. Por lo tanto, las bibliotecas de ADN genómico con rangos de
1.
Se preparó un gel de agarosa al 2%.
2.
Se añadieron 10 μL de 10X colorante listo para cargar (“Ready-Load Dye”) a los restantes 90 μL de la mezcla de ligación de ADN.
3.
La mezcla de colorante/ligación se cargó en el gel usando cuatro calles adyacentes (25 μL por calle).
4.
Se cargaron 10 μL de la escalera de 100 pb (0,1 μg/μL) a dos calles de las calles de reacción de ligación.
5.
Se corrió el gel a 100V durante 3 horas.
6.
Cuando el recorrido del gel se completó, se retiró el gel de la caja de geles y se transfirió a una superficie plana cubierta con un envoltorio de plástico. Se visualizaron las bandas de ADN usando una luz UV de onda larga sostenida a mano. Usando un escalpelo desechable esterilizado, se cortaron fragmentos de tamaños de 200-400 pb del gel de agarosa. Usando esta estrategia, se pueden aislar bibliotecas de cualquier rango de tamaños. También es posible aislar más de un rango de tamaños. Cuando el intervalo de tamaños de la biblioteca es 200-900 pb, es posible aislar varios rangos de tamaño desde un pocillo individual (es decir, 200-400 pb y 500-700 pb).
7.
El ADN embebido en el gel de agarosa fue aislado usando el kit de extracción de gel Qiagen MinElute siguiendo las instrucciones del fabricante. Resumidamente, se añadió tampón QG para cubrir la agarosa en el tubo. Se permitió que la agarosa se disolviera completamente. Se mantuvo el color del tampón QG ajustando el pH de acuerdo con las instrucciones de Qiagen para minimizar la pérdida de muestra. Para la purificación se usaron dos columnas de giro MinElute (Qiagen). El gran volumen de agarosa disuelta requirió que cada columna fuera cargada varias veces. Las columnas fueron eluidas con 10 μL de tampón EB que había sido precalentado a 55ºC. Los eluatos se agruparon para producir 20 μL de biblioteca de ADNg.
8.
Se analizó una alícuota de 1 μL de cada biblioteca de ADN aislada usando un BioAnalyzer DNA 1000 LabChip para determinar la distribución exacta de la población de biblioteca de ADN.
Etapa 5: Desplazamiento de cadena y extensión de librería de ADN de cadena doble mellada
Debido a que los oligonucleótidos de ADN usados para los adaptadores universales no están fosforilados, hay huecos presentes en las intersecciones 3’ de los ADNgs fragmentados. Estos dos “huecos” o “melladuras” se pueden rellenar usando una ADN polimerasa de desplazamiento de cadena. La polimerasa reconoce melladuras, desplaza las cadenas melladas y extiende la cadena de un modo que da como resultado la reparación de melladuras y la formación de ADN de cadena doble no mellado. La enzima de desplazamiento de cadena usada es el fragmento grande de Bst ADN polimerasa.
1.
En un tubo de 0,2 mL, se añadieron por orden 19 μL de biblioteca de ADN extraída con gel, 40 μL de nH2O, 8 μL de 10X tampón de reacción ThermoPol, 8 μL de BSA (1 mg/mL), 2 μL de dNTPs (10 mM) y 3 μL de Bst I polimerasa (8 U/μL).
2.
Las muestras se mezclaron bien y se colocaron en un termociclador y se incubaron usando el programa de incubación de desplazamiento de cadena: “BST”. El programa BST para el desplazamiento y extensión de cadena de ADN de cadena doble mellado:
1.
Incubar a 65ºC, 30 minutos;
2.
Incubar a 80ºC, 10 minutos;
3.
Incubar a 58ºC, 10 minutos; y
4.
Mantener a 14ºC.
3.
Se corrió una muestra de 1 μL de la biblioteca de ADN tratada con Bst usando un BioAnalyzer DNA 1000 LabChip.
Etapa 6: Preparación de partículas de estreptavidina
Después de la generación de ADN genómico de cadena doble sin melladuras, es necesario aislar ADNs genómicos de cadena sencilla que contienen secuencias de adaptador universal flanqueantes. Esta etapa describe la unión de ADN de cadena doble marcado con biotina a partículas de estreptavidina. Para preparar las partículas de estreptavidina se usó el siguiente protocolo.
1.
Se lavaron 100 μL de partículas de estreptavidina Dynal M-270 dos veces con 200 μL de 1X tampón de unión
2.
Las partículas fueron resuspendidas en 100 μL de 2X tampón de unión, a continuación se añadió el resto de 79 μL de la muestra de ADN tratada con Bst (procedente de la Etapa 5) y 20 μL de agua.
3.
La disolución de partículas se mezcló bien y se colocó sobre un rotador de tubos a temperatura ambiente durante
5 20 minutos. Las mezclas de partículas fueron lavadas, usando el MPC, dos veces con 100 μL de 1X tampón de unión, a continuación se lavaron dos veces con nH2O. Se preparó tampón Binding & Washing (B&W) (2X y 1X): 2X B&W mezclando Tris·HCl 10 mM (pH 7,5), EDTA 1 mM y NaCl 2 M. Los reactivos se combinaron como se ha enumerado anteriormente y se mezclaron intensamente. La disolución se puede almacenar a temperatura ambiente durante 6 meses; se preparó tampón 1X B&W mezclando tampón 2X B&W con nH2O, 1:1. Las concentraciones finales fueron la mitad de las anteriores, es decir, Tris·HCl 5 mM (pH 7,5), EDTA 0,5 mM y NaCl 1 M.
Etapa 7: Aislamiento de biblioteca de ADN de cadena sencilla usando partículas de estreptavidina
Después de la unión de la biblioteca de ADNg de cadena doble a partículas de estreptavidina, es preferible aislar del conjunto ligado sólo los ADNgs de cadena sencilla que contiene adaptador universal A y adaptador universal B (las poblaciones deseadas se designan abajo con asteriscos). Los conjuntos de fragmento de ADN genómico de cadena
15 doble tendrán adaptadores ligados en las siguientes configuraciones posibles:
Adaptador universal A – Fragmento de ADNg – Adaptador universal A
Adaptador universal B – Fragmento de ADNg – Adaptador universal A*
Adaptador universal A – Fragmento de ADNg – Adaptador universal B*
Adaptador universal B – Fragmento de ADNg – Adaptador universal A
Debido a que solo el adaptador B tiene un resto de biotina 5’, se pueden usar las partículas magnéticas que contienen estreptavidina para unir todas las especies de la biblioteca de ADNg que poseen el adaptador universal B. Las poblaciones de biblioteca genómica que contienen dos especies de adaptador universal A (o especies no ligadas) no se unen a partículas que contienen estreptavidina y son eliminadas durante el procedimiento de lavado. Las especies que permanecen ligadas a la partícula después del lavado incluyen aquellas con los adaptadores
25 universales A y B, o aquellas con dos extremos de adaptador universal B.
Las especies de ADN genómico con dos secuencias de adaptador universal B con dos moléculas de biotina se pueden unir a las partículas que contienen estreptavidina en ambos extremos. Las especies con adaptadores A y B que solo tienen una molécula de biotina se pueden unir a las partículas solo en el extremo “B”. Para aislar la población de cadena sencilla, el ADN de cadena doble ligado a partículas es tratado con una disolución de hidróxido sódico que sirve para romper los enlaces de hidrógeno entre las cadenas de ADN complementarias. Si el fragmento de ADN tiene biotina en cada extremo (extremos de adaptador universal B), las dos cadenas sencillas resultantes permanecen ligadas a las partículas. Si el fragmento tiene solo una biotina individual (adaptadores universales A y B), entonces la cadena complementaria se separa del complejo ADN-partícula.
La biblioteca de ADN genómico de cadena sencilla resultante se recolecta a partir de la fase en disolución y se
35 cuantifica, por ejemplo, usando secuenciamiento de pirofosfato (PyroSequence) o usando un RNA Pico 6000 LabChip (Agilent, Palo Alto, CA). Las bibliotecas de ADN genómico de cadena sencilla se cuantifican calculando el número de moléculas por unidad de volumen. A continuación las moléculas de ADNg de cadena sencilla son maduradas (a media copia por partícula para obtener una copia efectiva por partícula) con partículas de sepharose de 25-30 μm que contienen cebadores de captura (cebador B de PCR). A continuación las plantillas son amplificadas usando protocolos de reacción en cadena de polimerasa en emulsión. El secuenciamiento posterior se puede llevar a cabo usando técnicas conocidas. Para el aislamiento de la biblioteca de cadena sencilla se usó el siguiente protocolo.
1. Se añadieron 250 μL de disolución de fusión (NaOH 0,125 M, NaCl 0,1 M) a las partículas lavadas de la Etapa 6 anterior.
45 2. La disolución de partículas se mezcló bien y la mezcla de partículas se incubó a temperatura ambiente durante 10 minutos sobre un rotador de tubos.
3.
Se usó un MPC Dynal (concentrador de partículas magnéticas), las partículas fueron retiradas con cuidado y el sobrenadante se dejó a un lado. Los 250 μL de sobrenadante incluyeron la biblioteca de ADN de cadena sencilla.
4.
En un tubo separado, se añadieron 1250 μL de PB (del kit de purificación QiaQuick) y la disolución se neutralizó añadiendo 9 μL de ácido acético al 20%.
5.
Usando un MPC Dynal se aglomeraron las partículas del sobrenadante de 250 μL que incluían la biblioteca de ADNg de cadena sencilla y el sobrenadante fue retirado cuidadosamente y transferido a la recién preparada disolución de PB/ácido acético.
6.
Los 1500 μL de la disolución fueron purificados usando una única columna de giro de purificación QiaQuick (cargar la muestra a través de la misma columna dos veces a 750 μL por carga). La biblioteca de ADN de cadena sencilla fue eluida con 50 μL de EB.
Etapa 8a: Cuantificación de ADNg de cadena sencilla usando secuenciamiento de pirofosfato. Tiempo total de preparación: aproximadamente 1 hora.
1. En un tubo de 0,2 mL se añadieron los siguientes reactivos en orden:
25 μL de ADNg de cadena sencilla
1 μL de cebador de secuenciamiento MMP2B
14 μL de tampón de maduración de biblioteca
40 μL en total
2.
Se dejó madurar el ADN usando el programa ANNEAL-S (véase el Apéndice más adelante).
3.
Las muestras fueron corridas en PSQ (plantilla de guía de secuenciamiento de pirofosfato) para determinar el número de picomoles de plantilla en cada muestra (ver más adelante). Los métodos de secuenciamiento se pueden encontrar en la Patente de EE.UU. Nº 6.274.320; la Patente de EE.UU. Nº 4.863.849; la Patente de EE.UU. Nº
6.210.891 y la Patente de EE.UU. Nº 6.258.568.
Se realizaron cálculos para determinar el número de moléculas de plantilla de ADNg de cadena sencilla por microlitro. Los restantes 25 μL de la biblioteca de ADNg de cadena sencilla preparados fueron usados para amplificación y posterior secuenciamiento (aproximadamente 1 x 106 reacciones).
Etapa 8b: Cuantificación de ADNg de cadena sencilla usando RNA Pico 6000 LabChip. Tiempo total de preparación: aproximadamente 30 minutos.
1.
La opción de ensayo Pico de ARNm se seleccionó en el BioAnalyzer (Software versión 2.12).
2.
Se preparó un RNA Pico 6000 LabChip en un BioAnalyzer de acuerdo según las guías del fabricante.
3.
Se preparó una escalera RNA LabChip (escalera RNA 6000) según las directrices del fabricante (Ambion). Resumidamente, la escalera RNA LabChip, en disolución, fue calentada hasta 70ºC durante 2 minutos. La disolución se enfrió en hielo durante 5 minutos para enfriar de golpe la escalera. La disolución se centrifugó brevemente para eliminar cualquier condensado de las paredes del tubo. La escalera RNA LabChip se almacenó en hielo y se usó en el mismo día.
4.
La biblioteca de ADNss que se va a analizar se corrió por triplicado, en calles adyacentes, usando tres alícuotas de 1 μL.
5.
El software BioAnalyzer fue usado para calcular la concentración de cada calle de biblioteca de ADNss (véase la Tabla mostrada a continuación y la Figura 24. El promedio de las tres calles se usó para calcular la concentración de ADN de la biblioteca usando el procedimiento descrito más adelante.
a.
La línea del límite inferior de integración de pico (línea discontinua en la Figura 24) fue desplazada inmediatamente delante del pico de la biblioteca (ver más adelante).
b.
La línea de límite superior de integración de pico (línea discontinua en la Figura 24) se desplazó inmediatamente detrás del pico de la biblioteca. De este modo, la línea de integración de pico que conecta las líneas de integración inferior y superior siguió la pendiente del ruido de fondo.
c.
Se usó la flecha del ratón para determinar el tamaño medio del pico de las bases (normalmente cerca del punto más alto del pico) o se usó un pico definido elegido mediante el software.
d.
Se usó el valor integrado para la cantidad de material del pico. El valor obtenido para picogramos recuperados fue convertido en moléculas recuperadas (ver Tabla, más adelante). Entonces se determinó la concentración de biblioteca (moléculas por microlitro).
Tabla
Tal como se muestra en la Tabla anterior, la concentración de la Biblioteca 1 se calculó en 1639 pg/μL (Columna 5) y el tamaño promedio de fragmento fue de 434 nucleótidos (Columna 9). Estos valores fueron obtenidos a partir del software Agilent 2100 tal como se describe en las Etapas (a)-(d), anteriores. El peso molecular promedio (PM) de un ribonucleótido es 328,2 g/mol (Columna 10). El PM del fragmento promedio de la biblioteca (1,42 x 105 g/mol, Columna 11) se calculó multiplicando la longitud promedio de fragmento (434) por el ribonucleótido promedio (328,2). La biblioteca cuantificada (1639 pg/μL) se convirtió a gramos por microlitro (1,64 x 10-9 g/μL, Columna 12). El número de moles por microlitro (1,15 x 10-14 moles/μL, Columna 14) fue calculado dividiendo los gramos por microlitro (1,64 x 10-9 g/μL, Columna 12) por el peso molecular promedio de los fragmentos de biblioteca (1,42 x 105, Columna 11). Finalmente, el número de moléculas por microlitro (6,93 x 109 moléculas/μL, Columna 15) fue obtenido multiplicando el número de moles por microlitro (1,15 x 10-14 moles/μL, Columna 14) por el número de Avogadro (6,02 x 1023 moléculas/mol).
Se esperaba que la concentración final de la biblioteca fuera superior a 1 x 108 moléculas/μL. Un factor más importante para la calidad de la biblioteca fue la concentración de dímero adaptador. En la Figura 24, se determinó que la altura del pico de la biblioteca era 10 veces superior a la del pico de dímero de adaptador (el primer pico tras el marcador). Es de esperar que una biblioteca de buena calidad tenga una altura de pico de al menos 2 veces la altura del pico del dímero. Debería destacarse que el RNA Pico 6000 LabChip proporcionado estima con una precisión del 500% dentro de la concentración de ADNg de cadena sencilla. Por tanto, era importante llevar a cabo una ejecución de secuenciamiento inicial usando una valoración de plantilla para determinar el número de copias por partícula (cpb) de ADNg de entrada. La entrada recomendada de ADN es 2,5 cpb, 1 cpb, 0,5 cpb y 0,1 cpb. Esta valoración se comprobó fácilmente usando la cámara de carga de partículas de 4 ranuras sobre un PTP de 14 x 43.
Etapa 9: Dilución y almacenamiento de biblioteca de ADNg de cadena sencilla
La biblioteca de ADNg de cadena sencilla se eluyó y se cuantificó en tampón EB. Para evitar la degradación, la biblioteca de ADNg de cadena sencilla se almacenó congelada a -20ºC en presencia de EDTA. Tras la cuantificación, se añadió un volumen igual de TE 10 mM a la reserva de biblioteca. Todas las diluciones subsiguientes fueron en TE. El rendimiento fue como se indica a continuación:
Volumen final restante de biblioteca de ADNss tras análisis PSQ = 25 μL.
Volumen final restante de biblioteca de ADNss tras análisis LabChip = 47 μL.
Para la dilución inicial de la reserva, la biblioteca de ADNg de cadena sencilla se diluyó hasta 100 millones de moléculas/μL en 1X tampón de elución de Grado-biblioteca. Se prepararon alícuotas de biblioteca de ADNg de cadena sencilla para uso común. Para ello, se diluyeron 200.000 moléculas/μL en 1X tampón de elución de Gradobiblioteca y se midieron alícuotas de 20 μL. Las alícuotas de biblioteca de un uso se almacenaron a -20ºC.
Etapa 10: Reacción en cadena de polimerasa en emulsión
Cuando se prefería un número elevado de cpb, se llevó a cabo PCR en emulsión tal como se describe en la Solicitud de Patente de EE.UU. con Nº de serie 06/476.504, presentada el 6 de junio de 2003.
Preparación de reactivos
La disolución de parada (EDTA 50 mM) incluía 100 μL de EDTA 0,5 M mezclados con 900 μL de nH2O para obtener 1,0 mL de disolución de EDTA 50 mM. Para dNTPs 10 mM, se mezclaron 10 μL de dCTP (100 mM), 10 μL de dATP (100 mM), 10 μL de dGTP (100 mM) y 10 μL de dTTP (100 mM) con 60 μL de agua de grado de biología molecular. Las cuatro reservas de nucleótidos 100 mM fueron congeladas en hielo. A continuación, 10 μL de cada nucleótido fueron combinados con 60 μL de nH2O hasta un volumen final de 100 μL, y se mezclaron intensamente. A continuación, se dispensaron alícuotas de 1 mL en tubos de microcentrífuga de 1,5 mL. Las disoluciones de reserva podían almacenarse a -20ºC durante un año.
El 10 X tampón de maduración incluía Tris 200 mM (pH 7,5) y acetato de magnesio 50 mM. Para esta disolución, se añadieron 24,23 g de Tris a 800 mL de nH2O y la mezcla se ajustó a pH 7,5. A esta disolución se añadieron 10,72 g de acetato de magnesio y se disolvieron completamente. La disolución se llevó hasta un volumen final de 1000 mL y se podía almacenar a 4ºC durante 1 mes. El 10 X TE incluía Tris·HCl 100 mM (pH 7,5) y EDTA 50 mM. Estos reactivos se añadieron juntos y se mezclaron intensamente. La disolución podía almacenarse a temperatura ambiente durante 6 meses.
Ejemplo 2: Diseño de cebador
Tal como se ha discutido anteriormente, los adaptadores universales se diseñan para incluir: 1) un conjunto único de regiones cebadoras de PCR que normalmente tienen una longitud de 20 pb (localizadas adyacentes a (2)); 2) un conjunto único de regiones cebadoras de secuenciamiento que normalmente tienen una longitud de 20 pb; y 3) opcionalmente seguido de una secuencia llave discriminatoria única que consiste en al menos uno de cada uno de los cuatro desoxirribonucleótidos (es decir, A, C, G, T). La probabilidad de hibridación cruzada entre los cebadores y las regiones no pretendidas del genoma de interés aumenta cuando aumenta el tamaño del genoma, y la longitud de una coincidencia perfecta con el cebador disminuye. Sin embargo, no es de esperar que esta interacción potencial con una región de hibridación cruzada (CHR, del inglés “cross-hybridizing region”) produzca problemas por las razones enumeradas a continuación.
En una realización preferida de la presente invención, la biblioteca de ADN de cadena sencilla se utiliza para la amplificación de PCR y el posterior secuenciamiento. La metodología de secuenciamiento requiere una digestión aleatoria de un genoma dado en de 150 a 500 fragmentos de pares base, tras lo cual dos cebadores bipartitos únicos (compuestos de ambos, una región de PCR y una de secuenciamiento) son ligados sobre los extremos 5’ y 3’ de los fragmentos (Figura 25). Al contrario que las amplificaciones de PCR típicas, cuando se selecciona una sección existente del genoma como un sitio de cebado en base a la temperatura de fusión (Tm), la unicidad de la secuencia cebadora dentro del genoma y la proximidad a la región o gen particular de interés, el proceso descrito utiliza sitios de cebado sintéticos que necesitan un diseño de cebador desde cero cuidadoso.
Selección de tetrámero:
Las estrategias para el diseño de cebador desde cero se encuentran en la bibliografía publicada relativa al trabajo llevado a cabo con etiquetas moleculares para experimentos de hibridación (véase, Hensel, M. y D.W. Holden, “Molecular genetic approaches for the study of virulence in both pathogenic bacteria and fungi”. Microbiology, 1996. 142(Pt 5): páginas 1049-58; Shoemaker, D.D., y col., “Quantitative phenotypic analysis of yeast deletion mutants using a highly parallel molecular bar-coding strategy”. Nat Genet, 1996. 14(4): pág. 450-6) y cebadores de hibridación PCR/LDR (reacción en cadena de polimerasa/reacción de detección de ligación) (véase, Gerry, N.P. y col., “Universal DNA microarray method for multiplex detection of low abundance point mutations”. Journal of Molecular Biology, 1999. 292: pág. 251-262; Witowski, N.E. y col., “Microarray-based detection of select cardiovascular disease markers”. BioTechniques, 2000. 29(5): pág. 936-944).
El trabajo de PCR/LDR fue particularmente relevante y se enfocó al diseño de “códigos postales” de oligonucleótidos, cebadores de 24 bases compuestos por seis tetrámeros diseñados específicamente con una Tm final similar (véase, Gerry, N.P. y col., “Universal DNA microarray method for multiplex detection of low abundance point mutations”. Journal of Molecular Biology, 1999. 292: pág. 251-262; Patente de EE.UU. Nº 6.506.594). Los componentes tetraméricos se eligieron en base a los siguientes criterios: cada tetrámero difirió de los demás en al menos dos bases, los tetrámeros que inducen el auto-emparejamiento de formaciones de horquilla fueron excluidos, y los tetrámeros palindrómicos (AGCT) o repetitivos (TATA) también fueron omitidos. Treinta y seis de las 256 (44) posibles permutaciones cumplían los requerimientos necesarios y fueron sometidas a continuación a restricciones adicionales requeridas para un diseño de cebador de PCR aceptable (Tabla 1).
