CN114269917A - 用于测序的dna和rna的单管制备 - Google Patents

用于测序的dna和rna的单管制备 Download PDF

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Abstract

本发明是用于同时地从存在于样品中的DNA和RNA形成用于核酸测序的文库的方法和组合物。

Description

用于测序的DNA和RNA的单管制备
技术领域
本发明涉及核酸测序领域。更具体地，本发明涉及富集用于测序的罕见核酸靶标的领域。
背景技术
对于DNA样品和RNA样品的单独制备和测序，存在许多工作流程。当需要从DNA和RNA两者获取信息时，一些工作流程是完全独立的，而其他工作流程可能会在过程中的某个步骤作为一个工作流程加入。在任一种情况下，如果需要从来自单一来源(例如患者样品)的DNA和RNA两者获取信息，则需要两个单独的样本，一个用于分离DNA，另一个用于分离RNA。这导致样品材料以及劳动力和试剂成本的浪费。对于珍贵的样品，诸如临床活检样品、法医样品或历史样品，可能没有足够的材料来对DNA和RNA执行两次单独的分离。出于对RNA相关步骤可能会损害DNA(例如通过变性)，而DNA相关步骤可能会损害RNA的担心，组合的DNA和RNA工作流程被认为是不明智的。需要一种稳健的组合型RNA/DNA工作流程，其将会可靠地从同一试管中的样品中回收DNA和RNA。
发明内容
本发明是一种形成适用于核酸测序或其他下游分析的DNA文库的方法，其中文库中的靶标序列来源于细胞RNA和细胞DNA。尽管DNA和RNA靶标在单个工作流程中同时处理，但在完成该方法后，它们仍可区分为分别源自DNA或RNA。
在一些实施例中，本发明是制备用于测序的RNA和DNA靶标混合物的方法，该方法包括：提供包含RNA和DNA靶标的样品；在不允许DNA变性的条件下使所述样品与靶标特异性引物接触；用具有反转录酶活性的核酸聚合酶延伸与至少一个RNA靶标杂交的靶标特异性引物以形成cDNA链；以及使所述样品与RNaseH活性及核酸末端修复活性接触以形成双链DNA和双链cDNA混合物。靶标特异性引物可以包括条形码，该条形码将双链DNA和双链cDNA混合物中的cDNA分子与DNA分子区分开。核酸末端修复活性可由DNA聚合酶、核酸外切酶和多核苷酸激酶的混合物组成。在一些实施例中，该方法进一步包括对RNA和DNA靶标进行片段化的预备步骤。在一些实施例中，该方法进一步包括使双链DNA和双链cDNA混合物与具有一个或多个条形码的衔接子接触，该一个或多个条形码例如唯一分子标识符(UID)和样品标识符(SID)。在一些实施例中，该方法进一步包括在测序前对衔接的DNA进行扩增之后任选地对衔接的DNA进行测序的步骤。
在一些实施例中，本发明是一种核酸文库，该核酸文库由包含以下各项的方法形成：提供包含RNA和DNA靶标的样品；在不允许DNA变性的条件下使所述样品与靶标特异性引物接触；用具有反转录酶活性的核酸聚合酶延伸与至少一个RNA靶标杂交的靶标特异性引物以形成cDNA链；以及使所述样品与RNaseH活性及核酸末端修复活性接触以形成双链DNA和双链cDNA混合物。双链DNA和双链cDNA混合物可以进一步包括衔接子。靶标特异性引物可以包括条形码，使得双链cDNA可通过条形码的存在与双链DNA区分。
在一些实施例中，本发明是一种用于通过本文描述的新颖的方法制备用于测序的RNA和DNA靶标混合物的试剂盒，该试剂盒包括：一个或多个靶标特异性引物，其具有条形码；核酸聚合酶，其具有反转录酶活性；RNaseH；DNA聚合酶，其具有3′-5-核酸外切酶活性；多核苷酸激酶并且任选地，衔接子和DNA连接酶，其中该衔接子包括一个或多个分子条形码和通用引物结合位点。
附图说明
图1是工作流程初始部分的示意图。
图2是部分工作流程的示意图。
图3是工作流最后部分的示意图。
图4示出了应用于细胞系样品的组合的DNA/RNA协议的实验验证。
具体实施方式
定义
除非另有定义，否则本文所用的科学技术术语具有如本领域的普通技术人员通常理解的相同意义。参见，Sambrook等天.，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第4th版，冷泉港实验室出版社(2012)。
提供以下定义以促进对本公开的理解。
