CN115956128A

CN115956128A - 在下一代测序文库的靶捕获过程中使用毒性引物对非靶文库分子进行靶向消耗

Info

Publication number: CN115956128A
Application number: CN202180046616.0A
Authority: CN
Inventors: R·丹尼鲍姆; B·C·戈德温; D·L·彭克勒; E·斯拉伯特; R·范德尔默威
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG; Kapa Biosystems Inc
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG; Kapa Biosystems Inc
Priority date: 2020-07-08
Filing date: 2021-07-07
Publication date: 2023-04-11
Also published as: WO2022008578A1; JP2023533271A; EP4179113A1

Abstract

本公开涉及通过单向引物延伸进行靶富集的方法、组合物和试剂盒，其中所述方法、组合物和试剂盒利用毒性引物和靶捕获引物两者。

Description

在下一代测序文库的靶捕获过程中使用毒性引物对非靶文库分子进行靶向消耗

背景技术

对于许多核酸富集技术来说，首先提供核酸分子的“鸟枪文库”是有用的，其中由此衍生自样品中的更长的核酸序列被细分为与短读段测序技术兼容的更小的片段(即约50至500个核苷酸)。为了制备鸟枪文库，将高分子量核酸链(通常是cDNA或基因组DNA)剪切成随机片段，通过连接共同的末端序列(即衔接子)进行任选地修饰，并选择大小进行下游处理和分析。例如，选择性捕获鸟枪文库中的一部分核酸可能是有用的。

目前，捕获技术主要有两大类：基于杂交的捕获和基于扩增的捕获。基于杂交的捕获方法的优点是能够恢复原始鸟枪文库片段的全部，而不是仅复制和恢复原始文库片段的一个子集。然而，与基于扩增的方法相比，基于杂交的捕获相关的在靶率通常较低。值得注意的是，由于需要对脱靶捕获产物进行测序，较低的在靶率造成了测序容量的浪费。此外，与基于杂交的捕获方法相关的工作流程相对于基于扩增的方法可能较复杂，周转时间较长。相比之下，基于扩增的方法，诸如锚定多重PCR方法，相对于基于杂交的方法具有工作流程简单、周转时间快、在靶率高等优点，但也存在一些缺点。例如，靶捕获引物序列扩增后并入文库片段造成了测序容量的浪费。此外，文库片段不一定能代表原始鸟枪文库，因为模板必须在靶特异性引物结合位点处截短。

在一些实施例中，鸟枪靶捕获技术涉及生物素化引物的杂交和延伸。在一些实施例中，随后使用链霉亲和素结合的磁性珠粒进行靶富集。在一些实施例中，结合的靶文库片段可以使用非生物素化的靶释放引物从链霉亲和素中释放，或者直接从链霉亲和素珠中扩增(参见，例如，美国专利公开号2020/0032244和2018/0016630，其公开内容通过引用以其全文并入本文)。然而，在一些实施例中，靶捕获引物可以错误引发，从而捕获和富集不需要的文库分子，这些文库分子可能被下游扩增并测序。据信，在以下情况下可能存在问题：(i)不需要的分子的丰度远远超过靶分子的丰度(例如由于cDNA文库通常包括约95％的rRNA和约5％的mRNA衍生分子，在cDNA文库中核糖体RNA(rRNA)衍生分子的丰度较高)；和/或(ii)与野生型转录物相比，某些融合转录物的低丰度使得检测具有挑战性。

在制备和分析下一代测序文库时，消耗不需要的文库分子是一个反复出现的主题。例如，rRNA包括从哺乳动物组织或细胞系样品中提取的总RNA的至少90％。使用大规模平行测序技术的信息转录谱分析需要富集成熟的多聚腺苷酸化转录物或靶向消耗rRNA片段。核糖体消耗是转录组学中的关键步骤，通过去除高丰度的rRNA种类，允许有效地检测功能相关的编码和非编码转录物。据信，核糖体消耗(诸如在cDNA合成之前发生)是耗时和/或昂贵的。

发明内容

期望在鸟枪捕获的杂交和延伸过程中减少错误引发事件。还期望避免使用耗时且成本高昂的rRNA消耗方法。在一些实施例中，本公开提供改进的鸟枪靶捕获方法，其中在任何杂交和延伸步骤过程中，毒性引物都包括在靶捕获引物中。据信，与靶捕获引物相比，包含毒性引物(不包括捕获部分)可以阻止或减少在靶富集过程中经常观察到的错误引发和脱靶效应。进一步据信，目前公开的引入毒性引物与靶捕获引物相结合的方法无需耗时的rRNA去除方法，例如核糖体消耗，同时在捕获和富集步骤过程中仍然促进rRNA消耗。另外，据信，目前公开的方法可能会减少检测所期望靶核酸序列所需的测序深度。

本公开的一个方面是在核酸分子文库中富集至少一种靶核酸分子的方法，该方法包括：将第一靶捕获引物与核酸分子文库中的第一靶核酸分子杂交，其中第一靶捕获引物包括捕获部分；将第一毒性引物与核酸分子文库中的第一非靶核酸分子杂交，其中第一毒性引物不包括任何捕获部分；延伸第一杂交的靶捕获引物和第一杂交的毒性引物，其中第一杂交的靶捕获引物的延伸提供包含第一靶核酸分子和延伸的第一靶捕获引物的第一靶捕获引物延伸复合物；以及在核酸分子文库中相对于核酸分子文库富集第一靶核酸分子。在一些实施例中，将第一靶捕获引物和第一毒性引物作为引物池添加到文库。在一些实施例中，核酸分子文库中的核酸分子中的每一者都包括第一端(包括第一衔接子)和第二端(包括第二衔接子)。在一些实施例中，该方法不包括进行任何核糖体消耗步骤。

在一些实施例中，第一杂交的毒性引物的延伸防止或减轻了第一靶捕获引物与第一非靶核酸分子杂交，即第一杂交的毒性引物的延伸阻止或减轻了错误引发。在其他实施例中，第一杂交的毒性引物的延伸置换了与第一非靶核酸分子杂交的第一靶引物，即第一杂交的毒性引物的延伸置换了错误引发至第一非靶核酸分子的第一靶引物。

在一些实施例中，该方法进一步包括用第一扩增引物和第二扩增引物扩增第一靶核酸分子，其中第一扩增引物包括与第一衔接子互补的3′端，并且其中第二扩增引物包括与第二衔接子互补的3′端。在一些实施例中，该方法进一步包括对扩增的靶核酸分子进行测序。

在一些实施例中，相对于核酸分子文库的第一靶核酸分子的富集包括(i)第一靶捕获引物延伸复合物的捕获；(i)未被捕获的非靶核酸分子的去除；以及(ii)从捕获的第一靶捕获引物延伸复合物中第一靶核酸分子的释放。在一些实施例中，该第一靶捕获引物延伸复合物的捕获包括将第一靶捕获引物延伸复合物与官能化底物接触。

在一些实施例中，该第一靶捕获引物的捕获部分包括特异性结合实体对中的第一成员，并且其中官能化底物包括特异性结合实体对中的第二个成员。在一些实施例中，该特异性结合实体对中的第一成员选自由生物素、抗原分子、酶底物、受体配体、多糖、巯基化分子和端氨基分子组成的组。在一些实施例中，该特异性结合实体对中的第二成员选自由链霉亲和素、抗体、酶、受体、凝集素、金颗粒和NHS激活部分组成的组。在一些实施例中，该第一靶捕获引物的捕获部分包括生物素。在一些实施例中，该官能化表面包括链霉亲和素。在一些实施例中，该官能化底物包括具有表面被特异性结合实体对中的第二成员官能化的珠粒。在一些实施例中，该官能化底物包括具有包括多个链霉亲和素分子的表面的珠粒。

在一些实施例中，第一靶捕获引物通过捕获部分偶联到底物，然后第一靶捕获引物与核酸分子文库中的第一靶核酸分子杂交。在一些实施例中，第一靶捕获引物与第一靶核酸分子杂交和/或第一杂交的靶捕获引物延伸，从而将第一靶核酸分子捕获到底物。

在一些实施例中，第一靶捕获引物延伸复合物的捕获包括：(i)将通用捕获寡核苷酸与第一靶捕获引物延伸复合物的捕获部分杂交，以形成通用捕获寡核苷酸复合物，其中通用捕获寡核苷酸包括(a)特异性结合实体对中的第一成员，以及(b)与捕获部分的捕获序列的至少一部分互补的核苷酸序列；(ii)将通用捕获复合物与官能化底物接触，其中官能化底物包括特异性结合实体对中的第二成员。

在一些实施例中，未被捕获的核酸分子的去除包括洗去未被捕获的非靶核酸分子。在一些实施例中，捕获的第一靶捕获引物延伸复合物的释放包括：(i)将释放引物与第一靶核酸分子杂交；以及(b)延伸杂交的释放引物。在一些实施例中，杂交的第一靶捕获引物用第一聚合酶延伸；并且其中杂交的释放引物用第二聚合酶延伸。在一些实施例中，第一聚合酶和第二聚合酶不同。在一些实施例中，第一靶捕获引物的解链温度大于第一毒性引物的解链温度。

在一些实施例中，核酸分子文库包括多种靶核酸分子和多种非靶核酸分子，其中与多种非靶核酸分子相比，多种靶核酸分子呈低丰度。在一些实施例中，多种靶核酸分子包含少于10％的核酸分子文库中核酸分子。在一些实施例中，多种靶核酸分子包含少于5％的核酸分子文库中核酸分子。在一些实施例中，多种靶核酸分子包括mRNA衍生的核酸分子。在一些实施例中，多种靶核酸分子包括融合转录物。

本公开的另一方面是试剂盒，其包括：第一靶捕获引物(该第一靶捕获引物与核酸分子文库中的靶核酸分子互补，并且其中第一靶捕获引物包括捕获部分)；以及第一毒性引物(该第一毒性引物与核酸分子文库中的非靶核酸分子互补，并且其中第一毒性引物不包括捕获部分)。在一些实施例中，该第一靶捕获引物具有在约55℃至约65℃之间的范围内的Tm。在一些实施例中，该第一毒性引物具有在约65℃至约68℃之间的范围的Tm。在一些实施例中，该试剂盒包括至少一种聚合酶。在一些实施例中，该试剂盒包括至少两种不同的聚合酶。在一些实施例中，该试剂盒进一步包括多种核苷酸。在一些实施例中，该试剂盒进一步包括一种或多种缓冲溶液和/或洗涤溶液。在一些实施例中，该试剂盒进一步包括具有官能化表面的珠粒。在一些实施例中，该试剂盒进一步包括一种或多种释放引物。在一些实施例中，该试剂盒进一步包含第一扩增引物和第二扩增引物。

本公开的另一方面是组合物，其包含：核酸分子文库，其中核酸分子文库包括多种靶核酸分子和多种非靶核酸分子，其中与多种非靶核酸分子相比，多种靶核酸分子呈低丰度；第一靶捕获引物，第一靶捕获引物与核酸分子文库中的第一靶核酸分子互补，并且其中第一靶捕获引物包括捕获部分；第一毒性引物，第一毒性引物与核酸分子文库中的第一非靶核酸分子互补，并且其中第一毒性引物不包括捕获部分；以及第一聚合酶。在一些实施例中，该组合物进一步包括与第一聚合酶不同的第二聚合酶。在一些实施例中，该组合物进一步包括官能化底物。在一些实施例中，该组合物进一步包括一种或多种衔接子分子。在一些实施例中，该组合物进一步包括一种或多种释放引物。在一些实施例中，该组合物进一步包括第一扩增引物和第二扩增引物。

本公开的另一方面是组合物，其包含：核酸分子文库，其中核酸分子文库包括多种靶核酸分子和多种非靶核酸分子；第一靶捕获引物与核酸分子文库中第一靶核酸分子的部分杂交，并且其中第一靶捕获引物包括捕获部分，该捕获部分与官能化底物结合；第一毒性引物与核酸分子文库中第一非靶核酸分子的部分杂交，并且其中第一毒性引物不包括捕获部分。在一些实施例中，与多种非靶核酸分子相比，多种靶核酸分子呈低丰度。

在一些实施例中，该捕获部分包括特异性结合实体对中的第一成员。在一些实施例中，该官能化底物是具有表面被特异性结合实体对中的第二成员官能化的珠粒。在一些实施例中，该特异性结合实体对中的第一成员选自由生物素、抗原分子、酶底物、受体配体、多糖、巯基化分子和端氨基分子组成的组。在一些实施例中，该特异性结合实体对中的第二成员选自由链霉亲和素、抗体、酶、受体、凝集素、金颗粒和NHS激活部分组成的组。在一些实施例中，该第一靶捕获引物的捕获部分包括生物素。在一些实施例中，该官能化表面包括链霉亲和素。

本公开的另一方面是富含靶核酸分子的组合物，该组合物通过以下制备：(i)将第一靶捕获引物与核酸分子文库中的第一靶核酸分子杂交，其中核酸分子文库包括多种靶核酸分子和多种非靶核酸分子，其中与多种非靶核酸分子相比，多种靶核酸分子呈低丰度，并且其中第一靶捕获引物包括捕获部分；(ii)将第一毒性引物与核酸分子文库中的第一非靶核酸分子杂交，其中第一毒性引物不包括任何捕获部分；(iii)延伸第一杂交的靶捕获引物和第一杂交的毒性引物，其中第一杂交的靶捕获引物的延伸提供包含第一靶核酸分子和延伸的第一靶捕获引物的第一靶捕获引物延伸复合物；以及(iv)在核酸分子文库中相对于核酸分子文库富集第一靶核酸分子。

