CN117729937A - 涉及腺苷受体的方法和组合物 - Google Patents

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CN117729937A CN202280022804.4A CN202280022804A CN117729937A CN 117729937 A CN117729937 A CN 117729937A CN 202280022804 A CN202280022804 A CN 202280022804A CN 117729937 A CN117729937 A CN 117729937A
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亚伦·萨托
刘强
福米可·阿克塞尔罗德
王琳雅
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Abstract

本文提供了涉及腺苷A2A受体文库的方法和组合物，该文库具有编码包含腺苷A2A结合结构域的支架的核酸。本文描述的腺苷A2A受体文库编码免疫球蛋白诸如抗体。

Description

涉及腺苷受体的方法和组合物
交叉引用
本申请要求2021年1月21日提交的美国专利申请第63/140,201号、2021年6月11日提交的美国专利申请第63/209,892号和2021年9月16日提交的美国专利申请第63/244,976号的权益，其中所述申请的每一个的内容通过引用整体并入本文。
背景
G蛋白偶联受体(GPCR)诸如腺苷受体与各种各样的疾病有关。由于获得合适抗原的问题，产生针对GPCR的抗体一直很困难，因为GPCR通常在细胞中以低水平表达，并且在纯化时非常不稳定。因此，对于靶向腺苷受体的治疗干预的改进的剂存在需求。
通过引用并入
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请通过引用并入本文，其程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请被具体和单独地指明通过引用并入。
简要概述
本文提供了用于活化T细胞的组合物和方法。
本文提供了用于活化T细胞的方法，该方法包括施用抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段包含与SEQ ID NO:6-717中列出的序列至少约90％相同的序列。本文还提供了用于活化T细胞的方法，其中所述抗体或抗体片段包含与SEQ ID NO:35-44中任一项中列出的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列。本文还提供了用于活化T细胞的方法，其中所述抗体或抗体片段包含SEQ ID NO:35-44中任一项中列出的氨基酸序列。本文还提供了用于活化T细胞的方法，其中所述抗体是单克隆抗体、多克隆抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、移植抗体(grafted antibody)、人类抗体、人源化抗体、合成抗体、嵌合抗体、骆驼源化抗体、单链Fv(scFv)、单链抗体、Fab片段、F(ab′)2片段、Fd片段、Fv片段、单结构域抗体、分离的互补决定区(CDR)、双特异抗体(diabody)、仅包含单个单体可变结构域的片段、二硫键连接的Fv(sdFv)、胞内抗体、抗独特型(抗-Id)抗体或其抗原结合片段。本文还提供了用于活化T细胞的方法，其中所述抗体或抗体片段以小于约75nM的KD与腺苷2A受体结合。本文还提供了用于活化T细胞的方法，其中所述抗体或抗体片段以小于约50nM的KD与腺苷2A受体结合。本文还提供了用于活化T细胞的方法，其中所述抗体或抗体片段以小于约25nM的KD与腺苷2A受体结合。本文还提供了用于活化T细胞的方法，其中所述抗体或抗体片段以小于约10nM的KD与腺苷2A受体结合。本文还提供了用于活化T细胞的方法，其中所述抗体或抗体片段包括在T细胞活化测定中小于约20nM的IC50。本文还提供了用于活化T细胞的方法，其中所述抗体或抗体片段包括在T细胞活化测定中小于约10nM的IC50。本文还提供了用于活化T细胞的方法，其中所述抗体或抗体片段包括在T细胞活化测定中小于约7.5nM的IC50。本文还提供了用于活化T细胞的方法，其中所述抗体或抗体片段包括在T细胞活化测定中小于约5nM的IC50。
本文提供了抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段包含与SEQ ID NO:6-717中列出的序列至少约90％相同的序列。本文还提供了抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包含与SEQ ID NO:35-44中任一项中列出的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列。本文还提供了抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包含SEQ ID NO:35-44中任一项中列出的氨基酸序列。本文还提供了抗体或抗体片段，其中所述抗体是单克隆抗体、多克隆抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、移植抗体、人类抗体、人源化抗体、合成抗体、嵌合抗体、骆驼源化抗体、单链Fv(scFv)、单链抗体、Fab片段、F(ab′)2片段、Fd片段、Fv片段、单结构域抗体、分离的互补决定区(CDR)、双特异抗体、仅包含单个单体可变结构域的片段、二硫键连接的Fv(sdFv)、胞内抗体、抗独特型(抗-Id)抗体或其抗原结合片段。本文还提供了抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段以小于约75nM的KD与腺苷2A受体结合。本文还提供了抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段以小于约50nM的KD与腺苷2A受体结合。本文还提供了抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段以小于约25nM的KD与腺苷2A受体结合。本文还提供了抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段以小于约10nM的KD与腺苷2A受体结合。本文还提供了抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括在T细胞活化测定中小于约20nM的IC50。本文还提供了抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括在T细胞活化测定中小于约10nM的IC50。本文还提供了抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括在T细胞活化测定中小于约7.5nM的IC50。本文还提供了抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括在T细胞活化测定中小于约5nM的IC50。
附图简述
图1A描绘了免疫球蛋白支架的第一示意图。
图1B描绘了免疫球蛋白支架的第二示意图。
图2描绘了放置在支架中的基序的示意图。
图3呈现了显示如本文公开的用于基因合成的示例性过程工作流程的步骤图。
图4示出了计算机系统的实例。
图5是示出计算机系统的架构的框图。
图6是显示被配置为并入多于一个计算机系统、多于一个手机和个人数据助理以及网络附接存储(NAS)的网络的图。
图7是使用共享虚拟地址存储器空间的多处理器计算机系统的框图。
图8A描绘了包含使用接头附接至VL结构域的VH结构域的免疫球蛋白支架的示意图。
图8B描绘了包含使用接头附接至VL结构域的VH结构域、前导序列和pIII序列的免疫球蛋白支架的全结构域架构的示意图。
图8C描绘了VL结构域或VH结构域的四个框架元件(FW1、FW2、FW3、FW4)和3个可变CDR(L1、L2、L3)元件的示意图。
图9A描绘了胰高血糖素样肽1(GLP-1，加框的)与GLP-1受体(GLP-1R)复合的结构，PDB条目5VAI。
图9B描绘了CXCR4趋化因子受体与环肽拮抗剂CVX15(加框的)复合的晶体结构，PDB条目3OR0。
图9C描绘了具有跨膜结构域和胞外结构域(ECD)(加框的)的人类smoothened的晶体结构，PDB条目5L7D。ECD通过胞外环3(ECL3)接触TMD。
图9D描绘了GLP-1R与Fab(加框的)复合的结构，PDB条目6LN2。
图9E描绘了CXCR4与病毒趋化因子拮抗剂病毒巨噬细胞炎性蛋白2(vMIP-II，加框的)复合的晶体结构，PDB条目4RWS。
图10描绘了聚焦GPCR的文库设计的方案。两条种系重链VH1-69和VH3-30；4条种系轻链IGKV1-39和IGKV3-15、以及IGLV1-51和IGLV2-14。
图11描绘了聚焦GPCR的文库中HCDR3长度分布与来自三名健康成人供者的B细胞群体中的HCDR3长度分布进行比较的图。总计，分析了来自GPCR文库的2,444,718个独特VH序列和来自人类B细胞库(repertoire)的2,481,511个独特VH序列，以产生长度分布图。y轴以0.0200单位间隔标记从0.000至0.1400的频率；x轴是长度，并且以3个氨基酸间隔标记0至57个氨基酸。
图12描绘了VHH-Fc的克隆、ELISA值、文库、ProA值和KD值。
图13描绘了本文产生的噬菌体展示的超免疫文库的设计方案。
图14A-图14B描绘了A2AR-90-007的剂量曲线(图14A)和FACS分析(图14B)的图。
图15A描绘了重链IGHV3-23设计的方案。
图15B描绘了重链IGHV1-69设计的方案。
图15C描绘了轻链IGKV 2-28和IGLV 1-51设计的方案。
图15D描绘了GPCR文库的理论多样性和最终多样性的方案。
图16A-图16O描绘了使用变体A2A受体免疫球蛋白A2A90(图16A)、A2A91(图16B)、A2A92(图16C)、A2A93(图16D)、A2A94(图16E)、A2A1(图16F)、A2A95(图16G)、A2A2(图16H)、A2A3(图16I)、A2A4(图16J)、A2A5(图16K)、A2A6(图16L)、A2A96(图16M)、A2A7(图16N)和对照(图16O)的流式细胞术数据。
图17A-图17H描绘了使用变体A2A受体免疫球蛋白A2A-94(图17A)、A2A1(图17B)、A2A3(图17C)、A2A4(图17D)、A2A5(图17E)、A2A6(图17F)、A2A7(图17G)和对照(图17H)的结合曲线的图。用IgG浓度与MFI(平均荧光强度)绘制结合曲线。
图18A-图18O描绘了使用来自小鼠免疫文库的变体：A2A97(图18A)、A2A98(图18B)、A2A99(图18C)、A2A100(图18D)、A2A101(图18E)、A2A102(图18F)、A2A103(图18G)、A2A104(图18H)、A2A9(图18I)、A2A10(图18J)、A2A11(图18K)、A2A12(图18L)、A2A13(图18M)、A2A14(图18N)，以及使用对照(图18O)的结合曲线的图。
图19A-图19G描绘了细胞与腺苷A2aR单克隆抗体(MAB9497)和选择的变体：A2A-9(图19A)、A2A10(图19B)、A2A11(图19C)、A2A12(图19D)、A2A13(图19E)、A2A15(图19F)和对照(图19G)结合的图。用IgG浓度与MFI(平均荧光强度)绘制结合曲线。
图20A-图20G描绘了从100nM开始的滴定测定中细胞结合的图。图描绘了以下的细胞结合：针对A2a蛋白的合成文库(图20A)、针对A2a蛋白的合成文库+ZM241385(图20B)、针对A2a蛋白的人源化合成文库(图20C)、针对A2a蛋白的人源化合成文库+ZM241385(图20D)、针对A2a蛋白的免疫文库(图20E)、针对A2a蛋白的免疫文库+ZM241385(图20F)和针对A2a蛋白的小鼠免疫文库(图20G)。
图21描绘了使用cAMP测定测量的激动剂剂量响应测定的数据。
图22描绘了使用cAMP测定测量的拮抗剂剂量响应测定的数据。
图23描绘了来自cAMP拮抗剂滴定测定的结果。
图24描绘了来自cAMP测定的变体A2A-1和A2A-9的数据。
图25描绘了使用cAMP测定的变体A2A9的数据。
图26描绘了使用cAMP拮抗剂滴定测定的变体A2A9的数据。
图27A描绘了拮抗cAMP测定中变体A2A受体免疫球蛋白的数据。图27B描绘了拮抗cAMP测定中另外的变体A2A受体免疫球蛋白的数据。图27C描绘了拮抗cAMP测定中另外的变体A2A受体免疫球蛋白的数据。
图28A描绘了别构cAMP测定中变体A2A受体免疫球蛋白的数据。图28B描绘了别构cAMP测定中另外的变体A2A受体免疫球蛋白的数据。图28C描绘了别构cAMP测定中另外的变体A2A受体免疫球蛋白的数据。
图29A描绘了拮抗cAMP测定中变体A2A受体免疫球蛋白的数据。图29B描绘了拮抗cAMP测定中另外的变体A2A受体免疫球蛋白的数据。图29C描绘了拮抗cAMP测定中另外的变体A2A受体免疫球蛋白的数据。
图30A描绘了拮抗cAMP测定中变体A2A受体免疫球蛋白的数据。图30B描绘了拮抗cAMP测定中另外的变体A2A受体免疫球蛋白的数据。图30C描绘了拮抗cAMP测定中另外的变体A2A受体免疫球蛋白的数据。
图31A-图31C描绘了变型A2A-77的亲和力数据(图31A)、另外的亲和力数据(图31B)和特异性数据(图31C)。
图31D描绘了A2A-77与食蟹猴PBMC的结合。
图32A描绘了变体A2A-81、A2A-51、A2A-53、A2A-77、A2A-31、A2A-24、A2A-78、A2A-74、A2A-75、A2A-52和A2A-36的T细胞活化。图32B描绘了变体A2A-81、A2A-51、A2A-53、A2A-77、A2A-31和A2A-78的T细胞活化。
图32C描绘了变体A2A-77的T细胞活化数据。
图32D-图32H描绘了变体A2A-81、A2A-51、A2A-77和A2A-28的T细胞活化数据。
图33A描绘了变体A2A-77和A2A-81的细胞结合测定的结果。
图33B描绘了变体A2A-77和A2A-81的A2A拮抗cAMP测定的结果。
图33C描绘了变体A2A-77和A2A-81以及对照A2a的特异性数据。
图33D描绘了变体A2A-77和A2A-81的T细胞活化数据。
图34A-图34B描绘了用变体A2A-77和A2A-81治疗的小鼠的随时间推移的平均肿瘤体积(图34A和图34C)和随时间推移的相对肿瘤体积(图34B和图34D)。
图34E描绘了组合治疗的实验方案。
图34F-图34K描绘了结肠癌模型的数据。
图35A-图35M描绘了在四个治疗组中的每一个中的小鼠中检测到的细胞的比例量。图35A描绘了TIL CD45+细胞的数目相对于检测到的所有活细胞的百分比。图35B-图35G描绘了总T细胞(图35B)、CD4+细胞(图35C)、CD8+细胞(图35D)、调节性T细胞(Treg，图35E)、M1肿瘤相关巨噬细胞(TAM，图35F)和M2 TAM(图35G)的数目。图35H描绘了TIL CD45+细胞的数目相对于检测到的所有活细胞的百分比。图35I-图35J描绘了总T细胞(图35I)、CD4+细胞(图35J)、CD8+细胞(图35K)、调节性T细胞(Treg，图35L)和M1肿瘤相关巨噬细胞(TAM，图35M)的数目。
图36A-图36C描绘了中期与终末(terminal)样品中裂解全血的细胞谱。CD45+细胞的百分比描绘为相对于活细胞的百分比(图36A)。CD3+(图36B)和CD3-(图36C)细胞的量描绘为相对于CD45+细胞的百分比。
图37A-图37G描绘了在四个治疗组的每组小鼠的中期裂解的全血样品中检测到的细胞的比例量。图37A描绘了TIL CD45+细胞的数目相对于检测到的所有活细胞的百分比。图37B-图37G描绘了总T细胞(图37B)、CD4+细胞(图37C)、CD8+细胞(图37D)、调节性T细胞(Treg，图37E)、M1肿瘤相关巨噬细胞(TAM，图37F)和M2 TAM(图37G)的数目。
图38A-图38G描绘了在四个治疗组的每组小鼠的中期裂解的全血样品中检测到的细胞的比例量。图38A描绘了TIL CD45+细胞的数目相对于检测到的所有活细胞的百分比。图38B-图38G描绘了总T细胞(图38B)、CD4+细胞(图38C)、CD8+细胞(图38D)、调节性T细胞(Treg，图38E)、M1肿瘤相关巨噬细胞(TAM，图38F)和M2 TAM(图38G)的数目。
图39描绘了T细胞活化后外周血中的细胞因子水平。
图40A-图40G描绘了在终末血液样品中检测到的干扰素γ(图40A)、白细胞介素2(图40B)、白细胞介素4(图40C)、白细胞介素6(图40D)、白细胞介素8(图40E)、白细胞介素10(图40F)和TNFα(图40G)的水平。
图41A-图41C描绘了中期与终末样品中裂解全血的细胞谱。CD45+细胞的百分比描绘为相对于活细胞的百分比(图41A)。CD3+(图41B)和CD3-(图41C)细胞的量描绘为相对于CD45+细胞的百分比。
图42A-图42G描绘了在四个治疗组的每组小鼠的中期裂解的全血样品中检测到的细胞的比例量。图42A描绘了TIL CD45+细胞的数目相对于检测到的所有活细胞的百分比。图42B-图42G描绘了总T细胞(图42B)、CD4+细胞(图42C)、CD8+细胞(图42D)、调节性T细胞(Treg，图42E)、M1肿瘤相关巨噬细胞(TAM，图42F)和M2 TAM(图42G)的数目。
图43A-图43G描绘了在在四个治疗组的每组小鼠的终末裂解的全血样品中检测到的细胞的比例量。图43A描绘了TIL CD45+细胞的数目相对于检测到的所有活细胞的百分比。图43B-图43G描绘了总T细胞(图43B)、CD4+细胞(图43C)、CD8+细胞(图43D)、调节性T细胞(Treg，图43E)、M1肿瘤相关巨噬细胞(TAM，图43F)和M2 TAM(图43G)的数目。
图44A-图44G描绘了在终末血液样品中检测到的干扰素γ(图44A)、白细胞介素2(图44B)、白细胞介素4(图44C)、白细胞介素6(图44D)、白细胞介素8(图44E)、白细胞介素10(图44F)和TNFα(图44G)的水平。
图45描绘了HEK293T细胞中hA2b交叉结合物(binder)的活性。
图46描绘了用于测试A2b抗体活性的功能cAMP测定。
图47A-图47D描绘了A2b功能cAMP测定的结果。
图48A-图48E显示了响应于重新格式化的抗体(IgG1或IgG4)的原代T细胞活化测定(细胞因子释放)。
图49A-图49L描绘了在治疗组的每组小鼠的中期裂解的全血样品中检测到的细胞的比例量。图49A描绘了LWB CD45+细胞的数目相对于检测到的所有活细胞的百分比。图49B-图49L描绘了总CD3+细胞(图49B)、CD8+细胞(图49C)、CD4+细胞(图49D)、CD3-非T细胞(图49E)、Treg细胞(图49F)、增殖性T细胞(图49G)、增殖性Treg细胞(图49H)、CD11b+细胞(图49I)、CD11c+细胞(图49J)、M1巨噬细胞(图49K)和M2巨噬细胞(图49L)的数目。
图50A-图50L描绘了在治疗组的每组小鼠的终末裂解的全血样品中检测到的细胞的比例量。图50A描绘了LWB CD45+细胞的数目相对于检测到的所有活细胞的百分比。图50B-图50L描绘了总CD3+细胞(图50B)、CD4+细胞(图50C)、CD8+细胞(图50D)、CD3-非T细胞(图50E)、Treg细胞(图50F)、增殖性T细胞(图50G)、增殖性Treg细胞(图50H)、CD11b+细胞(图50I)、CD11c+细胞(图50J)、M1巨噬细胞(图50K)和M2巨噬细胞(图50L)的数目。
图51A-图51L描绘了在治疗组的每组小鼠的终末裂解的全血样品中检测到的细胞的比例量。图51A描绘了TIL CD45+细胞的数目相对于检测到的所有活细胞的百分比。图51B-图51L描绘了总CD3+细胞(图51B)、CD4+细胞(图51C)、CD8+细胞(图51D)、CD3-非T细胞(图51E)、Treg细胞(图51F)、增殖性T细胞(图51G)、增殖性Treg细胞(图51H)、CD11b+细胞(图51I)、CD11c+细胞(图51J)、M1巨噬细胞(图51K)和M2巨噬细胞(图51L)的数目。
图51M描绘了小鼠终末裂解的全血样品中TIL M1/M2巨噬细胞的比率。
图52A-图52E描绘了在治疗组的每组小鼠的终末裂解的全血样品中检测到的LWBCD3+细胞的比例量。图52A描绘了LWB CD3+细胞的数目相对于检测到的所有CD45+细胞的百分比。图52B-图52E描绘了总CD3+TNFa+细胞(图52B)、CD3+IFNg+细胞(图52C)、CD3+IL6+细胞(图52D)和CD3+IL8+细胞(图52E)的数目相对于检测到的所有CD3+细胞的百分比。
图53A-图53E描绘了在治疗组的每组小鼠的终末裂解的全血样品中检测到的LWBCD4+细胞的比例量。图53A描绘了LWB CD4+细胞的数目相对于检测到的所有CD3+细胞的百分比。图53B-图53E描绘了总CD4+TNFa+细胞(图53B)、CD4+IFNg+细胞(图53C)、CD4+IL6+细胞(图53D)和CD4+IL8+细胞(图53E)的数目相对于检测到的所有CD4+细胞的百分比。
图54A-图54E描绘了在治疗组的每组小鼠的终末裂解的全血样品中检测到的LWBCD8+细胞的比例量。图54A描绘了LWB CD8+细胞的数目相对于检测到的所有CD3+细胞的百分比。图54B-图54E描绘了总CD8+TNFa+细胞(图54B)、CD8+IFNg+细胞(图54C)、CD8+IL6+细胞(图54D)和CD8+IL8+细胞(图54E)的数目相对于检测到的所有CD8+细胞的百分比。
图55A-图55D描绘了在治疗组的每组小鼠的终末裂解的全血样品中检测到的MFICD3+细胞的量。图55A-图55D描绘了总CD3+TNFa+细胞(图55A)、CD3+IFNg+细胞(图55B)、CD3+IL6+细胞(图55C)和CD3+IL8+细胞(图55D)的数目相对于检测到的所有MFI细胞的差异。
图56A-图56D描绘了在治疗组的每组小鼠的终末裂解的全血样品中检测到的MFICD4+细胞的量。图56A-图56D描绘了总CD4+TNFa+细胞(图56A)、CD4+IFNg+细胞(图56B)、CD4+IL6+细胞(图56C)和CD4+IL8+细胞(图56D)的数目相对于检测到的所有MFI细胞的差异。
图57A-图57D描绘了在治疗组的每组小鼠的终末裂解的全血样品中检测到的MFICD8+细胞的量。图57A-图57D描绘了总CD8+TNFa+细胞(图57A)、CD8+IFNg+细胞(图57B)、CD8+IL6+细胞(图57C)和CD8+IL8+细胞(图57D)的数目相对于检测到的所有MFI细胞的差异。
图58A-图58B描绘了在治疗组的每组小鼠的中期裂解的全血样品中检测到的LWBCD8+细胞的比例量。图58A-图58B描绘了CD8+细胞(图58A)和Treg细胞(图58B)的数目相对于CD45+细胞的比例。
图58C描绘了小鼠中期裂解的全血样品中LWB CD8+/Treg细胞的比率。
图59A-图59B描绘了在治疗组的每组小鼠的终末裂解的全血样品中检测到的LWBCD8+细胞的比例量。图59A-59B描绘了CD8+细胞(图59A)和Treg细胞(图59B)的数目相对于CD45+细胞的比例。
图59C描绘了小鼠终末裂解的全血样品中LWB CD8+/Treg细胞的比率。
图60A-图60B描绘了在治疗组的每组小鼠的终末裂解的全血样品中检测到的TILCD8+细胞的比例量。图60A-60B描绘了CD8+细胞(图60A)和Treg细胞(图60B)的数目相对于CD45+细胞的比例。
图60C描绘了小鼠终末裂解的全血样品中TIL CD8+/Treg细胞的比率。
详述
除非另有指示，否则本公开内容采用本领域技术范围内的常规分子生物学技术。除非另有定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。
定义
在整个本公开内容中，各种实施方案以范围形式呈现。应当理解，以范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，并且不应当被解释为对任何实施方案的范围的不可改变的限制。因此，除非上下文另有清楚地规定，否则范围的描述应被认为已经具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的单独的数值，直至下限单位的十分之一。例如，范围的描述诸如从1至6应该被认为已具体公开了子范围诸如从1至3、从1至4、从1至5、从2至4、从2至6、从3至6等等，以及在该范围内的单独的数字，例如1.1、2、2.3、5和5.9。不论范围的宽度如何，这都适用。这些中间范围的上限和下限可以独立地被包括在较小的范围内，并且也被涵盖在本公开内容内，受限于所述范围内的任何特定地排除的限值。在所述范围包括限值中的一个或两个的情况下，除非上下文另有清楚地规定，否则将那些所包括的限值中的任一个或两个排除的范围也被包括在本公开内容中。