La tabla muestra una matriz que demuestra la selección de componentes de cebador tetramérico en base a los criterios descritos por Gerry y col, 1999. J. Mol. Bio. 292: 251-262. Se requería que cada tetrámero difiriera de los
5 demás en al menos dos bases. Los tetrámeros no podían ser palindrómicos o complementarios con otro tetrámero. Se seleccionaron treinta y seis tetrámeros (en negrita, subrayados); las secuencias en cursiva indica tetrámeros palindrómicos que fueron excluidos de consideración.
Diseño de cebador:
Los cebadores de PCR se diseñaron para cumplir las especificaciones comunes al diseño general de cebadores
10 (véase, Rubin, E. y A.A. Levy, “A mathematical model and a computerized simulation of PCR using complex templates”. Nucleic Acids Res, 1996. 24(18): p. 3538-45; Buck, G.A., y col., “Design strategies and performance of custom DNA sequencing primers”. BioTechniques, 1999. 27(3): pág. 528-36), y la selección real se llevó a cabo mediante un programa de ordenador, el MMP. Los cebadores se limitaron a una longitud de 20 bases (5 tetrámeros) para una síntesis eficiente del bipartito total cebador de PCR/secuenciamiento. Cada cebador contenía una pinza
15 GC de dos bases en el extremo 5’, y una pinza GC sencilla en el extremo 3’ (Tabla 2), y todos los cebadores compartían una Tm similar (+/- 2ºC) (Figura 27). No se permitió la formación de horquilla dentro del cebador (rama de horquilla interna AG > -1,9 Kcal/mol). También se controló la dimerización; se permitió un dímero aceptable de máximo 3 bases, pero podría darse en seis bases 3’ finales, y la AG máxima permisible para un dímero 3’ fue de 2,0 Kcal/mol. Adicionalmente, se aplicó una penalización a los cebadores en los que los extremos 3’ eran demasiado
20 similares a otros del grupo, evitando con ello la hibridación cruzada entre un cebador y el complemento inverso de otro.
Tabla 2
La Tabla 2 muestra las posibles permutaciones de los 36 tetrámeros seleccionados que proporcionan dos pinzas G/C 5’ y una pinza G/C 3’. Las posiciones internas están compuestas por los tetrámeros restantes. Esto da como resultado 8 x 19 x 19 x 19 x 9 permutaciones, o 493.848 posibles combinaciones. La Figura 27 muestra el primer paso de la selección de cebadores aceptables basada en Tm, que reduce el campo de 493.848 cebadores a 56.246 candidatos con una Tm de 64 a 66ºC.
Tabla 3
La probabilidad de coincidencias de secuencia perfectas aumenta cuando disminuyen los requerimientos de longitud de coincidencia y aumenta el tamaño del genoma de interés.
Longitud de coincidencia
Probabilidad de coincidencia perfecta (1/(4^longitud)) % de probabilidad para coincidencia en Adeno ~35K bases % de probabilidad para coincidencia en base de datos de bacterias NCBI ~488M bases % de probabilidad para coincidencia en Humano ~3B bases
20
9,1E-13 0,00% 0,04% 0,27%
19
7,3E-12 0,00% 0,65% 4,32%
18
4,4E-11 0,00% 5,76% 34,37%
17
2,3E-10 0,00% 35,69% 99,17%
16
1,2E-09 0,02% 97,52% >100%
15
5,6E-09 0,12% >100% >100%
14
2,6E-08 0,64% >100% >100%
13
1,2E-07 3,29% >100% >100%
12
5,4E-07 15,68% >100% >100%
11
2,4E-06 58,16% >100% >100%
10
1,0E-05 99,35% >100% >100%
9
4,6E-05 >100% >100% >100%
8
2,0E-04 >100% >100% >100%
7
8,5E-04 >100% >100% >100%
6
3,7E-03 >100% >100% >100%
5
1,6E-02 >100% >100% >100%
4
6,46E-02 >100% >100% >100%
3
2,5E-01 >100% >100% >100%
2
7,1E-01 >100% >100% >100%
1
1,0E+00 >100% >100% >100%
La posibilidad de regiones complementarias que se dan dentro del genoma de interés no fue una preocupación importante en el proceso de diseño de cebador a pesar de la tolerancia publicada de la PCR para faltas de coincidencia en poblaciones de muestras complejas (véase, por ejemplo, Rubin, E. y A.A. Levy, “A mathematical 10 model and a computerized simulation of PCR using complex templates”. Nucleic Acids Res, 1996. 24(18): pág. 353845). Aunque la probabilidad de encontrar una coincidencia perfecta con un cebador de 20 bases es extremadamente baja (420) (Tabla 3), la probabilidad de encontrar menos coincidencias no consecutivas aumenta significativamente con el tamaño del genoma de interés. Como resultado, la probabilidad de encontrar una coincidencia perfecta de al menos 10 de 20 bases es del 99,35% para un genoma de Adenovirus. La probabilidad de encontrar una
15 coincidencia perfecta de 16 bases es del 97% para las secuencias de la base de datos NCBI (aproximadamente 100 veces más grande que la del genoma de Adenovirus). La probabilidad de encontrar una coincidencia perfecta de 17 bases para un cebador de 20 bases es del 99% para las secuencias del genoma humano (3 millones de bases).
La elevada probabilidad de hibridación cruzada de cebador con regiones del genoma es menos problemática de lo que se podría esperar debido a la digestión de ADN aleatoria usada para producir los fragmentos de plantilla. Por 20 tanto, los efectos de una región de hibridación cruzada (CHR) son bastante benignos. Es improbable que una CHR sea capaz de competir con éxito con la coincidencia perfecta entre los cebadores de PCR en disolución y la plantilla. Además, cualquier cebador que incluya faltas de coincidencia en su extremo 3’ sería una desventaja competitiva significativa. Incluso si una CHR debería dejar fuera de competencia al cebador de PCR pretendido, produciría un producto de PCR truncado, sin un sitio por debajo para el cebador de secuenciamiento. Si el producto truncado 25 pudiera conducirse a la partícula de captura y ser inmovilizado, se podría producir una de las dos situaciones. Si la CHR dejó fuera de competencia el cebador en fase disolución, entonces el producto inmovilizado carecería de un sitio de unión de cebador de secuenciamiento, y daría como resultado un pocillo de placa PicoTiter (PTP) vacío. Si la CHR dejó fuera de competencia el cebador ligado a partícula, el cebador de secuenciamiento estaría presente, y el único efecto sería un injerto más corto. Ningún resultado comprometería excesivamente la calidad del 30 secuenciamiento. Dada la gran cantidad de material genómico usado en el proceso de preparación de muestra
Ejemplo 3: Preparación de muestra mediante nebulización
Preparación de ADN mediante nebulización
El propósito de la etapa de nebulización es fragmentar un tira grande de ADN tal como un genoma completo o una porción grande de un genoma en especies moleculares más pequeñas que son susceptibles de secuenciamiento de ADN. Esta población de especies de ADN de tamaño más pequeño generadas a partir de una plantilla de ADN individual se denomina biblioteca. La nebulización rompe el ADN plantilla de cadena doble en fragmentos que oscilan entre 50 y 900 pares base. La biblioteca rota contiene extremos de cadena sencilla que son reparados mediante una combinación de ADN polimerasa de T4, ADN polimerasa de E. coli (fragmento Klenow) y polinucleótido quinasa de T4. Ambas ADN polimerasas, T4 y Klenow, se usan para “rellenar” extremos 3’ de receso (salientes 5’) de ADN a través de su actividad de polimerasa 5’-3’. La cantidad de exonucleasa 3’-5’ de cadena sencilla de las polimerasas T4 y Klenow eliminará los extremos 3’ salientes y la actividad de quinasa de la polinucleótido quinasa de T4 añadirá fosfatos a los extremos de hidroxilo 5’.
La muestra se preparó como se indica a continuación:
1.
15 μg de ADNg (ADN genómico) se obtuvieron y se ajustaron hasta un volumen final de 100 μL en TE 10 mM (Tris 10 mM, EDTA 0,1 mM, pH 7,6; ver la lista de reactivos del final de la sección). Se analizó el ADN para determinar contaminación midiendo la relación de D.O.260/280, que fue de 1,8 o superior. Se esperaba que la concentración final de ADNg fuera de aproximadamente 300 μg/mL.
2.
Se añadieron al ADNg 1600 μL de tampón de nebulización enfriado en hielo (ver el final de la sección).
3.
La mezcla de reacción se colocó en un nebulizador enfriado en hielo (CIS-US, Bedford, MA).
4.
Se puso un tapón de un tubo falcon de 15 mL de cierre a presión sobre la parte superior del nebulizador (Figura 28A).
5.
El tapón se aseguró con un montaje de pinza de nebulizador limpio, que consistía en la cobertura ajustada (para la tapa del tubo falcon) y dos juntas de goma (Figura 28B).
6.
El fondo del nebulizador se unió a un suministro de nitrógeno y todo el dispositivo se envolvió en parafilm (Figuras 28C y 28D).
7.
Manteniendo el nebulizador en posición vertical (como se muestra en la Figura 28D), se aplicaron 3,4 bar (50 psi) de nitrógeno durante 5 minutos. El fondo del nebulizador se golpeó sobre una superficie rígida cada pocos segundos para forzar a que el líquido condensado bajara al fondo.
8.
El nitrógeno se cortó después de 5 minutos. Después de que la presión se hubiera normalizado (30 segundos), se retiró la fuente de nitrógeno del nebulizador.
9.
Se retiró el parafilm y se desenroscó la parte superior del nebulizador. Se extrajo la muestra y se transfirió a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
10.
La parte superior del nebulizador se reinstaló y se centrifugó el nebulizador a 500 rpm durante 5 minutos.
11.
Se recuperó el resto de la muestra del nebulizador. La recuperación total fue de aproximadamente 700 μL.
12.
La muestra recuperada se purificó usando una columna QIAquick (Qiagen Inc., Valencia, CA) según las indicaciones del fabricante. El gran volumen requirió que la columna se cargara varias veces. La muestra fue eluida con 30 μL de tampón EB (Tris·HCl 10 mM, pH 8,5; suministrado en el kit Qiagen) que fue pre-calentado a 55ºC.
13.
La muestra se cuantificó mediante espectroscopía UV (2 μL en 198 μL de agua para una dilución 1:100).
Pulido enzimático
La nebulización de plantillas de ADN produce muchos fragmentos de ADN con extremos deshilachados. Estos extremos se hacen romos (se redondean) y se preparan para ligación a fragmentos de adaptador usando tres enzimas, ADN polimerasa de T4, ADN polimerasa de E. coli (fragmento Klenow) y polinucleótido quinasa de T4.
La muestra se preparó como se indica a continuación:
1. En un tubo de 0,2 mL se añadieron los siguientes reactivos en orden:
28 μL de fragmentos de ADNg nebulizado purificado
5 μL de agua 5 μL de 10 X tampón de ADN polimerasa T4 5 μL de BSA (1 mg/mL) 2 μL de dNTPs (10 mM) 5 μL de ADN polimerasa T4 (3 unidades/μL) 50 μL de volumen final
2.
La disolución de la etapa 1 se mezcló bien y se incubó a 25ºC durante 10 minutos en un termociclador MJ (se puede usar cualquier incubadora de precisión).
3.
Se añadieron 1,25 μL de ADN polimerasa de E. coli (fragmento Klenow) (5 unidades/mL).
4.
La reacción se mezcló bien y se incubó en el termociclador MJ durante 10 minutos a 25ºC y durante otras 2 h adicionales a 16ºC.
5.
El ADN tratado se purificó usando una columna QiaQuick y se eluyó con 30 μL de tampón EB (Tris·HCl 10 mM, pH 8,5) que se precalentó a 55ºC.
6.
Los siguientes reactivos fueron combinados en un tubo de 0,2 mL. 30 μL de fragmentos de ADNg nebulizado, pulido y purificado con Qiagen 5 μL de agua 5 μL de 10 X tampón PNK de T4 5 μL de ATP (10 mM) 5 μL de PNK de T4 (10 unidades/mL) 50 μL de volumen final
7.
La disolución final se mezcló y se colocó en un termociclador MJ usando el programa de PNK de T4 para la incubación a 37ºC durante 30 minutos, 65ºC durante 20 minutos, seguido de almacenamiento a 14ºC.
8.
La muestra se purificó usando una columna QiaQuick y se eluyó en 30 μL de tampón EB que se precalentó a 55ºC.
9.
Se guardó para análisis una alícuota de 2 μL de la reacción final de pulido usando un BioAnalyzer DNA 1000 LabChip (ver más adelante).
Ligación de adaptadores
El procedimiento para ligar los adaptadores se llevó a cabo como se indica a continuación:
1.
En un tubo de 0,2 mL se añadieron los siguientes reactivos en orden: 20,6 μL de agua de grado biología molecular 28 μL de biblioteca de ADNg digerida y pulida 60 μL de 2 X tampón de reacción de ligasa Quick 1,8 μL de MMP (200 pmol/μL) conjunto de adaptador universal 9,6 μL de ligasa Quick 120 μL en total
La anterior reacción se diseño para 5 μg y se escaló dependiendo de la cantidad de ADNg usado.
2.
Los reactivos se mezclaron bien y se incubaron a 25ºC durante 20 minutos. El tubo se mantuvo en hielo hasta que se preparó el gel para la electroforesis de gel de agarosa.
Electroforesis de gel y extracción de biblioteca de ADNg adaptada
La nebulización de ADN genómico produce una población de biblioteca que oscila entre 50 y 900 pb. La adición del conjunto de adaptadores universales de 88 pb desplazará la población hacia un tamaño mayor y dará como resultado un perfil de migración con un intervalo de tamaños mayor (aproximadamente 130-980 pb). Los dímeros de adaptador migrarán a 88 pb y los adaptadores no ligados migrarán a 44 pb. Por lo tanto, las bibliotecas de ADN genómico aisladas en los intervalos de tamaño 250 pb se pueden aislar fisicamente del gel de agarosa y se pueden purificar usando técnicas de extracción de gel estándares. El aislamiento de gel de la biblioteca de ADNg adaptada dará como resultado la recuperación de una población de biblioteca en un intervalo de tamaños que es de
250 pb (el rango de tamafos de la biblioteca se puede variar dependiendo de la aplicacion). El intervalo de tamaños de la biblioteca después de la ligación de los adaptadores es de 130 a 980 pb. Debería destacarse que el procedimiento se puede adaptar para el aislamiento de cualquier rango de tamaño de banda, tal como, por ejemplo, de 130 a 200 pb, de 200 a 400 pb, de 250 a 500 pb, de 300 a 600 pb, de 500 a 700 pb, y similares, cortando diferentes regiones del gel. Se usó el procedimiento descrito más adelante para los fragmentos aislados de 250 pb a 500 pb.
Se preparó un gel de agarosa de 150 mL para incluir un 2% de agarosa, 1X TBE y 4,5 μL de bromuro de etidio (reserva de 10 mg/mL). El ADN ligado se mezcló con 10X colorante listo para cargar (“Ready-Load Dye”) y se cargó sobre el gel. Adicionalmente, se cargaron 10 μL de una escalera de 100 pb (0,1 μg/μL) en dos calles separadas de la reacción de ligación que flanquea la muestra. El gel fue sometido a electroforesis a 100 V durante 3 horas. Cuando se completó el avance del gel, éste se retiró de la caja de geles, se transfirió a un GelDoc y se cubrió con un envoltorio plástico. Las bandas de ADN fueron visualizadas usando la luz UV Prep. Se usó un escalpelo desechable esterilizado para cortar una población de biblioteca del gel de agarosa con tamaños de fragmento de 250 a 500 pb. Este proceso se realizó tan rápidamente como fue posible para prevenir el mellado de ADN. Las tiras de gel se colocaron en un tubo falcon de 15 mL. Se aisló la biblioteca de ADNg embebida en la agarosa usando el kit de extracción de gel Qiagen MinElute. Se analizaron alícuotas de cada biblioteca de ADNg aislada usando un BioAnalyzer DNA 1000 LabChip para determinar la distribución exacta de la población de biblioteca de ADNg.
Desplazamiento de cadena y extensión de la biblioteca de ADNg y aislamiento de la biblioteca de ADNg de cadena sencilla usando partículas de estreptavidina
El desplazamiento de cadena y la extensión de biblioteca de ADNg de cadena doble mellada se llevó a cabo tal como se ha descrito en el Ejemplo 1, con la excepción de que las muestras tratadas con Bst fueron incubadas en el termociclador a 65ºC durante 30 minutos y colocadas en hielo hasta que fueran necesarias. Las partículas de estreptavidina fueron preparadas como se describe en el Ejemplo 1, excepto en que el lavado final se llevó a cabo usando dos lavados con 200 μL de 1X tampón de unión y dos lavados con 200 μL de nH2O. La biblioteca de ADNg de cadena sencilla se aisló usando partículas de estreptavidina como se indica a continuación. Se retiró el agua de las partículas lavadas y se añadieron 250 μL de disolución de fusión (ver más adelante). La suspensión de partículas se mezcló bien y se incubó a temperatura ambiente durante 10 minutos en un rotador de tubos. En un tubo separado, se mezclaron 1250 μL de PB (del kit de purificación QiaQuick) y 9 μL de ácido acético al 20%. Las partículas de 250 μL de disolución de fusión fueron peletizadas usando un Dynal MPC y el sobrenadante se retiró cuidadosamente y se transfirió a la disolución de PB/ácido acético recién preparada. El ADN de la disolución de 1500 μL se purificó usando una única columna de giro de purificación MinElute. Esto se llevó a cabo cargando la muestra a través de la misma columna dos veces a 750 μL por carga. La biblioteca de ADNg de cadena sencilla se eluyó con 15 μL de tampón EB que se había precalentado a 55ºC.
Cuantificación y almacenamiento de ADNg de cadena sencilla
El ADNg de cadena sencilla se cuantificó usando el RNA Pico 6000 LabChip descrito en el Ejemplo 1. En algunos casos, la biblioteca de cadena sencilla se cuantificó mediante un segundo ensayo para asegurar que la cuantificación inicial con el Agilent 2100 se había realizado con precisión. Para este fin, se llevó a cabo una cuantificación RiboGreen tal como se ha descrito (cuantificación de ADNss mediante fluorimetría) para confirmar la cuantificación del Agilent 2100. Si las dos estimaciones diferían en más de un 300%, se repetía cada análisis. Si la cuantificación mostraba una diferencia superior a 300% entre los dos procedimientos, se usó un rango más amplio de plantilla a partícula.
La dilución y el almacenamiento de la biblioteca de ADNg de cadena sencilla se llevaron a cabo como se describe en el Ejemplo 1. El rendimiento fue el siguiente:
Volumen final remanente de biblioteca de ADNss después de análisis LabChip = 12 μL.
Volumen final remanente de biblioteca de ADNss después de análisis RiboGreen = 9 μL.
Volumen final de biblioteca de ADNss tras adición de TE = 18 μL.
Se añadió un volumen igual de TE a la reserva de biblioteca de ADNg de cadena sencilla. Biblioteca de ADNg de cadena sencilla a 1 x 108 moléculas/μL en tampón BE. La reserva se diluyó (1/500) hasta 200.000 moléculas/μL en TE y se prepararon alícuotas de 20 μL.
Distribución de tamaños de fragmento de biblioteca tras nebulización
En la Figura 29A se muestran los resultados típicos del análisis de Agilent 2100 DNA 1000 LabChip de 1 μL de material tras nebulización y pulido. Se esperaba que la distribución de intervalos de tamaño de la mayor parte del producto estuviera alrededor de 50 a 900 pares base. El tamaño medio (máximo del pico) se esperaba aproximadamente a 450 pb. En la Figura 29B se muestran resultados típicos de la purificación de gel de fragmentos
5 de biblioteca ligados a adaptador.
Reactivos
A menos que se especifique de otro modo, los reactivos enumerados en los Ejemplos representan reactivos estándar que se encuentran disponibles comercialmente. Por ejemplo, Klenow, ADN polimerasa T4, tampón de ADN polimerasa T4, PNK T4, tampón de PNK T4, ADN ligasa T4 Quick, tampón de ligación Quick, ADN polimerasa Bst
10 (el fragmento grande) y tampón de reacción ThermoPol se encuentran disponibles en New England Biolabs (Beverly, MA). La mezcla de dNTP está disponible en Pierce (Rockford, IL). Agarosa, TBE UltraPure, tampón de carga de gel BlueJuice y escalera de ADN de 100 pb Ready-Load se pueden adquirir en Invitrogen (Carlsbad, CA). El bromuro de etidio y el 2-propanol se pueden comprar a Fisher (Hampton, NH). La escalera de ARN se puede comprar a Ambion (Austin, TX). Otros reactivos son conocidos comúnmente y/o se enumera a continuación:
Disolución de fusión:
Ingrediente
Cantidad requerida Vendedor Número de stock
NaCl (5 M)
200 μL Invitrogen 24740-011
NaOH (10 N)
125 μL Fisher SS255-1
Agua de grado biología molecular
9,675 mL Eppendorf 0032-006-205
15 La disolución de fusión incluía NaCl 100 mM y NaOH 125 mM. Los reactivos enumerados se combinaron y se mezclaron intensamente. La disolución se podía almacenar a temperatura ambiente durante seis meses.
Tampón de unión y lavado (B&W) (2X y 1X):
Ingrediente
Cantidad requerida Vendedor Número de stock
Tris·HCl UltraPure (pH 7,5, 1 M)
250 μL Invitrogen 15567-027
EDTA (0,5 M)
50 μL Invitrogen 15575-020
NaCl (5 M)
10 mL Invitrogen 24740-011
Agua de grado biología molecular
14,7 mL Eppendorf 0032-006-205
El tampón 2X B&W incluyó unas concentraciones finales de Tris·HCl 10 mM (pH 7,5), EDTA 1 mM y NaCl 2 M. Los reactivos enumerados se combinaron y se mezclaron intensamente. La disolución se podía almacenar a temperatura ambiente durante 6 meses. El tampón 1X B&W se preparó mezclando el tampón 2X B&W con H2O picopura, 1:1.
