CN113766930A - Glp1受体的变异核酸文库 - Google Patents

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Abstract

本文提供了与胰高血糖素样肽‑1受体(GLP1R)文库有关的方法和组合物，所述文库具有编码包含GLP1R结合域的支架的核酸。本文所述的文库包括斑驳化的文库，其包含各自编码至少一个预定参考核酸序列的预定变体的核酸。本文进一步描述了当翻译所述核酸文库时生成的蛋白质文库。本文进一步描述了表达本文所述的斑驳化核酸文库的细胞文库。

Description

GLP1受体的变异核酸文库
交叉引用
本申请要求2019年2月26日提交的第62/810,377号美国临时专利申请、2019年4月5日提交的第62/830,316号美国临时专利申请、2019年5月31日提交的第62/855,836号美国临时专利申请、2019年9月23日提交的第62/904,563号美国临时专利申请、2019年12月6日提交的第62/945,049号美国临时专利申请和2020年1月14日提交的第62/961,104号美国临时专利申请的权益，其中每个临时申请均通过引用而整体并入。
背景技术
G蛋白偶联受体(GPCR)与多种疾病有关。因为GPCR通常在细胞中低水平表达，并且在纯化时非常不稳定，故而在获得合适的抗原中存在问题，因此难以产生针对GPCR的抗体。因此，需要靶向GPCR的用于治疗性干预的改良药剂。
援引并入
本说明书中所提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，其程度犹如具体地且单独地指出每个单独的出版物、专利或专利申请均通过引用而并入。
发明内容
本文提供了结合GLP1R的抗体或其抗体片段，其包含免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链：(a)其中所述免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:2303、2304、2305、2306、2307、2308、2309、2317、2318、2319、2320或2321所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、99％或100％相同的氨基酸序列；并且(b)其中所述免疫球蛋白轻链包含与SEQ ID NO:2310、2311、2312、2313、2314、2315或2316所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、99％或100％相同的氨基酸序列。本文进一步提供了结合GLP1R的抗体或其抗体片段，其中所述免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:2303所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、99％或100％相同的氨基酸序列；并且其中所述免疫球蛋白轻链包含与SEQ ID NO:2310所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、99％或100％相同的氨基酸序列。本文进一步提供了结合GLP1R的抗体或其抗体片段，其中所述免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:2304所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、99％或100％相同的氨基酸序列；并且其中所述免疫球蛋白轻链包含与SEQ ID NO:2311所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、99％或100％相同的氨基酸序列。本文进一步提供了结合GLP1R的抗体或其抗体片段，其中所述免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:2305所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、99％或100％相同的氨基酸序列；并且其中所述免疫球蛋白轻链包含与SEQ ID NO:2312所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、99％或100％相同的氨基酸序列。本文进一步提供了结合GLP1R的抗体或其抗体片段，其中所述免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:2306所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、99％或100％相同的氨基酸序列；并且其中所述免疫球蛋白轻链包含与SEQ ID NO:2313所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、99％或100％相同的氨基酸序列。本文进一步提供了结合GLP1R的抗体或其抗体片段，其中所述免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:2307所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、99％或100％相同的氨基酸序列；并且其中所述免疫球蛋白轻链包含与SEQ ID NO:2314所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、99％或100％相同的氨基酸序列。本文进一步提供了结合GLP1R的抗体或其抗体片段，其中所述免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:2308所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、99％或100％相同的氨基酸序列；并且其中所述免疫球蛋白轻链包含与SEQ IDNO:2315所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、99％或100％相同的氨基酸序列。本文进一步提供了结合GLP1R的抗体或其抗体片段，其中所述免疫球蛋白重链包含与SEQ IDNO:2309、2317、2318、2319所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、99％或100％相同的氨基酸序列；并且其中所述免疫球蛋白轻链包含与SEQ ID NO:2316所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、99％或100％相同的氨基酸序列。本文进一步提供了结合GLP1R的抗体或其抗体片段，其中所述抗体是单克隆抗体、多克隆抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、移植抗体、人抗体、人源化抗体、合成抗体、嵌合抗体、骆驼化抗体、单链Fv(scFv)、单链抗体、Fab片段、F(ab')2片段、Fd片段、Fv片段、单结构域抗体、分离的互补决定区(CDR)、双抗体、仅由单个单体可变域组成的片段、二硫键连接的Fv(sdFv)、胞内抗体、抗独特型(抗-Id)抗体，或它们的抗原结合片段。本文进一步提供了结合GLP1R的抗体或其抗体片段，其中所述抗体或其抗体片段是嵌合的或人源化的。本文进一步提供了结合GLP1R的抗体或其抗体片段，其中所述抗体在cAMP测定中的EC50小于约25纳摩尔。本文进一步提供了结合GLP1R的抗体或其抗体片段，其中所述抗体在cAMP测定中的EC50小于约20纳摩尔。本文进一步提供了结合GLP1R的抗体或其抗体片段，其中所述抗体在cAMP测定中的EC50小于约10纳摩尔。本文进一步提供了结合GLP1R的抗体或其抗体片段，其中所述抗体是GLP1R的激动剂。本文进一步提供了结合GLP1R的抗体或其抗体片段，其中所述抗体是GLP1R的拮抗剂。本文进一步提供了结合GLP1R的抗体或其抗体片段，其中所述抗体是GLP1R的别构调节剂。本文进一步提供了结合GLP1R的抗体或其抗体片段，其中所述GLP1R的别构调节剂是负别构调节剂。本文进一步提供了结合GLP1R的抗体或其抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包含CDR-H3，该CDR-H3包含SEQ ID NO:2277、2278、2281、2282、2283、2284、2285、2286、2289、2290、2291、2292、2294、2295、2296、2297、2298、2299、2300、2301或2302中的任一个的序列。
本文提供了包含多个核酸的核酸文库，其中每个核酸编码当翻译时编码免疫球蛋白支架的序列，其中所述免疫球蛋白支架包含CDR-H3环，该CDR-H3环包含GLP1R结合域，并且其中每个核酸包含编码所述GLP1R结合域的序列变体的序列。本文进一步提供了核酸文库，其中所述CDR-H3环的长度为约20至约80个氨基酸。本文进一步提供了核酸文库，其中所述CDR-H3环的长度为约80至约230个碱基对。本文进一步提供了核酸文库，其中所述免疫球蛋白支架进一步包含一个或多个选自轻链可变域(VL)、重链可变域(VH)、轻链恒定域(CL)和重链恒定域(CH)的结构域。本文进一步提供了核酸文库，其中所述VH结构域是IGHV1-18、IGHV1-69、IGHV1-8、IGHV3-21、IGHV3-23、IGHV3-30/33rn、IGHV3-28、IGHV3-74、IGHV4-39或IGHV4-59/61。本文进一步提供了核酸文库，其中所述VH结构域是IGHV1-69、IGHV3-30、IGHV3-23、IGHV3、IGHV1-46、IGHV3-7、IGHV1或IGHV1-8。本文进一步提供了核酸文库，其中所述VH结构域是IGHV1-69和IGHV3-30。本文进一步提供了核酸文库，其中所述VL结构域是IGKV1-39、IGKV1-9、IGKV2-28、IGKV3-11、IGKV3-15、IGKV3-20、IGKV4-1、IGLV1-51、IGLV2-14、IGLV1-40或IGLV3-1。本文进一步提供了核酸文库，其中所述VH结构域的长度为约90至约100个氨基酸。本文进一步提供了核酸文库，其中所述VL结构域的长度为约90至约120个氨基酸。本文进一步提供了核酸文库，其中所述VH结构域的长度为约280至约300个碱基对。本文进一步提供了核酸文库，其中所述VL结构域的长度为约300至约350个碱基对。本文进一步提供了核酸文库，其中所述文库包含至少105个不相同的核酸。本文进一步提供了核酸文库，其中所述免疫球蛋白支架包含单个免疫球蛋白结构域。本文进一步提供了核酸文库，其中所述免疫球蛋白支架包含至多100个氨基酸的肽。
本文提供了包含多个蛋白质的蛋白质文库，其中所述多个蛋白质中的每个蛋白质包含免疫球蛋白支架，其中所述免疫球蛋白支架包含CDR-H3环，该CDR-H3环包含GLP1R结合域的序列变体。本文进一步提供了蛋白质文库，其中所述CDR-H3环的长度为约20至约80个氨基酸。本文进一步提供了蛋白质文库，其中所述免疫球蛋白支架进一步包含一个或多个选自轻链可变域(VL)、重链可变域(VH)、轻链恒定域(CL)和重链恒定域(CH)的结构域。本文进一步提供了蛋白质文库，其中所述VH结构域是IGHV1-18、IGHV1-69、IGHV1-8、IGHV3-21、IGHV3-23、IGHV3-30/33rn、IGHV3-28、IGHV3-74、IGHV4-39或IGHV4-59/61。本文进一步提供了蛋白质文库，其中所述VH结构域是IGHV1-69、IGHV3-30、IGHV3-23、IGHV3、IGHV1-46、IGHV3-7、IGHV1或IGHV1-8。本文进一步提供了蛋白质文库，其中所述VH结构域是IGHV1-69和IGHV3-30。本文进一步提供了蛋白质文库，其中所述VL结构域是IGKV1-39、IGKV1-9、IGKV2-28、IGKV3-11、IGKV3-15、IGKV3-20、IGKV4-1、IGLV1-51、IGLV2-14、IGLV1-40或IGLV3-1。本文进一步提供了蛋白质文库，其中所述VH结构域的长度为约90至约100个氨基酸。本文进一步提供了蛋白质文库，其中所述VL结构域的长度为约90至约120个氨基酸。本文进一步提供了蛋白质文库，其中所述多个蛋白质用来生成拟肽文库。本文进一步提供了蛋白质文库，其中所述蛋白质文库包含抗体。
本文提供了包含多个蛋白质的蛋白质文库，其中所述多个蛋白质包含编码不同GPCR结合域的序列，并且其中每个GPCR结合域的长度为约20至约80个氨基酸。本文进一步提供了蛋白质文库，其中所述蛋白质文库包含肽。本文进一步提供了蛋白质文库，其中所述蛋白质文库包含免疫球蛋白。本文进一步提供了蛋白质文库，其中所述蛋白质文库包含抗体。本文进一步提供了蛋白质文库，其中所述多个蛋白质用来生成拟肽文库。
本文提供了包含如本文所述的核酸文库的载体文库。
本文提供了包含如本文所述的核酸文库的细胞文库。
本文提供了包含如本文所述的蛋白质文库的细胞文库。
本文提供了抗体，其中所述抗体包含CDR-H3，该CDR-H3包含SEQ ID NO:2277、2278、2281、2282、2283、2284、2285、2286、2289、2290、2291、2292、2294、2295、2296、2297、2298、2299、2300、2301或2302中的任一个的序列。
本文提供了抗体，其中所述抗体包含CDR-H3，该CDR-H3包含SEQ ID NO:2277、2278、2281、2282、2283、2284、2285、2286、2289、2290、2291、2292、2294、2295、2296、2297、2298、2299、2300、2301或2302中的任一个的序列；并且其中所述抗体是单克隆抗体、多克隆抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、移植抗体、人抗体、人源化抗体、合成抗体、嵌合抗体、骆驼化抗体、单链Fv(scFv)、单链抗体、Fab片段、F(ab')2片段、Fd片段、Fv片段、单结构域抗体、分离的互补决定区(CDR)、双抗体、仅由单个单体可变域组成的片段、二硫键连接的Fv(sdFv)、胞内抗体、抗独特型(抗-Id)抗体，或它们的抗原结合片段。
本文提供了抑制GLP1R活性的方法，其包括施用如本文所述的抗体或抗体片段。本文进一步提供了抑制GLP1R活性的方法，其中所述抗体或抗体片段是别构调节剂。本文进一步提供了抑制GLP1R活性的方法，其中所述抗体或抗体片段是负别构调节剂。本文进一步提供了治疗代谢紊乱的方法，其包括向有需要的受试者施用如本文所述的抗体或抗体片段。本文进一步提供了治疗代谢紊乱的方法，其中所述代谢紊乱是II型糖尿病或肥胖症。
本文提供了核酸文库，其包含：多个核酸，其中每个核酸编码当翻译时编码GLP1R结合免疫球蛋白的序列，其中所述GLP1R结合免疫球蛋白包含GLP1R结合域的变体，其中所述GLP1R结合域是GLP1R的配体，并且其中所述核酸文库包含至少10,000个变异免疫球蛋白重链和至少10,000个变异免疫球蛋白轻链。本文进一步提供了核酸文库，其中所述核酸文库包含至少50,000个变异免疫球蛋白重链和至少50,000个变异免疫球蛋白轻链。本文进一步提供了核酸文库，其中所述核酸文库包含至少100,000个变异免疫球蛋白重链和至少100,000个变异免疫球蛋白轻链。本文进一步提供了核酸文库，其中所述核酸文库包含至少105个不相同的核酸。本文进一步提供了核酸文库，其中所述免疫球蛋白重链当翻译时的长度为约90至约100个氨基酸。本文进一步提供了核酸文库，其中所述免疫球蛋白重链当翻译时的长度为约100至约400个氨基酸。本文进一步提供了核酸文库，其中所述变异免疫球蛋白重链当翻译时与SEQ ID NO:2303、2304、2305、2306、2307、2308、2309、2317、2318、2319、2320或2321具有至少80％的序列同一性。本文进一步提供了核酸文库，其中所述变异免疫球蛋白轻链当翻译时与SEQ ID NO:2310、2311、2312、2313、2314、2315或2316具有至少80％的序列同一性。
本文提供了核酸文库，其包含：多个核酸，其中每个核酸编码当翻译时编码GLP1R单结构域抗体的序列，其中所述多个序列中的每个序列包含编码重链上的CDR1、CDR2和CDR3中的至少一个的变异序列；其中所述文库包含至少30,000个变异序列；并且其中所述抗体或抗体片段以小于100nM的KD与其抗原结合。本文进一步提供了核酸文库，其中所述核酸文库包含至少50,000个变异免疫球蛋白重链和至少50,000个变异免疫球蛋白轻链。本文进一步提供了核酸文库，其中所述核酸文库包含至少100,000个变异免疫球蛋白重链和至少100,000个变异免疫球蛋白轻链。本文进一步提供了核酸文库，其中所述核酸文库包含至少105个不相同的核酸。本文进一步提供了核酸文库，其中所述免疫球蛋白重链当翻译时的长度为约90至约100个氨基酸。本文进一步提供了核酸文库，其中所述免疫球蛋白重链当翻译时的长度为约100至约400个氨基酸。本文进一步提供了核酸文库，其中所述变异免疫球蛋白重链当翻译时与SEQ ID NO:2303、2304、2305、2306、2307、2308、2309、2317、2318、2319、2320或2321具有至少80％的序列同一性。本文进一步提供了核酸文库，其中所述变异免疫球蛋白轻链当翻译时与SEQ ID NO:2310、2311、2312、2313、2314、2315或2316具有至少80％的序列同一性。
本文提供了GLP1R的拮抗剂，其包含SEQ ID NO:2279或2320。本文进一步提供了拮抗剂，其中所述拮抗剂的EC50不超过1.5nM。本文进一步提供了拮抗剂，其中所述拮抗剂的EC50不超过1.0nM。本文进一步提供了拮抗剂，其中所述拮抗剂的EC50不超过0.5nM。本文进一步提供了拮抗剂，其中所述拮抗剂是抗体或其抗体片段。
本文提供了核酸文库，其包含：多个核酸，其中每个核酸编码当翻译时编码GLP1R结合免疫球蛋白的序列，其中所述GLP1R结合免疫球蛋白包含GLP1R结合域的变体，其中所述GLP1R结合域是GLP1R的配体，并且其中所述核酸文库包含至少10,000个变异免疫球蛋白重链和至少10,000个变异免疫球蛋白轻链。本文进一步提供了核酸文库，其中所述核酸文库包含至少50,000个变异免疫球蛋白重链和至少50,000个变异免疫球蛋白轻链。本文进一步提供了核酸文库，其中所述核酸文库包含至少100,000个变异免疫球蛋白重链和至少100,000个变异免疫球蛋白轻链。本文进一步提供了核酸文库，其中所述核酸文库包含至少105个不相同的核酸。本文进一步提供了核酸文库，其中所述免疫球蛋白重链当翻译时的长度为约90至约100个氨基酸。本文进一步提供了核酸文库，其中所述免疫球蛋白重链当翻译时的长度为约100至约400个氨基酸。本文进一步提供了核酸文库，其中所述变异免疫球蛋白重链当翻译时与SEQ ID NO:2303、2304、2305、2306、2307、2308、2309、2317、2318、2319、2320或2321具有至少90％的序列同一性。本文进一步提供了核酸文库，其中所述变异免疫球蛋白轻链当翻译时与SEQ ID NO:2310、2311、2312、2313、2314、2315或2316具有至少90％的序列同一性。
本文提供了核酸文库，其包含：多个核酸，其中每个核酸编码当翻译时编码GLP1R单结构域抗体的序列，其中所述多个序列中的每个序列包含编码重链上的CDR1、CDR2和CDR3中的至少一个的变异序列；其中所述文库包含至少30,000个变异序列；并且其中所述抗体或抗体片段以小于100nM的KD与其抗原结合。本文进一步提供了核酸文库，其中所述核酸文库包含至少50,000个变异免疫球蛋白重链和至少50,000个变异免疫球蛋白轻链。本文进一步提供了核酸文库，其中所述核酸文库包含至少100,000个变异免疫球蛋白重链和至少100,000个变异免疫球蛋白轻链。本文进一步提供了核酸文库，其中所述核酸文库包含至少105个不相同的核酸。本文进一步提供了核酸文库，其中所述免疫球蛋白重链当翻译时的长度为约90至约100个氨基酸。本文进一步提供了核酸文库，其中所述免疫球蛋白重链当翻译时的长度为约100至约400个氨基酸。本文进一步提供了核酸文库，其中所述变异免疫球蛋白重链当翻译时与SEQ ID NO:2303、2304、2305、2306、2307、2308、2309、2317、2318、2319、2320或2321具有至少90％的序列同一性。本文进一步提供了核酸文库，其中所述变异免疫球蛋白轻链当翻译时与SEQ ID NO:2310、2311、2312、2313、2314、2315或2316具有至少90％的序列同一性。
本文提供了结合GLP1R的抗体或抗体片段，其包含免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链：(a)其中所述免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:2303、2304、2305、2306、2307、2308、2309、2317、2318、2319、2320或2321所示的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且(b)其中所述免疫球蛋白轻链包含与SEQ ID NO:2310、2311、2312、2313、2314、2315或2316所示的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。本文进一步提供了抗体或抗体片段，其中所述免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:2303所示的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且其中所述免疫球蛋白轻链包含与SEQ ID NO:2310所示的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。本文进一步提供了抗体或抗体片段，其中所述免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:2304所示的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且其中所述免疫球蛋白轻链包含与SEQ ID NO:2311所示的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。本文进一步提供了抗体或抗体片段，其中所述免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:2305所示的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且其中所述免疫球蛋白轻链包含与SEQ ID NO:2312所示的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。本文进一步提供了抗体或抗体片段，其中所述免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:2306所示的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且其中所述免疫球蛋白轻链包含与SEQ ID NO:2313所示的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。本文进一步提供了抗体或抗体片段，其中所述免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:2307所示的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且其中所述免疫球蛋白轻链包含与SEQ ID NO:2314所示的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。本文进一步提供了抗体或抗体片段，其中所述免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:2308所示的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且其中所述免疫球蛋白轻链包含与SEQ IDNO:2315所示的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。本文进一步提供了抗体或抗体片段，其中所述免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:2309所示的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且其中所述免疫球蛋白轻链包含与SEQ ID NO:2316所示的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。本文进一步提供了抗体或其抗体片段，其中所述抗体是单克隆抗体、多克隆抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、移植抗体、人抗体、人源化抗体、合成抗体、嵌合抗体、骆驼化抗体、单链Fv(scFv)、单链抗体、Fab片段、F(ab')2片段、Fd片段、Fv片段、单结构域抗体、分离的互补决定区(CDR)、双抗体、仅由单个单体可变域组成的片段、二硫键连接的Fv(sdFv)、胞内抗体、抗独特型(抗-Id)抗体，或它们的抗原结合片段。本文进一步提供了抗体或抗体片段，其中所述抗体或其抗体片段是嵌合的或人源化的。本文进一步提供了抗体或抗体片段，其中所述抗体在cAMP测定中的EC50小于约25纳摩尔。本文进一步提供了抗体或抗体片段，其中所述抗体在cAMP测定中的EC50小于约20纳摩尔。本文进一步提供了抗体或抗体片段，其中所述抗体在cAMP测定中的EC50小于约10纳摩尔。本文进一步提供了抗体或抗体片段，其中所述抗体是GLP1R的激动剂。本文进一步提供了抗体或抗体片段，其中所述抗体是GLP1R的拮抗剂。本文进一步提供了抗体或抗体片段，其中所述抗体是GLP1R的别构调节剂。本文进一步提供了抗体或抗体片段，其中所述GLP1R的别构调节剂是负别构调节剂。