术语“条形码”是指可被检测和鉴定的核酸序列。条形码通常可以为2个以上且最长可达约50个核苷酸。条形码被设计成与群体中的其他条形码具有至少最小数量的差异。条形码对于样品中的每个分子可以为唯一的，或对样品是唯一的，并且由样品中的多个分子共享。术语“多重标识符”、“MID”或“样品条形码”是指识别样品或样品来源的条形码。就此而言，来自单一来源或样品的所有或基本上所有的MID条形码化的多核苷酸将共享相同序列的MID；而来自不同来源或样品的所有或基本上所有(例如，至少90％或99％)的MID条形码化的多核苷酸将具有不同的MID条形码序列。可以将来自具有不同MID的不同来源的多核苷酸进行混合并进行并行测序，同时保持MID条形码中编码的样品信息。术语“唯一分子标识符”或“UID”是指识别与其附接的多核苷酸的条形码。通常，UID条形码化的多核苷酸混合物中的所有或基本上所有(例如，至少90％或99％)的UID条形码是唯一的。
术语“DNA聚合酶”是指从脱氧核苷酸执行模板导向合成多核苷酸的酶。DNA聚合酶包括原核Pol I、Pol II、Pol III、Pol IV和Pol V，真核DNA聚合酶，古细菌DNA聚合酶、端粒酶和反转录酶。术语“热稳定聚合酶”是指对热稳定的酶，它是耐热的，当在高温下经过实现双链核酸变性所需要的时间后，其保留足够的活性以实现随后的多核苷酸延伸反应，并且不会不可逆变性(失活)。在一些实施例中，可以使用以下热稳定的聚合酶：嗜热高温球菌(Thermococcus litoralis)(Vent，GenBank：AAA72101)、强烈火球菌属(Pyrococcusfuriosus)(Pfu，GenBank：D12983，BAA02362)、沃氏热球菌，火球菌属(fyrococcus woesii，Pyrococcus)GB-D(Deep Vent，GenBank：AAA67131)、超好热古细菌(Thermococcuskodakaraensis) KODI(KOD，GenBank：BD175553，BAA06142；高温球菌属(Thermococcus)sp.菌株KOD(Pfx，GenBank：AAE68738))、嗜热古细菌(Thermococcus gorgonarius)(Tgo，Pdb：4699806)、硫化叶菌(Sulfolobus solataricus)(GenBank：NC002754，P26811)、敏捷气热菌(Aeropyrum pernix)(GenBank：BAA81109)、灰古菌(Archaeglobus fulgidus)(GenBank：029753)、耐超高温热棒菌(Pyrobaculum aerophilum)(GenBank：AAL63952)、隐蔽热网菌(Pyrodictium occultum)(GenBank：BAA07579，BAA07580)、高温球菌属9度Nm(GenBank：AAA88769，Q56366)、烟曲霉热球菌(Thermococcus fumicolans)(GenBank：CAA93738，P74918)、热水管盐水球形热球菌(Thermococcus hydrothermalis)(GenBank：CAC18555)、高温球菌属sp.GE8(GenBank：CAC12850)、高温球菌属sp.JDF-3(GenBank：AX135456、WO0132887)、高温球菌属sp.TY(GenBank：CAA73475)、深海火球菌属(Pyrococcus abyssi)(GenBank：P77916)、食糖火球菌属(Pyrococcus glycovorans)(GenBank：CAC12849)、掘越氏火球菌属(Pyrococcus horikoshii)(GenBank：NP 143776)、火球菌属sp.GE23(GenBank：CAA90887)、火球菌属sp.ST700(GenBank：CAC 12847)、深海热液区超嗜热古菌(Thermococcus pacificus)(GenBank：AX411312.1)、齐利热球菌(Thermococcuszilligii)(GenBank：DQ3366890)、聚集热球菌(Thermococcus aggregans)、巴罗西热球菌(Thermococcus barossii)、速生热球菌(Thermococcus celer)(GenBank：DD259850.1)、深嗜热球菌(Thermococcus profundus)(GenBank：E14137)，西古里热球菌(Thermococcussiculi)(GenBank：DD259857.1)、硫还原热球菌(Thermococcus thioreducens)、纽氏热球菌(Thermococcus onnurineus)NA1、嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarium)、硫叶菌(Sulfolobus tokodaii)、卡利迪丰焦杆菌(Pyrobaculum calidifontis)、冰岛热棒菌(Pyrobaculum