JP2023551472A - 単一細胞における全トランスクリプトーム解析 - Google Patents

単一細胞における全トランスクリプトーム解析 Download PDF

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Abstract

本発明は、単一細胞トランスクリプトーム解析の方法である。本方法は、ＤＮＡポリメラーゼ及び末端トランスフェラーゼを使用して形成された細胞特異的化合物バーコードで、任意に、逆転写酵素などの単一酵素において、転写物をバーコード化することによって、複数の細胞の各個々の細胞中の複数の転写物を検出することを含む。

Description

本発明は、概して、単一細胞分析に関する。より具体的には、本発明は、個々の細胞を単離又は分離する必要なく、個々の細胞中の複数の核酸標的を検出することに関する。
単一細胞分析は、生物学及び疾患の理解において重要性を増し始めている。全トランスクリプトーム解析を含む遺伝子発現研究は、細胞間の遺伝子発現の変動を明らかにする。以前の方法は、顕微鏡下での各細胞の物理的単離を必要とした（Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００９）ｍＲＮＡ－Ｓｅｑ，ｗｈｏｌｅ－ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ６：３７７を参照）。米国特許第１０，３９２，６６２号は、個々の細胞を液滴に封入し、複数の個々の反応が一度に起こり得るように水－油エマルジョンを処理することを含む技術的解決策を記載している。代替的な、より単純で洗練された手法は、米国特許第１０，１４４，９５０号に記載されている。「量子バーコード化（Ｑｕａｎｔｕｍ Ｂａｒｃｏｄｉｎｇ）」又は「ＱＢＣ」と呼ばれるこの新規なアプローチは、液滴中又は任意の他の手段によって個々の細胞を分離することを必要としない。代わりに、ＱＢＣは、複数の細胞全体を一連のスプリットプールラウンドに通過させることを含み、その結果、各細胞上に固有の化合物バーコードをアセンブリすることができる。各ラウンドにおいて、複数の細胞を含有する溶液は、それぞれがバーコード配列を含有するいくつかの反応体積に分割される。バーコードが各細胞の標的に結合された後、反応体積がプールされ、再度分割され、その結果、各細胞は次のラウンドバーコードを受け取る。各細胞は、一連のバーコード含有ウェルを通る固有の経路をたどり、固有の細胞関連化合物バーコードを取得する。ＱＢＣ法は、これらのユニーク細胞関連化合物バーコードを細胞中の目的の任意の標的、すなわち、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質又は他の細胞標的に付着させることを可能にする。
核酸上での化合物バーコードのアセンブリは、典型的にはライゲーション工程を含み、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｍｏｕｓｅ ｂｒａｉｎ ａｎｄ ｓｐｉｎａｌ ｃｏｒｄ ｂｙ ｓｐｌｉｔ－ｐｏｏｌ ｂａｒｃｏｄｉｎｇ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３６０：１７６を参照されたい。ライゲーションは、追加の試薬及び反応条件を必要とし、プライマー伸長よりも効率が悪い。核酸標的が稀である用途、例えば全トランスクリプトーム分析では、低効率は許容されない。個々の細胞における核酸標的をバーコード化及び検出するよりロバストな方法に対する満たされていない必要性がある。
本発明は、個々の細胞中の核酸標的上に化合物バーコードをアセンブリする方法を含む。個々の細胞における複数の標的の各々は、同じ細胞特異的バーコードで標識されるようになる。バーコードは、スプリットプールプロセスを介してバーコードサブユニットからアセンブリされる。逆転写酵素の固有の特性を利用して、バーコードサブユニットをコピーし、化合物バーコードをアセンブリする。
一実施形態では、本発明は、複数の細胞において複数の標的核酸を検出する方法であって、試料中の複数の細胞を、末端トランスフェラーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼの存在下で各標的核酸に対するオリゴヌクレオチドプライマーと接触させ、オリゴヌクレオチドプライマーを伸長させて、コピー鎖の３’末端に１つ以上の非鋳型ヌクレオチドを有する前記コピー鎖を形成することと、複数の細胞の各細胞中の各標的核酸について、一連のバーコードサブユニットを、第１のコピー鎖の３’末端に、試料を第１の反応体積セットに分配することであって、各体積が、第１のバーコードサブユニットと、第１のバーコードサブユニットをコピーするためにコピー鎖の３’末端を伸長させるための核酸ポリメラーゼとを含む、分配することと、第１の反応体積セットをプールに組み合わせることと、プールを第２の反応体積セットに分配することであって、各体積が、第２のバーコードサブユニットと、コピー鎖の３’末端を更に伸長して第２のバーコードサブユニットをコピーするための核酸ポリメラーゼとを含む、分配することと、を１ラウンド以上含むスプリットプールプロセスにより順次結合させることによって、コピー鎖上に細胞特性化合物バーコードを形成することと、細胞特性化合物バーコードを含む伸長されたコピー鎖の配列を決定し、それにより、複数の細胞中の複数の標的核酸を検出することと、を含む、方法である。いくつかの実施形態では、本方法は、配列決定の前に、細胞特性化合物バーコードを含む前記伸長されたコピー鎖を増幅する工程を更に含む。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドプライマーは、バーコード及び／又はユニバーサル増幅プライマー結合部位を含む。いくつかの実施形態では、コピーされるバーコードサブユニットは、ユニバーサル増幅プライマー結合部位を含む。
いくつかの実施形態では、標的核酸はＤＮＡである。いくつかの実施形態では、標的核酸はＲＮＡ、例えばメッセンジャーＲＮＡであり、オリゴヌクレオチドプライマーはポリ－ｄＴ配列又は標的特異的配列を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドプライマーはバーコードを含む。
いくつかの実施形態では、核酸ポリメラーゼは逆転写酵素である。ＲＴは、低下したＲＮａｓｅＨ活性を有し得る。
いくつかの実施形態では、非鋳型ヌクレオチドはデオキシシトシンである。
いくつかの実施形態では、バーコードサブユニットは、１つ以上の非鋳型ヌクレオチドに相補的な部分を含む。いくつかの実施形態では、バーコードサブユニットは、サブユニットハイブリダイゼーションの安定性を低下させる１つ以上の修飾ヌクレオチド、例えば、バーコードサブユニットの５’末端に位置するイソヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、本発明は、複数の細胞中の複数の標的核酸を検出するためのキットであり、該キットは、オリゴヌクレオチドプライマーと、逆転写酵素と、複数のバーコードサブユニットとを含み、各バーコードサブユニットがポリ－ｄＧ配列を含む。バーコードサブユニットは、複数の別々の反応体積中に存在し得る。
図１は、バーコード化ワークフローの概略図である。 図２は、バーコーディングワークフローの別の実施形態の概略図である。 図３は、バーコードワークフローの更に別の実施形態の概略図である。
定義
以下の定義は、本開示の理解を助ける。
「アダプター（ａｄａｐｔｏｒ）」（又は「アダプター（ａｄａｐｔｅｒ）」）という用語は、別の配列に追加の特性をもたらすためにその配列に付加することができるヌクレオチド配列を指す。アダプターは、一本鎖若しくは二本鎖であり得るか、又は一本鎖部分及び二本鎖部分の両方を有していてもよい。
「バーコード」という用語は、共通の特性又は起源を共有する分子又は分子群に同一性を付与するヌクレオチド配列を意味する。バーコードは、個々の分子（及びそのコピー）に固有の同一性を付与し得る。このようなバーコードは、ユニークＩＤ（ＵＩＤ）又はユニーク分子識別子（ＵＭＩ）である。バーコードは、同じ供給源（例えば、試料）に由来する分子の集団全体（及びそれらのコピー）に同一性を付与し得る。このバーコードは、マルチプレックスＩＤ（ＭＩＤ）又はサンプルＩＤ（ＳＩＤ）である。核酸分子を同定するために、バーコードは固有である必要はない。核酸はその配列によっても識別されるため、異なる配列を有する２つの核酸は同じバーコードを共有することができ、そのようなバーコードはユニーク分子バーコード（ＵＩＤ又はＵＭＩ）として機能する。
「化合物バーコード」という用語は、バーコードサブユニットからアセンブリされたバーコードを意味する。各化合物バーコードは独特であるが、２つ以上の化合物バーコードは、それらの中で１つ以上のバーコードサブユニットを共有することができる。
「核酸」という用語は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ等のそれらのサブカテゴリを含むヌクレオチド（例えば、リボヌクレオチド及びデオキシリボヌクレオチド、天然及び非天然の両方）のポリマーを指す。核酸は、一本鎖又は二本鎖であり得、一般に５’－３’ホスホジエステル結合を含有するが、いくつかの場合、ヌクレオチド類似体は、当技術分野で利用可能な他の結合並びにリンカー、スペーサー及び標識を有し得る。核酸は、天然の塩基（アデノシン、グアノシン、シトシン、ウラシル及びチミジン）及び非天然の塩基を含み得る。非天然塩基のいくつかの例としては、例えば、Ｓｅｅｌａ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ ８２：１６４０に記載されている非天然塩基が挙げられる。非天然塩基は、特定の機能、例えば、核酸二重鎖の安定性を増加させること、ヌクレアーゼ消化を阻害すること、又はプライマー伸長若しくは鎖重合を遮断すること、を有し得る。