本文提供了抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包含SEQ ID NO:2277、2278、2281、2282、2283、2284、2285、2286、2289、2290、2291、2292、2294、2295、2296、2297、2298、2299、2300、2301或2302中的任一个的序列或表27所示的序列。
本文提供了抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包含SEQ ID NO:2277、2278、2281、2282、2283、2284、2285、2286、2289、2290、2291、2292、2294、2295、2296、2297、2298、2299、2300、2301或2302中的任一个的序列或表27所示的序列；并且其中所述抗体是单克隆抗体、多克隆抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、移植抗体、人抗体、人源化抗体、合成抗体、嵌合抗体、骆驼化抗体、单链Fv(scFv)、单链抗体、Fab片段、F(ab')2片段、Fd片段、Fv片段、单结构域抗体、分离的互补决定区(CDR)、双抗体、仅由单个单体可变域组成的片段、二硫键连接的Fv(sdFv)、胞内抗体、抗独特型(抗-Id)抗体，或它们的抗原结合片段。
本文提供了GLP1R的拮抗剂，其包含SEQ ID NO:2279或2320。本文进一步提供了GLP1R的拮抗剂，其中所述拮抗剂的EC50不超过1.5nM。本文进一步提供了GLP1R的拮抗剂，其中所述拮抗剂的EC50不超过1.0nM。本文进一步提供了GLP1R的拮抗剂，其中所述拮抗剂的EC50不超过0.5nM。本文进一步提供了GLP1R的拮抗剂，其中所述拮抗剂是抗体或抗体片段。
本文提供了GLP1R的激动剂，其包含SEQ ID NO:2317。本文进一步提供了GLP1R的激动剂，其中所述激动剂的EC50不超过1.5nM。本文进一步提供了GLP1R的激动剂，其中所述激动剂的EC50不超过1.0nM。本文进一步提供了GLP1R的激动剂，其中所述激动剂的EC50不超过0.5nM。本文进一步提供了GLP1R的激动剂，其中所述激动剂是抗体或抗体片段。
本文提供了抑制GLP1R活性的方法，其包括施用如本文所述的抗体或抗体片段。本文进一步提供了抑制GLP1R活性的方法，其中所述抗体或抗体片段是别构调节剂。本文进一步提供了抑制GLP1R活性的方法，其中所述抗体或抗体片段是负别构调节剂。
本文提供了用于治疗代谢紊乱的方法，其包括向有需要的受试者施用如本文所述的抗体。本文提供了用于治疗代谢紊乱的方法，其中所述代谢紊乱是II型糖尿病或肥胖症。
本文提供了由本文所述的核酸文库编码的蛋白质文库，其中所述蛋白质文库包含肽。本文进一步提供了蛋白质文库，其中所述蛋白质文库包含免疫球蛋白。本文进一步提供了蛋白质文库，其中所述蛋白质文库包含抗体。本文进一步提供了蛋白质文库，其中所述蛋白质文库是拟肽文库。
本文提供了包含如本文所述的核酸文库的载体文库。本文提供了包含如本文所述的核酸文库的细胞文库。本文提供了包含如本文所述的蛋白质文库的细胞文库。
附图说明
图1A描绘了免疫球蛋白支架的第一示意图。
图1B描绘了免疫球蛋白支架的第二示意图。
图2描绘了用于放置在支架中的基序的示意图。
图3呈现了说明如本文所公开的基因合成的示例性处理工作流程的步骤图。
图4示出了计算机系统的示例。
图5是示出计算机系统的架构的框图。
图6是说明网络的示图，该网络被配置用于并入多个计算机系统、多个蜂窝电话和个人数据助理，以及网络附加存储(NAS)。
图7是使用共享虚拟地址存储空间的多处理器计算机系统的框图。
图8A描绘了包含使用连接体连接至VL结构域的VH结构域的免疫球蛋白支架的示意图。
图8B描绘了免疫球蛋白支架的全结构结构的示意图，该免疫球蛋白支架包含使用连接体连接至VL结构域的VH结构域、前导序列和pIII序列。
图8C描绘了VL或VH结构域的四个框架元件(FW1、FW2、FW3、FW4)和可变的3个CDR(L1、L2、L3)元件的示意图。
图9A-9O描绘了GLP1R-2(图9A)、GLP1R-3(图9B)、GLP1R-8(图9C)、GLP1R-26(图9D)、GLP1R-30(图9E)、GLP1R-56(图9F)、GLP1R-58(图9G)、GLP1R-10(图9H)、GLP1R-25(图9I)、GLP1R-60(图9J)、GLP1R-70(图9K)、GLP1R-72(图9L)、GLP1R-83(图9M)、GLP1R-93(图9N)和GLP1R-98(图9O)的细胞结合数据。
图10A-10O描绘了GLP1R-2(图10A)、GLP1R-3(图10B)、GLP1R-8(图10C)、GLP1R-26(图10D)、GLP1R-30(图10E)、GLP1R-56(图10F)、GLP1R-58(图10G)、GLP1R-10(图10H)、GLP1R-25(图10I)、GLP1R-60(图10J)、GLP1R-70(图10K)、GLP1R-72(图10L)、GLP1R-83(图10M)、GLP1R-93(图10N)和GLP1R-98(图10O)变体对抑制GLP1-7-36肽诱导的cAMP活性的图示。
图11A-11G描绘了GLP1R-2(图11A)、GLP1R-3(图11B)、GLP1R-8(图11C)、GLP1R-26(图11D)、GLP1R-30(图11E)、GLP1R-56(图11F)和GLP1R-58(图11G)的细胞功能数据。
图12A-12G描绘了GLP1R-2(图12A)、GLP1R-3(图12B)、GLP1R-8(图12C)、GLP1R-26(图12D)、GLP1R-30(图12E)、GLP1R-56(图12F)和GLP1R-58(图12G)变体对抑制毒蜥外泌肽-4肽诱导的cAMP活性的图示。
图13描绘了胰高血糖素、GLP1-1和GLP-2的示意图。
图14A-14C描绘了纯化的免疫球蛋白的细胞结合亲和力。
图14D描绘了纯化的免疫球蛋白的cAMP活性。
图15A-15H描绘了对于GLP1R-238(图15A)、GLP1R-240(图15B)、GLP1R-241(图15C)、GLP1R-242(图15D)、GLP1R-243(图15E)、GLP1R-244(图15F)、pGPCR-GLP1R-43(图15G)和pGPCR-GLP1R-44(图15H)，以纳摩尔(nM)为单位的IgG浓度相对于MFI(平均荧光强度)绘制的结合曲线。
图16A-16I描绘了采用GLP1R-238(图16A)、GLP1R-240(图16B)、GLP1R-241(图16C)、GLP1R-242(图16D)、GLP1R-243(图16E)、GLP1R-244(图16F)、pGPCR-GLP1R-43(图16G)、pGPCR-GLP1R-44(图16H)和GLP1R-239(图16I)的100nM IgG，以点图形式呈现的结合测定的流式细胞术数据。
图17A-17B描绘了来自cAMP测定的数据，y轴是相对发光单位(RLU)，x轴是以纳摩尔(nM)为单位的浓度。响应于GLP1(7-36)、GLP1R-238、GLP1R-239、GLP1R-240、GLP1R-241、GLP1R-242、GLP1R-243、GLP1R-244、pGPCR-GLP1R-43、pGPCR-GLP1R-44和缓冲液测量cAMP。
图17C描绘了GLP1R-241的cAMP别构效应图。
图17D描绘了GLP1R-241的β-抑制蛋白募集图。
图17E描绘了GLP1R-241内化图。
图18A-18B描绘了来自cAMP测定的数据，y轴是相对发光单位(RLU)，x轴是以纳摩尔(nM)为单位的GLP1(7-36)浓度。测试了GLP1R-238、GLP1R-239、GLP1R-240、GLP1R-241、GLP1R-242、GLP1R-243、GLP1R-244、pGPCR-GLP1R-43、pGPCR-GLP1R-44和无抗体的别构效应。
图19A-19F描绘了对于GLP1R-59-2(图19A)、GLP1R-59-241(图19B)、GLP1R-59-243(图19C)、GLP1R-3(图19D)、GLP1R-241(图19E)和GLP1R-2(图19F)，以点图和直方图的形式呈现的结合测定的流式细胞术数据。图19A-19F还描绘了对于GLP1R-59-2(图19A)、GLP1R-59-241(图19B)、GLP1R-59-243(图19C)、GLP1R-3(图19D)、GLP1R-241(图19E)和GLP1R-2(图19F)，以纳摩尔(nM)为单位的IgG浓度相对于MFI(平均荧光强度)绘制的滴定曲线。
图20A-20F描绘了对于GLP1R-59-2(图20A)、GLP1R-59-241(图20B)、GLP1R-59-243(图20C)、GLP1R-3(图20D)、GLP1R-241(图20E)和GLP1R-2(图20F)，来自cAMP测定的数据，y轴是相对发光单位(RLU)，x轴是以纳摩尔(nM)为单位的GLP1(7-36)浓度，以及β-抑制蛋白募集和受体内化。
图21A-21B描绘了VHH文库的TIGIT亲和力分布图，描绘了20至4000的亲和力阈值(图21A)或20至1000的亲和力阈值(图21B)。在140个VHH结合物中，51个变体<100nM，90个变体<200nM。
图22A-22B描绘了GLP1R-43-77的FAC分析图(图22A)以及剂量曲线图和特异性图(图22B)。
图23A描绘了重链IGHV3-23设计的示意图。
图23B描绘了重链IGHV1-69设计的示意图。
图23C描绘了轻链IGKV 2-28和IGLV 1-51设计的示意图。
图23D描绘了GLP1R文库的理论多样性和最终多样性的示意图。
图23E-23F描绘了GLP1R IgG的FACS结合图。
图23G-23H描绘了使用纯化的GLP1R IgG的cAMP测定的图示。
图24A描绘了与无抗体相比的GLP1R-3抑制图。y轴描绘了相对发光单位(RLU)，x轴以纳摩尔(nM)为单位描绘了GLP1(7-36)的浓度。
图24B描绘了用0.05nM GLP1(7-36)刺激后，高浓度下GLP1R-3抑制的图示。y轴描绘了相对发光单位(RLU)，x轴以纳摩尔(nM)为单位描绘了GLP1R-3的浓度。
图24C描绘了在饮食诱发肥胖的小鼠模型中，当用媒介物(三角形)、利拉鲁肽(正方形)和GLP1R-3(圆形)处理时，施用葡萄糖后的葡萄糖水平。
图24D描绘了在饮食诱发肥胖的小鼠模型中，当用媒介物(空心三角形)、利拉鲁肽(正方形)和GLP1R-59-2(实心三角形)处理时，施用葡萄糖后的葡萄糖水平。
图25A描绘了用GLP1R-59-2(激动剂)、GLP1R-3(拮抗剂)和对照随时间(以分钟为单位，x轴)处理的小鼠的血糖水平(mg/dL；y轴)图。
图25B描绘了用GLP1R-59-2(激动剂)、GLP1R-3(拮抗剂)和对照处理的小鼠的血糖水平(mg/dL；y轴)图。
图25C描绘了与对照相比，在禁食(p＝0.0008)和非禁食(p<0.0001)小鼠中，经GLP1R-59-2(激动剂)处理的小鼠的血糖水平(mg/dL；y轴)图。
图25D描绘了预先给药的GLP1R-59-2(激动剂)、GLP1R-3(拮抗剂)和对照小鼠的血糖水平(mg/dL/min；y轴)图。
具体实施方式
除非另有说明，否则本公开采用在本领域技术范围内的常规分子生物学技术。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同的含义。
定义
贯穿本公开内容，多个实施方案以范围格式给出。应当理解，范围格式的描述只是为了方便和简明，而不应被解释为对任何实施方案的范围的硬性限制。因此，除非上下文另有明确规定，否则对范围的描述应被认为明确公开了所有可能的子范围以及该范围内精确到下限单位十分之一的各个数值。例如，对诸如从1至6的范围的描述应被认为已经明确公开了诸如从1至3、从1至4、从1至5、从2至4、从2至6、从3至6等子范围，以及该范围内的各个值，例如，1.1、2、2.3、5和5.9。无论范围的宽度如何，这都是适用的。这些中间范围的上限和下限可独立地包括在更小的范围内，并且也被涵盖于本公开内容中，受所述范围中任何具体排除的限值所约束。除非上下文另有明确规定，否则在所述范围包括限值之一或两者的情况下，排除了这些所包含的限值中的任一个或两者的范围也被包括在本公开内容中。
本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，而非旨在限制任何实施方案。除非上下文另有明确规定，否则如本文所用的单数形式“一个”、“一种”和“该”也意欲包括复数形式。进一步应当理解，术语“包括”和/或“包含”在本说明书中使用时指代所述特征、整数、步骤、操作、元件和/或组分的存在，但不排除存在或添加一个或多个其他特征、整数、步骤、操作、元件、组分和/或其群体。如本文所用的，术语“和/或”包括一个或多个相关所列项目的任何及所有组合。
除非具体说明或从上下文中可以明显看出，否则如本文所用的，关于数字或数字范围的术语“约”应被理解为表示所述数字及其+/-10％的数字，或者对于范围列出的值，表示低于所列下限的10％至高于所列上限的10％。
除非具体说明，否则如本文所用的，术语“核酸”涵盖双链或三链核酸以及单链分子。在双链或三链核酸中，核酸链不必共同延伸(即，双链核酸不必沿两条链的全长都是双链的)。当提供时，核酸序列以5’至3’的方向列出，除非另有说明。本文所述的方法提供了分离的核酸的生成。本文所述的方法另外提供了分离并纯化的核酸的生成。本文提及的“核酸”在长度上可包含至少5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000个或更多个碱基。而且，本文提供了合成任意数目的编码多肽区段的核苷酸序列的方法，该序列包括编码非核糖体肽(NRP)的序列，编码以下物质的序列：非核糖肽合成酶(NRPS)模块和合成变体、其它模块化蛋白质如抗体的多肽区段、来自其它蛋白质家族的多肽区段，包括非编码DNA或RNA，如调节序列，例如启动子、转录因子、增强子、siRNA、shRNA、RNAi、miRNA、衍生自微小RNA的核仁小RNA，或任何感兴趣的功能性或结构性DNA或RNA单元。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段的编码区或非编码区、基因间DNA、由连锁分析限定的基因座(多个基因座)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微小RNA(miRNA)、核仁小RNA、核酶、互补DNA(cDNA)(其为mRNA的DNA呈现形式，通常通过信使RNA(mRNA)的逆转录或通过扩增来获得)；经合成或通过扩增产生的DNA分子、基因组DNA、重组多核苷酸、支链多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。编码本文提及的基因或基因片段的cDNA可包含至少一个编码外显子序列的区域，而没有基因组等同序列中的间插内含子序列。
GLP1受体的GPCR文库
本文提供了与胰高血糖素样肽-1受体(GLP1R)的G蛋白偶联受体(GPCR)结合文库有关的方法和组合物，所述文库包含编码含有GPCR结合域的支架的核酸。如本文所述的支架可以稳定地支撑GPCR结合域。可以基于GLP1R配体与GLP1R的表面相互作用来设计GPCR结合域。如本文所述的文库可以进一步被斑驳化(variegated)，以提供包含各自编码至少一个预定参考核酸序列的预定变体的核酸的变体文库。本文进一步描述了可以在翻译所述核酸文库时生成的蛋白质文库。在一些情况下，将如本文所述的核酸文库转移到细胞中以生成细胞文库。本文还提供了使用本文所述的方法合成的文库的下游应用。下游应用包括鉴定具有增强的生物学相关功能(例如，改善的稳定性、亲和力、结合、功能活性)和用于治疗或预防与GPCR信号传导相关的疾病状态的变异核酸或蛋白质序列。
支架文库
本文提供了包含编码支架的核酸的文库，其中编码GPCR结合域的序列被置于该支架中。本文所述的支架允许一定范围的GPCR结合域编码序列在插入该支架中时与插入未修饰的支架时相比改善的稳定性。示例性的支架包括但不限于蛋白质、肽、免疫球蛋白、其衍生物或它们的组合。在一些情况下，该支架是免疫球蛋白。本文所述的支架具有改善的功能活性、结构稳定性、表达、特异性或其组合。在一些情况下，支架包含用于支撑GPCR结合域的长区域。
本文提供了包含编码支架的核酸的文库，其中该支架是免疫球蛋白。在一些情况下，该免疫球蛋白是抗体。如本文所用的，术语抗体将被理解为包括具有典型抗体分子的特征性双臂、Y形的蛋白质以及保留与抗原特异性结合的能力的抗体的一个或多个片段。示例性抗体包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、移植抗体、人抗体、人源化抗体、合成抗体、嵌合抗体、骆驼化抗体、单链Fv(scFv)(包括这样的片段，其中VL和VH使用重组方法通过合成或天然连接体连接，该连接体使它们能够成为单蛋白质链，其中VL和VH区配对形式单价分子，包括单链Fab和scFab)、单链抗体、Fab片段(包括包含VL、VH、CL和CH1结构域的单价片段)、F(ab′)2片段(包括包含在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段)、Fd片段(包括包含VH和CH1片段的片段)、Fv片段(包括包含抗体单臂的VL和VH结构域的片段)、单结构域抗体(dAb或sdAb)(包括包含VH结构域的片段)、分离的互补决定区(CDR)、双抗体(包括包含二价二聚体的片段，该二聚体例如是彼此结合并识别两种不同抗原的两个VL和VH结构域)、仅由单个单体可变域组成的片段、二硫键连接的Fv(sdFv)、胞内抗体、抗独特型(抗-Id)抗体，或它们的抗原结合片段。在一些情况下，本文公开的文库包含编码支架的核酸，其中该支架是Fv抗体，包括由包含完整抗原识别和抗原结合位点的最小抗体片段组成的Fv抗体。在一些实施方案中，该Fv抗体由紧密、非共价缔合的一个重链可变域和一个轻链可变域的二聚体组成，并且每个可变域的三个高变区相互作用以在该VH-VL二聚体的表面上限定抗原结合位点。在一些实施方案中，这六个高变区为抗体赋予抗原结合特异性。在一些实施方案中，单个可变域(或仅包含对抗原为特异性的三个高变区的Fv的一半，包括包含一个重链可变域的从骆驼科动物分离的单结构域抗体，如VHH抗体或纳米抗体)具有识别并结合抗原的能力。在一些情况下，本文公开的文库包含编码支架的核酸，其中该支架是单链Fv或scFv，包括包含VH、VL或VH和VL结构域两者的抗体片段，其中这两个结构域均存在于单个多肽链中。在一些实施方案中，Fv多肽在VH与VL结构域之间进一步包含多肽连接体，从而允许scFv形成用于抗原结合的所需结构。在一些情况下，scFv连接至Fc片段，或VHH连接至Fc片段(包括小抗体)。在一些情况下，所述抗体包含免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性片段，例如，含有抗原结合位点的分子。免疫球蛋白分子是任何类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如IgG 1、IgG 2、IgG 3、IgG 4、IgA1和IgA2)或亚类的。
在一些实施方案中，文库包含适用于预期治疗靶标的种类的免疫球蛋白。通常，这些方法包括“哺乳动物化”，并且包括将供体抗原结合信息转移到免疫原性较低的哺乳动物抗体接受体以生成有用的治疗性处理的方法。在一些情况下，该哺乳动物是小鼠、大鼠、马、绵羊、牛、灵长类动物(例如黑猩猩、狒狒、大猩猩、猩猩、猴)、狗、猫、猪、驴、兔和人。在一些情况下，本文提供了用于抗体的猫科动物化和犬科动物化的文库和方法。
非人抗体的“人源化”形式可以是含有衍生自非人抗体的最小序列的嵌合抗体。人源化抗体通常是人抗体(接受体抗体)，其中来自一个或多个CDR的残基被替换为来自非人抗体(供体抗体)的一个或多个CDR的残基。供体抗体可以是任何合适的非人抗体，如具有所需特异性、亲和力或生物学效应的小鼠、大鼠、兔、鸡或非人灵长类动物抗体。在一些情况下，接受体抗体的选定框架区残基被替换为来自供体抗体的相应框架区残基。人源化抗体还可包含在接受体抗体或供体抗体中均未发现的残基。在一些情况下，进行这些修饰以进一步改进抗体性能。
“犬科动物化”可包括将非犬抗原结合信息从供体抗体转移到免疫原性较低的犬抗体接受体以生成可在狗中用作治疗剂的治疗的方法。在一些情况下，本文提供的非犬抗体的犬科动物化形式是含有衍生自非犬抗体的最小序列的嵌合抗体。在一些情况下，犬科动物化抗体是犬抗体序列(“接受体”或“受体”抗体)，其中接受体的高变区残基被替换为来自非犬物种(“供体”抗体)如小鼠、大鼠、兔、猫、狗、山羊、鸡、牛、马、美洲驼、骆驼、单峰驼、鲨鱼、非人灵长类动物、人、人源化、重组序列或具有所需性质的工程化序列的高变区残基。在一些情况下，犬抗体的框架区(FR)残基被替换为相应的非犬FR残基。在一些情况下，犬科动物化抗体包括在接受体抗体或供体抗体中未发现的残基。在一些情况下，进行这些修饰以进一步改进抗体性能。犬科动物化抗体还可包含犬抗体的免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分。
“猫科动物化”可包括将非猫抗原结合信息从供体抗体转移到免疫原性较低的猫抗体接受体以生成可在猫中用作治疗剂的治疗的方法。在一些情况下，本文提供的非猫抗体的猫科动物化形式是含有衍生自非猫抗体的最小序列的嵌合抗体。在一些情况下，猫科动物化抗体是猫抗体序列(“接受体”或“受体”抗体)，其中接受体的高变区残基被替换为来自非猫物种(“供体”抗体)如小鼠、大鼠、兔、猫、狗、山羊、鸡、牛、马、美洲驼、骆驼、单峰驼、鲨鱼、非人灵长类动物、人、人源化、重组序列或具有所需性质的工程化序列的高变区残基。在一些情况下，猫抗体的框架区(FR)残基被替换为相应的非猫FR残基。在一些情况下，猫科动物化抗体包括在接受体抗体或供体抗体中未发现的残基。在一些情况下，进行这些修饰以进一步改进抗体性能。猫科动物化抗体还可包含猫抗体的免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分。
本文提供了包含编码支架的核酸的文库，其中该支架是非免疫球蛋白。在一些情况下，该支架是非免疫球蛋白结合域。例如，该支架是抗体模拟物。示例性抗体模拟物包括但不限于anticalins、affilins、affibody分子、affimers、affitins、alphabodies、avimers、atrimers、DARPins、fynomers、基于Kunitz结构域的蛋白质、单抗体(monobodies)、anticalins、knottins、基于犰狳重复蛋白的蛋白质和双环肽。
本文所述的包含编码支架的核酸的文库(其中该支架是免疫球蛋白)在该免疫球蛋白的至少一个区域中包含变异。用于变异的抗体的示例性区域包括但不限于互补决定区(CDR)、可变域或恒定域。在一些情况下，该CDR是CDR1、CDR2或CDR3。在一些情况下，该CDR是重链结构域，包括但不限于CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。在一些情况下，该CDR是轻链结构域，包括但不限于CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在一些情况下，该可变域是轻链可变域(VL)或重链可变域(VH)。在一些情况下，该VL结构域包含κ或λ链。在一些情况下，该恒定域是轻链恒定域(CL)或重链恒定域(CH)。
本文所述的方法提供了合成包含编码支架的核酸的文库，其中每个核酸编码至少一个预定参考核酸序列的预定变体。在一些情况下，该预定参考序列是编码蛋白质的核酸序列，并且该变体文库包含编码至少单个密码子的变异的序列，使得由合成核酸编码的后续蛋白质中单个残基的多个不同变体通过标准翻译过程生成。在一些情况下，该支架文库包含共同编码多个位置处的变异的变化的核酸。在一些情况下，该变体文库包含编码CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、VL或VH结构域的至少单个密码子的变异的序列。在一些情况下，该变体文库包含编码CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、VL或VH结构域的多个密码子的变异的序列。在一些情况下，该变体文库包含编码框架元件1(FW1)、框架元件2(FW2)、框架元件3(FW3)或框架元件4(FW4)的多个密码子的变异的序列。用于变异的密码子的示例性数目包括但不限于至少或大约1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、225、250、275、300个或超过300个密码子。