本文使用的术语仅用于描述特定的实施方案的目的，且不意图限制任何实施方案。除非上下文另有清楚地指示，否则如本文使用的，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”意图也包括复数形式。还应理解，术语“包括/包含(comprises)”和/或“包括/包含(comprising)”在本说明书中使用时，指定所述特征、整数、步骤、操作、要素和/或组成部分的存在，但不排除存在或添加一个或更多个其他特征、整数、步骤、操作、要素、组成部分和/或它们的组。如本文使用的，术语“和/或”包括所列出的相关的项中的一项或更多项的任何和所有的组合。
除非具体陈述或从上下文中明显，否则如本文使用的，提及数字或数字的范围术语“约”应理解为意指所述数字及其+/-10％的数字，或对于对范围列出的值的列出的下限以下10％和上限以上10％的数字。
除非具体规定，否则如本文使用的，术语“核酸”涵盖双链或三链核酸，以及单链分子。在双链或三链核酸中，核酸链不必为共延伸的(coextensive)(即，双链核酸不必沿着两条链的整个长度为双链的)。除非另有规定，否则在提供时核酸序列按5’至3’方向列出。本文描述的方法提供了分离的核酸的产生。本文描述的方法另外地提供了分离和纯化的核酸的产生。如本文提及的“核酸”的长度可以包括至少5个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、125个、150个、175个、200个、225个、250个、275个、300个、325个、350个、375个、400个、425个、450个、475个、500个、600个、700个、800个、900个、1000个、1100个、1200个、1300个、1400个、1500个、1600个、1700个、1800个、1900个、2000个或更多个碱基。此外，本文提供了用于合成任何数目的编码多肽区段的核苷酸序列的方法，所述核苷酸序列包括编码非核糖体肽(NRP)的序列、编码非核糖体肽合成酶(NRPS)模块和合成变体、其他模块化蛋白的多肽区段诸如抗体、来自其他蛋白家族的多肽区段的序列，包括非编码DNA或RNA，诸如调节序列，例如启动子、转录因子、增强子、siRNA、shRNA、RNAi、miRNA、来源于微RNA的小核仁RNA，或任何感兴趣的功能或结构DNA或RNA单元。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段的编码或非编码区、基因间DNA、由连锁分析定义的一个或更多个基因座、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转运RNA、核糖体RNA、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微RNA(miRNA)、小核仁RNA、核酶、互补DNA(cDNA)(其是mRNA的DNA表示，通常通过信使RNA(mRNA)的逆转录或通过扩增获得)；合成或通过扩增产生的DNA分子、基因组DNA、重组多核苷酸、支链多核苷酸、质粒、载体、分离的任何序列的DNA、分离的任何序列的RNA、核酸探针和引物。编码本文提及的基因或基因片段的cDNA可以包含至少一个编码外显子序列而不含基因组对应序列中的中间内含子序列的区域。
腺苷A2A和A2B受体文库
本文提供了涉及腺苷A2A受体(ADORA2)的G蛋白偶联受体(GPCR)结合文库的方法和组合物，该文库包含编码包含腺苷A2A受体结合结构域的支架的核酸。如本文描述的支架可以稳定地支持腺苷A2A受体结合结构域。腺苷A2A受体结合结构域可以基于腺苷A2A受体配体和腺苷A2A受体的表面相互作用来设计。本文还提供了涉及腺苷A2B受体(ADORA2B)的G蛋白偶联受体(GPCR)结合文库的方法和组合物，该文库包含编码包含腺苷A2B受体结合结构域的支架的核酸。如本文描述的支架可以稳定地支持腺苷A2B受体结合结构域。腺苷A2B受体结合结构域可以基于腺苷A2B受体配体和腺苷A2B受体的表面相互作用来设计。如本文描述的文库可以进一步多样化，以提供包含各自编码至少一种预定参考核酸序列的预定变体的核酸的变体文库。本文还描述了在核酸文库被翻译时可以产生的蛋白文库。在一些情况下，如本文描述的核酸文库被转移到细胞中以产生细胞文库。本文还提供了使用本文描述的方法合成的文库的下游应用。下游应用包括鉴定具有增强的生物学相关功能(例如，改进的稳定性、亲和力、结合、功能活性)的变体核酸或蛋白序列，以及用于治疗或预防与腺苷A2A受体信号传导、腺苷A2B受体信号传导或者腺苷A2A受体信号传导和腺苷A2B受体信号传导两者相关的疾病状态。
本文描述的用于优化腺苷A2A受体免疫球蛋白或抗体、腺苷A2B受体免疫球蛋白或抗体或者两者的方法、组合物和系统包括反映抗体序列天然多样性的比率变体方法(ratio-variant approach)。在一些情况下，优化的腺苷A2A受体免疫球蛋白或抗体的文库包含变体腺苷A2A受体免疫球蛋白或抗体序列。在一些情况下，变体腺苷A2A受体免疫球蛋白或抗体序列被设计为包含变体CDR区。在一些情况下，包含变体CDR区的变体腺苷A2A受体免疫球蛋白或抗体序列通过混编美洲驼、人源化或嵌合框架中的天然CDR序列产生。在一些情况下，优化的腺苷A2B受体免疫球蛋白或抗体的文库包含变体腺苷A2B受体免疫球蛋白或抗体序列。在一些情况下，变体腺苷A2B受体免疫球蛋白或抗体序列被设计为包含变体CDR区。在一些情况下，包含变体CDR区的变体腺苷A2B受体免疫球蛋白或抗体序列通过混编美洲驼、人源化或嵌合框架中的天然CDR序列产生。在一些情况下，合成这样的文库，克隆到表达载体中，并且评价翻译产物(抗体)的活性。在一些情况下，将序列的片段合成并且随后组装。在一些情况下，使用表达载体展示并且富集期望的抗体，诸如噬菌体展示。在一些情况下，噬菌体载体是Fab噬菌粒载体。在一些情况下，富集期间使用的选择压力包括结合亲和力、毒性、免疫耐受性、稳定性或其他因素。这样的表达载体允许选择(“淘选(pan)”)具有特定特性的抗体，并且这样的序列的随后繁殖或扩增富集具有这些序列的文库。淘选轮可以重复任何次数，诸如1轮、2轮、3轮、4轮、5轮、6轮、7轮或多于7轮。在一些情况下，每轮淘选包括许多次洗涤。在一些情况下，每轮淘选包括至少或约1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次、11次、12次、13次、14次、15次、16次或多于16次洗涤。
本文描述了计算机文库设计的方法和系统。在一些情况下，如本文描述的文库是基于包含多种抗体序列的数据库设计的。在一些情况下，数据库包括针对多种靶的多于一个变体抗体序列。在一些情况下，数据库包括至少100个、500个、1000个、1500个、2000个、2500个、3000个、3500个、4000个、4500个、5000个或多于5000个抗体序列。示例性数据库是iCAN数据库。在一些情况下，数据库包括初始B细胞受体序列和记忆B细胞受体序列。在一些情况下，初始B细胞受体序列和记忆B细胞受体序列是人类、小鼠或灵长类动物序列。在一些情况下，初始B细胞受体序列和记忆B细胞受体序列是人类序列。在一些情况下，对数据库进行位置特异性变异(variation)分析。在一些情况下，本文描述的抗体包含CDR区中的位置特异性变异。在一些情况下，CDR区包含多于一个变异位点。
支架文库
本文提供了包含编码支架的核酸的文库，其中腺苷A2A受体结合结构域的序列被放置在支架中。与未修饰的支架相比，本文描述的支架允许在插入到支架中时改进一系列腺苷A2A受体结合结构域编码序列的稳定性。示例性支架包括但不限于蛋白、肽、免疫球蛋白、其衍生物或其组合。在一些情况下，支架是免疫球蛋白。如本文描述的支架包括改进的功能活性、结构稳定性、表达、特异性或其组合。在一些情况下，支架包含用于支持腺苷A2A受体结合结构域的长区域。
本文提供了包含编码支架的核酸的文库，其中腺苷A2B受体结合结构域的序列被放置在支架中。与未修饰的支架相比，本文描述的支架允许在插入到支架中时改进一系列腺苷A2B受体结合结构域编码序列的稳定性。示例性支架包括但不限于蛋白、肽、免疫球蛋白、其衍生物或其组合。在一些情况下，支架是免疫球蛋白。如本文描述的支架包括改进的功能活性、结构稳定性、表达、特异性或其组合。在一些情况下，支架包含用于支持腺苷A2B受体结合结构域的长区域。
本文提供了包含编码支架的核酸的文库，其中支架是免疫球蛋白。在一些情况下，免疫球蛋白是抗体。如本文使用的，术语抗体将应被理解为包括具有典型抗体分子的特征性双臂Y形的蛋白以及保留与抗原特异性结合能力的抗体的一个或更多个片段。示例性抗体包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、移植抗体、人类抗体、人源化抗体、合成抗体、嵌合抗体、骆驼源化抗体、单链Fv(scFv)(包括其中VL和VH使用重组方法通过合成或天然接头连接的片段，该接头使得它们能够以单个蛋白链产生，其中VL区和VH区配对形成单价分子，包括单链Fab和scFab)、单链抗体、Fab片段(包括包含VL结构域、VH结构域、CL结构域和CH1结构域的单价片段)、F(ab′)2片段(包括包含通过铰链区的二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段)、Fd片段(包括包含VH和CH1片段的片段)、Fv片段(包括包含抗体单臂的VL结构域和VH结构域的片段)、单结构域抗体(dAb或sdAb)(包括包含VH结构域的片段)、分离的互补决定区(CDR)、双特异抗体(包括包含二价二聚体(诸如彼此结合并识别两种不同抗原的两个VL结构域和VH结构域)的片段)、仅包含单个单体可变结构域的片段、二硫键连接的Fv(sdFv)、胞内抗体、抗独特型(抗Id)抗体或其抗原结合片段。在一些情况下，本文公开的文库包含编码支架的核酸，其中支架是Fv抗体，包括由包含完整抗原识别和抗原结合位点的最小抗体片段构成的Fv抗体。在一些实施方案中，Fv抗体由紧密非共价缔合的一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域二聚体组成，并且每个可变结构域的三个高变区相互作用以定义VH-VL二聚体表面上的抗原结合位点。在一些实施方案中，六个高变区赋予抗体抗原结合特异性。在一些实施方案中，单个可变结构域(或仅包含三个抗原特异性高变区的Fv的一半，包括从骆驼科动物中分离的包含一个重链可变结构域或重链可变区的单结构域抗体，诸如VHH抗体或纳米抗体)具有识别和结合抗原的能力。在一些情况下，本文公开的文库包含编码支架的核酸，其中支架是单链Fv或scFv，包括包含VH结构域、VL结构域或者VH结构域和VL结构域两者的抗体片段，其中这两个结构域存在于单个多肽链中。在一些实施方案中，Fv多肽还包含VH结构域与VL结构域之间的多肽接头，允许scFv形成用于抗原结合的期望的结构。在一些情况下，scFv与Fc片段连接，或者VHH与Fc片段连接(包括微型抗体)。在一些情况下，抗体包含免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性片段，例如，包含抗原结合位点的分子。免疫球蛋白分子具有任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如，IgG 1、IgG 2、IgG 3、IgG 4、IgA1和IgA 2)或亚类。
在一些实施方案中，文库包含适合于预期治疗靶的物种的免疫球蛋白。通常，这些方法包括“哺乳动物源化(mammalization)”，并且包括用于将供者抗原结合信息转移至免疫原性较低的哺乳动物抗体接受者以产生有用的治疗性治疗的方法。在一些情况下，哺乳动物是小鼠、大鼠、马科动物、绵羊、牛、灵长类动物(例如，黑猩猩、狒狒、大猩猩、猩猩、猴)、犬、猫、猪、驴、兔和人类。在一些情况下，本文提供了用于抗体的猫源化(felinization)和犬源化(caninization)的文库和方法。
非人类抗体的“人源化”形式可以是包含最少的来源于非人类抗体的序列的嵌合抗体。人源化抗体通常是人类抗体(受者抗体)，其中来自一个或更多个CDR的残基被来自非人类抗体(供者抗体)的一个或更多个CDR的残基替代。供者抗体可以是任何合适的非人类抗体，诸如具有期望的特异性、亲和力或生物学作用的小鼠、大鼠、兔、鸡或非人灵长类动物抗体。在一些情况下，受者抗体的选择的框架区残基被来自供者抗体的对应框架区残基替代。人源化抗体也可以包含不存在于受者抗体或供者抗体中的残基。在一些情况下，进行这些修饰以进一步改进抗体性能。
“犬源化”可以包括用于将非犬科动物抗原结合信息从供者抗体转移至免疫原性较低的犬科动物抗体接受者以产生可用作犬治疗剂的治疗的方法。在一些情况下，本文提供的非犬科动物抗体的犬源化形式是包含最少的来源于非犬科动物抗体的最小序列的嵌合抗体。在一些情况下，犬源化抗体是犬科动物抗体序列(“接受者”或“受者”抗体)，其中受者的高变区残基被来自具有期望的特性的非犬科动物物种(“供者”抗体)，诸如小鼠、大鼠、兔、猫、犬、山羊、鸡、牛科动物、马、美洲驼、骆驼、单峰骆驼、鲨鱼、非人灵长类动物、人类、人源化、重组序列或工程化序列的高变区残基替代。在一些情况下，犬科动物抗体的框架区(FR)残基被对应的非犬科动物FR残基替代。在一些情况下，犬源化抗体包含不存在于受者抗体或供者抗体中的残基。在一些情况下，进行这些修饰以进一步改进抗体性能。犬源化抗体还可以包含犬科动物抗体的免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分。
“猫源化”可以包括用于将非猫科动物抗原结合信息从供者抗体转移至免疫原性较低的猫科动物抗体接受者以产生可用作犬治疗剂的治疗的方法。在一些情况下，本文提供的非猫科动物抗体的猫源化形式是包含最少的来源于非猫科动物抗体的序列的嵌合抗体。在一些情况下，猫源化抗体是猫科动物抗体序列(“接受者”或“受者”抗体)，其中受者的高变区残基被来自具有期望的特性的非猫科动物物种(“供者”抗体)，诸如小鼠、大鼠、兔、猫、犬、山羊、鸡、牛科动物、马、美洲驼、骆驼、单峰骆驼、鲨鱼、非人灵长类动物、人类、人源化、重组序列或工程化序列的高变区残基替代。在一些情况下，猫科动物抗体的框架区(FR)残基被对应的非猫科动物FR残基替代。在一些情况下，猫源化抗体包含不存在于受者抗体或供者抗体中的残基。在一些情况下，进行这些修饰以进一步改进抗体性能。猫源化抗体还可以包含猫科动物抗体的免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分。
本文提供了包含编码支架的核酸的文库，其中支架是非免疫球蛋白。在一些情况下，支架是非免疫球蛋白结合结构域。例如，支架是抗体模拟物。示例性抗体模拟物包括但不限于anticalin、affilin、亲和体分子、affimer、affitin、α抗体、avimer、atrimer、DARPin、fynomer、基于Kunitz结构域的蛋白、单抗体、anticalin、knottin、基于犰狳重复蛋白的蛋白和双环肽。
本文描述的包含编码支架(其中支架是免疫球蛋白)的核酸的文库包含免疫球蛋白的至少一个区域中的变异。抗体的用于变异的示例性区域包括但不限于互补决定区(CDR)、可变结构域或恒定结构域。在一些情况下，CDR是CDR1、CDR2或CDR3。在一些情况下，CDR是重结构域，包括但不限于CDRH1、CDRH2和CDRH3。在一些情况下，CDR是轻结构域，包括但不限于CDRL1、CDRL2和CDRL3。在一些情况下，可变结构域是轻链可变结构域(VL)或重链可变结构域(VH)。在一些情况下，VL结构域包含κ链或λ链。在一些情况下，恒定结构域是轻链恒定结构域(CL)或重链恒定结构域(CH)。
本文描述的方法提供了包含编码支架的核酸的文库的合成，其中每个核酸编码至少一种预定参考核酸序列的预定变体。在一些情况下，预定参考序列是编码蛋白的核酸序列，并且变体文库包含编码至少单个密码子变异的序列，使得由合成的核酸编码的随后蛋白中单个残基的多于一个不同变体通过标准翻译过程产生。在一些情况下，支架文库包含共同编码在多于一个位置处的变异的不同核酸。在一些情况下，变体文库包含编码CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2、CDRL3、VL结构域或VH结构域的至少单个密码子变异的序列。在一些情况下，变体文库包含编码CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2、CDRL3、VL结构域或VH结构域的多于一个密码子变异的序列。在一些情况下，变体文库包含编码框架元件1(Fw1)、框架元件2(Fw2)、框架元件3(Fw3)或框架元件4(FW4)的多于一个密码子变异的序列。用于变异的密码子的示例性数目包括但不限于至少或约1个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、125个、150个、175个、225个、250个、275个、300个或多于300个密码子。
在一些情况下，用于变异的免疫球蛋白的至少一个区域来自重链V-基因家族、重链D-基因家族、重链J-基因家族、轻链V-基因家族或轻链J-基因家族。在一些情况下，轻链V基因家族包括免疫球蛋白κ(IGK)基因或免疫球蛋白λ(IGL)。示例性基因包括但不限于IGHV1-18、IGHV1-69、IGHV1-8、IGHV3-21、IGHV3-23、IGHV3-30/33rn、IGHV3-28、IGHV1-69、IGHV3-74、IGHV4-39、IGHV4-59/61、IGKV1-39、IGKV1-9、IGKV2-28、IGKV3-11、IGKV3-15、IGKV3-20、IGKV4-1、IGLV1-51、IGLV2-14、IGLV1-40和IGLV3-1。在一些情况下，基因是IGHV1-69、IGHV3-30、IGHV3-23、IGHV3、IGHV1-46、IGHV3-7、IGHV1或IGHV1-8。在一些情况下，基因是IGHV1-69和IGHV3-30。在一些情况下，基因是IGHJ3、IGHJ6、IGHJ、IGHJ4、IGHJ5、IGHJ2或IGH1。在一些情况下，基因是IGHJ3、IGHJ6、IGHJ或IGHJ4。
本文提供了包含编码免疫球蛋白支架的核酸的文库，其中文库用各种数目的片段合成。在一些情况下，片段包含CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2、CDRL3、VL或VH结构域。在一些情况下，片段包含框架元件1(Fw1)、框架元件2(Fw2)、框架元件3(Fw3)或框架元件4(FW4)。在一些情况下，支架文库用至少或约2个片段、3个片段、4个片段、5个片段或多于5个片段合成。每个核酸片段的长度或合成的核酸的平均长度可以是至少或约50个、75个、100个、125个、150个、175个、200个、225个、250个、275个、300个、325个、350个、375个、400个、425个、450个、475个、500个、525个、550个、575个、600个或多于600个碱基对。在一些情况下，长度是约50个至600个、75个至575个、100个至550个、125个至525个、150个至500个、175个至475个、200个至450个、225个至425个、250个至400个、275个至375个或300个至350个碱基对。
包含编码如本文描述的免疫球蛋白支架的核酸的文库在翻译时包含多种长度的氨基酸。在一些情况下，每个氨基酸片段的长度或合成的氨基酸的平均长度可以是至少或约15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、105个、110个、115个、120个、125个、130个、135个、140个、145个、150个或多于150个氨基酸。在一些情况下，氨基酸的长度是约15个至150个、20个至145个、25个至140个、30个至135个、35个至130个、40个至125个、45个至120个、50个至115个、55个至110个、60个至110个、65个至105个、70个至100个或75个至95个氨基酸。在一些情况下，氨基酸的长度是约22个氨基酸至约75个氨基酸。在一些情况下，免疫球蛋白支架包含至少或约100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个、1000个、2000个、3000个、4000个、5000个或多于5000个氨基酸。
使用如本文描述的方法从头合成用于变异的免疫球蛋白的至少一个区域的许多变体序列。在一些情况下，从头合成CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2、CDRL3、VL、VH或其组合的许多变体序列。在一些情况下，从头合成框架元件1(Fw1)、框架元件2(Fw2)、框架元件3(Fw3)或框架元件4(FW4)的许多变体序列。变体序列的数目可以是至少或约5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、125个、150个、175个、200个、225个、250个、275个、300个、325个、350个、375个、400个、425个、450个、475个、500个或多于500个序列。在一些情况下，变体序列的数目是至少或约500个、600个、700个、800个、900个、1000个、2000个、3000个、4000个、5000个、6000个、7000个、8000个或多于8000个序列。在一些情况下，变体序列的数目是约10个至500个、25个至475个、50个至450个、75个至425个、100个至400个、125个至375个、150个至350个、175个至325个、200个至300个、225个至375个、250个至350个或275个至325个序列。
在一些情况下，免疫球蛋白的至少一个区域的变体序列在长度或序列方面不同。在一些情况下，从头合成的至少一个区域用于CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2、CDRL3、VL、VH或其组合。在一些情况下，从头合成的至少一个区域用于框架元件1(Fw1)、框架元件2(Fw2)、框架元件3(Fw3)或框架元件4(FW4)。在一些情况下，与野生型相比，变体序列包含至少或约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个或多于50个变体核苷酸或氨基酸。在一些情况下，与野生型相比，变体序列包含至少或约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个或50个额外的核苷酸或氨基酸。在一些情况下，与野生型相比，变体序列少包含至少或约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个或50个核苷酸或氨基酸。在一些情况下，文库包含至少或约101个、102个、103个、104个、105个、106个、107个、108个、109个、1010个或多于1010个变体。
在合成支架文库之后，支架文库可以用于筛选和分析。例如，测定支架文库的文库可展示性并淘选。在一些情况下，使用可选择的标签测定可展示性。示例性标签包括但不限于放射性标签、荧光标签、酶、化学发光标签、比色标签、亲和标签或本领域已知的其他标记或标签。在一些情况下，标签是组氨酸、多组氨酸、myc、血凝素(HA)或FLAG。在一些情况下，支架文库通过使用各种方法测序来测定，包括但不限于单分子实时(SMRT)测序、Polony测序、连接测序、可逆终止子测序、质子检测测序、离子半导体测序、纳米孔测序、电子测序、焦磷酸测序、Maxam-Gilbert测序、链终止(例如，Sanger)测序、+S测序或合成测序。
在一些情况下，测定支架文库的功能活性、结构稳定性(例如，热稳定或pH稳定)、表达、特异性或其组合。在一些情况下，测定支架库中能够折叠的支架。在一些情况下，测定抗体区域的功能活性、结构稳定性、表达、特异性、折叠或其组合。例如，测定VH区或VL区的功能活性、结构稳定性、表达、特异性、折叠或其组合。
腺苷A2A受体文库
本文提供了腺苷A2A受体结合文库，该文库包含编码包含腺苷A2A受体结合结构域序列的支架的核酸。在一些情况下，支架是免疫球蛋白。在一些情况下，包含腺苷A2A受体结合结构域序列的支架通过腺苷A2A受体结合结构域与腺苷A2A受体之间的相互作用确定。