islandicum)(GenBank：AAF27815)、詹氏甲烷球菌(Methanococcusjannaschii)(GenBank：Q58295)、脱硫球菌属种TOK、除硫球菌属(Desulfurococcus)、火叶菌属(Pyrolobus)、嗜热菌(Pyrodictium)、葡萄热菌属(Staphylothermus)、埃塔火神杆菌(Vulcanisaetta)、产甲烷球菌属(Methanococcus)(GenBank：P52025)和其他古细菌B聚合酶，例如GenBank AAC62712、P956901、BAAA07579))、嗜热细菌栖热菌属(Thermus)种(例如，黄曲霉(flavus)、红色红曲菌(ruber)、嗜热链球菌(thermophilus)、乳白耙菌(lacteus)、红色栖热菌(rubens)、水生菌(aquaticus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)、海栖热袍菌(Thermotoga maritima)、甲烷嗜热菌(Methanothermusfervidus)、KOD聚合酶、TNA1聚合酶、高温球菌属sp.9度N-7、T4、T7、phi29、强烈火球菌属(Pyrococcus furiosus)、深海热球菌(P.Abyssi)、嗜热古细菌(T.Gorgonarius)、嗜热高温球菌(T.Litoralis)、齐利热球菌(T.zilligii)、T.sp.GT，P.sp.GB-D、KOD、Pfu、嗜热古细菌、齐利热球菌、嗜热高温球菌和高温球菌属sp.9N-7聚合酶。在一些情况下，核酸(例如DNA或RNA)聚合酶可以是经修饰的天然存在的A型聚合酶。本发明的另外的实施例通常涉及一种方法，其中例如在引物延伸、末端修饰(例如末端转移酶、降解或补平)或扩增反应中，经修饰的A型聚合酶可以选自以下任何属的任何种：亚栖热菌属(Meiothermus)、热袍菌门(Thermotoga)或嗜热菌属(Thermomicrobium)。本发明的另一实施例通常从属于一种方法，其中例如在引物延伸、末端修饰(例如末端转移酶、降解或补平)或扩增反应中，聚合酶可以从以下任一种分离栖热水生菌(Thermus aquaticus)(Taq)、嗜热栖热菌(Thermusthermophilus)、嗜钙质热菌(Thermus caldophilus)或丝状栖热菌(Thermusfiliformis)。本发明的另外的实施例通常涵盖一种方法，其中例如在引物延伸、末端修饰(例如末端转移酶、降解或补平)或扩增反应中，修饰的A型聚合酶可以从以下分离：嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜热球形杆菌(Sphaerobacter thermophilus)、嗜热链球菌(Dictoglomusthermophilum)或大肠杆菌(Escherichia coli)。在另外的实施例中，本发明通常涉及一种方法，其中例如在引物延伸、末端修饰(例如末端转移酶、降解或补平)或扩增反应中，修饰的A型聚合酶可以为突变Taq-E507K聚合酶。本发明的另一实施例通常从属于一种方法，其中热稳定聚合酶可用于引起靶标核酸的扩增。
术语“核酸”或“多核苷酸”是指单链形式或双链形式的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其聚合物。除非特别限定，否则该术语涵盖包含天然核苷酸的已知类似物的核酸，该天然核苷酸具有与参考核酸相似的结合特性并且以与天然存在的核苷酸相似的方式进行代谢。除非另外指出，否则特定的核酸序列还隐含地涵盖其保守修饰的变体(例如，简并密码子替换)、等位基因、同源基因序、SNP和互补序列，以及明确指出的序列。
术语“引物”是指与单链模板核酸分子的特定区域结合并通过聚合酶介导的酶促反应启动核酸合成的寡核苷酸。通常，引物包括少于约100个核苷酸，且优选包括少于约30个核苷酸。靶标特异性引物在杂交条件下与靶标多核苷酸特异性杂交。此类杂交条件可包括但不限于在等温扩增缓冲液中(20mM的Tris-HCl，10mM的(NH4)2SO4)、50mM的KCl、2mM的MgSO4、0.1％的
Figure BDA0003509142220000061
20、25℃下pH为8.8)在约40℃至约70℃的温度下进行杂交。除了靶标结合区域外，引物可以具有附加区域，通常位于5′-部分。附加区域可以包括通用引物结合位点或条形码。