在一些情况下，用于变异的免疫球蛋白的至少一个区域来自重链V基因家族、重链D基因家族、重链J基因家族、轻链V基因家族或轻链J基因家族。参见图1A-1B。在一些情况下，轻链V基因家族包含免疫球蛋白κ(IGK)基因或免疫球蛋白λ(IGL)。示例性基因包括但不限于IGHV1-18、IGHV1-69、IGHV1-8、IGHV3-21、IGHV3-23、IGHV3-30/33rn、IGHV3-28、IGHV1-69、IGHV3-74、IGHV4-39、IGHV4-59/61、IGKV1-39、IGKV1-9、IGKV2-28、IGKV3-11、IGKV3-15、IGKV3-20、IGKV4-1、IGLV1-51、IGLV2-14、IGLV1-40和IGLV3-1。在一些情况下，该基因是IGHV1-69、IGHV3-30、IGHV3-23、IGHV3、IGHV1-46、IGHV3-7、IGHV1或IGHV1-8。在一些情况下，该基因是IGHV1-69和IGHV3-30。在一些情况下，该基因是IGHJ3、IGHJ6、IGHJ、IGHJ4、IGHJ5、IGHJ2或IGH1。在一些情况下，该基因是IGHJ3、IGHJ6、IGHJ或IGHJ4。
本文提供了包含编码免疫球蛋白支架的核酸的文库，其中所述文库用各种数目的片段合成。在一些情况下，所述片段包含CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、VL或VH结构域。在一些情况下，所述片段包含框架元件1(FW1)、框架元件2(FW2)、框架元件3(FW3)或框架元件4(FW4)。在一些情况下，用至少或大约2个片段、3个片段、4个片段、5个片段或多于5个片段合成所述支架文库。每个核酸片段的长度或合成的核酸的平均长度可以是至少或大约50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600个或超过600个碱基对。在一些情况下，该长度是大约50至600、75至575、100至550、125至525、150至500、175至475、200至450、225至425、250至400、275至375或300至350个碱基对。
当翻译时，包含编码如本文所述的免疫球蛋白支架的核酸的文库包含各种长度的氨基酸。在一些情况下，每个氨基酸片段的长度或合成的氨基酸的平均长度可以是至少或大约15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150个或超过150个氨基酸。在一些情况下，该氨基酸的长度是大约15至150、20至145、25至140、30至135、35至130、40至125、45至120、50至115、55至110、60至110、65至105、70至100或75至95个氨基酸。在一些情况下，该氨基酸的长度是约22个氨基酸至约75个氨基酸。在一些情况下，该免疫球蛋白支架包含至少或大约100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000个或超过5000个氨基酸。
使用本文所述的方法为用于变异的免疫球蛋白的至少一个区域从头合成大量变异序列。在一些情况下，为CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、VL、VH或其组合从头合成大量变异序列。在一些情况下，为框架元件1(FW1)、框架元件2(FW2)、框架元件3(FW3)或框架元件4(FW4)从头合成大量变异序列。变异序列的数目可以是至少或大约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500个或超过500个序列。在一些情况下，变异序列的数目是至少或大约500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000个或超过8000个序列。在一些情况下，变异序列的数目是大约10至500、25至475、50至450、75至425、100至400、125至375、150至350、175至325、200至300、225至375、250至350或275至325个序列。
在一些情况下，用于免疫球蛋白至少一个区域的变异序列在长度或序列上是各不相同的。在一些情况下，从头合成的至少一个区域是用于CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、VL、VH或其组合。在一些情况下，从头合成的至少一个区域是用于框架元件1(FW1)、框架元件2(FW2)、框架元件3(FW3)或框架元件4(FW4)。在一些情况下，该变异序列与野生型相比包含至少或大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50个或超过50个变异核苷酸或氨基酸。在一些情况下，该变异序列与野生型相比包含至少或大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45或50个额外的核苷酸或氨基酸。在一些情况下，该变异序列包含比野生型少至少或大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45或50个的核苷酸或氨基酸。在一些情况下，该文库包含至少或大约101、102、103、104、105、106、107、108、109、1010个或超过1010个变体。
在合成支架文库之后，可以将支架文库用于筛选和分析。例如，分析支架文库的文库可展示性和淘选。在一些情况下，使用选择性标签分析可展示性。示例性标签包括但不限于放射性标记、荧光标记、酶、化学发光标签、比色标签、亲和标签或本领域已知的其他标记或标签。在一些情况下，该标签是组氨酸、聚组氨酸、myc、血凝素(HA)或FLAG。
在一些情况下，通过使用各种方法的测序对支架文库进行分析，所述方法包括但不限于单分子实时(SMRT)测序、聚合酶克隆(Polony)测序、连接测序、可逆终止子测序、质子检测测序、离子半导体测序、纳米孔测序、电子测序、焦磷酸测序、Maxam-Gilbert测序、链终止(例如，Sanger)测序、+S测序或合成测序。
在一些情况下，分析支架文库的功能活性、结构稳定性(例如，热稳定或pH稳定)、表达、特异性或其组合。在一些情况下，分析支架文库中能够折叠的支架。在一些情况下，分析抗体区域的功能活性、结构稳定性、表达、特异性、折叠或其组合。例如，分析VH区或VL区的功能活性、结构稳定性、表达、特异性、折叠或其组合。
GLP1R文库
本文提供了GLP1R结合文库，其包含编码支架的核酸，所述支架包含GLP1R结合域的序列。在一些情况下，该支架是免疫球蛋白。在一些情况下，通过GLP1R结合域与GLP1R之间的相互作用来确定包含GLP1R结合域的序列的支架。
本文提供了包含编码包含GLP1R结合域的支架的核酸的文库，其中该GLP1R结合域是基于GLP1R上的表面相互作用而设计的。在一些情况下，该GLP1R包含如SEQ ID NO:1定义的序列。在一些情况下，GLP1R结合域与GLP1R的氨基或羧基端相互作用。在一些情况下，GLP1R结合域与至少一个跨膜结构域相互作用，该跨膜结构域包括但不限于跨膜结构域1(TM1)、跨膜结构域2(TM2)、跨膜结构域3(TM3)、跨膜结构域4(TM4)、跨膜结构域5(TM5)、跨膜结构域6(TM6)和跨膜结构域7(TM7)。在一些情况下，GLP1R结合域与GLP1R的细胞内表面相互作用。例如，GLP1R结合域与至少一个细胞内环相互作用，该细胞内环包括但不限于细胞内环1(ICL1)、细胞内环2(ICL2)和细胞内环3(ICL3)。在一些情况下，GLP1R结合域与GLP1R的细胞外表面相互作用。例如，GLP1R结合域与GLP1R的至少一个胞外域(ECD)或细胞外环(ECL)相互作用。该细胞外环包括但不限于细胞外环1(ECL1)、细胞外环2(ECL2)和细胞外环3(ECL3)。
本文描述了GLP1R结合域，其中基于GLP1R配体与GLP1R之间的表面相互作用设计该GLP1R结合域。在一些情况下，该配体是肽。在一些情况下，该配体是胰高血糖素、胰高血糖素样肽l-(7-36)酰胺、胰高血糖素样肽l-(7-37)、利拉鲁肽、毒蜥外泌肽-4、利西拉肽、T-0632、GLP1R0017或BETP。在一些情况下，该配体是GLP1R激动剂。在一些情况下，该配体是GLP1R拮抗剂。在一些情况下，该配体是GLP1R别构调节剂。在一些情况下，该别构调节剂是负别构调节剂。在一些情况下，该别构调节剂是正别构调节剂。
使用各种方法分析基于GLP1R配体与GLP1R之间表面相互作用的GLP1R结合域的序列。例如，进行多物种计算分析。在一些情况下，进行结构分析。在一些情况下，进行序列分析。可以使用本领域已知的数据库进行序列分析。数据库的非限制性实例包括但不限于NCBI BLAST(blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)、UCSC Genome Browser(genome.ucsc.edu/)、UniProt(www.uniprot.org/)和IUPHAR/BPS Guide toPHARMACOLOGY(guidetopharmacology.org/)。
本文描述了基于各种生物体之间的序列分析设计的GLP1R结合域。例如，进行序列分析以鉴定不同生物中的同源序列。示例性的生物包括但不限于小鼠、大鼠、马、绵羊、牛、灵长类动物(例如黑猩猩、狒狒、大猩猩、猩猩、猴)、狗、猫、猪、驴、兔、鱼、苍蝇和人。
在鉴定GLP1R结合域之后，可以生成包含编码GLP1R结合域的核酸的文库。在一些情况下，GLP1R结合域文库包含基于构象配体相互作用、肽配体相互作用、小分子配体相互作用、GLP1R的胞外域或靶向GLP1R的抗体设计的GLP1R结合域序列。在一些情况下，GLP1R结合域文库包含基于肽配体相互作用设计的GLP1R结合域的序列。GLP1R结合域的文库可以被翻译以生成蛋白质文库。在一些情况下，翻译GLP1R结合域的文库以生成肽文库、免疫球蛋白文库、其衍生物或它们的组合。在一些情况下，翻译GLP1R结合域的文库以生成蛋白质文库，进一步修饰所述蛋白质文库以生成拟肽文库。在一些情况下，翻译GLP1R结合域的文库以生成用于生成小分子的蛋白质文库。
本文所述的方法提供了GLP1R结合域文库的合成，该文库包含各自编码至少一个预定参考核酸序列的预定变体的核酸。在一些情况下，该预定参考序列是编码蛋白质的核酸序列，并且该变体文库包含编码至少单个密码子的变异的序列，使得由合成核酸编码的后续蛋白质中单个残基的多个不同变体通过标准翻译过程生成。在一些情况下，该GLP1R结合域文库包含共同编码多个位置处的变异的变化的核酸。在一些情况下，该变体文库包含编码GLP1R结合域中的至少单个密码子的变异的序列。在一些情况下，该变体文库包含编码GLP1R结合域中的多个密码子的变异的序列。用于变异的密码子的示例性数目包括但不限于至少或大约1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、225、250、275、300个或超过300个密码子。
本文所述的方法提供了合成包含编码GLP1R结合域的核酸的文库，其中该文库包含编码该GLP1R结合域的长度变异的序列。在一些情况下，该文库包含编码与预定参考序列相比少至少或大约1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、225、250、275、300个或超过300个密码子的长度变异的序列。在一些情况下，该文库包含编码与预定参考序列相比多至少或大约1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300个或超过300个密码子的长度变异的序列。
在鉴定GLP1R结合域后，可以将GLP1R结合域置于如本文所述的支架中。在一些情况下，该支架是免疫球蛋白。在一些情况下，将GLP1R结合域置于CDR-H3区域中。可以置于支架中的GPCR结合域也可以被称为基序。可以基于结合、特异性、稳定性、表达、折叠或下游活性来设计包含GLP1R结合域的支架。在一些情况下，包含GLP1R结合域的支架使得能够与GLP1R接触。在一些情况下，包含GLP1R结合域的支架使得能够与GLP1R高亲和力结合。GLP1R结合域的示例性氨基酸序列在表1中描述。
表1.GLP1R氨基酸序列
Figure BDA0003322188410000271
Figure BDA0003322188410000281
本文提供了包含GLP1R结合域的支架，其中该GLP1R结合域的序列支持与GLP1R的相互作用。该序列可以与GLP1R配体的序列同源或相同。在一些情况下，该GLP1R结合域序列与SEQ ID NO:1具有至少或大约70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些情况下，该GLP1R结合域序列与SEQ ID NO:1具有至少或大约95％的同源性。在一些情况下，该GLP1R结合域序列与SEQ ID NO:1具有至少或大约97％的同源性。在一些情况下，该GLP1R结合域序列与SEQ ID NO:1具有至少或大约99％的同源性。在一些情况下，该GLP1R结合域序列与SEQ ID NO:1具有至少或大约100％的同源性。在一些情况下，该GLP1R结合域序列至少包含具有SEQ ID NO:1的至少或大约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400个或超过400个氨基酸的部分。
术语“序列同一性”是指两个多核苷酸序列在比较窗口内是相同的(即，在逐个核苷酸的基础上)。术语“序列同一性百分比”如下计算：在比较窗口内比较两个最佳比对的序列，确定相同核酸碱基(例如，A、T、C、G、U或I)在两个序列中均出现的位置的数目以产生匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗口内的位置总数(即窗口大小)，并将结果乘以100以得到序列同一性的百分比。
术语两种蛋白质之间的“同源性”或“相似性”通过将一个蛋白质序列的氨基酸序列及其保守氨基酸置换物与第二个蛋白质序列进行比较来确定。相似性可以通过本领域公知的程序来确定，例如BLAST程序(国家生物信息中心的基本局部比对搜索工具)。
本文提供了GLP1R结合文库，其包含编码包含GLP1R结合域的支架的核酸，所述支架包含结构域类型、结构域长度方面的变异或残基变异。在一些情况下，该结构域是包含GLP1R结合域的支架中的区域。例如，该区域是VH、CDR-H3或VL结构域。在一些情况下，该结构域是GLP1R结合域。
本文所述的方法提供了合成各自编码至少一个预定参考核酸序列的预定变体的核酸的GLP1R结合文库。在一些情况下，该预定参考序列是编码蛋白质的核酸序列，并且该变体文库包含编码至少单个密码子的变异的序列，使得由合成核酸编码的后续蛋白质中单个残基的多个不同变体通过标准翻译过程生成。在一些情况下，该GLP1R结合文库包含共同编码多个位置处的变异的变化的核酸。在一些情况下，该变体文库包含编码VH、CDR-H3或VL结构域的至少单个密码子的变异的序列。在一些情况下，该变体文库包含编码GLP1R结合域中的至少单个密码子的变异的序列。例如，表1中列出的GLP1R结合域的至少一个单密码子是各不相同的。在一些情况下，该变体文库包含编码VH、CDR-H3或VL结构域的多个密码子的变异的序列。在一些情况下，该变体文库包含编码GLP1R结合域中的多个密码子的变异的序列。用于变异的密码子的示例性数目包括但不限于至少或大约1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、225、250、275、300个或超过300个密码子。
本文所述的方法提供了合成各自编码至少一个预定参考核酸序列的预定变体的核酸的GLP1R结合文库，其中该GLP1R结合文库包含编码结构域的长度变异的序列。在一些情况下，该结构域是VH、CDR-H3或VL结构域。在一些情况下，该结构域是GLP1R结合域。在一些情况下，该文库包含编码与预定参考序列相比少至少或大约1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、225、250、275、300个或超过300个密码子的长度变异的序列。在一些情况下，该文库包含编码与预定参考序列相比多至少或大约1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300个或超过300个密码子的长度变异的序列。
本文提供了GLP1R结合文库，其包含编码包含GLP1R结合域的支架的核酸，其中所述GLP1R结合文库用各种数目的片段合成。在一些情况下，所述片段包含VH、CDR-H3或VL结构域。在一些情况下，所述GLP1R结合文库用至少或大约2个片段、3个片段、4个片段、5个片段或多于5个片段合成。每个核酸片段的长度或合成的核酸的平均长度可以是至少或大约50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600个或超过600个碱基对。在一些情况下，该长度是大约50至600、75至575、100至550、125至525、150至500、175至475、200至450、225至425、250至400、275至375或300至350个碱基对。
当翻译时，如本文所述的包含编码含有GLP1R结合域的支架的核酸的GLP1R结合域文库包含各种长度的氨基酸。在一些情况下，每个氨基酸片段的长度或合成的氨基酸的平均长度可以是至少或大约15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150个或超过150个氨基酸。在一些情况下，该氨基酸长度是大约15至150、20至145、25至140、30至135、35至130、40至125、45至120、50至115、55至110、60至110、65至105、70至100或75至95个氨基酸。在一些情况下，该氨基酸长度是约22个至约75个氨基酸。
包含从头合成的编码含有GLP1R结合域的支架的变异序列的GLP1R结合文库包含大量变异序列。在一些情况下，为CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、VL、VH或其组合从头合成大量变异序列。在一些情况下，为框架元件1(FW1)、框架元件2(FW2)、框架元件3(FW3)或框架元件4(FW4)从头合成大量变异序列。在一些情况下，为GPCR结合域从头合成大量变异序列。例如，变异序列的数目对于VH结构域是约1个至约10个序列，对于GLP1R结合域是108个序列，对于VK结构域是约1个至约44个序列。变异序列的数目可以是至少或大约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500个或超过500个序列。在一些情况下，变异序列的数目是约10至300、25至275、50至250、75至225、100至200或125至150个序列。
包含从头合成的编码含有GLP1R结合域的支架的变异序列的GLP1R结合文库具有改善的多样性。例如，通过将GLP1R结合域变体置于包含N末端CDR-H3变异和C末端CDR-H3变异的免疫球蛋白支架变体中来生成变体。在一些情况下，变体包括亲和力成熟变体。备选地或组合地，变体包括免疫球蛋白其他区域中的变体，该区域包括但不限于CDR-H1、CDR-H2、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在一些情况下，GLP1R结合文库的变体的数目是至少或大约104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1015、1016、1017、1018、1019、1020或超过1020个不相同的序列。例如，包含约10个VH区变异序列、约237个CDR-H3区变异序列和约43个VL和CDR-L3区变异序列的文库包含105个不相同的序列(10x237x43)。
本文提供了包含编码GLP1R抗体的核酸的文库，该GLP1R抗体在该抗体的至少一个区域中包含变异，其中该区域是CDR区。在一些情况下，该GLP1R抗体是包含一个重链可变域的单结构域抗体，如VHH抗体。在一些情况下，该VHH抗体在一个或多个CDR区中包含变异。在一些情况下，本文所述的文库包含CDR1、CDR2或CDR3的至少或大约1、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1200、1400、1600、1800、2000、2400、2600、2800、3000个或超过3000个序列。在一些情况下，本文所述的文库包含CDR1、CDR2或CDR3的至少或大约104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1015、1016、1017、1018、1019、1020或超过1020个序列。例如，所述文库包含至少2000个CDR1序列、至少1200个CDR2序列和至少1600个CDR3序列。在一些情况下，每个序列是不相同的。
在一些情况下，所述CDR1、CDR2或CDR3是轻链可变域(VL)的。轻链可变域(VL)的CDR1、CDR2或CDR3可分别被称为CDR-L1、CDR-L2或CDR-L3。在一些情况下，本文所述的文库包含VL的CDR1、CDR2或CDR3的至少或大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1200、1400、1600、1800、2000、2400、2600、2800、3000个或超过3000个序列。在一些情况下，本文所述的文库包含VL的CDR1、CDR2或CDR3的至少或大约104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1015、1016、1017、1018、1019、1020或超过1020个序列。例如，所述文库包含至少20个VL的CDR1序列、至少4个VL的CDR2序列和至少140个VL的CDR3序列。在一些情况下，所述文库包含至少2个VL的CDR1序列、至少1个VL的CDR2序列和至少3000个VL的CDR3序列。在一些情况下，该VL是IGKV1-39、IGKV1-9、IGKV2-28、IGKV3-11、IGKV3-15、IGKV3-20、IGKV4-1、IGLV1-51、IGLV2-14、IGLV1-40或IGLV3-1。在一些情况下，该VL是IGKV2-28。在一些情况下，该VL是IGLV1-51。
在一些情况下，所述CDR1、CDR2或CDR3是重链可变域(VH)的。重轻链可变域(VH)的CDR1、CDR2或CDR3可分别被称为CDR-H1、CDR-H2或CDR-H3。在一些情况下，本文所述的文库包含VH的CDR1、CDR2或CDR3的至少或大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1200、1400、1600、1800、2000、2400、2600、2800、3000个或超过3000个序列。在一些情况下，本文所述的文库包含VH的CDR1、CDR2或CDR3的至少或大约104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1015、1016、1017、1018、1019、1020或超过1020个序列。例如，所述文库包含至少30个VH的CDR1序列、至少570个VH的CDR2序列和至少108个VH的CDR3序列。在一些情况下，所述文库包含至少30个VH的CDR1序列、至少860个VH的CDR2序列和至少107个VH的CDR3序列。在一些情况下，该VH是IGHV1-18、IGHV1-69、IGHV1-8、IGHV3-21、IGHV3-23、IGHV3-30/33rn、IGHV3-28、IGHV3-74、IGHV4-39或IGHV4-59/61。在一些情况下，该VH是IGHV1-69、IGHV3-30、IGHV3-23、IGHV3、IGHV1-46、IGHV3-7、IGHV1或IGHV1-8。在一些情况下，该VH是IGHV1-69和IGHV3-30。在一些情况下，该VH是IGHV3-23。
在一些实施方案中，如本文所述的文库包含不同长度的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2或CDR-H3。在一些情况下，该CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2或CDR-H3的长度包含至少或大约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90个或超过90个氨基酸。例如，该CDR-H3在长度上包含至少或大约12、15、16、17、20、21或23个氨基酸。在一些情况下，该CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2或CDR-H3在长度上包含约1至约10、约5至约15、约10至约20或约15至约30个范围内的氨基酸。