在一些实施例中，该组合物富含低丰度的融合转录物。在一些实施例中，该组合物富含mRNA衍生的分子。在一些实施例中，该富含靶核酸分子的组合物是在不进行任何核糖体消耗步骤的情况下制备的。

在一些实施例中，将第一靶捕获引物和第一毒性引物作为引物池添加到文库。在一些实施例中，核酸分子文库中的核酸分子中的每一者都包括第一端(包括第一衔接子)和第二端(包括第二衔接子)。

在一些实施例中，第一靶捕获引物延伸复合物的捕获包括：(i)将通用捕获寡核苷酸与第一靶捕获引物延伸复合物的捕获部分杂交，以形成通用捕获寡核苷酸复合物，其中该通用捕获寡核苷酸包括(a)特异性结合实体对中的第一成员，以及(b)与捕获部分的捕获序列的至少一部分互补的核苷酸序列；(ii)将通用捕获复合物与官能化底物接触，其中该官能化底物包括特异性结合实体对中的第二成员。

在一些实施例中，未被捕获的核酸分子的去除包括洗去未被捕获的非靶核酸分子。在一些实施例中，捕获的第一靶捕获引物延伸复合物的释放包括：(i)将释放引物与第一靶核酸分子杂交；以及(b)延伸杂交的释放引物。在一些实施例中，杂交的第一靶捕获引物用第一聚合酶延伸；并且其中杂交的释放引物用第二聚合酶延伸。

附图说明

有关对本公开特征的一般理解，请参考附图。在附图中，整个附图使用相同的附图标记来识别相同的元素。专利或申请文件含有至少一幅彩色附图。在提出请求并支付必要的费用后，专利局将提供带有一幅或多幅彩图的本专利或专利申请公布的拷贝。

图1A提供了使用与靶捕获引物相结合的毒性引物来实现从核酸文库中靶向消耗非靶核酸分子的概述。在一些实施例中，非靶核酸分子为rRNA衍生的cDNA分子。

图1B提供了使用与靶捕获引物相结合的毒性引物通过消耗背景分子文库来实现从下一代测序捕获文库富集靶核酸分子的概述。在一些实施例中，靶核酸分子为融合转录物。

图2A示出了根据本公开的一个实施例在制备的核酸文库中富集靶核酸分子的方法的概述。

图2B示出了根据本公开的一个实施例在制备的核酸文库中富集靶核酸分子的方法。

图2C示出了根据本公开的一个实施例从包含靶核酸分子的至少一部分和延伸的杂交的靶捕获引物的形成的复合物中释放靶核酸分子的方法。

图3A示出了根据本公开的一个实施例的引物延伸靶富集的方法，其中毒性引物的杂交和毒性引物沿非靶核酸分子的延伸阻止或减少了靶捕获引物错误引发至非靶核酸的发生率。

图3B示出了应用通用捕获寡核苷酸捕获靶核酸分子的替代方法。

图4示出了根据本公开的一个实施例的引物延伸靶富集的方法，其中毒性引物的杂交和毒性引物沿非靶核酸分子的延伸从错误引发的靶捕获引物中切割靶捕获部分。

图5示出了图3A中描绘的方法的替代实施例，其中根据本公开的一个实施例，靶捕获引物在与靶核酸分子杂交之前通过捕获部分与底物偶联。

图6示出了图4中描绘的方法的替代实施例，其中根据本公开的一个实施例，靶捕获引物在与靶核酸分子杂交之前通过捕获部分与底物偶联。图6进一步示出了通过捕获部分偶联到底物的靶捕获引物可以错误引发至非靶核酸分子，并且其中偶联到底物的捕获部分可以通过杂交的毒性引物的延伸而被释放。

图7列示了根据本公开的一个实施例的在对靶核酸分子进行扩增和/或测序之前，从靶核酸分子中释放延伸的杂交的靶捕获引物的方法。

图8描绘了实验的结果，其中sgPETE显示了在使用10ng UHR RNA作为文库制备和捕获的输入的测序读段中平均约45％的rRNA读段。当sgPETE捕获反应中包括1μM毒性引物时，rRNA读段的平均数量降低了约25％。在核糖体消耗的样品中，包含毒性引物并没有导致脱靶读段的显著增加。

图9A描绘了二次采样的测序读段分解至350万。毒性引物中包括233万(±17万)融合靶读段，且对照样品中包括105万(±8万)融合读段。

图9B示出了对照样品所需的理论测序深度和读段的分解，以检测相似数量的融合靶读段。

具体实施方式

还应该理解的是，除非指明是相反情况，否则在本文所要求保护的包括一个以上步骤或动作的任何方法中，方法的步骤或动作的顺序不必限于表述该方法的步骤或动作的顺序。

定义

如本文所用，除非上下文另有明确指示，否则单数形式“一(a/an)”和“该/所述”包括复数个指代物。同样，除非上下文另有明确指示，否则词语“或”旨在包括“和”。术语“包括”定义为包容性，如“包括A或B”是指包括A、B或A和B。

如本文在说明书和权利要求书中所用，“或”应理解为与上文定义的“和/或”具有相同的含义。例如，在分隔列表中的项目时，“或”或“和/或”应解释为具有包容性，例如，若干元素或元素列表中的至少一个元素，但也包含一个以上元素，以及任选地包含额外的未列出的项目。只有指明与之相反的术语，如“仅其中之一”或“恰好其中之一”，或者在权利要求中使用的“由…组成”，将指包含若干元素或元素列表中的恰好一个元素。一般来说，本文使用的术语“或者”只有在前面有“或”、“其中之一”、“只有一个”或“恰好一个”等排他性术语时，才应解释为表示排他性的替代选择(例如，“一个或另一个，但不是两个”)。在权利要求书中使用的“基本上由...组成”应具有在专利法领域使用的普通含义。

“包括”、“包含”、“具有”等术语可互换使用，且含义相同。类似地，“包括”、“包含”、“具有”等可互换使用并且具有相同的含义。具体而言，每个术语的定义都与普通美国专利法对“包括”的定义一致，因此每个术语都可理解为一个开放性术语，其含义为“至少以下”，并且也可理释为不排除额外的特征、限制、方面等。因此，例如“具有组件a、b和c的装置”是指所述装置至少包括组件a、b和c。同样，短语：“涉及步骤a、b和c的方法”是指所述方法至少包括步骤a、b和c。此外，尽管本文可以特定的顺序概述步骤和过程，但是本领域技术人员将认识到，所述顺序步骤和过程可能会有所不同。

如本文在说明书和权利要求书中所用，就一个或多个元素的列表而言，短语“至少一个”应理解为选自元素列表中任何一个或多个元素的至少一个元素，但不一定包括元素列表中具体列出的每个元素中的至少一个，也不排除元素列表中的任何元素组合。除了在短语“至少一个”所涉及的元素列表中具体确定的元素之外，该定义还允许其他元素任选地存在，无论这些元素与具体确定的元素相关与否。因此，作为一个非限制性实例，“A和B中的至少一个”(或者等效地，“A或B中的至少一个”，或者等效地，“A和/或B中的至少一个”)在一个实施例中可以指至少一个任选地包括一个以上的A，但没有B(以及任选地包括B以外的元素)；在另一个实施例中，指至少一个任选地包括一个以上的B，但没有A(以及任选地包括A以外的元素)；在又一个实施例中，指至少一个任选地包括一个以上的A，以及至少一个任选地包括一个以上的B(以及任选地包括其他元素)等。

贯穿本说明书的对“一个实施例”、“一种实施例”等的引用，意指结合该实施例描述的特定特征、结构或特性包括在至少一个实施例中。因此，在本说明书中的不同位置出现的短语“在一个实施例中”或“在一种实施例中”不一定都是指同一个实施例。此外，具体特征、结构或特性可在一个或多个实施例中以任何合适的方式组合。

如本文所用，术语“衔接子”是指核苷酸序列，可将其加入另一序列中以赋予该另一序列以另外的性质。衔接子可以是单链的或双链的，或者可具有单链部分和双链部分两者。

如本文所用，“扩增”是指拷贝数增加的过程。扩增可以是随着时间的推移重复发生复制以形成模板的多个拷贝的过程。随着扩增的进行，扩增可以产生指数或线性增加的拷贝数。示例性扩增策略包括聚合酶链反应(PCR)、环介导等温扩增(LAMP)、滚环复制(RCA)、级联RCA、核酸依赖性扩增(NASBA)等。此外，扩增可以应用线性或圆形模板。扩增可以在任何合适的温度条件下进行，诸如热循环或等温。此外，可以在扩增混合物(或试剂混合物)中进行扩增，扩增混合物(或试剂混合物)是能够在混合物中扩增核酸靶(如有)的任何组合物。PCR扩增依赖加热和冷却的重复循环(即热循环)来实现连续多轮的复制。PCR可以通过在两个或多个温度设定点(诸如较高的变性温度和较低的退火/延伸温度)之间或者在三个或多个温度设定点(诸如较高的变性温度、较低的退火温度和中间的延伸温度等)之间的热循环进行。可以使用热稳定聚合酶，诸如Taq DNA聚合酶进行PCR。PCR通常在连续循环中产生产物扩增子的量的指数增长。

如本文所用，术语“互补”通常是指两个核苷酸之间精确配对的能力。术语“互补”是指在适当的温度和离子缓冲条件下，在两个核苷酸的碱基之间形成有利的热力学稳定性和特异性配对的能力。互补性是通过核碱基腺嘌呤、胸腺嘧啶(RNA中的尿嘧啶)、鸟嘌呤和胞嘧啶之间的不同相互作用实现的，其中腺嘌呤与胸腺嘧啶或尿嘧啶配对，鸟嘌呤与胞嘧啶配对。例如，如果核酸的给定位置的核苷酸能够与另一核酸的核苷酸发生氢键结合，则认为这两种核酸在该位置上彼此互补。两个单链核酸分子之间的互补可以是“部分”互补，即仅部分核苷酸结合，或者当单链分子之间存在总体互补时也可以是完全互补。如果第一核苷酸序列与第二核苷酸序列互补，则第一核苷酸序列可以说是第二个序列的“互补序列”。如果第一核苷酸序列与第二序列的反向(即核苷酸的顺序是颠倒的)序列互补，则第一核苷酸序列可以说是第二序列的“反向互补序列”。

如本文所用，术语“互补DNA”或“cDNA”是指从RNA中复制的DNA。在一些实施例中，cDNA是通过逆转录酶(RNA依赖的DNA聚合酶)的作用下在RNA模板上产生的DNA。从mRNA中复制的cDNA不包括基因组DNA所特有的各种非编码序列。

如本文所用，术语“cDNA文库”如本文所用是指在细胞或组织类型中表达的信使RNA的cDNA的集合。

如本文所用，术语“缀合物”是指共价连接至较大构建体的两个或更多个分子(和/或诸如纳米颗粒的材料)。在一些实施例中，缀合物包括共价连接至一个或多个其他分子(诸如一个或多个其他生物分子)的一个或多个生物分子(诸如肽、蛋白质、酶、糖、多糖、脂质、糖蛋白和脂蛋白)。

如本文所用，术语“富集”是指相对于处理之前样品中最初存在的分子的总量来增加样品中分子(例如核酸分子)群的相对丰度的过程。因此，富集步骤提供百分比或分数增加，而不是直接增加例如目标核酸序列的拷贝数作为扩增方法，诸如聚合酶链反应。

如本文所用，术语“流体”是指任何液体或液体组合物，包括水、溶剂、缓冲剂、溶液(例如极性溶剂、非极性溶剂)、洗液或洗涤溶液和/或混合物。流体可以是含水的或非水的。在一些实施例中，洗涤溶液包含表面活性剂以促进洗涤液在载玻片的样本承载表面上的扩散。在一些实施例中，酸溶液包括去离子水、酸(例如乙酸)和溶剂。在一些实施例中，碱性溶液包括去离子水、碱和溶剂。在一些实施例中，转移溶液包括一种或多种二醇醚，例如一种或多种丙烯基二醇醚(例如丙二醇醚、二(丙二醇)醚和三(丙二醇)醚、乙二醇基二醇醚(例如，乙二醇醚、二(乙二醇)醚和三(乙二醇)醚)及其功能类似物。

缓冲剂的非限制性实例包括柠檬酸、磷酸二氢钾、硼酸、二乙基巴比妥酸、哌嗪-N，N′-双(2-乙磺酸)、二甲基次胂酸、2-(N-吗啉代)乙磺酸、三(羟甲基)甲胺(TRIS)、2-(N-吗啉代)乙磺酸(TAPS)、N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸(Bicine)、N-三(羟甲基)甲基甘氨酸(Tricine)、4-2-羟乙基-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)、2-{[三(羟甲基)甲基]氨基}乙磺酸(TES)及其组合。在其他实施例中，缓冲溶液可以由三(羟甲基)甲胺(TRIS)、2-(N-吗啉代)乙磺酸(TAPS)、N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸(Bicine)、N-三(羟甲基)甲基甘氨酸(Tricine)、4-2-羟乙基-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)、2-{[三(羟甲基)甲基]氨基}乙磺酸(TES)或其组合构成。美国专利申请公开号2016/0282374中描述了另外的洗涤溶液、转移溶液、酸溶液和碱性溶液，其公开内容通过引用以其全文并入本文。