本文提供了包含编码包含腺苷A2A受体结合结构域的支架的核酸的文库，其中腺苷A2A受体结合结构域是基于腺苷A2A受体上的表面相互作用设计的。在一些情况下，腺苷A2A受体结合结构域包含如由SEQ ID NO:1定义的序列。在一些情况下，腺苷A2A受体结合结构域与腺苷A2A受体的氨基末端或羧基末端相互作用。在一些情况下，腺苷A2A受体结合结构域与至少一个跨膜结构域相互作用，所述至少一个跨膜结构域包括但不限于跨膜结构域1(TM1)、跨膜结构域2(TM2)、跨膜结构域3(TM3)、跨膜结构域4(TM4)、跨膜结构域5(TM5)、跨膜结构域6(TM6)和跨膜结构域7(TM7)。在一些情况下，腺苷A2A受体结合结构域与腺苷A2A受体的胞内表面相互作用。例如，腺苷A2A受体结合结构域与至少一个胞内环相互作用，至少一个胞内环包括但不限于胞内环1(ICL1)、胞内环2(ICL2)和胞内环3(ICL3)。在一些情况下，腺苷A2A受体结合结构域与腺苷A2A受体的胞外表面相互作用。例如，腺苷A2A受体结合结构域与腺苷A2A受体的至少一个胞外结构域(ECD)或胞外环(ECL)相互作用。胞外环包括但不限于胞外环1(ECL1)、胞外环2(ECL2)和胞外环3(ECL3)。
本文描述了腺苷A2A受体结合结构域，其中腺苷A2A受体结合结构域是基于腺苷A2A受体配体与腺苷A2A受体之间的表面相互作用设计的。在一些情况下，配体是肽。在一些情况下，配体是腺苷A2A受体激动剂。在一些情况下，配体是腺苷A2A受体拮抗剂。在一些情况下，配体是腺苷A2A受体别构调节剂。在一些情况下，别构调节剂是负别构调节剂。在一些情况下，别构调节剂是正别构调节剂。腺苷A2A受体的示例性配体包括但不限于DU172、PSB36、ZM241385、XAC、咖啡因、T4G、T4E、6DY、6DZ、6DX、6DV、8D1b、茶碱、UK-432097、腺苷、NECA和CGS21680。
基于腺苷A2A受体配体与腺苷A2A受体之间的表面相互作用的腺苷A2A受体结合结构域序列使用多种方法进行分析。例如，进行多物种计算分析。在一些情况下，进行结构分析。在一些情况下，进行序列分析。可以使用本领域已知的数据库进行序列分析。数据库的非限制性实例包括但不限于NCBI BLAST(blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)、UCSC基因组浏览器(genome.ucsc.edu/)、UniProt(www.uniprot.org/)和IUPHAR/BPS Guide toPHARMACOLOGY(guidetopharmacology.org/)。
本文描述了基于多种生物体之间的序列分析设计的腺苷A2A受体结合结构域。例如，进行序列分析以鉴定不同生物体中的同源序列。示例性生物体包括但不限于小鼠、大鼠、马科动物、绵羊、牛、灵长类动物(例如，黑猩猩、狒狒、大猩猩、猩猩、猴)、犬、猫、猪、驴、兔、鱼、蝇和人类。
在鉴定腺苷A2A受体结合结构域之后，可以产生包含编码腺苷A2A受体结合结构域的核酸的文库。在一些情况下，腺苷A2A受体结合结构域的文库包含基于构象配体相互作用、肽配体相互作用、小分子配体相互作用、腺苷A2A受体的胞外结构域或靶向腺苷A2A受体的抗体设计的腺苷A2A受体结合结构域的序列。在一些情况下，腺苷A2A受体结合结构域的文库包含基于肽配体相互作用设计的腺苷A2A受体结合结构域的序列。在一些情况下，配体不是抗体配体。腺苷A2A受体结合结构域的文库可以被翻译以产生蛋白文库。在一些情况下，腺苷A2A受体结合结构域的文库被翻译以产生肽文库、免疫球蛋白文库、其衍生物或其组合。在一些情况下，腺苷A2A受体结合结构域的文库被翻译以产生蛋白文库，该蛋白文库被进一步修饰以产生肽模拟物文库。在一些情况下，腺苷A2A受体结合结构域的文库被翻译以产生蛋白文库，该蛋白文库被用于产生小分子。
本文描述的方法提供了包含各自编码至少一种预定参考核酸序列的预定变体的核酸的腺苷A2A受体结合结构域的文库的合成。在一些情况下，预定参考序列是编码蛋白的核酸序列，并且变体文库包含编码至少单个密码子变异的序列，使得由合成的核酸编码的随后蛋白中单个残基的多于一个不同变体通过标准翻译过程产生。在一些情况下，腺苷A2A受体结合结构域的文库包含共同编码在多于一个位置处的变异的不同核酸。在一些情况下，变体文库包含编码腺苷A2A受体结合结构域中至少单个密码子变异的序列。在一些情况下，变体文库包含编码腺苷A2A受体结合结构域中多于一个密码子变异的序列。用于变异密码子的示例性数目包括但不限于至少或约1个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、125个、150个、175个、225个、250个、275个、300个或多于300个密码子。
本文描述的方法提供了包含编码腺苷A2A受体结合结构域的核酸的文库的合成，其中文库包含编码腺苷A2A受体结合结构域长度变异的序列。在一些情况下，文库包含编码与预定参考序列相比少至少或约1个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、125个、150个、175个、225个、250个、275个、300个或多于300个密码子的长度变异的序列。在一些情况下，文库包含编码与预定参考序列相比多至少或约1个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、125个、150个、175个、200个、225个、250个、275个、300个或多于300个密码子的长度变异的序列。
在鉴定腺苷A2A受体结合结构域之后，腺苷A2A受体结合结构域可以被放置在如本文描述的支架中。在一些情况下，支架是免疫球蛋白。在一些情况下，腺苷A2A受体结合结构域被放置在CDRH3区中。可以被放置在支架中的腺苷A2A受体结合结构域也可以被称为基序。包含腺苷A2A受体结合结构域的支架可以是基于结合、特异性、稳定性、表达、折叠或下游活性设计的。在一些情况下，包含腺苷A2A受体结合结构域的支架能够与腺苷A2A受体接触。在一些情况下，包含腺苷A2A受体结合结构域的支架能够与腺苷A2A受体高亲和力结合。腺苷A2A受体结合结构域的示例性氨基酸序列描述于表1中。
表1.腺苷A2A受体结合域氨基酸序列
本文提供了包含腺苷A2A受体结合结构域的支架或免疫球蛋白，其中腺苷A2A受体结合结构域的序列支持与腺苷A2A受体的相互作用。该序列可以与腺苷A2A受体配体的序列同源或相同。在一些情况下，腺苷A2A受体结合结构域序列包括与SEQ ID NO:1至少或约70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些情况下，腺苷A2A受体结合结构域序列包括与SEQ ID NO:1至少或约95％的同源性。在一些情况下，腺苷A2A受体结合结构域序列包括与SEQ ID NO:1至少或约97％的同源性。在一些情况下，腺苷A2A受体结合结构域序列包括与SEQ ID NO:1至少或约99％的同源性。在一些情况下，腺苷A2A受体结合结构域序列包括与SEQ ID NO:1至少或约100％的同源性。在一些情况下，腺苷A2A受体结合结构域序列包含具有SEQ ID NO:1的至少或约10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、110个、120个、130个、140个、150个、160个、170个、180个、190个、200个、210个、220个、230个、240个、250个、260个、270个、280个、290个、300个、310个、320个、330个、340个、350个、360个、370个、380个、390个、400个或多于400个氨基酸的至少一部分。
本文提供了抗体或免疫球蛋白，其中所述抗体或免疫球蛋白包含与SEQ ID NO:540-717中任一项至少或约70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些情况下，所述抗体或免疫球蛋白序列包括与SEQ ID NO:540-717中任一项至少或约95％的序列同一性。在一些情况下，所述抗体或免疫球蛋白序列包括与SEQ ID NO:540-717中任一项至少或约97％的序列同一性。在一些情况下，所述抗体或免疫球蛋白序列包括与SEQ ID NO:540-717中任一项至少或约99％的序列同一性。在一些情况下，所述抗体或免疫球蛋白序列包括与SEQ ID NO:540-717中任一项至少或约100％的序列同一性。在一些情况下，所述抗体或免疫球蛋白序列包含具有SEQID NO:540-717中任一项的至少或约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、12个、14个、16个、18个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、110个或多于110个氨基酸的至少一部分。
在一些实施方案中，所述抗体或免疫球蛋白序列包含含有如表15-表16中列出的序列的互补决定区(CDR)。在一些实施方案中，所述抗体或免疫球蛋白序列包含含有与SEQID NO:6-539中任一项至少或约70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的互补决定区(CDR)。在一些情况下，所述抗体或免疫球蛋白序列包含含有与SEQ ID NO:6-539中任一项至少或约95％同源性的互补决定区(CDR)。在一些情况下，所述抗体或免疫球蛋白序列包含含有与SEQ ID NO:6-539中任一项至少或约97％同源性的互补决定区(CDR)。在一些情况下，所述抗体或免疫球蛋白序列包含含有与SEQ ID NO:6-539中任一项至少或约99％同源性的互补决定区(CDR)。在一些情况下，所述抗体或免疫球蛋白序列包含含有与SEQ ID NO:6-539中任一项至少或约100％同源性的互补决定区(CDR)。在一些情况下，所述抗体或免疫球蛋白序列包含含有具有SEQ IDNO:6-539中任一项的至少或约3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、12个、14个、16个或多于16个氨基酸的至少一部分的互补决定区(CDR)。
在一些实施方案中，所述抗体或免疫球蛋白序列包含含有与SEQ ID NO:6-94或273-361中任一项至少或约70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的CDR1。在一些情况下，所述抗体或免疫球蛋白序列包含含有SEQ ID NO:6-94或273-361中任一项的至少或约95％同源性的CDR1。在一些情况下，所述抗体或免疫球蛋白序列包含含有与SEQ ID NO:6-94或273-361中任一项至少或约97％同源性的CDR1。在一些情况下，所述抗体或免疫球蛋白序列包含含有与SEQ ID NO:6-94或273-361中任一项至少或约99％同源性的CDR1。在一些情况下，所述抗体或免疫球蛋白序列包含含有与SEQ ID NO:6-270或273-537中任一项至少或约100％同源性的CDR1。在一些情况下，所述抗体或免疫球蛋白序列包含含有具有SEQ ID NO:6-94或273-361中任一项的至少或约3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、12个、14个、16个或多于16个氨基酸的至少一部分的CDR1。
在一些实施方案中，所述抗体或免疫球蛋白序列包含含有与SEQ ID NO:95-183和362-450中任一项至少或约70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的CDR2。在一些情况下，所述抗体或免疫球蛋白序列包含含有与SEQ ID NO:95-183和362-450中任一项至少或约95％同源性的CDR2。在一些情况下，所述抗体或免疫球蛋白序列包含含有与SEQ ID NO:795-183和362-450中任一项至少或约97％同源性的CDR2。在一些情况下，所述抗体或免疫球蛋白序列包含含有与SEQ ID NO:95-183和362-450中任一项至少或约99％同源性的CDR2。在一些情况下，所述抗体或免疫球蛋白序列包含含有与SEQ ID NO:95-183和362-450中任一项至少或约100％同源性的CDR2。在一些情况下，所述抗体或免疫球蛋白序列包含含有具有SEQ ID NO:95-183和362-450中任一项的至少或约3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、12个、14个、16个或多于16个氨基酸的至少一部分的CDR2。
在一些实施方案中，所述抗体或免疫球蛋白序列包含含有与SEQ ID NO:184-272和451-539中任一项至少或约70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的CDR3。在一些情况下，所述抗体或免疫球蛋白序列包含含有与SEQ ID NO:184-272和451-539中任一项至少或约95％同源性的CDR3。在一些情况下，所述抗体或免疫球蛋白序列包含含有与SEQ ID NO:184-272和451-539中任一项至少或约97％同源性的CDR3。在一些情况下，所述抗体或免疫球蛋白序列包含含有与SEQ ID NO:184-272和451-539中任一项至少或约99％同源性的CDR3。在一些情况下，所述抗体或免疫球蛋白序列包含含有与SEQ ID NO:184-272和451-539中任一项至少或约100％同源性的CDR3。在一些情况下，所述抗体或免疫球蛋白序列包含含有具有SEQ ID NO:184-272和451-539中任一项的至少或约3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、12个、14个、16个或多于16个氨基酸的至少一部分的CDR3。
在一些实施方案中，所述抗体或免疫球蛋白序列包含含有与SEQ ID NO:6-94中任一项至少或约70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的CDRH1；含有与SEQ ID NO:95-183中任一项至少或约70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的CDRH2；和含有与SEQ ID NO:184-272中任一项至少或约70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的CDRH3。在一些情况下，所述抗体或免疫球蛋白序列包含含有与SEQ ID NO:6-94中任一项至少或约95％、97％、99％或100％同源性的CDRH1；含有与SEQ ID NO:95-183中任一项至少或约95％、97％、99％或100％同源性的CDRH2；和含有与SEQ ID NO:184-272中任一项至少或约95％、97％、99％或100％同源性的CDRH3。在一些情况下，所述抗体或免疫球蛋白序列包含含有具有SEQ IDNO:6-94的至少或约3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、12个、14个、16个或多于16个氨基酸的至少一部分的CDRH1；含有具有SEQ ID NO:95-183的至少或约3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、12个、14个、16个或多于16个氨基酸的至少一部分的CDRH2；和含有具有SEQ ID NO:184-272的至少或约3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、12个、14个、16个或多于16个氨基酸的至少一部分的CDRH3。
在一些实施方案中，所述抗体或免疫球蛋白序列包含含有与SEQ ID NO:273-361至少或约70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的CDRL1；含有与SEQ ID NO:362-450至少或约70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的CDRL2；和含有与SEQ ID NO:451-539至少或约70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的CDRL3。在一些情况下，所述抗体或免疫球蛋白序列包含含有与SEQ ID NO:273-361至少或约95％、97％、99％或100％同源性的CDRL1；含有与SEQ ID NO:362-450至少或约95％、97％、99％或100％同源性的CDRL2；和含有与SEQ IDNO:451-539至少或约95％、97％、99％或100％同源性的CDRL3。在一些情况下，所述抗体或免疫球蛋白序列包含含有具有SEQ ID NO:273-361的至少或约3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、12个、14个、16个或多于16个氨基酸的至少一部分的CDRL1；含有具有SEQ ID NO:362-450的至少或约3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、12个、14个、16个或多于16个氨基酸的至少一部分的CDRL2；和含有具有SEQ ID NO:451-539的至少或约3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、12个、14个、16个或多于16个氨基酸的至少一部分的CDRL3。
在一些实施方案中，所述抗体或免疫球蛋白序列包含含有与SEQ ID NO:6-94中任一项至少或约70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的CDRH1；含有与SEQ ID NO:95-183中任一项至少或约70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的CDRH2；含有与SEQ ID NO:184-272中任一项至少或约70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的CDRH3；含有与SEQ ID NO:273-362中任一项至少或约70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的CDRL1；含有与SEQ ID NO:362-450中任一项至少或约70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的CDRL2；和含有与SEQ ID NO:451-539中任一项至少或约70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的CDRL3。在一些情况下，所述抗体或免疫球蛋白序列包含含有与SEQ ID NO:6-94中任一项至少或约95％、97％、99％或100％同源性的CDRH1；含有与SEQ ID NO:95-183中任一项至少或约95％、97％、99％或100％同源性的CDRH2；含有与SEQ ID NO:184-272中任一项至少或约95％、97％、99％或100％同源性的CDRH3；含有与SEQ ID NO:273-362中任一项至少或约95％、97％、99％或100％同源性的CDRL1；含有与SEQ ID NO:362-450中任一项至少或约95％、97％、99％或100％同源性的CDRL2；和含有与SEQ ID NO:451-539中任一项至少或约95％、97％、99％或100％同源性的CDRL3。在一些情况下，所述抗体或免疫球蛋白序列包含含有具有SEQ ID NO:6-94中任一项的至少或约3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、12个、14个、16个或多于16个氨基酸的至少一部分的CDRH1；含有具有SEQ ID NO:95-183中任一项的至少或约3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、12个、14个、16个或多于16个氨基酸的至少一部分的CDRH2；含有具有SEQ ID NO:184-272中任一项的至少或约3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、12个、14个、16个或多于16个氨基酸的至少一部分的CDRH3；含有具有SEQ IDNO:273-362中任一项的至少或约3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、12个、14个、16个或多于16个氨基酸的至少一部分的CDRL1；含有具有SEQ ID NO:362-450中任一项的至少或约3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、12个、14个、16个或多于16个氨基酸的至少一部分的CDRL2；和含有具有SEQ ID NO:451-539中任一项的至少或约3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、12个、14个、16个或多于16个氨基酸的至少一部分的CDRL3。
在一些实施方案中，本文描述了与腺苷A2A受体结合的抗体或免疫球蛋白。在一些情况下，腺苷A2A受体抗体或免疫球蛋白序列包含含有与SEQ ID NO:540-628中任一项至少或约70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域。在一些情况下，腺苷A2A受体抗体或免疫球蛋白序列包含含有与SEQ ID NO:540-628中任一项至少或约95％序列同一性的重链可变结构域。在一些情况下，腺苷A2A受体抗体或免疫球蛋白序列包含含有与SEQ ID NO:540-628中任一项至少或约97％序列同一性的重链可变结构域。在一些情况下，腺苷A2A受体抗体或免疫球蛋白序列包含含有与SEQ ID NO:540-628中任一项至少或约99％序列同一性的重链可变结构域。在一些情况下，腺苷A2A受体抗体或免疫球蛋白序列包含含有与SEQ ID NO:540-628中任一项至少或约100％序列同一性的重链可变结构域。在一些情况下，腺苷A2A受体抗体或免疫球蛋白序列包含含有具有SEQ ID NO:540-628的至少或约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、12个、14个、16个、18个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、110个或多于110个氨基酸的至少一部分的重链可变结构域。
在一些情况下，腺苷A2A受体抗体或免疫球蛋白序列包含含有与SEQ ID NO:629-717中任一项至少或约70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域。在一些情况下，腺苷A2A受体抗体或免疫球蛋白序列包含含有与SEQ ID NO:629-717中任一项至少或约95％序列同一性的轻链可变结构域。在一些情况下，腺苷A2A受体抗体或免疫球蛋白序列包含含有与SEQ ID NO:629-717中任一项至少或约97％序列同一性的轻链可变结构域。在一些情况下，腺苷A2A受体抗体或免疫球蛋白序列包含含有与SEQ ID NO:629-717中任一项至少或约99％序列同一性的轻链可变结构域。在一些情况下，腺苷A2A受体抗体或免疫球蛋白序列包含含有与SEQ IDNO:629-717中任一项至少或约100％序列同一性的轻链可变结构域。在一些情况下，腺苷A2A受体抗体或免疫球蛋白序列包含含有具有SEQ ID NO:629-717的至少或约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、12个、14个、16个、18个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、110个、120个、130个、140个、150个、160个、170个、180个、190个、200个、210个、220个、230个、240个、250个、260个、270个、280个、290个、300个、310个、320个、330个、340个、350个、360个、370个、380个、390个、400个或多于400个氨基酸的至少一部分的轻链可变结构域。