当翻译时，包含编码如本文所述的具有变异CDR序列的抗体的核酸的文库包含各种长度的氨基酸。在一些情况下，每个氨基酸片段的长度或合成的氨基酸的平均长度可以是至少或大约15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150个或超过150个氨基酸。在一些情况下，该氨基酸长度是大约15至150、20至145、25至140、30至135、35至130、40至125、45至120、50至115、55至110、60至110、65至105、70至100或75至95个氨基酸。在一些情况下，该氨基酸长度是约22个氨基酸至约75个氨基酸。在一些情况下，该抗体包含至少或大约100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000个或超过5000个氨基酸。
CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2或CDR-H3的长度比可以在本文所述的文库中变化。在一些情况下，在长度上包含至少或大约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90个或超过90个氨基酸的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2或CDR-H3占所述文库的约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或超过90％。例如，在长度上包含约23个氨基酸的CDR-H3以40％存在于文库中，在长度上包含约21个氨基酸的CDR-H3以30％存在于文库中，在长度上包含约17个氨基酸的CDR-H3以20％存在于文库中，在长度上包含约12个氨基酸的CDR-H3以10％存在于文库中。在一些情况下，在长度上包含约20个氨基酸的CDR-H3以40％存在于文库中，在长度上包含约16个氨基酸的CDR-H3以30％存在于文库中，在长度上包含约15个氨基酸的CDR-H3以20％存在于文库中，在长度上包含约12个氨基酸的CDR-H3以10％存在于文库中。
如本文所述的编码VHH抗体的文库包含经改组以生成理论多样性为至少或大约107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1015、1016、1017、1018、1019、1020或超过1020个序列的文库的变异CDR序列。在一些情况下，该文库的最终文库多样性为至少或大约107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1015、1016、1017、1018、1019、1020个或超过1020个序列。
本文提供了编码免疫球蛋白的GLP1R结合文库。在一些情况下，该GLP1R免疫球蛋白是抗体。在一些情况下，该GLP1R免疫球蛋白是VHH抗体。在一些情况下，该GLP1R免疫球蛋白对GLP1R的结合亲和力(例如kD)小于1nM、小于1.2nM、小于2nM、小于5nM、小于10nM、小于11nm、小于13.5nM、小于15nM、小于20nM、小于25nM或小于30nM。在一些情况下，该GLP1R免疫球蛋白具有小于1nM的kD。在一些情况下，该GLP1R免疫球蛋白具有小于1.2nM的kD。在一些情况下，该GLP1R免疫球蛋白具有小于2nM的kD。在一些情况下，该GLP1R免疫球蛋白具有小于5nM的kD。在一些情况下，该GLP1R免疫球蛋白具有小于10nM的kD。在一些情况下，该GLP1R免疫球蛋白具有小于13.5nM的kD。在一些情况下，该GLP1R免疫球蛋白具有小于15nM的kD。在一些情况下，该GLP1R免疫球蛋白具有小于20nM的kD。在一些情况下，该GLP1R免疫球蛋白具有小于25nM的kD。在一些情况下，该GLP1R免疫球蛋白具有小于30nM的kD。
在一些情况下，该GLP1R免疫球蛋白是GLP1R激动剂。在一些情况下，该GLP1R免疫球蛋白是GLP1R拮抗剂。在一些情况下，该GLP1R免疫球蛋白是GLP1R别构调节剂。在一些情况下，该别构调节剂是负别构调节剂。在一些情况下，该别构调节剂是正别构调节剂。在一些情况下，该GLP1R免疫球蛋白在至少或大约1nM、2nM、4nM、6nM、8nM、10nM、20nM、30nM、40nM、50nM、60nM、70nM、80nM、90nM、100nM、120nM、140nM、160nM、180nM、200nM、300nM、400nM、500nM、600nM、700nM、800nM、900nM、1000nM或超过1000nM的浓度下导致激动、拮抗或别构效应。在一些情况下，该GLP1R免疫球蛋白是负别构调节剂。在一些情况下，该GLP1R免疫球蛋白在至少或大约0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1nM、2nM、4nM、6nM、8nM、10nM、20nM、30nM、40nM、50nM、60nM、70nM、80nM、90nM、100nM或超过100nM的浓度下是负别构调节剂。在一些情况下，该GLP1R免疫球蛋白在约0.001至约100、0.01至约90、约0.1至约80、1至约50、约10至约40nM或约1至约10nM范围内的浓度下是负别构调节剂。在一些情况下，该GLP1R免疫球蛋白的EC50或IC50为至少或大约0.001、0.0025、0.005、0.01、0.025、0.05、0.06、0.07、0.08、0.9、0.1、0.5、1、2、3、4、5、6nM或超过6nM。在一些情况下，该GLP1R免疫球蛋白的EC50或IC50为至少或大约1nM、2nM、4nM、6nM、8nM、10nM、20nM、30nM、40nM、50nM、60nM、70nM、80nM、90nM、100nM或超过100nM。
本文提供了编码免疫球蛋白的GLP1R结合文库，其中该免疫球蛋白具有长半衰期。在一些情况下，该GLP1R免疫球蛋白的半衰期为至少或大约12小时、24小时、36小时、48小时、60小时、72小时、84小时、96小时、108小时、120小时、140小时、160小时、180小时、200小时或超过200小时。在一些情况下，该GLP1R免疫球蛋白的半衰期在约12小时至约300小时、约20小时至约280小时、约40小时至约240小时或约60小时至约200小时的范围内。
如本文所述的GLP1R免疫球蛋白可具有改善的性质。在一些情况下，该GLP1R免疫球蛋白是单体的。在一些情况下，该GLP1R免疫球蛋白不易聚集。在一些情况下，至少或大约70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的GLP1R免疫球蛋白是单体的。在一些情况下，该GLP1R免疫球蛋白是热稳定的。在一些情况下，该GLP1R免疫球蛋白导致非特异性结合减少。
在合成包含编码含有GLP1R结合域的支架的核酸的GLP1R结合文库之后，可将文库用于筛选和分析。例如，分析文库的文库可展示性和淘选。在一些情况下，使用选择性标签分析可展示性。示例性标签包括但不限于放射性标记、荧光标记、酶、化学发光标签、比色标签、亲和标签或本领域已知的其他标记或标签。在一些情况下，该标签是组氨酸、聚组氨酸、myc、血凝素(HA)或FLAG。在一些情况下，所述GLP1R结合文库包含编码支架的核酸，所述支架包含具有多个标签如GFP、FLAG和Lucy以及DNA条形码的GPCR结合域。在一些情况下，通过使用各种方法的测序对文库进行测定，所述方法包括但不限于单分子实时测序(SMRT)、聚合酶克隆(Polony)测序、连接测序、可逆终止子测序、质子检测测序、离子半导体测序、纳米孔测序、电子测序、焦磷酸测序、Maxam-Gilbert测序、链终止(例如，Sanger)测序、+S测序或合成测序。
表达系统
本文提供了包含编码含有GLP1R结合域的支架的核酸的文库，其中所述文库具有改善的特异性、稳定性、表达、折叠或下游活性。在一些情况下，本文所述的文库用于筛选和分析。
本文提供了包含编码含有GLP1R结合域的支架的核酸的文库，其中所述核酸文库用于筛选和分析。在一些情况下，筛选和分析包括体外、体内或离体测定。用于筛选的细胞包括取自活受试者的原代细胞或细胞系。细胞可以来自原核生物(例如细菌和真菌)或真核生物(例如动物和植物)。示例性的动物细胞包括但不限于来自小鼠、兔、灵长类动物和昆虫的动物细胞。在一些情况下，用于筛选的细胞包括细胞系，包括但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系、人胚肾(HEK)细胞系或幼仓鼠肾(BHK)细胞系。在一些情况下，本文所述的核酸文库也可以被递送至多细胞生物体。示例性的多细胞生物体包括但不限于植物、小鼠、兔、灵长类动物和昆虫。
可以针对各种药理学或药代动力学性质筛查本文所述的核酸文库或其编码的蛋白质文库。在一些情况下，使用体外测定、体内测定或离体测定来筛查文库。例如，所筛查的体外药理学或药代动力学性质包括但不限于结合亲和力、结合特异性和结合亲合力。所筛查的本文所述文库的示例性体内药理学或药代动力学性质包括但不限于治疗功效、活性、临床前毒性性质、临床功效性质、临床毒性性质、免疫原性、效力和临床安全性性质。
可以筛选的药理学或药代动力学性质包括但不限于细胞结合亲和力和细胞活性。例如，进行细胞结合亲和力测定或细胞活性测定，以确定本文所述的文库的激动、拮抗或别构效应。在一些情况下，该细胞活性测定是cAMP测定。在一些情况下，将本文所述的文库与GLP1R配体的细胞结合或细胞活性进行比较。
可以在基于细胞的测定或在非基于细胞的测定中筛查本文所述的文库。非基于细胞的测定的实例包括但不限于使用病毒颗粒、使用体外翻译蛋白质和使用具有GLP1R的脂蛋白体。
可通过测序筛查如本文所述的核酸文库。在一些情况下，使用下一代测序来确定GLP1R结合变体的序列富集。在一些情况下，确定V基因分布、J基因分布、V基因家族、每个长度的CDR3计数或其组合。在一些情况下，确定克隆频率、克隆积累、谱系积累或其组合。在一些情况下，确定序列数、具有VH克隆的序列、克隆、大于1的克隆、克隆型、大于1的克隆型、谱系、simpsons或其组合。在一些情况下，确定不相同的CDR3的百分比。例如，不相同的CDR3的百分比被计算为样品中不相同的CDR3的数目除以样品中具有CDR3的序列总数。
本文提供了核酸文库，其中所述核酸文库可以在载体中表达。用于插入本文公开的核酸文库的表达载体可包括真核或原核表达载体。示例性的表达载体包括但不限于哺乳动物表达载体：pSF-CMV-NEO-NH2-PPT-3XFLAG、pSF-CMV-NEO-COOH-3XFLAG、pSF-CMV-PURO-NH2-GST-TEV、pSF-OXB20-COOH-TEV-FLAG(R)-6His、pCEP4 pDEST27、pSF-CMV-Ub-KrYFP、pSF-CMV-FMDV-daGFP、pEF1a-mCherry-N1载体、pEF1a-tdTomato载体、pSF-CMV-FMDV-Hygro、pSF-CMV-PGK-Puro、pMCP-tag(m)和pSF-CMV-PURO-NH2-CMYC；细菌表达载体：pSF-OXB20-BetaGal、pSF-OXB20-Fluc、pSF-OXB20和pSF-Tac；植物表达载体：pRI 101-AN DNA和pCambia2301；和酵母表达载体：pTYB21和pKLAC2，以及昆虫载体：pAc5.1/V5-His A和pDEST8。在一些情况下，该载体是pcDNA3或pcDNA3.1。
本文描述了在载体中表达以生成包含支架的构建体的核酸文库，该支架包含GLP1R结合域的序列。在一些情况下，该构建体的大小各不相同。在一些情况下，该构建体包含至少或大约500、600、700、800、900、1000、1100、1300、1400、1500、1600、1700、1800、2000、2400、2600、2800、3000、3200、3400、3600、3800、4000、4200,4400、4600、4800、5000、6000、7000、8000、9000、10000个或超过10000个碱基。在一些情况下，该构建体包含约300至1,000、300至2,000、300至3,000、300至4,000、300至5,000、300至6,000、300至7,000、300至8,000、300至9,000、300至10,000、1,000至2,000、1,000至3,000、1,000至4,000、1,000至5,000、1,000至6,000、1,000至7,000、1,000至8,000、1,000至9,000、1,000至10,000、2,000至3,000、2,000至4,000、2,000至5,000、2,000至6,000、2,000至7,000、2,000至8,000、2,000至9,000、2,000至10,000、3,000至4,000、3,000至5,000、3,000至6,000、3,000至7,000、3,000至8,000、3,000至9,000、3,000至10,000、4,000至5,000、4,000至6,000、4,000至7,000、4,000至8,000、4,000至9,000、4,000至10,000、5,000至6,000、5,000至7,000、5,000至8,000、5,000至9,000、5,000至10,000、6,000至7,000、6,000至8,000、6,000至9,000、6,000至10,000、7,000至8,000、7,000至9,000、7,000至10,000、8,000至9,000、8,000至10,000或9,000至10,000个碱基的范围内。
本文提供了包含编码含有GPCR结合域的支架的核酸的文库，其中所述核酸文库在细胞中表达。在一些情况下，合成所述文库以表达报告基因。示例性的报告基因包括但不限于乙酰羟酸合酶(AHAS)、碱性磷酸酶(AP)、β-半乳糖苷酶(LacZ)、β-葡糖苷酸酶(GUS)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、青色荧光蛋白(CFP)、天蓝色荧光蛋白、黄水晶荧光蛋白、橙色荧光蛋白、樱桃荧光蛋白、绿松石荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、辣根过氧化物酶(HRP)、萤光素酶(Luc)、胭脂碱合酶(NOS)、章鱼碱合酶(OCS)、萤光素酶及其衍生物。确定报告基因的调节的方法是本领域公知的、并且包括但不限于荧光光度法(例如，荧光光谱法、荧光激活细胞分选(FACS)、荧光显微术)和抗生素抗性确定。
疾病和病症
本文提供了包含编码含有GLP1R结合域的支架的核酸的GLP1R结合文库，其可具有治疗效果。在一些情况下，所述GLP1R结合文库当翻译时产生蛋白质，该蛋白质用于治疗疾病或病症。在一些情况下，该蛋白质是免疫球蛋白。在一些情况下，该蛋白质是拟肽。
如本文所述的GLP1R文库可包含GLP1R的调节剂。在一些情况下，该GLP1R的调节剂是抑制剂。在一些情况下，该GLP1R的调节剂是活化剂。在一些情况下，该GLP1R抑制剂是GLP1R拮抗剂。在一些情况下，该GLP1R拮抗剂是GLP1R-3。在一些情况下，GLP1R-3包含SEQID NO:2279。在一些情况下，GLP1R-3包含SEQ ID NO:2320。在一些情况下，使用GLP1R的调节剂治疗各种疾病或病症。
示例性的疾病包括但不限于癌症、炎性疾病或病症、代谢疾病或紊乱、心血管疾病或病症、呼吸系统疾病或病症、疼痛、消化系统疾病或病症、生殖系统疾病或病症、内分泌疾病或病症或者神经系统疾病或病症。在一些情况下，该癌症是实体癌或血液系统癌症。在一些情况下，本文所述的GLP1R的调节剂用于治疗体重增加(或用于引起体重减轻)、治疗肥胖症或治疗II型糖尿病。在一些情况下，该GLP1R调节剂用于治疗低血糖症。在一些情况下，该GLP1R调节剂用于治疗减肥后低血糖症。在一些情况下，该GLP1R调节剂用于治疗重度低血糖症。在一些情况下，该GLP1R调节剂用于治疗高胰岛素血症。在一些情况下，该GLP1R调节剂用于治疗先天性高胰岛素血症。
在一些情况下，该受试者是哺乳动物。在一些情况下，该受试者是小鼠、兔、狗或人。通过本文描述的方法治疗的受试者可以是婴儿、成人或儿童。包含本文所述的抗体或抗体片段的药物组合物可以静脉内或皮下施用。
本文描述了包含结合GLP1R的抗体或其抗体片段的药物组合物。在一些实施方案中，所述抗体或其抗体片段包含免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链：其中所述免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:2303、2304、2305、2306、2307、2308、2309、2317、2318、2319、2320或2321所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、99％或100％相同的氨基酸序列；并且其中所述免疫球蛋白轻链包含与SEQ ID NO:2310、2311、2312、2313、2314、2315或2316所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗体或其抗体片段包含免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链。其中所述免疫球蛋白重链包含SEQ ID NO:2303、2304、2305、2306、2307、2308、2309、2317、2318、2319、2320或2321所示的氨基酸序列；并且其中所述免疫球蛋白轻链包含SEQ ID NO:2310、2311、2312、2313、2314、2315或2316所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗体或其抗体片段包含免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链：其中所述免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:2303所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、99％或100％相同的氨基酸序列；并且其中所述免疫球蛋白轻链包含与SEQ ID NO:2310所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗体或其抗体片段包含免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链：其中所述免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:2304所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、99％或100％相同的氨基酸序列；并且其中所述免疫球蛋白轻链包含与SEQ ID NO:2311所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗体或其抗体片段包含免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链：其中所述免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:2305所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、99％或100％相同的氨基酸序列；并且其中所述免疫球蛋白轻链包含与SEQ ID NO:2312所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗体或其抗体片段包含免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链：其中所述免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:2306所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、99％或100％相同的氨基酸序列；并且其中所述免疫球蛋白轻链包含与SEQ ID NO:2313所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗体或其抗体片段包含免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链：其中所述免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:2307所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、99％或100％相同的氨基酸序列；并且其中所述免疫球蛋白轻链包含与SEQ ID NO:2314所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗体或其抗体片段包含免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链：其中所述免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:2308所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、99％或100％相同的氨基酸序列；并且其中所述免疫球蛋白轻链包含与SEQ IDNO:2315所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗体或其抗体片段包含免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链：其中所述免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:2309所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、99％或100％相同的氨基酸序列；并且其中所述免疫球蛋白轻链包含与SEQ ID NO:2316所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在一些情况下，药物组合物包含本文所述的包含CDR-H3的抗体或抗体片段，该CDR-H3包含SEQ ID NO:2260-2276中的任一个的序列。在一些情况下，药物组合物包含本文所述的抗体或抗体片段，该抗体或抗体片段包含SEQ ID NO:2277-2295中的任一个的序列。在一些情况下，药物组合物包含本文所述的抗体或抗体片段，该抗体或抗体片段包含SEQID NO:2277、2278、2281、2282、2283、2284、2285、2286、2289、2290、2291、2292、2294或2295中的任一个的序列。在进一步的情况下，该药物组合物用于治疗代谢紊乱。
变体文库
密码子变异
本文所述的变异核酸文库可包含多个核酸，其中每个核酸编码与参考核酸序列相比的变异密码子序列。在一些情况下，第一核酸群体中的每个核酸在单变异位点处含有变体。在一些情况下，第一核酸群体在单变异位点处含有多个变体，使得第一核酸群体在相同变异位点处含有超过一个变体。第一核酸群体可包含在相同变异位点处共同编码多个密码子变体的核酸。第一核酸群体可包含在相同位置处共同编码多达19个或更多个密码子的核酸。第一核酸群体可包含在相同位置处共同编码多达60个变异三联体的核酸，或者第一核酸群体可包含在相同位置处共同编码多达61个不同密码子三联体的核酸。每个变体可编码在翻译过程中产生不同氨基酸的密码子。表3提供了对于变异位点可能的每个密码子(和代表性氨基酸)的列表。
表2.密码子和氨基酸列表
Figure BDA0003322188410000421
Figure BDA0003322188410000431
核酸群体可包含在多个位置处共同编码至多20个密码子变异的改变的核酸。在这类情况下，该群体中的每个核酸包含在相同核酸中超过一个位置处的密码子变异。在一些情况下，该群体中的每个核酸包含在单个核酸中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个密码子处的密码子变异。在一些情况下，每个变异长核酸包含在单个长核酸中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个密码子处的密码子变异。在一些情况下，该变异核酸群体包含在单个核酸中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个密码子处的密码子变异。在一些情况下，该变异核酸群体包含在单个长核酸中的至少约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100个或更多个密码子处的密码子变异。
高度平行的核酸合成
本文提供了一种平台方法，其利用从多核苷酸合成到硅上纳米孔内基因装配的端到端过程的小型化、平行化及垂直整合来创建革命性的合成平台。本文所述的装置采用与96孔板相同的占地面积(footprint)提供了这样一种硅合成平台，与传统合成方法相比，该硅合成平台能够将通量提高高达1,000倍或更多，其中在单次高度平行化运行中产生高达约1,000,000个或更多个多核苷酸或10,000个或更多个基因。
随着新一代测序的出现，高分辨率基因组数据已成为深入研究各种基因在正常生物学和疾病发病机理中的生物学作用的研究的重要因素。本研究的核心是分子生物学的中心法则和“连续信息的逐残基转移”的概念。将DNA中编码的基因组信息转录成信息，随后将其翻译成蛋白质，该蛋白质是给定生物学途径内的活性产物。
