JP7323703B2 - 配列決定用のｄｎａ及びｒｎａのシングルチューブ調製 - Google Patents

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Description

本開示は、核酸検出の分野に関する。より具体的には、本発明は、配列決定のための稀少核酸標的を濃縮する分野に関する。
ＤＮＡサンプル及びＲＮＡサンプルの別々の調製及び配列決定のために多くのワークフローが存在する。ＤＮＡとＲＮＡの両方から情報が望まれる場合、一部のワークフローは完全に分離されているが、他のワークフローは途中の工程で１つのワークフローとして加わることができる。いずれの場合も、単一の供給源（例えば患者サンプル）からのＤＮＡとＲＮＡの両方から情報が望まれる場合、２つの別々の検体、すなわちＤＮＡを単離するための１つ目の検体とＲＮＡを単離するための２つ目検体が必要である。これは、サンプル材料の浪費並びに労力及び試薬コストをもたらす。臨床生検サンプル、法医学サンプル又は歴史的サンプル等の貴重なサンプルの場合、ＤＮＡ及びＲＮＡの２つの別個の単離を実施するには十分な材料がない可能性がある。ＤＮＡとＲＮＡとを組み合わせたワークフローは、ＲＮＡ関連工程が（例えば変性により）ＤＮＡに害を及ぼし得る一方で、ＤＮＡ関連工程がＲＮＡに害を及ぼし得るという懸念のために非現実的であると考えられる。同じチューブ内のサンプルからＤＮＡ及びＲＮＡを確実に回収することができる堅牢な組み合わされたＲＮＡ／ＤＮＡワークフローが必要とされている。
本発明は、核酸配列決定又は他の下流分析に適したＤＮＡライブラリーを形成する方法であって、ライブラリー中の標的配列が細胞ＲＮＡ及び細胞ＤＮＡの両方に由来する方法である。ＤＮＡ及びＲＮＡ標的は単一のワークフローで同時に処理されるが、それらは、上記方法の完了後にそれぞれＤＮＡ又はＲＮＡに由来するものとして識別可能なままである。
いくつかの実施形態では、本発明は、配列決定するためのＲＮＡ及びＤＮＡ標的の混合物を調製する方法であって、ＲＮＡ及びＤＮＡ標的を含むサンプルを提供すること、ＤＮＡ変性を許容しない条件下でサンプルを標的特異的プライマーと接触させること、少なくとも１つのＲＮＡ標的にハイブリダイズした標的特異的プライマーを逆転写酵素活性を有する核酸ポリメラーゼで伸長してｃＤＮＡ鎖を形成すること、及び該サンプルをＲＮａｓｅＨ活性及び核酸末端修復活性と接触させて、二本鎖ＤＮＡと二本鎖ｃＤＮＡの混合物を形成すること、を含む方法である。標的特異的プライマーは、二本鎖ＤＮＡと二本鎖ｃＤＮＡの混合物中のｃＤＮＡ分子をＤＮＡ分子と区別するバーコードを含み得る。核酸末端修復活性は、ＤＮＡポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼ及びポリヌクレオチドキナーゼの混合物からなり得る。いくつかの実施形態では、上記方法は、ＲＮＡ及びＤＮＡ標的を断片化する予備工程を更に含む。いくつかの実施形態では、上記方法は、二本鎖ＤＮＡと二本鎖ｃＤＮＡの混合物を、１つ以上のバーコード、例えば固有の分子識別子（ＵＩＤ）及びサンプル識別子（ＳＩＤ）を有するアダプターと接触させる工程を更に含む。いくつかの実施形態では、上記方法は、配列決定の前に適応ＤＮＡを増幅した後、任意に、適応ＤＮＡを配列決定する工程を更に含む。
いくつかの実施形態では、本発明は、ＲＮＡ及びＤＮＡ標的を含むサンプルを提供すること、ＤＮＡ変性を許容しない条件下でサンプルを標的特異的プライマーと接触させること、少なくとも１つのＲＮＡ標的にハイブリダイズした標的特異的プライマーを逆転写酵素活性を有する核酸ポリメラーゼで伸長してｃＤＮＡ鎖を形成すること、及び該サンプルをＲＮａｓｅＨ活性及び核酸末端修復活性と接触させて、二本鎖ＤＮＡと二本鎖ｃＤＮＡの混合物を形成すること、を含む方法によって形成された核酸のライブラリーである。二本鎖ＤＮＡと二本鎖ｃＤＮＡの混合物は、アダプターを更に含み得る。標的特異的プライマーは、二本鎖ｃＤＮＡがバーコードの存在によって二本鎖ＤＮＡと区別できるようにバーコードを含み得る。
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載の新規方法によって配列決定のためのＲＮＡ及びＤＮＡ標的の混合物を調製するキットであって、バーコードを有する１つ以上の標的特異的プライマー、逆転写酵素活性を有する核酸ポリメラーゼ、ＲＮａｓｅＨ、３’－５－エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、ポリヌクレオチドキナーゼ、並びに任意にアダプター及びＤＮＡリガーゼを含み、該アダプターは、１つ以上の分子バーコード及びユニバーサルプライマー結合部位を含むキットである。
図１は、ワークフローの最初の部分の図である。 図２は、ワークフローの一部の図である。 図３は、ワークフローの最後の部分の図である。 図４は、細胞株サンプルに適用された混合ＤＮＡ／ＲＮＡプロトコルの実験的検証を示す。
定義
別段の定義がない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、当該技術分野の当業者によって一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，４ｔｈ Ｅｄ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ Ｐｒｅｓｓ（２０１２）を参照されたい。
以下の定義は、本開示の理解を容易にするために提供される。
「バーコード」という用語は、検出及び同定することができる核酸配列を指す。バーコードは、一般に、２ヌクレオチド以上から約５０ヌクレオチドまでの長さであり得る。バーコードは、集団中の他のバーコードとの少なくとも最小数の差を有するように設計される。バーコードは、サンプル中の各分子に固有であってもよく、又はサンプルに固有であってもよく、またサンプル中の複数の分子によって共有されてもよい。「多重識別子」、「ＭＩＤ」又は「サンプルバーコード」という用語は、サンプル又はサンプルの供給源を識別するバーコードを指す。したがって、単一の供給源又はサンプル由来の全て又は実質的に全てのＭＩＤバーコード化ポリヌクレオチドは、同じ配列のＭＩＤを共有するが、異なる供給源又はサンプル由来の全ての、又は実質的に全ての（例えば、少なくとも９０％又は９９％）ＭＩＤバーコード化ポリヌクレオチドは、異なるＭＩＤバーコード配列を有するであろう。ＭＩＤバーコードにコードされたサンプル情報を維持しながら、種々のＭＩＤを有する種々の供給源からのポリヌクレオチドを混合し、並行して配列決定することができる。「固有の分子識別子」又は「ＵＩＤ」という用語は、付着しているポリヌクレオチド識別するバーコードを指す。典型的には、ＵＩＤバーコード化ポリヌクレオチドの混合物中の全て又は実質的に全て（例えば、少なくとも９０％又は９９％）のＵＩＤバーコードは固有である。