在一些实施方案中，免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:540中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且免疫球蛋白轻链包含与SEQ ID NO:629中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链包含与SEQ IDNO:541中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且免疫球蛋白轻链包含与SEQ ID NO:630中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:542中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且免疫球蛋白轻链包含与SEQ ID NO:631中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:543中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且免疫球蛋白轻链包含与SEQ ID NO:632中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:544中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且免疫球蛋白轻链包含与SEQID NO:633中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:545中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且免疫球蛋白轻链包含与SEQ ID NO:634中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:546中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且免疫球蛋白轻链包含与SEQ ID NO:635中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:547中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且免疫球蛋白轻链包含与SEQ IDNO:636中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:548中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且免疫球蛋白轻链包含与SEQ ID NO:637中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:549中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且免疫球蛋白轻链包含与SEQ ID NO:638中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:550中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且免疫球蛋白轻链包含与SEQ IDNO:639中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:551中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且免疫球蛋白轻链包含与SEQ ID NO:640中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:552中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且免疫球蛋白轻链包含与SEQ ID NO:641中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:553中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且免疫球蛋白轻链包含与SEQ IDNO:642中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:554中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且免疫球蛋白轻链包含与SEQ ID NO:643中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:555中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且免疫球蛋白轻链包含与SEQ ID NO:644中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:556中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且免疫球蛋白轻链包含与SEQ IDNO:645中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:557中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且免疫球蛋白轻链包含与SEQ ID NO:646中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:558中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且免疫球蛋白轻链包含与SEQ ID NO:647中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:559中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且免疫球蛋白轻链包含与SEQ IDNO:648中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:560中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且免疫球蛋白轻链包含与SEQ ID NO:649中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:561中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且免疫球蛋白轻链包含与SEQ ID NO:650中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:562中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且免疫球蛋白轻链包含与SEQ IDNO:651中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:563中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且免疫球蛋白轻链包含与SEQ ID NO:652中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:564中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且免疫球蛋白轻链包含与SEQ ID NO:653中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:565中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且免疫球蛋白轻链包含与SEQ IDNO:654中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:566中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且免疫球蛋白轻链包含与SEQ ID NO:655中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:567中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且免疫球蛋白轻链包含与SEQ ID NO:656中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:568中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且免疫球蛋白轻链包含与SEQ IDNO:657中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:569中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且免疫球蛋白轻链包含与SEQ ID NO:658中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:570中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且免疫球蛋白轻链包含与SEQ ID NO:659中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:571中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且免疫球蛋白轻链包含与SEQ IDNO:660中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:572中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且免疫球蛋白轻链包含与SEQ ID NO:661中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:573中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且免疫球蛋白轻链包含与SEQ ID NO:662中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:574中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且免疫球蛋白轻链包含与SEQ IDNO:663中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:575中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且免疫球蛋白轻链包含与SEQ ID NO:664中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:576中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且免疫球蛋白轻链包含与SEQ ID NO:665中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:577中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且免疫球蛋白轻链包含与SEQ IDNO:666中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:578中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且免疫球蛋白轻链包含与SEQ ID NO:667中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:579中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且免疫球蛋白轻链包含与SEQ ID NO:668中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:580中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且免疫球蛋白轻链包含与SEQ IDNO:669中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:581中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且免疫球蛋白轻链包含与SEQ ID NO:670中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:582中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且免疫球蛋白轻链包含与SEQ ID NO:671中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:583中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且免疫球蛋白轻链包含与SEQ IDNO:672中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:584中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且免疫球蛋白轻链包含与SEQ ID NO:673中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:585中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且免疫球蛋白轻链包含与SEQ ID NO:674中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:586中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且免疫球蛋白轻链包含与SEQ IDNO:675中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:587中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且免疫球蛋白轻链包含与SEQ ID NO:676中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:588中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且免疫球蛋白轻链包含与SEQ ID NO:677中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:589中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且免疫球蛋白轻链包含与SEQ IDNO:678中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:590中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且免疫球蛋白轻链包含与SEQ ID NO:679中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:591中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且免疫球蛋白轻链包含与SEQ ID NO:680中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:592中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且免疫球蛋白轻链包含与SEQ IDNO:681中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:593中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且免疫球蛋白轻链包含与SEQ ID NO:682中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:594中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且免疫球蛋白轻链包含与SEQ ID NO:683中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:595中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且免疫球蛋白轻链包含与SEQ IDNO:684中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:596中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且免疫球蛋白轻链包含与SEQ ID NO:685中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:597中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且免疫球蛋白轻链包含与SEQ ID NO:686中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:598中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且免疫球蛋白轻链包含与SEQ IDNO:687中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:599中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且免疫球蛋白轻链包含与SEQ ID NO:688中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:600中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且免疫球蛋白轻链包含与SEQ ID NO:689中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:601中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且免疫球蛋白轻链包含与SEQ IDNO:690中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:602中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且免疫球蛋白轻链包含与SEQ ID NO:691中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:603中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且免疫球蛋白轻链包含与SEQ ID NO:692中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:604中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且免疫球蛋白轻链包含与SEQ IDNO:693中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:605中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且免疫球蛋白轻链包含与SEQ ID NO:694中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:606中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且免疫球蛋白轻链包含与SEQ ID NO:695中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:607中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且免疫球蛋白轻链包含与SEQ IDNO:696中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:608中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且免疫球蛋白轻链包含与SEQ ID NO:697中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:609中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且免疫球蛋白轻链包含与SEQ ID NO:698中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:610中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且免疫球蛋白轻链包含与SEQ IDNO:699中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:611中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且免疫球蛋白轻链包含与SEQ ID NO:700中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:612中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且免疫球蛋白轻链包含与SEQ ID NO:701中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:613中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且免疫球蛋白轻链包含与SEQ IDNO:702中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:614中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且免疫球蛋白轻链包含与SEQ ID NO:703中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:615中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且免疫球蛋白轻链包含与SEQ ID NO:704中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:616中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且免疫球蛋白轻链包含与SEQ IDNO:705中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:617中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且免疫球蛋白轻链包含与SEQ ID NO:706中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:618中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且免疫球蛋白轻链包含与SEQ ID NO:707中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:619中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且免疫球蛋白轻链包含与SEQ IDNO:708中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:620中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且免疫球蛋白轻链包含与SEQ ID NO:709中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:621中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且免疫球蛋白轻链包含与SEQ ID NO:710中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:622中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且免疫球蛋白轻链包含与SEQ IDNO:711中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:623中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且免疫球蛋白轻链包含与SEQ ID NO:712中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:624中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且免疫球蛋白轻链包含与SEQ ID NO:713中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:625中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且免疫球蛋白轻链包含与SEQ IDNO:714中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:626中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且免疫球蛋白轻链包含与SEQ ID NO:715中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:627中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且免疫球蛋白轻链包含与SEQ ID NO:716中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:628中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列；并且免疫球蛋白轻链包含与SEQ IDNO:717中列出的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。