另一个令人兴奋的研究领域是关于着眼于高度特异性细胞靶标的治疗性分子的发现、研发和制备。高度多样性的DNA序列文库是靶向治疗剂的开发流程的核心。在设计、构建和测试蛋白质工程循环中使用基因突变体表达蛋白质，在理想情况下该循环得到针对对其治疗靶标具有高亲和力的蛋白质的高度表达而优化的基因。作为实例，考虑受体的结合口袋。同时测试结合口袋内所有残基的所有序列排列的能力将允许进行彻底的探索，从而增加成功的可能性。饱和诱变(其中研究人员试图在受体内的特定位点处生成所有可能的突变)代表了针对这种开发挑战的一种方法。虽然其成本高、耗时且耗力，但它能够将每个变体引入到每个位置。相反，组合诱变(其中几个选定的位置或短DNA段可得到广泛修饰)生成具有偏向呈现的变体的不完全组库。
为了加速药物开发流程，具有在可用于测试的正确位置处以预期频率可获得的所需变体的文库(换言之，精确文库)使得能够降低成本以及筛选的周转时间。本文提供了用于合成核酸合成变体文库的方法，其能够以所需的频率精确引入每种期望的变体。对于最终用户来说，这意味着不仅能够彻底对序列空间进行采样，而且能够以有效的方式查询这些假设，从而降低成本和筛选时间。全基因组编辑可以阐明重要的途径，可以检测每个变体和序列排列以获得最佳功能性的文库，并且可以使用数以千计的基因重建整个途径和基因组，以重新改造生物系统以供药物发现。
在第一个实例中，药物本身可以使用本文所述的方法进行优化。例如，为了改善抗体的指定功能，设计并合成编码抗体一部分的变异多核苷酸文库。然后可以通过本文所述的过程(例如，PCR诱变之后插入载体中)生成抗体的变异核酸文库。然后在生产细胞系中表达该抗体，并针对增强的活性进行筛选。示例筛选包括检查对抗原的结合亲和力、稳定性或效应物功能(例如，ADCC、补体或凋亡)的调节。用来优化抗体的示例性区域包括但不限于Fc区、Fab区、Fab区的可变区、Fab区的恒定区、重链或轻链的可变域(VH或VL)以及VH或VL的特定互补决定区(CDR)。
通过本文所述的方法合成的核酸文库可以在与疾病状态相关的各种细胞中表达。与疾病状态相关的细胞包括细胞系、组织样品、来自受试者的原代细胞、从受试者扩充的培养细胞或模型系统中的细胞。示例性的模型系统包括但不限于疾病状态的植物和动物模型。
为了鉴定与疾病状态的预防、减轻或治疗相关的变异分子，本文所述的变异核酸文库在与疾病状态相关的细胞中表达，或者在可以诱发细胞疾病状态的细胞中表达。在一些情况下，使用药剂在细胞中诱发疾病状态。用于疾病状态诱发的示例性工具包括但不限于Cre/Lox重组系统、LPS炎症诱发和用来诱发低血糖的链脲佐菌素。与疾病状态相关的细胞可以是来自模型系统的细胞或培养的细胞，以及来自具有特定疾病状况的受试者的细胞。示例性疾病状况包括细菌、真菌、病毒、自身免疫性或增生性病症(例如，癌症)。在一些情况下，所述变异核酸文库在模型系统、细胞系或来源于受试者的原代细胞中表达，并针对至少一种细胞活性的改变进行筛选。示例性的细胞活性包括但不限于增殖、周期进展、细胞死亡、粘附、迁移、复制、细胞信号传导、能量产生、氧利用、代谢活性和老化、对自由基损伤的响应或其任意组合。
基底
用作多核苷酸合成表面的装置可以是基底的形式，其包括但不限于均质阵列表面、图案化的阵列表面、通道、珠子、凝胶等。本文提供了包含多个簇的基底，其中每个簇包含多个支持多核苷酸附着和合成的座位。在一些情况下，基底包含均匀的阵列表面。例如，该均匀的阵列表面是均匀的板。如本文所用的术语“座位”是指结构上的离散区域，其提供了对编码单个预定序列的多核苷酸从该表面延伸的支持。在一些情况下，座位在二维表面(例如，基本上为平面的表面)上。在一些情况下，座位在三维表面(例如，孔、微孔、通道或柱杆)上。在一些情况下，座位的表面包含这样的材料，该材料被活化官能化，以附着至少一个核苷酸以供多核苷酸合成，或者优选地，附着相同核苷酸的群体以供多核苷酸群体合成。在一些情况下，多核苷酸是指编码相同核酸序列的多核苷酸群体。在一些情况下，基底的表面包括基底的一个或多个表面。使用所提供的系统和方法在本文所述的文库内合成的多核苷酸的平均错误率通常小于1/1000、小于约1/2000、小于约1/3000或更低，通常没有错误校正。
本文提供了支持在共同支持物上的可寻址位置处平行合成具有不同预定序列的多个多核苷酸的表面。在一些情况下，基底为合成超过50、100、200、400、600、800、1000、1200、1400、1600、1800、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000、1,000,000、1,200,000、1,400,000、1,600,000、1,800,000、2,000,000、2,500,000、3,000,000、3,500,000、4,000,000、4,500,000、5,000,000、10,000,000个或更多个不同的多核苷酸提供支持。在一些情况下，该表面为合成超过50、100、200、400、600、800、1000、1200、1400、1600、1800、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000、1,000,000、1,200,000、1,400,000、1,600,000、1,800,000、2,000,000、2,500,000、3,000,000、3,500,000、4,000,000、4,500,000、5,000,000、10,000,000个或更多个编码不同序列的多核苷酸提供支持。在一些情况下，至少一部分多核苷酸具有相同的序列或被配置为用相同的序列合成。在一些情况下，该基底提供用于增长具有至少80、90、100、120、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500个或更多个碱基的多核苷酸的表面环境。
本文提供了在基底的不同座位上合成多核苷酸的方法，其中每个座位支持合成多核苷酸群体。在一些情况下，每个座位支持合成与在另一座位上增长的多核苷酸群体具有不同序列的多核苷酸群体。在一些情况下，每个多核苷酸序列被合成为在用于多核苷酸合成的表面上同一座位簇内的不同座位上具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或更多的冗余度。在一些情况下，基底的座位位于多个簇内。在一些情况下，基底包含至少10、500、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、11000、12000、13000、14000、15000、20000、30000、40000、50000个或更多个簇。在一些情况下，基底包含超过2,000、5,000、10,000、100,000、200,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000、1,000,000、1,100,000、1,200,000、1,300,000、1,400,000、1,500,000、1,600,000、1,700,000、1,800,000、1,900,000、2,000,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000、1,000,000、1,200,000、1,400,000、1,600,000、1,800,000、2,000,000、2,500,000、3,000,000、3,500,000、4,000,000、4,500,000、5,000,000或10,000,000个或更多个不同的座位。在一些情况下，基底包含约10,000个不同的座位。单簇内的座位的量在不同情况下是不同的。在一些情况下，每个簇包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、130、150、200、300、400、500个或更多个座位。在一些情况下，每个簇包含约50-500个座位。在一些情况下，每个簇包含约100-200个座位。在一些情况下，每个簇包含约100-150个座位。在一些情况下，每个簇包含约109、121、130或137个座位。在一些情况下，每个簇包含约19、20、61、64个或更多个座位。备选地或组合地，多核苷酸合成在均匀的阵列表面上进行。
在一些情况下，在基底上合成的不同多核苷酸的数目取决于基底中可用的不同座位的数目。在一些情况下，基底的簇或表面内的座位密度至少是或约为1、10、25、50、65、75、100、130、150、175、200、300、400、500、1,000个或更多个座位/mm2。在一些情况下，基底包含10-500、25-400、50-500、100-500、150-500、10-250、50-250、10-200或50-200mm2。在一些情况下，簇或表面内两个相邻座位的中心之间的距离为约10-500、约10-200或约10-100um。在一些情况下，相邻座位的两个中心之间的距离大于约10、20、30、40、50、60、70、80、90或100um。在一些情况下，两个相邻座位的中心之间的距离小于约200、150、100、80、70、60、40、30、20或10um。在一些情况下，每个座位具有约0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100um的宽度。在一些情况下，每个座位具有约0.5-100、0.5-50、10-75或0.5-50um的宽度。
在一些情况下，基底内的簇的密度是至少或大约1个簇/100mm2、1个簇/10mm2、1个簇/5mm2、1个簇/4mm2、1个簇/3mm2、1个簇/2mm2、1个簇/1mm2、2个簇/1mm2、3个簇/1mm2、4个簇/1mm2、5个簇/1mm2、10个簇/1mm2、50个簇/1mm2或更高。在一些情况下，基底包含约1个簇/10mm2至约10个簇/1mm2。在一些情况下，两个相邻簇的中心之间的距离至少为或约为50、100、200、500、1000、2000或5000um。在一些情况下，两个相邻簇的中心之间的距离约为50-100、50-200、50-300、50-500和100-2000um。在一些情况下，两个相邻簇的中心之间的距离约为0.05-50、0.05-10、0.05-5、0.05-4、0.05-3、0.05-2、0.1-10、0.2-10、0.3-10、0.4-10、0.5-10、0.5-5或0.5-2mm。在一些情况下，每个簇具有约0.5至约2、约0.5至约1或约1至约2mm的横截面。在一些情况下，每个簇具有约0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2mm的横截面。在一些情况下，每个簇具有约0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.15、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2mm的内部横截面。
在一些情况下，基底是大约标准96孔板的大小，例如，约100至约200mm乘以约50至约150mm。在一些情况下，基底具有小于或等于约1000、500、450、400、300、250、200、150、100或50mm的直径。在一些情况下，基底的直径约为25-1000、25-800、25-600、25-500、25-400、25-300或25-200mm。在一些情况下，基底具有至少约100、200、500、1,000、2,000、5,000、10,000、12,000、15,000、20,000、30,000、40,000、50,000mm2或更大的平面表面积。在一些情况下，基底的厚度约为50-2000、50-1000、100-1000、200-1000或250-1000mm。
表面材料
本文提供的基底、装置和反应器由适合于本文描述的方法、组合物和系统的任何种类的材料制成。在某些情况下，将基底材料制造成表现出低水平的核苷酸结合。在一些情况下，修饰基底材料以生成表现出高水平的核苷酸结合的不同表面。在一些情况下，基底材料对可见光和/或紫外线是透明的。在一些情况下，基底材料具有足够的导电性，例如，能够跨整个基底或其一部分形成均匀的电场。在一些情况下，导电材料在电气上接地。在一些情况下，该基底是导热的或隔热的。在一些情况下，该材料是耐化学的且耐热的，以支持化学或生化反应，例如多核苷酸合成反应过程。在一些情况下，基底包含柔性材料。对于柔性材料而言，材料可包括但不限于：改性及未改性的尼龙、硝酸纤维素、聚丙烯等。在一些情况下，基底包含刚性材料。对于刚性材料而言，材料可包括但不限于：玻璃；熔融石英；硅、塑料(例如，聚四氟乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚碳酸脂，及其混合物等)；金属(例如，金、铂等)。基底、固体支持物或反应器可由选自硅、聚苯乙烯、琼脂糖、葡聚糖、纤维素聚合物、聚丙烯酰胺、聚二甲基硅氧烷(PDMS)和玻璃的材料制成。基底/固体支持物或者其中的微结构、反应器可使用本文所列材料或本领域中已知的任何其他适当材料的组合制成。
表面架构
本文提供了用于本文描述的方法、组合物和系统的基底，其中所述基底具有适合于本文描述的方法、组合物和系统的表面架构。在一些情况下，基底包含凸起和/或凹陷特征。具有这类特征的一个益处是用来支持多核苷酸合成的表面积增大。在一些情况下，具有凸起和/或凹陷特征的基底被称为三维基底。在一些情况下，三维基底包含一个或多个通道。在一些情况下，一个或多个座位包含通道。在一些情况下，通道可通过沉积装置如材料沉积装置进行试剂沉积。在一些情况下，试剂和/或流体收集在与一个或多个通道流体连通的较大的孔中。例如，基底包含与具有簇的多个座位相对应的多个通道，并且所述多个通道与该簇的一个孔流体连通。在一些方法中，多核苷酸文库在簇的多个座位中合成。
本文提供用于本文描述的方法、组合物和系统的基底，其中该基底被配置用于多核苷酸合成。在一些情况下，该结构被配制为允许用于表面上多核苷酸合成的受控的流动和质量传递路径。在一些情况下，基底的构造允许在多核苷酸合成过程中质量传递路径、化学暴露次数和/或洗涤功效的受控且均匀的分布。在一些情况下，基底的构造允许增加扫描效率，例如通过提供足以用于增长多核苷酸的体积，使得由增长的多核苷酸所排除的体积占可用于或适合于增长多核苷酸的初始可用体积的不超过50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更少。在一些情况下，三维结构允许流体的受管控的流动，从而允许化学暴露的快速交换。
本文提供了用于本文描述的方法、组合物和系统的基底，其中所述基底包含适合于本文描述的方法、组合物和系统的结构。在一些情况下，通过物理结构实现隔离。在一些情况下，通过表面的差异官能化以生成用于多核苷酸合成的活化和钝化区域来实现隔离。在一些情况下，差异官能化通过在整个基底表面上交替呈现疏水性，从而造成可引起沉积的试剂结珠或润湿的水接触角效应来实现。采用较大的结构可减少飞溅和邻近斑点的试剂对不同的多核苷酸合成位置的交叉污染。在一些情况下，使用装置如材料沉积装置将试剂沉积到不同的多核苷酸合成位置。具有三维特征的基底以允许以低错误率(例如，小于约1:500、1:1000、1:1500、1:2,000；1:3,000；1:5,000；或1:10,000)合成大量多核苷酸(例如，超过约10,000个)的方式配置。在一些情况下，基底包含密度为大约或大于约1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、300、400或500个特征/mm2的特征。
基底的孔可具有与基底的另一个孔相同或不同的宽度、高度和/或容积。基底的通道可具有与基底的另一个通道相同或不同的宽度、高度和/或容积。在一些情况下，簇的直径或包含簇的孔的直径或两者约为0.05-50、0.05-10、0.05-5、0.05-4、0.05-3、0.05-2、0.05-1、0.05-0.5、0.05-0.1、0.1-10、0.2-10、0.3-10、0.4-10、0.5-10、0.5-5或0.5-2mm。在一些情况下，簇或孔或两者的直径小于或约为5、4、3、2、1、0.5、0.1、0.09、0.08、0.07、0.06或0.05mm。在一些情况下，簇或孔或两者的直径为约1.0mm至1.3mm。在一些情况下，簇或孔或两者的直径约为1.150mm。在一些情况下，簇或孔或两者的直径约为0.08mm。簇的直径是指二维或三维基底内的簇。
在一些情况下，孔的高度约为20-1000、50-1000、100-1000、200-1000、300-1000、400-1000或500-1000um。在一些情况下，孔的高度小于约1000、900、800、700或600um。
在一些情况下，基底包含与簇内的多个座位相对应的多个通道，其中通道的高度或深度为5-500、5-400、5-300、5-200、5-100、5-50或10-50um。在一些情况下，通道的高度小于100、80、60、40或20um。
在一些情况下，通道、座位(例如，在基本上平坦的基底中)或通道和座位两者(例如，在其中座位对应于通道的三维基底中)的直径约为1-1000、1-500、1-200、1-100、5-100或10-100um，例如约90、80、70、60、50、40、30、20或10um。在一些情况下，通道、座位或通道和座位两者的直径小于约100、90、80、70、60、50、40、30、20或10um。在一些情况下，两个相邻通道、座位或通道和座位的中心之间的距离约为1-500、1-200、1-100、5-200、5-100、5-50或5-30，例如约20um。
表面修饰
本文提供了用于在表面上合成多核苷酸的方法，其中该表面包含各种表面修饰。在一些情况下，采用表面修饰通过加成工艺或减成工艺对表面进行化学和/或物理改变，以改变基底表面或基底表面的选定位点或区域的一种或多种化学和/或物理性质。例如，表面修饰包括但不限于：(1)改变表面的润湿性质；(2)对表面进行官能化，即，提供、修改或取代表面官能团；(3)对表面进行去官能化，即，移除表面官能团；(4)以其他方式例如通过刻蚀来改变表面的化学组成；(5)增大或减小表面粗糙度；(6)在表面上提供涂层，例如，展现出与表面的润湿性质不同的润湿性质的涂层；和/或(7)在表面上沉积微粒。
在一些情况下，在表面顶部添加化学层(被称为粘附促进剂)有利于基底表面上的座位的结构化图案化。用于施加粘附促进剂的示例性表面包括但不限于玻璃、硅、二氧化硅和氮化硅。在一些情况下，该粘附促进剂是具有高表面能的化学品。在一些情况下，在基底的表面上沉积第二化学层。在一些情况下，第二化学层具有低表面能。在一些情况下，涂覆在表面上的化学层的表面能支持小液滴在表面上的定位。根据所选择的图案化布置，座位的接近度和/或在座位处的流体接触面积是可改变的。
在一些情况下，(例如为了多核苷酸合成)核酸或其他部分所沉积到的基底表面或解析座位是光滑的或基本上为平面的(例如，二维的)，或者具有不规则性，诸如凸起或凹陷特征(例如，三维特征)。在一些情况下，用一个或多个不同的化合物层来修饰基底表面。感兴趣的此类修饰层包括但不限于无机层和有机层，如金属、金属氧化物，聚合物、有机小分子等。
在一些情况下，使用增大和/或减小表面能的一个或多个部分对基底的解析座位进行官能化。在一些情况下，部分是化学惰性的。在一些情况下，部分被配置为支持所需的化学反应，例如在多核苷酸合成反应中的一个或多个过程。表面的表面能或疏水性是决定核苷酸附着到该表面上的亲和力的因素。在一些情况下，基底官能化方法包括：(a)提供具有包含二氧化硅的表面的基底；和(b)使用本文所述的或本领域已知的合适的硅烷化剂(例如，有机官能烷氧基硅烷分子)对所述表面进行硅烷化。方法和官能化剂在通过引用整体并入本文的美国专利5474796中有描述。
在一些情况下，基底表面通常经由存在于基底表面上的反应性亲水部分，在有效地将硅烷偶联至基底表面的反应条件下，使基底表面与含有硅烷混合物的衍生化组合物相接触来进行官能化。硅烷化一般通过使用有机官能烷氧基硅烷分子自装配来覆盖表面。还可使用本领域当前已知的多种硅氧烷官能化试剂，例如用于降低或增大表面能。有机官能烷氧基硅烷根据其有机官能来分类。
多核苷酸合成
用于多核苷酸合成的本公开的方法可包括涉及亚磷酰胺化学法的过程。在一些情况下，多核苷酸合成包括将碱基与亚磷酰胺偶联。多核苷酸合成可包括通过在偶联条件下沉积亚磷酰胺来偶联碱基，其中相同的碱基任选地与亚磷酰胺沉积超过一次，即双偶联。多核苷酸合成可包括未反应位点的加帽。在一些情况下，加帽是可选的。多核苷酸合成还可包括氧化或氧化步骤或多个氧化步骤。多核苷酸合成可包括解封闭、脱三苯甲基化和硫化。在一些情况下，多核苷酸合成包括氧化或硫化。在一些情况下，在多核苷酸合成反应期间的一个步骤或每个步骤之间，例如使用四唑或乙腈来洗涤所述装置。亚磷酰胺合成方法中任一步骤的时间范围可小于约2min、1min、50sec、40sec、30sec、20sec和10sec。
使用亚磷酰胺方法的多核苷酸合成可包括随后将亚磷酰胺构件(例如，核苷亚磷酰胺)添加至增长的多核苷酸链以形成亚磷酸三酯键。亚磷酰胺多核苷酸合成沿3’至5’方向进行。亚磷酰胺多核苷酸合成允许在每个合成循环中将一个核苷酸受控添加至增长的核酸链。在一些情况下，每个合成循环包括偶联步骤。亚磷酰胺偶联包括在活化的核苷亚磷酰胺与(例如通过连接体)结合至基底的核苷之间形成亚磷酸三酯键。在一些情况下，将核苷亚磷酰胺提供给活化的装置。在一些情况下，将核苷亚磷酰胺提供给具有活化剂的装置。在一些情况下，核苷亚磷酰胺以相对于与基底结合的核苷1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100倍或更多倍的过量来提供给装置。在一些情况下，核苷亚磷酰胺的添加在无水环境中(例如，在无水乙腈中)进行。添加核苷亚磷酰胺后，任选地洗涤该装置。在一些情况下，偶联步骤额外重复一次或多次，任选地在向基底添加核苷亚磷酰胺之间进行洗涤步骤。在一些情况下，本文使用的多核苷酸合成方法包括1、2、3个或更多个连续的偶联步骤。在许多情况下，在偶联之前，与装置结合的核苷通过去除保护基团来脱保护，其中该保护基团起到防止聚合的作用。常见的保护基团为4,4’-二甲氧基三苯甲基(DMT)。
偶联后，亚磷酰胺多核苷酸合成方法任选地包括加帽步骤。在加帽步骤中，用加帽剂处理增长的多核苷酸。加帽步骤可用来在偶联后封闭未反应的与基底结合的5’-OH基团以防止进一步链延伸，从而防止形成具有内部碱基缺失的多核苷酸。此外，用1H-四唑活化的亚磷酰胺可以在很小的程度上与鸟苷的O6位置反应。不受理论的束缚，在用I2/水氧化后，该副产物(可能经由O6-N7迁移)可经历脱嘌呤。无嘌呤位点可终止在多核苷酸的最终脱保护过程中被切割，从而降低全长产物的产率。O6修饰可通过在用I2/水氧化之前用加帽试剂处理而去除。在一些情况下，与没有加帽的合成相比，在多核苷酸合成过程中包括加帽步骤会降低错误率。作为实例，加帽步骤包括用乙酸酐和1-甲基咪唑的混合物处理与基底结合的多核苷酸。在加帽步骤之后，任选地洗涤所述装置。
在一些情况下，在添加核苷亚磷酰胺之后，并且任选地在加帽和一个或多个洗涤步骤之后，对与装置结合的增长的核酸进行氧化。氧化步骤包括将亚磷酸三酯氧化成四配位的磷酸三酯——天然存在的磷酸二酯核苷间连接的受保护的前体。在一些情况下，增长的多核苷酸的氧化通过任选地在弱碱(例如，吡啶、二甲基吡啶、三甲吡啶)的存在下用碘和水处理来实现。氧化可在无水条件下采用例如叔丁基过氧化氢或(1S)-(+)-(10-樟脑磺酰基)-氧杂吖丙啶(CSO)进行。在一些方法中，在氧化之后进行加帽步骤。第二个加帽步骤允许装置干燥，因为可能持续存在的来自氧化的残余水可以抑制随后的偶联。氧化后，任选地洗涤装置和增长的多核苷酸。在一些情况下，氧化步骤用硫化步骤来代替，以获得多核苷酸硫代磷酸，其中任何加帽步骤均可在硫化之后进行。许多试剂能够进行有效的硫转移，包括但不限于3-(二甲基氨基亚甲基)氨基)-3H-1,2,4-二噻唑-3-硫酮、DDTT、3H-1,2-苯并二噻戊环-3-酮1,1-二氧化物(也被称为Beaucage试剂)和N,N,N'N'-四乙基秋兰姆二硫化物(TETD)。
为了使后续核苷掺入循环通过偶联而发生，除去与装置结合的增长的多核苷酸的受保护的5’末端，使得伯羟基与下一个核苷亚磷酰胺反应。在一些情况下，保护基团为DMT，并且用在二氯甲烷中的三氯乙酸进行解封闭。进行延长时间的脱三苯甲基化或者使用比推荐的酸溶液更强的酸溶液进行脱三苯甲基化可导致与固体支持物结合的多核苷酸的脱嘌呤增加，并因此降低了所需全长产物的产率。本文所述的本公开的方法和组合物提供了受控的解封闭条件，从而限制不希望的脱嘌呤反应。在一些情况下，与装置结合的多核苷酸在解封闭后洗涤。在一些情况下，解封闭后的有效洗涤有助于以低错误率合成多核苷酸。
多核苷酸合成方法一般包括一系列迭代的以下步骤：将受保护的单体施加至活化官能化的表面(例如，座位)以与活化的表面、连接体或与预先脱保护的单体连接；使所施加的单体脱保护，使其可与随后施加的受保护的单体反应；以及施加另一种受保护的单体以供连接。一个或多个中间步骤包括氧化或硫化。在一些情况下，在一个或全部步骤之前或之后有一个或多个洗涤步骤。
基于亚磷酰胺的多核苷酸合成方法包括一系列化学步骤。在一些情况下，合成方法的一个或多个步骤涉及试剂循环，其中该方法的一个或多个步骤包括向该装置施加对该步骤有用的试剂。例如，试剂通过一系列液相沉积和真空干燥步骤进行循环。对于包含诸如孔、微孔、通道等三维特征的基底，试剂任选地经由孔和/或通道穿过该装置的一个或多个区域。