「ＤＮＡポリメラーゼ」という用語は、デオキシリボヌクレオチドからポリヌクレオチドの鋳型指向性合成を行う酵素を指す。ＤＮＡポリメラーゼとしては、原核生物のＰｏｌ Ｉ、Ｐｏｌ ＩＩ、Ｐｏｌ ＩＩＩ、Ｐｏｌ ＩＶ及びＰｏｌ Ｖ、真核生物のＤＮＡポリメラーゼ、古細菌のＤＮＡポリメラーゼ、テロメラーゼ及び逆転写酵素が挙げられる。「熱安定性ポリメラーゼ」という用語は、熱に対して安定であり、耐熱性であり、かつ、二本鎖核酸の変性を行うのに必要な時間にわたり高温に曝された場合に、続いてポリヌクレオチド伸長反応を行うのに充分な活性を保持し、不可逆的に変性（不活性化）されない、酵素を指す。いくつかの実施形態では、以下の熱安定性ポリメラーゼを使用することができる：サーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）（Ｖｅｎｔ、ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ７２１０１）、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）（Ｐｆｕ、ＧｅｎＢａｎｋ：Ｄ１２９８３、ＢＡＡ０２３６２）、パイロコッカス・ウーゼイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｗｏｅｓｉｉ）、パイロコッカスＧＢ－Ｄ（Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ、ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ６７１３１）、サーモコッカス・コダカレンシス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ）ＫＯＤＩ（ＫＯＤ、ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＤ１７５５５３、ＢＡＡ０６１４２、サーモコッカス属種ＫＯＤ株（Ｐｆｘ、ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＥ６８７３８））、サーモコッカス・ゴルゴナリウス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ）（Ｔｇｏ、Ｐｄｂ：４６９９８０６）、スルフォロブス・ソラタリクス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌａｔａｒｉｃｕｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＣ００２７５４、Ｐ２６８１１）、アエロパイラム・ペルニクス（Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ ｐｅｒｎｉｘ）（ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＡＡ８１１０９）、アーケオグロブス・フルギダス（Ａｒｃｈａｅｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ：０２９７５３）、パイロバクルム・アエロフィラム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ）（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＬ６３９５２）、パイロディクティウム・オカルタム（Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ ｏｃｃｕｌｔｕｍ）（ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＡＡ０７５７９、ＢＡＡ０７５８０）、サーモコッカス９°Ｎｍ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ８８７６９、Ｑ５６３６６）、サーモコッカス・フミコランス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｍｉｃｏｌａｎｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＡＡ９３７３８、Ｐ７４９１８）、サーモコッカス・ヒュドロテルマリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｈｙｄｒｏｔｈｅｒｍａｌｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＡＣ１８５５５）、サーモコッカス属種ＧＥ８（ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＡＣ１２８５０）、サーモコッカス属種ＪＤＦ－３（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＸ１３５４５６、ＷＯ０１３２８８７）、サーモコッカス属種ＴＹ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＡＡ７３４７５）、パイロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ）（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｐ７７９１６）、パイロコッカス・グリコボランス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｇｌｙｃｏｖｏｒａｎｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＡＣ１２８４９）、パイロコッカス・ホリコシイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）（ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＰ１４３７７６）、パイロコッカス属種ＧＥ２３（ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＡＡ９０８８７）、パイロコッカス属種ＳＴ７００（ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＡＣ１２８４７）、サーモコッカス・パシフィカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｐａｃｉｆｉｃｕｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＸ４１１３１２．１）、サーモコッカス・ジリジイ（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｚｉｌｌｉｇｉｉ）（ＧｅｎＢａｎｋ：ＤＱ３３６６８９０）、サーモコッカス・アグレガンス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ａｇｇｒｅｇａｎｓ）、サーモコッカス・バロシイ（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｂａｒｏｓｓｉｉ）、サーモコッカス・セラー（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｃｅｌｅｒ）（ＧｅｎＢａｎｋ：ＤＤ２５９８５０．１）、サーモコッカス・プロファンダス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｐｒｏｆｕｎｄｕｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｅ１４１３７）、サーモコッカス・サイクリ（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｉｃｕｌｉ）（ＧｅｎＢａｎｋ：ＤＤ２５９８５７．