20 Las concentraciones finales fueron la mitad de las mencionadas anteriormente, es decir, Tris·HCl 5 mM (pH 7,5), EDTA 0,5 mM y NaCl 1 M.
Otros tampones incluyen los siguientes. Tampón 1X de ADN polimerasa T4: NaCl 50 mM, Tris·HCl 10 mM, MgCl2 10 mM, ditiotreitol 1 mM (pH 7,9 a 25ºC). TE: Tris 10 mM, EDTA 1 mM.
Preparación de reactivos especiales: TE (10 mM):
Ingrediente
Cantidad requerida Vendedor Número de stock
TE (1 M)
1 mL Fisher BP1338-1
Agua de grado biología molecular
99 mL Eppendorf 0032-006-205
Los reactivos se mezclaron y la disolución se podía almacenar a temperatura ambiente durante seis meses.
Tampón de nebulización:
Ingrediente
Cantidad requerida Vendedor Número de stock
Glicerol
53,1 mL Sigma G5516
Agua de grado biología molecular
42,1 mL Eppendorf 0032-006-205
Tris·HCl UltraPure (pH 7,5, 1M)
3,7 mL Invitrogen 15567-027
EDTA (0,5 M)
1,1 mL Sigma M-10228
25 Todos los reactivos se añadieron (el glicerol en último lugar) a una Stericup y se mezclaron bien. La disolución se
ATP (10 mM):
Ingrediente
Cantidad requerida Vendedor Número de stock
ATP (100 mM)
10 μL Roche 1140965
Agua de grado biología molecular
90 μL Eppendorf 0032-006-205
Los reactivos se mezclaron y la disolución se podía almacenar a -20ºC durante seis meses.
BSA (1 mg/mL):
Ingrediente
Cantidad requerida Vendedor Número de stock
BSA (10 mg/mL)
10 μL NEB Kit M0203
Agua de grado biología molecular
90 μL Eppendorf 0032-006-205
Los reactivos se mezclaron y la disolución se podía almacenar a 4ºC durante seis meses.
Tampón de maduración de biblioteca, 10X:
Ingrediente
Cantidad requerida Vendedor Número de stock
Tris·HCl UltraPure (pH 7,5, 1 M)
200 mL Invitrogen 15567-027
Acetato de magnesio, grado enzimático (1 M)
10,72 g Fisher BP-215-500
Agua de grado biología molecular
~ 1 L Eppendorf 0032-006-205
El tampón de maduración 10 X incluía Tris 200 mM (pH 7,5) y acetato de magnesio 50 mM. Para este tampón, se añadieron 200 mL de Tris a 500 mL de H2O picopura. A continuación, se añadieron 10,72 g de acetato de magnesio a la disolución y se disolvieron completamente. La disolución se ajustó a un volumen final de 1000 mL. La disolución podía almacenarse a 4ºC durante seis meses. Para evitar el potencial de contaminación de bibliotecas, el tampón se dividió en alícuotas para uso individual o a corto plazo.
Adaptadores:
Adaptador “A” (400 μM):
Ingrediente
Cantidad requerida Vendedor Número de stock
Adaptador A (sentido; purificado con HPLC, enlaces de fosforotioato, 44 pb, 1000 pmol/μL)
10,0 μL IDT encargo
Adaptador A (antisentido; purificado con HPLC, enlaces de fosforotioato, 44 pb, 1000 pmol/μL)
10,0 μL IDT encargo
Tampón de maduración (10X)
2,5 μL 454 Corp. Tabla previa
Agua de grado biología molecular
2,5 μL Eppendorf 0032-006-205
10 Para esta disolución, se mezclaron 10 μL de Adaptador A (44 pb, sentido) de 1000 pmol/μL con 10 μL de Adaptador A (40 pb, antisentido) de 1000 pmol/μL, 2,5 μL de tampón de maduración de biblioteca 10X y 2,5 μL de agua (Vf = 25 μL). Los adaptadores fueron madurados usando el programa ANNEAL-A (ver apéndice más adelante) en el termociclador Sample Prep Lab. En el apéndice se proporcionan más detalles del diseño de adaptador.
Adaptador “B” (400 μM):
Ingrediente
Cantidad requerida Vendedor Número de stock
Adaptador B (sentido; purificado con HPLC, enlaces de fosforotioato, 40 pb, 1000 pmol/μL)
10 μL IDT encargo
Adaptador B (antisentido; purificado con HPLC, enlaces de fosforotioato, biotinilado 5’, 44 pb, 1000 pmol/μL)
10 μL IDT encargo
Tampón de maduración (10X)
2,5 μL 454 Corp. Tabla previa
Agua de grado biología molecular
2,5 μL Eppendorf 0032-006-205
Para esta disolución, se mezclaron 10 μL de Adaptador B (40 pb, sentido) de 1000 pmol/μL con 10 μL de Adaptador 15 B (44 pb, antisentido) de 1000 pmol/μL, 2,5 μL de tampón de maduración de biblioteca 10X y 2,5 μL de agua (Vf = 25 Para esta disolución se añadió ácido acético glacial a agua. La disolución se podía almacenar a temperatura ambiente durante seis meses.
Ácido acético al 20%:
Ingrediente
Cantidad requerida Vendedor Número de stock
Ácido acético, glacial
2 mL Fisher A35-500
Agua de grado biología molecular
8 mL Eppendorf 0032-006-205
Programa de maduración de adaptador:
Programa ANNEAL-A para la maduración de cebador:
1.
Incubar a 95ºC, 1 minuto;
2.
Reducir la temperatura a 15ºC a 0,1ºC/s; y
3.
Mantener a 14ºC. Programa POLISH de polimerasa T4/Klenow para reparación de extremos:
1.
Incubar a 25ºC, 10 minutos;
2.
Incubar a 16ºC, 2 horas; y
3.
Mantener a 4ºC. Programa PNK T4 para reparación de extremos:
1.
Incubar a 37ºC, 30 minutos;
2.
Incubar a 65ºC, 20 minutos; y
3. Mantener a 14ºC. Programa BST para desplazamiento de cadena y extensión de ADNg de doble cadena mellado:
1.
Incubar a 65ºC, 30 minutos; y
2.
Mantener a 14ºC.
Etapa 9: Dilución y almacenamiento de biblioteca de ADN de cadena sencilla
Biblioteca de ADN de cadena sencilla en tampón EB: volumen final remanente = 25 μL.
La dilución inicial de la reserva se realizó como se indica a continuación. Usando los resultados de pirosecuenciamiento (Pyrosequencing AB, Uppsala, Suecia), se diluyó la biblioteca de ADN de cadena sencilla hasta 100 M moléculas/μL en tampón de maduración 1X (normalmente con una dilución 1:50).
Se prepararon alícuotas de la biblioteca de ADN de cadena sencilla para uso común mediante dilución de 200.000 moléculas/μL en tampón de maduración 1X y preparando alícuotas de 30 μL. Almacenamiento a -20ºC. Las muestras se utilizaron en PCR en emulsión.
Preparación de reactivos:
Disolución de parada (EDTA 50 mM): 100 μL de EDTA 0,5 M se mezclaron con 900 μL de nH2O para hacer 1,0 mL de disolución de EDTA 50 mM.
La disolución de dNTPs 10 mM incluía 10 μL de dCTP (100 mM), 10 μL de dATP (100 mM), 10 μL de dGTP (100 mM) y 10 μL de dTTP (100 mM), 60 μL de agua de grado biología molecular (nH2O). Las cuatro reservas de nucleótidos 100 mM se congelaron en hielo. Se combinaron 10 μL de cada nucleótido con 60 μL de nH2O hasta un volumen final de 100 μL, y se mezclaron intensamente. Se dispensaron alícuotas de 1 mL en tubos de microcentrífuga de 1,5 mL, y se almacenaron a -20ºC por un tiempo no superior a un año.
Tampón de maduración, 10X: el tampón de maduración 10X incluía Tris 200 mM (pH 7,5) y acetato de magnesio 50 mM. Para esta disolución, se añadieron 24,23 g de Tris a 800 mL de nH2O y se ajustó a pH 7,5. A esto se añadieron TE 10X: el TE 10X incluía Tris·HCl 100 mM (pH 7,5) y EDTA 50 mM. Estos reactivos se añadieron juntos y se mezclaron intensamente. La disolución se podía almacenar a temperatura ambiente durante 6 meses.
Ejemplo 4: PCR en emulsión de partículas
Los siguientes procedimientos, que incluyen la captura del ADN plantilla, la amplificación de ADN y la recuperación de las partículas ligadas a la plantilla amplificada, se pueden llevar a cabo en un tubo individual. El formato de emulsión asegura la separación física de las partículas en “microrreactores” de 100-200 μm dentro de dicho tubo individual, permitiendo de este modo la amplificación clonal de las diversas plantillas. La inmovilización del producto de amplificación se logra a través de la extensión de la plantilla junto con los oligonucleótidos ligados a las partículas de captura de ADN. Normalmente el número de copias de la plantilla inmovilizada oscila entre 10 y 30 millones de copias por partícula. Las partículas de captura de ADN con múltiples copias fijadas de una única especie de plantilla de ácido nucleico están preparadas para su distribución sobre las PTPs.
Los 300.000 pocillos de 75 picolitros grabados en la superficie de la PTP proporcionan un sistema único para el secuenciamiento de plantillas de ADN cortas de un modo paralelo masivo, eficaz y económico. Sin embargo, esto requiere cantidades bastante grandes de plantillas clonales en cada pocillo de reacción (millones de copias). Los métodos de la invención permiten al usuario amplificar clonalmente especies de plantilla genómica de cadena sencilla a través de reacciones PCR llevadas a cabo en tubos estándar o en placas microtiter. Las copias individuales de las especies de plantilla se pueden mezclar con las partículas de captura, se pueden volver a suspender en disolución de amplificación PCR completa, y se pueden poner en emulsión en microrreactores (con un diámetro de 100 a 200 μm), tras lo cual la amplificación PCR genera una amplificación de 107 veces las especies de plantilla iniciales. Este procedimiento es mucho más simple y más económico que los métodos previos.
Unión de plantilla de ácido nucleico a partículas de captura
Este ejemplo describe la preparación de una población de partículas que preferiblemente tienen solo una plantilla de ácido nucleico unida a ellas. Una amplificación clonal exitosa depende de la administración de un número controlado de especies plantilla a cada partícula (de 0,5 a 1). La administración de un exceso de especies puede producir la amplificación PCR de una población mixta de plantillas, impidiendo la generación de datos de secuencia con significado a la vez que un defecto de especies dará como resultado menos pocillos que contengan plantilla para el secuenciamiento. Esto puede reducir la extensión de la cobertura de genoma proporcionada por la fase de secuenciamiento. Como resultado, es preferible que la concentración de plantilla se determine con precisión a través de una cuantificación replicada, y que el protocolo de unión se siga como se describe a continuación.
Control de calidad de plantilla
El éxito de la reacción PCR en emulsión está relacionado con la calidad de las especies de plantilla. Independientemente del cuidado y el detalle que se ponga en la fase de amplificación, unas plantillas de baja calidad impedirán que la amplificación y la generación de secuencias con significado sean exitosas. Para evitar una pérdida innecesaria de tiempo y dinero, es importante comprobar la calidad del material de plantilla antes de iniciar la fase de PCR en emulsión del proceso. Preferiblemente, la biblioteca debería pasar dos etapas de control de calidad antes de ser usada en PCR en emulsión. Se debería determinar su concentración y la distribución de productos que contiene. Idealmente, la biblioteca debería aparecer como una población heterogénea de fragmentos con pocos o ningún dímero de adaptador visible (por ejemplo, ~90 bases). Asimismo, la amplificación con cebadores de PCR debería dar como resultado una marca de producto que oscile, por ejemplo, entre 300 y 500 pb. La ausencia de producto de amplificación puede reflejar un fallo para ligar apropiadamente los adaptadores a la plantilla, mientras que la presencia de una única banda de cualquier tamaño puede reflejar una contaminación de la plantilla.
Preparación de la disolución PCR
La consideración principal para esta fase es prevenir la contaminación de la mezcla de reacción PCR con productos de amplificación (amplicones) perdidos. La contaminación de las reacciones PCR con un amplicón residual es uno de los factores críticos que pueden provocar un fallo de la ejecución del secuenciamiento. Para reducir la posibilidad de contaminación, debería seguirse una técnica de laboratorio apropiada, y la preparación de la mezcla de reacción debería llevarse a cabo en un espacio limpio en una campana de extracción laminar tratada con UV.
Mezcla de reacción PCR:
Para 200 μL de mezcla de reacción PCR (suficiente para amplificar 600.000 partículas), se combinaron los siguientes reactivos en un tubo de PCR de 0,2 mL:
Reserva
Final Microlitros
Tampón HIFI
10 X 1 X 20
Nucleótidos tratados
10 mM 1 mM 20
Mg
50 mM 2 mM 8
BSA
10 % 0,1 % 2
Tween 80
1 % 0,01 % 2
Ppasa
2 U 0,003 U 0,333333
Cebador MMP1a
100 μM 0,625 μM 1,25
Cebador MMP1b
10 μM 0,078 μM 1,56
Polimerasa Taq
5 U 0,2 U 8
Agua
136,6
Total
200
El tubo se sometió a vórtice intensamente y se almacenó en hielo hasta que las partículas se maduraron a la plantilla.
Partículas de captura de ADN:
5 1. Se transfirieron 600.000 partículas de ADN desde el tubo de reserva hasta un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. La cantidad exacta usada dependerá de la concentración de partículas de reactivo formalizado.
2.
Las partículas fueron peletizadas en una minicentrífuga de sobremesa y el sobrenadante se retiró.
3.
Las etapas 4-11 se llevaron a cabo en un espacio limpio para PCR.
4.
Las partículas se lavaron con 1 mL de tampón de maduración 1X.
10 5. Las partículas de captura se peletizaron en una microcentrífuga. El tubo se volteó 180º y se giró de nuevo.
6.
Se eliminó todo el sobrenadante del tubo que contenía las partículas excepto 10 μL. Las partículas no se alteraron.
7.
Se añadió 1 mL de tampón de maduración 1X y la mezcla se incubó durante 1 minuto. A continuación las partículas se peletizaron como en la etapa 5.
15 8. Se extrajo todo el material del tubo excepto aproximadamente 100 μL.
9.
Las partículas y la disolución remanentes se transfirieron a un tubo de PCR.
10.
El tubo de 1,5 mL se lavó con 150 μL de tampón de maduración 1X pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces. Esto se añadió al tubo de PCR que contenía las partículas.
11. Las partículas fueron peletizadas como en la etapa 5 y se eliminó todo el sobrenadante excepto 10 μL, teniendo 20 cuidado de no alterar el pélet de partículas.
12. Se extrajo una alícuota de ADN plantilla de cadena sencilla (ADNsst) cuantificado. La concentración final fue de
200.000 moléculas de ADNsst/μL.
13. Se añadieron 3 μL de ADNsst diluido al tubo de PCR que contenía las partículas. Esto fue equivalente a 600.000 copias de ADNsst.
25 14. El tubo se agitó en círculos suavemente para mezclar los contenidos.
15. El ADNsst se maduró a las partículas de captura en un termociclador PCR con el programa 80Anneal almacenado en el fichero EPCR del Thermocycler MJ, usando el siguiente protocolo:
• 5 minutos a 65ºC;
•
Disminución a 0,1ºC/s hasta 60ºC; 30 • Mantener a 60ºC durante 1 minuto;
•
Disminuir a 0,1ºC/s hasta 50ºC;
•
Mantener a 50ºC durante 1 minuto;
•
Disminuir a 0,1ºC/s hasta 40ºC;
•
Mantener a 40ºC durante 1 minuto; 5 • Disminuir a 0,1ºC/s hasta 20ºC; y
• Mantener a 10ºC hasta que esté preparado para la siguiente etapa.
En la mayoría de los casos se usaron las partículas para amplificación inmediatamente después de la unión de plantilla. Si las partículas no se usan inmediatamente, deberían almacenarse en la disolución de plantilla a 4ºC hasta que se necesitaran. Tras el almacenamiento, las partículas fueron tratadas como se indica a continuación.
10 16. Como en la etapa 6, las partículas fueron extraídas del termociclador, centrifugadas y se retiró el tampón de maduración sin afectar a las partículas.
17.
Las partículas fueron almacenadas en un cubo de hielo hasta emulsificación (Ejemplo 2).
18.
Las partículas de captura incluyeron, de media, de 0,5 a 1 copias de ADNsst ligado a cada partícula, y estaban listas para emulsificación.
15 Ejemplo 5: Emulsificación
A continuación se describe una disolución de PCR adecuada para su uso en esta etapa. Para 200 μL de mezcla de reacción PCR (suficiente para amplificar 600K partículas), se añadió lo siguiente a un tubo de PCR de 0,2 mL:
Reserva
Final Microlitros
Tampón HIFI
10 X 1 X 20
Nucleótidos tratados
10 mM 1 mM 20
Mg
50 mM 2 mM 8
BSA
10 % 0,1 % 2
Tween 80
1 % 0,01 % 2
Ppasa
2 U 0,003 U 0,333333
Cebador MMP1a
100 μM 0,625 μM 1,25
Cebador MMP1b
10 μM 0,078 μM 1,56
Taq
5 U 0,2 U 8
Agua
136,6
Total
200
Este ejemplo describe cómo crear una emulsión agua-en-aceite estable térmicamente que contiene aproximadamente 3.000 microrreactores de PCR por microlitro. A continuación se describe un protocolo para 20 preparar la emulsión.
1.
Se añadieron 200 μL de disolución de PCR a las 600.000 partículas (ambos componentes del Ejemplo 1).
2.
La disolución se pipeteó hacia arriba y hacia abajo varias veces para volver a suspender las partículas.
3.
Se dejó incubar la mezcla PCR-partículas a temperatura ambiente durante 2 minutos para equilibrar las partículas con la disolución de PCR.
25 4. Se añadieron 400 μL de aceite de emulsión a un tubo de microcentrífuga de 2 mL irradiado con UV.
5. Se añadió una barra de agitación magnética de ¼’’ “libre de amplicón” al tubo de aceite de emulsión.
La barra de agitación libre de amplicón se preparó como se indica a continuación. Se usó una barra de agitación grande para sujetar la barra de agitación de ¼’’. A continuación la barra de agitación:
• Se lavó con DNA-Off (gotero o espray); 30 • Se enjuagó con agua picopura;
•
Se secó con el borde de una toallita Kimwipe; y
•
Se irradió con UV durante 5 minutos.
6. Se extrajo la inserción magnética de un portatubos Dynal MPC-S. El tubo de aceite de emulsión se colocó en el portatubos. El tubo se fijó en el centro de una placa de agitación fijada a 600 rpm.
5 7. El tubo se sometió a vórtice extensivamente para volver a suspender las partículas. Esto aseguró que hubiera una aglomeración de partículas mínima.
8. Usando una pipeta P-200, la mezcla PCR-partículas se añadió gota a gota al aceite agitado con una velocidad de aproximadamente una gota cada 2 segundos, permitiendo que cada gota se hundiera hasta el nivel de la barra magnética y se emulsificara antes de añadir la siguiente gota. La disolución se volvió un líquido blanco lechoso
10 homogéneo con una viscosidad similar a la mayonesa.
9.
Una vez que se había añadido toda la mezcla PCR-partículas, se golpeó el tubo de microcentrífuga varias veces para mezclar cualquier aceite de la superficie con la emulsión lechosa.
10.
Se continuó con la agitación durante otros 5 minutos.
11.
Se repitieron las etapas 9 y 10.
15 12. La barra de agitación se extrajo del material emulsificado arrastrándola hacia el exterior del tubo con una barra magnética de mayor tamaño.
13. Se extrajeron 10 μL de la emulsión y se colocaron sobre un portaobjetos de microscopio. La emulsión se cubrió con un cubreobjetos y se inspeccionó con unos aumentos de 50X (10X ocular y 5X lentes de objetivo). Se esperaba que una “buena” emulsión incluyera principalmente partículas individuales en gotas aisladas (microrreactores) de
20 disolución de PCR en aceite.
14. Se preparó una mezcla de aceite en emulsión adecuada con estabilizantes de emulsión como se indica a continuación. Los componentes para la mezcla de emulsión se muestran en la Tabla 5.
Tabla 5
Ingrediente
Cantidad requerida Fuente Nº referencia
Aceite mineral ligero Sigma
94,5 g Sigma M-5904
Atlox 4912
1 g Uniquema NA
Span 80
4,5 g Uniquema NA
La mezcla de aceite en emulsión se preparó precalentando el Atlox 4912 a 60ºC en un baño de agua. A continuación
25 se añadieron 4,5 gramos de Span 80 a 94,5 gramos de aceite mineral para formar una mezcla. Entonces se añadió un gramo del Atlox 4912 precalentado a la mezcla. Las disoluciones se llevaron a un recipiente cerrado y se mezclaron agitando e invirtiendo el recipiente. Cualquier evidencia de que el Atlox se estaba sedimentando o solidificando fue solventada calentando la mezcla a 60ºC, seguido de una agitación adicional.
Ejemplo 6: Amplificación
30 Este ejemplo describe la amplificación del ADN plantilla en la mezcla partícula-emulsión. Según este protocolo de la invención, la fase de amplificación de ADN del proceso dura de 3 a 4 horas. Una vez que la amplificación se ha completado, la emulsión se puede dejar sobre el termociclador hasta 12 horas antes de comenzar el proceso de aislamiento de las partículas. Se llevó a cabo un termociclado PCR colocando de 50 a 100 μL de la mezcla de reacción emulsificada en cámaras de reacción PCR individuales (es decir, tubos PCR). La PCR se llevó a cabo
35 como se indica a continuación:
1. La emulsión se transfirió en cantidades de 50-100 μL en aproximadamente 10 tubos de PCR separados o en una placa de 96 pocillos usando una punta de pipeta individual. Para esta etapa, la emulsión de agua-en-aceite fue altamente viscosa.