「ＤＮＡポリメラーゼ」という用語は、デオキシリボヌクレオチドからポリヌクレオチドの鋳型指向合成を行う酵素を指す。ＤＮＡポリメラーゼとしては、原核生物のＰｏｌ Ｉ、Ｐｏｌ ＩＩ、Ｐｏｌ ＩＩＩ、Ｐｏｌ ＩＶ及びＰｏｌ Ｖ、真核生物のＤＮＡポリメラーゼ、古細菌のＤＮＡポリメラーゼ、テロメラーゼ及び逆転写酵素が挙げられる。「熱安定性ポリメラーゼ」という用語は、熱に対して安定であり、耐熱性であり、かつ、二本鎖核酸の変性を行うのに必要な時間にわたり高温に曝された場合に、続いてポリヌクレオチド伸長反応を行うのに充分な活性を保持し、不可逆的に変性（不活性化）されない、酵素を指す。いくつかの実施形態では、以下の熱安定性ポリメラーゼを使用することができる：サーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）（Ｖｅｎｔ、ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ７２１０１）、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）（Ｐｆｕ、ＧｅｎＢａｎｋ：Ｄ１２９８３、ＢＡＡ０２３６２）、パイロコッカス・ウーゼイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｗｏｅｓｉｉ）、パイロコッカスＧＢ－Ｄ（Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ、ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ６７１３１）、サーモコッカス・コダカレンシス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ）ＫＯＤＩ（ＫＯＤ、ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＤ１７５５５３、ＢＡＡ０６１４２、サーモコッカス属種ＫＯＤ株（Ｐｆｘ、ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＥ６８７３８））、サーモコッカス・ゴルゴナリウス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ）（Ｔｇｏ、Ｐｄｂ：４６９９８０６）、スルフォロブス・ソラタリクス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌａｔａｒｉｃｕｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＣ００２７５４、Ｐ２６８１１）、アエロパイラム・ペルニクス（Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ ｐｅｒｎｉｘ）（ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＡＡ８１１０９）、アーケオグロブス・フルギダス（Ａｒｃｈａｅｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ：０２９７５３）、パイロバクルム・アエロフィラム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ）（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＬ６３９５２）、パイロディクティウム・オカルタム（Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ ｏｃｃｕｌｔｕｍ）（ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＡＡ０７５７９、ＢＡＡ０７５８０）、サーモコッカス９°Ｎｍ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ８８７６９、Ｑ５６３６６）、サーモコッカス・フミコランス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｍｉｃｏｌａｎｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＡＡ９３７３８、Ｐ７４９１８）、サーモコッカス・ヒュドロテルマリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｈｙｄｒｏｔｈｅｒｍａｌｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＡＣ１８５５５）、サーモコッカス属種ＧＥ８（ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＡＣ１２８５０）、サーモコッカス属種ＪＤＦ－３（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＸ１３５４５６、ＷＯ０１３２８８７）、サーモコッカス属種ＴＹ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＡＡ７３４７５）、パイロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ）（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｐ７７９１６）、パイロコッカス・グリコボランス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｇｌｙｃｏｖｏｒａｎｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＡＣ１２８４９）、パイロコッカス・ホリコシイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）（ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＰ １４３７７６）、パイロコッカス属種ＧＥ２３（ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＡＡ９０８８７）、パイロコッカス属種ＳＴ７００（ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＡＣ １２８４７）、サーモコッカス・パシフィカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｐａｃｉｆｉｃｕｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＸ４１１３１２．１）、サーモコッカス・ジリジイ（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｚｉｌｌｉｇｉｉ）（ＧｅｎＢａｎｋ：ＤＱ３３６６８９０）、サーモコッカス・アグレガンス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ａｇｇｒｅｇａｎｓ）、サーモコッカス・バロシイ（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｂａｒｏｓｓｉｉ）、サーモコッカス・セラー（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｃｅｌｅｒ）（ＧｅｎＢａｎｋ：ＤＤ２５９８５０．１）、サーモコッカス・プロファンダス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｐｒｏｆｕｎｄｕｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｅ１４１３７）、サーモコッカス・サイクリ（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｉｃｕｌｉ）（ＧｅｎＢａｎｋ：ＤＤ２５９８５７．１）、サーモコッカス・チオレドゥセンス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｉｏｒｅｄｕｃｅｎｓ）、サーモコッカス・オンヌリネウス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｏｎｎｕｒｉｎｅｕｓ）ＮＡ１、スルフォロブス・アキドカルダリウム（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｍ）、スルフォロブス・トコダイイ（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｔｏｋｏｄａｉｉ）、パイロバクルム・カリディフォンティス（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ｃａｌｉｄｉｆｏｎｔｉｓ）、パイロバクルム・イスランディクム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ｉｓｌａｎｄｉｃｕｍ）（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＦ２７８１５）、メタノコッカス・ヤンナスキイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｑ５８２９５）、デスルフロコッカス（Ｄｅｓｕｌｆｏｒｏｃｏｃｃｕｓ）種ＴＯＫ、デスルフロコッカス属（Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｃｏｃｃｕｓ）、パイロロブス属（Ｐｙｒｏｌｏｂｕｓ）、パイロディクティウム属（Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ）、スタフィロサーマス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｔｈｅｒｍｕｓ）、ヴァルカニザエッタ属（Ｖｕｌｃａｎｉｓａｅｔｔａ）、メタノコッカス属（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｐ５２０２５）、並びに他の個細菌のＢポリメラーゼ、例えばＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＣ６２７１２、Ｐ９５６９０１、ＢＡＡＡ０７５７９））、高温細菌サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）種（例えば、フラバス（ｆｌａｖｕｓ）、ルバー（ｒｕｂｅｒ）、サーモフィルス（ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクテウス（ｌａｃｔｅｕｓ）、ルーベンス（ｒｕｂｅｎｓ）、アクアティカス（ａｑｕａｔｉｃｕｓ））、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）、メタノテルムス・フェルウィドゥス（Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｕｓ ｆｅｒｖｉｄｕｓ）、ＫＯＤポリメラーゼ、ＴＮＡ１ポリメラーゼ、サーモコッカス属種９°Ｎ－７、Ｔ４、Ｔ７、ｐｈｉ２９、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）、Ｐ．アビシ（Ｐ．ａｂｙｓｓｉ）、Ｔ．ゴルゴナリウス（Ｔ．ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ）、Ｔ．リトラリス（Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）、Ｔ．ジリジイ（Ｔ．ｚｉｌｌｉｇｉｉ）、Ｔ属種ＧＴ、Ｐ属種ＧＢ－Ｄ、ＫＯＤ、Ｐｆｕ、Ｔ．ゴルゴナリウス（Ｔ．ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ）、Ｔ．ジリジイ（Ｔ．ｚｉｌｌｉｇｉｉ）、Ｔ．リトラリス（Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）、及びサーモコッカス属種９Ｎ－７のポリメラーゼ。