１）、サーモコッカス・チオレドゥセンス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｉｏｒｅｄｕｃｅｎｓ）、サーモコッカス・オンヌリネウス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｏｎｎｕｒｉｎｅｕｓ）ＮＡ１、スルフォロブス・アキドカルダリウム（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｍ）、スルフォロブス・トコダイイ（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｔｏｋｏｄａｉｉ）、パイロバクルム・カリディフォンティス（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ｃａｌｉｄｉｆｏｎｔｉｓ）、パイロバクルム・イスランディクム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ｉｓｌａｎｄｉｃｕｍ）（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＦ２７８１５）、メタノコッカス・ヤンナスキイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｑ５８２９５）、デスルフロコッカス（Ｄｅｓｕｌｆｏｒｏｃｏｃｃｕｓ）種ＴＯＫ、デスルフロコッカス属（Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｃｏｃｃｕｓ）、パイロロブス属（Ｐｙｒｏｌｏｂｕｓ）、パイロディクティウム属（Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ）、スタフィロサーマス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｔｈｅｒｍｕｓ）、ヴァルカニザエッタ属（Ｖｕｌｃａｎｉｓａｅｔｔａ）、メタノコッカス属（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｐ５２０２５）、並びに他の個細菌のＢポリメラーゼ、例えばＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＣ６２７１２、Ｐ９５６９０１、ＢＡＡＡ０７５７９））、高温細菌サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）種（例えば、フラバス（ｆｌａｖｕｓ）、ルバー（ｒｕｂｅｒ）、サーモフィルス（ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクテウス（ｌａｃｔｅｕｓ）、ルーベンス（ｒｕｂｅｎｓ）、アクアティカス（ａｑｕａｔｉｃｕｓ））、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）、メタノテルムス・フェルウィドゥス（Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｕｓ ｆｅｒｖｉｄｕｓ）、ＫＯＤポリメラーゼ、ＴＮＡ１ポリメラーゼ、サーモコッカス属種９°Ｎ－７、Ｔ４、Ｔ７、ｐｈｉ２９、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）、Ｐ．アビシ（Ｐ．ａｂｙｓｓｉ）、Ｔ．ゴルゴナリウス（Ｔ．ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ）、Ｔ．リトラリス（Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）、Ｔ．ジリジイ（Ｔ．ｚｉｌｌｉｇｉｉ）、Ｔ属種ＧＴ、Ｐ属種ＧＢ－Ｄ、ＫＯＤ、Ｐｆｕ、Ｔ．ゴルゴナリウス（Ｔ．ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ）、Ｔ．ジリジイ（Ｔ．ｚｉｌｌｉｇｉｉ）、Ｔ．リトラリス（Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）、及びサーモコッカス属種９Ｎ－７のポリメラーゼ。いくつかの場合、核酸（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）ポリメラーゼは、改変された天然に存在するＡ型ポリメラーゼであり得る。本発明の更なる実施形態は、一般に、例えばプライマー伸長、末端修飾（例えば、末端トランスフェラーゼ、分解又は研磨）又は増幅反応における改変Ａ型ポリメラーゼが、メイオサーマス（Ｍｅｉｏｔｈｅｒｍｕｓ）属、サーモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）属又はサーモミクロビウム（Ｔｈｅｒｍｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）属の任意の種から選択され得る方法に関する。本発明の別の実施形態は、一般に、ポリメラーゼが、例えばプライマー伸長、末端修飾（（例えば、末端トランスフェラーゼ、分解又は研磨）又は増幅反応において、サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）（Ｔａｑ）、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、サーマス・カルドフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｃａｌｄｏｐｈｉｌｕｓ）、又はサーマス・フィリフォルミス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）のいずれかから単離され得る方法に関する。本発明の更なる実施形態は、一般に、改変Ａ型ポリメラーゼが、例えばプライマー伸長、末端修飾（例えば、末端トランスフェラーゼ、分解又は研磨）又は増幅反応において、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、スファエロバクター・サーモフィルス（Ｓｐｈａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ディクチオグロムス・サーモフィルム（Ｄｉｃｔｏｇｌｏｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）、又は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）から単離され得る方法を包含する。別の実施形態では、本発明は、一般に、例えば、プライマー伸長、末端修飾（例えば、末端トランスフェラーゼ、分解又は研磨）又は増幅反応において改変Ａ型ポリメラーゼが、変異Ｔａｑ－Ｅ５０７Ｋポリメラーゼであり得る方法に関する。本発明の別の実施形態は、一般に、熱安定性ポリメラーゼを使用して標的核酸の増幅を行うことができる方法に関する。
「核酸」又は「ポリヌクレオチド」という用語は、一本鎖又は二本鎖形態のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）及びそれらのポリマーを指す。具体的に限定されない限り、この用語は、参照核酸と同様の結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドと同様の様式で代謝される天然ヌクレオチドの既知の類縁体を含有する核酸を包含する。特に示されない限り、特定の核酸配列はまた、暗に、それらの保存的に修飾された変異体（例えば、縮重コドン置換体）、対立遺伝子、オルソログ、ＳＮＰ、及び相補的配列と並んで、明示された配列を包含する。
「プライマー」という用語は、一本鎖鋳型核酸分子の特定の領域に結合し、ポリメラーゼ媒介酵素反応を介して核酸合成を開始するオリゴヌクレオチドを指す。典型的には、プライマーは約１００個未満のヌクレオチドを含み、好ましくは約３０個未満のヌクレオチドを含む。標的特異的プライマーは、ハイブリダイゼーション条件下で標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする。そのようなハイブリダイゼーション条件には、等温増幅緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４）、５０ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１％ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０、ｐＨ８．８、２５℃）中、約４０℃～約７０℃の温度でのハイブリダイゼーションが含まれ得るが、これらに限定されない。標的結合領域に加えて、プライマーは、典型的には５’部分に更なる領域を有し得る。追加の領域は、ユニバーサルプライマー結合部位又はバーコードを含み得る。