2. La placa se selló, o se cerraron las tapas del tubo PCR, y los recipientes se colocaron en un termociclador MJ con 40 o sin adaptador de placa de 96 pocillos.
3. El termociclador PCR se programó para ejecutar el siguiente programa:
•
1 ciclo (4 minutos a 94ºC) – inicio Hotstart;
•
40 ciclos (30 segundos a 94ºC, 30 segundos a 58ºC, 90 segundos a 68ºC);
•
25 ciclos (30 segundos a 94ºC, 6 minutos a 58ºC); y
•
Almacenamiento a 14ºC.
4. Tras completar la reacción PCR, se extrajo el material amplificado con el objetivo de proceder a la ruptura de la emulsión y recuperar las partículas.
Ejemplo 7: Ruptura de la emulsión y recuperación de partículas
Este ejemplo describe cómo romper la emulsión y recuperar las partículas con plantilla amplificada sobre ellas. Preferiblemente, la emulsión post-PCR debería permanecer intacta. La fase inferior de la emulsión debería, mediante inspección visual, permanecer como una suspensión blanca lechosa. Si la disolución es transparente, la emulsión se puede haber resuelto parcialmente en sus fases acuosa y aceitosa, y es probable que muchas de las partículas tengan una mezcla de plantillas. Si la emulsión se ha roto en uno o dos de los tubos, estas muestras no deberían combinarse con las demás. Si la emulsión se ha roto en todos los tubos, el procedimiento no debería continuarse.
1.
Todas las reacciones PCR de la muestra original de 600 μL fueron combinadas en un único tubo de microcentrífuga de 1,5 mL usando una única punta de pipeta. Tal como se ha indicado anteriormente, la emulsión era bastante viscosa. En algunos casos se repitió el pipeteo varias veces para cada tubo. Se transfirió tanto material como fue posible al tubo de 1,5 mL.
2.
El resto del material emulsificado se recuperó de cada tubo de PCR añadiendo 50 μL de aceite mineral Sigma en cada muestra. Usando una única punta de pipeta, se pipeteó cada tubo hacia arriba y hacia abajo unas cuantas veces para volver a suspender el material restante.
3.
Este material se añadió al tubo de 1,5 mL que contenía la masa de material emulsificado.
4.
La muestra se giró durante 30 segundos.
5.
La muestra se giró durante 20 minutos en el tubo de microcentrífuga de sobremesa a 13.200 rpm en la microcentrífuga Eppendorf.
6.
La emulsión se separó en dos fases con una interfase blanca grande. De la parte superior se retiró la máxima cantidad posible de fase aceite transparente. El material turbio se dejó en el tubo. A menudo, una capa blanca separaba las capas aceitosa y acuosa. A menudo las partículas se aglomeraban formando un pélet en el fondo del tubo.
7.
Se extrajo la capa acuosa por encima de las partículas y se rescató para análisis (análisis en gel, Agilent 2100, y Taqman). Si la interfase de material blanco persistía por encima de la capa acuosa, se extraían 20 microlitros de la capa acuosa subyacente. Esto se llevó a cabo penetrando el material de la interfase con una punta de pipeta y retirando la disolución de debajo.
8.
En la Campana extractora de fabricación de PTP y de espacio de química superficial, se añadió 1 mL de hexanos al resto de la emulsión.
9.
La muestra se sometió a vórtice durante 1 minuto y se giró a máxima velocidad durante otro minuto.
10.
En la Campana extractora de fabricación de PTP y de espacio de química superficial, la fase aceite/hexano de la parte superior fue extraída y llevada en el recipiente de residuos orgánicos.
11.
Se añadió 1 mL de tampón de maduración 1X en etanol al 80% al resto de la fase acuosa, la interfase y las partículas.
12.
La muestra se sometió a vórtice durante 1 minuto o hasta que la sustancia blanca se había disuelto.
13.
La muestra se centrifugó durante 1 minuto a alta velocidad. El tubo se rotó 180 grados y se volvió a girar durante 1 minuto. Se recuperó el sobrenadante sin afectar al pélet de partículas.
14.
Las partículas se lavaron con 1 mL de tampón de maduración 1X que contenía un 0,1% de Tween 20 y se repitió esta etapa.
Ejemplo 8: Eliminación de cadenas sencillas y maduración de cebador
Si las partículas se van a usar en una reacción de secuenciamiento basada en pirofosfato, entonces es necesario eliminar la segunda cadena del producto de PCR y madurar un cebador de secuenciamiento a la plantilla de cadena sencilla que está ligada a la partícula. Este ejemplo describe un protocolo para llevar a cabo esto.
1.
Las partículas se lavaron con 1 mL de agua y se giraron dos veces durante 1 minuto. El tubo se rotó 180º entre los giros. Tras girar se eliminó la fase acuosa.
2.
Las partículas se lavaron con 1 mL de EDTA 1 mM. El tubo se giró como en la etapa 1 y se retiró la fase acuosa.
3.
Se añadió 1 mL de NaOH 0,125 M y la muestra se incubó durante 8 minutos.
4.
La muestra se sometió brevemente a vórtice y se colocó en una microcentrífuga.
5.
Tras 6 minutos, las partículas fueron peletizadas como en la etapa 1 y se retiró tanta disolución como fue posible.
6.
Al finalizar el 8º minuto de la incubación con NaOH, se añadió 1 mL de tampón de maduración 1X.
7.
La muestra se sometió a vórtice brevemente y las partículas fueron peletizadas como en la etapa 1. Se retiró tanto sobrenadante como fue posible, y a se añadió otro 1 mL de tampón de maduración 1X.
8.
La muestra se sometió a vórtice brevemente, las partículas fueron peletizadas como en la etapa 1 y se extrajeron 800 μL de tampón de maduración 1X.
9.
Las partículas fueron transferidas a un tubo PCR de 0,2 mL.
10.
Las partículas fueron transferidas y se eliminó tanto tampón de maduración como fue posible sin afectar a las partículas.
11.
Se añadieron 100 μL de tampón de maduración 1X.
12.
Se añadieron 4 μL de cebador de secuenciamiento 100 μM. La muestra se sometió a vórtice justo antes de la maduración.
13.
Se llevó a cabo la maduración en un termociclador MJ usando el programa “80Anneal”.
14.
Las partículas se lavaron tres veces con 200 μL de tampón de maduración 1X y se volvieron a suspender con 100 μL de tampón de maduración 1X.
15.
Las partículas fueron contabilizadas en un hemacitómetro Hausser. Típicamente, se recuperaron entre 300.000 y
500.000 partículas (3.000-5.000 partículas/μL).
16. Las partículas se almacenaron a 4ºC y se podían usar para el secuenciamiento durante 1 semana.
Ejemplo 9: Etapa de enriquecimiento opcional
Las partículas se pueden enriquecer en partículas que contienen amplicón usando el siguiente procedimiento. El enriquecimiento no es necesario pero podría usarse para hacer más eficaces las técnicas de biología molecular posteriores, tal como el secuenciamiento de ADN.
Se añadieron cincuenta microlitros de cebador de secuenciamiento-biotina 10 μM (en total 500 pmoles) a las partículas se Sepharose que contienen amplicones procedentes del Ejemplo 5. Las partículas se colocaron en un termociclador. El cebador se maduró al ADN sobre la partícula mediante el programa de maduración del Ejemplo 2.
Tras la maduración, las partículas de sepharose se lavaron tres veces con tampón de maduración que contenía un 0,1% de Tween 20. Las partículas, conteniendo ya fragmentos de ADNss madurados con los cebadores de secuenciamiento-biotina, fueron concentradas mediante centrifugación y resuspendidas en 200 μL de tampón de unión BST. Se añadieron diez microlitros de Bst-polimerasa a 50.000 unidades/mL a las partículas resuspendidas y el recipiente que contenía las partículas se colocó en un rotor durante cinco minutos. Se añadieron dos microlitros de mezcla dNTP 10 mM (es decir, 2,5 μL de cada uno de dATP, dGTP, dCTP y dTTP, todos 10 mM) y la mezcla se incubó durante otros 10 minutos adicionales a temperatura ambiente. Las partículas se lavaron tres veces con tampón de maduración que contenía un 0,1% de Tween 20 y se volvieron a suspender en el volumen original de tampón de maduración.
Cincuenta microlitros de partículas de estreptavidina Dynal (Dynal Biotech Inc., Lake Success, NY; partículas M270
o MyOneTM a 10 mg/mL) se lavaron tres veces con tampón de maduración que contiene Tween 20 al 0,1% y se resuspendieron en el volumen original de tampón de maduración que contiene Tween 20 al 0,1%. A continuación se añadió la mezcla de partículas Dynal a las partículas de sepharose resuspendidas. La mezcla se sometió a vórtice y se colocó en un rotador durante 10 minutos a temperatura ambiente.
Las partículas fueron recogidas del fondo del tubo de ensayo mediante centrifugación a 2300 g (500 rpm en una Centrífuga Eppendorf 5415D). Las partículas se resuspendieron en el volumen original de tampón de maduración que contiene Tween 20 al 0,1%. La mezcla, en un tubo de ensayo, se colocó en un separador magnético (Dynal). Las partículas se lavaron tres veces con tampón de maduración que contiene Tween 20 al 0,1% y resuspendieron en el volumen original en el mismo tampón. Las partículas sin amplicones se eliminaron mediante etapas de lavado, como se ha descrito previamente. Solo se retuvieron las partículas de sepharose que contenían los fragmentos de ADN adecuados.
5 Ejemplo 10: Secuenciamiento de ácido nucleico usando PCR en emulsión de partículas
Se llevó a cabo el siguiente experimento para evaluar la eficacia de la PCR en emulsión de partículas. Para este protocolo, se unieron covalentemente 600.000 partículas de Sepharose, con un diámetro medio de 25-35 μm (tal como las suministra el fabricante) a cebadores de captura con una relación de 30-50 millones de copias por partícula. Las partículas con cebadores de captura unidos covalentemente se mezclaron con 1,2 millones de copias
10 de biblioteca de adenovirus de cadena sencilla. Las construcciones de biblioteca incluían una secuencia que era complementaria al cebador de captura de las partículas.
La biblioteca de adenovirus se maduró con las partículas usando el procedimiento descrito en el Ejemplo 1. A continuación, las partículas se resuspendieron en disolución de PCR completa. La disolución de PCR y las partículas fueron emulsificados en 2 volúmenes de aceite de emulsificación giratorio usando el mismo procedimiento descrito
15 en el Ejemplo 2. Las partículas emulsificadas (encapsuladas) fueron sometidas a amplificación mediante PCR tal como se ha descrito en el Ejemplo 3. La emulsión se rompió como se ha descrito en el Ejemplo 4. El ADN o las partículas se hicieron de cadena sencilla, el cebador de secuenciamiento se maduró usando el procedimiento del Ejemplo 5.
A continuación, se secuenciaron 70.000 partículas simultáneamente mediante secuenciamiento de pirofosfato 20 usando un secuenciador de pirofosfato de 454 Life Sciences (New Haven, CT). Se secuenciaron múltiples lotes de
70.000 partículas y los datos se enumeran en la Tabla 6, mostrada a continuación.
Tabla 6
Tolerancia de error
Alineamientos Cobertura Error de lectura inferido
de alineamiento
Ninguno Sencillo Múltiple Único
0%
47916 1560 1110 54,98% 0,00%
5%
46026 3450 2357 83,16% 1,88%
10%
43474 6001 1 3742 95,64% 4,36%
Esta tabla muestra los resultados obtenidos en el análisis BLAST comparando las secuencias obtenidas en el secuenciador de pirofosfato y la secuencia de adenovirus. La primera columna muestra la tolerancia de error usada
25 en el programa BLAST. La última columna muestra el error real determinado mediante comparación directa con la secuencia conocida.
PCR EN EMULSIÓN DE PARTÍCULAS PARA EL SECUENCIAMIENTO DE EXTREMO DOBLE
Ejemplo 11: Control de calidad de plantilla
Como se ha indicado previamente, se observó que el éxito de la reacción de PCR en emulsión está relacionado con
30 la calidad de las especies de plantilla de cadena sencilla. Por consiguiente, se determinó la calidad del material de plantilla con dos controles de calidad separados antes de iniciar el protocolo de PCR en emulsión. En primer lugar, se corrió una alícuota de la plantilla de cadena sencilla en el 2100 BioAnalyzer (Agilient). Se usó un chip RNA Pico para verificar que la muestra incluía una población heterogénea de fragmentos, que oscila en tamaño entre aproximadamente 200 y 500 bases. En segundo lugar, se cuantificó usando el ensayo de fluorescencia RiboGreen
35 en un fluorómetro de placas Bio-Tek FL600. Las muestras para las que se determinó que tenían concentraciones de ADN por debajo de 5 ng/μL se consideraron demasiado diluidas para su uso.
Ejemplo 12: Síntesis de partículas de captura de ADN
Las partículas empaquetadas de un 1 mL de una columna de afinidad de éster de N-hidroxisuccinimida (NHS)-Sepharose HP activada (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) fueron extraídas de la columna. Se seleccionaron 40 las partículas de 30-25 μm de tamaño mediante pasaje en serie a través de secciones de malla de filtro de 30 y 25 μm (Sefar America, Depew, NY, EE.UU.). Las partículas que pasaron a través del primer filtro y que fueron retenidas por el segundo fueron recogidas y activadas como se describe en la bibliografía del producto (Protocolo nº 71700600AP de Amersham Pharmacia). Se obtuvieron dos cebadores diferentes de captura largos de HEG (hexaetilenglicol) marcados con amina, que corresponden al extremo 5’ de la cadena sentido y antisentido de la 45 plantilla que se va a amplificar (espaciadores 5’-amino-3 HEG gcttacctgaccgacctctgcctatcccctgttgcgtgtc-3’; SEC ID Nº: 12; y espaciadores 5’-amino-3 HEG ccattccccagctcgtcttgccatctgttccctccctgtc-3’; SEC ID Nº: 13) (IDT Technologies, Coralville, IA, EE.UU.). Los cebadores se diseñaron para captura ambas cadenas de los productos de amplificación para permitir el secuenciamiento de doble extremo, es decir, el secuenciamiento de la primera y segunda cadenas de los productos de amplificación. Los cebadores de captura se disolvieron en tampón fosfato 20
Ejemplo 13: Preparación y formulación de la mezcla de reacción de PCR
Como con cualquier técnica de amplificación de molécula sencilla, la contaminación de las reacciones con amplicón ajeno o residual procedente de otros experimentos podría interferir con una ejecución de secuenciamiento. Para reducir la posibilidad de contaminación, se preparó la mezcla de reacción PCR en una campana de flujo laminar tratada con UV localizada en un espacio limpio para PCR. Para cada reacción de PCR en emulsión de 600.000 partículas, se mezclaron los siguientes reactivos en un tubo de 1,5 mL: 225 μL de mezcla de reacción (tampón HiFi de platino 1X (Invitrogen)), dNTPs 1 mM, MgSO4 2,5 mM (Invitrogen), BSA al 0,1%, Tween al 0,01%, 0,003 U/μL de PPi-asa termoestable (NEB), cebador directo 0,125 μM (5’-gcttacctgaccgacctctg-3’; SEC ID Nº: 14) y cebador inverso 0,125 μm (5’-ccattccccagctcgtcttg-3’; SEC ID Nº: 15) (IDT Technologies, Coralville, IA, EE.UU.) y 0,2 U/μL de Polimerasa Platino Hi-Fi Taq (Invitrogen). Se extrajeron veinticinco microlitros de la mezcla de reacción y se almacenaron en un tubo de PCR de 200 μL individual para uso como control negativo. Tanto la mezcla de reacción como los controles negativos se almacenaron sobre hielo cuando fue necesario.
Ejemplo 14. Unión de especies de plantilla a partículas de captura de ADN
Una amplificación de ADN clonal exitosa para el secuenciamiento está relacionada con la administración de un número controlado de especies de plantilla por cada partícula. Para los experimentos descritos en la presente memoria más adelante, se determinó que la concentración de plantilla diana típica era de 0,5 copias de plantilla por partícula de captura. A dicha concentración, la distribución de Poisson dicta que el 61% de las partículas no tienen una plantilla asociada, el 30% tienen una especie de plantilla y el 9% tiene dos o más especies de plantilla. La administración de especies en exceso puede dar como resultado en la unión y posterior amplificación de una población mixta (2 o más especies) sobre una partícula individual, evitando la generación de datos de secuencia con significado. Sin embargo, la administración de demasiado pocas especies dará como resultado menos pocillos que contengan plantilla (una especie por partícula), reduciendo la extensión de la cobertura de secuenciamiento. Consecuentemente, se juzgó que la concentración de biblioteca de cadena sencilla era importante.
Las moléculas de ácido nucleico plantilla fueron maduradas con cebadores complementarios sobre las partículas de captura de ADN mediante el siguiente método, llevado a cabo en una campana de flujo laminar tratada con UV. Seiscientas mil partículas de captura de ADN suspendidas en un tampón de almacenamiento de partículas (véase el Ejemplo 9 anterior) se transfirieron a un tubo de PCR de 200 μL. El tubo se centrifugó en una minicentrífuga de sobremesa durante 10 segundos, se rotaron 180º y se giraron durante otros 10 segundos para asegurar una formación de pélet uniforme. Se retiró el sobrenadante y las partículas se lavó con 200 μL de tampón de maduración (Tris 20 mM, pH 7,5 y acetato de magnesio 5 mM). El tubo se sometió a vórtice durante 5 segundos para resuspender las partículas, y las partículas fueron peletizadas como se ha indicado antes. Se retiró todo el sobrenadante sobre las partículas, excepto aproximadamente 10 μL, y se añadieron 200 μL adicionales de tampón de maduración. Las partículas se volvieron a someter a vórtice durante 5 segundos, se dejaron asentar durante 1 minuto y a continuación se peletizaron como se ha indicado antes. Se descartó todo el sobrenadante excepto 10 μL.
A continuación, se añadió a las partículas 1,5 μL de biblioteca de plantilla 300.000 moléculas/μL. El tubo se sometió a vórtice durante 5 segundos para mezclar el contenido, y las plantillas se maduraron a las partículas en un programa controlado de desnaturalización/maduración llevado a cabo en un termociclador MJ. El programa permitió la incubación durante 5 minutos a 80ºC, seguido de un descenso de 0,1ºC/s hasta 70ºC, incubación durante 1 minuto a 70ºC, disminución en 0,1ºC/s hasta 60ºC, mantener a 60ºC durante 1 minuto, disminución en 0,1ºC/s hasta 50ºC, mantener a 50ºC durante 1 minuto, disminución en 0,1ºC/s hasta 20ºC, mantener a 20ºC. Después de completar el proceso de maduración, las partículas se extrajeron del termociclador, se centrifugaron como se ha indicado antes, y el tampón de maduración se decantó con cuidado. Las partículas de captura incluyeron de media 0,5 copias de ADN plantilla de cadena sencilla ligado a cada partícula, y se almacenaron sobre hielo hasta que se necesitaron.
Ejemplo 15: Emulsificación
El proceso de emulsificación crea una emulsión de agua-en-aceite estable térmicamente que contiene 10.000 microrreactores de PCR discretos por microlitro. Esto sirve como matriz para amplificación clonal de molécula individual de las moléculas individuales de la biblioteca diana. La mezcla de reacción y las partículas de captura de ADN para una reacción individual fueron emulsificadas de la siguiente manera. En una campana de flujo laminar tratada con UV, se añadieron 200 μL de disolución de PCR (procedente del Ejemplo 10) al tubo que contiene las
600.000 partículas de captura de ADN (procedente del Ejemplo 11). Las partículas fueron resuspendidas mediante pipeteado repetido. Después de esto, la mezcla de partículas de PCR se incubó a temperatura ambiente durante al menos 2 minutos, permitiendo que las partículas se equilibraran con la disolución de PCR. Al mismo tiempo, se llevó una alícuota de 450 μL de aceite de emulsión (4,5 % (p/p) de Span 80, 1% (p/p) de Atlox 4912 (Uniquema, Delaware) en aceite mineral ligero (Sigma)) a un tubo de centrífuga de 2 mL de cierre plano (Dot Scientific) que La disolución de partículas de PCR se sometió a vórtice durante 15 segundos para resuspender las partículas. A continuación la disolución se extrajo con una jeringa desechable de plástico de 1 mL (Benton-Dickenson) acoplada a una aguja de jeringa de seguridad de plástico (Henry Schein). La jeringa se colocó en una bomba de jeringa (Cole-Palmer) modificada con una unidad de base de aluminio que orienta la bomba verticalmente en lugar de horizontalmente (Figura 30). El tubo con el aceite de emulsión se alineó sobre la placa de agitación de tal modo que quedó centrado por debajo de la aguja de jeringa de plástico y la barra de agitación magnética giraba apropiadamente. La bomba de jeringa se fijó para dispensar 0,6 mL a 5,5 mL/h. La disolución de partículas de PCR se añadió al aceite de emulsión gota a gota. Se tuvo cuidado para asegurar que las gotas no entraran en contacto con el lateral del tubo al caer dentro del aceite en agitación.
Una vez que se había formado la emulsión, se extremó el cuidado para minimizar la agitación de la emulsión durante el proceso de emulsificación y las etapas de toma de alícuotas post-emulsificación. Se observó que someter a vórtice, pipetear rápidamente o mezclar de forma excesiva podría provocar que la emulsión se rompiera, destruyendo los microrreactores discretos. Al formar la emulsión, las dos disoluciones se volvieron una mezcla blanca lechosa homogénea con la viscosidad de la mayonesa. El contenido de la jeringa se vacío dentro del aceite en agitación. A continuación, el tubo de emulsión se retiró de la plantilla de sujeción y se golpeó suavemente con un dedo hasta que desapareció cualquier capa de aceite residual en la parte superior de la emulsión. El tubo se devolvió a la plantilla de sujeción y se agitó con la barra de agitación magnética durante otro minuto adicional. Se extrajo la barra de agitación de la emulsión utilizando una herramienta de recuperación magnética por el exterior del tubo, y se desechó la barra de agitación.