本文提供了腺苷A2A受体结合文库，该文库包含编码包含腺苷A2A受体结合结构域的支架或免疫球蛋白的核酸，该腺苷A2A受体结合结构域包含结构域类型、结构域长度的变异或残基变异。在一些情况下，该结构域是支架中包含腺苷A2A受体结合结构域的区域。例如，该区域是VH、CDRH3或VL结构域。在一些情况下，该结构域是腺苷A2A受体结合结构域。
本文描述的方法提供了各自编码至少一种预定参考核酸序列的预定变体的核酸的腺苷A2A受体结合文库的合成。在一些情况下，预定参考序列是编码蛋白的核酸序列，并且变体文库包含编码至少单个密码子变异的序列，使得由合成的核酸编码的随后蛋白中单个残基的多于一个不同变体通过标准翻译过程产生。在一些情况下，腺苷A2A受体结合文库包含共同编码在多于一个位置处的变异的不同核酸。在一些情况下，变体文库包含编码VH、CDRH3或VL结构域的至少单个密码子变异的序列。在一些情况下，变体文库包含编码腺苷A2A受体结合结构域中至少单个密码子变异的序列。例如，如表1中列出的腺苷A2A受体结合结构域的至少一个单个密码子是不同的。在一些情况下，变体文库包含编码VH、CDRH3或VL结构域的多于一个密码子变异的序列。在一些情况下，变体文库包含编码腺苷A2A受体结合结构域中多于一个密码子变异的序列。用于变异密码子的示例性数目包括但不限于至少或约1个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、125个、150个、175个、225个、250个、275个、300个或多于300个密码子。
本文描述的方法提供了各自编码至少一种预定参考核酸序列的预定变体的核酸的腺苷A2A受体结合文库的合成，其中腺苷A2A受体结合文库包含编码结构域长度变异的序列。在一些情况下，该结构域是VH、CDRH3或VL结构域。在一些情况下，该结构域是腺苷A2A受体结合结构域。在一些情况下，文库包含编码与预定参考序列相比少至少或约1个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、125个、150个、175个、225个、250个、275个、300个或多于300个密码子的长度变异的序列。在一些情况下，文库包含编码与预定参考序列相比多至少或约1个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、125个、150个、175个、200个、225个、250个、275个、300个或多于300个密码子的长度变异的序列。
本文提供了包含编码包含腺苷A2A受体结合结构域的支架的核酸的腺苷A2A受体结合文库，其中腺苷A2A受体结合文库用多种数目的片段合成。在一些情况下，该片段包含VH、CDRH3或VL结构域。在一些情况下，腺苷A2A受体结合文库用至少或约2个片段、3个片段、4个片段、5个片段或多于5个片段合成。每个核酸片段的长度或合成的核酸的平均长度可以是至少或约50个、75个、100个、125个、150个、175个、200个、225个、250个、275个、300个、325个、350个、375个、400个、425个、450个、475个、500个、525个、550个、575个、600个或多于600个碱基对。在一些情况下，长度是约50个至600个、75个至575个、100个至550个、125个至525个、150个至500个、175个至475个、200个至450个、225个至425个、250个至400个、275个至375个或300个至350个碱基对。
包含编码包含如本文描述的腺苷A2A受体结合结构域的支架的核酸的腺苷A2A受体结合文库在翻译时包含多种长度的氨基酸。在一些情况下，每个氨基酸片段的长度或合成的氨基酸的平均长度可以是至少或约15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、105个、110个、115个、120个、125个、130个、135个、140个、145个、150个或多于150个氨基酸。在一些情况下，氨基酸的长度是约15个至150个、20个至145个、25个至140个、30个至135个、35个至130个、40个至125个、45个至120个、50个至115个、55个至110个、60个至110个、65个至105个、70个至100个或75个至95个氨基酸。在一些情况下，氨基酸的长度是约22个至约75个氨基酸。
包含编码包含腺苷A2A受体结合结构域的支架的从头合成的变体序列的腺苷A2A受体结合文库包含许多变体序列。在一些情况下，从头合成用于CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2、CDRL3、VL、VH或其组合的许多变体序列。在一些情况下，从头合成用于框架元件1(Fw1)、框架元件2(Fw2)、框架元件3(Fw3)或框架元件4(FW4)的许多变体序列。在一些情况下，从头合成腺苷A2A受体结合结构域的许多变体序列。例如，变体序列的数目对于VH结构域是约1个至约10个序列，对于腺苷A2A受体结合结构域是约108个序列，并且对于VK结构域是约1个至约44个序列。变体序列的数目可以是至少或约5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、125个、150个、175个、200个、225个、250个、275个、300个、325个、350个、375个、400个、425个、450个、475个、500个或多于500个序列。在一些情况下，变体序列的数目是约10个至300个、25个至275个、50个至250个、75个至225个、100个至200个或125个至150个序列。
包含编码包含腺苷A2A受体结合结构域的支架的从头合成的变体序列的腺苷A2A受体结合文库包括改进的多样性。例如，变体通过将腺苷A2A受体结合结构域变体放置在包含N末端CDRH3变异和C末端CDRH3变异的免疫球蛋白支架变体中来产生。在一些情况下，变体包括亲和力成熟变体。可选地或组合地，变体包括免疫球蛋白的其他区域(包括但不限于CDRH1、CDRH2、CDRL1、CDRL2和CDRL3)中的变体。在一些情况下，腺苷A2A受体结合文库的变体的数目为至少或约104个、105个、106个、107个、108个、109个、1010个、1011个、1012个、1013个、1014个、1015个、1016个、1017个、1018个、1019个、1020个或多于1020个不相同的序列。例如，包含VH区的约10个变体序列、CDRH3区的约237个变体序列以及VL区和CDRL3区的约43个变体序列的文库包含105个不相同的序列(10×237×43)。
本文提供了包含编码包含抗体的至少一个区域的变异的腺苷A2A受体抗体的核酸的文库，其中所述区域是CDR区。在一些情况下，腺苷A2A受体抗体是包含一个重链可变结构域的单结构域抗体，诸如VHH抗体。在一些情况下，VHH抗体包含一个或更多个CDR区的变异。在一些情况下，本文描述的文库包含CDR1、CDR2或CDR3的至少或约1个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个、1000个、1200个、1400个、1600个、1800个、2000个、2400个、2600个、2800个、3000个或多于3000个序列。在一些情况下，本文描述的文库包含CDR1、CDR2或CDR3的至少或约104个、105个、106个、107个、108个、109个、1010个、1011个、1012个、1013个、1014个、1015个、1016个、1017个、1018个、1019个、1020个或多于1020个序列。例如，文库包含至少2000个CDR1序列、至少1200个CDR2序列和至少1600个CDR3序列。在一些情况下，每个序列都是不相同的。
在一些情况下，CDR1、CDR2或CDR3属于轻链可变结构域(VL)。轻链可变结构域(VL)的CDR1、CDR2或CDR3可以分别称为CDRL1、CDRL2或CDRL3。在一些情况下，本文描述的文库包含VL的CDR1、CDR2或CDR3的至少或约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个、1000个、1200个、1400个、1600个、1800个、2000个、2400个、2600个、2800个、3000个或多于3000个序列。在一些情况下，本文描述的文库包含VL的CDR1、CDR2或CDR3的至少或约104个、105个、106个、107个、108个、109个、1010个、1011个、1012个、1013个、1014个、1015个、1016个、1017个、1018个、1019个、1020个或多于1020个序列。例如，文库包含VL的CDR1的至少20个序列、VL的CDR2的至少4个序列和VL的CDR3的至少140个序列。在一些情况下，文库包含VL的CDR1的至少2个序列、VL的CDR2的至少1个序列和VL的CDR3的至少3000个序列。在一些情况下，VL是IGKV1-39、IGKV1-9、IGKV2-28、IGKV3-11、IGKV3-15、IGKV3-20、IGKV4-1、IGLV1-51、IGLV2-14、IGLV1-40或IGLV3-1。在一些情况下，VL是IGKV2-28。在一些情况下，VL是IGLV1-51。
在一些情况下，CDR1、CDR2或CDR3属于重链可变结构域(VH)。重链可变结构域(VH)的CDR1、CDR2或CDR3可以分别称为CDRH1、CDRH2或CDRH3。在一些情况下，本文描述的文库包含VH的CDR1、CDR2或CDR3的至少或约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个、1000个、1200个、1400个、1600个、1800个、2000个、2400个、2600个、2800个、3000个或多于3000个序列。在一些情况下，本文描述的文库包含VH的CDR1、CDR2或CDR3的至少或约104个、105个、106个、107个、108个、109个、1010个、1011个、1012个、1013个、1014个、1015个、1016个、1017个、1018个、1019个、1020个或多于1020个序列。例如，文库包含VH的CDR1的至少30个序列、VH的CDR2的至少570个序列和VH的CDR3的至少108个序列。在一些情况下，文库包含VH的CDR1的至少30个序列、VH的CDR2的至少860个序列和VH的CDR3的至少107个序列。在一些情况下，VH是IGHV1-18、IGHV1-69、IGHV1-8、IGHV3-21、IGHV3-23、IGHV3-30/33rn、IGHV3-28、IGHV3-74、IGHV4-39或IGHV4-59/61。在一些情况下，VH是IGHV1-69、IGHV3-30、IGHV3-23、IGHV3、IGHV1-46、IGHV3-7、IGHV1或IGHV1-8。在一些情况下，VH是IGHV1-69和IGHV3-30。在一些情况下，VH是IGHV3-23。
在一些实施方案中，如本文描述的文库包含不同长度的CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1、CDRH2或CDRH3。在一些情况下，CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1、CDRH2或CDRH3的长度包含至少或约5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个或多于90个氨基酸的长度。例如，CDRH3包含至少或约12个、15个、16个、17个、20个、21个或23个长度的氨基酸。在一些情况下，CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1、CDRH2或CDRH3包含约1个至约10个、约5个至约15个、约10个至约20个或约15个至约30个长度的氨基酸的范围。
包含编码具有如本文描述变体CDR序列的抗体的核酸的文库在翻译时包含多种长度的氨基酸。在一些情况下，每个氨基酸片段的长度或合成的氨基酸的平均长度可以是至少或约15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、105个、110个、115个、120个、125个、130个、135个、140个、145个、150个或多于150个氨基酸。在一些情况下，氨基酸的长度是约15个至150个、20个至145个、25个至140个、30个至135个、35个至130个、40个至125个、45个至120个、50个至115个、55个至110个、60个至110个、65个至105个、70个至100个或75个至95个氨基酸。在一些情况下，氨基酸的长度是约22个氨基酸至约75个氨基酸。在一些情况下，抗体包含至少或约100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个、1000个、2000个、3000个、4000个、5000个或多于5000个氨基酸。
CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1、CDRH2或CDRH3的长度比率在本文描述的文库中可以变化。在一些情况下，包含至少或约5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个或多于90个氨基酸长度的CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1、CDRH2或CDRH3包括文库的约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或多于90％。例如，包含约23个氨基酸长度的CDRH3以40％存在于文库中，包含约21个氨基酸长度的CDRH3以30％存在于文库中，包含约17个氨基酸长度的CDRH3以20％存在于文库中，并且包含约12个氨基酸长度的CDRH3以10％存在于文库中。在一些情况下，包含约20个氨基酸长度的CDRH3以40％存在于文库中，包含约16个氨基酸长度的CDRH3以30％存在于文库中，包含约15个氨基酸长度的CDRH3以20％存在于文库中，并且包含约12个氨基酸长度的CDRH3以10％存在于文库中。
如本文描述的编码VHH抗体的文库包含变体CDR序列，该变体CDR序列被混编以产生具有至少或约107个、108个、109个、1010个、1011个、1012个、1013个、1014个、1015个、1016个、1017个、1018个、1019个、1020个或多于1020个序列的理论多样性的文库。在一些情况下，文库具有至少或约107个、108个、109个、1010个、1011个、1012个、1013个、1014个、1015个、1016个、1017个、1018个、1019个、1020个或多于1020个序列的最终文库多样性。
本文提供了编码免疫球蛋白的腺苷A2A受体结合文库。在一些情况下，腺苷A2A受体免疫球蛋白是抗体。在一些情况下，腺苷A2A受体免疫球蛋白是VHH抗体。在一些情况下，腺苷A2A受体免疫球蛋白包括小于1nM、小于1.2nM、小于2nM、小于5nM、小于10nM、小于11nm、小于13.5nM、小于15nM、小于20nM、小于25nM或小于30nM的与腺苷A2A受体的结合亲和力(例如，KD)。在一些情况下，腺苷A2A受体免疫球蛋白包括小于1nM的KD。在一些情况下，腺苷A2A受体免疫球蛋白包括小于1.2nM的KD。在一些情况下，腺苷A2A受体免疫球蛋白包括小于2nM的KD。在一些情况下，腺苷A2A受体免疫球蛋白包括小于5nM的KD。在一些情况下，腺苷A2A受体免疫球蛋白包括小于10nM的KD。在一些情况下，腺苷A2A受体免疫球蛋白包括小于13.5nM的KD。在一些情况下，腺苷A2A受体免疫球蛋白包括小于15nM的KD。在一些情况下，腺苷A2A受体免疫球蛋白包括小于20nM的KD。在一些情况下，腺苷A2A受体免疫球蛋白包括小于25nM的KD。在一些情况下，腺苷A2A受体免疫球蛋白包括小于30nM的KD。
在一些情况下，腺苷A2A受体免疫球蛋白是腺苷A2A受体激动剂。在一些情况下，腺苷A2A受体免疫球蛋白是腺苷A2A受体拮抗剂。在一些情况下，腺苷A2A受体免疫球蛋白是腺苷A2A受体别构调节剂。在一些情况下，别构调节剂是负别构调节剂。在一些情况下，别构调节剂是正别构调节剂。在一些情况下，腺苷A2A受体免疫球蛋白以至少或约1nM、2nM、4nM、6nM、8nM、10nM、20nM、30nM、40nM、50nM、60nM、70nM、80nM、90nM、100nM、120nM、140nM、160nM、180nM、200nM、300nM、400nM、500nM、600nM、700nM、800nM、900nM、1000nM或多于1000nM的浓度产生激动、拮抗或别构效应。在一些情况下，腺苷A2A受体免疫球蛋白是负别构调节剂。在一些情况下，腺苷A2A受体免疫球蛋白以至少或约0.001nM、0.005nM、0.01nM、0.05nM、0.1nM、0.5nM、1nM、2nM、4nM、6nM、8nM、10nM、20nM、30nM、40nM、50nM、60nM、70nM、80nM、90nM、100nM或多于100nM的浓度是负别构调节剂。在一些情况下，腺苷A2A受体免疫球蛋白以在约0.001nM至约100nM、0.01nM至约90nM、约0.1nM至约80nM、1nM至约50nM、约10nM至约40nM或约1nM至约10nM的范围内的浓度是负别构调节剂。在一些情况下，腺苷A2A受体免疫球蛋白包括至少或约0.001nM、0.0025nM、0.005nM、0.01nM、0.025nM、0.05nM、0.06nM、0.07nM、0.08nM、0.9nM、0.1nM、0.5nM、1nM、2nM、3nM、4nM、5nM、6nM或多于6nM的EC50或IC50。在一些情况下，腺苷A2A受体免疫球蛋白包括至少或约1nM、2nM、4nM、6nM、8nM、10nM、20nM、30nM、40nM、50nM、60nM、70nM、80nM、90nM、100nM或多于100nM的EC50或IC50。
如本文描述的腺苷A2A受体免疫球蛋白可以包括改进的特性。在一些情况下，腺苷A2A受体免疫球蛋白是单体的。在一些情况下，腺苷A2A受体免疫球蛋白不易于聚集。在一些情况下，腺苷A2A受体免疫球蛋白的至少或约70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％是单体的。在一些情况下，腺苷A2A受体免疫球蛋白是热稳定的。在一些情况下，腺苷A2A受体免疫球蛋白导致非特异性结合减少。
在合成包含编码包含腺苷A2A受体结合结构域的支架的核酸的腺苷A2A受体结合文库之后，文库可以用于筛选和分析。例如，测定文库的文库可展示性并淘选。在一些情况下，使用可选择的标签测定可展示性。示例性标签包括但不限于放射性标签、荧光标签、酶、化学发光标签、比色标签、亲和标签或本领域已知的其他标记或标签。在一些情况下，标签是组氨酸、多组氨酸、myc、血凝素(HA)或FLAG。腺苷A2A受体结合文库可以包含编码包含具有多于一个标签(诸如GFP、FLAG和Lucy以及DNA条形码)的腺苷A2A受体结合结构域的支架的核酸。在一些情况下，文库通过使用各种方法测序来测定，包括但不限于单分子实时(SMRT)测序、Polony测序、连接测序、可逆终止子测序、质子检测测序、离子半导体测序、纳米孔测序、电子测序、焦磷酸测序、Maxam-Gilbert测序、链终止(例如，Sanger)测序、+S测序或合成测序。
腺苷A2B受体文库
本文提供了腺苷A2B受体结合文库，该文库包含编码包含腺苷A2B受体结合结构域序列的支架的核酸。在一些情况下，支架是免疫球蛋白。在一些情况下，包含腺苷A2B受体结合结构域序列的支架通过腺苷A2B受体结合结构域与腺苷A2B受体之间的相互作用确定。
本文提供了包含编码包含腺苷A2B受体结合结构域的支架的核酸的文库，其中腺苷A2B受体结合结构域是基于腺苷A2B受体上的表面相互作用设计的。在一些情况下，腺苷A2B受体结合结构域与腺苷A2B受体的氨基末端或羧基末端相互作用。在一些情况下，腺苷A2B受体结合结构域与至少一个跨膜结构域相互作用，所述至少一个跨膜结构域包括但不限于跨膜结构域1(TM1)、跨膜结构域2(TM2)、跨膜结构域3(TM3)、跨膜结构域4(TM4)、跨膜结构域5(TM5)、跨膜结构域6(TM6)和跨膜结构域7(TM7)。在一些情况下，腺苷A2B受体结合结构域与腺苷A2B受体的胞内表面相互作用。例如，腺苷A2B受体结合结构域与至少一个胞内环相互作用，至少一个胞内环包括但不限于胞内环1(ICL1)、胞内环2(ICL2)和胞内环3(ICL3)。在一些情况下，腺苷A2B受体结合结构域与腺苷A2B受体的胞外表面相互作用。例如，腺苷A2B受体结合结构域与腺苷A2B受体的至少一个胞外结构域(ECD)或胞外环(ECL)相互作用。胞外环包括但不限于胞外环1(ECL1)、胞外环2(ECL2)和胞外环3(ECL3)。
本文描述了腺苷A2B受体结合结构域，其中腺苷A2B受体结合结构域是基于腺苷A2B受体配体与腺苷A2B受体之间的表面相互作用设计的。在一些情况下，配体是肽。在一些情况下，配体是腺苷A2B受体激动剂。在一些情况下，配体是腺苷A2B受体拮抗剂。在一些情况下，配体是腺苷A2B受体别构调节剂。在一些情况下，别构调节剂是负别构调节剂。在一些情况下，别构调节剂是正别构调节剂。腺苷A2B受体的示例性配体包括但不限于DU172、PSB36、ZM241385、XAC、咖啡因、T4G、T4E、6DY、6DZ、6DX、6DV、8D1b、茶碱、UK-432097、腺苷、NECA和CGS21680。
基于腺苷A2B受体配体与腺苷A2B受体之间的表面相互作用的腺苷A2B受体结合结构域的序列使用多种方法进行分析。例如，进行多物种计算分析。在一些情况下，进行结构分析。在一些情况下，进行序列分析。可以使用本领域已知的数据库进行序列分析。数据库的非限制性实例包括但不限于NCBI BLAST(blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)、UCSC基因组浏览器(genome.ucsc.edu/)、UniProt(www.uniprot.org/)和IUPHAR/BPS Guide toPHARMACOLOGY(guidetopharmacology.org/)。