「サンプル」という用語は、典型的にはＤＮＡ又はＲＮＡを含む核酸分子を含む任意の生物学的サンプルを指す。サンプルは、組織、細胞又はそれらの抽出物であり得るか、又は核酸分子の精製サンプルであり得る。「サンプル」という用語は、標的核酸を含有する、又は含有すると推定されるいずれかの組成物を指す。「サンプル」という用語の使用は、サンプル中に存在する核酸分子間の標的配列の存在を必ずしも意味しない。サンプルは、個体から単離された組織又は流体の検体、例えば、皮膚、血漿、血清、脊髄液、リンパ液、滑液、尿、涙、血球、器官及び腫瘍であってもよく、またホルマリン固定されたパラフィン包埋組織（ＦＦＰＥＴ）及びそこから単離された核酸を含む、個体から採取された細胞から確立されたｉｎ ｖｉｔｒｏ培養物のサンプルであってもよい。サンプルにはまた、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）又は循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）を含有する無細胞血液画分等の無細胞材料も含まれてもよい。サンプルを、非ヒト対象又は環境から収集することができる。
「標的」又は「標的核酸」という用語は、サンプル中の目的の核酸を指す。サンプルは、複数の標的並びに各標的の複数のコピーを含み得る。
「ユニバーサルプライマー」という用語は、ユニバーサルプライマー結合部位にハイブリダイズすることができるプライマーを指す。ユニバーサルプライマー結合部位は、非標的特異的様式で標的配列に典型的に付加される天然又は人工の配列であり得る。
核酸配列決定は、臨床現場に急速に拡大している。現在の配列決定技術は、単一分子配列決定を使用し、極めて稀な標的の検出を可能にする。核酸配列決定の臨床用途の中には、「液体細胞診（ｌｉｑｕｉｄ ｂｉｏｐｓｙ）」、例えば、従来の侵襲的生検の代わりに血液サンプルを使用する悪性腫瘍の検出及びモニタリングがある。腫瘍ＤＮＡは、単一ヌクレオチド変異又は小さい配列変異と並んで、遺伝子融合を含む変異の存在によって区別される。Ｎｅｗｍａｎ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，（２０１４）Ａｎ ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｎｇ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ＤＮＡ ｗｉｔｈ ｂｒｏａｄ ｐａｔｉｅｎｔ ｃｏｖｅｒａｇｅ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍ．３５１９を参照されたい。別の臨床用途は、少量の胎児ＤＮＡを含有する母体血液のサンプルを利用する出生前検査及び出生前診断である。より正確な配列決定の多くの用途としては、感染性疾患、分子毒性学、及び希少核酸配列の正確な検出を必要とする他の用途が挙げられる。
ＤＮＡサンプルとＲＮＡサンプルとを別々に調製するために、多くのライブラリー調製ワークフローが存在する。情報がＤＮＡ及びＲＮＡの両方から所望される場合、単一の供給源（例えば、単一患者検体）を使用することができるように、本明細書中に記載される組み合わされたワークフローを有することが特に有利である。これにより、サンプル材料の必要性が低減され、また誤差が排除される。これは、臨床血漿又はホルマリン固定パラフィン包埋組織（ＦＦＰＥＴ）サンプル、法医学サンプル、又は歴史的若しくは保管サンプル等の貴重なサンプルに特に有利である。さらに、これらの貴重なサンプルについては、ＤＮＡ及びＲＮＡについて２つの別個の単離を実施するのに十分な材料さえない可能性がある。本明細書に記載の単一の供給源からのＤＮＡ及びＲＮＡの同時分析により、第２のタイプの核酸から収集された追加の情報は有意であり得る。例えば、ＤＮＡは、単一ヌクレオチド変異体（ＳＮＶ）及びコピー数変異体（ＣＮＶ）を含む突然変異に関する情報を保持する。さらに、ＤＮＡに由来する情報は定量的であり得、すなわち、突然変異のタイプだけでなく、腫瘍サンプルにおける突然変異負荷も反映し得る。対照的に、ＲＮＡは、発現レベルの変動がゲノムにおける突然変異負荷を不明瞭にするため、突然変異に関する定性的情報を提供する。同時に、遺伝子転写は、稀な突然変異事象からのシグナルを増幅し、検出をより容易にする。ＲＮＡの分析は、両方の融合パートナー由来の野生型ＤＮＡ配列のバックグラウンドにおける遺伝子融合を検出するために特に有用である。
組み合わされたＤＮＡ／ＲＮＡワークフローは、当該技術分野の２０１７年６月１日出願の米国特許出願公開第第１５／６１１，５０７号に記載されている。本開示は、ＲＮＡ関連工程が（例えば変性により）ＤＮＡに害を及ぼすことなく、ＤＮＡとＲＮＡとの組合せワークフローを実施するのに必要な方法及び試薬を含み、現在のワークフローは、同じチューブ内のＤＮＡに対する悪影響を最小限に抑えるように最適化されている。いくつかの実施形態では、本発明は、単一チューブ内のＤＮＡとＲＮＡの混合物から配列決定ライブラリーを作製する方法を更に含む。該方法は更に、ＲＮＡに由来する断片にタグ付けすることを可能にし、次いで配列分析中にＤＮＡから分離することができる。
本発明は、サンプル中のＤＮＡ及びＲＮＡ標的核酸の同時単離及び配列決定を含む。いくつかの実施形態では、サンプルは、対象又は患者に由来する。いくつかの実施形態では、サンプルは、例えば、生検によって、対象又は患者に由来する固形組織の断片又は固形腫瘍を含むことができる。サンプルは、体液（例えば、尿、痰、血清、血漿又はリンパ、唾液、痰、汗、涙、脳脊髄液、羊水、滑液、心膜液、腹水、胸水、嚢胞液、胆汁、胃液、腸液、又は糞便サンプル）も含み得る。サンプルは、正常細胞又は腫瘍細胞が存在し得る全血又は血液画分を含み得る。いくつかの実施形態では、サンプル、特に液体サンプルは、無細胞腫瘍ＤＮＡ又は腫瘍ＲＮＡを含む無細胞のＤＮＡ又はＲＮＡ等の無細胞材料を含むことができる。いくつかの実施形態では、サンプルは、無細胞サンプル、例えば、無細胞腫瘍ＤＮＡ又は腫瘍ＲＮＡが存在する無細胞血液由来サンプルである。他の実施形態では、サンプルは、培養サンプル、例えば、培養物中の細胞又は培養物中に存在する感染因子に由来する核酸を含有するか又は含有すると疑われる培養物又は培養上清である。いくつかの実施形態では、感染性試剤は、細菌、原生動物、ウイルス、又はマイコプラズマである。
標的核酸は、サンプル中に存在する可能性がある、関心対象の核酸である。各標的は、その核酸配列を特徴とする。本発明は、１つ以上のＲＮＡ及びＤＮＡ標的の同時検出を可能にする。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ標的核酸は、遺伝子若しくは遺伝子断片（エクソン及びイントロンを含む）、又は遺伝子間領域であり、ＲＮＡ標的核酸は、標的特異的プライマーがハイブリダイズする転写物又は転写物の一部である。いくつかの実施形態では、標的核酸は、一塩基多型若しくは一塩基変異体（ＳＮＶのＳＮＰ）を含む遺伝子変異体の遺伝子座、例えば多型、又は例えば遺伝子融合をもたらす遺伝子再配列を含有する。いくつかの実施形態では、標的核酸は、バイオマーカー、すなわち、その変異体が疾患又は症状に関連する遺伝子を含む。例えば、標的核酸は、２０１５年９月１０日出願の米国特許出願第第１４／７７４，５１８号に記載されている。そのようなパネルは、ＡＶＥＮＩＯ ｃｔＤＮＡ分析キット（Ｒｏｃｈｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、カリフォルニア州プレザン）として入手可能である。他の実施形態では、標的核酸は、特定の生物に特徴的であり、生物又は薬剤感受性若しくは薬剤耐性等の病原性生物の特徴の同定を補助する。更に他の実施形態では、標的核酸は、ヒト対象の固有の特徴、例えば対象の固有のＨＬＡ又はＫＩＲの遺伝子型を定義するＨＬＡ又はＫＩＲの配列の組合せである。更に他の実施形態では、標的核酸は、免疫グロブリン（ＩｇＧ、ＩｇＭ及びＩｇＡ免疫グロブリンを含む）又はＴ細胞受容体配列（ＴＣＲ）を表す再編成された免疫配列等の体細胞配列である。更に別の用途では、標的は、胎児の疾患若しくは症状、又は妊娠に関連する母体の症状に特徴的な胎児配列を含む、母体血液中に存在する胎児配列である。