Se tomaron veinte microlitros de la emulsión del medio del tubo usando un pipeteador P100 y llevaron a un portaobjetos de microscopio. Se usaron las puntas de pipeta más grandes para minimizar las fuerzas de cizalla. Se inspeccionó la emulsión a 50X aumentos para asegurar que está compuesta predominantemente por partículas individuales en microrreactores de 30 a 150 micras de diámetro de disolución de PCR en aceite (Figura 33). Tras un examen visual, las emulsiones fueron amplificadas inmediatamente.
Ejemplo 16: Amplificación
La emulsión se dividió en alícuotas en 7-8 tubos de PCR separados. Cada tubo incluía aproximadamente 75 μL de la emulsión. Los tubos fueron sellados y colocados en un termociclador MJ junto con los 25 μL de control negativo descrito anteriormente. Se usaron los siguientes tiempos de ciclo: 1 ciclo de incubación durante 4 minutos a 94ºC (inicio Hotstart), 30 ciclos de incubación durante 30 segundos a 94ºC y 150 segundos a 68ºC (amplificación), y 40 ciclos de incubación durante 30 segundos a 94ºC, y 360 segundos a 68ºC (hibridación y extensión). Tras completar el programa PCR, los tubos fueron extraídos y las emulsiones se rompieron inmediatamente o las reacciones se almacenaron a 10ºC durante hasta 16 horas antes de iniciar el proceso de ruptura.
Ejemplo 17: Ruptura de la emulsión y recuperación de partículas
Después de la amplificación, las emulsiones fueron examinadas para determinar ruptura (separación de las fases de aceite y agua). Las emulsiones no rotas se combinaron en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL individual, mientras que la emulsión rota ocasional se descartó. Puesto que las muestras de emulsión eran bastante viscosas, en cada tubo permanecieron cantidades significativas. La emulsión que quedaba en los tubos se recuperó añadiendo 75 μL de aceite mineral en cada tubo de PCR y pipeteando la mezcla. Esta mezcla se añadió al tubo de 1,5 mL que contenía la masa del material emulsificado. A continuación el tubo de 1,5 mL se sometió a vórtice durante 30 segundos. Después de esto, el tubo se centrifugó durante 20 minutos en la microcentrífuga de sobremesa a 13200 rpm (máxima velocidad).
Tras la centrifugación, la emulsión se separó en dos fases con una interfase grande blanca. La fase superior, de aceite transparente, se descartó mientras que el material de la interfase se dejó en el tubo. En una campana de extracción química, se añadió 1 mL de hexanos a la fase inferior y a la capa de interfase. La mezcla se sometió a vórtice durante 1 minuto a máxima velocidad durante 1 minuto en una microcentrífuga de sobremesa. La fase superior de aceite/hexano se extrajo y se descartó. Después de esto se añadió 1 mL de 80% de etanol/tampón de maduración 1X a la fase acuosa remanente, la interfase y las partículas. Esta mezcla se sometió a vórtice durante 1 minuto o hasta que el material blanco de la interfase se había disuelto. A continuación se centrifugó la muestra en una microcentrífuga de sobremesa durante 1 minuto a velocidad máxima. El tubo se rotó 180 grados, y se giró de nuevo durante un minuto adicional. El sobrenadante se eliminó entonces cuidadosamente sin afectar al pélet de partículas.
El pélet de partículas blanco se lavó dos veces con 1 mL de tampón de maduración que contenía Tween al 0,1%. La disolución de lavado se descartó y las partículas se peletizaron tras cada lavado como se ha descrito anteriormente. El pélet se lavó con 1 mL de agua picopura. Las partículas se peletizaron con el método de centrífuga-rotacióncentrífuga usado previamente. La fase acuosa se eliminó con cuidado. Las partículas se lavaron entonces con 1 mL El ADN amplificado, inmovilizado sobre las partículas de captura, se trató para obtener ADN de cadena sencilla. La segunda cadena se eliminó mediante incubación en una disolución de fusión básica. Subsiguientemente se añadió a las partículas un mL de disolución de fusión (NaOH 0,125 M, NaCl 0,2 M). El pélet se resuspendió sometiendo a vórtice a nivel medio durante 2 segundos, y el tubo se colocó en un rotador de tubos Thermolyne LabQuake durante 3 minutos. A continuación las partículas se peletizaron como se ha indicado antes y el sobrenadante se eliminó cuidadosamente y se descartó. La disolución de fusión residual se neutralizó mediante la adición de 1 mL de tampón de maduración. Después de esto, las partículas fueron sometidas a vórtice a nivel medio durante 2 segundos. Las partículas fueron peletizadas, y el sobrenadante se eliminó como antes. Se repitió el lavado de tampón de maduración, excepto que solo se eliminaron tras la centrifugación 800 μL del tampón de maduración. Las partículas y el tampón de maduración remanente fueron transferidos a un tubo de PCR de 0,2 mL. Las partículas se usaron inmediatamente o se almacenaron a 4ºC durante hasta 48 horas antes de continuar con el proceso de enriquecimiento.
Ejemplo 18: Enriquecimiento de partículas opcional
La masa de partículas incluía partículas con cadenas de ADN inmovilizadas y amplificadas, y partículas vacías o nulas. Como se ha mencionado previamente, se calculó que el 61% de las partículas carecían de ADN plantilla durante el proceso de amplificación. El enriquecimiento se usó para aislar selectivamente partículas con ADN plantilla, maximizando con ello la eficacia del secuenciamiento. El proceso de enriquecimiento se describe con detalle a continuación.
Las partículas de cadena sencilla del Ejemplo 14 fueron peletizadas con el método de centrífuga-rotación-centrífuga, y se eliminó tanto sobrenadante como fue posible sin afectar a las partículas. Se añadieron quince microlitros de tampón de maduración a las partículas, seguido de 2 μL de cebador biotinilado 100 μM enriquecido con 40 bases (5’-Biotin- tetra-etilenglicol espaciadores ccattccccagctcgtcttgccatctgttccctccctgtctcag-3’; SEC ID Nº: 16). El cebador fue complementario a los sitios de amplificación y secuenciamiento combinados (cada uno de 20 bases de longitud) sobre el extremo 3’ de la plantilla inmovilizada en partícula. La disolución se mezcló sometiendo a vórtice a nivel medio durante 2 segundos, y los cebadores de enriquecimiento fueron madurados con las cadenas de ADN inmovilizadas usando un programa controlado de desnaturalización/maduración en un termociclador MJ. El programa consistió en los siguientes tiempos y temperaturas de ciclo: incubación durante 30 segundos a 65ºC, disminución a 0,1ºC/s hasta 58ºC, incubación durante 90 segundos a 58ºC, y mantener a 10ºC.
Mientras que los cebadores se maduraban, las partículas de estreptavidina Dynal MyOneTM fueron resuspendidas mediante un movimiento suave. A continuación se añadieron 20 μL de las partículas MyOneTM a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL que contenía 1 mL de fluido potenciador (NaCl 2 M, Tris·HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7,5). La mezcla de partículas MyOne se sometió a vórtice durante 5 segundos, y el tubo se colocó en un imán Dynal MPC-s. Las partículas paramagnéticas fueron peletizadas contra el lateral del tubo de microcentrífuga. El sobrenadante se extrajo cuidadosamente y se descartó sin afectar a las partículas MyOneTM. Se quitó el tubo del imán, y se añadieron 100 μL de fluido potenciador. El tubo se sometió a vórtice durante 3 segundos para resuspender las partículas, y se almacenó sobre hielo hasta que se necesitó.
Tras completar el programa de maduración, se añadieron 100 μL de tampón de maduración al tubo de PCR que contenía las partículas de captura de ADN y el cebador de enriquecimiento. El tubo se sometió a vórtice durante 5 segundos, y el contenido se transfirió a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL nuevo. El tubo de PCR en el que se maduró el cebador de enriquecimiento con las partículas de captura se lavó una vez con 200 μL de tampón de maduración, y la disolución de lavado se añadió al tubo de 1,5 mL. Las partículas se lavaron tres veces con 1 mL de tampón de maduración, se sometieron a vórtice durante 2 segundos y se peletizaron como se ha indicado antes. El sobrenadante se extrajo con cuidado. Después del tercer lavado, las partículas se lavaron dos veces con 1 mL de fluido potenciador enfriado en hielo. Las partículas fueron sometidas a vórtice, peletizadas y se retiró el sobrenadante como se ha indicado antes. Las partículas fueron resuspendidas en 150 μL de fluido potenciador enfriado en hielo y la disolución de partículas se añadió a las partículas MyOneTM lavadas.
La mezcla de partículas se sometió a vórtice durante 3 segundos y se incubó a temperatura ambiente durante 3 minutos en un rotador de tubos LabQuake. Las partículas MyOneTM recubiertas de estreptavidina fueron ligadas a los cebadores de enriquecimiento biotinilados madurados a plantillas inmovilizadas sobre las partículas de captura de ADN. A continuación las partículas fueron centrifugadas a 2.000 rpm durante 3 minutos, tras lo cual las partículas fueron sometidas a vórtice con pulsos de 2 segundos hasta que se resuspendieron. Las partículas resuspendidas fueron colocadas en hielo durante 5 minutos. Después de esto, se añadieron 500 μL de fluido potenciador frío a las partículas y el tubo se insertó en un imán Dynal MPC-S. Se dejó a las partículas sin alterar durante 60 segundos para permitir la peletización contra el imán. Tras esto, se extrajo cuidadosamente el sobrenadante con el exceso de partículas MyOneTM y de captura de ADN y se descartó.
El tubo se retiró del imán MPC-S, y se añadió 1 mL de fluido potenciador frío a las partículas. Las partículas fueron resuspendidas con un movimiento suave del dedo. Era importante no producir vórtice en las partículas esta vez, ya que una mezcla demasiado fuerte podría romper el enlace entre las partículas MyOneTM y las partículas de captura de ADN. Las partículas se devolvieron al imán y se extrajo el sobrenadante. Este lavado se repitió tres veces más para asegurar la eliminación de todas las partículas de captura nulas. Para eliminar los cebadores de enriquecimiento madurados y las partículas MyOneTM, las partículas de captura de ADN fueron resuspendidas en 400 μL de disolución de fusión, se sometieron a vórtice durante 5 segundos y se peletizaron con el imán. El sobrenadante con las partículas enriquecidas se transfirió a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL separado. Para una máxima recuperación de las partículas enriquecidas, se añadió una segunda alícuota de 400 μL de disolución de fusión al tubo que contenía las partículas MyOneTM. Las partículas se sometieron a vórtice y se peletizaron como se ha indicado antes. Se extrajo el sobrenadante del segundo lavado y se combinó con el primer bolo de partículas enriquecidas. El tubo de partículas MyOneTM agotadas se descartó.
El tubo de partículas de captura de ADN enriquecidas se colocó en un imán Dynal MPC-S para peletizar las partículas MyOneTM residuales. Las partículas enriquecidas del sobrenadante fueron transferidas a un segundo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y se centrifugaron. Se extrajo el sobrenadante, y las partículas se lavaron 3 veces con 1 mL de tampón de maduración para neutralizar la disolución de fusión residual. Tras el tercer lavado, se extrajeron 800 μL del sobrenadante, y las partículas remanentes y la disolución fueron transferidas a un tubo de PCR de 0,2 mL. Las partículas enriquecidas fueron centrifugadas a 2.000 rpm durante 3 minutos y el sobrenadante se decantó. A continuación se añadieron 20 μL de tampón de maduración y 3 μL de dos cebadores de secuenciamiento 100 μM diferentes (5’-ccatctgttccctccctgtc-3’; SEC ID Nº: 17, y 5’-cctatcccctgttgcgtgtc-3’ fosfato; SEC ID Nº: 18). El tubo se sometió a vórtice durante 5 segundos y se colocó en un termociclador MJ para el siguiente programa de maduración de cuatro etapas: incubación durante 5 minutos a 65ºC, disminución a 0,1ºC/s hasta 50ºC, incubación durante 1 minuto a 50ºC, disminución a 0,1ºC/s hasta 40ºC, mantener a 40ºC durante 1 minuto, disminución a 0,1ºC/s hasta 15ºC y mantener a 15ºC.
Tras completar el programa de maduración, las partículas fueron extraídas del termociclador y peletizadas mediante centrifugación durante 10 segundos. El tubo se rotó 180º y se giró durante otros 10 segundos adicionales. El sobrenadante se decantó y se descartó, y se añadieron 200 μL de tampón de maduración al tubo. Las partículas se resuspendieron con un vórtice de 5 segundos y se peletizaron como se ha indicado antes. Se extrajo el sobrenadante y las partículas se resuspendieron en tampón de maduración de 100 μL. En este punto, las partículas se cuantificaron con un Contador Multisizer 3 Coulter (Beckman Coulter). Las partículas se almacenaron a 4ºC y fueron estables durante al menos 1 semana.
Ejemplo 19: Secuenciamiento de cadena doble
Para el secuenciamiento de cadena doble se usan dos cebadores de secuenciamiento diferentes; un cebador MMP7A sin modificar y un cebador 3’ fosforilado MMP2Bp. Existen múltiples etapas en el proceso. Este proceso se muestra esquemáticamente en la Figura 38.
1.
Secuenciamiento de la primera cadena. El secuenciamiento de la primera cadena implica la extensión del cebador no modificado mediante ADN polimerasa a través de la adición secuencial de nucleótidos durante un número predeterminado de ciclos.
2.
ACABADO: el secuenciamiento de la primera cadena fue terminado haciendo fluir un tampón de acabado que contenía Tricina 25 mM, acetato de magnesio 5 mm, DTT 1 mM, 0,4 mg/mL de PVP, 0,1 mg/mL de BSA, Tween al 0,01% y 2 μM de cada uno de los didesoxinucleótidos y 2 μM de cada desoxinucléotido.
3.
LIMPIEZA: los desoxinucléotidos y didesoxinucleótidos residuales fueron eliminados haciendo fluir tampón de apirasa que contenía Tricina 25 mM, acetato de magnesio 5 mM, DTT 1 mM, 0,4 mg/mL de PVP, 0,1 mg/mL de BSA, Tween al 0,01% y 8,5 unidades/L de apirasa.
4.
CORTE: el segundo cebador bloqueado se desbloqueó eliminando el grupo fosfato del extremo 3’ del cebador 3’ fosforilado modificado haciendo fluir un tampón de corte que contenía 5 unidades/mL de fosfatasas intestinales de ternero.
5.
CONTINUACIÓN: el segundo cebador desbloqueado se activó mediante la adición de polimerasa haciendo fluir 1000 unidades/mL de ADN polimerasas para capturar todos los sitios de cebador disponibles.
6.
Secuenciamiento de segunda cadena: el secuenciamiento de la segunda cadena mediante una ADN polimerasa a través de la adición secuencial de nucleótidos durante un número predeterminado de ciclos.
Usando los métodos descritos antes se secuenció el ADN genómico de Staphylococcus aureus. Los resultados se presentan en la Figura 39. Se obtuvieron un total de 31.785 lecturas en base a 15770 lecturas de la primera cadena y 16015 lecturas de la segunda cadena. De éstas, un total de 11.799 lecturas fueron emparejadas y 8187 lecturas estaban desparejadas, obteniéndose una cobertura total del 38%.
Las longitudes de lectura oscilaron entre 60 y 130 con un promedio de 95 +/- 9 bases (Figura 40). La distribución de amplitud de genoma y el número de pocillos de cada genoma se muestran en la Figura 41. En la Figura 42 se muestran cuerdas de alineamiento representativas procedentes de este secuenciamiento genómico.
Partículas de NHS Sepharose de 30 micras fueron acopladas con 1 mM de cada uno de los siguientes cebadores:
MMP1A: cgtttcccctgtgtgccttg (SEC ID Nº: 19)
MMP1B: ccatctgttgcgtgcgtgtc (SEC ID Nº: 20)
Se llevó a cabo una PCR dirigida a partícula en un tubo en el termociclador MJ añadiendo 50 μL de partículas acopladas a cebador lavadas a una mezcla maestra de PCR con una relación volumen-volumen uno-a-uno. La mezcla maestra de PCR incluía:
Tampón de PCR 1X;
1 mM de cada dNTP;
0,625 μM de cebador MMP1A;
0,625 μM de cebador MMP1B;
1 μL de 1 unidad/μL de Hi Fi Taq (Invitrogen, San Diego, CA); y
~ 5-10 ng de ADN plantilla (el ADN que se va a secuenciar).
La reacción PCR se llevó a cabo programando el termociclador MJ para lo siguiente: incubación a 94ºC durante 3 minutos; 39 ciclos de incubación a 94ºC durante 30 segundos, 58ºC durante 30 segundos, 68ºC durante 30 segundos; seguido de incubación a 94ºC durante 30 segundos y 58ºC durante 10 minutos; 10 ciclos de incubación a 94ºC durante 30 segundos, 58ºC durante 30 segundos, 68ºC durante 30 segundos; y almacenamiento a 10ºC.
Ejemplo 21: Preparación de ADN plantilla y Maduración de cebador de secuenciamiento
Las partículas del Ejemplo 1 se lavaron dos veces con agua destilada; se lavaron una vez con EDTA 1 mM, y se incubaron con NaOH 0,125 M durante 5 minutos. Esto eliminó las cadenas de ADN no ligadas a las partículas. A continuación, las partículas se lavaron una vez con tampón de acetato Tris 50 mM, y dos veces con tampón de maduración: Tris-Acetato 200 mM, acetato de Mg 50 mM, pH 7,5. A continuación, se añadieron a las partículas 500 pmoles de cebador de secuenciamiento MMP7A (ccatctgttccctccctgtc; SEC ID Nº: 21) y MMP2B-fos (cctatcccctgttgcgtgtc; SEC ID Nº: 22). Los cebadores fueron madurados con el siguiente programa en el termociclador MJ: incubación a 60ºC durante 5 minutos; bajada de temperatura de 0,1 grados por segundo hasta 50ºC; incubación a 50ºC durante 5 minutos; bajada de temperatura a 0,1 grados por segundo hasta 40ºC; incubación a 40ºC durante 5 minutos; bajada de temperatura a 0,1 grados por segundo hasta 10ºC. La plantilla se secuenció entonces usando un secuenciamiento de pirofosfato estándar.
Ejemplo 22: Secuenciamiento y parada de la primera cadena
Las partículas fueron giradas en una placa PicoTiter (PTP) de 55 μm a 3000 rpm durante 10 minutos. La PTP se colocó en una plataforma y se corrió usando un secuenciamiento nuevo para un número predeterminado de ciclos. El secuenciamiento se detuvo acabando la primera cadena. La primera cadena fue acabada añadiendo 100 μL de 1X AB (acetato de Mg 50 mM, tricina 250 mM), 1000 unidades/mL de BST polimerasa, 0,4 mg/mL de proteína de unión a ADN de cadena sencilla, DTT 1 mM, 0,4 mg/mL de PVP (polivinil pirrolidona), 10 μM de cada ddNTP y 2,5 μM de cada dNTP. Entonces se hizo fluir apirasa con el objetivo de eliminar el exceso de nucleótidos añadiendo 1X AB, 0,4 mg/mL de PVP, DTT 1 mM, 0,1 mg/mL de BSA, 0,125 unidades/mL de apirasa, se incubó durante 20 minutos.
Ejemplo 23: Preparación de segunda cadena para secuenciamiento
La segunda cadena se desbloqueó añadiendo 100 μL de 1X AB, 0,1 unidades por mL de polinucleótido quinasa, DTT 5 mM. La plantilla resultante se secuenció usando un secuenciamiento de pirofosfato estándar (descrito, por ejemplo, en las Patentes de EE.UU. 6.274.320, 6.258.568 y 6.210.891, incorporadas a la presente memoria a modo de referencia). Los resultados del método de secuenciamiento se pueden ver en la Figura 10F, en la que se secuenció un fragmento de 174 pb en ambos extremos usando secuenciamiento de pirofosfato y los métodos descritos en estos ejemplos.
Ejemplo 24: Análisis de secuencia de ácido nucleico en una placa PicoTiter
La placa picotiter que contiene los ácidos nucleicos amplificados tal como se describe en el Ejemplo 2 se coloca en una cámara de perfusión. A continuación se administran sulfurilasa, apirasa y luciferasa a la placa picotiter.
El cebador de secuenciamiento ceba la síntesis de ADN que se extiende en el injerto sospechosos de presentar un polimorfismo, tal como se muestra en las Figuras 11A-11D. El cebador de secuenciamiento se extiende en primer lugar alimentando a la cámara de perfusión, en sucesión, una disolución de lavado, una ADN polimerasa, y uno de dTTP, dGTP, dCTP o a tio dATP (un análogo de dATP). La sulfurilasa, la luciferasa y la apirasa, unidas a los extremos convierten cualquier PPi liberado como parte de la reacción de secuenciamiento en luz detectable. La apirasa presente degrada cualquier dNTP no reaccionado. Típicamente, se permite la recolección de luz durante 3 segundos (aunque también es adecuado 1-100 segundos, por ejemplo 2-10 segundos) mediante una cámara CCD ligada al haz de fibra de imagen, tras lo cual se añade disolución de lavado adicional a la cámara de perfusión para eliminar los nucleótidos de exceso y los subproductos. A continuación se añade el siguiente nucleótido, junto con polimerasa, repitiendo de este modo el ciclo.
Durante el lavado, la luz recolectada es transferida desde la cámara CCD hasta un ordenador. La emisión de luz se analiza mediante el ordenador y se usa para determinar si el correspondiente dNTP ha sido incorporado en el cebador de secuencia extendido. La adición de dNTPs y reactivos de secuenciamiento de pirofosfato se repite hasta que se obtiene la secuencia de la región de injerto que contiene el polimorfismo sospechado.