如本文所用，术语“杂交”是指不同核酸分子之间与其核苷酸序列一致的碱基配对。

如本文所用，短语“下一代测序(NGS)”是指与传统的基于桑格和毛细管电泳的方法相比具有高通量测序的测序技术，其中测序过程并行执行，例如一次产生数千或数百万个相对小的序列读取。下一代测序技术的一些示例包括但不限于边合成边测序、边连接边测序以及边杂交边测序。这些技术产生较短读取(从约25至约500bp)，但在相对短的时间内产生数十万或数百万次读取。术语“下一代测序”是指目前由Illumina、Life Technologies和Helicos Biosciences采用的所谓的并行边合成边测序或边连接边测序平台。下一代测序方法还可以包括具有电子检测的纳米孔测序方法(Oxford Nanopore和RocheDiagnostics)。

如本文所用，术语“核酸”或“多核苷酸”(本文中可互换使用)是指任何长度的核苷酸的聚合形式，脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或者其类似物。多核苷酸可具有任何三维结构，并且可以执行任何已知或未知的功能。除非特别限定，否则该术语涵盖包括天然核苷酸的已知类似物的核酸或多核苷酸，该天然核苷酸具有与参考核酸相似的结合特性并且以与天然存在的核苷酸相似的方式进行代谢。多核苷酸的非限制性实例包括基因或基因片段的编码区或非编码区、从连锁分析中定义的位点(基因座)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、合成多核苷酸、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离DNA、任何序列的分离RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可包含修饰的核苷酸，诸如甲基化核苷酸和核苷酸类似物。如果存在的话，可以在聚合物组装之前或之后对核苷酸结构进行修饰。核苷酸的序列可以被非核苷酸成分中断。多核苷酸可进一步修饰，诸如通过与标记组分缀合来修饰。除非另外指出，否则特定的核酸序列还隐含地涵盖其保守修饰的变体(例如，简并密码子替换)、等位基因、同源基因序、SNP和互补序列，以及明确指出的序列。具体而言，简并密码子替换可通过产生序列来实现，其中一个或多个所选(或全部)密码子的第三位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基所替换(Batzer等人，Nucleic AcidRes.19：5081(1991)；Ohtsuka等人，J.Biol.Chem.260：2605-2608(1985)；以及Rossolini等人，Mol.Cell.Probes 8：91-98(1994))。

如本文所用，术语“寡核苷酸”是指核苷酸或核苷单体单元的寡聚物，其中该寡聚物任选地包括非核苷酸单体单元和/或在该寡聚物的内部和/或外部位置连接的其他化学基团。寡聚物可以是天然的或合成的，并且可以包括天然存在的寡核苷酸，或包括具有非天然存在(或修饰的)碱基、糖部分、磷酸二酯-类似物键和/或替代性单体单元手性和异构结构的核苷的寡聚物(例如5′-键至2′-键、L-核苷，α-异头物核苷、β-异构体核苷、锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA))。

如本文所用，任何两个不同反应性基团(诸如试剂和颗粒的任何两个反应性基团)之间的“反应”可以表示在两个反应性基团(或两个反应性官能团)之间形成共价键；或可以表示两个反应性基团(或两个反应性官能团)彼此缔合、彼此相互作用、彼此杂交、彼此氢键合等。在一些实施例中，“反应”包括结合事件，例如反应性官能团之间的结合事件或特异性结合实体对中的第一成员和第二成员之间的结合事件。

如本文所用，术语“聚合酶”是指执行模板导向合成多核苷酸的酶。DNA聚合酶仅能在新形成的链的3’端添加游离核苷酸。这导致新形成的链在5’-3’方向上伸长。没有已知的DNA聚合酶能够开始新的链(从头开始)。DNA聚合酶仅能在预先存在的3’-OH基团上添加核苷酸，因此在其可以添加第一核苷酸处需要引物。聚合酶的非限制性实例包括原核生物DNA聚合酶(例如Pol I、Pol II、Pol III、Pol IV和Pol V)、真核生物DNA聚合酶、古细菌DNA聚合酶、端粒酶、逆转录酶和RNA聚合酶。逆转录酶是RNA依赖的DNA聚合酶，其可以从RNA模板合成DNA。逆转录酶家族含有DNA聚合酶功能和RNase H功能，其可将配对的RNA碱基降解为DNA。RNA聚合酶是在基因转录过程中使用DNA作为模板合成RNA的酶。RNA聚合酶在RNA转录物的3’端聚合核糖核苷酸。

在一些实施例中，来自以下的聚合酶可用于聚合酶介导的引物延伸、末端修饰(例如末端转移酶、降解或补平)或扩增反应：古细菌(例如海滨热球菌(Thermococcuslitoralis)(Vent，GenBank：AAA72101)、强烈火球菌(Pyrococcus furiosus)(Pfu，GenBank：D12983，BAA02362)、沃氏火球菌，火球菌属(Pyrococcus woesii，Pyrococcus)GB-D(Deep Vent，GenBank：AAA67131)、鹿儿岛热球菌(Thermococcus kodakaraensis)KODI(KOD，GenBank：BD175553，BAA06142；热球菌属(Thermococcus)菌株KOD(Pfx，GenBank：AAE68738)、高加索热球菌(Thermococcus gorgonarius)(Tgo，Pdb：4699806)、硫矿硫化叶菌(Sulfolobus solataricus)(GenBank：NC002754，P26811)、敏捷气热菌(Aeropyrumpemix)(GenBank：BAA81109)、闪烁古生球菌(Archaeglobus fulgidus)(GenBank：029753)、嗜气热棒菌(Pyrobaculum aerophilum)(GenBank：AAL63952)、隐蔽热网菌(Pyrodictiumoccultum)(GenBank：BAA07579，BAA07580)、热球菌属9度Nm(GenBank：AAA88769，Q56366)、烟生热球菌(Thermococcus fumicolans)(GenBank：CAA93738，P74918)、热水管热球菌(Thermococcus hydrothermalis)(GenBank：CAC18555)、热球菌属GE8(GenBank：CAC12850)、热球菌属JDF-3(GenBank：AX135456、WO0132887)、热球菌属TY(GenBank：CAA73475)、深海火球菌(Pyrococcus abyssi)(GenBank：P77916)、甘氏火球菌(Pyrococcusglycovorans)(GenBank：CAC12849)、堀越氏火球菌(Pyrococcus horikoshii)(GenBank：NP143776)、火球菌属GE23(GenBank：CAA90887)、火球菌属ST700(GenBank：CAC 12847)、太平洋热球菌(Thermococcus pacificus)(GenBank：AX411312.1)、齐氏热球菌(Thermococcuszilligii)(GenBank：DQ3366890)、团聚热球菌(Thermococcus aggtegans)、巴罗西热球菌(Thermococcus barossii)、速生热球菌(Thermococcus celer)(GenBank：DD259850.1)、深水热球菌(Thermococcus profundus)(GenBank：E14137)、西库尔热球菌(Thermococcussiculi)(GenBank：DD259857.1)、硫还原热球菌(Thermococcus thioreducens)、纽氏热球菌(Thermococcus onnurineus)NA1、嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarium)、头寇岱硫化叶菌(Sulfolobus tokodaii)、热泉热棒菌(Pyrobaculum calidifontis)、冰岛热棒菌(Pyrobaculum islandicum)(GenBank：AAF27815)、詹氏产甲烷球菌(Methanococcusjannaschii)(GenBank：Q58295)、脱硫球菌属种TOK、脱硫球菌属(Desulfurococcus)、火叶菌属(Pyrolobus)、热网菌属(Pyrodictium)、葡萄热菌属(Staphylothermus)、埃塔火神杆菌(Vulcanisaetta)、产甲烷球菌属(Methanococcus)(GenBank：P52025)和其他古细菌B聚合酶，诸如GenBank AAC62712、P956901、BAAA07579))、嗜热细菌栖热菌属(Thermus)种(例如，黄栖热菌(Thermus flavus)、红栖热菌(Thermus ruber)、嗜热栖热菌(Thermusthermophilus)、乳栖热菌(Thermus lacteus)、红色栖热菌(Thermus rubens)、水生栖热菌(Thermus aquaticus))、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、海栖热袍菌(Thermotoga maritima)、炽热甲烷嗜热菌(Methanothermus fervidus)、KOD聚合酶、TNA1聚合酶、热球菌属9度N-7、T4、T7、phi29、强烈火球菌(Pyrococcus furiosus)、深海火球菌(P.abyssi)、高加索热球菌(T.gorgonarius)、海滨热球菌(T.litoralis)、齐氏热球菌(T.zilligii)、热球菌属GT、火球菌属GB-D、KOD、Pfu、高加索热球菌(T.gorgonarius)、齐氏热球菌(T.zilligii)、海滨热球菌(T.litoralis)和热球菌属(Thermococcus sp.)9N-7聚合酶。

如本文所用，术语“热稳定聚合酶”是指对热稳定的酶，它是耐热的，当在高温下经过实现双链核酸变性所需要的时间后，其保留足够的活性以实现随后的多核苷酸延伸反应，并且不会不可逆变性(失活)。核酸变性所需的加热条件是本领域众所周知的并在例如美国专利号4,683,202、4,683,195和4,965,188中举例说明，这些专利以引用方式并入本文。如本文所用，热稳定聚合酶适用于温度循环反应，诸如聚合酶链反应(“PCR”)、引物延伸反应、或末端修饰(例如末端转移酶、降解或补平)反应。用于本文目的的不可逆变性是指永久的和完全的酶活性丧失。对于热稳定聚合酶，酶活性是指以适当的方式组合核苷酸以形成与模板核酸链互补的多核苷酸延伸产品的催化作用。来自嗜热细菌的热稳定DNA聚合酶包括，例如来自海栖热袍菌(Thermotoga maritima)、水生栖热菌(Thermus aquaticus)、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)、黄栖热菌(Thermus flavus)、丝状栖热菌(Thermusfiliformis)、栖热菌属(Thermus)种sps17、栖热菌属(Thermus)种Z05、嗜酸栖热菌(Thermus caldophilus)、热坚芽孢杆菌(Bacillus caldotenax)、那不勒斯栖热袍菌(Thermotoga neopolitana)、非洲栖热腔菌(Thermosipho afficanus)和上文公开的其他热稳定DNA聚合酶的DNA聚合酶。

在一些情况下，核酸(例如DNA或RNA)聚合酶可以是经修饰的天然存在的A型聚合酶。本发明的另外的实施例通常涉及一种方法，其中例如在引物延伸、末端修饰(例如末端转移酶、降解或补平)或扩增反应中，经修饰的A型聚合酶可以选自以下任何属的任何种：亚栖热菌属(Meiothermus)、栖热袍菌属(Thermotoga)或热微菌属(Thermomicrobium)。本发明的另一实施例通常从属于一种方法，其中例如在引物延伸、末端修饰(例如末端转移酶、降解或补平)或扩增反应中，聚合酶可以从以下任一种分离水生栖热菌(Thermusaquaticus)(Taq)、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)、嗜酸栖热菌(Thermuscaldophilus)或丝状栖热菌(Thermus filiformis)。本发明的进一步的实施例通常涵盖一种方法，其中例如在引物延伸、端部修饰(例如末端转移酶、降解或补平)或扩增反应中，修饰的A型聚合酶可以从以下分离：嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、嗜热球杆菌(Sphaerobacter thermophilus)、嗜热网团菌(Dictoglomus thermophilum)或大肠杆菌(Escherichia coli)。在另一实施例中，本发明通常涉及一种方法，其中例如在引物延伸、端部修饰(例如末端转移酶、降解或补平)或扩增反应中，修饰的A型聚合酶可以为突变Taq-E507K聚合酶。本发明的另一实施例通常从属于一种方法，其中热稳定的聚合酶可用于引起靶核酸的扩增。

如本文所用，术语“引物”是指与单链模板核酸分子的特定区结合并经由聚合酶介导的酶促反应(从引物的3′端延伸)启动核酸合成并与模板分子的序列互补的寡核苷酸。PCR扩增引物可称为“正向”和“反向”引物，其中一者与核酸链互补，另一者与该链的互补序列互补。通常，引物包括少于约100个核苷酸，且优选包括少于约30个核苷酸。示例性引物范围为约5至约25个核苷酸。引物可以包含例如RNA和/或DNA碱基，以及非天然存在的碱基。新形成的链(子链)的方向性与DNA聚合酶沿模板链运动的方向相反。在一些情况下，靶捕获引物在杂交条件下与靶多核苷酸特异性杂交。此类杂交条件可包括但不限于在等温扩增缓冲液中(20mM的Tris-HCl，10mM的(NH₄)₂SO₄)、50mM的KCl、2mM的MgSO₄、0.1％的

20、25℃下pH为8.8)在约40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃或70℃的温度下进行杂交。

如本文所用，术语“序列”在用于指核酸分子时是指核酸分子中核苷酸(或碱基)的顺序。在核酸分子中存在不同种类的核苷酸的情况下，序列包括在核酸分子中各个位置处的核苷酸的种类(或碱基)的鉴定。序列是全部或部分核酸分子的特性。该术语可以类似地用于描述其他聚合物中单体单元(例如蛋白质聚合物的氨基酸单体单元)的顺序和位置同一性。

如本文所用，术语“测序”是指确定核酸分子中碱基的顺序和位置。更具体地，术语“测序”是指用于确定DNA寡核苷酸中核苷酸碱基、腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶的顺序的生化方法。如本文中所使用的术语，测序可以包括但不限于平行测序或本领域技术人员已知的任何其他测序方法，例如链终止法、快速DNA测序法、游走点分析(wandering-spotanalysis)、Maxam-Gilbert测序、染料终止剂测序，或使用任何其他现代的自动化DNA测序仪器。