术语“样品”是指包括核酸分子的任何生物样品，通常包括DNA或RNA。样品可以是组织、细胞或其提取物，或者可以是核酸分子的纯化样品。术语“样品”是指任何含有或假定含有靶核酸的组合物。使用术语“样品”并不一定意味着在存在于样品中的核酸分子中存在靶标序列。该样品可以为包括从个体分离的组织或液体的样本，例如，皮肤、血浆、血清、脊髓液、淋巴液、滑液、尿液、泪液、血液细胞、器官和肿瘤，也指从取自个体的细胞建立的体外培养物的样品，包括福尔马林固定石蜡包埋组织(FFPET)和自其分离的核酸。样品也可包括不含细胞的材料，诸如含有无细胞DNA(cfDNA)或循环肿瘤DNA(ctDNA)的不含细胞的血液级分(fraction)。样品可以从非人类受试者或从环境中收集。
术语“靶标”或“靶标核酸”是指样品中的目标核酸。样品可能包含多个靶标以及每个靶标的多个拷贝。
术语“通用引物”是指可以与通用引物结合位点杂交的引物。通用引物结合位点可以是通常以非靶标特异性方式添加到靶标序列的天然或人工序列。
核酸测序正在迅速扩展到临床实践中。当前的测序技术采用单分子测序并允许检测极其罕见的靶标。核酸测序的临床应用“液体活检”(例如使用血液样品检测和监测恶性肿瘤)来代替统的侵入性活检。肿瘤DNA的特征在于突变的存在，包括单核苷酸变异或小序列变异以及基因融合。参见Newman，A.，等人.，(2014)An ultrasensitive method forquantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage，NatureMedicine doi：10.1038/nm.3519.另一个临床应用是利用含有少量胎儿DNA的母体血液样品进行产前检测和产前诊断。更多精密测序应用包括传染病、分子毒理学和其他需要准确检测罕见核酸序列的应用。
对于单独制备DNA样品和RNA样品存在许多文库制备工作流程。当需要来自DNA和RNA的信息时，具有如本文所述的组合工作流程尤其有利，因此可以使用单一来源(例如，单一患者样本)。这减少了对样品材料的需求并消除了错误。这对于珍贵样品尤其有利，例如临床血浆或福尔马林固定石蜡包埋组织(FFPET)样品、法医样品、或者历史或档案样品。此外，对于这些珍贵的样品，甚至可能没有足够的材料来对DNA和RNA进行两次单独的分离。利用如本文所描述的同时分析来自单一来源的DNA和RNA，从第二类核酸收集的附加信息可能很有意义。例如，DNA保存有关突变的信息，包括单核苷酸变异(SNV)和拷贝数变异(CNV)。此外，来源于DNA的信息可以是定量的，即不仅反映突变的类型，还反映肿瘤样品中的突变负荷。相比之下，RNA提供了关于突变的定性信息，因为不同的表达水平掩盖了基因组中的突变负荷。同时，基因转录放大了来自罕见突变事件的信号，使其更容易被检测到。RNA分析对于检测来自两个融合配偶体的野生型DNA序列背景中的基因融合尤其有用。
组合的DNA/RNA工作流程在本领域是已知的，于2017年6月1日递交的美国申请Ser.第15/611,507。本公开内容包括在不允许RNA相关步骤损害DNA(例如通过变性)的情况下执行组合的DNA和RNA工作流程所必需的方法和试剂，并且已经优化了当前工作流程以最小化对相同试管内的DNA的任何负面影响。在一些实施例中，本发明进一步包括在单管中从DNA和RNA混合物产生测序文库的方法。该方法还能够标记源自RNA的片段，然后在序列分析期间可以将该片段与DNA分离。
本发明包括对样品中DNA和RNA靶标核酸同时进行分离和测序。在一些实施例中，该样品获自受试者或患者。在一些实施例中，该样品可包括例如通过活检而获自该受试者或患者的固体组织或实体肿瘤的片段。所述样品还可包括体液(例如尿液、痰、血清、血浆或淋巴、唾液、痰、汗液、泪液、脑脊液、羊水、滑液、心包液、腹膜液、胸膜液、囊液、胆汁、胃液、肠液或粪便样品)。样品可以包括全血或其中可能存在正常细胞或肿瘤细胞的血液级分。在一些实施例中，该样品，特别是液体样品可包括无细胞材料，诸如无细胞DNA或RNA，包括无细胞肿瘤DNA或肿瘤RNA。在一些实施例中，该样品是无细胞样品，例如，存在无细胞肿瘤DNA或肿瘤RNA的无细胞血源性样品。在其他实施例中，样品是培养样品，例如，培养物或者含有或疑似含有来源于培养物中的细胞或培养物中存在的感染源的核酸的培养物上清液。在一些实施例中，该感染源为细菌、原生动物、病毒或支原体。