いくつかの実施形態では、標的核酸はＲＮＡ（ｍＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ウイルスＲＮＡを含む）である。他の実施形態では、標的核酸は、細胞ＤＮＡを含むＤＮＡ又は循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）を含む無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）である。標的核酸は、短い形態又は長い形態で存在し得る。より長い標的核酸は断片化され得る。いくつかの実施形態では、標的核酸は、自然にフラグメントにされており、例えば、保存されたサンプル中に見られるような、環状無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）又は化学的に分解されたＤＮＡである。
いくつかの実施形態では、本発明は、核酸単離の工程を含む。一般に、ＤＮＡ及びＲＮＡを含む単離された核酸の混合物を生じる核酸抽出の任意の方法が使用され得る。ゲノムＤＮＡ及びＲＮＡは、溶液ベース又は固相ベースの核酸抽出技術を使用して、組織、細胞、液体生検サンプル（血液又は血漿サンプルを含む）から抽出することができる。核酸抽出は、界面活性剤ベースの細胞溶解、核タンパク質の変性、及び任意に汚染物質の除去を含むことができる。保存されたサンプルからの核酸の抽出は、脱パラフィン化の工程を更に含み得る。溶液ベースの核酸抽出方法は、塩析方法又は有機溶媒法若しくはカオトロープ法を含み得る。固相核酸抽出方法は、シリカ樹脂法、陰イオン交換法又は磁性ガラス粒子、及び常磁性ビーズ（ＫＡＰＡ Ｐｕｒｅ Ｂｅａｄｓ，Ｒｏｃｈｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、カリフォルニア州プレザントン）又はＡＭＰｕｒｅビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、カリフォルニア州レア）を含み得るが、これらに限定されない。
典型的な抽出方法は、サンプル中に存在する組織材料及び細胞の溶解を含む。溶解された細胞から放出された核酸は、溶液中若しくはカラム中に存在する固体支持体（ビーズ又は粒子）、又は膜上に結合することができ、核酸は、タンパク質、脂質及びその断片を含む汚染物質をサンプルから除去するために１つ以上の洗浄工程を受けることができる。最後に、結合した核酸を固体支持体、カラム、又は膜から解放し、更なる処理の準備ができるまで適切なバッファー中に保存することができる。ＤＮＡ及びＲＮＡの両方を単離さなければならないことから、ヌクレアーゼを使用することはできず、精製プロセス中にヌクレアーゼ活性を阻害するように注意すべきである。いくつかの実施形態では、ゲノムＤＮＡ等のより長い核酸を、例えば超音波処理又は酵素的剪断によって、より小さいゲノムＤＮＡ断片に剪断又は断片化することができる。
一実施形態では、本発明は、単一のチューブ内でＤＮＡ及びＲＮＡを同時に単離し、単離されたＤＮＡ及び単離されたＲＮＡに由来する標的を含むライブラリーを形成する方法を含む。
図１を参照すると、サンプルはＲＮＡ１００及びＤＮＡ１０１を含む。ＤＮＡは、部分的に一本鎖であってもよく、すなわち、一方又は両方の末端にオーバーハングを有していてもよい。サンプルを、ＲＮＡ標的に結合するプライマー１０２と接触させる。プライマーは、ＲＮＡ分子１００の子孫を識別し、そのような子孫をＤＮＡ分子１０１及びその子孫と識別するタグ１０３を含む。プライマーはＤＮＡ標的に結合しない。いくつかの実施形態では、プライマー１０２は、遺伝子特異的プライマーである。プライマーは、その配列によってＤＮＡ標的への結合が防止され得る。他の実施形態では、プライマー１０２は、ＤＮＡ標的が二本鎖のままであり、プライマーにアクセスできない条件下でサンプルと接触している。いくつかの実施形態では、サンプルを、プライマー－ＲＮＡ結合を可能にするがＤＮＡ二本鎖変性を促進しない温度及び塩条件に維持する。いくつかの実施形態では、条件は、塩、例えば７５ｍＭ ＫＣｌ＋３ｍＭ ＭｇＣｌ２の存在下での穏やかな加熱を含む。
図１を更に参照すると、工程Ａにおいて、サンプルを逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼと接触させる。伸長プライマー１０２は、ＤＮＡ鎖１０４及びＲＮＡ鎖１０５からなるＲＮＡ－ＤＮＡハイブリッド１０６においてプライマー伸長産物１０４を形成する。
工程Ｂでは、サンプルを、ＲＮＡ－ＤＮＡハイブリッド１０６中のＲＮＡ鎖１０５を断片化するＲＮａｓｅ Ｈと接触させる。いくつかの実施形態では、ハイブリッド１０６をＲＮアーゼＨの穏やかな活性と接触させて、ＲＮＡ鎖１０５の断片化の程度を制限することが有利である。
図２を参照すると、サンプルはここで、断片化された（部分的に分解された）ＲＮＡ鎖２０２及びＤＮＡ２０１と共にＲＮＡ－ＤＮＡハイブリッド２００を含む。注目すべきことに、ＤＮＡ２０１は図１のＤＮＡ１０１と同一である。工程Ｃでは、サンプルをＤＮＡ修復酵素と接触させる。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ修復酵素は、５’－３’ポリメラーゼ活性及び３’－５’一本鎖エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、ｄｓＤＮＡ分子に５’リン酸を付加するポリヌクレオチドキナーゼ、及びｄｓＤＮＡ分子の３’末端に単一ｄＡ塩基を付加するＤＮＡポリメラーゼを含む。末端修復／Ａテイリングキットは、例えば、Ｋａｐａライブラリー調製物、ＫＡＰＡ Ｈｙｐｅｒ Ｐｒｅｐ及びＫＡＰＡ ＨｙｐｅｒＰｌｕｓを含むキット（Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、マサチューセッツ州ウィルミントン）が利用可能である。修復酵素は、部分的に分解されたＲＮＡ鎖２０２を、主に二本鎖ｃＤＮＡ分子２０３中のｃＤＮＡ鎖２０４に変換する。同じ修復酵素がＤＮＡ２０１に平滑末端を生成して平滑末端ＤＮＡ２０５を形成する。
いくつかの実施形態では、サンプルをＲＮａｓｅＨ及び修復酵素と同時に接触させる工程Ｂ及び工程Ｃが同時に行われる。
図２を更に参照すると、工程Ｄにおいて、ＤＮＡ研磨酵素及びＡテイリング酵素は、平滑末端を有する完全な二本鎖ＤＮＡを生成し、３’末端のそれぞれに単一のＡ（デオキシリボアデノシンヌクレオシド）を付加する。
図３を参照すると、工程Ｄの後、サンプルはここで完全二本鎖及びＡテイル付ｃＤＮＡ３００、並びに完全二本鎖及びＡテイル付ＤＮＡ３０１を含有する。特に、ＤＮＡ３００は、ＤＮＡの子孫からＲＮＡの子孫を同定するバーコード３０２の存在によってＤＮＡ３０１と区別可能である。ｃＤＮＡ３００及びＤＮＡ３０１は、例えば、アダプターライゲーション、増幅若しくは標的捕捉、又はユーザが所望する任意の順序の上記の任意の組合せ等の配列決定ワークフローにおける更なる工程に対して準備ができている。