如本文所用，术语“底物”是指能够与捕获部分相互作用的任何材料。在一些实施例中，底物为固体载体。在一些实施例中，固体载体可以涵盖任何类型的固体，多孔、或空心球，球，轴承，圆柱，毛细管，通道，或由塑料、陶瓷、金属或聚合物材料(例如水凝胶)组成的其他类似结构(核酸分子可以固定(例如共价或非共价)在其上)。在一些实施例中，固体载体可以包含离散颗粒，其可以是球形(例如微球)或具有非球形或不规则形状，诸如立方体、长方体、锥体、圆柱体、圆锥体、椭圆形或圆盘形等。在一些实施例中，固体载体可以包括硅片、微粒、纳米颗粒、平板、阵列、毛细管、平板载体诸如玻璃纤维滤片、玻璃表面、金属表面(钢、金、银、铝、硅和铜)、玻璃载体、塑料载体、硅胶载体、芯片、滤片、薄膜、微孔板、载玻片、塑料材料包括多孔板或薄膜(例如聚乙烯、聚丙烯、聚酰胺、聚偏二氟乙烯等)、和/或晶片、梳子、销或针(例如适合于组合合成或分析的销阵列)或诸如晶片(例如硅片)的平板表面的凹陷或纳升量级孔的阵列中的珠、带有有或没有滤底的凹陷的晶片。在一些实施例中，固体载体可以是能够悬浮在溶液(例如玻璃珠、磁性珠粒或其他类似颗粒)中的液相载体，或者是固相载体(例如硅片、载玻片等)。液相载体的非限制性实例包括超顺磁性球形聚合物颗粒，诸如INVITROGEN的DYNABEADS磁性珠粒或磁性玻璃颗粒，诸如美国专利号656,568、6,274,386、7,371,830、6,870,047、6,255,477、6,746,874和6,258,531中所述的，其公开内容通过引用以其全文并入本文。

如本文所用，术语“特异性结合实体”是指特异性结合对的成员。特异性结合对是特征在于彼此结合以实质性地排除与其他分子结合的分子对(例如，特异性结合对的结合常数可以比生物学样品中其他分子的结合对的两个成员中的任一者的结合常数大至少10³M^-1、10⁴M^-1或10⁵M^-1)。特异性结合部分的实例包括特异性结合蛋白(例如，抗体、凝集素、链霉亲和素和蛋白A等抗生物素蛋白)。特异性结合部分也可以包括由这种特异性结合蛋白特异性结合的分子(或其部分)。

如本文所用，术语“基本上”意指展现出目标特征或特性的全部或接近全部范围或程度的定性条件。在一些实施例中，“基本上”意指在约5％以内。在一些实施例中，“基本上”意指在约10％以内。在一些实施例中，“基本上”意指在约15％以内。在一些实施例中，“基本上”意指在约20％以内。

如本文所用，术语“靶”或“靶序列”是指靶核酸分子序列，例如与寡核苷酸探针杂交的那些。

如本文所用，术语“通用引物”是指能够与具有共同互补通用引物结合位点的靶多核苷酸杂交并支持扩增的引物。类似地，术语“通用引物对”是指能够杂交并支持具有共同互补的正向和反向通用引物结合位点的靶多核苷酸的PCR扩增的正向和反向引物对。此类一种或多种通用引物和一种或多种通用引物结合位点可以允许感兴趣的多核苷酸区域的单引物或双引物介导的通用扩增(例如通用PCR)。本文提供的标题仅是为了方便，并不用于解释本发明所公开的实施例的范围或含义。

概述

本公开涉及通过单向引物延伸进行靶富集的方法、组合物和试剂盒，其中该方法、组合物和试剂盒利用毒性引物和靶捕获引物两者。本公开的一个方面是富集多个靶核酸分子的方法，例如，在约1至约10000个靶核酸分子之间，或在约1至约5000个靶核酸分子之间，或在约1至约1000个靶核酸分子之间，其中该方法应用了毒性引物和靶捕获引物两者。

本公开还涉及扩增靶富集样品的方法，诸如使用本文所述的任何一种方法制备的靶富集样品。另外，本公开还涉及使用靶富集样品进行测序的方法，诸如使用本文所述的任何一种方法制备的靶富集样品。本公开的方法可用作测序方案的一部分，包括高通量单分子测序方案。在一些实施例中，本公开的方法生成富集的待测序的靶核酸分子文库。文库中富集的靶核酸分子可以任选地并入条形码进行分子鉴定和样品鉴定，诸如美国公开号No.2020/0032244和美国专利号7,393,665，8,168,385、8,481,292、8,685,678和8,722,368中所述的，其公开内容通过引用以其全文并入本文。

在一些实施例中，本公开描述了应用毒性引物和靶捕获引物两者的基于单向双探针引物延伸的富集的通用方法。在一些实施例中，该方法包括：将第一靶捕获引物与核酸分子文库中的第一靶核酸分子杂交，其中第一靶捕获引物包含捕获部分；将第一毒性引物与核酸分子文库中的第一非靶核酸分子杂交，其中第一毒性引物不包括任何捕获部分；延伸第一杂交的靶捕获引物和第一杂交的毒性引物，其中第一杂交的靶捕获引物的延伸提供包含第一靶核酸分子和延伸的第一靶捕获引物的第一靶捕获引物延伸复合物；以及在核酸分子文库中相对于核酸分子文库富集第一靶核酸分子。在一些实施例中，引入的毒性引物在非靶核酸分子(非靶核酸分子)上杂交和延伸，并且阻止或减少了靶捕获引物与非靶核酸分子的错误引发。在其他实施例中，毒性引物从被错误引发和杂交至非靶核酸分子的靶捕获引物上游杂交，并且然后从被错误引发和杂交的靶捕获引物延伸并置换捕获部分。据信，这两种作用机制可以阻止或减少错误引发的非靶核酸分子的下游富集。

有利地，本公开的组合物、试剂盒和方法允许在核酸文库中富集低丰度靶核酸分子，该核酸文库包括低丰度靶核酸分子(例如mRNA；融合转录物)和高丰度非靶核酸分子(例如rRNA；野生型转录物)。在一些实施例中，应用毒性引物以实现从下一代测序文库中靶向消耗不期望的分子，即非靶核酸分子。这可以包括rRNA衍生的cDNA分子，以及其他非靶分子，这些分子被不期望地捕获并随后在下游扩增(参见，例如，图1A)。另外，在cDNA文库的背景下，本公开的组合物、试剂盒和方法有助于富集低丰度的靶分子，而不需要成本高昂且耗时的核糖体消耗步骤。在其他实施例中，应用毒性引物以通过消耗背景分子文库以实现从下一代测序捕获文库富集所需分子。例如，在寻找新的融合转录物时，该实施例将包括野生型转录物的消耗(参见，例如图1B)。

参照图2A，在一些实施例中，本文公开的方法包括获得包含多个核酸分子的核酸文库(步骤101)。在一些实施例中，获得的核酸文库中的核酸分子选自DNA分子、RNA分子、基因组DNA分子、cDNA分子、mRNA分子、rRNA分子、mtDNA、siRNA分子或其组合。在一些实施例中，多个核酸分子包含单链多核苷酸。在一些实施例中，多个核酸分子衍生自组织样品，诸如衍生自哺乳动物受试者的组织样品。在其他实施例中，多个核酸分子衍生自细胞学样品，诸如衍生自哺乳动物受试者的细胞学样品。

在一些实施例中，获得的核酸文库包括多种靶核酸分子和/或多种非靶核酸分子。在一些实施例中，与核酸文库中的靶核酸分子相比，非靶核酸分子呈高丰度。在一些实施例中，在获得的核酸文库中，非靶核酸分子至少占核酸分子的约70％。在其他实施例中，在获得的核酸文库中，非靶核酸分子至少占核酸分子的约75％。在又一些实施例中，在获得的核酸文库中，非靶核酸分子至少占核酸分子的约80％。在进一步的实施例中，在获得的核酸文库中，非靶核酸分子至少占核酸分子的约85％。在更进一步的实施例中，在获得的核酸文库中，非靶核酸分子至少占核酸分子的约90％。在再进一步的实施例中，在获得的核酸文库中，非靶核酸分子至少占核酸分子的约95％。在一些实施例中，在获得的核酸文库中，非靶核酸分子至少占核酸分子的约96％。在一些实施例中，在获得的核酸文库中，非靶核酸分子至少占核酸分子的约97％。在一些实施例中，在获得的核酸文库中，非靶核酸分子至少占核酸分子的约98％。在一些实施例中，在获得的核酸文库中，非靶核酸分子至少占核酸分子的约99％。

在一些实施例中，获得的核酸文库是包含mRNA衍生分子和至少约90％的rRNA的cDNA文库。在一些实施例中，获得的核酸文库是包含mRNA衍生分子和至少约92％的rRNA的cDNA文库。在其他实施例中，获得的核酸文库是包含mRNA衍生分子和至少约94％的rRNA的cDNA文库。在又一些实施例中，获得的核酸文库是包含mRNA衍生分子和至少约95％的rRNA的cDNA文库。在进一步的实施例中，获得的核酸文库是包含mRNA衍生分子和至少约96％的rRNA的cDNA文库。在进一步的实施例中，获得的核酸文库是包含mRNA衍生分子和至少约97％的rRNA的cDNA文库。在进一步的实施例中，获得的核酸文库是包含mRNA衍生分子和至少约98％的rRNA的cDNA文库。在进一步的实施例中，获得的核酸文库是包含mRNA衍生分子和至少约99％的rRNA的cDNA文库。在一些实施例中，cDNA文库包括rRNA和mRNA衍生的分子，并且其中cDNA文库衍生自既往未用核糖体消耗方法处理的生物样品。在一些实施例中，期望在不需要进行核糖体消耗步骤的情况下，对mRNA衍生的分子进行富集。

在一些实施例中，获得的核酸文库包括融合转录物和野生型转录物。在一些实施例中，与野生型转录物相比，融合转录物呈低丰度。在一些实施例中，获得的核酸文库中融合转录物与野生型转录物的比例至少约为1∶3。在其他实施例中，获得的核酸文库中融合转录物与野生型转录物的比例至少约为1∶4。在其他实施例中，获得的核酸文库中融合转录物与野生型转录物的比例至少约为1∶5。在其他实施例中，获得的核酸文库中融合转录物与野生型转录物的比例至少约为1∶10。在其他实施例中，获得的核酸文库中融合转录物与野生型转录物的比例至少约为1∶20。在其他实施例中，获得的核酸文库中融合转录物与野生型转录物的比例至少约为1∶50。在其他实施例中，获得的核酸文库中融合转录物与野生型转录物的比例至少约为1∶100。

在一些实施例中，获得的核酸文库衍生自一个或多个肿瘤样品，并且靶核酸分子包括低丰度的融合转录物。用于检测的融合转录物的非限制性实例包括EML4-ALK、ETV6-NTRK3和ALK-RET融合癌基因。在其他实施例中，获得的核酸文库包括表达的管家基因，其中表达的管家基因相对于获得的核酸文库中的非靶核酸分子呈低丰度。管家基因的非限制性实例包括VCP、RAB7A和CHMP2A。

在一些实施例中，首先从生物样品中制备核酸片段，例如组织样品和/或细胞学样品。DNA测序文库可以由基因组DNA构建用于基因组分析，或由从RNA或mRNA制备的cDNA构建用于转录组分析，并且它可以由任何生物体物种的DNA或cDNA构建，可以从该任何生物体物种中提取这些核酸。在一些实施例中，将获得的样品剪切成片段以提供核酸片段群。在一些实施例中，使用机械(例如雾化或超声)和/或酶促片段化(例如限制性核酸内切酶)来实现获得的基因组样品的剪切。在一些实施例中，生成的核酸片段是随机大小的。在一些实施例中，生成的核酸片段具有小于约1000个碱基对的长度。在其他实施例中，生成的核酸片段包括具有长度在约100至约1000个碱基对之间的序列大小的序列片段。在又一些实施例中，生成的核酸片段包括长度在约500至约750个碱基对之间的序列大小的序列片段。

在一些实施例中，衔接子然后经由连接反应添加至核酸分子的群。在一些实施例中，衔接子包括一个或多个条形码序列。将衔接子连接到核酸分子的方法描述于美国专利公开号2017/0037459、2018/0334709、2018/0016630和在PCT公开号WO2017021449，其公开内容通过引用以其全文并入本文。

在核酸文库的断裂和制备(步骤101)之后，向核酸文库或包括核酸文库和其他组分的反应混合物中引入引物池以实现杂交(例如缓冲液等)。引入后，引物池中的一种或多种毒性引物和一种或多种靶捕获引物至少部分分别杂交到一种或多种非靶和/或靶核酸分子(步骤102、103)。

在一些实施例中，引物池包括一种或多种毒性引物和一种或多种靶捕获引物。在一些实施例中，该引物池包括约1至约1000种之间的不同的毒性引物。在一些实施例中，该引物池包括约50至约750种之间的不同的毒性引物。在其他实施例中，该引物池包括约100至约500种之间的不同的毒性引物。在一些实施例中，该引物池包括约50至约2500种之间的不同的靶捕获引物。在其他实施例中，该引物池包括约150至约1000种之间的不同的靶捕获引物。

在一些实施例中，一种或多种靶捕获引物是靶特异性的，因此，被设计为用于杂交到核酸文库中的互补核酸分子的子集，该核酸文库包括所需的靶基因、外显子和/或其他感兴趣的基因组区域(以下简称“靶核酸分子”)。在一些实施例中，靶捕获引物包括RocheSeqCap EZ Probes池(可从Roche Sequencing and Life Sciences，Indianapolis，IND获得)。在一些实施例中，靶捕获引物包括可商购自ThermoFisher的Ampliseq引物的池。