本文所述的方法和系统涉及用于合成多核苷酸的多核苷酸合成装置。该合成可以是平行的。例如，可以平行合成至少或大约至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、1000、10000、50000、75000、100000个或更多个多核苷酸。可以平行合成的多核苷酸的总数可以是2-100000、3-50000、4-10000、5-1000、6-900、7-850、8-800、9-750、10-700、11-650、12-600、13-550、14-500、15-450、16-400、17-350、18-300、19-250、20-200、21-150、22-100、23-50、24-45、25-40、30-35个。本领域技术人员知晓，平行合成的多核苷酸的总数可处于由这些值中的任何值所限定的任何范围内，例如25-100。平行合成的多核苷酸的总数可处于由充当范围端点的任何值所限定的任何范围内。在装置内合成的多核苷酸的总摩尔质量或每种多核苷酸的摩尔质量可以是至少或至少约10、20、30、40、50、100、250、500、750、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、25000、50000、75000、100000皮摩尔或更大。每种多核苷酸的长度或装置内多核苷酸的平均长度可以是至少或大约至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、100、150、200、300、400、500个或更多个核苷酸。每种多核苷酸的长度或装置内多核苷酸的平均长度可以是至多或大约至多500、400、300、200、150、100、50、45、35、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10个或更少的核苷酸。每种多核苷酸的长度或装置内多核苷酸的平均长度可以处于10-500、9-400、11-300、12-200、13-150、14-100、15-50、16-45、17-40、18-35、19-25之间。本领域技术人员知晓，每种多核苷酸的长度或装置内多核苷酸的平均长度可处于由这些值中的任何值所限定的任何范围内，例如100-300。每种多核苷酸的长度或装置内多核苷酸的平均长度可处于由充当范围端点的任何值所限定的任何范围内。
本文提供的在表面上合成多核苷酸的方法允许以较快的速度合成。作为实例，每小时合成至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、125、150、175、200个或更多个核苷酸。核苷酸包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿苷构件，或其类似物/修饰形式。在一些情况下，多核苷酸文库在基底上平行合成。例如，包含大约或至少约100、1,000、10,000、30,000、75,000、100,000、1,000,000、2,000,000、3,000,000、4,000,000或5,000,000个解析座位的装置能够支持合成至少相同数目的不同的多核苷酸，其中编码不同序列的多核苷酸在解析座位上合成。在一些情况下，在少于约三个月、两个月、一个月、三周、15天、14天、13天、12天、11天、10天、9天、8天、7天、6天、5天、4天、3天、2天、24小时或更短的时间内，以本文所述的低错误率在装置上合成多核苷酸文库。在一些情况下，使用本文所述的基底和方法从以低错误率合成的多核苷酸文库装配的较大核酸在少于约三个月、两个月、一个月、三周、15天、14天、13天、12天、11天、10天、9天、8天、7天、6天、5天、4天、3天、2天、24小时或更短的时间内制备。
在一些情况下，本文所述的方法提供了生成包含在多个密码子位点处不同的变异核酸的核酸文库。在一些情况下，核酸可具有1个位点、2个位点、3个位点、4个位点、5个位点、6个位点、7个位点、8个位点、9个位点、10个位点、11个位点、12个位点、13个位点、14个位点、15个位点、16个位点、17个位点、18个位点、19个位点、20个位点、30个位点、40个位点、50个位点或更多个变异密码子位点。
在一些情况下，变异密码子位点的一个或多个位点可以是相邻的。在一些情况下，变异密码子位点的一个或多个位点可以是不相邻的，并且由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个密码子隔开。
在一些情况下，核酸可包含变异密码子位点的多个位点，其中所有变异密码子位点彼此相邻，形成一段变异密码子位点。在一些情况下，核酸可包含变异密码子位点的多个位点，其中所述变异密码子位点彼此均不相邻。在一些情况下，核酸可包含变异密码子位点的多个位点，其中一些变异密码子位点彼此相邻，形成一段变异密码子位点，而一些变异密码子位点彼此不相邻。
参见附图，图3示出了用于从较短核酸合成核酸(例如，基因)的示例性处理工作流程。该工作流程大致分为以下阶段：(1)从头合成单链核酸文库，(2)连接核酸以形成更大的片段，(3)错误校正，(4)质量控制，以及(5)运输。在从头合成之前，预先选择预期的核酸序列或一组核酸序列。例如，预先选择一组基因用于生成。
一旦选择用于生成的大核酸，则针对从头合成来设计预定的核酸文库。用于生成高密度多核苷酸阵列的各种合适的方法是已知的。在该工作流程示例中，提供了装置表面层。在该示例中，改变表面的化学性质，以改进多核苷酸合成过程。生成低表面能区域以排斥液体，同时生成高表面能区域以吸引液体。表面本身可以是平面表面的形式或者包含形状的变化，例如增加表面积的突起或微孔。在该工作流程示例中，如在通过引用整体并入本文的国际专利申请公开WO/2015/021080中所公开的，所选择的高表面能分子发挥支持DNA化学过程的双重功能。
多核苷酸阵列的原位制备在固体支持物上进行，并利用单核苷酸延伸过程平行延伸多个寡聚物。沉积装置如材料沉积装置被设计为以逐步方式释放试剂，使得多个多核苷酸平行地一次延伸一个残基，以生成具有预定核酸序列的寡聚物302。在一些情况下，多核苷酸在该阶段从表面上切下。切割包括例如采用氨或甲胺的气体切割。
将生成的多核苷酸文库放置于反应室中。在该示例性工作流程中，反应室(也被称为“纳米反应器”)为硅涂覆的孔，其含有PCR试剂并下降到多核苷酸文库303上。在多核苷酸密封304之前或之后，添加试剂以从基底释放多核苷酸。在该示例性工作流程中，多核苷酸在纳米反应器密封305之后释放。一旦释放，单链多核苷酸的片段即发生杂交，以跨越整个长程DNA序列。部分杂交305是可能的，因为每个合成的多核苷酸被设计为具有与池中的至少一个其他多核苷酸重叠的一小部分。
杂交后，开始PCA反应。在聚合酶循环过程中，多核苷酸与互补片段退火，并且用聚合酶补平缺口。根据哪些多核苷酸彼此发现，每个循环随机增加各个片段的长度。片段之间的互补性允许形成完整的大跨度的双链DNA 306。
在PCA完成之后，将纳米反应器与装置分开307，并定位成与具有PCR引物的装置相互作用308。密封后，纳米反应器经历PCR 309并扩增较大的核酸。在PCR之后310，打开纳米室311，添加错误校正试剂312，将腔室密封313并进行错误校正反应，以从双链PCR扩增产物中去除具有较差互补性的错配碱基对和/或链314。打开并分离纳米反应器315。错误校正产物接下来经历另外的处理步骤，如PCR和分子条形码化，随后包装322以供运输323。
在一些情况下，采取质量控制措施。在错误校正之后，质量控制步骤包括例如与具有用于扩增错误校正产物的测序引物的晶片进行相互作用316，将晶片密封到含有错误校正扩增产物的腔室中317，并进行另一轮扩增318。打开纳米反应器319，合并产物320并进行测序321。在得到可接受的质量控制结果之后，包装的产物322准许运输323。
在一些情况下，通过诸如图3中的工作流程生成的核酸使用本文公开的重叠引物进行诱变。在一些情况下，通过在固体支持物上原位制备来生成引物文库，并利用单核苷酸延伸过程平行延伸多个寡聚物。沉积装置如材料沉积装置被设计为以逐步方式释放试剂，使得多个多核苷酸平行地一次延伸一个残基，以生成具有预定核酸序列的寡聚物302。
计算机系统
本文所述的任何系统均可以可操作地连接至计算机，并且可以本地或远程地通过计算机进行自动化。在各种情况下，本公开的方法和系统可进一步包括计算机系统上的软件程序及其使用。因此，对于分配/抽真空/再填充功能的同步(如编排和同步材料沉积装置运动、分配动作和真空致动)的计算机化控制处于本公开内容的范围内。计算机系统可被编程为在用户指定的碱基序列与材料沉积装置的位置之间接合，以将正确的试剂递送至基底的指定区域。
图4中示出的计算机系统400可被理解为能够从介质411和/或网络端口405读取指令的逻辑设备，其可任选地连接至具有固定介质412的服务器409。诸如图4示出的系统可包括CPU 401、磁盘驱动器403、可选的输入设备如键盘415和/或鼠标416以及可选的监视器407。可通过示出的通信媒介实现与本地或远程位置处的服务器的数据通信。通信媒介可包括传输和/或接收数据的任何手段。例如，通信媒介可以是网络连接、无线连接或因特网连接。这样的连接可提供经由万维网的通信。可以设想有关本公开的数据可经过这样的网络或连接而传输，以便由图4所示的用户方422接收和/或审阅。
图5是示出可与本公开的示例实例结合使用的计算机系统500的第一示例架构的框图。如图5所示，该示例计算机系统可包括用于处理指令的处理器502。处理器的非限制性示例包括：Intel XeonTM处理器、AMD OpteronTM处理器、Samsung 32-位RISC ARM 1176JZ(F)-S v1.0TM处理器、ARM Cortex-A8 Samsung S5PC100TM处理器、ARM Cortex-A8AppleA4TM处理器、Marvell PXA930TM处理器或功能上等效的处理器。多个执行线程可用于并行处理。在一些情况下，也可以使用多个处理器或具有多个核的处理器，无论是在单一计算机系统中，在群集中，还是通过包含多个计算机、蜂窝电话和/或个人数据助理设备的网络跨系统分布。
如图5所示，高速缓冲存储器504可连接至或并入处理器502，以提供由处理器502新近或频繁使用的指令或数据的高速存储器。处理器502通过处理器总线508连接至北桥506。北桥506通过存储器总线512连接至随机存取存储器(RAM)510，并管理处理器502对RAM510的访问。北桥506还通过芯片集总线516连接至南桥514。南桥514又连接至外围总线518。外围总线可以是例如PCI、PCI-X、PCI Express或其他外围总线。北桥和南桥通常被称为处理器芯片集，并管理在处理器、RAM与外围总线518上的外围组件之间的数据传送。在一些备选的架构中，北桥的功能性可以并入处理器中，而不是使用单独的北桥芯片。在一些情况下，系统500可包括附接至外围总线518的加速器卡522。加速器可包括现场可编程门阵列(FPGA)或用于加速某个处理的其他硬件。例如，加速器可用于适应性数据重建或用来评价在扩展集处理中使用的代数表达式。
软件和数据存储在外部存储器524中，并可加载至RAM 510和/或高速缓冲存储器504中，以供处理器使用。系统500包括用于管理系统资源的操作系统；操作系统的非限制性实例包括：Linux、WindowsTM、MACOSTM、BlackBerry OSTM、iOSTM和其他功能上等效的操作系统，以及在操作系统顶部运行的、用于根据本公开的示例情况管理数据存储和优化的应用软件。在该实例中，系统500还包括与外围总线连接的网络接口卡(NIC)520和521，以提供与外部存储如网络附加存储(NAS)和可用于分布式并行处理的其他计算机系统的网络接口。
图6是显示了具有多个计算机系统602a和602b、多个蜂窝电话和个人数据助理602c以及网络附加存储(NAS)604a和604b的网络600的示图。在示例实例中，系统602a、602b和602c可管理数据存储并优化对存储在网络附加存储(NAS)604a和604b中的数据的数据访问。数学模型可用于该数据，并使用跨计算机系统602a和602b和蜂窝电话以及个人数据助理系统602c的分布式并行处理进行评价。计算机系统602a和602b和蜂窝电话以及个人数据助理系统602c也可提供对存储在网络附加存储(NAS)604a和604b中的数据的适应性数据重建的并行处理。图6仅示出了一个实例，而多种多样的其他计算机架构和系统可与本公开的多个实例一起使用。例如，刀片服务器可以用来提供并行处理。处理器刀片可通过背板连接，以提供并行处理。存储还可通过单独的网络接口连接至背板或作为网络附加存储(NAS)。在一些示例实例中，处理器可维持单独的存储空间，并通过网络接口、背板或其他连接器传输数据以便由其他处理器并行处理。在其他情况下，部分或全部处理器可使用共享的虚拟地址存储空间。
图7是根据示例情况使用共享虚拟地址存储空间的多处理器计算机系统700的框图。该系统包括可访问共享的存储器子系统704的多个处理器702a-f。该系统中在存储器子系统704中并入多个可编程硬件存储算法处理器(MAP)706a-f。每个MAP 706a-f可以包含存储器708a-f以及一个或多个现场可编程门阵列(FPGA)710a-f。MAP提供可配置的功能单元，并且可以向FPGA710a-f提供特定算法或算法的部分，以供与相应的处理器密切协同地进行处理。例如，在示例情况中，MAP可用来评价与数据模型相关的代数表达式以及用来进行适应性数据重建。在该示例中，每个MAP可被用于这些目的的所有处理器全局访问。在一种配置中，每个MAP可使用直接存储器访问(DMA)来访问相关联的存储器708a-f，使其独立于且异步于各自的微处理器702a-f而执行任务。在这一配置中，MAP可将结果直接馈送至另一MAP以用于流水处理和并行执行算法。
以上计算机架构和系统仅为实例，并且多种多样的其他计算机、蜂窝电话和个人数据助理架构和系统可与示例实例结合使用，包括使用通用处理器、协处理器、FPGA和其他可编程逻辑设备、芯片上系统(SOC)、专用集成电路(ASIC)和其他处理和逻辑元件的任何组合的系统。在一些情况下，全部或部分计算机系统可用软件或硬件来实现。任何种类的数据存储介质可与示例实例结合使用，包括随机存取存储器、硬盘驱动器、闪速存储器、磁带驱动器、磁盘阵列、网络附加存储(NAS)和其他的本地或分布式数据存储设备和系统。
在示例实例中，计算机系统可使用在任何上述或其他计算机架构和系统上执行的软件模块来实现。在其他实例中，该系统的功能可部分或完全地在固件、可编程逻辑设备如图5提到的现场可编程门阵列(FPGA)、芯片上系统(SOC)、专用集成电路(ASIC)或其他处理和逻辑元件中实现。例如，集处理器(Set Processor)和优化器可通过使用硬件加速器卡如图5所示的加速器卡522用硬件加速方式实现。
阐述以下实施例是为了向本领域技术人员更清楚地说明本文所公开的实施方案的原理和实践，而不应解释为限制任何请求保护的实施方案的范围。除非另有说明，否则所有份数和百分比均以重量计。
实施例
给出以下实施例是为了说明本公开的多个实施方案的目的，而并非意图以任何方式限制本发明。这些实施例以及目前代表优选实施方案的本文所述方法是示例性的，而非旨在限制本公开的范围。本领域技术人员将会想到其变化以及包含在由权利要求的范围所限定的本公开的精神之内的其他用途。
实施例1：装置表面的官能化
对装置进行官能化以支持多核苷酸文库的附接和合成。首先使用包含90％H2SO4和10％H2O2的水虎鱼溶液(piranha solution)将装置表面润湿清洗20分钟。将该装置在含有去离子水的数个烧杯中冲洗，在去离子水鹅颈旋塞下保持5min，并用N2干燥。随后将该装置在NH4OH(1:100；3mL:300mL)中浸泡5min，使用手持式喷枪(handgun)用去离子水冲洗，在连续三个含有去离子水的烧杯中各浸泡1min，然后再使用手持式喷枪用去离子水冲洗。然后通过将装置表面暴露于O2来等离子体清洗该装置。使用SAMCO PC-300仪器在下游模式下以250瓦进行O2等离子体蚀刻1min。
使用具有以下参数的YES-1224P气相沉积烘箱系统，用包含N-(3-三乙氧基甲硅烷基丙基)-4-羟基丁酰胺的溶液对清洁的装置表面进行活化官能化：0.5至1托，60min，70℃，135℃汽化器。使用BrewerScience 200X旋涂仪对装置表面进行抗蚀剂涂覆。将SPRTM3612光致抗蚀剂以2500rpm旋涂在装置上40sec。该装置在Brewer热板上以90℃预烘30min。使用Karl Suss MA6掩模对准仪对装置进行光刻。将该装置暴露2.2sec并在MSF 26A中显影1min。剩余的显影剂用手持式喷枪冲洗，并将装置在水中浸泡5min。该装置在烘箱中以100℃烘烤30min，随后使用Nikon L200目视检查光刻缺陷。采用预清除(descum)工艺利用SAMCO PC-300仪器以250瓦进行O2等离子体蚀刻1min来去除残余抗蚀剂。
用与10μL轻质矿物油混合的100μL全氟辛基三氯硅烷溶液对装置表面进行钝化官能化。将该装置放置于腔室中，泵送10min，随后关闭通往泵的阀门并静置10min。使该腔室排气。该装置通过在70℃下在500mL NMP中进行两次5min浸泡并同时以最大功率(在Crest系统上的9)进行超声波处理来剥离抗蚀剂。然后将该装置在室温下在500mL异丙醇中浸泡5min，同时以最大功率进行超声波处理。将该装置浸入300mL的200标准酒精度(proof)的乙醇中并用N2吹干。活化该官能化表面以充当多核苷酸合成的支持物。
实施例2：在寡核苷酸合成装置上合成50-聚体序列
将二维寡核苷酸合成装置组装至流动池中，其与流动池(Applied Biosystems(ABI394 DNA合成仪")连接。该二维寡核苷酸合成装置用N-(3-三乙氧基甲硅烷基丙基)-4-羟基丁酰胺(Gelest)均匀地官能化，并用来使用本文所述的多核苷酸合成方法合成50bp的示例性多核苷酸("50-聚体多核苷酸”)。
所述50-聚体的序列如SEQ ID NO.:2所述。5'AGACAATCAACCATTTGGGGTGGACAGCCTTGACCTCTAGACTTCGGCAT##TTTTTTTTTT3'(SEQ ID NO.:2)，其中#表示胸苷-琥珀酰基己酰胺CED亚磷酰胺(来自ChemGenes的CLP-2244)，它是允许在脱保护过程中从表面上释放多核苷酸的可切割的连接体。
根据表3中的方案和ABI合成仪，使用标准DNA合成化学法(偶联、加帽、氧化和解封闭)完成合成。
表3：合成方案
Figure BDA0003322188410000641
Figure BDA0003322188410000651
Figure BDA0003322188410000661
亚磷酰胺/活化剂组合以类似于本体试剂通过流动池递送的方式进行递送。当在全部时间内保持环境被试剂“润湿”时，不进行干燥步骤。
从ABI 394合成仪中去除限流器，以使得能够更快速流动。在没有限流器的情况下，酰胺类(amidites)(在ACN中0.1M)、活化剂(在ACN中的0.25M苯甲酰基硫基四唑(“BTT”；来自GlenResearch的30-3070-xx))和Ox(在20％吡啶、10％水和70％THF中的0.02M I2)的流速大致为约100uL/sec，乙腈(“ACN”)和加帽试剂(帽A和帽B的1:1混合物，其中帽A是在THF/吡啶中的乙酸酐，帽B是在THF中的16％1-甲基咪唑(1-methylimidizole))的流速大致为约200uL/sec，而解封闭剂(在甲苯中的3％二氯乙酸)的流速大致为约300uL/sec(相比之下，在有限流器的情况下，所有试剂的流速均为约50uL/sec)。观测完全排出氧化剂的时间，相应地调整化学品流动时间的时间选择，并在不同的化学品之间引入额外的ACN洗涤。在多核苷酸合成后，将芯片在75psi下在气态氨中脱保护过夜。将五滴水施加到表面上以回收多核苷酸。然后在BioAnalyzer小RNA芯片上分析所回收的多核苷酸。
实施例3：在寡核苷酸合成装置上合成100-聚体序列
使用实施例2中描述的用于合成50-聚体序列的相同过程，在两个不同的硅芯片上合成100-聚体多核苷酸(“100-聚体多核苷酸”；5'CGGGATCCTTATCGTCATCGTCGTACAGATCCCGACCCATTTGCTGTCCACCAGTCATGCTAGCCATACCATGATGATGATGATGATGAGAACCCCGCAT##TTTTTTTTTT3'，其中#表示胸苷-琥珀酰基己酰胺CED亚磷酰胺(来自ChemGenes的CLP-2244)；SEQ ID NO.:3)，第一个用N-(3-三乙氧基甲硅烷基丙基)-4-羟基丁酰胺均匀地官能化，而第二个用11-乙酰氧基十一烷基三乙氧基硅烷和正癸基三乙氧基硅烷的5/95混合物官能化，并在BioAnalyzer仪器上分析从表面提取的多核苷酸。
使用下列热循环程序，在50uL PCR混合物(25uL NEB Q5主混合物，2.5uL 10uM正向引物，2.5uL 10uM反向引物，1uL从表面提取的多核苷酸，用水加至50uL)中使用正向引物(5'ATGCGGGGTTCTCATCATC3'；SEQ ID NO.:4)和反向引物(5'CGGGATCCTTATCGTCATCG3'；SEQID NO.:5)进一步PCR扩增来自两个芯片的全部十个样品：
98℃，30sec
98℃，10sec；63℃，10sec；72℃，10sec；重复12个循环
72℃，2min
PCR产物还在BioAnalyzer上运行，在100-聚体位置处显示出尖锐峰。然后，对PCR扩增的样品进行克隆，并进行Sanger测序。表4总结了从来自芯片1的斑点1-5采集的样品和从来自芯片2的斑点6-10采集的样品的Sanger测序结果。
表4：测序结果
Figure BDA0003322188410000671
Figure BDA0003322188410000681
因此，合成的多核苷酸的高质量和均匀度在具有不同表面化学的两个芯片上重现。总体上，所测序的100-聚体中有89％是没有错误的完美的序列，对应于262个中的233个。
表5总结了从来自斑点1-10的多核苷酸样品中获得的序列的错误特征。
表5：错误特征
Figure BDA0003322188410000682
实施例4：基于肽配体相互作用的GLP1R结合域的设计
基于与GLP1R相互作用的肽配体之间的相互作用表面，设计了GLP1R结合域。基于肽与ECD的相互作用表面以及与N末端GLP1R配体的相互作用表面，生成了基序变体。这使用结构建模来完成。如表6所示，基于胰高血糖素样肽与GLP1R的相互作用创建了示例性的基序变体。使用以下来自胰高血糖素样肽的序列产生了基序变异序列：HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG(SEQ ID NO:6)。
表6.胰高血糖素样肽的变异氨基酸序列
SEQ ID NO. 变体 氨基酸序列
7 1 sggggsggggsggggHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLV
8 2 sggggsggggsggggAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLV
9 3 sggggsggggsggggEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLV
10 4 sggggsggggsggggGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLV
11 5 sggggsggggsggggTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLV
12 6 sggggsggggsggggFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLV
13 7 sggggsggggsggggTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLV
14 8 sggggsggggsggggSDVSSYLEGQAAKEFIAWLV
15 9 sggggsggggsggggDVSSYLEGQAAKEFIAWLV
实施例5：抗体支架的设计
为了生成支架，进行了结构分析、重链组库(repertoire)测序分析以及异二聚体高通量测序数据集的特异性分析。每条重链与每个轻链支架相缔合。每个重链支架被分配了5个不同的长CDR-H3环选项。每个轻链支架被分配了5个不同的L3支架。重链CDR-H3茎选自在个体和V基因区段之间发现的经常观察到的长H3环茎(N末端和C末端上的10个氨基酸)。轻链支架L3选自包含长H3的异二聚体。使用基于来自Protein Data Bank(PDB)和深度测序数据集的信息的直接异二聚体，其中CDR H1、H2、L1、L2、L3和CDR-H3茎被固定。然后对各种支架进行格式化，以供在噬菌体上展示以评估表达。
结构分析
分析了大约2,017个抗体结构，从中观察到22个具有至少25个氨基酸长度的CDR-H3的结构。重链包括：IGHV1-69、IGHV3-30、IGHV4-49和IGHV3-21。鉴定出的轻链包括：IGLV3-21、IGKV3-11、IGKV2-28、IGKV1-5、IGLV1-51、IGLV1-44和IGKV1-13。在分析中，多次观察到四个异二聚体组合，包括：IGHV4-59/61-IGLV3-21、IGHV3-21-IGKV2-28、IGHV1-69-IGKV3-11和IGHV1-69-IGKV1-5。序列和结构分析确定了一些结构中的CDR-H3内部二硫键，茎中堆积了大体积的侧链，如酪氨酸，从而为长期的H3稳定性提供了支持。还观察到包括β-转角-β片层和“锤头型”子结构域的二级结构。