Ejemplo 25: Amplificación de PCR sobre placa PicoTiter
Preparación de placa picotiter: en una realización adicional, la biblioteca de cadena sencilla unida a las partículas se distribuye directamente sobre la placa picotiter y a continuación se amplifica la plantilla de ácido nucleico sobre cada partícula (usando PCR u otra tecnología de amplificación conocida) para generar un número de copias de la plantilla suficiente para generar una señal detectable en los métodos de secuenciamiento basados en pirofosfato descritos en la presente memoria.
Ejemplo 26: Análisis de secuencia de ácido nucleico sobre una PTP
Los reactivos usados para el análisis de secuencia y como controles fueron los cuatro nucleótidos y pirofosfato (PPi) 0,1 μM se prepararon en disolución de sustrato. Disolución de sustrato se refiere a una mezcla de luciferina 300 μM y adenosina 5’-fosfosulfato, APS, 4 μM, que son los sustratos para la cascada de reacciones que implican PPi, luciferasa y sulfurilasa. El sustrato se prepara en un tampón de ensayo. La concentración de PPi usada para evaluar las enzimas y determinar los niveles de fondo de reactivos que pasan a través de la cámara fue de 0,1 μM. La concentración de los nucleótidos, dTTP, dGTP, dCTP fue de 6,5 μM y la de adATP fue de 50 μM. Cada uno de los nucleótidos se mezcló con ADN polimerasa, Klenow a una concentración de 100 U/mL.
Se colocó la PTP en la cámara de flujo del instrumento, y la cámara de flujo se unió a la placa frontal de la cámara CCD. El PTP se lavó haciendo fluir el sustrato (3 mL por minuto, 2 minutos) a través de la cámara. Después de esto, se hizo fluir una secuencia de reactivos a través de la cámara mediante la bomba conectada a un actuador, que se programó para cambiar posiciones, que tenía tubos insertados en los diferentes reactivos. Se determinó la secuencia de reactivos, los caudales y los tiempos de flujo. La cámara se fijó en un modo de adquisición rápida, con un tiempo de exposición = 2,5 s.
La señal producida por la almohadilla se determinó como la media de conteos de todos los píxeles de la almohadilla. El número de marco fue equivalente al tiempo transcurrido durante el experimento. Se usó un método gráfico para representar el flujo de los diferentes reactivos.
Ejemplo 27: Plataforma basada en placa para las reacciones de PCR a escala de picolitros
Materiales y métodos
A menos que se indique lo contrario, todos los productos químicos de laboratorio comunes fueron adquiridos en Sigma (Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MI) o en Fisher (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA).
Las placas PicoTiterPlateTM (25 x 75 x 2 mm) se fabricaron mediante grabado anisotrópico de placas frontales de fibra óptica de un modo similar al descrito previamente (Pantano, P. y Walt, D.R., Chemistry of Materials 1996, 8, 2832-2835). Las placas fueron grabadas en tres profundidades de micropocillo diferentes, 26, 50 y 76 μm. La distancia de centro-a-centro de micropocillos fue de 50 μm, y los diámetros de pocillo oscilaron entre 39 y 44 μm (véase la Figura 14), con una densidad de pocillo calculada de 480 pocillos/mm2.
Inmovilización en fase sólida de cebadores de oligonucleótidos: de extrajeron las partículas empaquetadas de 1 mL de columna de afinidad HP de Sepharose activadas con NHS (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) y se activaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Protocolo Nº 71700600AP de Amersham Pharmacia). Veinticinco microlitros de un cebador de captura de HEG marcado con aminas 1 mM (5’-amino-3 hexaetilenglicol espaciadores ccatctgttgcgtgcgtgtc-3’; SEC ID Nº: 23) (IDT Technologies, Coralville, IA) en tampón fosfato 20 mM pH 8,0 fueron ligados a las partículas. Después de esto, se seleccionaron las partículas de 36 a 25 μm mediante pasaje en serie a través de secciones de malla de filtro de poros de 36 y 25 μm (Sefar America, Depew, NY). Las partículas de captura de ADN que pasaron a través del primer filtro, pero que fueron retenidas por el segundo, fueron recogidas en un tampón de almacenamiento de partículas (Tris 50 mM, Tween al 0,02%, azide sódico al 0,02%, pH 8), se cuantificaron con un hematocitómetro (Hausser Scientific, Horsham, PA) y se almacenaron a 4ºC hasta que se necesitaron.
Generación de fragmentos de ADN de ensayo: la amplificación de fragmentos de ensayo se derivo del vector de adenovirus de serotipo 5 disponible comercialmente, pAdEasy (Stratagene, La Jolla, CA). Los fragmentos fueron amplificados usando cebadores de PCR bipartitos, cuyo extremo 5’ contenía una región de amplificación de 20 bases y una sección 3’ de 20 bases, complementarios a la región específica del genoma de adenovirus. Usando estos cebadores, se amplificaron dos fragmentos a partir de la posición 12933-13070 y 5659-5767 del genoma de adenovirus y se les asignaron las etiquetas Fragmento A y Fragmento B, respectivamente.
Las secuencias de los cebadores directo e inverso para el Fragmento A son como se indica a continuación. Una barra (/) denota la separación entre dos regiones del cebador: directo (5’-cgtttcccctgtgtgccttg / catcttgtccactaggctct3’; SEC ID Nº: 24 – SEC ID Nº: 25), e inverso (5’-ccatctgttgcgtgcgtgtc / accagcactcgcaccacc-3’; SEC ID Nº: 26 – SEC ID Nº: 27). Los cebadores del Fragmento B incluían: directo (5’-cgtttcccctgtgtgccttg / tacctctccgcgtaggcg-3’; SEC ID Nº: 28 – SEC ID Nº: 29), e inverso (5’-ccatctgttgcgtgcgtgtc / ccccggacgagacgcag-3’; SEC ID Nº: 30 – SEC ID Nº: 31).
Las condiciones de reacción incluían KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 9,0), Triton X-100 al 0,1%, MgCl2 2,5 mM, dNTP 0,2 mM, 1 μM de cada cebador directo e inverso, 0,1 U/μL de Taq (Promega, Madison, WI) y 50 nmol de ADN plantilla. Ambas plantillas fueron amplificadas con un programa de PCR que incluía 35 ciclos de incubación a 94ºC durante 30 segundos, 56ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 90 segundos. Con los cebadores de PCR, la longitud total de los fragmentos amplificados fue de 178 pb para el Fragmento A y de 148 pb para el Fragmento B.
Para generar sondas fluorescentes, se prepararon sondas fluorescentes de cadena doble biotiniladas mediante amplificación de PCR a partir del vector pAdEasy tal como se ha descrito antes. Sin embargo, las secuencias de cebador fueron cambiadas para prevenir la hibridación entre el fragmento de ensayo y las regiones de cebador sonda. Adicionalmente, los cebadores inversos de ambos fragmentos utilizaron una 5’biotina seguida de espaciadores de 3X hexaetilenglicol para permitir la inmovilización de producto sobre las partículas antes de la elución de la sonda de cadena sencilla.
La secuencia del cebador directo para la sonda de Fragmento A fluorescente fue como se indica a continuación. Una barra (/) denota la separación entre las dos regiones del cebador (5’-atctctgcctactaaccatgaag / catcttgtccactaggctct3’; SEC ID Nº: 32 – SEC ID Nº: 33). La secuencia del cebador inverso fue 5’-biotina-3X hexaetilenglicol espaciadores –gtttctctccagcctctcaccga / accagcactcgcaccacc-3’; SEC ID Nº: 34 – SEC ID Nº: 35. Los cebadores del Fragmento B fueron como se indica a continuación: directo (5’-atctctgcctactaaccatgaag / tacctctccgcgtaggcg-3’; SEC ID Nº: 36 – SEC ID Nº: 37), e inverso (5’-biotina-3X hexaetilenglicol espaciadores – gtttctctccagcctctcaccga / ccccggacgagacgcag-3’; SEC ID Nº: 38 – SEC ID Nº: 39).
Los restos fluorescentes fueron incorporados a través de la mezcla de nucleótidos. Ésta incluía dATP/dGTP/dCTP 0,2 mM, TTP 0,15 mM y Alexa Fluor 488 - dUTP 0,05 mM (Molecular Probes, Eugene, OR) para el Fragmento A. Alternativamente, para amplificar el Fragmento B se usó dATP/dGTP/TTP 0,2 mM, dCTP 0,15 mM y Alexa Fluor 647
-
dCTP 0,05 mM (Molecular Probes, Eugene, OR). Los productos fluorescentes fueron purificados con un kit de purificación de PCR QIAquick (Qiagen, Valencia, CA). El ADN biotinilado fue ligado posteriormente a 100 μL (aproximadamente 8,1 millones) de partículas de ata resolución de Sepharose estreptavidina (Amersham Biosciences) en lavado de unión 1X (Tris·HCl 5 mM, pH 7,5, NaCl 1 M, EDTA 0,5 mM, Tween-20 al 0,05%) durante 2 horas a temperatura ambiente. Tras la incubación, las partículas fueron lavadas tres veces en tampón TE (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0) y se incubaron con 250 μL de disolución de fusión (NaOH 0,125 N/NaCl 0,1 M) durante 2 minutos, liberando la sonda de cadena sencilla de las partículas.
Las partículas fueron peletizadas con una breve centrifugación en una centrífuga de sobremesa y el sobrenadante se neutralizó en 1,25 mL de tampón PB (Qiagen) con 1,9 μL de ácido acético glacial. Esta mezcla se volvió a purificar en una columna QiaQuick (Qiagen), y se determinó la concentración de la sonda purificada mediante cuantificación TaqMan usando el BioRad iCycler (BioRad, Hercules, CA).
Se llevó a cabo la PT-PCR en fase disolución como se indica a continuación. La mezcla de reacción PCR se cargó en pocillos individuales de una placa PicoTiterPlateTM individual de 14 mm x 13 mm. Para ello, en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL se combinaron 500 μL de mezcla de reacción PCR (tampón 1X Platinum HiFi (Invitrogen, Carlsbad, CA), MgSO4 2,5 mM, BSA al 0,5%, dNTPs 1 mM (MBI Fermentas, Hanover, MD), cebador directo 1 μM (5’-cgtttcccctgtgtgccttg-3’; SEC ID Nº: 40) e inverso 1 μM (5’-ccatctgttgcgtgcgtgtc-3’; SEC ID Nº: 41), Tween-80 al 0,05%, 1 U/μL de pirofosfatasa termoestable (USB, Cleveland, OH), y un cálculo de 5 copias de plantilla de Fragmento B por pocillo). El tubo se sometió a vórtice intensamente y se almacenó en hielo hasta que se ensambló el cartucho de carga de la placa PicoTiterPlateTM.
El cartucho de carga de placa PicoTiterPlateTM interno fue unido a la placa PicoTiterPlateTM con dos ganchos de plástico, asentando la cesta del cartucho de silicona firmemente sobre la superficie de la placa PicoTiterPlateTM (véase la Figura 20). La mezcla de reacción PCR se extrajo en una jeringa desechable de 1 mL, y la punta de la jeringa se insertó en el tubo de entrada del cartucho de carga. El cartucho de carga se colocó en el extremo, de tal modo que el puerto de entrada quedó orientado hacia al fondo del cartucho, y la mezcla de PCR se cargó lentamente en la cámara. Mientras se cargaba, se inspeccionó a través de la parte posterior transparente de la placa PicoTiterPlateTM para asegurar una administración uniforme, libre de burbujas.
Tras cargar, se dejó que la mezcla PCR se incubara durante 5 minutos, tiempo en el cual la mezcla de reacción fue retirada del cartucho de carga de la placa PicoTiterPlateTM. La placa PicoTiterPlateTM fue retirada del cartucho de carga y se colocó inmediatamente en la cámara de amplificación (véase la Figura 21). La superficie de la placa PicoTiterPlateTM se cubrió con una lámina de silicio Silpad A-2000 de 0,25 mm de espesor (The Bergquist Company, Chanhassen, MN). Encima de todo ello se colocó un cubreobjetos de microscopio de vidrio estándar de 25 mm x 75 mm (Fisher). En la parte superior del cubreobjetos de microscopios se colocó una almohadilla de espuma de aislamiento de célula cerrada (Wicks Aircraft Supply, Highland, IL). Se unió una tapa de aluminio a la base de la cámara mediante seis tornillos de 25 mm sellando la cámara de amplificación.
Una vez sellada, la cámara de amplificación se colocó en un Termociclador MJ PTC 225 Tetrad (MJ Research, Waltham, MA) equipado con Flat Block Alpha Units. El programa de amplificación incluía la incubación durante 3 minutos a 94ºC (inicio Hotstart) seguido de 40 ciclos de incubación durante 12 segundos a 94ºC, 12 segundos a 58ºC, 12 segundos a 68ºC, manteniendo constante la temperatura a 10ºC al final. Tras completar el programa de PCR, la placa PicoTiterPlateTM se retiró de la cámara de amplificación y se volvió a unir el cartucho de carga. Se usó una jeringa desechable para rellenar la cámara del cartucho con 1 mL de H2O, y se dejó incubar durante 20 minutos a temperatura ambiente.
Una vez completada la incubación, se retiró la disolución de recuperación del cartucho de carga y se transfirió a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. El producto de PCR fue cuantificado usando una unidad de PCR iCycler RealTime (BioRad) y sondas indicadoras con etiquetas FAM (Epoch Biosciences, Bothell, WA). Se combinó la TaqMan Universal PCR MasterMix (Applied Biosystems, Foster City, CA) con cebadores directo e inverso 0,3 μM, sonda etiquetada con FAM 0,15 μM, y 27 μL de la mezcla de reacción añadidos a cada pocillo de una placa de PCR de 96 pocillos.
Se usaron los fragmentos purificados para crear una curva patrón (con seis patrones que oscilan entre 1 x 109 y 1 x 104 moléculas por pocillo), que se analizó por triplicado. La amplificación de PCR se ejecutó con los siguientes parámetros: incubación durante 5 minutos a 94ºC (inicio hotstart), 60 ciclos de incubación durante 15 segundos a 94ºC, 45 segundos a 68ºC, manteniendo la temperatura finalmente a 4ºC. Los datos fueron analizados con el software iCycler Optical Systems versión 2.3 (BioRad), y el rendimiento de la PCR se cuantificó usando los datos del iCycler y Microsoft Excel (Microsoft, Redmond, WA).
Se llevó a cabo una PTPCR en estado sólido de manera similar a la PTPCR en fase disolución, excepto en que las partículas de captura de ADN fueron cargadas en los pocillos de la placa PicoTiterPlateTM antes de la amplificación mediante centrifugación, como se describe a continuación. Además, la mezcla de PCR se cargó en los micropocillos después de que la deposición se hubiera completado. Para facilitar la retención de las partículas de captura durante las etapas de lavado, los experimentos en fase sólida utilizaron placas PicoTiterPlateTM con una profundidad de 50 μm. La placa PicoTiterPlateTM se colocó en una rejilla de carga de partículas de plexiglass de fabricación doméstica. Ésta era similar a la rejilla de carga de placas PicoTiterPlateTM descrita en la Figura 20, excepto en que la placa PicoTiterPlateTM queda como capa intermedia entre una placa inferior de Plexiglass y un placa superior de la rejilla, que contiene los puertos de entrada y salida, y se selló mediante una cesta de silicio con tornillos de plástico.
El ADN plantilla se premaduró con las partículas de captura de ADN con una concentración de 5 copias de plantilla por partícula mediante incubación a 80ºC durante 3 minutos, tras lo cual se dejó que las partículas se enfriaran hasta temperatura ambiente durante 15 minutos. A continuación las partículas fueron giradas en los pocillos de la placa PicoTiterPlateTM antes de cargar la mezcla de reacción de PCR. El tampón de carga de partículas (450 μL; tampón 1X Platinum HiFi PCR (Invitrogen), Tween-80 al 0,02%) que contenía cien mil partículas de captura de ADN de Sepharose (aproximadamente 1 partícula por cada 3 pocillos de placa PicoTiterPlateTM) fue inyectado mediante pipeta en la rejilla a través de uno de los puertos de entrada. A continuación se selló cada agujero de entrada con una almohadilla adhesiva circular (3M VHS, St. Paul, MN). La rejilla sujetó la placa PicoTiterPlateTM con sus pocillosorientados hacia arriba y cubiertos con la suspensión de partículas. Ésta se centrifugó a 2000 rpm durante 5 minutos a temperatura ambiente en una centrífuga Allegra 6 (Beckman Coulter, Fullerton, CA) usando un Rotor Microtiter.
Tras la centrifugación, la placa PicoTiterPlateTM se retiró de la rejilla. La mezcla de reacción de PCR se cargó en la placa PicoTiterPlateTM como se ha descrito para la PCR en fase disolución. Sin embargo, la mezcla de PCR en fase sólida omitió la plantilla ya que la plantilla fue premadurada a las partículas de captura de ADN. El programa de amplificación de PCR en fase sólida incluía ciclos adicionales de hibridación/extensión para compensar la cinética más lenta del cebador inmovilizado. El programa incluyó la incubación durante 3 minutos a 94ºC para el inicio hotstart, 40 ciclos de incubación durante 12 segundos a 94ºC, 12 segundos a 58ºC, 12 segundos a 68ºC, seguido de 10 ciclos de incubación durante 12 segundos a 94ºC, 10 minutos a 68ºC durante la hibridación y la extensión, manteniendo finalmente la temperatura a 10ºC.
Tras completar el programa de PCR, la placa PicoTiterPlateTM fue retirada de la cámara de amplificación, y se lavó con 1 mL de H2O como se ha descrito para la PCR en fase disolución. A continuación la placa PicoTiterPlateTM se preparó para la detección de hibridación de producto PCR inmovilizado.
La hibridación se llevó a cabo con sondas marcadas fluorescentemente como se indica a continuación. Una vez que la PTPCR se hubo completado, se extrajo la cadena complementaria a la cadena inmovilizada. Para ello se incubó la placa PicoTiterPlateTM entera en NaOH 0,125 M durante 8 minutos a temperatura ambiente. Esta disolución se neutralizó mediante dos lavados de 5 minutos en 50 mL de Tris-acetato 20 mM, pH 7,5. A continuación la placa PicoTiterPlateTM se colocó en una cámara de hibridación de 800 μL hecha a medida, y se bloqueó con tampón de hibridación (3,5X SSC, 3,0% de SDS, 20X tampón SSC es NaCl 3 M; Na3-citrato 0,3 M) a 65ºC durante 30 minutos. El contenido de la cámara se reemplazó con tampón de hibridación fresco que contenía las sondas: Fragmento A
5 fluorescente 20 nM (Alexa-488) y Fragmento B fluorescente 20 nM (Alexa-647). Se permitió que las sondas se hibridaran con sus dianas. La incubación se llevó a cabo a 65ºC durante 4 horas agitando a 200 rpm en un agitador orbital (Barnstead International, Dubuque, IA).
Tras la hibridación, la placa PicoTiterPlateTM fue lavada con 2X SSC, 0,1% de SDS durante 15 minutos a 37ºC, seguido de un lavado de 15 minutos en 1x SSC a 37ºC, con dos lavados finales de 15 minutos en 0,2x SSC a 37ºC. 10 Después del lavado post-hibridación, las placas PicoTiterPlateTM fueron secadas al aire y colocadas en un Analizador de Imágenes de Fluorescencia FLA-8000 (Fujifilm Medical Systems EE.UU., Stamford, CT) y escaneadas a las longitudes de onda de 635 y 473 nm. Las imágenes tiff de 16 bits resultantes fueron importadas con el software Genepix 4.0 (Axon Instruments, Union City, CA). En el área de interés se dibujó un bloque de 100 características de análisis y se registraron las intensidades de fluorescencia a 635 y 473 nm para cada característica. A continuación
15 los datos fueron exportados a Microsoft Excel para su análisis.
Las partículas de control se prepararon como se indica a continuación. Las plantillas A y B biotiniladas de ensayo se prepararon mediante amplificación PCR a partir del vector pAdEasy, se purificaron, se inmovilizaron sobre partículas de alta resolución de Sepharose estreptavidina y se separó la cadena como se ha descrito en el apartado de “Preparación de sondas fluorescentes”. Sin embargo, se omitieron los dNTPs marcados fluorescentemente en la
20 reacción de PCR. Las partículas peletizadas fueron lavadas 3 veces con tampón TE y se almacenaron a 4ºC en TE hasta deposición en la placa PicoTiterPlateTM.
Resultados
La amplificación en fase disolución se demostró cargando placas PicoTiterPlateTM con la mezcla maestra de PCR que contenía 5 copias calculadas de plantilla por pocillo de PicoTiterPlateTM. Las reacciones se llevaron a cabo por
25 duplicado en placas PicoTiterPlateTM con pocillos de 26, 50 y 76 μm de profundidad. Se aplicaron cuarenta ciclos de amplificación PTPCR como se ha descrito en el apartado de “Material y Métodos”. Se incorporaron aditivos para prevenir los efectos superficiales negativos que rutinariamente se presentan en recipientes de reacción de sílice (Kalinina, O., y col., Nucleic Acids Res. 1997, 25, 1999-2004; Wittwer, C.T. y Garling, D.J., Biotechniques 1991, 10, 76-83; Taylor, T.B. y col., Nucleic Acids Res. 1997, 25, 3164-3168).
30 La inclusión de BSA al 0,5% y de Tween-80 al 0,05% en la mezcla de reacción no solo fue efectiva para reducir los efectos superficiales, sino que también facilitó la amplificación. Reducir las concentraciones relativas de cualquier reactivo tuvo un efecto negativo sobre la amplificación. Adicionalmente, debido a las propiedades desactivantes de la polimerasa de las superficies de sílice (Taylor, T.B. y col., Nucleic Acids Res. 1997, 25, 3164-3168; Shoffner, M.A., Cheng, J., Hvichia, G.E., Kricka, L.J. y Wilding, P., Nucleic Acids Res. 1996, 24, 375-379), las concentraciones de
35 Taq elevadas demostraron ser beneficiosas. Concentraciones por encima de 1 U/μL fueron óptimas para potenciar el rendimiento de amplicón.