在一些实施例中，靶捕获引物可以由核糖核酸、脱氧核糖核酸或其他本领域已知的核酸类似物组成。在一些实施例中，靶捕获引物可以包括一种或多种非天然核苷酸，例如锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、γ-PNA、乙二醇核酸(GNA)和苏糖核酸(TNA)。在一些实施例中，靶捕获引物的长度范围从约20个核苷酸至约100个核苷酸。在其他实施例中，靶捕获引物的长度范围从约40个核苷酸至约80个核苷酸。在又一些实施例中，靶捕获引物的长度范围从约50个核苷酸至约75个核苷酸。

在一些实施例中，一种或多种靶捕获引物中的每一种都是包含以下的缀合物：(i)捕获部分；和(ii)与核酸文库中的一种或多种靶核酸分子的序列实质性互补的序列。在一些实施例中，一种或多种靶捕获引物的每一种都能够通过杂交和/或延伸的捕获部分并如本文所述的与官能化底物结合(参见，例如，图3A和4)。在其他实施例中，靶捕获引物在杂交之前通过捕获部分与官能化底物结合，如本文所述(参见，例如图5和6)。

在一些实施例中，一种或多种靶捕获引物的每一种的捕获部分都包含第一部分(例如第一反应性官能团)，其与另一实体(例如与官能化底物缀合的第二部分)的第二部分(例如第二反应性官能团)具有反应性。在一些实施例中，第一部分是特定结合实体对中的第一成员；并且第二部分是同一特定结合实体对中的第二成员。在一些实施例中，第一部分和第二部分之间的“反应”可以表示在两个反应性基团或两个部分的两个反应性官能团之间形成共价键；或可以表示两个反应性基团或两个部分的两个反应性官能团彼此缔合、彼此相互作用、彼此杂交、彼此氢键合等。因此，在一些实施例中，“反应”包括结合事件，诸如半抗原与抗半抗原抗体的结合或生物素与链霉亲和素的结合。在一些实施例中，靶捕获引物中的每一个包括相同的捕获部分，例如生物素。在其他实施例中，不同子集的靶捕获引物包括不同的捕获部分。

在一些实施例中，捕获部分可以包括生物素，以结合包括亲和素或链霉亲和素的官能化底物。在其他实施例中，捕获部分可以包括巯基化的分子，以结合包括金颗粒的官能化底物。在又一些实施例中，捕获部分可以包括端氨基分子，以结合NHS激活的底物。

在一些实施例中，捕获部分包括固定的抗体，其可用于结合包括或缀合至特定抗原分子(诸如结合官能化底物的抗原分子)的分子。在其他实施例中，捕获部分包括抗原分子，其可用于结合固定化抗体(诸如结合官能化底物的抗体)。

在一些实施例中，捕获部分包括酶，其可以用于结合包括或缀合至特定酶底物的分子。在其他实施例中，捕获部分包括酶的底物，其可用于结合酶(诸如与官能化底物偶联的酶)。

在一些实施例中，捕获部分包括受体，其可用于结合包括或缀合至特定受体配体(诸如结合一个官能化底物的受体配体)的分子。在其他实施例中，捕获部分包括一种或多种受体配体，其可用于结合包括受体(诸如结合官能化底物的受体)的分子。

在一些实施例中，捕获部分包括凝集素，其可用于结合包括或缀合至特定聚糖(诸如结合一个官能化底物的特定聚糖)的分子。在其他实施例中，捕获部分包括一种或多种聚糖，其可用于结合包括或缀合至一种或多种凝集素(诸如结合一个官能化底物的一种或多种凝集素)的分子。

在再进一步的实施例中，捕获部分包括一个或多个核酸序列，其可以用于结合包括或与缀合至互补碱基序列的分子。在其他实施例中，捕获部分可以包括可与诸如小分子、肽、蛋白质、细胞等靶分析物特异性结合的受束缚的DNA/RNA适体。

一种或多种毒性引物中的每一种都被设计为与核酸文库中的互补的核酸分子的第二子集杂交，该核酸文库不包括所需的基因、外显子和/或其他感兴趣的基因组区域(以下简称“非靶核酸分子”)。与靶捕获引物不同，本公开的毒性引物不与任何捕获部分缀合，并且因此不能与任何官能化底物反应。

在一些实施例中，毒性引物可以由核糖核酸、脱氧核糖核酸或其他本领域已知的核酸类似物组成。在一些实施例中，毒性引物可以包括一种或多种非天然核苷酸，例如锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、γ-PNA、乙二醇核酸(GNA)和苏糖核酸(TNA)。在一些实施例中，毒性引物的长度范围从约20个核苷酸至约100个核苷酸。在其他实施例中，毒性引物的长度范围从约40个核苷酸至约80个核苷酸。在又一些实施例中，毒性引物的长度范围从约50个核苷酸至约75个核苷酸。

在一些实施例中，毒性引物与靶捕获引物相比具有较低的解链温度(T_m)。在一些实施例中，毒性引物的T_m比靶捕获引物的T_m低至少约2％。在其他实施例中，毒性引物的T_m比靶捕获引物的T_m低至少约5％。在又一些实施例中，毒性引物的T_m比靶捕获引物的T_m低至少约10％。在进一步的实施例中，毒性引物的T_m比靶捕获引物的T_m低至少约15％。在再进一步的实施例中，毒性引物的T_m比靶捕获引物的T_m低至少约20％。

在一些实施例中，第一靶捕获引物的解链温度比第一毒性引物的解链温度高至少约1℃。在其他实施例中，第一靶捕获引物的解链温度比第一毒性引物的解链温度低至少约2℃。在又一些实施例中，第一靶捕获引物的解链温度比第一毒性引物的解链温度高至少约3℃。在进一步的实施例中，第一靶捕获引物的解链温度比第一毒性引物的解链温度高至少约4℃。在再进一步的实施例中，第一靶捕获引物的解链温度比第一毒性引物的解链温度高至少约5℃。在进一步的实施例中，第一靶捕获引物的解链温度比第一毒性引物的解链温度高至少约6℃。在进一步的实施例中，第一靶捕获引物的解链温度比第一毒性引物的解链温度高至少约7℃。在进一步的实施例中，第一靶捕获引物的解链温度比第一毒性引物的解链温度高至少约8℃。在进一步的实施例中，第一靶捕获引物的解链温度比第一毒性引物的解链温度高至少约9℃。在进一步的实施例中，第一靶捕获引物的解链温度比第一毒性引物的解链温度高至少约10℃。

在一些实施例中，毒性引物的T_m至少为约50℃。在一些实施例中，毒性引物的T_m至少为约55℃。在一些实施例中，毒性引物的T_m至少为约60℃。在一些实施例中，毒性引物的T_m至少为约65℃。在一些实施例中，毒性引物的T_m至少为约70℃。在一些实施例中，毒性引物的T_m至少为约75℃。在一些实施例中，毒性引物的T_m至少为约80℃。

在一些实施例中，靶捕获引物的浓度和毒性引物的浓度大致相同。在其他实施例中，靶捕获引物的浓度和毒性引物的浓度不同。在一些实施例中，毒性引物的浓度比靶捕获引物的浓度高至少两倍。在其他实施例中，毒性引物的浓度比靶捕获引物的浓度高至少五倍。在其他实施例中，毒性引物的浓度比靶捕获引物的浓度高至少十倍。在其他实施例中，毒性引物的浓度比靶捕获引物的浓度高至少二十倍。在其他实施例中，毒性引物的浓度比靶捕获引物的浓度高至少五十倍。在其他实施例中，毒性引物的浓度比靶捕获引物的浓度高至少一百倍。在其他实施例中，毒性引物的浓度比靶捕获引物的浓度高至少两百倍。在其他实施例中，毒性引物的浓度比靶捕获引物的浓度高至少五百倍。在一些实施例中，一种或多种靶捕获引物可以错误引发，即与非靶核酸分子而不是靶核酸分子杂交。错误引发事件在本文图3A和4-6中示出。据信，引入、杂交和/或延伸一种或多种毒性引物阻止和/或减轻了错误引发事件。此外，据信，如果发生错误引发，杂交的毒性引物的延伸可能会阻止和/或减轻随后的捕获和/或富集非靶核酸分子。

在一种或多种靶捕获引物与一种或多种靶核酸分子杂交(步骤102)和一种或多种毒性引物与一种或多种非靶核酸分子杂交(步骤103)后，延伸一种或多种杂交的靶捕获引物和一种或多种杂交的毒性引物(步骤104)中的每一种，以形成一种或多种延伸的靶捕获引物复合物和/或一种或多种延伸的毒性引物复合物。在靶捕获引物被错误引发的那些情况下，错误引发的和杂交的靶捕获引物将沿着非靶核酸分子延伸，如本文进一步示出(参见，例如图3A和图4-6)。

在一些实施例中，通过使用第一聚合酶来延伸一种或多种杂交的靶捕获引物，从而形成一种或多种双链产物，每种双链产物包含与延伸的靶捕获引物杂交的靶核酸分子。在一些实施例中，一种或多种延伸的靶捕获引物复合物中的每一种都包括延伸的靶捕获引物(其本身包括杂交的靶捕获引物，其包括捕获部分)和与靶捕获引物杂交的靶核酸序列。在一些实施例中，延伸的靶捕获引物包括与靶捕获引物杂交的靶核酸分子的至少一部分的反向互补序列。

在一种或多种靶捕获引物被错误引发的情况下，那些被错误引发的靶捕获引物也可以使用第一聚合酶延伸。在一些实施例中，一种或多种错误引发的杂交的靶捕获引物(与非靶核酸分子杂交)通过使用第一聚合酶延伸，从而形成一种或多种双链产物，每种双链产物包含与延伸的靶捕获引物杂交的非靶核酸分子。

同样，通过使用第二聚合酶来延伸一种或多种杂交的毒性引物，从而形成一种或多种双链产物，每种双链产物包含与延伸的毒性引物杂交的非靶核酸分子。在一些实施例中，一种或多种延伸的毒性引物复合物中的每一种都包括延伸的靶捕获引物和毒性引物杂交的非靶核酸序列。在一些实施例中，延伸的毒性引物包括与毒性引物杂交的非靶核酸分子的至少一部分反向互补序列。

在一些实施例中，用于延伸一个或多个杂交的靶捕获引物的第一聚合酶与用于延伸一个或多个杂交的毒性引物的第二聚合酶相同。在其他实施例中，用于延伸一个或多个杂交的靶捕获引物的第一聚合酶与用于延伸一个或多个杂交的毒性引物的第二聚合酶不同。根据所分析的核酸分子的类型，聚合酶可以是DNA依赖的DNA聚合酶(“DNA聚合酶”)或RNA依赖的DNA聚合酶(“逆转录酶”)。合适的聚合酶选自Taq或Taq-衍生的聚合酶(例如来自KAPA BIOSYSTEMS的KAPA 2G聚合酶)；或B-族DNA聚合酶(例如来自KAPA BIOSYSTEMS的KAPAHIFI聚合酶)。

在一些实施例中，杂交和延伸过程(步骤102、103和104)同时进行。在其他实施例中，杂交和延伸过程(步骤102、103和104)依次进行。在一些实施例中，可以通过诸如灭活加入的第一和/或第二聚合酶等技术主动控制一种或多种杂交的靶捕获引物和一种或多种杂交的毒性引物延伸的长度，或者诸如通过消耗限制反应物等被动使反应完成。此类方法进一步描述于美国专利公开号2020/0032244，其公开内容通过引用以其全文并入本文。

再参考图2A，杂交的靶捕获引物和杂交的毒性引物两者均延伸(步骤104)后，由于一种或多种靶核酸分子的存在，核酸文库得到富集。在一些实施例中，富集涉及通过消耗(即移除)非靶核酸分子的核酸分子文库中其他成员提高一种或多种靶核酸分子的浓度。在一些实施例中，富集包括形成一种或多种释放引物延伸复合物的步骤。

靶核酸分子富集的一种方法如图2B所示。例如，在步骤201中捕获一种或多种靶捕获引物延伸复合物。一种或多种靶捕获引物延伸复合物的捕获可以通过如本文所述的多种方式实现，并且可以在上述杂交和/或延伸步骤之前、同时或之后实现。

在一些实施例中，捕获包括在杂交和/或延伸步骤后将靶捕获引物延伸复合物与适当官能化底物(例如珠粒)接触，使每种靶捕获引物延伸复合物的捕获部分与官能化底物的相应部分反应，从而将一种或多种靶捕获引物延伸复合物结合到官能化底物。例如，靶捕获引物延伸复合物可以包括包含生物素的捕获部分，该捕获部分可以与包括链霉亲和素在内的官能化底物结合。在这些实施例中，捕获部分在杂交步骤之前(即在步骤102之前)偶联到官能化底物(例如珠粒)上，通过每个靶捕获引物与其对应的靶核酸杂交实现捕获。本文进一步描述了捕获靶捕获引物延伸复合物的其他方法并且还描述于美国公开号2020/0032244，其公开内容通过引用以其全文并入本文。

在一些实施例中，在一些实施例中，官能化底物包含具有适当官能化表面(其中底物可以用上文所述的任何部分官能化)的珠粒。在一些实施例中，该珠粒包括在柱子或微流控装置中。在一些实施例中，该珠粒是磁性珠粒。在其他实施例中，该珠粒是非磁性珠粒。