いくつかの場合、核酸（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）ポリメラーゼは、修飾された天然に存在するＡ型ポリメラーゼであり得る。本発明の更なる実施形態は、一般に、例えばプライマー伸長、末端修飾（例えば、末端トランスフェラーゼ、分解又は研磨（ｐｏｌｉｓｈｉｎｇ））又は増幅反応における修飾Ａ型ポリメラーゼが、メイオサーマス（Ｍｅｉｏｔｈｅｒｍｕｓ）属、サーマトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）属又はテルモミクロビウム（Ｔｈｅｒｍｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）属の任意の種から選択され得る方法に関する。本発明の別の実施形態は、一般に、ポリメラーゼが、例えばプライマー伸長、末端修飾（例えば、末端トランスフェラーゼ、分解又は研磨）又は増幅反応において、サーマス・アクアチクス（Ｔｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓ）（Ｔａｑ）、サーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、サーマス・カルドフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓｃａｌｄｏｐｈｉｌｕｓ）又はサーマス・フィリフォルミス（Ｔｈｅｒｍｕｓｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）のいずれかから単離され得る方法に関する。本発明の更なる実施形態は、一般に、修飾Ａ型ポリメラーゼが、例えばプライマー伸長、末端修飾（例えば、末端トランスフェラーゼ、分解又は研磨）又は増幅反応において、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、スファエロバクター・サーモフィルス（Ｓｐｈａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ディクチオグロムス・サーモフィルム（Ｄｉｃｔｏｇｌｏｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）又はエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）から単離され得る方法を包含する。別の実施形態では、本発明は、一般に、例えばプライマー伸長、末端修飾（例えば、末端トランスフェラーゼ、分解又は研磨）又は増幅反応における修飾されたＡ型ポリメラーゼが変異Ｔａｑ－Ｅ５０７Ｋポリメラーゼであり得る方法に関する。本発明の別の実施形態は、一般に、熱安定性ポリメラーゼを使用して標的核酸の増幅を行い得る方法に関する。
「逆転写酵素」という用語は、適切なプライマーの存在下でＲＮＡ鋳型からｃＤＮＡを合成するＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを意味する。野生型逆転写酵素は、ＲＮＡ－ＤＮＡハイブリッド内のＲＮＡを分解するＲＮａｓｅＨ活性を有する。いくつかの野生型及び操作された逆転写酵素は、ＲＮａｓｅＨ活性が低下している。野生型ＲＮａｓｅＨ＋ＲＴを使用することができるが、ＲＮａｓｅＨ活性が低下した酵素は、本発明の方法に特に適している。逆転写酵素はまた、テンプレートスイッチオリゴヌクレオチド（ＴＳＯ：ｔｅｍｐｌａｔｅ ｓｗｉｔｃｈ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）を必要とする鋳型スイッチ活性を有し、鋳型の末端に達すると、逆転写酵素は鋳型のコピーからＴＳＯのコピーに切り替わる。
「ポリヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」という用語は、互換的に使用される。ポリヌクレオチドは、一本鎖又は二本鎖の核酸である。オリゴヌクレオチドは、より短いポリヌクレオチドを記載するために時折使用される用語である。オリゴヌクレオチドは、少なくとも６ヌクレオチド又は約１５～３０ヌクレオチドから構成され得る。オリゴヌクレオチドは、本技術分野において公知の任意の適切な方法によって、例えば、Ｎａｒａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９７９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０－９９；Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．（１９７９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：１０９－１５１；Ｂｅａｕｃａｇｅ ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２２：１８５９－１８６２；Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０３：３１８５－３１９１に記載されている直接的化学合成を含む方法によって調製される。
「プライマー」という用語は、標的核酸中の配列とハイブリダイズし、かつこのような合成に適した条件下で核酸の相補鎖に沿った合成の開始点として作用することができる一本鎖オリゴヌクレオチドを指す。プライマーは、標的と安定なハイブリッドを形成し、核酸ポリメラーゼによって伸長され得る限り、標的核酸と部分的に又は完全に相補的であり得る。「フォワード及びリバースプライマー」という用語は、標的配列に隣接する部位で標的核酸の反対鎖に相補的なプライマー対を指す。フォワード及びリバースプライマーは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって標的を指数関数的に増幅することができる。
「試料」という用語は、標的核酸を含有する、又は含有すると推定されるいずれかの組成物を指す。本用語には、個体から単離された組織又は流体の試料、例えば、皮膚、血漿、血清、脊髄液、リンパ液、滑液、尿、涙、血球、器官及び腫瘍が含まれ、並びにホルマリン固定されたパラフィン包埋組織（ＦＦＰＥＴ）及びそこから単離された核酸を含む個体から採取された細胞から確立されたインビトロ培養物の試料も含まれる。試料にはまた、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）又は循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）を含有する無細胞血液画分等の無細胞材料も含まれてもよい。いくつかの実施形態では、文脈から当業者に明らかなように、「試料」という用語は、患者から得られた一次試料を処理することによって（例えば、１つ以上の成分を除去又は追加することによって）得られる調製物を指す。例えば、そのような処理は、試料からいくつかの組織材料（血液成分を含む）を除去すること、及び任意のインタクトな細胞を溶解して核酸を放出することを含み得る。
「配列決定」という用語は、標的核酸中のヌクレオチドの配列を決定する任意の方法を指す。
「固体支持体」という用語は、捕捉部分と相互作用することができる任意の固体材料を指す。固体支持体は、溶液中に懸濁することができる溶液相支持体（例えば、ガラスビーズ、磁気ビーズ、又は別の同様の粒子）又は固相支持体（例えば、シリコンウェハ、ガラススライド等）であり得る。溶液相支持体の例としては、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ磁気ビーズ若しくはＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＡＭＰｕｒｅ固相可逆的固定化（ＳＰＲＩ）常磁性ビーズ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、マサチューセッツ州ウォルサム）等の超常磁性球状ポリマー粒子、又は米国特許第６２７４３８６号、同第７３７１８３０号、同第６８７００４７号、同第６２５５４７７号、同第６７４６８７４号及び同第６２５８５３１号に記載されているような磁性ガラス粒子が挙げられる。
「標的配列」、「標的核酸」又は「標的」という用語は、検出又は分析されるべき試料中の核酸配列の一部を指す。標的という用語は、標的配列の全ての変異形、例えば、１つ以上の突然変異体バリアント及び野生型バリアントを含む。
「ユニバーサルプライマー」及び「ユニバーサルプライミング部位」という用語は、標的配列に天然には存在しないプライマー及びプライミング部位を指す。典型的には、ユニバーサルプライミング部位は、標的特異的プライマーのアダプター又はテールエンドに存在する。ユニバーサルプライマーは、ユニバーサルプライミング部位に結合し、そこからプライマー伸長を指示することができる。
単一細胞の全トランスクリプトーム解析は、発生生物学及び疾患の研究において有用な新たなツールである。米国特許第１０，１４４，９５０号には、個々の細胞における複数の核酸標的（ＤＮＡ及びＲＮＡ）を含む複数の標的をユニーク細胞関連化合物バーコードで標識する方法（「量子バーコード化」又は「ＱＢＣ」と呼ばれる）が記載されている。化合物バーコードは、核酸バーコードを含む又は核酸バーコードからなるオリゴヌクレオチド等の核酸サブユニットから形成され得る。これらのバーコードサブユニットは、例えば配列決定による読み取りのために、互いに接続される。ＱＢＣ（米国特許第１０，１４４，９５０号）の一実施形態は、核酸標的上のオリゴヌクレオチドサブユニットから化合物バーコードをアセンブリすることを含む。オリゴヌクレオチドを接続する方法の１つはライゲーションによるものである。あるいは、ポリメラーゼは、米国特許出願公開第２０１９年１月１７日に出願された米国特許出願第１６／２５０，９７４号「Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｓ」に記載されているように、抗体に結合した鋳型にアニールしたバーコードサブユニットをコピーすることができる。本発明は、ＱＢＣによる核酸バーコード化の改良された方法である。具体的には、本方法は、個々の細胞における複数の核酸標的を分析する場合、標的濃縮及び標的バーコード化のために同じポリメラーゼ酵素を利用することによって、既存のＱＢＣ技術を改良する。
本発明は、個々の細胞を分離又はカプセル化する必要なしに、個々の細胞における遺伝子発現（全トランスクリプトームを含む）を分析する新規方法である。本発明は、単一細胞全トランスクリプトーム分析の既存の方法の単純化及び改良である。
本発明の方法で使用される試料は、任意の個体（例えば、非ヒト哺乳動物、ヒト対象又は患者）を含む。試料はまた、細胞を含有する環境試料又は植物試料であり得る。試料は、細胞培養物を含む任意の組織又は細胞含有流体を構成することができる。例えば、試料は、臓器（例えば、リンパ節）若しくは腫瘍生検、又は血液若しくは血漿試料であり得る。試料はまた、組織由来の細胞のサブセット、例えば腫瘍から単離された免疫細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）からなり得る。いくつかの実施形態では、試料はホルマリン固定・パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料である。