靶标核酸是样品中可能存在的目标核酸。每个靶标的特征在于其核酸序列。本发明能够同时检测一种或多种RNA和DNA靶标。在一些实施例中，DNA靶标核酸是基因或基因片段(包括外显子和内含子)或基因间区域，并且RNA靶标核酸是靶标特异性引物与之杂交的转录本或转录本的一部分。在一些实施例中，该靶标核酸包括遗传性变体的基因座，例如，多态性，包括单核苷酸多态性或变型(SNV的SNP)，或导致例如基因融合的基因重排。在一些实施例中，靶标核酸包括生物标志物，即基因，该基因的变体与疾病或病症相关。例如，靶标核酸可以选自于2015年9月10日递交的美国专利申请Ser.第14/774,518号中描述的疾病相关标志物组合。此类组合可作为AVENIO ctDNA分析试剂盒(罗氏测序解决方案公司，普莱森顿，如州)提供。在其他实施例中，靶标核酸具有特定生物体的特征并有助于识别生物体，或者具有病原生物体的特征，例如药物敏感性或耐药性。在其他实施例中，该靶标核酸具有人受试者的独特特征，例如，界定该受试者的独特HLA或KIR基因型的HLA或KIR序列的组合。在其他实施例中，靶标核酸是体细胞序列，例如代表免疫球蛋白(包括IgG、IgM和IgA免疫球蛋白)或T细胞受体序列(TCR)的重排免疫序列。在又一应用中，靶标是存在于母体血液中的胎儿序列，包括胎儿疾病或病症或与妊娠相关的母体病症的特征的胎儿序列。
在一些实施例中，靶标核酸是RNA(包括mRNA、微小RNA、病毒RNA)。在其他实施例中，靶标核酸是包括细胞DNA的DNA或包括循环肿瘤DNA(ctDNA)的无细胞DNA(cfDNA)。靶标核酸可以以短形式或长形式存在。可以将更长的靶标核酸片段化。在一些实施例中，靶核酸是天然片段化的，例如，循环无细胞DNA(cfDNA)或化学降解的DNA，诸如在保存的样品中发现的一种。
在一些实施例中，本发明包括核酸分离步骤。通常，可以使用产生包括DNA和RNA的分离核酸混合物的任何核酸提取方法。可以使用基于溶液或基于固相的核酸提取技术从组织、细胞、(包括血液或血浆样品)的液体活检样品提取基因组DNA和RNA。核酸提取可包含基于洗涤剂的细胞裂解、核蛋白质变性，以及任选地去除污染物。从保藏样品中提取核酸还可以包括脱蜡步骤。基于溶液的核酸提取方法可以包括盐析法、或者有机溶剂或离液剂法。固相核酸提取方法可以包括但不限于二氧化硅树脂法、阴离子交换法或磁性玻璃颗粒和顺磁珠(KAPA纯珠、罗氏测序解决方案公司，普莱森顿，加州)或AMPure珠(贝克曼库尔特，布雷亚市，加州。)
典型的提取方法包含裂解样品中存在的组织材料和细胞。从裂解的细胞中释放的核酸可以与存在于溶液或柱或膜中的固体支持物(珠或颗粒)结合，其中核酸可以经历一个或多个洗涤步骤以从样品中去除包括蛋白质、脂质及其片段在内的污染物。最后，结合的核酸可以从固体支持物、柱或膜中释放，并存储在相应的缓冲液中直到准备进一步处理。因为必须分离DNA和RNA，所以不可以使用核酸酶，在纯化过程中应当注意抑制任何核酸酶活性。在一些实施例中，例如通过超声或酶剪切，可以将诸如基因组DNA的较长的核酸剪切或片段化成较小的基因组DNA片段。
在一个实施例中，本发明包括在单管中同时分离DNA和RNA并形成包含源自分离的DNA和分离的RNA的靶标文库的方法。
参考图1，样品包括RNA 100和DNA 101。DNA可以是部分单链的，即在一端或两端具有突出端。样品与结合RNA靶标的引物102接触。引物包括识别RNA分子100的子代并将此类子代与DNA分子101及其子代区分开来的标签103。引物不与DNA靶标结合。在一些实施例中，引物102是基因特异性引物。可以借助引物的序列防止引物与DNA靶标结合。在其他实施例中，引物102在DNA靶标保持双链且引物不可接近的条件下接触样品。在一些实施例中，将样品维持在允许引物-RNA结合但不利于DNA双链体变性的温度和盐条件下。在一些实施例中，条件包括在例如75mM KCl+3mM MgCl2的盐存在下温和加热。
进一步参考图1，在步骤A中，样品与具有反转录酶活性的DNA聚合酶接触。延伸引物102在由DNA链104和RNA链105组成的RNA-DNA杂交体106中形成引物延伸产物104。
在步骤B中，样品与RNase H接触，RNase H将RNA-DNA杂交体106中的RNA链105片段化。在一些实施例中，以RNase H的温和活性接触杂交体106以限制RNA链105的片段化程度是有利的。
参考图2，现在样品包含带有片段化(部分降解)的RNA链202和DNA 201的RNA-DNA杂交体200。显然，DNA 201与图1中的DNA 101相同。在步骤C中，样品与DNA修复酶接触。在一些实施例中，DNA修复酶包括具有5′-3′聚合酶活性和3′-5′单链核酸外切酶活性的DNA聚合酶、将5′磷酸盐添加到dsDNA分子的多核苷酸激酶以及在dsDNA分子的3′末端添加单个dA碱基的DNA聚合酶。末端修复/A加尾试剂盒是可获得的，例如Kapa文库制备、包括KAPA HyperPrep和KAPA HyperPlus(Kapa生物，威明顿市，马萨诸塞州)的试剂盒。修复酶将部分降解的RNA链202转化为大部分双链cDNA分子203中的cDNA链204。相同的修复酶在DNA 201中创建平末端以形成平末端DNA 205。