いくつかの実施形態では、インプットＤＮＡ又はインプットＲＮＡは、工程Ａ（図１）の前に断片化を必要とする。そのような実施形態では、ＲＮＡは、熱と金属イオン、例えばマグネシウムの組合せによって断片化され得る。いくつかの実施形態では、サンプルをマグネシウムの存在下で１～６分間８５℃－９４℃に加熱する。（ＫＡＰＡ ＲＮＡ ＨｙｐｅｒＰｒｅｐキット、ＫＡＰＡ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ、マサチューセッツ州ウィルミントン）。ＤＮＡを、利用可能な機器（Ｃｏｖａｒｉｓ、マサチューセッツ州ウォーバン）又は酵素的手段（ＫＡＰＡ Ｆｒａｇｍｅｎｔａｓｅ Ｋｉｔ、ＫＡＰＡ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、物理的手段、例えば超音波処理によって断片化することができる。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡは損傷を受け、工程Ａ（図１）の前に前処理を必要とする。いくつかの実施形態では、ＤＮＡは、保存サンプル、例えばホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥＴ）サンプルからの部分的に損傷したＤＮＡである。いくつかの実施形態では、損傷したＤＮＡを、ウラシルＮ－ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＮＧ／ＵＤＧ）及び／又は８－オキソグアニンＤＮＡグリコシラーゼで処理する。
いくつかの実施形態では、本発明は、標的特異的プライマーを利用する。標的特異的プライマーは、標的に相補的な少なくとも一部を含む。バーコード１０３等の更なる配列が存在する場合（図１）、それらは典型的にはプライマーの５’部分に位置する。標的は、遺伝子配列（コード又は非コード）又はＲＮＡ１００（図１）中に存在する調節配列、例えばエンハンサー又はプロモーターであり得る。
いくつかの実施形態では、本発明は、アダプターライゲーションの工程を含む。アダプターは、本明細書に記載のように形成された二本鎖ＤＮＡ分子の末端に連結され得る。様々な形状及び機能のアダプターが当該技術分野で知られており、例えば、米国特許第８１５３３７５号明細書、米国特許第８８２２１５０号明細書及び国際出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１９／０５５０１５号’’Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ ｔｅｍｐｌａｔｅｓ ｆｏｒ ｓｉｎｇｌｅ－ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．’’を参照されたい。
アダプターは、二本鎖、部分的に一本鎖又は一本鎖であり得る。いくつかの実施形態では、Ｙ字形、ヘアピンアダプター又はステムループアダプターが使用され、アダプターの二本鎖部分は、本明細書に記載されるように形成された二本鎖核酸にライゲーションされる。
いくつかの実施形態では、アダプター分子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ合成人工配列である。他の実施形態では、アダプター分子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ合成天然配列である。更に他の実施形態では、アダプター分子は、分離した天然分子又は分離した非天然分子である。
いくつかの実施形態では、アダプターは、１つ以上のバーコードを含む。バーコードは、サンプルが混合（多重化）されるサンプルの源を同定するために使用される多重サンプルＩＤ（ＭＩＤ）であってもよい。バーコードはまた、各元の分子及びその子孫を同定するために使用される固有分子ＩＤ（ＵＩＤ）としても機能する。バーコードはまた、ＵＩＤとＭＩＤとの組合せであってもよい。いくつかの実施形態では、単一のバーコードが、ＵＩＤ及びＭＩＤの両方として使用される。いくつかの実施形態では、各バーコードは、所定の配列を含む。他の実施形態では、バーコードは、ランダム配列を含む。本発明のいくつかの実施形態、バーコードは、それぞれが異なる対の同一のバーコードを有する９６個～３８４個の異なるアダプターがヒトゲノムサンプルに付加されるように、約４～２０塩基長である。当業者は、バーコードの数がサンプルの複雑さ（すなわち、固有の標的分子の予想数）に依存し、各実験に適した数のバーコードを作製することができることを認識するであろう。
アダプターは、少なくとも１つのユニバーサルプライマーのプライマー結合部位を更に含む。
二本鎖又は部分的に二本鎖のアダプターオリゴヌクレオチドは、オーバーハング又は平滑末端を有することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法によって形成された二本鎖ＤＮＡは、平滑末端ライゲーションを適用して平滑末端アダプターをライゲーションすることができる平滑末端を含む。他の実施形態では、平滑末端ＤＮＡはＡテイリングを受け、単一のＡヌクレオチドが平滑末端に付加されて平滑末端から延びる単一のＴヌクレオチドを有するように設計されたアダプターに適合し、ＤＮＡとアダプターとの間のライゲーションを容易にする。アダプターライゲーションを行うための市販のキットとしては、ＡＶＥＮＩＯ ｃｔＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐキット又はＫＡＰＡ ＨｙｐｅｒＰｒｅｐ、及びＨｙｐｅｒＰｌｕｓキット（Ｒｏｃｈｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、カリフォルニア州プレザントン）が挙げられるいくつかの実施形態では、アダプター連結（適応）ＤＮＡは、過剰なアダプター及び連結されていないＤＮＡから分離され得る。
個々の分子を検出することは、通常、米国特許第７，３９３，６６５号、同第８，１６８，３８５号、同第８，４８１，２９２号、同第８，６８５，６７８号、及び同第８，７２２，３６８号に説明されているような分子バーコードを必要とする。固有の分子バーコードは、通常ｉｎ ｖｉｔｒｏ操作の最初の工程の間に患者のサンプル中の各分子に付加される、短い人工配列である。該バーコードは分子及びその子孫を標識する。固有の分子バーコード（ＵＩＤ）には複数の用途がある。バーコードは、生検なしで癌を検出及び監視するために、サンプル中の個々の核酸分子を追跡して、例えば患者の血液中の循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）分子の存在及び量を評定することを可能にする（Ｎｅｗｍａｎ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，（２０１４）Ａｎ ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｎｇ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ＤＮＡ ｗｉｔｈ ｂｒｏａｄ ｐａｔｉｅｎｔ ｃｏｖｅｒａｇｅ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍ．３５１９）。
固有の分子バーコードはまた、塩基配列決定のエラー訂正に使用することもできる。単一の標的分子の子孫全体が同じバーコードを用いて標識され、バーコードを付されたファミリーを形成する。バーコードを付されたファミリーの全メンバーによって共有されていない配列の変動は、人工物であって真の突然変異ではないとして廃棄される。ファミリー全体が元のサンプル中の単一分子を表すことから、バーコードは位置重複排除及び標的定量にも使用することができる（Ｎｅｗｍａｎ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，（２０１６）Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｄｉｇｉｔａｌ ｅｒｒｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｆｏｒ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ＤＮＡ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３４：５４７）。