在捕获一种或多种靶捕获引物延伸复合物后，进行一个或多个纯化过程，以去除非靶核酸分子以及任何其他未使用的反应组分(例如核苷酸、引物分子、酶、缓冲液等)(步骤202)。例如，非靶核酸分子可以通过流动的洗涤液和/或缓冲液通过包括官能化底物的柱(例如包括具有适当官能化表面的多个珠粒的柱)去除。在一些实施例中，洗涤进行至少一次。在其他实施例中，洗涤进行至少两次。在又一些实施例中，洗涤进行至少三次。熟练的技术人员将认识到与官能化底物(例如珠粒)结合的一种或多种靶捕获引物延伸复合物将随着洗涤液和/或缓冲液流经装填官能化底物的柱而保持与官能化底物的结合，而那些未结合的非靶核酸分子将被洗去，从而产生用一种或多种靶核酸分子富集的反应混合物。

在一些实施例中，靶核酸分子可以在富集后任选地扩增。在一些实施例中，捕获的靶核酸分子在偶联到官能化表面的同时被直接扩增。此类方法描述于美国专利号10,240,192、10,160995和7,842,457中，其公开内容通过引用以其全文并入本文。在其他实施例中，在扩增步骤之前，从捕获的靶捕获引物延伸复合物释放一种或多种靶核酸分子(步骤203)。

在一些实施例中，一种或多种靶核酸分子的释放遵循图2C所述的工作流程。例如，在一些实施例中，一种或多种释放引物与一种或多种靶核酸分子杂交(步骤211)。在一些实施例中，一种或多种释放引物被设计为与一种或多种靶核酸分子的一部分并且在第一衔接子与第二衔接子之间杂交。在其他实施例中，一种或多种释放引物被设计为与相对于一种或多种靶捕获引物延伸复合物上游的靶核酸分子的部分杂交。在一些实施例中，引物设计算法被设计为选择与捕获引物尽可能接近的引物。在一些实例中，捕获和释放引物之间没有间隙。在一些实施例中，释放引物将不具有捕获部分，这与毒性引物类似。然而，它将具有与捕获引物类似的Tm。

接下来，使用聚合酶延伸一种或多种杂交的释放引物，从而形成一种或多种延伸的杂交释放引物(步骤212)。在一些实施例中，一种或多种杂交的释放引物与聚合酶的延伸将一种或多种靶延伸的靶捕获引物从一种或多种靶捕获引物延伸复合物中释放出来。在一些情况下，该聚合酶表现出链置换活性。在一些情况下，该聚合酶表现出5′-3′核酸外切酶活性(其消化双链核酸分子的单链)(本文称为5′-3′双链核酸外切酶活性)或双链核酸外切酶活性。在一些情况下，该聚合酶同时表现出链置换和5′-3′双链核酸外切酶活性。在一些情况下，链置换、5′-3′双链核酸外切酶活性或其组合，可以将靶核酸分子(例如原始的靶核酸分子，从提供的样品)转移到溶液中。

例如，在一些实施例中，将含有与延伸的靶捕获引物杂交的靶核酸分子的第一双链产物固定在官能化底物上，例如通过透过延伸靶捕获引物的捕获部分的配体(例如生物素或其衍生物)的亲和捕获。在此类实施例中，延伸杂交释放引物的聚合酶的链置换活性将靶核酸分子从样品转移到溶液中。可替代地，5′-3′核酸外切酶活性可以降解通过亲和捕获固定并与靶核酸分子杂交的延伸的靶捕获引物，其中5′-3′核酸外切酶活性从而将靶核苷酸释放到溶液中。从形成的靶捕获引物延伸复合物中释放靶核酸分子的其他方法描述于美国专利公开号2018/0016630，其公开内容通过引用以其全文并入本文。

释放的一种或多种靶核酸分子然后可用于一个或多个下游过程，例如测序、扩增、进一步偶联等。再参考图2A，在一些实施例中，富集了一种或多种靶核酸分子的核酸文库被任选地扩增(步骤106)。在一些实施例中，任选的扩增的步骤(106)包括线性或指数扩增(例如聚合酶链反应(PCR))中的一者。如本文所用，“PCR”是指通过DNA互补链的同时引物延伸，对特定DNA序列进行体外扩增的反应。如本文所用，PCR涵盖反应的衍生形式，包括但不限于RT-PCR、实时PCR、嵌套式PCR、定量PCR、多重PCR、数字PCR、微滴式数字PCR和装配PCR。富集后的靶核酸分子的扩增可以包括基于非PCR的方法。非PCR方法的非限制性实例包括核酸序列依赖性扩增(NASBA)、转录介导的扩增(TMA)、全转录组扩增(WTA)、全基因组扩增(WGA)、多重置换扩增(MDA)、链置换扩增(SDA)、实时SDA、滚环扩增和/或环对环扩增。

一般来说，扩增(步骤106)包括用聚合酶、第一扩增引物和第二扩增引物扩增靶核酸分子。在一些实施例中，第一扩增引物和第二扩增引物的设计被设计为为了与步骤101中核酸分子文库中的一种或多种靶核酸分子中并入的衔接子序列互补。例如，第一扩增引物可以具有与第一衔接子互补的3′端，第二扩增引物可以具有与第二衔接子互补的3′端。在一些实施例中，扩增引物可以包括在被扩增的靶核酸分子(例如基因/靶特异性引物、通用引物等)中存在的任何序列，并且可以支持合成一条或两条链(即扩增反应的模板对应的双链核酸分子的上链和下链两者)的合成。在一些实施例中，第一扩增引物和第二扩增引物是通用引物。其他扩增方法描述于美国公开第2020/0032244号和第2018/0016630号中，其公开内容通过引用以其全文并入本文。

在一些实施例中，测序可以根据本领域技术人员已知的任何方法任选地进行(参见图2A的步骤107)。在一些实施例中，测序方法包括Sanger测序和染料终止子测序，以及下一代测序技术，诸如焦磷酸测序、纳米孔测序、基于微孔的测序、纳米球测序、MPSS、SOLiD、Illumina、Ion Torrent、Starlite、SMRT、tSMS、边合成边测序、边连接边测序、质谱测序、聚合酶测序、RNA聚合酶(RNAP)测序、基于显微镜的测序、微流控Sanger测序、基于显微镜的测序，RNAP测序等。例如，测序的仪器和方法在PCT公开号WO2014144478、WO2015058093、WO2014106076和WO2013068528中公开，其公开内容通过引用整体并入本文。

在一些实施例中，测序(步骤107)可以通过许多不同的方法进行，诸如通过采用合成测序技术。根据现有技术的合成测序被定义为任何测序方法，其监测在测序反应过程掺入特定脱氧核苷-三磷酸后副产物的产生(Hyman，1988，Anal.Biochem.174：423-436；Rhonaghi等天，1998，Science281：363-365)。合成反应测序的一个突出实施例是焦磷酸测序方法。在这种情况下，核苷酸掺入过程中焦磷酸盐的产生由导致化学发光信号产生的酶促级联监测。454基因组测序仪系统(Roche Applied Science目录号04 760 085 001)是边合成边测序的实例，其以焦磷酸测序技术为基础。如产品文献中所述，对于在454GS20或454FLX仪器上进行测序，平均基因组DNA片段大小分别在200或600bp范围内。

在一些实施例中，合成反应测序可以可替代地基于测序反应的终止染料类型。在这种情况下，掺入的染料脱氧核苷三磷酸(ddNTP)结构单元包含可检测标记，其优选为防止新生DNA链进一步延伸的荧光标记。然后在将ddNTP结构单元掺入模板/引物延伸杂交体中后，例如通过使用包含3′-5′核酸外切酶或校对活性的DNA聚合酶去除和检测标记。

在一些实施例中，并且在基因组测序系统工作流程(Roche Applied Science目录号04 896 548 001)的情况下，在第一步中，通过乳液PCR进行(克隆)扩增。因此，扩增的步骤是通过乳液PCR方法进行的，这也是在本公开的范围内。携带克隆扩增的靶核酸分子的珠粒可以随后根据制造商的操作方案被任意转移到一个picotiter plate中，并进行焦磷酸测序反应以进行序列测定。

在一些实施例中，使用下一代测序方法例如Illumina，Inc.提供的方法(“Illumina测序方法”)进行测序。不希望受任何特定理论的束缚，Illumina下一代测序技术使用克隆扩增和合成测序(SBS)化学来实现快速、准确的测序。该过程同时鉴定DNA碱基，同时将它们掺入到核酸链中。每个碱基在添加到生长链时都会发出独特的荧光信号，用于确定DNA序列的顺序。

如上所述，期望阻止靶捕获引物无意“错误引发”(即与非靶序列结合)。在图3A中的第一个非限制性实施例中示出了毒性引物阻止或减少从头开始“错误引发”的能力。在图4中的第二个非限制性实施例中示出了毒性引物阻止或减少捕获被错误引发的非靶分子的能力。一般来说，这两个实施例中的每一个都示出了引物延伸靶富集的方法，该方法包括溶液中引物介导的捕获靶核酸分子，然后将捕获的靶核酸分子相对于核酸分子文库中的其他核酸分子进行富集。

图3A描绘了靶核酸分子富集的方法，其中延伸的毒性引物阻止或减少靶捕获引物错误引发的发生率。在本实施例中，杂交的毒性引物的延伸阻止了靶捕获引物与非靶核酸分子杂交。首先转向图3A的小图301，首先制备核酸分子文库，其中核酸分子文库包括一种或多种靶核酸分子323和一种或多种非靶核酸分子333。在一些实施例中，与核酸分子文库中的一种或多种非靶核酸分子相比，一种或多种靶核酸分子323呈低丰度。例如，在一些实施例中，一种或多种靶核酸分子可以代表核酸分子文库中不到10％的核酸分子。在其他实施例中，一种或多种靶核酸分子可以代表核酸分子文库中不到5％的核酸分子。在一些实施例中，衔接子(321、322、331和332)连接在一种或多种靶核酸分子323和一种或多种非靶核酸分子333的两端。

小图301示出了靶核酸分子323，其中靶核酸分子包括包含第一衔接子301的第一端和包含第二衔接子322的第二端。小图301进一步示出了非靶核酸分子333，其中非靶核酸分子包括包含第一衔接子331的第一端和包含第二衔接子333的第二端。第一衔接子321和331分别位于靶和非靶核酸分子的5′端。第二衔接子322和332分别位于靶和非靶核酸分子的3′端。在一些实施例中，第一衔接子321和331是相同的；类似地，在一些实施例中，第二衔接子331和332是相同的。

制备好核酸文库后，将一种或多种靶捕获引物324和一种或多种毒性引物334分别与靶和非靶核酸分子323和333杂交(参见小图302)。在一些实施例中，一种或多种靶捕获引物324各自包括与靶核酸分子323至少一部分互补的靶捕获区域325和捕获部分326。捕获部分可以包括任何上述那些部分。在一些实施例中，捕获部分为生物素。在一些实施例中，一种或多种毒性引物334包括非靶特异性区域，该区域与非靶核酸分子333的至少一部分互补。值得注意的是，一种或多种毒性引物334不包括捕获部分，并且因此在任何富集步骤过程中都不能被捕获。

如图3A中的小图303所示，延伸一种或多种杂交的靶捕获引物和一种或多种毒性引物中的每一种。在一些实施例中，用第一聚合酶(未显示)延伸一种或多种杂交的靶捕获引物324，从而产生一种或多种靶捕获引物延伸复合物328。一种或多种靶捕获引物延伸复合物328各自包括靶核酸分子323和延伸的靶捕获引物327(其中虚线表示杂交的靶捕获引物324的延伸部分)。如小图303中进一步示出，用第二聚合酶(未显示)延伸一种或多种杂交的毒性引物334，从而产生一种或多种延伸的毒性引物335(其中虚线再次表示杂交的毒性引物334的延伸部分)。

熟练的技术人员将认识到，在一些实施例中，毒性引物的延伸阻止或减轻了靶捕获引物错误引发到非靶链(对比图3A的小图303和图4的小图402和403)。也就是说，双链多聚核酸的形成阻止或减轻了靶捕获引物与非靶核酸分子的结合，并且从而阻止或减轻了错误引发。

接下来，将靶捕获引物延伸复合物328捕获到官能化底物329(参见图3A的小图304)。在一些实施例中，官能化底物包括液相载体(例如珠粒或另一类似颗粒)或固相载体(例如硅片、载玻片等)。磁性玻璃颗粒和应用磁性玻璃颗粒的装置的实例描述于美国专利号656,568、6,274,386、7,371，830、6,870,047、6,255,477、6,746,874和6,258,531中，其公开内容通过引用以其全文并入本文。在小图304所示的实施例中，靶捕获引物延伸复合物328经由捕获部分326被捕获在官能化底物329上。在一些实施例中，捕获部分326包含生物素，官能化底物包含链霉亲和素。本文进一步描述了靶捕获的替代性方法(参见，例如，图5的实施例)。

在一些实施例中，并参照图3B，捕获包括将通用捕获寡核苷酸351与靶捕获引物324杂交。在该具体实施例中，靶捕获引物324包含包括捕获序列(即通用核酸序列350)的部分(参见小图310)。引入的通用捕获寡核苷酸351包括具有与靶捕获引物324的通用捕获序列350互补的核酸序列的部分；并进一步包括捕获部分351。与图3A的小图304所描述的实施例相同，捕获进一步包括引入官能化底物329，其中官能化底物329包括能够与捕获部分351反应或结合的部分。