本文描述了基于多种生物体之间的序列分析设计的腺苷A2B受体结合结构域。例如，进行序列分析以鉴定不同生物体中的同源序列。示例性生物体包括但不限于小鼠、大鼠、马科动物、绵羊、牛、灵长类动物(例如，黑猩猩、狒狒、大猩猩、猩猩、猴)、犬、猫、猪、驴、兔、鱼、蝇和人类。
在鉴定腺苷A2B受体结合结构域之后，可以产生包含编码腺苷A2B受体结合结构域的核酸的文库。在一些情况下，腺苷A2B受体结合结构域的文库包含基于构象配体相互作用、肽配体相互作用、小分子配体相互作用、腺苷A2B受体的胞外结构域或靶向腺苷A2B受体的抗体设计的腺苷A2B受体结合结构域的序列。在一些情况下，腺苷A2B受体结合结构域的文库包含基于肽配体相互作用设计的腺苷A2B受体结合结构域的序列。在一些情况下，配体不是抗体配体。腺苷A2B受体结合结构域的文库可以被翻译以产生蛋白文库。在一些情况下，腺苷A2B受体结合结构域的文库被翻译以产生肽文库、免疫球蛋白文库、其衍生物或其组合。在一些情况下，腺苷A2B受体结合结构域的文库被翻译以产生蛋白文库，该蛋白文库被进一步修饰以产生肽模拟物文库。在一些情况下，腺苷A2B受体结合结构域的文库被翻译以产生蛋白文库，该蛋白文库被用于产生小分子。
本文描述的方法提供了包含各自编码至少一种预定参考核酸序列的预定变体的核酸的腺苷A2B受体结合结构域的文库的合成。在一些情况下，预定参考序列是编码蛋白的核酸序列，并且变体文库包含编码至少单个密码子变异的序列，使得由合成的核酸编码的随后蛋白中单个残基的多于一个不同变体通过标准翻译过程产生。在一些情况下，腺苷A2B受体结合结构域的文库包含在多于一个位置处总共编码变异的不同核酸。在一些情况下，变体文库包含编码腺苷A2B受体结合结构域中至少单个密码子变异的序列。在一些情况下，变体文库包含编码腺苷A2B受体结合结构域中多于一个密码子变异的序列。用于变异密码子的示例性数目包括但不限于至少或约1个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、125个、150个、175个、225个、250个、275个、300个或多于300个密码子。
本文描述的方法提供了包含编码腺苷A2B受体结合结构域的核酸的文库的合成，其中文库包含编码腺苷A2B受体结合结构域长度变异的序列。在一些情况下，文库包含编码与预定参考序列相比少至少或约1个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、125个、150个、175个、225个、250个、275个、300个或多于300个密码子的长度变异的序列。在一些情况下，文库包含编码与预定参考序列相比多至少或约1个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、125个、150个、175个、200个、225个、250个、275个、300个或多于300个密码子的长度变异的序列。
在鉴定腺苷A2B受体结合结构域之后，腺苷A2B受体结合结构域可以被放置在如本文描述的支架中。在一些情况下，支架是免疫球蛋白。在一些情况下，腺苷A2B受体结合结构域被放置在CDRH3区中。可以被放置在支架中的腺苷A2B受体结合结构域也可以被称为基序。包含腺苷A2B受体结合结构域的支架可以是基于结合、特异性、稳定性、表达、折叠或下游活性设计的。在一些情况下，包含腺苷A2B受体结合结构域的支架能够与腺苷A2B受体接触。在一些情况下，包含腺苷A2B受体结合结构域的支架能够与腺苷A2B受体高亲和力结合。
在一些实施方案中，本文描述了与腺苷A2B受体结合的抗体或免疫球蛋白。
本文提供了腺苷A2B受体结合文库，该文库包含编码包含腺苷A2B受体结合结构域的支架或免疫球蛋白的核酸，该腺苷A2B受体结合结构域包含结构域类型、结构域长度的变异或残基变异。在一些情况下，该结构域是支架中包含腺苷A2B受体结合结构域的区域。例如，该区域是VH、CDRH3或VL结构域。在一些情况下，该结构域是腺苷A2B受体结合结构域。
本文描述的方法提供了各自编码至少一种预定参考核酸序列的预定变体的核酸的腺苷A2B受体结合文库的合成。在一些情况下，预定参考序列是编码蛋白的核酸序列，并且变体文库包含编码至少单个密码子变异的序列，使得由合成的核酸编码的随后蛋白中单个残基的多于一个不同变体通过标准翻译过程产生。在一些情况下，腺苷A2B受体结合文库包含共同编码在多于一个位置处的变异的不同核酸。在一些情况下，变体文库包含编码VH、CDRH3或VL结构域的至少单个密码子变异的序列。在一些情况下，变体文库包含编码腺苷A2B受体结合结构域中至少单个密码子变异的序列。在一些情况下，变体文库包含编码VH、CDRH3或VL结构域的多于一个密码子变异的序列。在一些情况下，变体文库包含编码腺苷A2B受体结合结构域中多于一个密码子变异的序列。用于变异密码子的示例性数目包括但不限于至少或约1个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、125个、150个、175个、225个、250个、275个、300个或多于300个密码子。
本文描述的方法提供了各自编码至少一种预定参考核酸序列的预定变体的核酸的腺苷A2B受体结合文库的合成，其中腺苷A2B受体结合文库包含编码结构域长度变异的序列。在一些情况下，该结构域是VH、CDRH3或VL结构域。在一些情况下，该结构域是腺苷A2B受体结合结构域。在一些情况下，文库包含编码与预定参考序列相比少至少或约1个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、125个、150个、175个、225个、250个、275个、300个或多于300个密码子的长度变异的序列。在一些情况下，文库包含编码与预定参考序列相比多至少或约1个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、125个、150个、175个、200个、225个、250个、275个、300个或多于300个密码子的长度变异的序列。
本文提供了包含编码包含腺苷A2B受体结合结构域的支架的核酸的腺苷A2B受体结合文库，其中腺苷A2B受体结合文库用多种数目的片段合成。在一些情况下，该片段包含VH、CDRH3或VL结构域。在一些情况下，腺苷A2B受体结合文库用至少或约2个片段、3个片段、4个片段、5个片段或多于5个片段合成。每个核酸片段的长度或合成的核酸的平均长度可以是至少或约50个、75个、100个、125个、150个、175个、200个、225个、250个、275个、300个、325个、350个、375个、400个、425个、450个、475个、500个、525个、550个、575个、600个或多于600个碱基对。在一些情况下，长度是约50个至600个、75个至575个、100个至550个、125个至525个、150个至500个、175个至475个、200个至450个、225个至425个、250个至400个、275个至375个或300个至350个碱基对。
包含编码包含如本文描述的腺苷A2B受体结合结构域的支架的核酸的腺苷A2B受体结合文库在翻译时包含多种长度的氨基酸。在一些情况下，每个氨基酸片段的长度或合成的氨基酸的平均长度可以是至少或约15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、105个、110个、115个、120个、125个、130个、135个、140个、145个、150个或多于150个氨基酸。在一些情况下，氨基酸的长度是约15个至150个、20个至145个、25个至140个、30个至135个、35个至130个、40个至125个、45个至120个、50个至115个、55个至110个、60个至110个、65个至105个、70个至100个或75个至95个氨基酸。在一些情况下，氨基酸的长度是约22个至约75个氨基酸。
包含编码包含腺苷A2B受体结合结构域的支架的从头合成的变体序列的腺苷A2B受体结合文库包含许多变体序列。在一些情况下，从头合成用于CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2、CDRL3、VL、VH或其组合的许多变体序列。在一些情况下，从头合成用于框架元件1(Fw1)、框架元件2(Fw2)、框架元件3(Fw3)或框架元件4(FW4)的许多变体序列。在一些情况下，从头合成腺苷A2B受体结合结构域的许多变体序列。例如，变体序列的数目对于VH结构域是约1个至约10个序列，对于腺苷A2B受体结合结构域是约108个序列，并且对于VK结构域是约1个至约44个序列。变体序列的数目可以是至少或约5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、125个、150个、175个、200个、225个、250个、275个、300个、325个、350个、375个、400个、425个、450个、475个、500个或多于500个序列。在一些情况下，变体序列的数目是约10个至300个、25个至275个、50个至250个、75个至225个、100个至200个或125个至150个序列。
包含编码包含腺苷A2B受体结合结构域的支架的从头合成的变体序列的腺苷A2B受体结合文库包括改进的多样性。例如，变体通过将腺苷A2B受体结合结构域变体放置在包含N末端CDRH3变异和C末端CDRH3变异的免疫球蛋白支架变体中来产生。在一些情况下，变体包括亲和力成熟变体。可选地或组合地，变体包括免疫球蛋白的其他区域(包括但不限于CDRH1、CDRH2、CDRL1、CDRL2和CDRL3)中的变体。在一些情况下，腺苷A2B受体结合文库的变体的数目为至少或约104个、105个、106个、107个、108个、109个、1010个、1011个、1012个、1013个、1014个、1015个、1016个、1017个、1018个、1019个、1020个或多于1020个不相同的序列。例如，包含VH区的约10个变体序列、CDRH3区的约237个变体序列以及VL区和CDRL3区的约43个变体序列的文库包含105个不相同的序列(10×237×43)。
本文提供了包含编码包含抗体的至少一个区域的变异的腺苷A2B受体抗体的核酸的文库，其中所述区域是CDR区。在一些情况下，腺苷A2B受体抗体是包含一个重链可变结构域的单结构域抗体，诸如VHH抗体。在一些情况下，VHH抗体包含一个或更多个CDR区的变异。在一些情况下，本文描述的文库包含CDR1、CDR2或CDR3的至少或约1个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个、1000个、1200个、1400个、1600个、1800个、2000个、2400个、2600个、2800个、3000个或多于3000个序列。在一些情况下，本文描述的文库包含CDR1、CDR2或CDR3的至少或约104个、105个、106个、107个、108个、109个、1010个、1011个、1012个、1013个、1014个、1015个、1016个、1017个、1018个、1019个、1020个或多于1020个序列。例如，文库包含至少2000个CDR1序列、至少1200个CDR2序列和至少1600个CDR3序列。在一些情况下，每个序列都是不相同的。
在一些情况下，CDR1、CDR2或CDR3属于轻链可变结构域(VL)。轻链可变结构域(VL)的CDR1、CDR2或CDR3可以分别称为CDRL1、CDRL2或CDRL3。在一些情况下，本文描述的文库包含VL的CDR1、CDR2或CDR3的至少或约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个、1000个、1200个、1400个、1600个、1800个、2000个、2400个、2600个、2800个、3000个或多于3000个序列。在一些情况下，本文描述的文库包含VL的CDR1、CDR2或CDR3的至少或约104个、105个、106个、107个、108个、109个、1010个、1011个、1012个、1013个、1014个、1015个、1016个、1017个、1018个、1019个、1020个或多于1020个序列。例如，文库包含VL的CDR1的至少20个序列、VL的CDR2的至少4个序列和VL的CDR3的至少140个序列。在一些情况下，文库包含VL的CDR1的至少2个序列、VL的CDR2的至少1个序列和VL的CDR3的至少3000个序列。在一些情况下，VL是IGKV1-39、IGKV1-9、IGKV2-28、IGKV3-11、IGKV3-15、IGKV3-20、IGKV4-1、IGLV1-51、IGLV2-14、IGLV1-40或IGLV3-1。在一些情况下，VL是IGKV2-28。在一些情况下，VL是IGLV1-51。
在一些情况下，CDR1、CDR2或CDR3属于重链可变结构域(VH)。重链可变结构域(VH)的CDR1、CDR2或CDR3可以分别称为CDRH1、CDRH2或CDRH3。在一些情况下，本文描述的文库包含VH的CDR1、CDR2或CDR3的至少或约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个、1000个、1200个、1400个、1600个、1800个、2000个、2400个、2600个、2800个、3000个或多于3000个序列。在一些情况下，本文描述的文库包含VH的CDR1、CDR2或CDR3的至少或约104个、105个、106个、107个、108个、109个、1010个、1011个、1012个、1013个、1014个、1015个、1016个、1017个、1018个、1019个、1020个或多于1020个序列。例如，文库包含VH的CDR1的至少30个序列、VH的CDR2的至少570个序列和VH的CDR3的至少108个序列。在一些情况下，文库包含VH的CDR1的至少30个序列、VH的CDR2的至少860个序列和VH的CDR3的至少107个序列。在一些情况下，VH是IGHV1-18、IGHV1-69、IGHV1-8、IGHV3-21、IGHV3-23、IGHV3-30/33rn、IGHV3-28、IGHV3-74、IGHV4-39或IGHV4-59/61。在一些情况下，VH是IGHV1-69、IGHV3-30、IGHV3-23、IGHV3、IGHV1-46、IGHV3-7、IGHV1或IGHV1-8。在一些情况下，VH是IGHV1-69和IGHV3-30。在一些情况下，VH是IGHV3-23。
在一些实施方案中，如本文描述的文库包含不同长度的CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1、CDRH2或CDRH3。在一些情况下，CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1、CDRH2或CDRH3的长度包含至少或约5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个或多于90个氨基酸的长度。例如，CDRH3包含至少或大约12个、15个、16个、17个、20个、21个或23个长度的氨基酸。在一些情况下，CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1、CDRH2或CDRH3包含约1个至约10个、约5个至约15个、约10个至约20个或约15个至约30个长度的氨基酸的范围。
包含编码具有如本文描述变体CDR序列的抗体的核酸的文库在翻译时包含多种长度的氨基酸。在一些情况下，每个氨基酸片段的长度或合成的氨基酸的平均长度可以是至少或约15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、105个、110个、115个、120个、125个、130个、135个、140个、145个、150个或多于150个氨基酸。在一些情况下，氨基酸的长度是约15个至150个、20个至145个、25个至140个、30个至135个、35个至130个、40个至125个、45个至120个、50个至115个、55个至110个、60个至110个、65个至105个、70个至100个或75个至95个氨基酸。在一些情况下，氨基酸的长度是约22个氨基酸至约75个氨基酸。在一些情况下，抗体包含至少或约100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个、1000个、2000个、3000个、4000个、5000个或多于5000个氨基酸。
CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1、CDRH2或CDRH3的长度比率在本文描述的文库中可以变化。在一些情况下，包含至少或约5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个或多于90个氨基酸长度的CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1、CDRH2或CDRH3包括文库的约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或多于90％。例如，包含约23个氨基酸长度的CDRH3以40％存在于文库中，包含约21个氨基酸长度的CDRH3以30％存在于文库中，包含约17个氨基酸长度的CDRH3以20％存在于文库中，并且包含约12个氨基酸长度的CDRH3以10％存在于文库中。在一些情况下，包含约20个氨基酸长度的CDRH3以40％存在于文库中，包含约16个氨基酸长度的CDRH3以30％存在于文库中，包含约15个氨基酸长度的CDRH3以20％存在于文库中，并且包含约12个氨基酸长度的CDRH3以10％存在于文库中。
如本文描述的编码VHH抗体的文库包含变体CDR序列，该变体CDR序列被混编以产生具有至少或约107个、108个、109个、1010个、1011个、1012个、1013个、1014个、1015个、1016个、1017个、1018个、1019个、1020个或多于1020个序列的理论多样性的文库。在一些情况下，文库具有至少或约107个、108个、109个、1010个、1011个、1012个、1013个、1014个、1015个、1016个、1017个、1018个、1019个、1020个或多于1020个序列的最终文库多样性。
本文提供了编码免疫球蛋白的腺苷A2B受体结合文库。在一些情况下，腺苷A2B受体免疫球蛋白是抗体。在一些情况下，腺苷A2B受体免疫球蛋白是VHH抗体。在一些情况下，腺苷A2B受体免疫球蛋白包括小于1nM、小于1.2nM、小于2nM、小于5nM、小于10nM、小于11nm、小于13.5nM、小于15nM、小于20nM、小于25nM或小于30nM的与腺苷A2A受体的结合亲和力(例如，KD)。在一些情况下，腺苷A2B受体免疫球蛋白包括小于1nM的KD。在一些情况下，腺苷A2B受体免疫球蛋白包括小于1.2nM的KD。在一些情况下，腺苷A2B受体免疫球蛋白包括小于2nM的KD。在一些情况下，腺苷A2B受体免疫球蛋白包括小于5nM的KD。在一些情况下，腺苷A2B受体免疫球蛋白包括小于10nM的KD。在一些情况下，腺苷A2B受体免疫球蛋白包括小于13.5nM的KD。在一些情况下，腺苷A2B受体免疫球蛋白包括小于15nM的KD。在一些情况下，腺苷A2B受体免疫球蛋白包括小于20nM的KD。在一些情况下，腺苷A2B受体免疫球蛋白包括小于25nM的KD。在一些情况下，腺苷A2B受体免疫球蛋白包括小于30nM的KD。
在一些情况下，腺苷A2B受体免疫球蛋白是腺苷A2B受体激动剂。在一些情况下，腺苷A2B受体免疫球蛋白是腺苷A2B受体拮抗剂。在一些情况下，腺苷A2B受体免疫球蛋白是腺苷A2B受体别构调节剂。在一些情况下，别构调节剂是负别构调节剂。在一些情况下，别构调节剂是正别构调节剂。在一些情况下，腺苷A2B受体免疫球蛋白以至少或约1nM、2nM、4nM、6nM、8nM、10nM、20nM、30nM、40nM、50nM、60nM、70nM、80nM、90nM、100nM、120nM、140nM、160nM、180nM、200nM、300nM、400nM、500nM、600nM、700nM、800nM、900nM、1000nM或多于1000nM的浓度产生激动、拮抗或别构效应。在一些情况下，腺苷A2B受体免疫球蛋白是负别构调节剂。在一些情况下，腺苷A2B受体免疫球蛋白以至少或约0.001nM、0.005nM、0.01nM、0.05nM、0.1nM、0.5nM、1nM、2nM、4nM、6nM、8nM、10nM、20nM、30nM、40nM、50nM、60nM、70nM、80nM、90nM、100nM或多于100nM的浓度是负别构调节剂。在一些情况下，腺苷A2B受体免疫球蛋白以在约0.001nM至约100nM、0.01nM至约90nM、约0.1nM至约80nM、1nM至约50nM、约10nM至约40nM或约1nM至约10nM的范围内的浓度是负别构调节剂。在一些情况下，腺苷A2B受体免疫球蛋白包括至少或约0.001nM、0.0025nM、0.005nM、0.01nM、0.025nM、0.05nM、0.06nM、0.07nM、0.08nM、0.9nM、0.1nM、0.5nM、1nM、2nM、3nM、4nM、5nM、6nM或多于6nM的EC50或IC50。在一些情况下，腺苷A2B受体免疫球蛋白包括至少或约1nM、2nM、4nM、6nM、8nM、10nM、20nM、30nM、40nM、50nM、60nM、70nM、80nM、90nM、100nM或多于100nM的EC50或IC50。
如本文描述的腺苷A2B受体免疫球蛋白可以包括改进的特性。在一些情况下，腺苷A2B受体免疫球蛋白是单体的。在一些情况下，腺苷A2B受体免疫球蛋白不易于聚集。在一些情况下，腺苷A2B受体免疫球蛋白的至少或约70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％是单体的。在一些情况下，腺苷A2B受体免疫球蛋白是热稳定的。在一些情况下，腺苷A2B受体免疫球蛋白导致非特异性结合减少。
在合成包含编码包含腺苷A2B受体结合结构域的支架的核酸的腺苷A2B受体结合文库之后，文库可以用于筛选和分析。例如，测定文库的文库可展示性并淘选。在一些情况下，使用可选择的标签测定可展示性。示例性标签包括但不限于放射性标签、荧光标签、酶、化学发光标签、比色标签、亲和标签或本领域已知的其他标记或标签。在一些情况下，标签是组氨酸、多组氨酸、myc、血凝素(HA)或FLAG。腺苷A2B受体结合文库可以包含编码包含具有多于一个标签(诸如GFP、FLAG和Lucy以及DNA条形码)的腺苷A2B受体结合结构域的支架的核酸。在一些情况下，文库通过使用各种方法测序来测定，包括但不限于单分子实时(SMRT)测序、Polony测序、连接测序、可逆终止子测序、质子检测测序、离子半导体测序、纳米孔测序、电子测序、焦磷酸测序、Maxam-Gilbert测序、链终止(例如，Sanger)测序、+S测序或合成测序。
表达系统
本文提供了包含编码包含腺苷A2A受体结合结构域、腺苷A2B受体结合结构域或其组合的支架的核酸的文库，其中文库具有改进的特异性、稳定性、表达、折叠或下游活性。在一些情况下，本文描述的文库用于筛选和分析。
本文提供了包含编码包含腺苷A2A受体结合结构域、腺苷A2B受体结合结构域或其组合的支架的核酸的文库，其中核酸文库用于筛选和分析。在一些情况下，筛选和分析包括体外测定、体内测定或离体测定。用于筛选的细胞包括取自活体受试者的原代细胞或细胞系。细胞可以来自原核生物(例如，细菌和真菌)或真核生物(例如，动物和植物)。示例性动物细胞包括但不限于来自小鼠、兔、灵长类动物和昆虫的那些细胞。在一些情况下，用于筛选的细胞包括细胞系，包括但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系、人类胚胎肾(HEK)细胞系或幼仓鼠肾(BHK)细胞系。在一些情况下，本文描述的核酸文库也可以被递送至多细胞生物体。示例性多细胞生物体包括但不限于植物、小鼠、兔、灵长类动物和昆虫。
本文描述的核酸文库或其编码的蛋白文库可以筛选各种药理学或药代动力学特性。在一些情况下，文库使用体外测定、体内测定或离体测定来筛选。例如，筛选的体外药理学或药代动力学特性包括但不限于结合亲和力(affinity)、结合特异性和结合亲合力(avidity)。筛选的本文描述文库的示例性体内药理学或药代动力学特性包括但不限于治疗功效、活性、临床前毒性特性、临床功效特性、临床毒性特性、免疫原性、效力和临床安全性特性。
可以筛选的药理学或药代动力学特性包括但不限于细胞结合亲和力和细胞活性。例如，进行细胞结合亲和力测定或细胞活性测定以确定本文描述文库的激动、拮抗或别构效应。在一些情况下，细胞活性测定是cAMP测定。在一些情况下，将如本文描述的文库与腺苷A2A受体、腺苷A2B受体或者腺苷A2A受体和腺苷A2B受体两者的配体的细胞结合或细胞活性进行比较。