いくつかの実施形態では、試料は、標的核酸を封入する細胞区画又は細胞内区画を含む。そのような実施形態では、方法は、標的核酸へのアクセスを可能にするために細胞又は細胞内区画を透過処理する工程を含み得る。細胞をメタノール緩衝液で固定し、ヌクレアーゼ阻害剤（例えば、ＲＮａｓｅ阻害剤）を含む適切な緩衝液に再懸濁してもよい。Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，（２０１８）ＰＢＭＣ Ｆｉｘａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｆｏｒ Ｃｈｒｏｍｉｕｍ Ｓｉｎｇｌｅ－Ｃｅｌｌ ＲＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，Ｊ．Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．１６：１９８を参照されたい。
本方法で使用されるプライマーは、標的特異的配列を含み得る。標的特異的配列は、遺伝子特異的配列、モチーフ特異的配列（例えば、キナーゼドメイン特異的配列、ＲＡＳファミリー特異的配列、トリヌクレオチドリピート配列等）、又はランダム配列（例えば、ランダムヘキサマー配列）であり得る。標的特異的配列はまた、ポリｄＴ配列（例えば、ｄＴ１２－１８）であり得る。いくつかの実施形態では、プライマーは、ランダムプライマーとポリ－ｄＴプライマーとの混合物である。
好ましくは、標的特異的配列はプライマーの３’部分に位置する。標的特異的領域に加えて、プライマーは追加の配列を含み得る。好ましくは、これらの追加の配列は、標的特異的領域の５’末端に位置する。他の実施形態では、標的特異的領域が標的にハイブリダイズし、以下に記載されるようにプライマー伸長反応を駆動することができる限り、プライマー内の他の場所に追加の配列を含めることが可能であり得る。プライマー内の追加の配列は、ユニーク分子同定配列（ＵＩＤ）又はマルチプレックス試料同定配列（ＭＩＤ）等の１つ以上のバーコード配列を含み得る。バーコード配列は、単一の配列として、又は２つ以上の配列として存在し得る。
いくつかの実施形態では、追加の配列は、プライマーの５’末端へのライゲーションを容易にする配列を含む。プライマーは、アダプターのライゲーションを可能にするユニバーサルライゲーション配列を含み得る。
いくつかの実施形態では、追加の配列は、１つ以上のユニバーサル増幅プライマーのための１つ以上の結合部位を含む。いくつかの実施形態では、プライマーは、捕捉オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションによるプライマー及びプライマー伸長産物の捕捉を可能にするユニバーサル捕捉配列を含む。
本発明は、複数の細胞における１つ以上の標的核酸配列を同時に評価する方法である。標的配列は、臨床的関連性のバイオマーカーを含み得る。本発明は、複数の細胞における１つ以上のｍＲＮＡ転写物を同時に評価する方法を含む。この実施形態では、標的は、発現レベルが疾患又は症状のバイオマーカーである遺伝子（又は遺伝子の断片）を含む。
いくつかの実施形態では、標的は、本方法において使用される細胞のタイプに対応する。例えば、複数の免疫細胞に適用する場合には、細胞の種類及び細胞の状態が異なることに特徴的な遺伝子を用いる。この実施形態では、標的は、ＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ３９、ＣＤ２５、ＩＬ－７Ｒ、ＣＤ４、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ６、ＣＤ３Ｇ、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ２、ＣＤ８Ａ、ＧＺＭＡ ＦＯＸＰ３、ＣＤ１９、ＣＤ７９Ａ、ＰＤＣＤ１、ＨＡＶＣＲ２、ＩＦＮＧ、ＴＮＦ、ＩＴＧＡＥ、ＣＸＣＲ６のうち１つ以上のＲＮＡ転写物を含む。
いくつかの実施形態では方法は複数の腫瘍細胞に適用される。この実施形態では、標的は、癌に一般的な１つ以上の融合遺伝子、例えばＡＬＫ、ＮＴＲＫ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＲＥＴ、ＲＯＳ１及びＦＩＰ１Ｌ１－ＰＤＧＦＲＡの１つ以上のＲＮＡ転写物を含む。標的はまた、癌において一般的に変異した遺伝子のＲＮＡ転写物を含み得る。標的は、以下の表３（ａ）～（ｃ）に列挙される１つ以上の遺伝子を含み得る。
Figure 2023551472000002
Figure 2023551472000003
Figure 2023551472000004
Figure 2023551472000005
プライマー伸長工程は、核酸ポリメラーゼによって行われる。分析される核酸の種類に応じて、ポリメラーゼは、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（「ＤＮＡポリメラーゼ」）又はＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（「逆転写酵素」）であり得る。いくつかの実施形態では、２つ以上のポリメラーゼの混合物が、所望の酵素活性の組み合わせを提供するために使用される。
いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、ＲＮａｓｅＨ活性が低下した逆転写酵素（例えば、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）ＲＴ）である。いくつかの実施形態では、逆転写酵素は高温（最大５５℃）で活性である。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、ターミナルヌクレオチドトランスフェラーゼ（ターミナルトランスフェラーゼ）活性を有する。逆転写酵素（例えば、ＭＭＬＶ ＲＴ）は、天然にこの活性を有する。いくつかの実施形態では、マンガン（Ｍｎ）イオン及びｄＣＴＰの存在下で、ＭＭＬＶ又はＭＭＬＶ由来ＲＴは、コピー鎖の３’末端にｄＣヌクレオチドのストレッチを付加する。他の条件下では、ＭＭＬＶ又はＭＭＬＶ由来ＲＴは、ｄＣヌクレオチドとｄＡヌクレオチドの組み合わせを追加する。
いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、末端トランスフェラーゼ活性及びテンプレートスイッチ活性を有する。例えば、逆転写酵素、例えば、第１鎖合成中のＭＭＬＶ又はＭＭＬＶ由来ＲＴは、コピー鎖の５’末端に達すると天然の末端トランスフェラーゼ活性を示す。付加された非鋳型ヌクレオチドのストレッチは、テンプレートスイッチオリゴ（ＴＳＯ）のためのアンカリング部位として機能する。ＴＳＯが非鋳型ヌクレオチドのストレッチにハイブリダイズすると、ポリメラーゼは鎖を標的のコピー（例えば、ＲＮＡ）からＴＳＯのコピーに切り替える。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、Ａ型ＤＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）である。いくつかのＤＮＡポリメラーゼは、限定された末端トランスフェラーゼ活性を有する（コピー鎖の３’末端に単一のｄＡを付加するＴａｑポリメラーゼ）。他のＤＮＡポリメラーゼは、検出可能な末端トランスフェラーゼ活性を有しない。そのような実施形態では、別々の末端トランスフェラーゼ酵素を使用して、非鋳型ヌクレオチドをコピー鎖の３’末端に付加する。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔポリメラーゼ又は同様の条件付きで活性化されるポリメラーゼである。増幅工程のために、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが使用され、例えば、ポリメラーゼはＴａｑ又はＴａｑ由来ポリメラーゼ（例えば、マサチューセッツ州ウィルミントンのＫＡＰＡ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製のＫＡＰＡ ２Ｇポリメラーゼ）である。
本発明は、バーコードサブユニットから化合物バーコードをアセンブリする方法を含む。バーコードサブユニットは、核酸バーコードを含むオリゴヌクレオチドである。一緒に結合すると、バーコードサブユニットは、化合物バーコードと呼ばれる順序付きの組み合わせを形成する。化合物バーコードは、タグ付けされた実体、例えば複数の細胞内の細胞を識別するのに必要な情報を提供する。バーコードサブユニットは、核酸ポリメラーゼによるバーコードサブユニットのコピーを可能にするのに十分なコピー鎖の３’部分とハイブリッドを形成するのに必要な核酸配列を更に含み得る。バーコードサブユニットは、コピー鎖の３’末端の非鋳型ヌクレオチドに相補的な配列を含み得る。いくつかの実施形態では、バーコードサブユニットは３’末端にポリｄＧ配列を含む。
各バーコードサブユニットは、２ヌクレオチド～５０ヌクレオチドを有することができる。各バーコードサブユニットは、所定の配列、ランダム配列、及びそれらの組み合わせ（図１、図２、図３を参照）を含み得る。ランダム配列バーコード（ＵＭＩ、図１、図２、図３）の使用は、追加されるバーコードの多様性を高めることができる。所定の配列の場合、バーコードのセットを実験用に設計することができる。
以下に記載されるワークフロー（図１、図２、図３）において、２つ以上のバーコード化実体（例えば、細胞）は、化合物バーコード内の同じ又は異なる位置に１つ以上のバーコードサブユニットを共有し得る。しかしながら、各バーコード化実体は、固有の化合物バーコードを形成するバーコード化サブユニットの固有の順序付き組み合わせを有する。
いくつかの実施形態では、コピー鎖とバーコードサブユニットとの間に形成されるハイブリッドの安定性を高めるために、サブユニットは、より高い融解温度（Ｔｍ）によって明らかにされるように、ハイブリッドの安定性を高める修飾ヌクレオチドを含む。Ｔｍを増加させるために、従来の塩基の代わりに以下の塩基を使用してもよい。
Figure 2023551472000006
いくつかの実施形態では、バーコードサブユニットは、１ラウンドのアセンブリにおける第２のサブユニットのアニーリングを阻害する修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、１つ以上の５’－ヌクレオチド異性体（ｉｓｏｄＣ又はｉｓｏｄＧ）である。
本発明は、複数の細胞中の各細胞を固有のバーコードで標識するのに十分な固有の化合物バーコードを生成するのに十分な数のスプリットプールラウンドを含む方法を提供する。米国特許第１０１４４９５０号に提供されている例示的な計算は、以下のように要約することができる。ユニーク化合物バーコード（Ｂ）の数を、以下の式に従って決定することができる：