捕获后，相对于核酸文库中存在的核酸分子富集靶捕获引物延伸复合物328。在一些实施例中，富集包括去除未捕获到官能化底物上的核酸分子。在一些实施例中，未捕获的核酸分子可以通过流过一种或多种洗液和/或缓冲液通过包括液相载体的柱来去除。通过比较小图301和305，熟练的技术人员将认识到在捕获一种或多种靶捕获引物延伸复合物和去除未捕获的核酸分子后，初始反应混合物会被一种或多种捕获的靶核酸分子富集。在一些实施例中，捕获的靶核酸分子在偶联到官能化表面的同时被直接扩增。在其他实施例中，如本文进一步描述的(参见图7)，靶捕获引物延伸复合物328可以从官能化底物329中释放，从而使靶核酸分子可以用于进一步的下游过程操作(例如扩增和/或测序)。

图4描绘了靶核酸富集的方法，其中延伸的毒性引物阻止了被靶捕获引物错误引发的非靶核酸分子的捕获。如本文所述，与非靶核酸分子杂交的毒性引物的延伸会从形成的靶捕获引物延伸复合物中切割捕获部分。首先转向图4的小图401，首先制备了核酸分子文库，其中核酸分子文库包括一种或多种靶核酸分子423和一种或多种非靶核酸分子433。在一些实施例中，衔接子(421、422、431和432)连接在一种或多种靶核酸分子423和一种或多种非靶核酸分子433的两端。在一些实施例中，与核酸分子文库中的一种或多种非靶核酸分子相比，一种或多种靶核酸分子423呈低丰度。例如，在一些实施例中，一种或多种靶核酸分子可以代表核酸分子文库中不到10％的核酸分子。在其他实施例中，一种或多种靶核酸分子可以代表核酸分子文库中不到5％的核酸分子。小图401示出了靶核酸分子423，其中靶核酸分子包括包含第一衔接子401的第一端和包含第二衔接子422的第二端。

小图401进一步示出了非靶核酸分子433，其中非靶核酸分子包括包含第一衔接子431的第一端和包含第二衔接子433的第二端。第一衔接子421和431分别位于靶和非靶核酸分子的5′端。第二衔接子422和432分别位于靶和非靶核酸分子的3′端。在一些实施例中，第一衔接子421和431是相同的；类似地，在一些实施例中，第二衔接子431和432是相同的。

制备好核酸文库后，将一种或多种靶捕获引物424和一种或多种毒性引物434分别与靶和非靶核酸分子423和433杂交(参见图4的小图402)。在一些实施例中，一种或多种靶捕获引物424各自包括与靶核酸分子423至少一部分互补的靶捕获区域425和捕获部分426(例如生物素)。

图4的小图402还示出了靶捕获引物424对非靶核酸分子序列433的错误引发。也就是说，在一些实施例中，包含捕获部分426的靶捕获引物424可以与非靶核酸分子433杂交，即靶捕获引物变成“错误引发”。因此，非靶核酸分子可以包含杂交的毒性引物以及杂交的和错误引发的靶捕获引物两者。

在一些实施例中，一种或多种毒性引物434包括非靶特异性区域，该区域与非靶核酸分子433的至少一部分互补。值得注意的是，一种或多种毒性引物434不包括捕获部分，并且因此在下游过程中都不能被捕获。

如图4中的小图403所示，延伸一种或多种杂交的靶捕获引物的每一种(包括那些已经被错误引发的)，以及一种或多种毒性引物。在一些实施例中，用第一聚合酶(未显示)延伸与靶核酸分子杂交的一种或多种靶捕获引物424，从而产生一种或多种靶捕获引物延伸复合物428。一种或多种靶捕获引物延伸复合物428各自包括靶核酸分子423和延伸的靶捕获引物427(其中虚线表示杂交的靶捕获引物424的延伸部分)。在一些实施例中，与非靶核酸分子杂交的靶捕获引物也被第一聚合酶(未显示)延伸，从而产生一种或多种错误引发的延伸复合物430。如小图403中进一步示出，用第二聚合酶(未显示)延伸一种或多种杂交的毒性引物434，从而产生一种或多种延伸的毒性引物435(其中虚线再次表示杂交的毒性引物434的延伸部分)。

如图4的小图404中进一步示出，随着毒性引物继续延伸，延伸的毒性引物将捕获部分426从靶捕获引物中剪下，从而将捕获部分从靶捕获引物延伸复合物中释放。熟练的技术人员将认识到，通过杂交的毒性引物的延伸，阻止或减少了捕获非靶核酸分子的发生率。

接下来，用官能化底物429捕获靶捕获引物延伸复合物428(参见图4小图405)。在一些实施例中，官能化底物是液相载体(例如珠粒或另一类似颗粒)或固相载体(例如硅片、载玻片等)。如上所述，可以应用美国专利号656,568、6,274,386、7,371,830、6,870,047、6,255,477、6,746,874和6,258,531中所述的任何磁性玻璃颗粒和应用磁性玻璃颗粒的装置。在小图405所示的实施例中，靶捕获引物延伸复合物428经由捕获部分426被捕获在官能化底物429上。本文描述了靶捕获的替代性方法(参见，例如，图6的实施例)。

捕获后，相对于核酸文库中存在的核酸分子富集靶捕获引物延伸复合物428。在一些实施例中，富集包括去除未捕获到官能化底物上的核酸分子，例如未捕获的核酸分子可以通过流过一种或多种洗液和/或缓冲液通过包含液相载体的柱来去除。通过比较小图401和406，熟练的技术人员将认识到在捕获一种或多种靶捕获引物延伸复合物和去除未捕获的核酸分子后，初始反应混合物会被一种或多种捕获的靶核酸分子富集。在一些实施例中，捕获的靶核酸分子在偶联到官能化表面的同时被直接扩增。在其他实施例中，如本文进一步描述的(参见图7)，靶捕获引物延伸复合物428可以从官能化底物429中释放，从而使靶核酸分子可以用于进一步的下游过程操作(例如，和/或测序)。

如本文所述，在靶捕获引物与靶核酸分子杂交之前，靶捕获引物的捕获部分可以与官能化底物结合。图5描绘了替代性的工作流程，其中靶捕获引物324在与靶核酸分子323杂交之前通过捕获部分326与官能化底物329结合。在一些实施例中，将与官能化底物329结合的靶捕获引物324与靶核酸分子323杂交(参见小图502)。同时，毒性引物334与非靶核酸分子333杂交(参见小图502)。与图3A所描述的实施例相同，将杂交的靶捕获引物324和杂交的毒性引物334两者都进行了延伸。在一些实施例中，毒性引物的延伸阻止或减少了靶捕获引物对非靶核酸分子333的错误引发。如小图503所示，靶捕获引物延伸复合物328通过捕获部分326与官能化底物329结合，并且因此不需要单独的捕获步骤(与图3A的小图304相比)。在一些实施例中，富集包括去除未捕获到官能化底物上的核酸分子，例如未捕获的核酸分子可以通过流过一种或多种洗液和/或缓冲液通过包含液相载体的柱来去除。如本文进一步描述的，靶捕获引物延伸复合物328可以从官能化底物329中释放，从而使靶核酸分子可以用于进一步的下游过程操作(例如测序)。

图6描绘了另一替代性的工作流程，其中靶捕获引物424在与靶核酸分子423杂交之前通过捕获部分426与官能化底物429结合。在一些实施例中，将与官能化底物429结合的靶捕获引物424与靶核酸分子423杂交(参见小图602)。同时，毒性引物434与非靶核酸分子433杂交(参见小图502)。在小图602中还显示了靶捕获引物424(同样通过捕获部分426与官能化底物429结合)错误引发至非靶核酸分子433。与图4所描述的实施例相同，将杂交的靶捕获引物424和杂交的毒性引物434两者都进行了延伸(参见小图603)。如图6的小图604所绘，随着毒性引物434的继续延伸，延伸的毒性引物将捕获部分426从靶捕获引物中剪下并结合官能化底物429，从而将捕获部分从靶捕获引物延伸复合物428中释放。

如小图604所示，靶捕获引物延伸复合物428通过捕获部分426与官能化底物429结合，并且因此不需要单独的捕获步骤(与图4的小图405相比)。在一些实施例中，富集包括去除未捕获到官能化底物上的核酸分子，例如，核酸分子可以通过流过一种或多种洗液和/或缓冲液通过包含液相载体的柱来去除。如本文进一步描述的，靶捕获引物延伸复合物428可以从官能化底物429中释放，从而使靶核酸分子可以用于进一步的下游过程操作(例如测序)。

如前所述，在一些实施例中，靶捕获引物延伸复合物可以从官能化底物中释放出来，从而可以对靶核酸分子进行扩增和/或测序。图7描绘了通过捕获部分726将靶捕获引物延伸复合物728偶联到官能化底物729(参见图7的小图701)。在一些实施例中，释放引物730与靶核酸分子723杂交(参见小图702)。在一些实施例中，释放引物730与靶核酸分子723互补，并在相对于靶捕获引物延伸复合物728的5′位置与靶核酸分子723杂交。如小图702所示，靶捕获引物延伸复合物728(附接在官能化底物729)和释放引物730两者都与靶核酸分子723杂交。

参照图7的小图703，用第三聚合酶(未显示)延伸杂交的释放引物730，从而提供了延伸释放引物731。在一些实施例中，杂交的释放引物730的延伸将延伸的靶捕获引物727从靶捕获引物延伸复合物728中释放出来。在一些实施例中，延伸的靶捕获引物727仍然附接在固体载体218上。

如图2E所示，用第四聚合酶(未显示)、第一扩增引物735，和第二扩增引物736扩增靶核酸分子723。第一扩增引物735包括与第一衔接子721互补的3′端，第二扩增引物736包括与第二衔接子722互补的3′端。在一些实施例中，第一扩增引物和第二扩增引物是通用引物。

实例使用通用人参考UHR(Agilent)RNA作为测试材料进行原理验证，输入量为25ng。使用Kapa RNA HyperPrep制备cDNA文库。使用Kapa Ribo-Erase制备rRNA消耗文库作为阳性对照。使用参考GRCh38，针对人rRNA衍生的cDNA的两条链设计毒性引物。rRNA毒性引物由98种引物(SEQ ID NO：1-98)组成，设计引物的T_m在54℃与58℃之间。搜索NCBI核苷酸存档(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore)查询″Homo sapiens″[Organism]AND″ribosomal ma″[All Fields]AND biomol_rrna[PROP]”以鉴定所有人rRNA基因。使用clustalW对核苷酸序列进行比对，以研究序列相似性。基于序列相似性，将列表归约为代表性rRNA(表1)。所有可能的长度为16-31bp的假定引物都是针对所列出的rRNA序列创建的。使用blat将引物序列比对到人参考基因组GRCh38(https：//github.com/dib-lab/ged-docs/wiki/BLAT)。基于定位位点数和熔点(＞54℃)筛选出具有良好PCR扩增性能的假定引物。选择引物跨越正链和负链上的每个rRNA靶，引物之间几乎没有重叠。捕获反应中包括毒性引物与捕获引物。靶捕获引物由152条引物组成，被设计为用于检测已知基因融合，其平均T_m为55℃。靶捕获引物伴随152条引物，设计用于在后续释放反应中从链霉亲和素释放捕获片段(“释放引物”)。捕获延伸的输入包括含毒性引物在1μM处的反应和不含毒性引物的反应作为对照。捕获延伸反应包括：1μg cDNA、Kapa 2G多重混合物(5X)、10μL BlockingOligo(37.3μM)、2μL捕获引物池(1.64nM/引物)和2μL，毒性引物池(5nM/引物)以及16μLddH₂O。捕获延伸反应使用以下热循环进行：95℃持续2分钟，80℃持续1秒，2％降至60℃持续10分钟，65℃持续2分钟并保持在4℃。通过与链霉亲和素磁性珠粒在1x结合缓冲液(100mM NaCl，10mM Tris-HCl，2％SDS)中孵育捕获延伸产物。使用洗涤缓冲液洗涤珠粒。将释放引物与珠粒捕获的靶在55℃杂交30分钟。在50℃使用sgPETE释放混合物进行释放引物延伸持续2分钟。最终释放反应使用Kapa HiFi ReadyMix进行扩增，扩增循环15次。通过使用2x150bp读段工作流程在Illumina Nextseq 500上进行测序来评估毒性引物消耗是否成功。每个样品的经解复用读段数范围从398万到1010万。为了进行生物信息学分析，用于所有样品的读段数被二次采样到350万读段。使用UMI工具使用默认设置对使用fastp过滤后的质量过滤测序读段进行去重。定位到rRNA读段的测序读段使用BWM MEM进行定位。使用STAR比对软件将剩余的非rRNA读段定位到RNA reverence Hg38。参照图8，UHR对照样品以无rRNA消耗的cDNA为输入，捕获反应中不加毒性引物。UHR不含RiboErase 1μM样品以无rRNA消耗的cDNA作为输入，并且捕获反应中含有1μM毒性引物。含有毒性引物的样品显示与对照样品(平均值为44.83％(±1.97％))相比，测序的脱靶rRNA片段丰度降低，平均为19.47％(±4.17％)。当捕获反应中包括毒性引物时，所期望的靶的数量也会增加。在二次采样的350万读段中，包含毒性引物时检测到233万(±17万)融合靶读段，对照样品中检测到105万(±8万)测序读段(图9A)。包含毒性引物导致具有相同总体测序深度的融合靶具有更高的读段深度。在本实例中，对照样品理论上将需要771万条读段才能达到与毒性引物处理相同的融合靶的读段深度(图9B)。Ribo-Erase处理的样品和包括毒性引物的Ribo-Erase处理的样品之间的％读段脱靶和未定位读段没有显著差异。因此，对于Ribo-Erase处理的样品，观察到包括毒性引物对测序度量没有负面影响(图8)。