在一些实施例中，步骤B和步骤C同时发生，其中样品同时与RNaseH和修复酶接触。
进一步参考图2，在步骤D中，DNA补平和A加尾酶创建具有平末端的完全双链DNA，并将单个A(脱氧核糖腺苷)添加至每个3′末端。
参考图3，在步骤D之后，现在样品包含全双链和A加尾的cDNA 300以及全双链和A加尾的DNA 301。显然，DNA 300可通过条形码302的存在与DNA 301区分，该条形码302将RNA的子代与DNA的子代识别开来。cDNA 300和DNA 301准备好用于测序工作流程中的进一步的步骤，例如衔接子连接、扩增或靶标捕获或以用户期望的任何顺序进行的前述步骤的任何组合。
在一些实施例中，输入DNA或输入RNA在步骤A之前需要进行片段化(图1)。在此类实施例中，RNA可以通过热和例如镁的金属离子组合来片段化。在一些实施例中，在镁存在下将样品加热至85°-94°℃持续1-6分钟。(KAPA RNA HyperPrep试剂盒，KAPA生物，威尔明顿，马萨诸塞州)。DNA可以通过物理手段进行片段化，例如超声，使用可获得的仪器(Covaris，沃本马萨诸塞州)或酶的手段(KAPA片段化酶试剂盒，KAPA生物)。
在一些实施例中，DNA受损并且在步骤A之前需要进行预处理(图1)。在一些实施例中，DNA是来自保藏样品的部分受损DNA，例如福尔马林固定石蜡包埋(FFPET)样品。在一些实施例，用尿嘧啶N-DNA糖基化酶(UNG/UDG)和/或8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶处理受损DNA。
在一些实施例中，本发明利用靶标特异性引物。靶标特异性引物包括与靶标互补的至少一部分。如果存在额外的序列，例如条形码103(图1)，它们通常位于引物的5′部分。靶标可以是基因序列(编码或非编码)或存在于RNA 100(图1)中的调控序列，例如增强子或启动子。
在一些实施例中，本发明包括衔接子连接步骤。衔接子可以连接到如本文所描述的形成的双链DNA分子的末端。各种形状和功能的衔接子在本领域中是已知的，参见例如US8153375、US8822150和Ser.PCT/EP2019/055015号国际申请“用于单分子测序的双链DNA模板的生成。”
衔接子可以是双链的、部分单链的或单链的。在一些实施例中，使用Y形、发夹衔接子或茎环衔接子，其中衔接子的双链部分连接至如本文所描述的形成的双链核酸。
在一些实施例中，衔接子分子为在体外合成的人工序列。在其他实施例中，所述衔接子分子是在体外合成的天然存在的序列。在其他实施例中，衔接子分子为分离的天然存在的分子或分离的非天然存在的分子。
在一些实施例中，衔接子包括一个或多个条形码。条形码可以是在样品被混合(多重化)的情况下用于鉴定样品来源的多重样品ID(MID)。条形码也可以作为唯一的分子ID(UID)，用于鉴定每个原始分子及其子代。条形码也可以是UID和MID的组合。在一些实施例中，将单个条形码用作UID和MID。在一些实施例中，每个条形码包括预定义序列。在其他实施例中，条形码包括随机序列。在本发明的一些实施例中，条形码的长度在约4-20个碱基之间，从而将96个到384个不同的衔接子添加到人类基因组样品中，每个衔接子具有不同的相同条形码对。普通技术人员会认识到条形码的数量取决于样品的复杂性(即，唯一靶标分子的预期数量)，并且将能够为每个实验创建合适数量的条形码。
该衔接子进一步包括用于至少一种通用引物的引物结合位点。
双链或部分双链衔接子寡核苷酸可具有突出端或平末端。在一些实施例中，通过本文所述的方法形成的双链DNA包括平末端，平末端连接可应用于该平末端以连接平末端衔接子。在其他实施例中，平末端DNA经历A加尾，其中将单个A核苷酸添加到平末端以匹配衔接子，该衔接子设计为具有从平末端延伸的单个T核苷酸以促进DNA和衔接子之间的连接。用于执行衔接子连接的可商购试剂盒包括AVENIO ctDNA文库制备试剂盒、或KAPAHyperPrep和HyperPlus试剂盒(罗氏测序解决方案公司，普莱森顿，加州)。在一些实施例中，衔接子连接的(衔接的)DNA可以从过量的衔接子和未连接的DNA分离。
检测单个分子通常需要分子条形码，诸如美国专利号7,393,665、8,168,385、8,481,292、8,685,678和8,722,368中所描述的。唯一分子条形码是短人工序列，其通常在体外操作的最初步骤中添加到患者样品中的每个分子上。所述条形码标记了分子及其子代。所述唯一分子条形码(UID)有多种用途。条形码允许跟踪样品中的每个单个核酸分子，以评估例如患者的血液中循环肿瘤DNA(ctDNA)分子的存在和数量，以便在不进行活检的情况下检测和监测癌症(Newman，A.，等人.，(2014)An ultrasensitive method forquantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage，NatureMedicine doi：10.1038/nm.3519)。