いくつかの実施形態では、本発明は増幅工程を含む。本明細書に記載の方法によって調製された二本鎖ＤＮＡ断片又は任意に適合させた核酸は、配列決定の前に増幅することができる。この工程は、線形又は指数関数的増幅、例えばＰＣＲを含み得る。増幅は等温であってもよく、又は熱サイクリングを含んでもよい。いくつかの実施形態では、増幅は指数関数的であり、ＰＣＲを伴う。いくつかの実施形態では、ユニバーサルプライマー、すなわち、サンプル中の全ての標的配列上に存在するアダプター中のユニバーサルプライマー結合部位にハイブリダイズするプライマー対が使用される。ユニバーサルプライマー結合部位を含む同じアダプターを有するライブラリー内の全ての分子を、同じプライマーセットで増幅することができる。ユニバーサルプライマーが使用される増幅サイクルの数は少なくてもよいが、後続の工程に必要な生成物の量に応じて、１０、２０、又は約３０以上の高サイクルであってもよい。ユニバーサルプライマーを用いたＰＣＲは配列バイアスが低減されているため、増幅バイアスを回避するために増幅サイクルの数を限定する必要はない。
いくつかの実施形態では、上記方法は、配列決定の前に１ラウンドのみの適応核酸の増幅を含む。他の実施形態では、上記方法は、例えば本明細書に記載の濃縮又は捕捉後に、更なる増幅ラウンドを含む。
いくつかの実施形態では、本発明は、標的濃縮の工程を更に含む。いくつかの実施形態では、上記方法は、オリゴヌクレオチドプローブ（例えば、捕捉プローブ）のプールを利用する。濃縮は、サブトラクションによるものであり得、この場合、捕捉プローブは、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）又は豊富に発現される遺伝子（例えば、グロビン）を含む豊富な望ましくない配列に相補的である。サブトラクションの場合、望ましくない配列は、捕捉プローブによって捕捉され、標的核酸の溶液から除去され、例えば、固体支持体上に捕捉され得る結合部分を有する捕捉プローブを利用して廃棄される。他の実施形態では、濃縮は捕捉であり得、この場合、捕捉プローブは１つ以上の標的配列に相補的である。この場合、標的配列は、捕捉プローブによって捕捉され、例えば、固体支持体上に捕捉され得る結合部分を有する捕捉プローブを利用して溶液から除去され、一方、溶液の残りは廃棄される。
濃縮のため、捕捉プローブは、溶液中に遊離していてもよく、又は固体支持体に固定されていてもよい。プローブはまた、結合部分（例えば、ビオチン）を含み得、固体支持体（例えば、アビジン又はストレプトアビジン含有支持材料）上に捕捉され得る。
いくつかの実施形態では、本発明は中間精製工程を含む。いくつかの実施形態では、未使用のプライマー及びアダプターは、例えば、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーから選択されるサイズ選択方法によって除去される。いくつかの実施形態では、サイズ選択は、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ（カリフォルニア州ブレア）製の固相可逆固定（ＳＰＲＩ）技術を使用して行うことができる。
本明細書に開示される方法によって記載される適応核酸又はそのアンプリコンを、核酸配列決定に供することができる。塩基配列決定は、当該技術分野で公知のいずれかの方法によって行うことができる。ハイスループット単一分子シーケンシングが特に有利である。このような技術の例としては、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑプラットフォーム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、カリフォルニア州サンディエゴ）、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔプラットフォーム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ニューヨーク州グランドアイランド）、ＳＭＲＴを利用するＰａｃｉｆｉｃ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓプラットフォーム（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州メンローパーク）、又はＯｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（英国オックスフォード）若しくはＲｏｃｈｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ（カリフォルニア州サンタクララ）によって製造されるもの等のナノポア技術、及び合成による塩基配列決定を伴う若しくはそれを伴わない、いずれかの他の既存の若しくは将来のＤＮＡ塩基配列決定技術を利用するプラットフォームが挙げられる。配列決定工程は、プラットフォーム特異的シーケンシングプライマーを利用することができる。これらのプライマーの結合部位は、増幅工程で使用される増幅プライマーの５’部分に導入され得る。プライマー部位がバーコード化分子のライブラリーに存在しない場合、そのような結合部位を導入する追加の短い増幅工程を実施することができる。
いくつかの実施形態では、配列決定工程は配列解析を伴う。いくつかの実施形態では、分析は、配列アラインメントの工程を含む。いくつかの実施形態では、整列化を使用して、複数の配列、例えば、同じバーコード（ＵＩＤ）を有する複数の配列からコンセンサス配列を決定する。いくつかの実施形態では、バーコード（ＵＩＤ）は、全てが同一のバーコード（ＵＩＤ）を有する複数の配列からコンセンサスを決定するために使用される。他の実施形態では、バーコード（ＵＩＤ）は、人工産物、すなわち、同一のバーコード（ＵＩＤ）を有する一部だが全てではない配列において存在する人工物を排除するために使用される。ＰＣＲエラー又はシーケンシングエラーから生じるこのような人工物は、除去され得る。
いくつかの実施形態では、サンプル中の各配列の数は、サンプル中の各バーコード（ＵＩＤ）を有する配列の相対数を定量することによって定量することができる。各ＵＩＤは、元のサンプル中の単一の分子であり、各配列変異体と会合した異なるＵＩＤを計数することによって、元のサンプル中の各配列の分率を決定することができる。当業者は、コンセンサス配列を決定するために必要な配列読出しの数を決定することができる。いくつかの実施形態では、関連する数は、正確な定量結果のために必要なＵＩＤ（「配列深度（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄｅｐｔｈ）」）当たりの読出しである。いくつかの実施形態では、所望の深度は、ＵＩＤ当たり５～５０読出しである。
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に開示されるＲＮＡ及びＤＮＡ標的に由来する標的核酸のライブラリーである。本明細書に記載の方法によって形成されたライブラリーは、元のサンプルに存在するＲＮＡ標的に由来する分子が、元のサンプルに存在するＲＮＡ標的に由来する分子には存在しないバーコードを特徴とする二本鎖ＤＮＡ分子を含む。ライブラリー分子は、図１～図３に記載の方法工程の完了後に添加されるアダプターを更に含み得る。
実施例．１ 細胞株サンプル由来のすぐに配列決定できるＤＮＡ及びＲＮＡの同時調製