本说明书中提到的和/或申请数据表中列出的所有美国专利、美国专利申请公开、美国专利申请、国外专利、国外专利以及非专利公开均通过引用整体并入本文。如有必要，可对实施例的各个方面进行修改，从而采用各类专利、申请和公开的概念来提供其他进一步的实施例。

尽管已经参照一些说明性实施例描述了本公开，但应当理解，本领域技术人员可以在本公开原则的精神和范围内设计出许多其他的修改和实施例。更具体地，在不违背本公开的精神的情况下，在上述公开、附图和所附权利要求的范围内，所述主题组合排列的组成部分和/或布置可以进行合理的变化和修改。除了在所述组成部分和/或布置中的变化和修改外，对于本领域技术人员来说，替代用途也将是显而易见的。

序列表

<110> 罗氏公司

罗氏诊断有限公司

罗氏测序解决方案公司

卡帕生物系统公司

<120> 在下一代测序文库的靶捕获过程中使用毒性引物对非靶文库分子进行靶向消耗

<130> P35925-WO

<140>

<141>

<150> US 63/049,255

<151> 2020-07-08

<160> 98

<170> PatentIn 版本 3.5

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 源

<223> /注=“合成毒性引物”

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<210> 2

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<212> DNA

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

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<210> 34

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 源

<223> /注=“合成毒性引物”

<400> 34

cctcctcctc ctcccc 16

<210> 35

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 源

<223> /注=“合成毒性引物”

<400> 35

ggggggctgt aacact 16

<210> 36

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 源

<223> /注=“合成毒性引物”

<400> 36

gtgggtagcc gacgtc 16

<210> 37

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 源

<223> /注=“合成毒性引物”

<400> 37

tctccagtcc gccgag 16

<210> 38

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 源

<223> /注=“合成毒性引物”

<400> 38

ctcgtgctcc acctcc 16

<210> 39

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 源

<223> /注=“合成毒性引物”

<400> 39

cgtccgacct gggtata 17

<210> 40

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 源

<223> /注=“合成毒性引物”

<400> 40

cagctatcct gagggaaac 19

<210> 41

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 源

<223> /注=“合成毒性引物”

<400> 41

ggaatgcgag tgcctag 17

<210> 42

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 源

<223> /注=“合成毒性引物”

<400> 42

ccttaacccg gcgttc 16

<210> 43

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 源

<223> /注=“合成毒性引物”

<400> 43

cacctgccga atcaact 17

<210> 44

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 源

<223> /注=“合成毒性引物”

<400> 44

gctcccgtcc actctc 16

<210> 45

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 源

<223> /注=“合成毒性引物”

<400> 45

ctcctactcg tcgcgg 16

<210> 46

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 源

<223> /注=“合成毒性引物”

<400> 46

gagaagggtt ccatgtgaa 19

<210> 47

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 源

<223> /注=“合成毒性引物”

<400> 47

ccgactgacc catgttc 17

<210> 48

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 源

<223> /注=“合成毒性引物”

<400> 48

ggattcgggg atctgaac 18

<210> 49

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 源

<223> /注=“合成毒性引物”

<400> 49

gttcgccccg agagag 16

<210> 50

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 源

<223> /注=“合成毒性引物”

<400> 50

gacgctttcc aaggca 16

<210> 51

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 源

<223> /注=“合成毒性引物”

<400> 51

ccaaggtgaa cagcctc 17

<210> 52

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 源

<223> /注=“合成毒性引物”

<400> 52

ggcttgccga cttccc 16

<210> 53

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 源

<223> /注=“合成毒性引物”

<400> 53

ctcgcgtcca gagtcg 16

<210> 54

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 源

<223> /注=“合成毒性引物”

<400> 54

taagtcggct gctaggc 17

<210> 55

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 源

<223> /注=“合成毒性引物”

<400> 55

gcgggagtaa ctatgactc 19

<210> 56

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 源

<223> /注=“合成毒性引物”

<400> 56

catgcgcgtc actaattag 19

<210> 57

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 源

<223> /注=“合成毒性引物”

<400> 57

gaataagtgg gaggccc 17

<210> 58

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 源

<223> /注=“合成毒性引物”

<400> 58

accgggtcag tgaaaaaa 18

<210> 59

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 源

<223> /注=“合成毒性引物”

<400> 59

tacacctgtc aaacggtaac 20

<210> 60

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 源

<223> /注=“合成毒性引物”

<400> 60

ttctgtcctc cctgagc 17

<210> 61

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 源

<223> /注=“合成毒性引物”

<400> 61

ccaagcgttc atagcga 17

<210> 62

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 源

<223> /注=“合成毒性引物”

<400> 62

tcacaatgat aggaagagcc 20

<210> 63

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 源

<223> /注=“合成毒性引物”

<400> 63

gttttaccct actgatgatg tg 22

<210> 64

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 源

<223> /注=“合成毒性引物”

<400> 64

ctcagccaag cacataca 18

<210> 65

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 源

<223> /注=“合成毒性引物”

<400> 65

gttggcctcg gatagc 16

<210> 66

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 源

<223> /注=“合成毒性引物”

<400> 66

gttccccacg aacgtg 16

<210> 67

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 源

<223> /注=“合成毒性引物”

<400> 67

tcgacacaag ggtttgtc 18

<210> 68

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 源

<223> /注=“合成毒性引物”

<400> 68

aggctaggac caaacctat 19

<210> 69

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 源

<223> /注=“合成毒性引物”

<400> 69

cagctcaaaa cgcttagc 18

<210> 70

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 源

<223> /注=“合成毒性引物”

<400> 70

aaggttaatc actgctgttt c 21

<210> 71

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 源

<223> /注=“合成毒性引物”

<400> 71

atagaagccg gcgtaaag 18

<210> 72

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 源

<223> /注=“合成毒性引物”

<400> 72

ttattgggga gggggtg 17

<210> 73

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 源

<223> /注=“合成毒性引物”

<400> 73

gcttagccct aaacctcaa 19

<210> 74

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 源

<223> /注=“合成毒性引物”

<400> 74

ggctcgtagt gttctgg 17

<210> 75

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 源

<223> /注=“合成毒性引物”

<400> 75

atataccgcc atcttcagc 19

<210> 76

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 源

<223> /注=“合成毒性引物”

<400> 76

tgtagccttc atcagggt 18

<210> 77

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 源

<223> /注=“合成毒性引物”

<400> 77

gaaaactacg atagccctta tg 22

<210> 78

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 源

<223> /注=“合成毒性引物”

<400> 78

gtgtgtacgc gcttca 16

<210> 79

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 源

<223> /注=“合成毒性引物”

<400> 79

agtgcacttg gacgaac 17

<210> 80

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 源

<223> /注=“合成毒性引物”

<400> 80

ggtttggggc taggtttag 19

<210> 81

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 源

<223> /注=“合成毒性引物”

<400> 81

gcaatagata tagtaccgca ag 22

<210> 82

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 源

<223> /注=“合成毒性引物”

<400> 82

cttgctatat tatgcttggt tataatt 27

<210> 83

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 源

<223> /注=“合成毒性引物”

<400> 83

ctaaaagagc acacccgt 18

<210> 84

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 源

<223> /注=“合成毒性引物”

<400> 84

cttggacaac cagctatca 19

<210> 85

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 源

<223> /注=“合成毒性引物”

<400> 85

ctaggaaaaa accttgtaga gag 23

<210> 86

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 源

<223> /注=“合成毒性引物”

<400> 86

tgagcttgaa cgctttct 18

<210> 87

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 源

<223> /注=“合成毒性引物”

<400> 87

aatgttagta taagtaacat gaaaacat 28

<210> 88

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 源

<223> /注=“合成毒性引物”

<400> 88

ttaatctgac gcaggcttat 20

<210> 89

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 源

<223> /注=“合成毒性引物”

<400> 89

gaaaggttaa aaaaagtaaa aggaac 26

<210> 90

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 源

<223> /注=“合成毒性引物”

<400> 90

aacaggcggg gtaagat 17

<210> 91

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 源

<223> /注=“合成毒性引物”

<400> 91

gttcagctgt ctcttacttt taa 23

<210> 92

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 源

<223> /注=“合成毒性引物”

<400> 92

tgttatgccc gcctct 16

<210> 93

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 源

<223> /注=“合成毒性引物”

<400> 93

gagcagaacc caacctc 17

<210> 94

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 源

<223> /注=“合成毒性引物”

<400> 94

tgtactgctc ggaggtt 17

<210> 95

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 源

<223> /注=“合成毒性引物”

<400> 95

acaatagggt ttacgacctc 20

<210> 96

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 源

<223> /注=“合成毒性引物”

<400> 96

ctgcaccatc gggatg 16

<210> 97

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 源

<223> /注=“合成毒性引物”

<400> 97

gtacgaaagg acaagagaaa taa 23

<210> 98

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 源

<223> /注=“合成毒性引物”

<400> 98

gtgggtataa tactaagttg agatg 25

Claims

1.一种在核酸分子文库中富集至少一种靶核酸分子的方法，所述方法包括：

(a)将第一靶捕获引物与所述核酸分子文库中的第一靶核酸分子杂交，其中所述第一靶捕获引物包含捕获部分；

(b)将第一毒性引物与所述核酸分子文库中的第一非靶核酸分子杂交，其中所述第一毒性引物不包含任何捕获部分；

(c)对第一杂交的靶捕获引物和第一杂交的毒性引物进行延伸，其中所述第一杂交的靶捕获引物的延伸提供包含所述第一靶核酸分子和延伸的第一靶捕获引物的第一靶捕获引物延伸复合物；以及

(d)在所述核酸分子文库中相对于所述核酸分子文库富集所述第一靶核酸分子。

2.根据权利要求1所述的方法，其中将所述第一靶捕获引物和所述第一毒性引物作为引物池添加到所述文库。

3.根据权利要求1至2所述的方法，其中所述第一杂交的毒性引物的延伸阻止所述第一靶捕获引物与所述第一非靶核酸分子杂交。

4.根据权利要求1至2所述的方法，其中所述第一杂交的毒性引物的延伸取代与所述第一非靶核酸分子杂交的第一靶引物。

5.根据权利要求1至4所述的方法，其中所述核酸分子文库中的核酸分子中的每一者均包含包括第一衔接子的第一末端和包括第二衔接子的第二末端。

6.根据权利要求5所述的方法，其进一步包括用第一扩增引物和第二扩增引物扩增所述第一靶核酸分子，其中所述第一扩增引物包含与所述第一衔接子互补的3′末端，并且其中所述第二扩增引物包含与所述第二衔接子互补的3′末端。

7.根据权利要求1所述的方法，其中相对于所述核酸分子文库富集所述第一靶核酸分子包括(i)捕获所述第一靶捕获引物延伸复合物；(i)去除未被捕获的非靶核酸分子；以及(ii)从捕获的第一靶捕获引物延伸复合物释放所述第一靶核酸分子。

8.根据权利要求7所述的方法，其中捕获所述第一靶捕获引物延伸复合物包括将所述第一靶捕获引物延伸复合物与功能化底物接触。

9.根据权利要求7所述的方法，其中捕获所述第一靶捕获引物延伸复合物包括：(i)将通用捕获寡核苷酸与所述第一靶捕获引物延伸复合物的捕获部分杂交，以形成通用捕获寡核苷酸复合物，其中所述通用捕获寡核苷酸包含(a)特异性结合实体对中的第一成员，以及(b)与所述捕获部分的捕获序列的至少一部分互补的核苷酸序列；(ii)将通用捕获复合物与功能化底物接触，其中所述功能化底物包含所述特异性结合实体对中的第二成员。

10.根据权利要求7至9所述的方法，其中去除未被捕获的核酸分子包括洗去所述未被捕获的非靶核酸分子。

11.根据权利要求7至10所述的方法，其中释放所述捕获的第一靶捕获引物延伸复合物包括：(i)将释放引物与所述第一靶核酸分子杂交；

以及(b)延伸杂交的释放引物。

12.根据权利要求1至11所述的方法，其中所述第一靶捕获引物的解链温度大于所述第一毒性引物的解链温度。

13.根据权利要求1至12所述的方法，其中所述核酸分子文库包含多种靶核酸分子和多种非靶核酸分子，其中与所述多种非靶核酸分子相比，所述多种靶核酸分子呈低丰度。

14.一种试剂盒，其包括：

(a)第一靶捕获引物，所述第一靶捕获引物与核酸分子文库中的靶核酸分子互补，并且其中所述第一靶捕获引物包含捕获部分；以及

(b)第一毒性引物，所述第一毒性引物与所述核酸分子文库中的非靶核酸分子互补，并且其中所述第一毒性引物不包含捕获部分。

15.一种组合物，其包含

(a)核酸文库，其中所述核酸文库包含多种靶核酸分子和多种非靶核酸分子，其中与所述多种非靶核酸分子相比，所述靶核酸分子呈低丰度；

(b)第一靶捕获引物，所述第一靶捕获引物与核酸分子文库中的第一靶核酸分子互补，并且其中所述第一靶捕获引物包含捕获部分；

(c)第一毒性引物，所述第一毒性引物与所述核酸分子文库中的第一非靶核酸分子互补，并且其中所述第一毒性引物不包含捕获部分；以及

(d)第一聚合酶。