Ｂ＝ｌｎ（１－Ｃ）／ｌｎ（１－１／Ｎ）、≡≡≡（式中、
Ｂは、化合物バーコードの数であり、
Ｃは、細胞に対するバーコードの過剰提示の確実性であり、
Ｎは、細胞数である）。
例えば、Ｎ＝１０６個の細胞（１００万）及び２つの細胞が同じバーコードを有する１／１０の確率から開始して、過剰提示の確実性Ｃ＝０．９９９９９９９である。必要とされる固有の化合物バーコードの数（ＢＣ）は、以下の通りである：
Ｂ＝ｌｎ（０．００００００１）／（１－１０－６）≡１６×１０６
１６００万個のタグ（１６×１０６）について、サブユニット（Ｓ）からのバーコード（Ｂ）のスプリットプール合成のラウンド数（Ｘ）は、以下の式によって決定される：
Ｘ＝Ｉｎ（Ｂ）／ｌｎ（Ｓ）
（Ｘは、スプリットプール合成のラウンド数であり、
Ｂは、化合物バーコードの数であり、
Ｓは、化合物バーコードを合成するために利用可能なサブユニットの数である）
例えば、２０個のサブユニットから１６００万個の化合物バーコードを得るには、
Ｘ＝ｌｎ（１６×１０６）／ｌｎ２０≡６
いくつかの実施形態では、本発明は、標的核酸又はコピー鎖の一方又は両方の末端に付加されたアダプターを利用する。様々な形状及び機能のアダプターが当技術分野で知られている（例えば、２０１９年２月２８日に出願されたＰＣＴ／ＥＰ２０１９／０５５１５、米国特許第８８２２１５０号及び米国特許第８４５５１９３号を参照）。
アダプターは、二本鎖、部分的に一本鎖又は一本鎖であり得る。いくつかの実施形態では、Ｙ字形、ヘアピンアダプター又はステムループアダプターが使用され、アダプターの二本鎖部分は、本明細書に記載されるように形成された二本鎖核酸にライゲーションされる。
いくつかの実施形態では、アダプター分子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ合成人工配列である。他の実施形態では、アダプター分子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ合成天然配列である。更に他の実施形態では、アダプター分子は、分離した天然分子又は分離した非天然分子である。
アダプターは、少なくとも１つのユニバーサルプライマーのプライマー結合部位を更に含む。
二本鎖又は部分的に二本鎖のアダプターオリゴヌクレオチドは、オーバーハング又は平滑末端を有することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法によって形成された二本鎖ＤＮＡは、平滑末端ライゲーションを適用して平滑末端アダプターをライゲーションすることができる平滑末端を含む。他の実施形態では、平滑末端ＤＮＡはＡテイリングを受け、単一のＡヌクレオチドが平滑末端に付加されて平滑末端から延びる単一のＴヌクレオチドを有するように設計されたアダプターに適合し、ＤＮＡとアダプターとの間のライゲーションを容易にする。アダプターライゲーションを行うための市販のキットとしては、ＡＶＥＮＩＯ ｃｔＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐキット又はＫＡＰＡ ＨｙｐｅｒＰｒｅｐ、及びＨｙｐｅｒＰｌｕｓキット（Ｒｏｃｈｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、カリフォルニア州プレザントン）が挙げられるいくつかの実施形態では、アダプター連結（適応）ＤＮＡは、過剰なアダプター及びライゲーションされていないＤＮＡから分離され得る。
一態様では、ユニバーサルブロッキングオリゴヌクレオチドは、第１及び第２の特異的領域に隣接する非特異的領域を含む。非特異的領域は、例えば、ユニバーサルブロッキングオリゴヌクレオチドが標的アダプター配列にハイブリダイズしたときにサンプルインデックス配列と整列する一連のイノシンを含む。ユニバーサルブロッキングオリゴヌクレオチドの特定の領域は、アダプター配列の不変部分に相補的であり、ブロッキングオリゴヌクレオチド－アダプター二重鎖のＴｍを増加させるために１つ以上の融解温度（Ｔｍ）修飾塩基を含む。Ｔｍ修飾塩基置換の例を表１に示す。
Figure 2023551472000007
別の態様では、２つの異なるアダプター配列を用いて調製された非増幅核酸ライブラリーは、アダプター末端が互いにハイブリダイズしない場合、オリゴヌクレオチドをブロックすることなく処理することができる。この手法に適したアダプタータイプには、フォーク形及びＹ字形のアダプターが含まれる。
アダプターのライゲーションは、一本鎖ライゲーション又は二本鎖ライゲーションによるものであり得る。一本鎖ライゲーションの場合、ＲＴプライマーはユニバーサルライゲーション部位を含み得る。そのような実施形態では、プライマー中のユニバーサルライゲーション部位に相補的な二本鎖領域及び一本鎖オーバーハングを有するアダプターをアニーリングし、ライゲーションしてもよい。プライマーの５’末端のユニバーサルライゲーション部位へのアダプターの一本鎖３’オーバーハングのアニーリングは、ＲＴプライマーを含有する鎖（コピー鎖）にニックを有する二本鎖領域を作り出す。２本の鎖は、プライマー伸長産物の５’－リン酸とアダプターの３’－ＯＨとの間の反応を触媒することができるＤＮＡリガーゼ若しくは別の酵素、又は非酵素試薬によってニックにおいてライゲーションすることができる。
一本鎖ライゲーション法を使用して、ユニバーサルプライミング部位をコピー鎖の反対側の末端に付加することができる。そのような実施形態では、配列非依存性一本鎖ライゲーション法が使用される。例示的な方法は、米国特許出願公開第２０１４０１９３８６０号に記載されている。本質的に、この方法は、ユニバーサルライゲーション部位を有する代わりに一本鎖３’末端オーバーハングがランダム配列、例えばランダムヘキサマー配列を有するアダプターの集団を使用する。その方法のいくつかの実施形態では、アダプターはヘアピン構造も有する。別の例は、ＡＣＣＥＬ－ＮＧＳ １Ｓ ＤＮＡライブラリーキット（Ｓｗｉｆｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ミシガン州アナーバー）によって可能にされる方法である。
この方法のライゲーション工程は、リガーゼ若しくは同様の活性を有する別の酵素又は非酵素試薬を利用する。リガーゼは、ＤＮＡ又はＲＮＡリガーゼ、例えば、Ｔ４若しくは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）リガーゼ等のウイルス若しくは細菌起源、又は熱安定性リガーゼＡｆｕ、Ｔａｑ、Ｔｆｌ若しくはＴｔｈであり得る。いくつかの実施形態では、代替酵素、例えばトポイソメラーゼを使用することができる。さらに、非酵素試薬を使用して、米国特許出願公開第２０１４０１９３８６０号に記載及び参照されているように、プライマー伸長産物の５’－リン酸とアダプターの３’－ＯＨとの間にリン酸－ジエステル結合を形成することができる。
本発明は、個々の細胞における標的配列に対する細胞特異的バーコードをアセンブリすることに関する。得られたバーコード化標的核酸は、核酸配列決定、好ましくは大規模並列単一分子配列決定に供される。大規模並列配列決定による個々の分子の分析は、典型的には、試料の同定及びエラー訂正のために別々のレベルのバーコード化を必要とする。米国特許第７，３９３，６６５号、同第８，１６８，３８５号、同第８，４８１，２９２号、同第８，６８５，６７８号及び同第８，７２２，３６８号に記載されているような分子バーコードの使用。配列決定される各分子にユニーク分子バーコードを付加して、分子及びその子孫をマークする（例えば、元の分子及びＰＣＲによって生成されたそのアンプリコン）。ユニーク分子バーコード（ＵＩＤ）は、試料中の元の標的分子の数のカウント及びエラー訂正を含む複数の用途を有する（Ｎｅｗｍａｎ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，（２０１４）Ａｎ ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｎｇ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ＤＮＡ ｗｉｔｈ ｂｒｏａｄ ｐａｔｉｅｎｔ ｃｏｖｅｒａｇｅ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍ．３５１９）。
いくつかの実施形態では、ユニーク分子バーコード（ＵＩＤ）が、配列決定エラー訂正のために使用される。単一の標的分子の子孫全体が同じバーコードで標識され、バーコード化されたファミリーを形成する。バーコード化ファミリーの全てのメンバーによって共有されていない配列内の変動は、アーチファクトして破棄される。ファミリー全体が元の試料中の単一分子を表すので、バーコードは位置重複排除及び標的定量にも使用することができる（Ｎｅｗｍａｎ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，（２０１６）Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｄｉｇｉｔａｌ ｅｒｒｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｆｏｒ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ＤＮＡ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３４：５４７）。
本発明のいくつかの実施形態では、バーコード化標的核酸の一方又は両方の末端にライゲーションされたアダプターは、配列決定に使用される１つ以上のバーコードを含む。バーコードは、試料が混合（多重化）される試料の供給源を識別するために使用されるＵＩＤ又は多重サンプルＩＤ（ＭＩＤ又はＳＩＤ）であり得る。バーコードはまた、ＵＩＤとＭＩＤとの組合せであってもよい。いくつかの実施形態では、単一のバーコードが、ＵＩＤ及びＭＩＤの両方として使用される。いくつかの実施形態では、各バーコードは、所定の配列を含む。他の実施形態では、バーコードは、ランダム配列を含む。本発明のいくつかの実施形態では、バーコードは約４～２０塩基長であり、したがって、９６個～３８４個の異なるアダプター（それぞれ、同一バーコードの異なる対を有する）が、ヒトゲノム試料に付加される。いくつかの実施形態では、反応におけるＵＩＤの数は、標識されるべき分子の数を超え得る。当業者は、バーコードの数が試料の複雑さ（すなわち、固有の標的分子の予想数）に依存し、各実験に適した数のバーコードを作成することができることを認識するであろう。