Después de la PTPCR, se recuperó la disolución procedente de cada placa PicoTiterPlateTM y se cuantificó las muestras de cada disolución por triplicado mediante un ensayo TaqMan. Se usó una curva de calibrado de plantilla diluida (lineal entre 1 x 109 y 104 moléculas, r2 = 0,995) para determinar la concentración del producto amplificado. El
40 número de moléculas amplificadas por pocillo se obtuvo dividiendo la cantidad de producto amplificado por el número total de pocillos en la placa PicoTiterPlateTM (372.380). La cantidad de amplificación por pocillo se calculó dividiendo este número por la concentración de plantilla inicial por pocillo. La amplificación PTPCR fue exitosa en todas las placas PicoTiterPlateTM, con rendimientos que oscilan entre 2,36 x 106 veces en los pocillos de 39,5 pL y 1,28 x 109 veces en los pocillos de 50 pL (véase la Tabla a continuación).
Profundidad de la placa PicoTiterPlateTM [μm]
Volumen de pocillo [pL] Promedio de la tasa de amplificación N=6 SD de la tasa de amplificación Concentración final de producto [M]
26
39,5 2,36E+06 1,02E+06 4,97E-07
50
76,0 1,28E+09 1,03E+09 1,40E-04
76
115,6 9,10E+08 4,95E+08 6,54E-05
45 La tabla muestra la amplificación de PCR de placa PicoTiterPlateTM determinada mediante el Ensayo TaqMan. Los valores reflejan medidas por triplicado tomadas de placas PicoTiterPlateTM duplicadas. (N=6); SD = desviación estándar.
El rendimiento se ve afectado por el volumen de pocillo. La concentración del producto final obtenido para los pocillos de profundidad 50 μm (1,4 x 10-4 M) fue significativamente mayor (valor p para ANOVA = 0,023) que la 50 obtenida en los pocillos de profundidad 76 μm (6,54 x 10-5 M), ambas fueron dos órdenes de magnitud superiores al rendimiento logrado en los pocillos de profundidad 26 μm (4,96 x 10-7 M). El rendimiento del micropocillo de profundidad 50 μm representó el balance óptimo de costes y beneficios asociados a la PCR de bajo volumen. En
La concentración final de producto PTPCR obtenida en cada una de las diferentes profundidades de pocillo (4,96 x 10-7 a 1,4 x 10-4 M) excedió la concentración de 10-8 M presentada típicamente como el máximo obtenible antes de que se produzca el efecto de meseta de PCR (Sardelli, A., Amplifications 1993, 9,1-5). La mayor concentración efectiva de moléculas de cebador y plantilla que resulta de un bajo volumen de micropocillo aumentó la eficacia global de la reacción y pospuso el inicio de la fase meseta hasta que se alcanzó un mayor rendimiento molar. Alternativamente, este efecto fue provocado por la elevada concentración de Taq usada en las reacciones de PTPCR, ya que una elevada concentración de polimerasa también se ha mostrado efectiva en el retraso del efecto meseta (Kainz, P., Biochim. Biophys. Acta 2000, 1494, 23-27; Collins, F.S. y col., Science 2003, 300, 286-290). La eficacia de amplificación a lo largo de 40 ciclos fue de 44,3, 68,9 y 67,5% para los pocillos de 26, 50 y 76 μm respectivamente, proporcionando una elevada concentración final de amplicones. El mayor rendimiento se observó en los pocillos de 50 μm de profundidad. Debería reconocerse, sin embargo, que no se ha realizado una optimización del número de ciclos; probablemente se podrían haber obtenido rendimientos de amplificación similares con muchos menos ciclos, incrementando de este modo la eficacia de la amplificación de PCTPCR.
La estrategia experimental para PTPCR clonal en fase sólida, comenzando con una copia efectiva de un fragmento de ADN de cadena sencilla, y acabando con un amplicón de ADN inmovilizado sobre partícula detectado mediante hibridación de sonda fluorescente, se muestra en la Figura 22ón de sonda fluorescente, se muestra en la Figura 22 y se describe en detalle a continuación:
Etapa 1: cada pocillo de placa PicoTiterPlateTM contiene una mezcla de reacción de PCR que consiste en una única molécula de plantilla (de cadena sencilla y madurada a las partículas de captura de ADN, tal como se muestra en la presente memoria, o flotando libre en disolución), los cebadores directo “F” (en rojo) e inverso “R” (en azul) en disolución, así como los cebadores R unidos a una partícula de captura de ADN. Los cebadores en fase disolución están presentes en una relación molar de 8:1, con el cebador F en exceso. Las flechas indican la orientación de ADN 5’ -> 3’.
Etapa 2: el ciclo térmico inicial desnaturaliza la plantilla de ADN, permitiendo que los cebadores R en disolución se unan a la región complementaria de la molécula plantilla. Las polimerasas termoestables inician el alargamiento en el sitio del cebador (línea discontinua), y en los ciclos posteriores se produce la amplificación exponencial en fase disolución. No se asume que los cebadores inmovilizados sobre partícula sean los principales contribuidores a la amplificación en esta etapa.
Etapa 3: PCR de fase temprana. Durante la amplificación exponencial temprana (de 1 a 10 ciclos), ambos cebadores F y R amplifican la plantilla igualmente, a pesar del exceso de cebadores F en disolución.
Etapa 4: PCR de fase media. Entre los ciclos 10 y 30, los cebadores R se agotan, deteniendo la amplificación exponencial. Entonces la reacción entra en una fase de amplificación asimétrica, y la población de amplicón se ve crecientemente dominada por cadenas F.
Etapa 5: PCR de fase tardía. Tras 30-40 ciclos, la amplificación asimétrica continúa aumentando la concentración de cadenas F en disolución. El exceso de cadenas F, sin complementos de cadena R, comienza a madurar los cebadores R inmovilizados a partícula. Las polimerasas termoestables utilizan la cadena F como plantilla para sintetizar una cadena R inmovilizada del amplicón.
Etapa 6: PCR de fase final. Los ciclos térmicos continuados fuerzan una maduración adicional a cebadores ligados a partícula. La amplificación en fase disolución puede ser mínima en esta etapa, pero la concentración de cadenas R inmovilizadas continúa aumentando.
Etapa 7: la cadena F no inmovilizada, complementaria a la cadena R inmovilizada, es eliminada mediante desnaturalización alcalina. Las partículas de captura de ADN están pobladas ahora por cadenas R de cadena sencilla del amplicón.
Etapa 8: se maduran sondas marcadas fluorescentemente (barras verdes) complementarias a la cadena R con la cadena inmovilizada. Las sondas específicas de secuencias de cadena particular son etiquetadas con fluoróforos únicos, dando como resultado un rango de señales fluorescentes homogéneas y heterogéneas que dependen del número de plantillas discretas amplificadas dentro de un pocillo de placa PicoTiterPlateTM.
Inicialmente, la especificidad de la sonda marcada fluorescentemente fue confirmada uniendo el Fragmento A biotinilado o fragmentos de ADN de ensayo del Fragmento B con partículas de Sepharose estreptavidina, cargando las partículas en una placa de PicoTiterPlateTM de 50 μm de profundidad mediante centrifugación e hibridando una población mixta de sondas marcadas fluorescentemente para los fragmentos Fragmento A y Fragmento B. No se observaron señales mixtas ni hibridaciones no específicas; las partículas con el producto de Fragmento A mostraron la señal a 488 nm, mientras que las partículas de Fragmento B exhibieron la señal de 635 nm (véanse las Figuras 23A y 23B). Un examen detenido de las Figuras 23A y 23B revela unas pocas partículas de Fragmento A en la Tal como se indica en la Figura 23C, las sondas fluorescentes detectaron una amplificación PTPCR en fase sólida exitosa de ambas plantillas de Fragmento A y Fragmento B. Las señales generadas por la sonda hibridada dependieron de la eficacia relativa de la incorporación de colorante dentro de las sondas, de la sensibilidad de las reacciones a cantidades desiguales de ADN plantilla, así como a las cantidades total y relativa de producto amplificado presente en cada plantilla. Además, es probable que la cantidad de plantilla generada y retenida sobre las partículas de captura de ADN varíe de pocillo a pocillo, y el número de cebadores de captura ligados a cada partícula también es probable que varíe debido a la distribución de tamaños de partícula. Como resultado, las relaciones no normalizadas generadas por la hibridación de sonda deberían verse como semi-cualitativas más que como datos cuantitativos. No obstante, las señales fluorescentes generadas por las sondas hibridadas oscilaron entre una señal de Fragmento B homogénea (rojo) y una señal de Fragmento A igualmente homogénea (verde), con evidencias también de mezclas heterogéneas de las dos señales (grados de amarillo).
Debido a la especificidad de sonda mostrada por los controles, así como al número cuantificable de partículas homogéneas rojas y verdes sobre la placa PicoTiterPlateTM, es improbable que la hibridación de sonda no específica provocara las señales heterogéneas. La estrecha proximidad de las partículas homogéneas de cualquier plantilla sugiere que es improbable que las partículas heterogéneas fueran el resultado de una fuga de amplicón entre los pocillos durante la amplificación; si fueran responsables las réplicas intrapocillo, sería de esperar que se vieran partículas heterólogas localizadas entre las partículas homogéneas de cada plantilla, y una distribución generalmente desigual de las señales homogéneas. Más bien, es probable que las moléculas de plantilla se disociaran de su partícula original y se remaduraran a nuevas partículas en la mezcla de carga de la placa PicoTiterPlateTM antes de ser girada en los micropocillos, o que fueran lavadas de una partícula a otra cuando la mezcla de PCR se aplica a la placa PicoTiterPlateTM. Independientemente de la causa de las partículas de plantilla mezcladas, los resultados de hibridación demuestran que la amplificación de PCR en los micropocillos de la placa PicoTiterPlateTM puede generar suficiente producto para las partículas de captura de ADN para permitir la hibridación de sonda fluorescente y la detección
Discusión
Los resultados de este ejemplo demuestran que la PCR basada en placa PicoTiterPlateTM alivia muchos factores asociados al proceso de amplificación de ADN, tal como los elevados costes de reactivos, el gran número de reacciones, y los largos tiempos de reacción, proporcionando otro “salto evolutivo” en la tecnología de PCR. Los micropocillos de una única placa PicoTiterPlateTM pueden actuar como hasta 370.000 recipientes de reacción discretos alcanzando un elevado rendimiento (de 2,3 x 106 hasta 1,2 x 109 veces superior) de amplificación incluso con volúmenes de reacción de tan solo 39,5 picolitros. Como resultado, la productividad aumenta, y el coste total de reactivos para la PTPCR se reduce; el volumen de reacción contenido en una placa PicoTiterPlateTM completa de 26
o de 76 μm de profundidad es de 15,3 y de 43 μL, respectivamente. Un aumento del tamaño de la placa PicoTiterPlateTM puede aumentar aún más la productividad máxima. Por ejemplo, aumentar las dimensiones de la placa PicoTiterPlateTM hasta 40 mm x 75 mm proporciona aproximadamente 1,4 x 106 recipientes de reacción discretos, y una placa PicoTiterPlateTM que posee las mismas dimensiones de perímetro que una placa de PCR de 96 pocillos disponible comercialmente (85,47 mm x 127,81 mm) podría contener como mucho 5,24 x 106 pocillos.
Las amplificaciones de PCR en fase disolución, independientemente del número y del volumen en el que se lleven a cabo, tienen una utilidad limitada a menos que el producto se pueda recuperar fácil y eficientemente. Los esfuerzos previos en PCR en paralelo (Nagai, H. y col., Anal. Chem. 2001, 73, 1043-1047) requerían la evaporación de la mezcla de reacción líquida, dejando el amplicón seco en las paredes del microrreactor, tras lo cual podría recuperarse para manipulaciones ulteriores. La metodología descrita en la presente memoria evita los problemas de la recuperación de producto incluyendo amplificación en fase sólida, inmovilizando el producto de PCR en una partícula de captura de ADN. Por tanto, el producto de una reacción de micropocillo de placa PicoTiterPlateTM no son
370.000 pocillos que contienen producto de PCR en fase disolución, si no hasta 370.000 partículas ligadas a producto de PCR inmovilizado. Dichos productos de PCR son adecuados para numerosos métodos en fase sólida de interrogación de ácido nucleico, que incluyen la capacidad potencial para soportar una estrategia masivamente paralela de secuenciamiento de genomas completos que contienen hasta cientos de millones de bases. La simplicidad del método descrito reducirá drásticamente los costes de secuenciamiento y de otras aplicaciones que ahora requieren robótica para mantener una clonación y PCR a gran escala. En la especificación y en las reivindicaciones anexas, las formas singulares incluyen referentes plurales a menos que el contexto claramente dicte lo contrario. A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente memoria tienen el mismo significado utilizado comúnmente por los especialistas en la técnica a la cual pertenecen la presente invención y descripción. A menos que se exprese lo contrario, las técnicas empleadas o contempladas en la presente memoria son metodologías estándar bien conocidas por el especialista en la técnica. Los ejemplos de las realizaciones únicamente tienen un fin ilustrativo.
Ejemplo 28: Método de secuenciamiento de plataforma
Este procedimiento se usó para una placa de 384 pocillos de PCR de clones de Adenovirus. Se prepararon partículas de Sepharose-Estreptavidina (12 mL) para la unión de fragmentos de PCR mediante lavado una vez con disolución de NaCl 2 M y resuspendiendo en 288 mL de NaCl 2 M. Las partículas lavadas se transfirieron a quince 5 placas de 96 pocillos a 200 μL de suspensión de partículas/pocillo. Los productos de PCR (25 μL) se transfirieron a una placa de pocillos de profundidad 384 usando un robot Tecan TeMo. Para unir ADN a los soportes sólidos, se añadieron 25 μL de suspensión de partículas (15.000 partículas) a cada pocillo de la placa de pocillos de profundidad 384 usando un robot Tecan TeMo y se mezclaron. La concentración final de NaCl en la reacción de unión fue de 1 M. La reacción de unión se incubó con agitación a temperatura ambiente durante 3 h en un agitador.
10 El contenido de las placas microtiter fue reunido invirtiendo las placas de 384 pocillos en un reservorio y centrifugando a 1000 g en una centrífuga de sobremesa Beckman Allegra. Las partículas reunidas fueron transferidas a un tubo Falcon de 50 mL, se centrifugaron a 1000 g y se eliminó el sobrenadante.
Aproximadamente un millón de partículas (soporte sólido móvil) fueron lavadas una vez con 100 μL de NaCl 2 M seguido de dos lavados con agua destilada (100 μL cada uno). Las partículas de lavado fueron incubadas en 300 μL
15 de reactivo de fusión (NaCl 0,1 M y NaOH 0,125 M) durante 10 minutos en un rotador para eliminar la cadena de ADN no biotinilada. El tubo se centrifugó a máxima velocidad para peletizar las partículas y la disolución de fusión se retiró y se descartó. Las partículas fueron lavadas con 100 μL de disolución de fusión seguido de tres lavados más con tampón de maduración 1X. Tras los lavados, las partículas fueron resuspendidas en 25 μL de tampón de maduración 1X.
20 Se añadió el cebador P2 (500 pmoles) a la mezcla de partículas y se mezcló. La mezcla de partículas, en tubos, se colocó en una incubadora automática (termociclador de PCR en este caso) con los siguientes perfiles de temperatura: incubación a 60ºC durante 5 minutos, disminución a 0,1ºC/segundo hasta 50ºC, incubación a 50ºC durante 5 minutos, disminución a 0,1ºC/segundo hasta 40ºC, incubación a 40ºC durante 5 minutos, disminución a 0,1ºC/segundo hasta 4ºC, incubación a 4ºC para siempre.
25 Tras la maduración, las partículas fueron lavadas con cuidado y se volvieron a suspender en 200 μL de disolución de unión de ADN polimerasa de Bst. A continuación, se procesaron alícuotas de 10 μL (50.000 partículas) de la suspensión para secuenciar en el instrumento descrito a continuación.
Etapa 2: Preparación de partículas de ADN de control
Se clonaron seis secuencias de ADN de control TF 2, 7, 9, 10, 12 y 15 en vector pBluescript II KS + y se usó ADN 30 plásmido como plantilla para PCR con un cebador biotinilado para la inmovilización en fase sólida de los amplicones.
Se añadieron los siguientes reactivos a un tubo de 1,7 mL para crear una mezcla de PCR.
Tampón 10 X HIFI
100 μL
Mezcla dNTP 10 mM
100 μL
MgSO4 50 mM
60 μL
5’-Bio-3HEG-MMP1B
10 μL
MMP1A
10 μL
Polimerasa HIFI Taq
10 μL
Agua de grado biología molecular
690 μL
Se añadieron veinte microlitros de ADN plantilla plásmido y la mezcla se dividió en alícuotas de 50 μL en tubos de PCR de 0,2 mL. Se usó el siguiente programa para el termociclado: incubación a 94ºC durante 4 minutos; 39 ciclos de incubación a 94ºC durante 15 segundos, 58ºC durante 30 segundos, 68ºC durante 90 segundos y 68ºC durante
35 120 segundos; mantener a 10ºC.
El ADN amplificado correspondiente a cada fragmento se purificó usando el kit Qiagen MinElute PCR Clean-Up siguiendo las instrucciones del fabricante. La pureza y el rendimiento de cada uno de los ADN de fragmento de ensayo fueron analizados usando el Bioanalizador Agilent 2100 y el kit de reactivos y chip DNA 500. Los productos de PCR biotinilados fueron inmovilizados en partículas de Sepharose estreptavidina con una concentración de 10
40 millones de copias de ADN/partícula.
Las partículas se lavaron una vez con disolución de NaCl 2 M. Esto se realizó añadiendo 100 μL, sometiendo brevemente a vórtice para resuspender las partículas, centrifugando durante 1 minuto a máxima velocidad para peletizar las partículas y a continuación eliminando el sobrenadante. Entonces se realizó un segundo lavado con NaCl 2 M. A continuación las partículas fueron resuspendidas en 30 μL de NaCl 2 M. El producto de PCR se añadió 45 a las partículas. La mezcla se sometió a vórtice para resuspender las partículas en disolución y a continuación se colocó en una guía, sobre un agitador de placas de titulación, a velocidad 7, durante 1 hora a temperatura ambiente.
La segunda cadena no biotinilada se eliminó mediante incubación con la disolución de fusión alcalina (NaOH 0,1 M / NaCl 0,15 M) durante 10 minutos en un rotador de cabeza a temperatura ambiente. Esto vino seguido de un lavado de las partículas una vez con 100 μL de disolución de fusión y tres veces con 100 μL de tampón de maduración 1X (Tris-acetato 50 mM, pH 7,5; MgCl2 5 mM). El cebador de secuenciamiento se maduró con el ADN de cadena sencilla inmovilizado mediante centrifugación durante un minuto a máxima velocidad. Se extrajo el sobrenadante y las partículas se resuspendieron en 25 μL de tampón de maduración 1X. A continuación, se añadieron 5 μL de cebador de secuenciamiento MMP7A (100 pmol/μL) a la suspensión de partículas y se usó el siguiente perfil de temperaturas para hibridar el cebador de secuenciamiento:
•
Incubación a 60ºC durante 5 minutos;
•
Disminución a 0,1ºC/segundo hasta 50ºC;
•
Incubación a 50ºC durante 5 minutos;
•
Disminución a 0,1ºC/segundo hasta 40ºC;
•
Incubación a 40ºC durante 5 minutos;
•
Disminución a 0,1ºC/segundo hasta 4ºC; y
•
Mantener a 4ºC.
Las partículas se lavaron dos veces con 100 μL de tampón de maduración 1X y a continuación se resuspendieron a un volumen final de 200 μL con tampón de maduración 1X y se almacenaron en alícuotas de 10 μL en tiras de tubos etiquetados en un frigorífico a 4ºC.
Etapa 3: Química de secuenciamiento
Las partículas de Sepharose con plantillas de ADN de cadena sencilla inmovilizadas y cebador de secuenciamiento madurado fueron incubadas con proteína de unión de cadena sencilla de E. coli (Amersham Biosciences) (5 μL de disolución de reserva ssb de 2,5 μg/μL por cada 50.000 partículas) y 500 U (10 μL de 50 U/μL) de ADN polimerasa de Bst (NEB) en 200 μL de disolución de unión de polimerasa (Tricina 25 mM, pH 7,8; acetato de magnesio 5 mM; DTT 1 mM; 0,4 mg/mL de PVP PM 360.000) durante 30 minutos a temperatura ambiente en un rotador. Después de esto, las partículas de ADN se mezclaron con partículas de SL y se depositaron en los pocillos de la placa PicoTiter como se indica a continuación. Los reactivos requeridos para un experimento de secuenciamiento en un instrumento 454 incluían: 1) disolución de lavado de sustrato; 2) disolución de lavado que contiene apirasa; 3) patrón de calibración de pirofosfato inorgánico 100 nM; 4) disoluciones de trifosfato de nucleótido individuales.
Todas las disoluciones fueron preparadas en el tampón de ensayo de sulfurilasa-luciferasa con sustratos de enzima (Tricina 25 mM, pH 7,8; acetato de magnesio 5 mM; 0,4 mg/mL de PVP PM 360.000; Tween 20 al 0,01%; Dluciferina 300 μM; APS 4μM). La disolución de lavado de sustrato era idéntica al tampón de ensayo de luciferasa. La disolución de lavado que contenía apirasa se basaba en el tampón de ensayo de luciferasa, excepto que no se añadieron sustratos enzimáticos (APS y D-luciferina) y este lavado contenía apirasa (Sigma St. Louis, MO; Pyrosequencing AB, Pyrosequencing, Inc. Westborough, MA) con una concentración final de 8,5 U/L.
Se preparó un patrón de pirofosfato (PPi) añadiendo decahidrato tetrabásico de pirofosfato sódico (Sigma, St. Louis, MO) al tampón de ensayo de luciferasa con una concentración final de 100 nM. Los trifosfatos de nucleótido (dCTP, dGTP, TTP; grado de difosfato mínimo) (Amersham Biosciences AB, Uppsala, Suecia) fueron diluidos hasta una concentración final de 6,5 μM en el tampón de ensayo de luciferasa. Se diluyó análogo de trifosfato de desoxiadenosina, 2’-desoxiadenosina-5’-O-(1-tiotrifosfato), Sp-isómero (Sp-dATP-a-S, Biolog Life Science Institute, Bremen, Alemania) hasta una concentración final de 50 μM en el tampón de ensayo de luciferasa.