如本文描述的文库可以在基于细胞的测定或非基于细胞的测定中筛选。非基于细胞的测定的实例包括但不限于使用病毒颗粒、使用体外翻译蛋白和使用具有腺苷A2A受体、腺苷A2B受体或者腺苷A2A受体和腺苷A2B受体两者的蛋白脂质体(protealiposome)。
如本文描述的核酸文库可以通过测序来筛选。在一些情况下，使用下一代序列来确定腺苷A2A受体结合变体、腺苷A2B受体结合变体或其组合的序列富集。在一些情况下，确定V基因分布、J基因分布、V基因家族、每种长度的CDR3计数(CDR3 counts per length)或其组合。在一些情况下，确定克隆频率、克隆积累、谱系积累或其组合。在一些情况下，确定序列的数目、具有VH克隆的序列、克隆、大于1的克隆、克隆型、大于1的克隆型、谱系、simpsons或其组合。在一些情况下，确定不相同的CDR3的百分比。例如，不相同的CDR3的百分比计算为样品中不相同的CDR3的数目除以样品中具有CDR3的序列总数。
本文提供了核酸文库，其中核酸文库可以在载体中表达。用于插入本文公开的核酸文库的表达载体可以包括真核或原核表达载体。示例性表达载体包括但不限于哺乳动物表达载体：pSF-CMV-NEO-NH2-PPT-3XFLAG、pSF-CMV-NEO-COOH-3XFLAG、pSF-CMV-PURO-NH2-GST-TEV、pSF-OXB20-COOH-TEV-FLAG(R)-6His、pCEP4 pDEST27、pSF-CMV-Ub-KrYFP、pSF-CMV-FMDV-daGFP、pEF1a-mCherry-N1载体、pEF1a-tdTomato载体、pSF-CMV-FMDV-Hygro、pSF-CMV-PGK-Puro、pMCP-tag(m)和pSF-CMV-PURO-NH2-CMYC；细菌表达载体：pSF-OXB20-BetaGal、pSF-OXB20-Fluc、pSF-OXB20和pSF-Tac；植物表达载体：pRI 101-AN DNA和pCambia2301；和酵母表达载体：pTYB21和pKLAC2；以及昆虫表达载体：pAc5.1/V5-His A和pDEST8。在一些情况下，载体是pcDNA3或pcDNA3.1。
本文描述了在载体中表达以产生包含支架(该支架包含腺苷A2A受体结合结构域、腺苷A2B受体结构域或其组合的序列)的构建体的核酸文库。在一些情况下，构建体的尺寸是不同的。在一些情况下，构建体包含至少或约500个、600个、700个、800个、900个、1000个、1100个、1300个、1400个、1500个、1600个、1700个、1800个、2000个、2400个、2600个、2800个、3000个、3200个、3400个、3600个、3800个、4000个、4200,4400个、4600个、4800个、5000个、6000个、7000个、8000个、9000个、10000个或多于10000个碱基。在一些情况下，构建体包含约300个至1,000个、300个至2,000个、300个至3,000个、300个至4,000个、300个至5,000个、300个至6,000个、300个至7,000个、300个至8,000个、300个至9,000个、300个至10,000个、1,000个至2,000个、1,000个至3,000个、1,000个至4,000个、1,000个至5,000个、1,000个至6,000个、1,000个至7,000个、1,000个至8,000个、1,000个至9,000个、1,000个至10,000个、2,000个至3,000个、2,000个至4,000个、2,000个至5,000个、2,000个至6,000个、2,000个至7,000个、2,000个至8,000个、2,000个至9,000个、2,000个至10,000个、3,000个至4,000个、3,000个至5,000个、3,000个至6,000个、3,000个至7,000个、3,000个至8,000个、3,000个至9,000个、3,000个至10,000个、4,000个至5,000个、4,000个至6,000个、4,000个至7,000个、4,000个至8,000个、4,000个至9,000个、4,000个至10,000个、5,000个至6,000个、5,000个至7,000个、5,000个至8,000个、5,000个至9,000个、5,000个至10,000个、6,000个至7,000个、6,000个至8,000个、6,000个至9,000个、6,000个至10,000个、7,000个至8,000个、7,000个至9,000个、7,000个至10,000个、8,000个至9,000个、8,000个至10,000个或9,000个至10,000个碱基的范围。
本文提供了包含编码包含腺苷A2A受体结合结构域、腺苷A2B受体结构域或其组合的支架的核酸的文库，其中核酸文库在细胞中表达。在一些情况下，文库被合成为表达报告基因。示例性报告基因包括但不限于乙酰羟基酸合酶(AHAS)、碱性磷酸酶(AP)、β半乳糖苷酶(LacZ)、β葡萄糖苷酶(GUS)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、青色荧光蛋白(CFP)、天蓝色荧光蛋白、柠檬黄(citrine)荧光蛋白、橙色荧光蛋白、樱桃色荧光蛋白、绿松石色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、辣根过氧化物酶(HRP)、萤光素酶(Luc)、胭脂碱合酶(NOS)、章鱼碱合酶(OCS)、萤光素酶以及其衍生物。确定报告基因调节的方法是本领域熟知的，并且包括但不限于荧光法(fluorometricmethod)(例如荧光光谱、荧光激活细胞分选(FACS)、荧光显微术)和抗生素抗性确定。
疾病和紊乱
本文提供了包含编码包含可能具有治疗作用的腺苷A2A受体结合结构域的支架的核酸的腺苷A2A受体结合文库。本文还提供了包含编码包含可能具有治疗作用的腺苷A2B受体结合结构域的支架的核酸的腺苷A2B受体结合文库。在一些情况下，腺苷A2A受体结合文库和腺苷A2B受体文库在翻译时产生用于治疗疾病或紊乱的蛋白。在一些情况下，该蛋白是免疫球蛋白。在一些情况下，该蛋白是肽模拟物。示例性疾病包括但不限于癌症、炎性疾病或紊乱、代谢疾病或紊乱、心血管疾病或紊乱、呼吸疾病或紊乱、疼痛、消化疾病或紊乱、生殖疾病或紊乱、内分泌疾病或紊乱、或神经疾病或紊乱。在一些情况下，如本文描述的腺苷A2A受体抑制剂、腺苷A2B受体抑制剂或其组合用于治疗中枢神经系统、肾、肠、肺、毛发、皮肤、骨或软骨的疾病或紊乱。在一些情况下，如本文描述的腺苷A2A受体抑制剂、腺苷A2B受体抑制剂或其组合用于睡眠调节、血管生成或免疫系统的调节。
在一些情况下，本文描述的A2AR免疫球蛋白、A2BR免疫球蛋白或其组合用于治疗神经疾病或紊乱。在一些情况下，神经疾病或紊乱是神经退行性疾病或紊乱。在一些情况下，神经疾病或紊乱是帕金森病、阿尔茨海默病或多发性硬化。
在一些情况下，本文描述的A2AR免疫球蛋白、A2BR免疫球蛋白或其组合用于治疗癌症。在一些情况下，癌症是实体癌症或血液癌症。在一些情况下，本文描述的A2AR免疫球蛋白、A2BR免疫球蛋白或其组合被用作用于治疗癌症的单一疗法。在一些情况下，本文描述的A2AR免疫球蛋白、A2BR免疫球蛋白或其组合与其他治疗剂组合用于治疗癌症。在一些实施方案中，癌症是肺癌、结肠直肠癌或前列腺癌。在一些情况下，本文描述的A2AR免疫球蛋白、A2BR免疫球蛋白或其组合增强肿瘤疫苗、检查点阻断和过继性T细胞疗法。在一些情况下，A2AR免疫球蛋白、A2BR免疫球蛋白或其组合靶向免疫细胞并且阻断免疫抑制以治疗癌症。
在一些情况下，本文描述的A2AR免疫球蛋白、A2BR免疫球蛋白或其组合使肿瘤尺寸减小至少或约10％、15％、20％、25％、30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或多于95％。在一些情况下，与比较抗体(例如帕博利珠单抗或纳武利尤单抗)或对照相比，本文描述的A2AR免疫球蛋白、A2BR免疫球蛋白或其组合使肿瘤尺寸减小至少或约10％、15％、20％、25％、30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或多于95％。在一些情况下，对照是没有治疗或安慰剂。
在一些情况下，本文描述的A2AR免疫球蛋白、A2BR免疫球蛋白或其组合增加淋巴或骨髓区室的细胞数目。在一些情况下，本文描述的A2AR免疫球蛋白、A2BR免疫球蛋白或其组合使肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)CD45+细胞、总T细胞、CD4+细胞、CD8+细胞、调节性T细胞(Treg)、M1肿瘤相关巨噬细胞(TAM)或其组合增加至少或约10％、15％、20％、25％、30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或多于95％。在一些情况下，与比较抗体(例如帕博利珠单抗或纳武利尤单抗)或对照相比，本文描述的A2AR免疫球蛋白、A2BR免疫球蛋白或其组合使肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)CD45+细胞、总T细胞、CD4+细胞、CD8+细胞、调节性T细胞(Treg)、M1肿瘤相关巨噬细胞(TAM)或其组合增加至少或约10％、15％、20％、25％、30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或多于95％。在一些情况下，对照是没有治疗或安慰剂。
在一些情况下，本文描述的A2AR免疫球蛋白、A2BR免疫球蛋白或其组合增加细胞因子表达。在一些实施方案中，细胞因子是干扰素γ、白细胞介素2、白细胞介素4、白细胞介素6、白细胞介素8、白细胞介素10或TNFα。在一些实施方案中，细胞因子是白细胞介素1β、白细胞介素1Rα、GM-CSF、白细胞介素2、白细胞介素7、白细胞介素15、白细胞介素6、白细胞介素6、白细胞介素10、干扰素γ或TNFα。在一些情况下，本文描述的A2AR免疫球蛋白、A2BR免疫球蛋白或其组合使细胞因子表达增加至少或约10％、15％、20％、25％、30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或多于95％。在一些情况下，与比较抗体(例如帕博利珠单抗或纳武利尤单抗)或对照相比，本文描述的A2AR免疫球蛋白、A2BR免疫球蛋白或其组合使细胞因子表达增加至少或约10％、15％、20％、25％、30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或多于95％。在一些情况下，对照是没有治疗或安慰剂。
在一些情况下，受试者是哺乳动物。在一些情况下，受试者是小鼠、兔、犬或人类。通过本文描述的方法治疗的受试者可以是婴儿、成人或儿童。包含如本文描述的抗体或抗体片段的药物组合物可以静脉内或皮下施用。
变体文库
密码子变异
本文描述的变体核酸文库可以包含多于一个核酸，其中与参考核酸序列相比，每个核酸编码变体密码子序列。在一些情况下，第一核酸群体的每个核酸包含在单个变体位点处的变体。在一些情况下，第一核酸群体包含在单个变体位点处的多于一个变体，使得第一核酸群体包含在相同变体位点处的多于一个变体。第一核酸群体可以包含共同编码在相同变体位点处的多于一个密码子变体的核酸。第一核酸群体可以包含共同编码在相同位置处的多至19个或更多密码子的核酸。第一核酸群体可以包含共同编码在相同位置处的多至60个变体三联体的核酸，或者第一核酸群体可以包含共同编码在相同位置处的多至61个不同密码子三联体的核酸。每个变体可以编码在翻译期间产生不同氨基酸的密码子。表2提供了变体位点的每个可能密码子(和代表性氨基酸)的列表。
表2.密码子和氨基酸的列表
核酸群体可以包含共同编码在多于一个位置处的多至20个密码子变异的不同核酸。在这样的情况下，群体中的每个核酸包含相同核酸中多于一个位置处的密码子变异。在一些情况下，群体中的每个核酸包含单个核酸中1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或更多个密码子处的密码子变异。在一些情况下，每个变体长核酸包含单个长核酸中1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个或更多个密码子处的密码子变异。在一些情况下，变体核酸群体包含单个核酸中1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个或更多个密码子处的密码子变异。在一些情况下，变体核酸群体包含单个长核酸中至少约10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个或更多个密码子中的密码子变异。
高度并行核酸合成
本文提供了一种平台方法，该方法利用从多核苷酸合成至硅上纳米孔内基因组装的端至端过程的小型化、并行化和垂直集成来产生革命性的合成平台。本文描述的装置提供了与96孔板具有相同足迹的硅合成平台，与传统合成方法相比，该硅合成平台能够使通量增加多至1,000倍或更多倍，并在单次高度并行运行中产生多至大约1,000,000或更多个多核苷酸或10,000或更多个基因。
随着下一代测序的出现，高分辨率基因组数据已经成为深入研究各种基因在正常生物学和疾病发病机制两者中的生物学作用的研究的重要因素。这项研究的核心是分子生物学的中心法则和“序列信息的逐残基转换(residue-by-residue transfer ofsequential information)”的概念。DNA中编码的基因组信息被转录为信息，然后该信息被翻译为蛋白，该蛋白是给定生物途径中的活性产物。
另一个令人兴奋的研究领域是聚焦高度特异性细胞靶的治疗分子的发现、开发和制造。高多样性DNA序列文库是靶向治疗剂开发流水线(pipeline)的核心。使用基因突变体在设计、构建和测试蛋白工程化循环中表达蛋白，该循环理想地以对其治疗靶具有高亲和力的蛋白的高表达的优化基因而结束。作为一个实例，考虑受体的结合口袋。同时测试结合袋内所有残基的所有序列排列的能力将允许彻底的探索，增加成功的机会。研究人员试图在受体内的特定位点处产生所有可能的突变的饱和诱变代表应对这一开发挑战的一种方法。虽然昂贵并且时间和劳动密集，但其能够实现待被引入到各位置中的各变体。相比之下，几个选择的位置或短段DNA可以被广泛修饰的组合诱变产生具有偏倚代表的不完整的变体库。
为了加速药物开发流水线，可用于测试的在正确位置中以预期频率具有可用期望变体的文库(换言之，精确文库)能够减少成本以及筛选的周转时间。本文提供了用于合成核酸合成变体文库的方法，该方法提供了每个预期的变体以期望频率的精确引入。对于最终用户，这意味着不仅能够彻底地对序列空间进行采样，而且能够以有效的方式查询这些假设，从而减少成本和筛选时间。全基因组编辑可以阐明重要的途径，可以测试文库中每个变体和序列排列的最佳功能，并且可以使用数千个基因重构整个途径和基因组，以便将生物系统工程化，用于药物发现。
在第一实例中，可以使用本文描述的方法优化药物本身。例如，为了改进抗体的特定功能，设计并合成编码抗体的一部分的变体多核苷酸文库。然后可以通过本文描述的方法(例如，PCR诱变，随后插入到载体中)产生抗体的变体核酸文库。然后在生产细胞系中表达抗体并且筛选增强的活性。示例性筛选包括检查与抗原的结合亲和力、稳定性或效应子功能(例如，ADCC、补体或凋亡)的调节。用于优化抗体的示例性区域包括但不限于Fc区、Fab区、Fab区的可变区、Fab区的恒定区、重链或轻链的可变结构域(VH或VL)以及VH或VL的特异性互补决定区(CDR)。
通过本文描述的方法合成的核酸文库可以在与疾病状态相关的各种细胞中表达。与疾病状态相关的细胞包括细胞系、组织样品、来自受试者的原代细胞、来自受试者的扩增的培养细胞或模型系统中的细胞。示例性模型系统包括但不限于疾病状态的植物和动物模型。
为了鉴定与疾病状态的预防、减少或治疗相关的变体分子，本文描述的变体核酸文库在与疾病状态相关的细胞中表达，或者在其中可以诱导细胞疾病状态的细胞中表达。在一些情况下，使用剂诱导细胞的疾病状态。用于疾病状态诱导的示例性工具包括但不限于Cre/Lox重组系统、LPS炎症诱导和诱导低血糖的链脲佐菌素。与疾病状态相关的细胞可以是来自模型系统的细胞或培养的细胞，以及来自患有特定疾病状况的受试者的细胞。示例性疾病状况包括细菌性紊乱、真菌性紊乱、病毒性紊乱、自身免疫性紊乱或增殖性紊乱(例如，癌症)。在一些情况下，变体核酸文库在模型系统、细胞系或来源于受试者的原代细胞中表达，并且筛选至少一种细胞活性的改变。示例性细胞活性包括但不限于增殖、周期进展、细胞死亡、粘附、迁移、繁殖、细胞信号传导、能量产生、氧利用、代谢活性和老化、对自由基损伤的响应或其任何组合。
基底
用作多核苷酸合成的表面的装置可以呈基底的形式，该基底包括但不限于同质阵列表面、图案化阵列表面、通道、珠、凝胶等。本文提供了包含多于一个簇的基底，其中每个簇包含支持多核苷酸附接和合成的多于一个位点。在一些情况下，基底包括同质阵列表面。例如，同质阵列表面是同质板。如本文中使用的术语“位点(locus)”是指结构上的离散区，其为编码单个预定序列的多核苷酸从表面延伸提供支持。在一些情况下，位点位于二维表面，例如，基本平坦表面上。在一些情况下，位点位于三维表面，例如，孔、微孔、通道或柱上。在一些情况下，位点的表面包含活性官能化的材料，以附接至用于多核苷酸合成的至少一个核苷酸，或优选地，用于多核苷酸群体合成的相同核苷酸群体。在一些情况下，多核苷酸是指编码相同核酸序列的多核苷酸群体。在一些情况下，基底的表面包括基底的一个或多于一个表面。使用所提供的系统和方法合成的在这里描述的文库中的多核苷酸的平均错误率通常小于1/1000、小于约1/2000、小于约1/3000或更小，通常在没有错误校正的情况下。
本文提供了支持在常见的支持物上的可寻址位置处并行合成具有不同预定序列的多于一个多核苷酸的表面。在一些情况下，基底为多于50个、100个、200个、400个、600个、800个、1000个、1200个、1400个、1600个、1800个、2,000个、5,000个、10,000个、20,000个、50,000个、100,000个、200,000个、300,000个、400,000个、500,000个、600,000个、700,000个、800,000个、900,000个、1,000,000个、1,200,000个、1,400,000个、1,600,000个、1,800,000个、2,000,000个、2,500,000个、3,000,000个、3,500,000个、4,000,000个、4,500,000个、5,000,000个、10,000,000个或更多个不相同多核苷酸的合成提供支持。在一些情况下，表面为多于50个、100个、200个、400个、600个、800个、1000个、1200个、1400个、1600个、1800个、2,000个、5,000个、10,000个、20,000个、50,000个、100,000个、200,000个、300,000个、400,000个、500,000个、600,000个、700,000个、800,000个、900,000个、1,000,000个、1,200,000个、1,400,000个、1,600,000个、1,800,000个、2,000,000个、2,500,000个、3,000,000个、3,500,000个、4,000,000个、4,500,000个、5,000,000个、10,000,000个或更多个编码不同序列的多核苷酸的合成提供支持。在一些情况下，多核苷酸的至少一部分具有相同的序列或被配置为用相同的序列合成。在一些情况下，基底为具有至少80个、90个、100个、120个、150个、175个、200个、225个、250个、275个、300个、325个、350个、375个、400个、425个、450个、475个、500个碱基或更多个碱基的多核苷酸的生长提供表面环境。
本文提供了用于在基底的不同位点上合成多核苷酸的方法，其中每个位点支持多核苷酸群体的合成。在一些情况下，每个位点支持与在另一个位点上生长的多核苷酸群体具有不同序列的多核苷酸群体的合成。在一些情况下，每种多核苷酸序列跨越用于多核苷酸合成的表面上的同一位点簇内的不同位点以1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或更多个冗余合成。在一些情况下，基底的位点位于多于一个簇内。在一些情况下，基底包括至少10个、500个、1000个、2000个、3000个、4000个、5000个、6000个、7000个、8000个、9000个、10000个、11000个、12000个、13000个、14000个、15000个、20000个、30000个、40000个、50000个或更多个簇。在一些情况下，基底包括多于2,000个、5,000个、10,000个、100,000个、200,000个、300,000个、400,000个、500,000个、600,000个、700,000个、800,000个、900,000个、1,000,000个、1,100,000个、1,200,000个、1,300,000个、1,400,000个、1,500,000个、1,600,000个、1,700,000个、1,800,000个、1,900,000个、2,000,000个、300,000个、400,000个、500,000个、600,000个、700,000个、800,000个、900,000个、1,000,000个、1,200,000个、1,400,000个、1,600,000个、1,800,000个、2,000,000个、2,500,000个、3,000,000个、3,500,000个、4,000,000个、4,500,000个、5,000,000个或10,000,000个或更多个不同的位点。在一些情况下，基底包括约10,000个不同的位点。在不同的情况下，单个簇内的位点的量是不同的。在一些情况下，每个簇包括1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、120个、130个、150个、200个、300个、400个、500个或更多个位点。在一些情况下，每个簇包括约50个-500个位点。在一些情况下，每个簇包括约100个-200个位点。在一些情况下，每个簇包括约100个-150个位点。在一些情况下，每个簇包括约109个、121个、130个或137个位点。在一些情况下，每个簇包括约19个、20个、61个、64个或更多个位点。可选地或组合地，多核苷酸合成发生在同质阵列表面上。
在一些情况下，基底上合成的不同多核苷酸的数目取决于基底中可用的不同位点的数目。在一些情况下，基底的簇或表面内的位点密度是每mm2至少或约1个、10个、25个、50个、65个、75个、100个、130个、150个、175个、200个、300个、400个、500个、1,000个或更多个位点。在一些情况下，基底包括10-500、25-400、50-500、100-500、150-500、10-250、50-250、10-200或50-200mm2。在一些情况下，簇或表面内两个相邻位点的中心之间的距离是约10um-500um、约10um-200um或约10um-100um。在一些情况下，两个相邻位点的中心之间的距离大于约10um、20um、30um、40um、50um、60um、70um、80um、90um或100um。在一些情况下，两个相邻位点的中心之间的距离小于约200um、150um、100um、80um、70um、60um、50um、40um、30um、20um或10um。在一些情况下，每个位点具有约0.5um、1um、2um、3um、4um、5um、6um、7um、8um、9um、10um、20um、30um、40um、50um、60um、70um、80um、90um或100um的宽度。在一些情况下，每个位点具有约0.5um-100um、0.5um-50um、10um-75um或0.5um-50um的宽度。
在一些情况下，基底内的簇的密度是至少或约1个簇/100mm2、1个簇/10mm2、1个簇/5mm2、1个簇/4mm2、1个簇/3mm2、1个簇/2mm2、1个簇/1mm2、2个簇/1mm2、3个簇/1mm2、4个簇/1mm2、5个簇/1mm2、10个簇/1mm2、50个簇/1mm2或更多。在一些情况下，基底包括约1个簇/10mm2至约10个簇/1mm2。在一些情况下，两个相邻簇的中心之间的距离是至少或约50um、100um、200um、500um、1000um、2000um或5000um。在一些情况下，两个相邻簇的中心之间的距离是在约50um-100um、50um-200um、50um-300um、50um-500um和100um-2000um之间。在一些情况下，两个相邻簇的中心之间的距离在约0.05mm-50mm、0.05mm-10mm、0.05mm-5mm、0.05mm-4mm、0.05mm-3mm、0.05mm-2mm、0.1mm-10mm、0.2mm-10mm、0.3mm-10mm、0.4mm-10mm、0.5mm-10mm、0.5mm-5mm或0.5mm-2mm之间。在一些情况下，每个簇具有约0.5mm至约2mm、约0.5mm至约1mm或约1mm至约2mm的横截面。在一些情况下，每个簇具有约0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1mm、1.1mm、1.2mm、1.3mm、1.4mm、1.5mm、1.6mm、1.7mm、1.8mm、1.9mm或2mm的横截面。在一些情况下，每个簇具有约0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1mm、1.1mm、1.15mm、1.2mm、1.3mm、1.4mm、1.5mm、1.6mm、1.7mm、1.8mm、1.9mm或2mm的内部横截面。