図４に記載されるデータを生成するために、最適化されたＤＮＡ／ＲＮＡワークフローを、既知の融合物（ＥＭＬ４－ＡＬＫ及びＳＬＣ３４Ａ２－ＲＯＳ１融合物）を含有する細胞株と共に細胞株ＤＮＡ／細胞株ＲＮＡブレンドに対して使用した。遺伝子特異的プライマーを使用して、逆転写中にＡＬＫ及びＲＯＳ１の関連エクソンを標的化した。上記のように、逆転写は、ＤＮＡがライブラリーを調製する能力を維持するように行った（すなわち、二本鎖に留まり、比較的損傷を受けていなかった）。逆転写後、ＲＮＡｓｅＨ処置を実施し、サンプルを、ＡＶＥＮＩＯ腫瘍組織分析キットのワークフロー（Ｒｏｃｈｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、カリフォルニア州プレザントン）の末端修復／Ａテイリング工程に採取し、ワークフローの残りを、ＡＶＥＮＩＯ腫瘍組織プロトコルを使用して実施した。この実験の目的は、サンプル内のＤＮＡから予想される深度を維持しながらＲＮＡ融合を検出できるかどうかを決定することであった。したがって、この方法を、ＤＮＡのみをインプットとして使用し、正確にはＡＶＥＮＩＯ Ｔｕｍｏｒ Ｔｉｓｓｕｅプロトコルに従う「ＤＮＡ調製物のみ（ＤＮＡ ｐｒｅｐ ｏｎｌｙ）」の方法、及び検出された融合物がＲＮＡ由来でないことを確実にするための「ＲＴ酵素なし（ｎｏ ＲＴ ｅｎｚｙｍｅ）」の条件と比較した。図４は、（１）融合物が、組み合わされたＤＮＡ／ＲＮＡ調製物でのみ検出され、予想される全ての融合物がその調製物で検出され、（２）ＤＮＡ／ＲＮＡ調製物は、最適化されたＤＮＡのみの調製物と比較してサンプル中で深度を失わないことを示す。
以下に、出願時の特許請求の範囲の記載を示す。
［請求項１］
配列決定するためのＲＮＡ及びＤＮＡ標的の混合物を調製する方法であって、
ａ）ＲＮＡ及びＤＮＡ標的を含むサンプルを提供すること、
ｂ）ＤＮＡ変性を許容しない条件下で前記サンプルを標的特異的プライマーと接触させること、
ｃ）少なくとも１つのＲＮＡ標的にハイブリダイズした前記標的特異的プライマーを、逆転写酵素活性を有する核酸ポリメラーゼで伸長してｃＤＮＡ鎖を形成すること、
ｄ）前記サンプルをＲＮａｓｅＨ活性及び核酸末端修復活性と接触させて、二本鎖ＤＮＡと二本鎖ｃＤＮＡの混合物を形成すること、
を含む、方法。
［請求項２］
前記標的特異的プライマーがバーコードを含む、請求項１に記載の方法。
［請求項３］
前記バーコードが、二本鎖ＤＮＡと二本鎖ｃＤＮＡの前記混合物中でｃＤＮＡ分子をＤＮＡ分子と区別する、請求項２に記載の方法。
［請求項４］
前記核酸末端修復活性が、ＤＮＡポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼ、及びポリヌクレオチドキナーゼの混合物からなる、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
［請求項５］
前記ＲＮＡ及びＤＮＡ標的を断片化する予備工程を更に含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
［請求項６］
前記二本鎖ＤＮＡ及び二本鎖ｃＤＮＡの混合物をアダプターと接触させて、適応ＤＮＡを形成することを更に含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
［請求項７］
前記アダプターが１つ以上のバーコードを含む、請求項６に記載の方法。
［請求項８］
前記バーコードが、固有の分子識別子（ＵＩＤ）及びサンプル識別子（ＳＩＤ）から選択される、請求項７に記載の方法。
［請求項９］
前記適応ＤＮＡを増幅し、任意に配列決定する工程を更に含む、請求項６に記載の方法。
［請求項１０］
核酸のライブラリーであって、
ＲＮＡ及びＤＮＡ標的を含むサンプルを提供すること、
ａ）ＤＮＡ変性を許容しない条件下で前記サンプルを標的特異的プライマーと接触させること、
ｃ）少なくとも１つのＲＮＡ標的にハイブリダイズした前記標的特異的プライマーを、逆転写酵素活性を有する核酸ポリメラーゼで伸長してｃＤＮＡ鎖を形成すること、
ｄ）前記サンプルをＲＮａｓｅＨ活性及び核酸末端修復活性と接触させて、二本鎖ＤＮＡと二本鎖ｃＤＮＡの混合物を形成すること、
を含む方法によって形成された、核酸のライブラリー。
［請求項１１］
二本鎖ＤＮＡと二本鎖ｃＤＮＡの前記混合物中の前記ＤＮＡがアダプターを更に含む、請求項１０に記載のライブラリー。
［請求項１２］
前記標的特異的プライマーがバーコードを含み、前記二本鎖ｃＤＮＡが、前記バーコードの存在によって前記二本鎖ＤＮＡと区別可能である、請求項１０又は１１に記載のライブラリー。
［請求項１３］
請求項１に記載の方法によって配列決定するためのＲＮＡ及びＤＮＡ標的の混合物を調製するためのキットであって、
ａ）バーコードを有する１つ以上の標的特異的プライマー、
ｂ）逆転写酵素活性を有する核酸ポリメラーゼ、
ｃ）ＲＮａｓｅＨ、
ｄ）３’－５－エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、
ｅ）ポリヌクレオチドキナーゼ、
を含む、キット。
［請求項１４］
アダプター及びＤＮＡリガーゼを更に含む、請求項１３に記載のキット。
［請求項１５］
前記アダプターが、１つ以上の分子バーコード及びユニバーサルプライマー結合部位を含む、請求項１４に記載のキット。

Claims (9)

  1. ＲＮＡ及びＤＮＡに由来する標的を含む、核酸配列決定のためのライブラリーを調製する方法であって、
    ａ）ＲＮＡ及びＤＮＡ標的を含むサンプルを提供すること、
    ｂ）ＤＮＡ変性を許容しない条件下で前記サンプルを標的特異的プライマーと接触させること、
    ｃ）少なくとも１つのＲＮＡ標的にハイブリダイズした前記標的特異的プライマーを、逆転写酵素活性を有する核酸ポリメラーゼで伸長してｃＤＮＡ鎖を形成すること、並びに、
    ｄ）前記サンプルをＲＮａｓｅＨ、並びにＤＮＡポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼ、及びポリヌクレオチドキナーゼの混合物と接触させて、二本鎖ＤＮＡと二本鎖ｃＤＮＡの混合物を形成すること、
    を含み、
    前記標的特異的プライマーがバーコードを含み、
    前記標的特異的プライマーに含まれる前記バーコードが、二本鎖ＤＮＡと二本鎖ｃＤＮＡの前記混合物中でｃＤＮＡ分子をＤＮＡ分子と区別するものである、
    前記方法。
  2. 前記ＲＮＡ及びＤＮＡ標的を断片化する予備工程を更に含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記二本鎖ＤＮＡ及び二本鎖ｃＤＮＡの混合物をアダプターと接触させて、アダプター連結ＤＮＡを形成することを更に含む、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記アダプターが１つ以上のバーコードを含む、請求項３に記載の方法。
  5. 前記アダプターに含まれる前記バーコードが、固有の分子識別子（ＵＩＤ）及びサンプル識別子（ＳＩＤ）から選択される、請求項４に記載の方法。
  6. 前記アダプター連結ＤＮＡを増幅し、任意に配列決定する工程を更に含む、請求項３～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 請求項１～６のいずれか１項に記載の核酸配列決定のためのライブラリーを調製する方法において使用するためのキットであって、
    ａ）バーコードを有する１つ以上の標的特異的プライマー、
    ｂ）逆転写酵素活性を有する核酸ポリメラーゼ、
    ｃ）ＲＮａｓｅＨ、
    ｄ）３’－５－エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、及び、
    ｅ）ポリヌクレオチドキナーゼ、
    を含む、キット。
  8. アダプター及びＤＮＡリガーゼを更に含む、請求項７に記載のキット。
  9. 前記アダプターが、１つ以上の分子バーコード及びユニバーサルプライマー結合部位を含む、請求項８に記載のキット。
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