本発明は、複数の細胞において複数の標的核酸を検出する方法である。いくつかの実施形態では、方法は、核酸ポリメラーゼの存在下で、試料中の複数の細胞を各標的核酸のオリゴヌクレオチドプライマーと接触させる工程を含む。核酸ポリメラーゼは、末端トランスフェラーゼ活性及びポリメラーゼ活性を有する。ポリメラーゼは、プライマーを伸長してコピー鎖を形成し、コピー鎖の３’末端に１つ以上の非鋳型ヌクレオチドを付加する。この方法は更に、一連のバーコードサブユニットをコピー鎖の３’末端に順次結合させることによって、コピー鎖上に（複数の細胞の各細胞の各標的核酸について）細胞特性化合物バーコードを形成することを含む。バーコードは、スプリットプールプロセスによって追加される。いくつかの実施形態では、試料は、核酸ポリメラーゼがコピー鎖の３’末端を伸長して第１バーコードサブユニットをコピーすることができるように、第１バーコードサブユニットを含有する各体積の第１の反応体積セット（例えば、マイクロウェルプレート内のチューブ又はウェル）に分配される。次いで、第１の反応体積セットをプールして、第２の反応体積セットに再度分配し、各体積は、核酸ポリメラーゼがコピー鎖の３’末端を更に伸長して第２のバーコードサブユニットをコピーすることができるように、第２のバーコードサブユニットを含む。所望の数のバーコードサブユニットが各標的核酸のコピー鎖に付加されるまで、これらのスプリットプール工程を繰り返す。次いで、バーコード化された鎖は、任意の利用可能な方法によって配列決定される。任意に、バーコード化された鎖は、配列決定の前に増幅される。
別の実施形態では、本開示は、複数の細胞における複数の標的核酸を検出するためのキットを提供する。いくつかの実施形態では、キットは、オリゴヌクレオチドプライマーと、逆転写酵素と、複数のバーコードサブユニットとを含み、各バーコードサブユニットはポリ－ｄＧ配列を含む。キットは、任意に、逆転写酵素の末端トランスフェラーゼ活性のためのＭｎイオンを含有する緩衝液を含み得る。キットはまた、例えば、コピー鎖又はバーコード化コピー鎖を過剰なプライマー又は過剰なバーコードサブユニットから分離するための、ＤＮＡ捕捉及び精製のための任意の試薬を含み得る。
いくつかの実施形態では、方法は、複数の細胞から発現ライブラリーを形成する工程を含む。ライブラリーは、複数の細胞に存在するポリヌクレオチドから生成された複数のバーコード化コピー鎖からなる。ライブラリーを保存し、ライブラリー中の核酸の増幅又は配列決定等の更なる処理のために複数回使用することができる。
いくつかの実施形態では、ライブラリーは、更なる分析のために標的核酸のサブセットを選択するために標的濃縮プロセスに供される。例えば、オリゴヌクレオチドプライマーが複数のｍＲＮＡ標的を捕捉するためのポリ－ｄＴ配列を含む実施形態では、標的濃縮工程を使用して、目的の１つ以上の遺伝子のｍＲＮＡ転写物を捕捉してもよい。
いくつかの実施形態では、方法は、１つ以上の精製工程を更に含む。いくつかの実施形態では、精製工程は、この方法の次の工程の前に、未使用のプライマー又は未使用のバーコードサブユニットを除去する。いくつかの実施形態では、プライマー及びバーコードサブユニットは、サイズ排除法（例えば、ゲル電気泳動、クロマトグラフィー、又は等速電気泳動若しくはエピタコ電気泳動）によって、より大きなサイズのコピー鎖から分離される。
いくつかの実施形態では、精製は、親和性結合によるものである。この実施形態の変形例において、親和性は、特定の標的配列（配列捕捉）に対するものである。他の実施形態では、プライマーは親和性タグを含む。当技術分野で公知の任意の親和性タグ、例えばビオチン、又は抗体若しくは特異的抗体が存在する抗原を使用することができる。親和性タグに対する親和性パートナーは、溶液中、例えば懸濁粒子若しくはビーズ等の溶液相固体支持体上に存在するか、又は固相支持体に結合していてもよい。親和性精製の過程で、反応混合物の未結合成分を洗い流す。いくつかの実施形態では、未使用のプライマーを除去するために追加の工程が行われる。いくつかの実施形態では、親和性捕捉はプライマー伸長産物の電荷を変化させる。例えば、１つ以上のビオチン化ヌクレオチドの包含及びそれへの結合又はストレプトアビジンは、新生核酸鎖上に変化した電荷を生成する。変化した電荷は、等速電気泳動又はエピトープ電気泳動による新生鎖（プライマー伸長産物）の分離に利用することができる。
いくつかの実施形態では、本発明は、配列決定工程の前に増幅する工程を含む。増幅は、上流プライマー及び下流プライマーを利用する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのプライマーは、標的特異的プライマーであり、すなわち、標的配列に相補的な配列を有する。いくつかの実施形態では、一方又は両方のプライマーはユニバーサルプライマーである。ユニバーサルプライマーは、（同じ又は異なる配列の）別のユニバーサルプライマーと対になっていてもよい。他の実施形態では、ユニバーサルプライマーは、標的特異的プライマーと対にされる。
ユニバーサルプライマー結合部位は、様々な方法で標的核酸に付加され得る。いくつかの実施形態では、ユニバーサルプライマー結合部位は、ＲＴプライマーの５’部分に存在する。同様に、ユニバーサルプライマー結合部位は、化合物バーコードに付加される最後のバーコードサブユニットの５’末端に存在し得る。他の実施形態では、ユニバーサルプライマー結合部位は、アダプター中に存在し、ライゲーションによって標的核酸の一方又は両方の末端に付加される。
いくつかの実施形態では、複数の細胞からのバーコード化コピー鎖又はバーコード化コピー鎖のライブラリーが配列決定される。多くの配列決定技術又は配列決定アッセイのいずれかを利用できる。本明細書で使用される「次世代シーケンシング（ＮＧＳ）」という用語は、クローンで増幅された分子及び単一の核酸分子の超並列シーケンシングを可能にする配列決定方法を指す。
本明細書に開示される方法での使用に適した配列アッセイの非限定的な例は、ナノポアシーケンシング（米国特許出願公開第２０１３／０２４４３４０号、第２０１３／０２６４２０７号、第２０１４／０１３４６１６号、第２０１５／０１１９２５９号及び第２０１５／０３３７３６６号）、サンガーシーケンシング、キャピラリーアレイシーケンシング、熱サイクルシーケンシング（Ｓｅａｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１３：６２６－６３３（１９９２））、固相シーケンシング（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，３：３９－４２（１９９２））、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳ；Ｆｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１６：３８１－３８４（１９９８））等の質量分析によるシーケンシング、ハイブリダイゼーションによるシーケンシング（Ｄｒｍａｎａｃ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１６：５４－５８（１９９８）、限定されないが、合成によるシーケンシング（例えば、ＨｉＳｅｑ（商標）、ＭｉＳｅｑ（商標）、又はＧｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ、それぞれＩｌｌｕｍｉｎａより入手可能）を含むＮＧＳ法、ライゲーションによるシーケンシング（例えば、ＳＯＬｉＤ（商標）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、イオン半導体シーケンシング（例えば、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ（商標）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、及びＳＭＲＴ（登録商標）シーケンシング（例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含む。
市販の配列決定技術は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｉｎｃ．（カリフォルニア州サニーベール）のハイブリダイゼーションによる配列決定プラットフォーム、Ｉｌｌｕｍｉｎａ／Ｓｏｌｅｘａ（カリフォルニア州サンディエゴ）及びＨｅｌｉｃｏｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（マサチューセッツ州ケンブリッジ）の合成による配列決定プラットフォーム、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（カリフォルニア州フォスターシティ）のライゲーションによる配列決定プラットフォームを含む。他の配列決定技術は、限定されないが、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ技術（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、及びナノポアシーケンシング（カリフォルニア州サンタクララのＲｏｃｈｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＳｏｌｕｔｉｏｎｓのＧｅｎｉａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）及びＯｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（英国オックスフォード）を含む。
いくつかの実施形態では、配列決定工程は、配列アラインメントを伴う。いくつかの実施形態では、整列化を使用して、複数の配列、例えば、同じユニーク分子バーコード（ＵＩＤ）を有する複数の配列からコンセンサス配列を決定する。分子ＩＤは、配列決定の前に、又は増幅工程が含まれる場合には増幅工程の前に各分子に付加することができるバーコードである。いくつかの実施形態では、ＵＩＤは、ＲＴプライマーの５’部分に存在する。同様に、ＵＩＤは、化合物バーコードに追加される最後のバーコードサブユニットの５’末端に存在することができる。他の実施形態では、ＵＩＤは、アダプター中に存在し、ライゲーションによって標的核酸の一方又は両方の末端に付加される。
いくつかの実施形態では、コンセンサス配列は、全て同一のＵＩＤを有する複数の配列から決定される。同一のＵＩＤを有する配列決定されたものは、増幅によって同じ元の分子に由来すると推定される。他の実施形態では、ＵＩＤは、アーチファクト、すなわち、（特定のＵＩＤによって特徴付けられる）単一分子の子孫に存在する変動を排除するために使用される。ＰＣＲエラー又は配列決定エラーから生じるこのようなアーチファクトは、除去され得る。
いくつかの実施形態では、試料中の各配列の数は、同じ多重サンプルＩＤ（ＭＩＤ）を有する集団の中の各ＵＩＤを有する配列の相対数を定量することによって決定することができる。各ＵＩＤは、元の試料中の単一の分子であり、各配列バリアントと会合した異なるＵＩＤを計数することによって、全ての分子が同じＭＩＤを共有する、元の試料中の各配列バリアントの分率を決定し得る。当業者は、コンセンサス配列を決定するために必要な配列読取りの数を決定することができる。いくつかの実施形態では、関連する数は、正確な定量結果のために必要なＵＩＤ（「配列深度（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄｅｐｔｈ）」）当たりの読出しである。いくつかの実施形態では、所望の深度はＵＩＤ当たり５～５０読取りである。