唯一分子条形码也可用于测序纠错。单个靶分子的整个子代都用相同的条形码标记，并形成条形码家族。不被带条形码家族的所有成员共享的序列变异被作为伪像丢弃而不是真突变。条形码还可用于位置去重(positional deduplication)和靶标量化，因为整个家族代表原始样品中的单个分子(Newman，A.，等人.，(2016)Integrated digital errorsuppression for improved detection of circulating tumor DNA，NatureBiotechnology 34：547)。
在一些实施例中，本发明包括扩增步骤。通过本文所描述的方法制备的双链DNA片段或任选地经过衔接的核酸可以在测序之前进行扩增。该步骤可以涉及线性或指数扩增，例如PCR。扩增可以是等温的或涉及热循环。在一些实施例中，扩增是指数的并且涉及PCR。在一些实施例中，使用通用引物，即与样品中所有靶序列上存在的衔接子中的通用引物结合位点杂交的一对引物。文库中具有包含通用引物结合位点的相同衔接子的所有分子可以用同一组引物进行扩增。使用通用引物的扩增循环的数量可以较低，但也可以为10个、20个或高达约30个或更多个循环，这取决于后续步骤所需的产物量。由于使用通用引物的PCR降低了序列偏倚，因此无需为了避免扩增偏倚而限制扩增循环数。
在一些实施例中，该方法包括在测序之前仅对衔接的核酸进行一轮扩增。在其他实施例中，该方法包括例如在如本文所描述的富集或捕获之后额外的扩增轮次。
在一些实施例中，本发明进一步包括靶标富集步骤。在一些实施例中，该方法利用寡核苷酸探针(例如，捕获探针)库。可以通过差减法进行富集，在这种情况下，捕获探针与包括核糖体RNA(rRNA)或大量表达的基因(例如珠蛋白)的大量不需要的序列互补。在差减法的情况下，例如利用具有可捕获在固体支持物上的结合部分的捕获探针，不需要的序列由捕获探针捕获并从靶标核酸溶液中去除并丢弃。在其他实施例中，富集可以是捕获，在这种情况下，捕获探针与一个或多个靶标序列互补。在这种情况下，例如利用具有可以捕获在固体支持物上的结合部分的捕获探针，靶标序列由捕获探针捕获并从溶液中去除，同时丢弃溶液的剩余部分。
为了富集，捕获探针可以在溶液中游离或固定在固体支持物上。探针还可以包含结合部分(例如，生物素)并且能够捕获在固体支持物(例如，含有支撑材料的抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白)上。
在一些实施例中，本发明包括中间的纯化步骤。实施例，例如通过选自凝胶电泳、亲和层析、和尺寸排阻层析的尺寸选择法来去除未使用的引物和衔接子。在一些实施例中，可以使用来自贝克曼库尔特(布雷亚市，加州)的固相可逆固定化(SPRI)来执行尺寸选择。
通过本文公开的方法描述的衔接的核酸或其扩增子可以经受核酸测序。测序可通过本领域已知的任何方法实施。尤其有利的是高通量单分子测序。此类技术的实例包括依诺米那HiSeq平台(依诺米那，圣地亚哥，加州)、离子激流平台(生命技术，格兰德艾兰，纽约)、利用SMRT的太平洋生物科学平台(太平洋生物科学，门洛帕克，加州)，或者利用纳米孔技术的平台诸如牛津纳米孔技术公司(牛津，英国)或罗氏测序解决方案公司(圣克拉拉，加州)制造的那些平台，和任何其他现有的或将来的DNA测序技术，该技术涉及或不涉及通过合成进行测序。测序步骤可利用平台特异性测序引物。可以将这些引物的结合位点引入扩增步骤中使用的扩增引物的5′-部分。如果条形码分子文库中不存在引物位点，则可以执行引入此类结合位点的额外短扩增步骤。
在一些实施例中，测序步骤涉及序列分析。在一些实施例中，该分析包括序列比对步骤。在一些实施例中，比对用于从多个序列(例如，具有相同条形码(UID)的多个序列)中确定共有序列。在一些实施例中，条形码(UID)用于从具有相同条形码(UID)的多个序列中确定共有序列。在其他实施例中，使用条形码(UID)来消除伪像，即，存在于一些但并非全部具有相同条形码(UID)的序列中的变异。源自PCR误差或测序误差的此类伪像可以被消除。
在一些实施例中，通过定量样品中每个条形码(UID)的序列的相对数量，可以定量样品中的每个序列的数量。每个UID代表原始样品中的单个分子，且计数与每个序列变体相关的不同UID可以确定每个序列在原始样品中的比例。本领域技术人员将能够确定为确定共有序列所必需的序列读出的数量。在一些实施例中，为了准确的定量结果，每个UID(“序列深度”)都需要读取相关数量。在一些实施例中，期望的深度是每个UID 5-50次读取。