Etapa 4: Clonación de His6-BCCP-sulfurilasa y His6-BCCP-luciferasa
Se clonó ATP sulfurilasa de Bacillus stearothermophilus (Bst) (E.C. 2.7.7.4) y luciferasa de luciérnaga (Photinus pyralis) (E.C. 1.13.12.7) en el vector pRSET-A digerido con Nhe I-BamHI (Invitrogen). La secuencia codificadora del gen de BCCP (proteína portadora de biotina carboxilo) (Alix, J.H., DNA 8 (10), 779-789 (1989); Muramatsu, S. y Mizuno, T., Nucleic Acids Res. 17 (10), 3982 (1989), Jackowski, S. y Alix, J.H., J. Bacteriol. 172 (7), 3842-3848 (1990); Li, S.J. y Cronan, J.E. Jr., J. Biol. Chem. 267 (2), 855-863 (1992), número de acceso de Genbank M80458) se usó para diseñar cebadores de PCR para amplificar el fragmento correspondiente a los aminoácidos 87-165 de la proteína BCCP. El cebador directo fue 5’-ctagctagcatggaagcgccagcagca-3’; SEC ID Nº: 42 y el cebador inverso fue 5’-ccgggatccctcgatgacgaccagcggc-3’; SEC ID Nº: 43. El cóctel de PCR se preparó como Mezcla 1 y Mezcla 2, de 25 μL cada una. La Mezcla 1 incluía 75 pmoles de cebadores, 100 ng de ADN genómico de E. coli y 5 μmoles de dNTPs. La Mezcla 2 incluía 1 unidad de ADN polimerasa Fidelity Expand (Boehringer Mannheim/Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN, nº de catálogo 1 732 641) y 5 μL de tampón 10 X Fidelity Expand (Boehringer Mannheim/Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN). Para permitir el inicio caliente de PCR, la Mezcla 1 y la Mezcla 2 se calentaron por separado durante 20 segundos a 96ºC antes de juntarse. La reacción reunida se cicló como se indica a continuación: incubación a 96ºC durante 3 minutos, 10 ciclos de incubación a 96ºC durante 30 segundos, 55ºC durante 1 minuto, y 68ºC durante 2 minutos, a continuación 20 ciclos de incubación a 96ºC durante 30 segundos, 60ºC durante 1 minuto, y 68ºC durante 2 minutos, seguido de una etapa de pulido de incubación a 72ºC durante 7 minutos. Tras la PCR, se obtuvo un único fragmento de 250 pb. El fragmento de BCCP se digirió con Nhe I y BamH I y se subclonó en pRSET-A digerido con Nhe I-BamH I.
Etapa 5: Expresión de sulfurilasa y luciferasa.
Los marcos de lectura abierta de la ATP sulfurilasa de Bst y la luciferasa de P. pyralis fueron amplificados mediante PCR con cebadores que contienen sitios de Pst I/Hind III y BamH I/Xho I (la primera enzima estaba en el extremo 5’ y la segunda enzima estaba en el extremo 3’), respectivamente. Esto produjo una fusión N-terminal de 6X His y dominio de BCCP con la ATP sulfurilasa y la luciferasa. Las enzimas se expresaron en E. coli usando medio de cultivo suplementado con biotina para permitir la biotinilación in vivo a través del dominio de BCCP. Las enzimas se purificaron hasta casi homogeneidad usando una combinación de IMAC y cromatografía de columna de exclusión de tamaños. La purificación se realizó mediante electroforesis usando el Bioanalizador Agilent 2100 en los chips Protein 200 Plus.
Etapa 6: Inmovilización en fase sólida de luciferasa y sulfurilasa.
Las enzimas se inmovilizaron sobre micropartículas magnéticas recubiertas de estreptavidina Dynal M-280 (Dynal, Oslo, Noruega) y sobre microesferas Bangs (300 nm) mediante incubación de una mezcla 1:3 de ATP sulfurilasa y luciferasa, respectivamente. La unión se llevó a cabo mezclando 50 μg de ATP sulfurilasa y 150 μg de luciferasa con 1 mg de partículas Dynal M-280 o con 0,6 mg de microesferas Bangs en tampón TAGE (Tris-Acetato 25 mM, pH 7,8, sulfato de amonio 200 mM, 15% v/v de glicerol y 30 % v/v de etilenglicol). La mezcla se incubó durante 1 hora a 4ºC en un rotador. Tras la unión, las partículas se podían almacenar a -20ºC en la disolución de enzimas durante 3 meses. Antes del uso, las partículas se lavaron intensamente en tampón de ensayo de luciferasa que contenía 0,1 mg/mL de albumina de suero bovino (Sigma, St. Louis, MO). La actividad de la enzima inmovilizada se determinó usando un luminómetro (Turner, Sunnyvale, California). Las partículas lavadas fueron almacenadas en hielo hasta su deposición sobre un portaobjetos PTP.
Etapa 7: Placas PicoTiterPlateTM (PTPs)
Las placas PicoTiterPlateTM (25 x 75 x 2 mm) se fabricaron mediante grabado anisotrópico de placas frontales de fibra óptica de un modo similar al descrito en bibliografía. Las placas fueron grabadas con tres profundidades de pocillo diferentes, 26, 50 y 76 μm. La distancia de centro-a-centro entre micropocillos fue de 50 μm, y los diámetros de pocillo oscilaron entre 39 y 44 μm con una densidad de pocillo calculada de 480 pocillos/mm2.
Etapa 8: Carga de PTP
En pocillos individuales de una placa PicoTiterPlateTM usando un método basado en centrifugación se depositaron partículas de Sepharose que portaban plantillas de ADN y mezcla de partículas de 0,3 μm de Dynal M-280 / Bangs con enzimas de sulfurilasa y luciferasa inmovilizadas. El procedimiento empleó una fijación (estructura) de policarbonato doméstica que incluía una placa de fondo (con clavijas de posicionamiento de portaobjetos), un elastómero de sellado de la junta, y una placa superior con dos puertos de carga. El porta de PTP se colocó sobre la placa de fondo con el lado grabado mirando hacia arriba y la placa con la junta de sellado en su sitio se colocó sobre la parte superior del porta de PTP. Todo el montaje se aseguró con cuatro tornillos de plástico a fin de proporcionar un cierra a prueba de agua. La junta de sellado se diseñó para formar una máscara para la deposición de partículas, dando como resultado un área hexagonal (14 x 43 mm) que cubre aproximadamente 270.000 pocillos de PTP.
Las partículas se depositaron en capas ordenadas. La PTP se eliminó de la incubación en tampón de lavado de partículas. La Capa 1, una mezcla de ADN y partículas de enzima, se depositó. Tras centrifugar, el sobrenadante de la Capa 1 se extrajo por aspiración de la PTP y la Capa 2, de partículas de enzima Dynal, se depositó.
Se preparó una suspensión de partículas mezclando 150.000 partículas de Sepharose que porta ADN en 120 μL de la mezcla de unión de ssb/Bst pol (ver antes) con 270 μL de partículas de Dynal-SL y Bangs-SL (ambas a 10 mg/mL) en un volumen total de 500 μL del tampón de ensayo de luciferasa que contienen 0,1 mg/mL de albumina de suero bovino. La suspensión de partículas se sometió a vórtice y se hizo fluir a la estructura de deposición de partículas a través de puertos de pipeteo. Se tuvo cuidado de evitar introducir burbujas de aire. El montaje de estructura/PTP se centrifugó a 2000 rpm durante 8 minutos en una centrífuga Beckman Allegra 6 equipada con un rotor de balanceo de placas de 4 posiciones. Tras la centrifugación, el sobrenadante se extrajo cuidadosamente de la cámara de la estructura usando una pipeta. Se depositó una segunda capa sólo de partículas Dynal-SL. Esta capa incluía 125 μL de Dynal-SL (a 10 mg/mL) y 375 μL de tampón de lavado de partículas en un tubo de 1,5 mL (2,5 mg/mL de partículas Dynal). La mezcla de partículas Dynal se pipeteó en un área activa principal de la PTP y se centrifugó durante 8 minutos a 2000 rpm. La mezcla de la Capa 2 se aspiró y la PTP se volvió a colocar en tampón de lavado de partículas (tampón de ensayo de luciferasa con 0,1 mg/mL de albumina de suero bovino y 8,5 U/L de apirasa) hasta estar lista para cargar en el secuenciador.
Etapa 9: Instrumento de secuenciamiento El instrumento de secuenciamiento doméstico incluía tres montajes principales: un subsistema de fluidos, un cartucho de PTP/cámara de flujo, y un subsistema de imagen. El subsistema de fluidos incluía reservorios para reactivos, líneas de alimentación de reactivos, un colector multi-válvula y una bomba peristáltica. Permitía la administración de reactivos a la cámara de flujo, un reactivo cada vez, con un caudal y una duración preprogramadas. El cartucho de PTP/cámara de flujo se diseñó de tal modo que tras unir una PTP hubiera un espacio de 300 μm entre la parte superior de la PTP (cara grabada) y el techo de la cámara. Incluía los medios para el control de temperatura de los reactivos y la PTP, así como un alojamiento a prueba de luz. El lado pulido de una PTP se expuso a la parte trasera del cartucho de PTP y se colocó directamente en contacto con el sistema de imagen. El sistema de imagen comprendía una cámara CCD con un haz de fibra de imagen 1-1, así como un sistema de enfriamiento criogénico para la cámara, y los elementos electrónicos de control de la cámara. La cámara usaba un cámara Spectral Instruments (Tucson, AZ) serie 600 con un Fairchild Imaging LM485 CCD (16 millones depíxeles, 15 μm de tamaño de píxel). Ésta estaba unidad directamente al haz de fibra de imagen con una distancia de fibra de 6 μm. La cámara se enfrió hasta -70ºC y se operó en un modo de transferencia de imagen. De este modo, la porción central del CCD se usó para obtener imágenes mientras que la porción exterior del CCD se usó para el almacenamiento y lectura de imágenes. La lectura se producía a través de 4 puertos, en cada esquina del CCD. La velocidad de adquisición de datos se fijó en 1 imagen cada 30 segundos. El tiempo de desplazamiento imagentransferencia fue aproximadamente de 0,25 segundos. Todas las imágenes de la cámara se almacenaron en un formato UTIFF 16 en un disco duro de ordenador (IBM eServer xSeries 335, IBM, White Plains, NY).
Etapa 10: Condiciones del experimento de secuenciamiento
La administración cíclica de reactivos de secuenciamiento en pocillos PTP y el lavado de los subproductos de reacción de secuenciamiento de los pocillos se logró mediante una operación pre-programada del sistema de fluidos. El programa se escribió en forma de una secuencia de comandos de Microsoft Excel, especificando el nombre del reactivo (Wash, dATPaS, dCTP, dGTP, dTTP, PPi standard), el caudal y la duración de cada etapa de la secuencia de comandos. El caudal se fijó en 3 mL/min para todos los reactivos y la velocidad lineal dentro de la cámara de flujo fue aproximadamente. Una etapa de lavado inicial (5 minutos) fue seguida de un caudal de PPi standard (2 minutos), seguido de 21 o 42 ciclos de (Wash – C – Wash – A – Wash – G – Wash – T), en donde cada caudal de nucleótido fue de 0,5 minutos y las etapas de lavado (wash) fueron de 2 minutos. Después de todos los ciclos de adiciones de nucleótidos y de lavados, se suministró un segundo caudal de PPi standard (2 minutos), seguido de una etapa de lavado final de 5 minutos. El tiempo total de experimento fue de 4 horas. Los volúmenes de reactivo requeridos para completar esta secuencia de comandos fueron los siguientes: 300 mL de cada disolución de lavado, 50 mL de cada disolución de nucleótido, 20 mL de disolución de PPi standard. Durante el experimento, todos los reactivos se mantuvieron a temperatura ambiente. Debido a que la cámara de flujo y las conducciones de entrada a la cámara de flujo se mantuvieron a 3ºC, todos los reactivos que entraban en la cámara de flujo estaban a 30ºC.
Referencias
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<210> 1 <211> 44 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Secuencia adaptadora sintética
<400> 1 cgtttcccct gtgtgccttg ccatctgttc cctccctgtc atgc
44
<210> 2 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Secuencia adaptadora sintética
<400> 2 gcatgacagg gagggaacag atggcaaggc acacagggga
40
<210> 3 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Secuencia adaptadora sintética
<400> 3 gcatgacacg caacagggga tagggacacg cacgcaacag
40
<210> 4
<211> 44
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Secuencia adaptadora sintética
<400> 4 ccatctgttg cgtgcgtgtc cctatcccct gttgcgtgtc atgc
<210> 5
<211> 64
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético
<400> 5
<210> 6 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador sintético
<400> 6 gacctcacac gatggctgca gctt
24
<210> 7 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador sintético
<400> 7 gacctcacac gatggctgca gctt
24
<210> 8 <211> 64 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador sintético
<400> 8
<210> 9
<211> 34
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético
<400> 9 ctagctcgta catataaatg aagataagat cctg
<210> 10
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador sintético
<400> 10 gacctcacac gagtagcatg gctgcagctt
<210> 11
<211> 64
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético
<400> 11 <220>
<210> 12 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético
<400> 12 gcttacctga ccgacctctg cctatcccct gttgcgtgtc
40
<210> 13 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético
<400> 13 ccattcccca gctcgtcttg ccatctgttc cctccctgtc
40
<210> 14 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador sintético
<400> 14 gcttacctga ccgacctctg
20
<210> 15 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador sintético
<400> 15 ccattcccca gctcgtcttg
20
<210> 16 <211> 44 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador sintético
<400> 16 ccattcccca gctcgtcttg ccatctgttc cctccctgtc tcag 44
<210> 17
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador sintético
<400> 17 ccatctgttc cctccctgtc 20
<210> 18
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador sintético
<400> 18 cctatcccct gttgcgtgtc 20
<210> 19
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador sintético
<400> 19 cgtttcccct gtgtgccttg 20
<210> 20
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador sintético
<400> 20 ccatctgttg cgtgcgtgtc 20
<210> 21
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador sintético
<400> 21 ccatctgttc cctccctgtc 20
<210> 22
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador sintético
<400> 22 cctatcccct gttgcgtgtc
20
<210> 23 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador sintético
<400> 23 ccatctgttg cgtgcgtgtc
20
<210> 24 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador sintético
<400> 24 cgtttcccct gtgtgccttg
20
<210> 25 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador sintético
<400> 25 catcttgtcc actaggctct
20
<210> 26 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador sintético
<400> 26 ccatctgttg cgtgcgtgtc
20
<210> 27 <211> 18 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador sintético
<400> 27 accagcactc gcaccacc
18
<210> 28 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador sintético
<400> 28 cgtttcccct gtgtgccttg
20
<210> 29 <211> 18 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador sintético
<400> 29 tacctctccg cgtaggcg
18
<210> 30 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador sintético
<400> 30 ccatctgttg cgtgcgtgtc
20
<210> 31 <211> 17 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador sintético
<400> 31 ccccggacga gacgcag
17
<210> 32 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador sintético
<400> 32 atctctgcct actaaccatg aag
23
<210> 33 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador sintético
<400> 33 catcttgtcc actaggctct
20
<210> 34 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador sintético
<400> 34 gtttctctcc agcctctcac cga
23
<210> 35 <211> 18 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador sintético
<400> 35 accagcactc gcaccacc
18
<210> 36 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador sintético
<400> 36 atctctgcct actaaccatg aag
23
<210> 37 <211> 18 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador sintético
<400> 37 tacctctccg cgtaggcg
18
<210> 38 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador sintético
<400> 38 gtttctctcc agcctctcac cga
23
<210> 39 <211> 17 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador sintético
<400> 39 ccccggacga gacgcag
17
<210> 40 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador sintético
<400> 40 cgtttcccct gtgtgccttg
20
<210> 41 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador sintético
<400> 41 ccatctgttg cgtgcgtgtc
20
<210> 42 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador sintético
<400> 42 ctagctagca tggaagcgcc agcagca
27
<210> 43 <211> 28 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador sintético
<400> 43 ccgggatccc tcgatgacga ccagcggc
28
<210> 44 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético
<400> 44 atgcacatgg ttgacacagt ggt
23
<210> 45 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético
<400> 45 atgcacatgg ttgacacagt gg
22
<210> 46 <211> 25 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético
<400> 46 atgccaccga cctagtctca aactt
25
<210> 47 <211> 51 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético
<400> 47
tattgttgat gctgtaaaaa gaagctactg gtgtagtatt tttatgaagt t
51
<210> 48 <211> 47 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético
<400> 48 tgctcaaaga attcatttaa aatatgacca tatttcattg tatcttt
47
<210> 49 <211> 48 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético
<400> 49 aagcgaacag tcaagtacca cagtcagttg acttttacac aagcggat
48
<210> 50 <211> 47 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético
<400> 50 tacaggtgtt ggtatgccat ttgcgatttg ttgcgcttgg ttagccg
47
<210> 51 <211> 52 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético
<400> 51 aacatataaa catcccctat ctcaatttcc gcttccatgt aacaaaaaaa gc
52
<210> 52 <211> 39 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético
<400> 52 tagatatcac ttgcgtgtta ctggtaatgc aggcatgag
39
<210> 53 <211> 41 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético
<400> 53 attcaactct ggaaatgctt tcttgatacg cctcgatgat g
41
<210> 54
<211> 40 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético
<400> 54 gatgaggagc tgcaatggca atgggttaaa ggcatcatcg
40
<210> 55 <211> 45 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético
<400> 55 tgtatctcga tttggattag ttgctttttg catcttcatt agacc
45
<210> 56 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético
<400> 56 cattaacatc tgcaccagaa atagcttcta atacgattgc
40
<210> 57 <211> 46 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético
<400> 57 gcgacgacgt ccagctaata acgctgcacc taaggctaat gataat
46
<210> 58 <211> 43 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético
<400> 58 aaaccatgca gatgctaaca aagctcaagc attaccagaa act
43
<210> 59 <211> 44 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético
<400> 59 tgttgctgca tcataattta atactacatc atttaattct ttgg
44
<210> 60 <211> 51 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético
<400> 60 gcagatggtg tgactaacca agttggtcaa aatgccctaa atacaaaaga t
<210> 61
<211> 6
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: 6xHis tag sintético
<400> 61
<210> 62
<211> 64
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético
<400> 62
<210> 63
<211> 32
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Oligonucleótido sintético
<400> 63 gtcctagaat agaagtaaat atacatgctc ga

Claims (4)

  1. REIVINDICACIONES
    1.-Un método para secuenciar ácidos nucleicos que comprende:
    (a)
    fragmentar moléculas de ácido nucleico plantilla grandes para generar una pluralidad de ácidos nucleicos fragmentados;
    (b)
    suministrar una población de los ácidos nucleicos fragmentados de cadena sencilla a un sistema (array) de al menos 10.000 cámaras de reacción sobre una superficie plana, en donde una pluralidad de los pocillos no comprende más de una partícula y un único ácido nucleico fragmentado de cadena sencilla;
    (c)
    amplificar los ácidos nucleicos fragmentados de cadena sencilla en las cámaras de reacción, en donde una pluralidad de copias amplificadas de los ácidos nucleicos fragmentados de cadena sencilla son inmovilizados sobre partículas; y
    (d)
    llevar a cabo una reacción de secuenciamiento simultáneamente en una pluralidad de las cámaras de reacción que comprenden las copias amplificadas inmovilizadas de los ácidos nucleicos fragmentados de cadena sencilla.
  2. 2.-El método de la reivindicación 1 en el que:
    (i)
    las cámaras de reacción tienen un espaciado de centro a centro de entre 20 y 100 μm;
    (ii)
    los ácidos nucleicos fragmentados tienen entre 30 y 500 bases;
    (iii) la etapa de amplificación se lleva a cabo usando reacción en cadena de polimerasa; o
    (iv) la reacción de secuenciamiento es una reacción de secuenciamiento basada en pirofosfato. 3.-El método de la reivindicación 1 en el que la reacción de secuenciamiento comprende las etapas de:
    (i)
    madurar una cantidad efectiva de un cebador de secuenciamiento con las plantillas de ácido nucleico fragmentado de cadena sencilla y extender el cebador de secuencia con una polimerasa y un trifosfato de nucleótido predeterminado para dar lugar a un producto de secuenciamiento y, si el trifosfato de nucleótido predeterminado se incorpora en el extremo 3’ de dicho cebador de secuenciamiento, un subproducto de la reacción de secuenciamiento; y
    (ii)
    identificar el subproducto de la reacción de secuenciamiento, determinando con ello la secuencia del ácido nucleico en una pluralidad de las cámaras de reacción.
  3. 4.-El método de la reivindicación 1, en el que la reacción de secuenciamiento comprende las etapas de:
    (a)
    hibridar dos o más cebadores de secuenciamiento a una o una pluralidad de cadenas sencillas de la molécula de ácido nucleico, en donde todos los cebadores excepto uno son cebadores bloqueados reversiblemente;
    (b)
    incorporar al menos una base en la molécula de ácido nucleico mediante alargamiento de polimerasa a partir de un cebador desbloqueado;
    (c)
    prevenir un alargamiento adicional de dicho cebador desbloqueado;
    (d)
    desbloquear uno de los cebadores bloqueados reversiblemente en un cebador desbloqueado; y
    (e)
    repetir las etapas (b) a (d) hasta que al menos uno de los cebadores bloqueados reversiblemente sea desbloqueado y usado para determinar una secuencia.
  4. 5.-El método de la reivindicación 1, en el que las cámaras de reacción son cavidades formadas mediante grabado de un extremo de un haz de fibra óptica.
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