本発明は、図１、図２及び図３を参照してより詳細に説明される。図は、本発明のいくつかの実施形態を示しており、任意の特徴並びに特許請求される方法における工程の順序又は数に関して限定するものとして解釈されるべきではない。図１、図２、及び図３に示す実施形態は、同じ工程を有するが、任意の特徴の数が異なる。ワークフローは、図１に関連して説明され、適切な場合には、図２及び図３は、任意の特徴を示すために参照される。
図１を参照すると、第１の工程は、一本鎖標的核酸（任意のタイプのＤＮＡ又はＲＮＡ）をプライマーと接触させることである。プライマーは、ハイブリダイゼーション及び伸長を確実にするために標的核酸に実質的に相補的な３’部分を有する。図１の例では、相補的配列は、ｍＲＮＡのポリｄＡ末端にハイブリダイズするためのポリｄＴである。他の相補敵意配列の例には、遺伝子特異的配列、モチーフ特異的配列（例えば、キナーゼドメイン特異的配列、ＲＡＳファミリー特異的配列、トリヌクレオチドリピート配列等）、又はランダム配列（例えば、ランダムヘキサマー配列）を含まれる。いくつかの実施形態では、プライマー配列は、ランダム配列とポリｄＴ配列との組み合わせである。
プライマーは、追加の配列を有する５’部分を含み得る。図１のプライマーは、プライマー結合部位、例えば増幅プライマー結合部位を有することが示されている。図２のプライマーは任意の追加の配列を欠いているが、図３のプライマーはプライマー結合部位及びバーコードを有する。バーコードは、細胞内のコピー鎖を一意に識別するランダムなユニーク分子識別子バーコード（ＵＭＩ）（ＵＩＤとしても知られる）を含む。バーコードはまた、定義されたバーコード（ＢＣ）を含む。任意に、試料を、それぞれが異なるバーコード（ＢＣ）を有するプライマーを含む一連の反応体積に分配することができる。異なる反応体積におけるバーコード（ＢＣ）の多様性は、個々の細胞に対する固有の識別子を作成するために以下に記載される化合物バーコードによって作成される多様性に追加する。
更に図１を参照すると、次の工程は、核酸ポリメラーゼを用いて標的核酸をコピーするためのプライマーの伸長である。ポリメラーゼは、コピー鎖を形成し、非鋳型ヌクレオチドをコピー鎖の３’末端に付加することが示されている。図１は、マンガンイオンの存在下での特定のタイプの逆転写酵素に特徴的な、ｄＣ３の非鋳型添加を示す。他のヌクレオチド配列も可能であり、コピー鎖の３’末端である。例えば、逆転写酵素は、異なる緩衝液条件下で他のヌクレオチド（ｄＡ又はｄＡ／ｄＣの組み合わせ等）を付加することができる。Ｔａｑポリメラーゼは、コピー鎖の３’末端に単一のｄＡを付加する。ポリメラーゼと末端トランスフェラーゼの機能を分離して、２つの機能が別々の酵素によって行われるようにすることが更に可能である。
更に図１を参照すると、次の工程はスプリットプール手順であり、反応混合物をいくつかの反応体積（例えば、マイクロウェルプレートのウェル、チューブストリップ又は他の種類の別個の体積）に分割し、各体積は固有のバーコードサブユニットオリゴヌクレオチドを含む。図１に示されるように、バーコードサブユニットは、コピー鎖の末端の非鋳型ヌクレオチドのストレッチにアニーリングすることを可能にする相補配列を有する。アニーリングは、コピー鎖を伸長する核酸ポリメラーゼによるバーコードサブユニットのコピーを可能にする。図１に示されるように、コピー鎖の非鋳型部分に相補的な配列に加えて、バーコードサブユニットはバーコード配列（ＢＣ１）を有する。バーコードは、図１及び図２に示すような所定の配列とすることができる。図３に示すように、バーコードはランダム配列（ＵＭＩ）で更に強化されている。
更に図１を参照すると、所望の長さの化合物バーコードがコピー鎖の末端でアセンブリされるまで、バーコードサブユニットを付加する工程が繰り返される。バーコードサブユニットの各付加は、スプリットプールプロセスによって実行される。バーコードサブユニットがポリメラーゼによってコピーされた後、反応物をプールし、次のラウンドの反応体積に分割し、各体積は、次の一連のバーコードアセンブリのための固有のバーコードサブユニットオリゴヌクレオチドを含む。各回において、ポリメラーゼは、次のラウンドのバーコードサブユニットオリゴヌクレオチドのアニーリングを可能にするために、伸長されたコピー鎖の末端に非鋳型ヌクレオチドの鎖を付加する。
いくつかの実施形態では、未使用のバーコードサブユニット及びプライマー等の未使用のオリゴヌクレオチドを除去する任意の精製工程が存在する。いくつかの実施形態では、精製は、エキソヌクレアーゼ、例えばエキソヌクレアーゼＩを利用する。未使用のオリゴヌクレオチド、並びに任意にエキソヌクレアーゼを除去するには、前のセクションに記載の親和性結合によるものを含む緩衝液交換が必要であり得る。
いくつかの実施形態では、追加のバーコード（例えば、オリゴヌクレオチドプライマー上の５’バーコード）並びにＵＭＩの使用は、化合物バーコードアセンブリのラウンド数を最小限に抑える。より少ないラウンド、特に単一のラウンドでは、精製工程を回避することができる。
コピー鎖にアニーリングする工程及び次のバーコードサブユニットをコピーするためのコピー鎖の伸長は、所望の長さのバーコードがアセンブリされるまで繰り返され得る。当業者は、バーコードサブユニットの長さ及び固有の化合物バーコードでタグ付けされる実体（例えば、細胞）の数と一致するのに必要なアセンブリのラウンド数を計算することができる。
ＲＴのテンプレートスイッチ活性は公知であり、商業的に使用されている（Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ｔｅｍｐｌａｔｅ ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ：ａ ＳＭＡＲＴ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ ｃＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｙ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，３０：８９２、並びに米国特許第５，９６２，２７１号及び第５，９６２，２７２号を参照）。ＲＴのこの特性は、完全長ｃＤＮＡを濃縮するために使用される（ＳＭＡＲＴＥＲ ＰＣＲ ｃＤＮＡ合成キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カリフォルニア州マウンテンビュー））。より最近では、ＲＴのこの特性は、テンプレートスイッチオリゴヌクレオチド（ＴＳＯ）が配列決定アダプターとして作用する、すなわちＮＧＳ特異的配列エレメントを含む、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）おける用途が見出された（Ｏｈｔｓｕｂｏ，ｅｔ ａｌ．，（２０１８）Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄ ＤＮＡ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｍｏｌｏｎｅｙ ｍｕｒｉｎｅ ｌｅｕｋａｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ，ＤＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２５：４７７，ａｎｄ ＳＭＡＲＴｅｒ（登録商標）ｓｍＲＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ ｆｏｒ Ｉｌｌｕｍｉｎａ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ．，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，Ｃａｌ．を参照）。
本発明は、標的核酸の一本鎖コピーにＴＳＯを連結（複数付加）する工程を含む。当技術分野では、複数のＴＳＯの添加は、最小化又は回避される望ましくないアーチファクトと考えられている。例えば、Ｋａｐｔｅｙｎ ｅｔ ａｌ．（（２０１０）Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｎ－ｎａｔｕｒａｌ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｉｎｔｏ ｔｅｍｐｌａｔｅ－ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｒｅｄｕｃｅｓ ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ ａｎｄ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｆｒｏｍ ｖｅｒｙ ｓｍａｌｌ ＲＮＡ ｓａｍｐｌｅｓ，ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１１：４１３）は、第２のテンプレートスイッチの発生を防ぐために、ＴＳＯの５’末端に修飾ヌクレオチドを組み込むことを教示している。Ｏｈｔｓｕｂｏ ｅｔ ａｌ．（前出）は、連結を防ぐために５’－ビオチン化オリゴヌクレオチドを使用している。本発明者らは、この酵素特性の新規な使用を考案した。本発明は、同じラウンドの連結を最小限にするが、次のラウンドのバーコードサブユニットの付加を可能にするための、バーコードサブユニットにおける５’－ヌクレオチド異性体（ｉｓｏｄＣ）の使用及び短縮されたインキュベーション時間を含む。本方法は、ポリメラーゼを利用して複数のＴＳＯから化合物バーコードをアセンブリすることによって、ポリメラーゼの望ましくない連結能力に有用性を見出す。
更に図１を参照すると、最後のアセンブリラウンドで付加されたバーコードサブユニットオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの５’部分に追加の配列を有し得る。図１及び図３に示されるように、最後のバーコードサブユニットは、増幅プライマー結合部位を有する。バーコードサブユニットはまた、配列決定プライマー結合部位、ユニーク分子バーコード及びサンプルバーコードを含み得る。図１及び図３では、配列決定方法特異的又は装置特異的要素は、増幅プライマーの５’部分を介して配列決定前の増幅中に付加される。図２は、配列決定される核酸の一方又は両方の末端にアダプターをライゲーションすることによって配列決定装置特異的要素を付加することを示す。
更に図１及び図２を参照すると、ワークフローは、標的核酸のコピー鎖と、コピー鎖を伸長することによってコピー鎖の一端にアセンブリされた細胞特異的化合物バーコードとを含む二本鎖核酸断片をもたらす。図３において、二本鎖核酸断片は、化合物バーコードの反対側の末端にバーコードを更に含む。