在一些实施例中，本发明是源自本文公开的RNA和DNA靶标的靶标核酸文库。通过本文所描述的方法形成的文库包含双链DNA分子，其中源自原始样品中存在的RNA靶标的分子的特征在于原自原始样品中存在的RNA靶标的分子不存在条形码。文库分子可以进一步包括在完成图1-3中描述的方法步骤之后添加的衔接子。
实例
实例1.从细胞系样品中同时制备测序就绪的DNA和RNA
为了生成图4中描述的数据，优化的DNA/RNA工作流程用于细胞系DNA/细胞系RNA与含有已知融合体(EML4-ALK和SLC34A2-ROS1融合体)的细胞系的混合。基因特异性引物用于在反转录期间靶向ALK和ROS1中的相关外显子。如上所显示的，反转录以这样一种方式进行，即DNA保持其文库准备的能力(即保持双链体并且相对完好无损)。反转录之后，进行RNAseH处理，将样品带入AVENIO肿瘤组织分析试剂盒工作流程(罗氏测序解决方案公司普莱森顿，加州)的末端修复/A加尾步骤，工作流程的其余部分使用AVENIO肿瘤组织方案执行。该实验的目标是确定在保持样品内的DNA的预期深度的同时是否可以检测到RNA融合体。就此而言，将该方法与“仅DNA制备”方法(仅将DNA用作输入并严格遵循AVENIO肿瘤组织方案)以及“无RT酶”条件进行比较，以确保检测到的融合体都不来自RNA。图4显示了(1)仅在组合的DNA/RNA制备中检测到融合体，并且在该制备中检测到所有预期的融合体，以及(2)相对于优化的仅DNA制备，DNA/RNA制备在样品中不会失去深度。

Claims (15)

1.一种制备用于测序的RNA和DNA靶标混合物的方法，所述方法包括：
a)提供包含RNA和DNA靶标的样品；
b)在不允许DNA变性的条件下使所述样品与靶标特异性引物接触；
c)用具有反转录酶活性的核酸聚合酶延伸与至少一个RNA靶标杂交的所述靶标特异性引物以形成cDNA链；
d)使所述样品与RNaseH活性及核酸末端修复活性接触以形成双链DNA和双链cDNA混合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶标特异性引物包含条形码。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述条形码将所述双链DNA和双链cDNA混合物中的cDNA分子与DNA分子区分开。
4.根据权利要求1至3所述的方法，其中所述核酸末端修复活性由DNA聚合酶、核酸外切酶和多核苷酸激酶的混合物组成。
5.根据权利要求1至4所述的方法，所述方法进一步包括对所述RNA和DNA靶标进行片段化的预备步骤。
6.根据权利要求1至5所述的方法，所述方法进一步包括使所述双链DNA和双链cDNA混合物与衔接子接触以形成衔接的DNA。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述衔接子包含一个或多个条形码。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述条形码选自唯一分子标识符(UID)和样品标识符(SID)。
9.根据权利要求6所述的方法，所述方法进一步包括对所述衔接的DNA进行扩增及任选地进行测序的步骤。
10.一种核酸文库，所述核酸文库由包含以下各项的方法形成：提供包含RNA和DNA靶标的样品；
a)在不允许DNA变性的条件下使所述样品与靶标特异性引物接触；
c)用具有反转录酶活性的核酸聚合酶延伸与至少一个RNA靶标杂交的所述靶标特异性引物以形成cDNA链；以及
d)使所述样品与RNaseH活性及核酸末端修复活性接触以形成双链DNA和双链cDNA混合物。
11.根据权利要求10所述的文库，其中双链DNA和双链cDNA混合物中的DNA进一步包含衔接子。
12.根据权利要求10至11所述的文库，其中所述靶标特异性引物包含条形码，并且所述双链cDNA可通过所述条形码的存在与所述双链DNA区分。
13.一种用于通过根据权利要求1所述的方法制备用于测序的RNA和DNA靶标混合物的试剂盒，所述试剂盒包括：
a)一个或多个靶标特异性引物，其具有条形码；
b)核酸聚合酶，其具有反转录酶活性；
c)RNaseH；
d)DNA聚合酶，其具有3′-5-核酸外切酶活性；
e)多核苷酸激酶。
14.根据权利要求13所述的试剂盒，所述试剂盒进一步包括衔接子和DNA连接酶。
15.根据权利要求14所述的试剂盒，其中所述衔接子包括一个或多个分子条形码和通用引物结合位点。
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