组库分析
对通过无偏5’RACE从12名健康对照获得的1,083,875个IgM+/CD27-幼稚B细胞受体(BCR)序列和1,433,011个CD27+序列进行了组库分析。这12名健康对照包括人数相等的男性和女性，由4名白人、4名亚裔和4名西班牙裔个体组成。组库分析表明，人类组库中的不到1％包含具有长于21个氨基酸的CDR-H3的BCR。在长CDR3子组库中观察到V基因偏倚(bias)，其中IGHV1-69、IGHV4-34、IGHV1-18和IGHV1-8在具有长H3环的BCR中显示出优先富集。对于IGHV3-23、IGHV4-59/61、IGHV5-51、IGHV3-48、IGHV3-53/66、IGHV3-15、IGHV3-74、IGHV3-73、IGHV3-72和IGHV2-70观察到背离长环的偏倚。IGHV4-34支架被证明是自反应性的，并且半衰期短。
还基于5’RACE参考组库设计了用于长环的可行的N末端和C末端CDR-H3支架变异。观察到约81,065个氨基酸长度为22个氨基酸或更长的CDR-H3。通过在V基因支架中进行比较，避免了支架特定的H3茎变异，从而允许将支架多样性克隆到多个支架参考中。
异二聚体分析
对支架进行了异二聚体分析，并测定了支架的变异序列和长度。
结构分析
使用变异序列的GPCR支架进行了结构分析，并测定了长度。
实施例6：GPCR抗体文库的生成
基于GPCR-配体相互作用表面和支架排列，设计并从头合成了文库。参见实施例4。为重链可变域设计了10个变异序列，为重链互补决定区3设计了237个变异序列，并为轻链可变域设计了44个变异序列。按照类似于实施例1-3中所述的方法，将这些片段合成为三个片段。
从头合成后，为重链可变域生成了10个变异序列，为重链互补决定区3生成了236个变异序列，并为包含轻链可变域和CDR-L3的区域设计了43个变异序列，其中9个变体是为轻链可变域设计的。这产生了具有约105多样性(10x236x43)的文库。使用具有1600万个读取的下一代测序(NGS)对其进行了确认。针对重链可变域的10个变体中每一个的归一化测序读取约为1(数据未示出)。针对轻链可变域的43个变体中每一个的归一化测序读取约为1(数据未示出)。针对重链互补决定区3的236个变异序列的归一化测序读取约为1(数据未示出)。
然后测试了各种轻链和重链的表达和蛋白质折叠。针对重链可变域的10个变异序列包括：IGHV1-18、IGHV1-69、IGHV1-8、IGHV3-21、IGHV3-23、IGHV3-30/33rn、IGHV3-28、IGHV3-74、IGHV4-39和IGHV4-59/61。在这10个变异序列中，IGHV1-18、IGHV1-69和IGHV3-30/33rn表现出改善的特性，如改善的热稳定性。针对轻链可变域的9个变异序列包括：IGKV1-39、IGKV1-9、IGKV2-28、IGKV3-11、IGKV3-15、IGKV3-20、IGKV4-1、IGLV1-51和IGLV2-14。在这9个变异序列中，IGKV1-39、IGKV3-15、IGLV1-51和IGLV2-14表现出改善的特性，如改善的热稳定性。
实施例7：GPCR抗体文库在HEK293细胞中的表达
在生成GPCR抗体文库后，选择约47个GPCR进行筛选。在pCDNA3.1载体中设计了大小为约1.8kb至约4.5kb的GPCR构建体。然后按照与实施例2-4中所述类似的方法，包括层级式装配，合成了GPCR构建体。在这47个GPCR构建体中，合成了46个GPCR构建体。
将合成的GPCR构建体转染到HEK293中，并使用免疫荧光法检测其表达。用包含N末端血凝素(HA)标记的人Y1受体的GPCR构建体转染HEK293细胞。转染24-48小时后，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞，并用4％低聚甲醛固定。使用针对HA标签的荧光第一抗体或包含荧光团和DAPI的第二抗体对细胞进行染色，以使细胞核呈现为蓝色。人Y1受体在未透化细胞的细胞表面上以及在透化细胞的细胞表面和细胞内呈现出来。
还通过设计包含自体荧光蛋白的GPCR构建体对GPCR构建体进行了可视化。人Y1受体包含与其C末端融合的EYFP，而人Y5受体包含与其C末端融合的ECFP。HEK293细胞用人Y1受体转染，或用人Y1受体和人Y5受体共转染。转染后，将细胞洗涤并用4％低聚甲醛固定。将细胞用DAPI染色。通过荧光显微术对人Y1受体和人Y5受体的定位进行可视化。
实施例8：免疫球蛋白文库的设计
设计了一种免疫球蛋白支架文库，以供放置GPCR结合域并提高一系列GPCR结合域编码序列的稳定性。该免疫球蛋白支架包括用连接体附接有VL结构域的VH结构域。为VH结构域和VL结构域的框架元件和CDR元件生成了变异核酸序列。该设计的结构在图8A中示出。全结构域架构在图8B中示出。前导序列、连接体和pIII的序列在表7中列出。
表7.核苷酸序列
Figure BDA0003322188410000721
设计的VL结构域包括IGKV1-39、IGKV3-15、IGLV1-51和IGLV2-14。四个VL结构域中的每一个与它们各自的不变的四个框架元件(FW1、FW2、FW3、FW4)和可变的3个CDR(L1、L2、L3)元件组装在一起。对于IGKV1-39，存在为L1设计的490个变体，为L2设计的420个变体，和为L3设计的824个变体，从而导致多样性为1.7x108(490*420*824)。对于IGKV3-15，存在为L1设计的490个变体，为L2设计的265个变体，和为L3设计的907个变体，从而导致多样性为1.2x108(490*265*907)。对于IGLV1-51，存在为L1设计的184个变体，为L2设计的151个变体，和为L3设计的824个变体，从而导致多样性为2.3x107(184*151*824)。对于IGLV2-14，存在为L1设计的967个变体，为L2设计的535个变体，和为L3设计的922个变体，从而导致多样性为4.8x108(967*535*922)。表8列出了IGLV1-51的四个框架元件(FW1、FW2、FW3、FW4)的氨基酸序列和核苷酸序列。表9列出了IGLV1-51的可变的3个CDR(L1、L2、L3)元件。还为IGKV1-39、IGKV3-15和IGLV2-14设计了四个框架元件(FW1、FW2、FW3、FW4)和可变的3个CDR(L1、L2、L3)元件的变异氨基酸序列和核苷酸序列。
表8.IGLV1-51框架元件的序列
Figure BDA0003322188410000731
表9.IGLV1-51 CDR元件的序列
Figure BDA0003322188410000741
Figure BDA0003322188410000751
Figure BDA0003322188410000761
Figure BDA0003322188410000771
Figure BDA0003322188410000781
Figure BDA0003322188410000791
Figure BDA0003322188410000801
Figure BDA0003322188410000811
Figure BDA0003322188410000821
Figure BDA0003322188410000831
Figure BDA0003322188410000841
Figure BDA0003322188410000851
Figure BDA0003322188410000861
Figure BDA0003322188410000871
Figure BDA0003322188410000881
Figure BDA0003322188410000891
Figure BDA0003322188410000901
Figure BDA0003322188410000911
Figure BDA0003322188410000921
Figure BDA0003322188410000931
Figure BDA0003322188410000941
Figure BDA0003322188410000951
Figure BDA0003322188410000961
Figure BDA0003322188410000971
Figure BDA0003322188410000981
Figure BDA0003322188410000991
Figure BDA0003322188410001001
Figure BDA0003322188410001011
Figure BDA0003322188410001021
Figure BDA0003322188410001031
Figure BDA0003322188410001041
Figure BDA0003322188410001051
预筛选CDR，使其不含氨基酸倾向(liabilities)、隐蔽剪接位点或核苷酸限制位点。CDR变异在至少两个个体中观察到，并且包含单突变、双突变和三突变的近种系空间。组装的顺序在图8C中示出。
设计的VH结构域包括IGHV1-69和IGHV3-30。两个重链VH结构域中的每一个都与它们各自的不变的4个框架元件(FW1、FW2、FW3、FW4)和可变的3个CDR(H1、H2、H3)元件组装在一起。对于IGHV1-69，为H1设计了417个变体，为H2设计了258个变体。对于IGHV3-30，为H1设计了535个变体，为H2设计了165个变体。对于CDR H3，在IGHV1-69和IGHV-30中都使用相同的盒，因为两者均设计为使用相同的FW4，并且对于IGHV1-69和IGHV3-30，FW3的边缘也相同。CDR H3包含N末端和C末端元件，这些元件组合地接合至中央中间元件以生成1×1010多样性。N末端和中间元件与“GGG”甘氨酸密码子重叠。中间和C末端元件与“GGT”甘氨酸密码子重叠。CDR H3包含5个单独组装的子池。各个N末端和C末端元件包含如表10所示的序列。
表10.N末端和C末端元件的序列
Figure BDA0003322188410001061
实施例9.GPCR GLP1R结合蛋白的富集
通过本文所述的方法生成具有包含GPCR结合蛋白变异片段的CDR-H3区的抗体，并如实施例4所述用基于细胞的方法进行淘选，以鉴定针对与特定GPCR的结合而富集的变体。
鉴定出GLP C末端肽的变体(列于表11中)，当嵌入抗体的CDR-H3区域中时，它们针对与GPCR GLP1R的结合而被重复地并选择性地富集。
表11.嵌入CDR-H3中的GLP1的序列
Figure BDA0003322188410001062
Figure BDA0003322188410001071
实施例10.GLP1R结合蛋白变体的分析
通过本文所述的方法生成具有包含GLP1R结合蛋白变异片段的CDR-H3区的抗体，并如实施例4所述用基于细胞的方法进行淘选，以鉴定针对与GLP1R的结合而富集的变体。
对GLP1R肽的变体进行了下一代序列(NGS)富集(数据未示出)。简言之，在每轮选择后对噬菌体群体进行深度测序，以追踪富集并鉴定跨样品克隆。从NGS数据中滤除CHO背景克隆后，选择靶标特异性克隆。对于GLP1R肽，约2000个VH和VL对直接从细菌菌落进行条形码化并测序，以鉴定不相同的克隆。
分析了GLP1R-1变体的V基因分布、J基因分布、V基因家族和每个长度的CDR3计数。确定V基因IGHV1-69、IGHV3-30、IGHV3-23、IGHV3、IGHV3-53、IGHV3-NL1、IGHV3-d、IGHV1-46、IGHV3-h、IGHV1、IGHV3-38、IGHV3-48、IGHV1-18、IGHV1-3和IGHV3-15的频率(数据未示出)。观察到IGHV1-69和IGHV3-30的高频率。还确定了J基因IGHJ3、IGHJ6、IGHJ、IGHJ4、IGHJ5、mIGHJ、IGHJ2和IGH1的频率(数据未示出)。观察到IGHJ3和IGHJ6的高频率，而观察到的IGHJ和IGHJ4的频率较低。确定了V基因IGHV1-69、IGHV3-30、IGHV3-23、IGHV3、IGHV1-46、IGHV3-7、IGHV1和IGHV1-8的频率(数据未示出)。观察到IGHV1-69和IGHV3-30的高频率。确定了J基因IGHJ3、IGHJ6、IGHJ、IGHJ4、IGHJ5、IGHJ2和IGH1的频率(数据未示出)。观察到IGHJ3和IGHJ6的高频率，而观察到的IGHJ和IGHJ4的频率较低。
确定GLP1R-1、GLP1R-2、GLP1R-3、GLP1R-4和GLP1R-5的H积累和频率(数据未示出)。
对GLP1R-1、GLP1R-2、GLP1R-3、GLP1R-4和GLP1R-5变体进行了序列分析(数据未示出)。
对GLP1R变体确定了细胞结合。图9A-9O显示了GLP1R-2(图9A)、GLP1R-3(图9B)、GLP1R-8(图9C)、GLP1R-26(图9D)、GLP1R-30(图9E)、GLP1R-56(图9F)、GLP1R-58(图9G)、GLP1R-10(图9H)、GLP1R-25(图9I)、GLP1R-60(图9J)、GLP1R-70(图9K)、GLP1R-72(图9L)、GLP1R-83(图9M)、GLP1R-93(图9N)和GLP1R-98(图9O)的细胞结合数据。
然后在cAMP测定中分析GLP1R-3、GLP1R-8、GLP1R-26、GLP1R-56、GLP1R-58和GLP1R-10对GLP1-7-36肽的别构效应。图10A-10O显示了GLP1R变体对抑制GLP1-7-36肽诱导的cAMP活性的图示。GLP1R-3(图10B)、GLP1R-8(图10C)、GLP1R-26(图10D)、GLP1R-30(图10E)、GLP1R-56(图10F)、GLP1R-58(图10G)、GLP1R-10(图10H，右图)、GLP1R-25(图10I)和GLP1R-60(图10J)显示了GLP1-7-36肽诱导的cAMP活性的别构抑制。图10H进一步显示了与毒蜥外泌肽-4相比，GLPR-10对cAMP信号的影响(图10H，左图)。
在cAMP测定中测试了GLP1R变体，以确定这些变体是否是阻断毒蜥外泌肽-4诱导的cAMP活性的拮抗剂。图11A-11G描绘了GLP1R-2(图11A)、GLP1R-3(图11B)、GLP1R-8(图11C)、GLP1R-26(图11D)、GLP1R-30(图11E)、GLP1R-56(图11F)和GLP1R-58(图11G)的细胞功能数据。
然后在cAMP测定中分析了GLP1R-2、GLP1R-3、GLP1R-8、GLP1R-26、GLP1R-30、GLP1R-56和GLP1R-58对毒蜥外泌肽-4的别构效应。图12A-12G描绘了GLP1R-2(图12A)、GLP1R-3(图12B)、GLP1R-8(图12C)、GLP1R-26(图12D)、GLP1R-30(图12E)、GLP1R-56(图12F)和GLP1R-58(图12G)变体对抑制毒蜥外泌肽-4肽诱导的cAMP活性的图示。表12显示了单独或与GLP1R-2、GLP1R-3、GLP1R-8、GLP1R-26、GLP1R-30、GLP1R-56和GLP1R-58一起的毒蜥外泌肽-4的EC50(nM)数据。
表12.EC50(nM)数据
Figure BDA0003322188410001091
对GLP1R变体进行FACS筛选。鉴定GLP1R-2、GLP1R-3、GLP1R-8、GLP1R-10、GLP1R-25、GLP1R-26、GLP1R-30、GLP1R-56、GLP1R-58、GLP1R-60、GLP1R-70、GLP1R-72、GLP1R-83、GLP1R-93和GLP1R-98，如表13所示。GLP1R-3、GLP1R-8、GLP1R-56、GLP1R-58、GLP1R-60、GLP1R-72和GLP1R-83包含GLP1基序。参见图13。GLP1R-25、GLP1R-30、GLP1R-70、GLP1R-93和GLP1R-98包含GLP2基序。参见图13。GLP1R-50和GLP1R-71包含CC趋化因子28基序。
表13.GLP1R变体
Figure BDA0003322188410001092
Figure BDA0003322188410001101
*粗体对应于GLP1或GLP2基序。
评估GLP1R变体的聚集。对GLP1R-30和GLP1R-56变体进行大小排阻色谱分析(SEC)。82.64％的GLP1R-30是单体的(约150Kd)。97.4％的GLP1R-56是单体的(约150Kd)。
实施例11.GPCR结合蛋白功能性
对于GPCR结合蛋白，将来自噬菌体选择的前100-200个scFv转化为全长免疫球蛋白。在免疫球蛋白转化后，将克隆在ExpiCHO中瞬时转染以产生免疫球蛋白。Kingfisher和Hamilton用于批量IgG纯化，随后是实验室芯片以收集所有纯化的免疫球蛋白的纯度数据。如表14所示，从10mL培养物中获得高收率和纯度。
表14.免疫球蛋白纯度百分比
名称 IgG％纯度
mAb1 100
mAb2 100
mAb3 100
mAb4 100
mAb5 98
mAb6 100
mAb7 97
mAb8 100
mAb9 100
mAb10 100
mAb11 100
mAb12 100
mAb13 100
mAb14 100
mAb15 100
然后产生表达GPCR靶标的稳定细胞系，并通过FACS进行确认(数据未示出)。然后将表达>80％的靶标的细胞直接用于基于细胞的选择。针对过表达目的靶标的细胞进行五轮选择。每轮选择使用108个细胞。在对表达靶标的细胞进行选择之前，首先在108个CHO背景细胞上消耗来自每一轮的噬菌体。通过增加在后续选择轮次中的洗涤次数来增加选择的严格性。监测每轮选择的富集比。
使用FACS(图14A-14C)和cAMP活性(图14D)测试纯化的IgG的细胞结合亲和力。观察到别构抑制。
使用BVP ELISA测试纯化的IgG。BVP ELISA显示一些克隆具有与比较抗体相当的BVP评分(数据未示出)。
实施例12.GLP1R scFv调节剂
该实施例说明了GLP1R调节剂的鉴定。
文库淘选
将GPCR1.0/2.0scFv-噬菌体文库与CHO细胞在室温(RT)下孵育1小时以消耗CHO细胞结合物。孵育后，通过以1,200rpm离心10分钟使细胞沉淀，以去除非特异性CHO细胞结合物。然后将CHO细胞结合物已耗尽的噬菌体上清液转移到表达GLP1R的CHO细胞中。噬菌体上清液和表达GLP1R的CHO细胞在室温下孵育1小时以选择GLP1R结合物。孵育后，通过用PBS洗涤数次洗掉非结合克隆。最后，为了选择性洗脱激动剂克隆，用1μM GLP1R的天然配体GLP1肽(残基7至36)竞争掉与GLP1R细胞结合的噬菌体。从细胞洗脱的克隆很可能与GLP1R上的GLP1配体结合表位结合。通过以1,200rpm离心10分钟使细胞沉淀，以去除仍与细胞上的GLP1R结合且未与内源性GLP1配体结合位点(正构位点)结合的克隆。上清液在TG1大肠杆菌细胞中扩增，用于下一轮选择。这种选择策略重复五轮。从一轮扩增的噬菌体用作下一轮的输入噬菌体，并且在随后的每一轮选择中增加洗涤的严格性。在五轮选择后，对第4轮和第5轮各500个克隆进行Sanger测序以鉴定GLP1R调节剂的克隆。将七个独特的克隆重新格式化为IgG2，纯化，并通过FACS和功能测定进行结合测试。
结合测定
七个GLP1R scFv克隆(GLP1R-238、GLP1R-239、GLP1R-240、GLP1R-241、GLP1R-242、GLP1R-243和GLP1R-244)和用作对照的两个GLP1R IgG(pGPCR-GLP1R-43和pGPCR-GLP1R-44，Janssen Biotech，J&J)在与流式细胞术分析耦合的结合测定中进行测试。GLP1R-238、GLP1R-239、GLP1R-240、GLP1R-241、GLP1R-242、GLP1R-243和GLP1R-244的CDR3序列(表15)、重链序列(表16)和轻链序列(表17)见下。
表15.CDR3序列
Figure BDA0003322188410001131
*粗体对应于GLP-1或GLP-2基序。
表16.可变重链序列
Figure BDA0003322188410001132
Figure BDA0003322188410001141
Figure BDA0003322188410001151
表17.可变轻链序列
Figure BDA0003322188410001152
Figure BDA0003322188410001161
简言之，将表达flag-GLP1R-GFP的CHO细胞(CHO-GLP1R)和CHO亲本细胞与100nMIgG在冰上孵育1小时，洗涤3次，并与Alexa 647缀合的山羊-抗人抗体(1:200)在冰上孵育30分钟，然后洗涤3次。所有孵育和洗涤均在含有PBS和0.5％BSA的缓冲液中进行。对于滴定，从100nM开始以1:3连续稀释IgG。通过流式细胞术分析细胞，并通过测量针对Alexa 647信号的GFP信号来鉴定发现IgG与CHO-GLP1R结合的命中。发现GLP1R-238、GLP1R-240、GLP1R-241、GLP1R-242、GLP1R-243和GLP1R-244与CHO-GLP1R结合。GLP1R-238与CHO-GLP1R和CHO亲本细胞同等结合，因此似乎是非特异性结合物。采用IgG滴定的结合测定分析呈现为IgG浓度相对于MFI(平均荧光强度)绘制的结合曲线，见图15A-15H。采用100nM IgG的结合测定的流式细胞术数据呈现为点图，见图12和图16A-16I。
功能测定
所有GLP1R scFv克隆，以及pGPCR-GLP1R-43和pGPCR-GLP1R-44，通过进行cAMP测定(Eurofins DiscoverX Corporation)来分析它们对GLP1R信号传导的潜在影响。这些测定涉及CHO细胞，这些细胞被工程改造为过表达天然Gαs-偶联的野生型GLP1R，并被设计用于检测响应于受体的激动剂刺激的细胞内cAMP水平变化。检测cAMP水平所涉及的技术是基于酶片段互补技术的无洗涤信号增益竞争性免疫测定，并产生与细胞中cAMP的量成正比的发光信号。实验旨在确定IgG的激动剂或别构活性。为了测试IgG的激动剂活性，用IgG(从100nM开始以1:3滴定)或用已知激动剂GLP1(7-36)肽(从12.5nM开始以1:6滴定)在37℃下刺激细胞30分钟。为了测试IgG的别构活性，将细胞与100nM固定浓度的IgG在室温下孵育1小时以允许结合，然后用GLP1(7-36)肽(从12.5nM开始以1:6滴定)在37℃下刺激30分钟。按照检测试剂盒说明书检测细胞内cAMP水平。
如图17A-17B所示，没有一种IgG引发激动剂信号。还测试了GLP1R-241的cAMP别构效应(图17C)、β-抑制蛋白募集(图17D)和内化(图17E)。通过以抑制方式改变这些细胞对GLP1(7-36)的信号响应，几种IgG充当负别构调节剂，如图18A-18B所示。表18显示了对应于图18A的EC50(nM)值，表19显示了对应于图18B的EC50。
表18.EC50(nM)值
Figure BDA0003322188410001171
表19.EC50(nM)值
Figure BDA0003322188410001172
数据显示了GLP1R调节剂的药理学和功能效应。
实施例13：GLP1R激动剂和拮抗剂
本实施例说明了GLP1R激动剂和拮抗剂的鉴定。
与实施例12类似地进行实验。分析了六种GLP1R免疫球蛋白(IgG)的结合和功能测定，以确定哪些克隆是激动剂或拮抗剂。测试的GLP1RIgG包括GLP1R-59-2、GLP1R-59-241、GLP1R-59-243、GLP1R-3、GLP1R-241和GLP1R-2。GLP1R-241、GLP1R-3和GLP1R-2先前在实施例10和12中描述。GLP1R-59-2、GLP1R-59-241、GLP1R-59-243、GLP1R-43-8和GLP1R-3的重链序列见表20。
表20.可变重链序列
Figure BDA0003322188410001173
Figure BDA0003322188410001181
表征了GLP1R IgG的热斜变稳定性(Tm和Tagg)。使用UNcle平台表征IgG，数据见表21。
表21.热斜变稳定性测量
Figure BDA0003322188410001191
然后使用如实施例12中所述的类似方法，在与流式细胞术分析耦合的结合测定中测定GLP1R IgG。简言之，将稳定表达Flag-GLP1R-GFP的CHO细胞或CHO亲本细胞与第一IgG(100nM或1:3滴定)一起孵育。第二抗体孵育涉及Alexa 647缀合的山羊抗人IgG。流式细胞术针对Alexa 647信号测量GFP信号，以鉴定与靶标(GLP1R)特异性结合的IgG。配体竞争测定涉及将第一IgG与1μM GLP1(7-36)共孵育。GLP1R-59-2、GLP1R-59-241、GLP1R-59-243、GLP1R-3、GLP1R-241和GLP1R-2的数据见图19A-19F。