いくつかの実施形態では、方法は、対象（例えば、患者）の状態の評価を更に含む。いくつかの実施形態では、方法は、患者の試料中で、複数の疾患バイオマーカーのＲＮＡ転写物の配列及び任意に量を決定することを更に含む。一例では、本発明は、患者から単離された免疫細胞集団からの個々の免疫細胞における免疫細胞バイオマーカーの発現を決定することによって患者の状態を評価することを含む。免疫細胞バイオマーカーは、Ｔ細胞型のマーカー、Ｔ細胞疲弊、Ｔ細胞活性化、組織常在性メモリー細胞のマーカー、腫瘍反応性Ｔ細胞のマーカー及びマーカー（複数）から選択され得る。これらのマーカーには、ＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ３９、ＣＤ２５、ＩＬ－７Ｒ、ＣＤ４、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ６、ＣＤ３Ｇ、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ２、ＣＤ８Ａ、ＧＺＭＡ ＦＯＸＰ３、ＣＤ１９、ＣＤ７９Ａ、ＰＤＣＤ１、ＨＡＶＣＲ２、ＩＦＮＧ、ＴＮＦ、ＩＴＧＡＥ、ＣＸＣＲ６の１つ以上のＲＮＡ転写物が含まれ得る（Ｙｏｓｔ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｃｌｏｎａｌ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ－ｃｅｌｌｓ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ＰＤ－１ ｂｌｏｃｋａｄｅ、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１５９１－０１９－０５２２－３を参照）。本方法は、患者の疾患の診断、又は患者から単離された細胞集団からの個々の細胞において決定されたＴ細胞バイオマーカーの発現及び疾患バイオマーカーの発現に基づいて処置を選択又は変更することを更に含む。
実施例１：細胞ｍＲＮＡ上のバーコードアセンブリの原理の証明
この実施例では、化合物バーコードの構築を単離された核酸に対して行った。標的配列は、再配列された免疫配列：Ｔ細胞受容体遺伝子アルファ及びベータ（ＴＣＲＡ及びＴＣＲＢ）、並びに再編成された免疫グロブリン遺伝子（ＩｇＧ）であった。ＲＮＡを末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離した。プライマーは、ポリＴ配列及びユニバーサルＰＣＲプライマー結合部位を含んでいた。第１鎖ｃＤＮＡ合成プロトコル（単一細胞及びｃＤＮＡ合成（Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ ａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ））及びプライマー配列は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂ（マサチューセッツ州イプスウィッチ）から入手した。３つの試料を以下のように処理した：
試料１：バーコードサブユニット１（配列番号１）＋バーコードサブユニット２（配列番号２）；試料２：バーコードサブユニット１（配列番号１）＋バーコードサブユニット２（配列番号２）＋酵素混合物；試料３：バーコードサブユニット１のみ（配列番号１）。試料２を、ＴＣＲ Ａ／Ｂ又はＩｇＧの遺伝子特異的プライマーを用いた配列決定によって処理した。
以下のバーコードサブユニットを使用した：
バーコードサブユニット１（ＴＳＯ＿１＿０１）（配列番号１）ＷＮＮＷＣＡＣＡＣＴＧＣＴＧＡＣＮＷＮｒＧｒＧｒＧ（ｒＧはリボグアノシンである）
バーコードサブユニット２（ＴＳＯ＿ｎａｎｏ＿ｉ７＿１１）（配列番号２）
／５Ｍｅ－ｉｓｏ－ｄＣ／ＧＴＧＡＣＴＧＧＡＧＴＴＣＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＮＮＷＣＡＣＡＣＴＧＣＴＧＡＣＷＧｒＧｒＧｒＧ
５－メチル－イソデオキシシトシン
反応を以下の温度プロファイルに供した：
４℃１分
４２℃７５分
４℃～第２のバーコードサブユニットを追加
４２℃１０分
７２℃１０分
４℃～
逆転写及びバーコードアセンブリの後、反応物を、ユニバーサルプライマー（配列番号６）に対向するＴＣＲＡ、ＴＣＲＢ及びＩｇＧ（配列番号３、４、５）の遺伝子特異的プライマーを用いてＰＣＲ増幅に供した。アンプリコンは以下の構造を有していた：
［ユニバーサルプライマー－ＢＣ２－ＢＣ１－遺伝子配列－遺伝子特異的プライマー］
増幅プライマーは、遺伝子特異的配列、バーコード配列（ＵＭＩ）及びＩｌｌｕｍｉｎａ特異的アダプター配列を含んでいた。
ＴＣＲＡプライマー（ＴＣＲＡ＿ｉ５０１）（配列番号３）
５’－ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣ ＴＡＴＡＧＣＣＴＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ ＮＮＮＮＮＮＧＧＣＡＧＧＧＴＣＡＧＧＧＴＴＣＴＧＧＡＴＡ－３’
ＴＣＲＢプライマー（ＴＣＲＢ＿ｉ５０１）（配列番号４）
５’－ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣ ＴＡＴＡＧＣＣＴＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ ＮＮＮＮＮＮＴＧＣＴＴＣＴＧＡＴＧＧＣＴＣＡＡＡＣＡＣＡＧＣＧ－３’
ＩｇＧプライマー（ＩｇＧ＿５０３）（配列番号５）
ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＣＣＴＡＴＣＣＴＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＮＮＮＮＮＮＧＴＡＧＴＣＣＴＴＧＡＣＣＡＧＧＣＡＧＣＣ－３’
ユニバーサルプライマー（ｉ＿７０１）（配列番号６）
ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴＣＧＡＧＴＡＡＴＧＴＧＡＣＴＧＧＡＧＴＴＣＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣ＊Ｔ
（＊Ｔはホスホロチオエートヌクレオチドである）
ＰＣＲ増幅は、Ｑ５（登録商標）Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ２Ｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ（マサチューセッツ州イプスウィッチ）を使用して、製造業者によって推奨される温度プロファイルを使用して行った。増幅産物を、Ｋａｐａ Ｐｕｒｅ Ｂｅａｄｓ（Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（マサチューセッツ州ウィルミントン）を使用して精製した。精製した増幅産物を、配列決定のためにＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑで配列決定した。２×３００塩基のリード長。リードを分析して、バーコードサブユニット１及び２（ＢＣ１、ＢＣ２）を検出した。結果を下表に示す。
Figure 2023551472000008

Claims (15)

  1. 複数の細胞において複数の標的核酸を検出する方法であって、前記方法が、
    ａ．試料中の前記複数の細胞を、末端トランスフェラーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼの存在下で各標的核酸に対するオリゴヌクレオチドプライマーと接触させ、前記オリゴヌクレオチドプライマーを伸長させて、コピー鎖の３’末端に１つ以上の非鋳型ヌクレオチドを有する前記コピー鎖を形成することと、
    ｂ．前記複数の細胞の各細胞中の各標的核酸について、一連のバーコードサブユニットを、第１のコピー鎖の３’末端に、
    ｉ．前記試料を第１の反応体積セットに分配することであって、各体積が、第１のバーコードサブユニットと、前記第１のバーコードサブユニットをコピーするために前記コピー鎖の前記３’末端を伸長させるための核酸ポリメラーゼとを含む、分配することと、
    ｉｉ．前記第１の反応体積セットをプールに組み合わせることと、
    ｉｉｉ．前記プールを第２の反応体積セットに分配することであって、各体積が、第２のバーコードサブユニットと、前記コピー鎖の前記３’末端を更に伸長して前記第２のバーコードサブユニットをコピーするための核酸ポリメラーゼとを含む、分配することと
    を１ラウンド以上含むスプリットプールプロセスにより、順次結合させることによって、前記コピー鎖上に細胞特性化合物バーコードを形成することと、
    ｃ．前記細胞特性化合物バーコードを含む前記伸長されたコピー鎖の配列を決定し、それにより、前記複数の細胞中の前記複数の標的核酸を検出することと、を含む、方法。
  2. 配列決定の前に、前記細胞特性化合物バーコードを含む前記伸長されたコピー鎖を増幅する工程を更に含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記オリゴヌクレオチドプライマーがバーコードを含む、請求項１に記載の方法。
  4. 前記オリゴヌクレオチドプライマーがユニバーサル増幅プライマー結合部位を含む、請求項２に記載の方法。
  5. コピーされる最後のバーコードサブユニットがユニバーサル増幅プライマー結合部位を含む、請求項２に記載の方法。
  6. 前記バーコードサブユニットが、サブユニットハイブリダイゼーションの安定性を低下させる１つ以上の修飾ヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
  7. 前記修飾ヌクレオチドが、前記バーコードサブユニットの５’末端に位置するイソヌクレオチドである、請求項６に記載の方法。
  8. 前記標的核酸がＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
  9. 前記オリゴヌクレオチドプライマーが標的特異的配列を含む、請求項１に記載の方法。
  10. 前記オリゴヌクレオチドプライマーがバーコードを含む、請求項１に記載の方法。
  11. 前記標的核酸がＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
  12. 前記核酸ポリメラーゼが逆転写酵素である、請求項１に記載の方法。
  13. 前記１つ以上の非鋳型ヌクレオチドがデオキシシトシンである、請求項１に記載の方法。
  14. 前記バーコードサブユニットが、前記１つ以上の非鋳型ヌクレオチドに相補的な部分を含む、請求項１に記載の方法。
  15. 複数の細胞中の複数の標的核酸を検出するためのキットであって、前記キットが、オリゴヌクレオチドプライマーと、逆転写酵素と、複数のバーコードサブユニットとを含み、各バーコードサブユニットがポリ－ｄＧ配列を含む、キット。
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