还使用如实施例12所述的类似方法使用GLP1R IgG进行功能测定。简言之，cAMP、β-抑制蛋白募集和活化受体内化测定从Eurofins DiscoverX获得，并利用过表达未标记的GLP-1R的CHO-K1或U2OS细胞。这些用于通过将细胞与IgG预孵育并检查它们对GLP1(7-36)诱导的信号传导的影响来测试IgG与GLP1(7-36)相比的激动剂活性，或IgG的拮抗活性。对于cAMP测定，在GLP1(7-36)或IgG刺激后，使用基于酶片段互补(EFC)技术的均质、无洗涤、信号增益竞争性免疫测定来测量细胞cAMP水平。来自GLP1R-59-2、GLP1R-59-241、GLP1R-59-243、GLP1R-3、GLP1R-241和GLP1R-2的功能测定的数据见图20A-20F。GLP1R-59-2、GLP1R-59-241、GLP1R-59-243、GLP1R-3、GLP1R-241和GLP1R-2的EC50(nM)数据见表22-23。如表23所见，GLP1R-3的EC50数据显示2.2倍的差异。GLP1-241的EC50数据显示1.7倍的差异。GLP1R-2的EC50数据显示0.8倍的差异。
表22.GLP1R-59-2、GLP1R-59-241和GLP1R-59-243的EC50(nM)
GLP1R IgG EC50 GLP1(7-36)EC50
GLP1R-59-2 0.842 0.4503
GLP1R-59-241 0.7223 0.4731
GLP1R-59-243 0.8209 0.4731
表23.GLP1R-3、GLP1R-241和GLP1R-2的EC50(nM)
Figure BDA0003322188410001201
还测定了GLP1R-3以确定GLP1R相比于GL1P2R结合的特异性，并确定对GLP1R比对GLP2R具有特异性(数据未示出)。还测定了GLP1R-3、GLP1R-59-242和GLP1R-43-8在小鼠、猕猴和人GLP1R上的结合。发现100nM的GLP1R-3、100nM的GLP1R-59-242和100nM的GLP1R-43-8结合小鼠、猕猴和人GLP1R(数据未示出)。还发现GLP1R-3结合表达内源性GLP1R的人胰腺前体细胞。
测定了GLP1R-59-2、GLP1R-59-241和GLP1R-59-243在小鼠、猕猴和人GLP1R上的结合。发现100nM的GLP1R-59-2、100nM的GLP1R-59-241和50nM的GLP1R-59-243结合小鼠、猕猴和人GLP1R(数据未示出)。还发现GLP1R-59-2结合表达内源性GLP1R的人胰腺前体细胞。
该实施例显示了具有激动和拮抗性质的GLP1R IgG。几种IgG诱导cAMP信号传导、β-抑制蛋白募集和受体内化，类似于GLP1(7-36)。
实施例14：VHH文库
开发了合成VHH文库。对于具有定制的CDR多样性的“VHH Ratio”文库，使用Clustal Omega比对2391个VHH序列(iCAN数据库)，以确定每个位置的共有序列，并且框架衍生自每个位置的共有序列。对所有2391个序列的CDR进行了位置特异性变异分析，并将这种多样性引入到文库设计中。对于具有改组CDR多样性的“VHH Shuffle”文库，对iCAN数据库扫描纳米抗体序列中的独特CDR。鉴定了1239个独特的CDR1、1600个独特的CDR2和1608个独特的CDR3，并且框架衍生自iCAN数据库中2391个序列中每个框架位置的共有序列。每个独特的CDR都在共有框架中单独合成并改组，以生成理论多样性为3.2x10^9的文库。然后使用限制酶消化将该文库克隆到噬菌粒载体中。对于‘VHH hShuffle’文库(合成的“人类”VHH文库，具有改组的CDR多样性)，对iCAN数据库扫描纳米抗体序列中的独特CDR。鉴定了1239个独特的CDR1、1600个独特的CDR2和1608个独特的CDR3，并且框架1、3和4衍生自人类种系DP-47框架。框架2衍生自iCAN数据库中2391个序列中每个框架位置的共有序列。每个独特的CDR都使用NUGE工具在部分人源化的框架中单独合成并改组，以生成理论多样性为3.2x10^9的文库。然后使用NUGE工具将该文库克隆到噬菌粒载体中。
使用Carterra SPR系统评估VHH-Fc变体的结合亲和力和亲和力分布。VHH-Fc显示出对TIGIT的一定范围的亲和力，下限为12nM KD，上限为1685nM KD(数据未示出)。表23A提供了VHH-Fc克隆对于ELISA、蛋白A(mg/ml)和KD(nM)的具体值。图21A和图21B在20-4000亲和力阈值(图21A；单价KD)和20-1000亲和力阈值(图21B；单价KD)上描绘了VHH文库的TIGIT亲和力分布。在140个测试的VHH结合物中，51个变体的亲和力<100nM，90个变体的亲和力<200nM。
表23A.VHH-Fc克隆的ELISA、蛋白A和KD
Figure BDA0003322188410001221
Figure BDA0003322188410001231
实施例15：GLP1R的VHH文库
通过类似于实施例14所述的方法开发了GLP1R的VHH文库。简言之，产生表达GLP1R的稳定细胞系，并通过FACS确认靶标表达。然后将表达>80％的靶标的细胞用于基于细胞的选择。针对稳定过表达目的靶标的细胞进行五轮基于细胞的选择。每轮选择使用108个细胞。在对表达靶标的细胞进行选择之前，首先在108个CHO背景细胞上消耗来自每一轮的噬菌体。通过增加随后几轮选择中的洗涤次数来增加选择的严格性。然后使用胰蛋白酶从噬菌体中洗脱细胞，并扩增噬菌体用于下一轮淘选。来自第4轮和第5轮的总共1000个克隆通过NGS进行测序，以鉴定用于重新格式化为VHH-Fc的独特克隆。
在156个独特GLP1R VHH Fc结合物中，有53个的靶细胞平均荧光强度(MFI)值是亲本细胞的2倍。变体GLP1R-43-77的数据见于图22A-22B和表23B-24。
表23B.淘选概述
Figure BDA0003322188410001241
表24.GLP1R-43-77数据
带有门控路径的子集名称 计数 中值：RL1-A
样品E10.fcs/CHO-亲本 11261 237
样品E10.fcs/CHO-GLP1R 13684 23439
实施例16.具有不同CDR的GLP1R文库
使用CDR随机化方案创建GLP1R文库。
简言之，基于GPCR抗体序列设计GLP1R文库。分析了超过60种不同的GPCR抗体，并使用CDR随机化方案修饰了来自这些GPCR的序列。
重链IGHV3-23设计见图23A。如图23A所示，IGHV3-23 CDRH3具有四种不同的长度：23个氨基酸、21个氨基酸、17个氨基酸和12个氨基酸，每个长度都有其残基多样性。四种长度的比例如下：CDRH3 23个氨基酸长度为40％，CDRH3 21个氨基酸长度为30％，CDRH3 17个氨基酸长度为20％，CDRH3 12个氨基酸长度为10％。CDRH3多样性被确定为9.3×108，全重链IGHV3-23多样性为1.9x1013。
重链IGHV1-69设计见图23B。如图23B所示，IGHV1-69 CDRH3具有四种不同的长度：20个氨基酸、16个氨基酸、15个氨基酸和12个氨基酸，每个长度都有其残基多样性。四种长度的比例如下：CDRH3 20个氨基酸长度为40％，CDRH3 16个氨基酸长度为30％，CDRH3 15个氨基酸长度为20％，CDRH3 12个氨基酸长度为10％。CDRH3多样性被确定为9×107，全重链IGHV-69多样性为4.1x1012。
轻链IGKV 2-28和IGLV 1-51设计见图23C。分析抗体轻链CDR序列的位置特异性变异。选择了两个具有固定CDR长度的轻链框架。κ链和轻链的理论多样性分别被确定为13800和5180。
最终的理论多样性被确定为4.7x1017，最终生成的Fab文库的多样性为6x109。参见图23D。
测定纯化的GLP1R IgG，以确定基于细胞的亲和力测量和功能分析。使用纯化的GLP1R IgG测量FACS结合。如图23E所示，GLP1R IgG以低纳摩尔范围的亲和力选择性结合表达GLPIR的细胞，证明IgG以1.1nM的亲和力选择性结合表达靶标的细胞。还在使用实施例4-10中描述的方法生成的GLP1R IgG中测量了FACS结合。如图23F所示，GLP1R IgG以低纳摩尔范围内的亲和力选择性结合表达GLPIR的细胞。
使用纯化的GLP1R IgG的cAMP测定证明，GLP1R IgG的存在导致表达GLP1R的CHO细胞中GLP1激动剂诱导的cAMP响应的剂量响应曲线左移，如图23G所示。使用实施例4-10中描述的方法生成的GLP1R IgG还导致表达GLP1R的CHO细胞中受体激动剂诱导的cAMP响应的剂量响应曲线左移(图23H)。
数据显示了具有改善的效力和功能的GLP1R IgG的设计和生成。
实施例17.口服葡萄糖耐量小鼠模型
本研究的目的是评价嵌合抗体GLP1R激动剂和拮抗剂对C57BL/6J DIO小鼠中饮食诱发肥胖小鼠模型中的血糖控制的急性影响。测试物见以下表25。
表25.测试物身份
Figure BDA0003322188410001251
Figure BDA0003322188410001261
-＝不适用。
对于每个测试物，产生7个不同的测试物组，如以下表26中所总结的，每组有8只动物。
表26.实验设计
Figure BDA0003322188410001262
No.＝编号；HFD＝高脂肪饮食；QD＝每天一次；SC＝皮下注射
在第3天(所有动物)和第1天(第1-7组)，通过剪尾测定非空腹血糖。收集了大约5-10μL血液。将来自动物的第二滴血液置于血糖测试条上，并使用手持式血糖仪(AbbottAlpha Trak)进行分析。
在操作当天进行非空腹血糖测量后，将动物称重，标记尾巴，并将动物放入没有食物的干净的笼子中。使动物禁食4小时并测定空腹血糖。然后用表26中所示的指定测试物处理动物。
60分钟后对每只动物进行口服葡萄糖耐量试验(OGTT)。通过口服管饲法给动物服用2g/kg葡萄糖(10mL/kg)。在相对于葡萄糖给药的以下时间，将来自动物的第二滴血液置于手持式血糖仪(AbbottAlpha Trak)上，通过剪尾测定血糖：0(刚好在葡萄糖给药之前)、15、30、60、90和120分钟。在OGTT的15分钟和60分钟时间点获得额外的血液样品，用于估计血清胰岛素。
图24A-24B显示GLP1R-3抑制GLP1:GLP1R信号传导(图24A)，在较高浓度下完全抑制(图24B)。如图24C所示，给予GLP1R-3的动物在施用葡萄糖后维持持续的高葡萄糖水平，表明GLP1:GLP1R信号阻断。如图24D所示，10mg/kg的GLP1R-59-2剂量表现出类似于利拉鲁肽对照的持续低葡萄糖水平。
数据显示，生成的GLP1R抗体在小鼠模型中对葡萄糖耐量具有功能影响。
实施例18.GLP1R激动剂和拮抗剂在野生型小鼠中的影响
在本实施例中确定了GLP1R-59-2(激动剂)和GLP1R-3(拮抗剂)在野生型小鼠中的影响。
使用15只C57BL/6NHsd小鼠，并进行葡萄糖耐量试验(GTT)。对三组小鼠进行体内GTT试验，每组5只。所有三组均禁食13.5小时，然后称重，测量零时血糖，然后以10uL/g体重的剂量腹膜内注射30％葡萄糖溶液。在葡萄糖注射后15、30、60、120和180分钟时记录每只小鼠的血糖测量值。第一组小鼠用两种剂量的GLP1R-59-2处理：在禁食时(GTT前-13.5小时)10mg/kg的GLP1R-59-2，在GTT开始前两小时再次用10mg/kg的GLP1R-59-2。第二组小鼠用两种剂量的GLP1R-3处理：禁食时(GTT前-13.5小时)10mg/kg的GLP1R-3，在GTT开始前两小时再次用10mg/kg的GLP1R-3。第三组小鼠是对照小鼠，并且未进行处理。GLP1R-59-2(激动剂)、GLP1R-3(拮抗剂)和对照的数据见于图25A-25D。图25A显示了用GLP1R-59-2(激动剂)、GLP1R-3(拮抗剂)和对照随时间(以分钟为单位，x轴)处理的小鼠的血糖水平(y轴)。图25B显示了用GLP1R-59-2(激动剂)、GLP1R-3(拮抗剂)和对照处理的小鼠的血糖水平(y轴)。如图25C所示，与对照相比，在禁食(p＝0.0008)和非禁食(p<0.0001)小鼠中，在经GLP1R-59-2(激动剂)处理的小鼠中观察到血糖显著降低。如图25D所示，GLP1R-3(拮抗剂)预给药的动物在禁食6小时内没有显示血糖降低，而对照小鼠表现出降低。
实施例19.示例性序列
GLP1R的示例性序列见表27。
表27.GLP1R序列
Figure BDA0003322188410001281
Figure BDA0003322188410001291
Figure BDA0003322188410001301
Figure BDA0003322188410001311
Figure BDA0003322188410001321
Figure BDA0003322188410001331
Figure BDA0003322188410001341
Figure BDA0003322188410001351
Figure BDA0003322188410001361
Figure BDA0003322188410001371
Figure BDA0003322188410001381
Figure BDA0003322188410001391
Figure BDA0003322188410001401
Figure BDA0003322188410001411
Figure BDA0003322188410001421
Figure BDA0003322188410001431
Figure BDA0003322188410001441
虽然本文已经示出并描述了本公开的优选实施方案，但对于本领域技术人员明显的是，这些实施方案仅以示例的方式提供。在不脱离本公开内容的情况下，本领域技术人员将会想到许多变化、改变和替换。应当理解，在实施本公开时可以采用本文所述本公开的实施方案的各种替代方案。旨在以所附权利要求书限定本公开的范围，并且由此涵盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物。

Claims (57)

1.一种核酸文库，其包含：多个核酸，其中每个核酸编码当翻译时编码GLP1R结合免疫球蛋白的序列，其中所述GLP1R结合免疫球蛋白包含GLP1R结合域的变体，其中所述GLP1R结合域是GLP1R的配体，并且其中所述核酸文库包含至少10,000个变异免疫球蛋白重链和至少10,000个变异免疫球蛋白轻链。
2.根据权利要求1所述的核酸文库，其中所述核酸文库包含至少50,000个变异免疫球蛋白重链和至少50,000个变异免疫球蛋白轻链。
3.根据权利要求1所述的核酸文库，其中所述核酸文库包含至少100,000个变异免疫球蛋白重链和至少100,000个变异免疫球蛋白轻链。
4.根据权利要求1所述的核酸文库，其中所述核酸文库包含至少105个不相同的核酸。
5.根据权利要求1所述的核酸文库，其中所述免疫球蛋白重链当翻译时的长度为约90至约100个氨基酸。
6.根据权利要求1所述的核酸文库，其中所述免疫球蛋白重链当翻译时的长度为约100至约400个氨基酸。
7.根据权利要求1所述的核酸文库，其中所述变异免疫球蛋白重链当翻译时与SEQ IDNO:2303、2304、2305、2306、2307、2308、2309、2317、2318、2319、2320或2321具有至少90％的序列同一性。
8.根据权利要求1所述的核酸文库，其中所述变异免疫球蛋白轻链当翻译时与SEQ IDNO:2310、2311、2312、2313、2314、2315或2316具有至少90％的序列同一性。
9.一种核酸文库，其包含：多个核酸，其中每个核酸编码当翻译时编码GLP1R单结构域抗体的序列，其中所述多个序列中的每个序列包含编码重链上的CDR1、CDR2和CDR3中的至少一个的变异序列；其中所述文库包含至少30,000个变异序列；并且其中所述抗体或抗体片段以小于100nM的KD与其抗原结合。
10.根据权利要求9所述的核酸文库，其中所述核酸文库包含至少50,000个变异免疫球蛋白重链和至少50,000个变异免疫球蛋白轻链。
11.根据权利要求9所述的核酸文库，其中所述核酸文库包含至少100,000个变异免疫球蛋白重链和至少100,000个变异免疫球蛋白轻链。
12.根据权利要求9所述的核酸文库，其中所述核酸文库包含至少105个不相同的核酸。
13.根据权利要求9所述的核酸文库，其中所述免疫球蛋白重链当翻译时的长度为约90至约100个氨基酸。
14.根据权利要求9所述的核酸文库，其中所述免疫球蛋白重链当翻译时的长度为约100至约400个氨基酸。
15.根据权利要求9所述的核酸文库，其中所述变异免疫球蛋白重链当翻译时与SEQ IDNO:2303、2304、2305、2306、2307、2308、2309、2317、2318、2319、2320或2321具有至少90％的序列同一性。
16.根据权利要求9所述的核酸文库，其中所述变异免疫球蛋白轻链当翻译时与SEQ IDNO:2310、2311、2312、2313、2314、2315或2316具有至少90％的序列同一性。
17.一种结合GLP1R的抗体或抗体片段，其包含免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链：
(a)其中所述免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:2303、2304、2305、2306、2307、2308、2309、2317、2318、2319、2320或2321所示的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且
(b)其中所述免疫球蛋白轻链包含与SEQ ID NO:2310、2311、2312、2313、2314、2315或2316所示的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。
18.根据权利要求17所述的抗体或抗体片段，其中所述免疫球蛋白重链包含与SEQ IDNO:2303所示的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且其中所述免疫球蛋白轻链包含与SEQ ID NO:2310所示的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。
19.根据权利要求17所述的抗体或抗体片段，其中所述免疫球蛋白重链包含与SEQ IDNO:2304所示的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且其中所述免疫球蛋白轻链包含与SEQ ID NO:2311所示的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。
20.根据权利要求17所述的抗体或抗体片段，其中所述免疫球蛋白重链包含与SEQ IDNO:2305所示的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且其中所述免疫球蛋白轻链包含与SEQ ID NO:2312所示的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。
21.根据权利要求17所述的抗体或抗体片段，其中所述免疫球蛋白重链包含与SEQ IDNO:2306所示的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且其中所述免疫球蛋白轻链包含与SEQ ID NO:2313所示的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。
22.根据权利要求17所述的抗体或抗体片段，其中所述免疫球蛋白重链包含与SEQ IDNO:2307所示的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且其中所述免疫球蛋白轻链包含与SEQ ID NO:2314所示的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。
23.根据权利要求17所述的抗体或抗体片段，其中所述免疫球蛋白重链包含与SEQ IDNO:2308所示的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且其中所述免疫球蛋白轻链包含与SEQ ID NO:2315所示的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。
24.根据权利要求17所述的抗体或抗体片段，其中所述免疫球蛋白重链包含与SEQ IDNO:2309所示的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且其中所述免疫球蛋白轻链包含与SEQ ID NO:2316所示的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。
25.根据权利要求17所述的抗体或抗体片段，其中所述抗体是单克隆抗体、多克隆抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、移植抗体、人抗体、人源化抗体、合成抗体、嵌合抗体、骆驼化抗体、单链Fv(scFv)、单链抗体、Fab片段、F(ab')2片段、Fd片段、Fv片段、单结构域抗体、分离的互补决定区(CDR)、双抗体、仅由单个单体可变域组成的片段、二硫键连接的Fv(sdFv)、胞内抗体、抗独特型(抗-Id)抗体，或它们的抗原结合片段。
26.根据权利要求17所述的抗体或抗体片段，其中所述抗体或其抗体片段是嵌合的或人源化的。
27.根据权利要求17所述的抗体或抗体片段，其中所述抗体在cAMP测定中的EC50小于约25纳摩尔。
28.根据权利要求17所述的抗体或抗体片段，其中所述抗体在cAMP测定中的EC50小于约20纳摩尔。
29.根据权利要求17所述的抗体或抗体片段，其中所述抗体在cAMP测定中的EC50小于约10纳摩尔。
30.根据权利要求17所述的抗体或抗体片段，其中所述抗体是GLP1R的激动剂。
31.根据权利要求17所述的抗体或抗体片段，其中所述抗体是GLP1R的拮抗剂。
32.根据权利要求17所述的抗体或抗体片段，其中所述抗体是GLP1R的别构调节剂。
33.根据权利要求32所述的抗体或抗体片段，其中所述GLP1R的别构调节剂是负别构调节剂。
34.一种抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包含SEQ ID NO:2277、2278、2281、2282、2283、2284、2285、2286、2289、2290、2291、2292、2294、2295、2296、2297、2298、2299、2300、2301或2302中的任一个的序列或表27所示的序列。
35.一种抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包含SEQ ID NO:2277、2278、2281、2282、2283、2284、2285、2286、2289、2290、2291、2292、2294、2295、2296、2297、2298、2299、2300、2301或2302中的任一个的序列或表27所示的序列；并且其中所述抗体是单克隆抗体、多克隆抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、移植抗体、人抗体、人源化抗体、合成抗体、嵌合抗体、骆驼化抗体、单链Fv(scFv)、单链抗体、Fab片段、F(ab')2片段、Fd片段、Fv片段、单结构域抗体、分离的互补决定区(CDR)、双抗体、仅由单个单体可变域组成的片段、二硫键连接的Fv(sdFv)、胞内抗体、抗独特型(抗-Id)抗体，或它们的抗原结合片段。
36.GLP1R的拮抗剂，其包含SEQ ID NO:2279或2320。
37.根据权利要求36所述的拮抗剂，其中所述拮抗剂的EC50不超过1.5nM。
38.根据权利要求36所述的拮抗剂，其中所述拮抗剂的EC50不超过1.0nM。
39.根据权利要求36所述的拮抗剂，其中所述拮抗剂的EC50不超过0.5nM。
40.根据权利要求36所述的拮抗剂，其中所述拮抗剂是抗体或抗体片段。
41.GLP1R的激动剂，其包含SEQ ID NO:2317。
42.根据权利要求41所述的激动剂，其中所述激动剂的EC50不超过1.5nM。
43.根据权利要求41所述的激动剂，其中所述激动剂的EC50不超过1.0nM。
44.根据权利要求41所述的激动剂，其中所述激动剂的EC50不超过0.5nM。
45.根据权利要求41所述的激动剂，其中所述激动剂是抗体或抗体片段。
46.一种抑制GLP1R活性的方法，其包括施用权利要求17-35中任一项的抗体或抗体片段。
47.根据权利要求46所述的方法，其中所述抗体或抗体片段是别构调节剂。
48.根据权利要求46所述的方法，其中所述抗体或抗体片段是负别构调节剂。
49.一种用于治疗代谢紊乱的方法，其包括向有需要的受试者施用权利要求17-35中任一项的抗体。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述代谢紊乱是II型糖尿病或肥胖症。
51.由权利要求1-16中任一项的核酸文库编码的蛋白质文库，其中所述蛋白质文库包含肽。
52.根据权利要求51所述的蛋白质文库，其中所述蛋白质文库包含免疫球蛋白。
53.根据权利要求51所述的蛋白质文库，其中所述蛋白质文库包含抗体。
54.根据权利要求51所述的蛋白质文库，其中所述蛋白质文库是拟肽文库。
55.一种载体文库，其包含权利要求1-16中任一项的核酸文库。
56.一种细胞文库，其包含权利要求1-16中任一项的核酸文库。
57.一种细胞文库，其包含权利要求51-54中任一项的蛋白质文库。
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