在一些情况下，基底是约标准96孔板的尺寸，例如在约100mm与约200mm之间乘以约50mm与约150mm之间。在一些情况下，基底具有小于或等于约1000mm、500mm、450mm、400mm、300mm、250mm、200mm、150mm、100mm或50mm的直径。在一些情况下，基底的直径在约25mm-1000mm、25mm-800mm、25mm-600mm、25mm-500mm、25mm-400mm、25mm-300mm或25mm-200mm之间。在一些情况下，基底具有至少约100mm2、200mm2、500mm2、1,000mm2、2,000mm2、5,000mm2、10,000mm2、12,000mm2、15,000mm2、20,000mm2、30,000mm2、40,000mm2、50,000mm2或更大的平坦表面面积。在一些情况下，基底的厚度在约50mm-2000mm、50mm-1000mm、100mm-1000mm、200mm-1000mm或250mm-1000mm之间。
表面材料
本文提供的基底、装置和反应器由适用于本文描述方法、组合物和系统的任何种类的材料制造。在某些情况下，制造表现出低水平的核苷酸结合的基底材料。在一些情况下，基底材料被改性以产生表现出高水平核苷酸结合的不同表面。在一些情况下，基底材料对可见光和/或UV光是透明的。在一些情况下，基底材料是足够导电的，例如，能够在基底的全部或一部分上形成均匀电场。在一些情况下，导电材料连接至电接地。在一些情况下，基底是导热的或隔热的。在一些情况下，材料是耐化学和耐热的，以支持化学或生物化学反应，例如多核苷酸合成反应过程。在一些情况下，基底包括柔性材料。对于柔性材料，材料可以包括但不限于：尼龙(改性和未改性两者)、硝酸纤维素、聚丙烯等。在一些情况下，基底包括刚性材料。对于刚性材料，材料可以包括但不限于：玻璃；熔融二氧化硅；硅、塑料(例如聚四氟乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯及其共混物等)；金属(例如金、铂等)。基底、固体支持物或反应器可以由选自由以下组成的组的材料制造：硅、聚苯乙烯、琼脂糖、右旋糖酐、纤维素聚合物、聚丙烯酰胺、聚二甲基硅氧烷(PDMS)和玻璃。基底/固体支持物或其中的微结构、反应器可以用本文列出的材料或本领域已知的任何其他合适材料的组合来制造。
表面架构
本文提供了用于本文描述的方法、组合物和系统的基底，其中基底具有适用于本文描述的方法、组合物和系统的表面架构。在一些情况下，基底包括升高和/或降低的特征。具有这样的特征的一个益处是增加支持多核苷酸合成的表面面积。在一些情况下，具有升高和/或降低的特征的基底被称为三维基底。在一些情况下，三维基底包括一个或更多个通道。在一些情况下，一个或更多个位点构成一个通道。在一些情况下，通道可经由沉积装置诸如材料沉积装置进行试剂沉积。在一些情况下，试剂和/或流体以流体连通一个或更多个通道的方式收集在较大的孔中。例如，基底包括对应于具有簇的多于一个位点的多于一个通道，并且多于一个通道与簇的一个孔流体连通。在一些方法中，在簇的多于一个位点中合成多核苷酸文库。
本文提供了用于本文描述的方法、组合物和系统的基底，其中基底被配置为用于多核苷酸合成。在一些情况下，结构被配置为允许用于表面上多核苷酸合成的受控流动和传质(mass transfer)路径。在一些情况下，基底的构造允许在多核苷酸合成期间传质路径、化学暴露时间和/或洗涤功效的受控且均匀的分布。在一些情况下，基底的构造允许增加扫描效率，例如通过为生长的多核苷酸提供足够的体积，使得生长的多核苷酸排除的体积占可用于或适用于使多核苷酸生长的初始可用体积的不大于50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小。在一些情况下，三维结构允许流体的受控流动，以允许化学暴露的快速更换。
本文提供了用于本文描述的方法、组合物和系统的基底，其中基底包括适用于本文描述的方法、组合物和系统的结构。在一些情况下，分隔(segregation)是通过物理结构实现的。在一些情况下，分隔是通过表面的差异官能化实现的，产生用于多核苷酸合成的活性区域和钝化区域。在一些情况下，差异官能化是通过以下实现的：改变跨越基底表面的疏水性，从而产生水接触角效应，引起沉积试剂的成珠(beading)或润湿。采用更大的结构可以降低不同多核苷酸合成位置与相邻点的试剂的飞溅和交叉污染。在一些情况下，使用装置，诸如材料沉积装置，使试剂沉积至不同的多核苷酸合成位置。具有三维特征的基底以允许以低错误率(例如，小于约1:500、1:1000、1:1500、1:2,000、1:3,000、1:5,000或1:10,000)合成大量多核苷酸(例如，多于约10,000个)的方式配置。在一些情况下，基底包括具有约或大于约1个、5个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、100个、110个、120个、130个、140个、150个、160个、170个、180个、190个、200个、300个、400个或500个特征/mm2的密度的特征。
基底的孔可以具有与基底的另一孔相同或不同的宽度、高度和/或体积。基底的通道可以具有与基底的另一通道相同或不同的宽度、高度和/或体积。在一些情况下，簇的直径或包含簇的孔的直径或两者在约0.05mm-50mm、0.05mm-10mm、0.05mm-5mm、0.05mm-4mm、0.05mm-3mm、0.05mm-2mm、0.05mm-1mm、0.05mm-0.5mm、0.05mm-0.1mm、0.1mm-10mm、0.2mm-10mm、0.3mm-10mm、0.4mm-10mm、0.5mm-10mm、0.5mm-5mm或0.5mm-2mm之间。在一些情况下，簇或孔或两者的直径是小于或约5mm、4mm、3mm、2mm、1mm、0.5mm、0.1mm、0.09mm、0.08mm、0.07mm、0.06mm或0.05mm。在一些情况下，簇或孔或两者的直径在约1.0mm与1.3mm之间。在一些情况下，簇或孔或两者的直径是约1.150mm。在一些情况下，簇或孔或两者的直径是约0.08mm。簇的直径是指二维或三维基底内的簇。
在一些情况下，孔的高度是约20um-1000um、50um-1000um、100um-1000um、200um-1000um、300um-1000um、400um-1000um或500um-1000um。在一些情况下，孔的高度小于约1000um、900um、800um、700um或600um。
在一些情况下，基底包括对应于簇内多于一个位点的多于一个通道，其中通道的高度或深度是5um-500um、5um-400um、5um-300um、5um-200um、5um-100um、5um-50um或10um-50um。在一些情况下，通道的高度小于100um、80um、60um、40um或20um。
在一些情况下，通道、位点(例如，在基本上平坦基底中)或通道和位点两者(例如，在其中位点对应于通道的三维基底中)的直径是约1um-1000um、1um-500um、1um-200um、1um-100um、5um-100um或10um-100um，例如，约90um、80um、70um、60um、50um、40um、30um、20um或10um。在一些情况下，通道、位点或通道和位点两者的直径小于约100um、90um、80um、70um、60um、50um、40um、30um、20um或10um。在一些情况下，两个相邻通道、位点或通道和位点的中心之间的距离是约1um-500um、1um-200um、1um-100um、5um-200um、5um-100um、5um-50um或5um-30um，例如约20um。
表面改性
本文提供了用于表面上多核苷酸合成的方法，其中表面包含各种表面改性。在一些情况下，表面改性用于通过添加或减少过程对表面进行化学和/或物理改变，以改变基底表面或基底表面的选择的位点或区域的一种或更多种化学和/或物理特性。例如，表面改性包括但不限于(1)改变表面的润湿特性，(2)使表面官能化，即提供、修饰或取代表面官能团，(3)使表面去官能化，即去除表面官能团，(4)以其他方式改变表面的化学组成，例如通过蚀刻，(5)增加或降低表面粗糙度，(6)在表面上提供涂层，例如，表现出不同于表面润湿特性的润湿特性的涂层，和/或(7)在表面上沉积颗粒。
在一些情况下，在表面顶部添加化学层(称为粘附促进剂)促进基底表面上位点的结构化图案化(structured patterning)。用于应用粘附促进的示例性表面包括但不限于玻璃、硅、二氧化硅和氮化硅。在一些情况下，粘附促进剂是具有高表面能的化学物质。在一些情况下，第二化学层沉积在基底的表面上。在一些情况下，第二化学层具有低表面能。在一些情况下，涂覆在表面上的化学层的表面能支持液滴在表面上的定位。根据所选择的图案化布置，位点的接近度和/或位点处的流体接触面积是可变的。
在一些情况下，例如，用于多核苷酸合成的核酸或其他部分沉积在其上的基底表面或解析位点是光滑的或基本上平坦的(例如，二维的)或具有不规则性，诸如升高或降低的特征(例如，三维特征)。在一些情况下，基底表面用一层或更多层不同的化合物改性。这样的感兴趣的改性层包括但不限于无机和有机层，诸如金属、金属氧化物、聚合物、小有机分子等。
在一些情况下，基底的解析位点用增加和/或降低表面能的一种或更多种部分官能化。在一些情况下，部分是化学惰性的。在一些情况下，部分被配置为支持期望的化学反应，例如，多核苷酸合成反应中的一个或更多个过程。表面的表面能或疏水性是决定核苷酸附接到表面上的亲和力的因素。在一些情况下，用于基底官能化的方法包括：(a)提供具有包括二氧化硅的表面的基底；和(b)使用本文描述或本领域已知的合适硅烷化剂，例如，有机官能烷氧基硅烷分子，使表面硅烷化。方法和官能化剂描述在美国专利第5474796号中，该专利通过引用以其整体并入本文。
在一些情况下，基底表面通过以下官能化：在对将硅烷偶联至基底表面有效的反应条件下，通常经由存在于基底表面上的反应性亲水性部分，与包含硅烷混合物的衍生组合物接触。硅烷化通常通过用有机官能烷氧基硅烷分子自组装来覆盖表面。还可以使用如本领域目前已知的多种硅氧烷官能化试剂，例如，用于降低或增加表面能。有机官能烷氧基硅烷根据其有机功能进行分类。
多核苷酸合成
本公开内容的用于多核苷酸合成的方法可以包括涉及亚磷酰胺化学的方法。在一些情况下，多核苷酸合成包括将碱基与亚磷酰胺偶联。多核苷酸合成可以包括通过在偶联条件下沉积亚磷酰胺来偶联碱基，其中相同碱基任选地与亚磷酰胺沉积多于一次，即双重偶联。多核苷酸合成可以包括未反应位点的加帽。在一些情况下，加帽是任选的。多核苷酸合成也可以包括氧化或一个氧化步骤或更多个氧化步骤。多核苷酸合成可以包括脱封闭、脱三苯甲基化和硫化。在一些情况下，多核苷酸合成包括氧化或硫化。在一些情况下，在多核苷酸合成反应期间的一个或每个步骤之间，使用例如四唑或乙腈洗涤装置。亚磷酰胺合成方法中任何一个步骤的时间帧可以小于约2min、1min、50sec、40sec、30sec、20sec和10sec。
使用亚磷酰胺方法的多核苷酸合成可以包括随后向生长的多核苷酸链中添加亚磷酰胺构建单元(building block)(例如核苷亚磷酰胺)，以形成亚磷酸三酯键。亚磷酰胺多核苷酸合成以3’至5’方向进行。亚磷酰胺多核苷酸合成允许在每个合成循环向生长的核酸链中受控添加一个核苷酸。在一些情况下，每个合成循环包括偶联步骤。亚磷酰胺偶联包括在活化的核苷亚磷酰胺和通过例如接头结合到基底的核苷之间形成亚磷酸三酯键。在一些情况下，核苷亚磷酰胺被提供至活化的装置。在一些情况下，核苷亚磷酰胺与活化剂一起被提供至装置。在一些情况下，核苷亚磷酰胺被以多于基底结合的核苷1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100倍过量或更多提供给装置。在一些情况下，核苷亚磷酰胺的添加在无水环境中例如在无水乙腈中进行。加入核苷亚磷酰胺后，任选地洗涤装置。在一些情况下，偶联步骤另外重复一次或更多次，且任选地在核苷亚磷酰胺添加到基底之间进行洗涤步骤。在一些情况下，本文使用的多核苷酸合成方法包括1、2、3或更多个顺序偶联步骤。在偶联之前，在许多情况下，结合到装置上的核苷通过去除保护基团而被脱保护，其中保护基团起到防止聚合的作用。常见的保护基团是4,4’-二甲氧基三苯甲基(DMT)。
偶联后，亚磷酰胺多核苷酸合成方法任选地包括加帽步骤。在加帽步骤中，用加帽剂处理生长的多核苷酸。加帽步骤可用于在偶联后阻止未反应的基底结合的5’-羟基基团进一步链延伸，防止形成具有内部碱基缺失的多核苷酸。此外，用1H-四唑活化的亚磷酰胺可以在很小程度上与鸟苷的O6位置反应。不受理论的约束，在用I2/水氧化时，这种副产物(可能通过O6-N7迁移)可能经历脱嘌呤作用。在多核苷酸的最终脱保护过程中，无嘌呤(apurinic)位点可能最终被裂解，从而减少全长产物的产量。O6修饰可以通过在用I2/水氧化之前用加帽剂处理来去除。在一些情况下，在多核苷酸合成期间包括加帽步骤与没有加帽的合成相比降低了错误率。例如，加帽步骤包括用乙酸酐和1-甲基咪唑的混合物处理与基底结合的多核苷酸。在加帽步骤之后，任选地洗涤装置。
在一些情况下，在添加核苷亚磷酰胺之后，并且任选地在加帽和一个或更多个洗涤步骤之后，装置结合的生长的核酸被氧化。氧化步骤包括将亚磷酸三酯氧化成四配位磷酸三酯，该四配位磷酸三酯是天然存在的磷酸二酯核苷间键的受保护前体。在一些情况下，生长的多核苷酸的氧化是通过任选地在存在弱碱(例如吡啶、二甲基吡啶(lutidine)、三甲基吡啶(collidine))的情况下用碘和水处理来实现的。氧化可以在无水条件下，使用例如叔丁基过氧化氢或(1S)-(+)-(10-樟脑磺酰基)-氧氮杂环丙烷(CSO)进行。在一些方法中，在氧化之后进行加帽步骤。第二个加帽步骤允许装置干燥，因为可能持续存在的从氧化残余的水可以抑制随后的偶联。氧化后，任选地洗涤装置和生长的多核苷酸。在一些情况下，氧化步骤被硫化步骤替代，以获得多核苷酸硫代磷酸酯，其中任何加帽步骤可以在硫化之后进行。许多试剂能够有效地转移硫，包括但不限于3-(二甲基氨基亚甲基)氨基)-3H-1,2,4-二噻唑-3-硫酮、DDTT、3H-1,2-苯并二硫-3-酮1,1-二氧化物、也称为Beaucage试剂、和二硫化N,N,N'N'-四乙基秋兰姆(TETD)。
为了核苷掺入的随后循环通过偶联发生，装置结合的生长的多核苷酸的受保护的5’末端被去除，使得伯羟基基团是与下一个核苷亚磷酰胺反应性的。在一些情况下，保护基团是DMT，并且在二氯甲烷中用三氯乙酸进行脱封闭。持续延长的时间或用比推荐更强的酸溶液进行脱三苯甲基化可能导致固体支持物结合的多核苷酸的脱嘌呤作用增加，并且从而降低期望的全长产物的产量。本文描述的公开内容的方法和组合物提供了限制不期望的脱嘌呤反应的受控的脱封闭条件。在一些情况下，脱封闭后洗涤装置结合的多核苷酸。在一些情况下，脱封闭后的有效洗涤有助于合成具有低错误率的多核苷酸。
用于合成多核苷酸的方法通常包括以下步骤的重复序列：将受保护单体施加到活性官能化表面(例如位点)，以与活化表面、接头或与先前脱保护的单体连接；将施加的单体脱保护，使得其与随后施加的受保护单体是反应性的；以及施加用于连接的另一种受保护单体。一个或更多个中间步骤包括氧化或硫化。在一些情况下，一个或更多个洗涤步骤在一个或所有步骤之前或之后。
用于基于亚磷酰胺的多核苷酸合成的方法包括一系列化学步骤。在一些情况下，合成方法的一个或更多个步骤涉及试剂循环，其中该方法的一个或更多个步骤包括将可用于步骤的试剂应用于装置。例如，试剂通过一系列液体沉积和真空干燥步骤循环。对于包括诸如孔、微孔、通道等三维特征的基底，试剂任选地经由孔和/或通道通过装置的一个或更多个区域。
本文描述的方法和系统涉及用于合成多核苷酸的多核苷酸合成装置。合成可以是并行的。例如至少或大约至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、1000、10000、50000、75000、100000种或更多多核苷酸可以并行合成。可以并行合成的多核苷酸的总数可以是2-100000、3-50000、4-10000、5-1000、6-900、7-850、8-800、9-750、10-700、11-650、12-600、13-550、14-500、15-450、16-400、17-350、18-300、19-250、20-200、21-150、22-100、23-50、24-45、25-40、30-35。本领域技术人员理解，并行合成的多核苷酸的总数可以落入由这些值中的任何一个限定的任何范围内，例如25-100。并行合成的多核苷酸的总数可以落入由用作范围端点的任何值定义的任何范围内。装置内合成的多核苷酸的总摩尔质量或每种多核苷酸的摩尔质量可以是至少或至少约10、20、30、40、50、100、250、500、750、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、25000、50000、75000、100000皮摩尔或更多。装置内每个多核苷酸的长度或多核苷酸的平均长度可以是至少或大约至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、100、150、200、300、400、500个核苷酸或更多。装置内每个多核苷酸的长度或多核苷酸的平均长度可以是最多或大约最多500、400、300、200、150、100、50、45、35、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10个核苷酸或更少。装置内每个多核苷酸的长度或多核苷酸的平均长度可以落入从10-500、9-400、11-300、12-200、13-150、14-100、15-50、16-45、17-40、18-35、19-25。本领域技术人员理解，装置内每个多核苷酸的长度或多核苷酸的平均长度可以落入由这些值中的任何一个限定的任何范围内，例如100-300。装置内每个多核苷酸的长度或多核苷酸的平均长度可以落入由用作范围端点的任何值定义的任何范围内。
本文提供的用于在表面上合成多核苷酸的方法允许快速合成。作为实例，每小时合成至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、125、150、175、200个核苷酸或更多。核苷酸包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿苷构建单元或其类似物/修饰形式。在一些情况下，多核苷酸文库在基底上并行合成。例如，包括大约或至少大约100个、1,000、10,000、30,000、75,000、100,000、1,000,000、2,000,000、3,000,000、4,000,000、或者5,000,000个解析位点的装置能够支持至少相同数量的不同多核苷酸的合成，其中编码不同序列的多核苷酸在解析位点上合成。在一些情况下，在少于约三个月、两个月、一个月、三周、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2天、24小时或更少的时间内，在本文描述的具有低错误率的装置上合成多核苷酸文库。在一些情况下，从使用本文所述的基底和方法以低错误率合成的多核苷酸文库组装的较大核酸在少于约三个月、两个月、一个月、三周、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2天、24小时或更少的时间内制备。
在一些情况下，本文描述的方法提供了包含在多于一个密码子位点处不同的变体核酸的核酸文库的产生。在一些情况下，核酸可以具有变体密码子位点中的1个位点、2个位点、3个位点、4个位点、5个位点、6个位点、7个位点、8个位点、9个位点、10个位点、11个位点、12个位点、13个位点、14个位点、15个位点、16个位点、17个位点、18个位点、19个位点、20个位点、30个位点、40个位点、50个位点或更多个。
在一些情况下，变体密码子位点中的一个或更多个位点可以是相邻的。在一些情况下，变体密码子位点中的一个或更多个位点可以不相邻，并且被1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个密码子分开。
在一些情况下，核酸可以包含变体密码子位点中的多于一个位点，其中所有变体密码子位点彼此相邻，形成一段变体密码子位点。在一些情况下，核酸可以包含变体密码子位点中的多于一个位点，其中任何变体密码子位点彼此不相邻。在一些情况下，核酸可以包含变体密码子位点中的多于一个位点，其中变体密码子位点中的一些彼此相邻，形成一段变体密码子位点，并且变体密码子位点中的一些彼此不相邻。
参考附图，图3示出了用于从较短核酸合成核酸(例如，基因)的示例性过程工作流程。工作流程通常分为以下阶段：(1)单链核酸文库的从头合成，(2)连接核酸以形成更大的片段，(3)错误校正，(4)质量控制，和(5)运送。在从头合成之前，预先选择预期的核酸序列或核酸序列组。例如，预先选择一组基因用于产生。
在选择用于产生的大核酸后，设计预定的核酸文库用于从头合成。用于产生高密度多核苷酸阵列的各种合适方法是已知的。在工作流程实例中，提供了装置表面层。在实例中，改变表面的化学以改进多核苷酸合成过程。产生低表面能区域以排斥液体，同时产生高表面能区域以吸引液体。表面本身可以是平坦表面的形式，或者包含形状上的变化，诸如增加表面面积的突起或微孔。在工作流程实例中，选择的高表面能分子起到支持DNA化学物质的双重功能，如国际专利申请公布WO/2015/021080中公开的，该公布通过引用以其整体并入本文。
多核苷酸阵列的原位制备是在固体支持物上产生的，并且利用单核苷酸延伸过程并行延伸多于一个寡聚体。沉积装置，诸如材料沉积装置，被设计为以逐步方式释放试剂，使得多于一个多核苷酸一次并行延伸一个残基，以产生具有预定核酸序列的寡聚体302。在一些情况下，多核苷酸在这个阶段从表面裂解。裂解包括气体裂解，例如，用氨或甲胺裂解。
将产生的多核苷酸文库放置在反应室中。在该示例性工作流程中，反应室(也称为“纳米反应器”)是硅涂覆的孔，包含PCR试剂并且降低到多核苷酸文库上303。在将多核苷酸密封304之前或之后，添加试剂以从基底释放多核苷酸。在示例性工作流程中，在纳米反应器密封305之后释放多核苷酸。在释放后，单链多核苷酸的片段杂交，以便跨越整个长范围DNA序列。部分杂交305是可能的，因为每个合成的多核苷酸被设计为具有与池中至少一个其他多核苷酸重叠的小部分。
在杂交后，开始PCA反应。在聚合酶循环期间，多核苷酸与互补片段退火，并且空位被聚合酶填充。每个循环随机增加各种片段的长度，这取决于哪些多核苷酸彼此相遇。片段之间的互补性允许形成完整的大段双链DNA 306。
在PCA完成后，将纳米反应器与装置分开307，并且定位用于与具有PCR引物的装置相互作用308。在密封后，使纳米反应器经历PCR 309，并且扩增较大的核酸。在PCR 310之后，打开纳米室311，添加错误校正试剂312，将室密封313，并且发生错误校正反应以从双链PCR扩增产物中去除错配的碱基对和/或互补性差的链314。将纳米反应器打开并分开315。使错误校正的产物接下来经历另外的处理步骤，诸如PCR和分子条形码化，并且然后包装322用于运送323。
在一些情况下，采取质量控制措施。在错误校正后，质量控制步骤包括例如与具有用于扩增经错误校正的产物的测序引物的晶片相互作用316，将晶片密封至包含经错误校正的扩增产物的室317，以及进行另外一轮扩增318。打开纳米反应器319，并且将产物汇集320并且测序321。在作出可接受的质量控制确定后，经包装的产物322被批准运送323。
在一些情况下，使用本文公开的重叠引物对由工作流程诸如图3中的工作流程产生的核酸进行诱变。在一些情况下，通过在固体支持物上原位制备产生引物文库，并且利用单核苷酸延伸过程并行延伸多于一个寡聚体。沉积装置，诸如材料沉积装置，被设计为以逐步方式释放试剂，使得多于一个多核苷酸一次并行延伸一个残基，以产生具有预定核酸序列的寡聚体302。
计算机系统
本文描述的任何系统都可以可操作地链接至计算机，并且可以通过本地或远程计算机实现自动化。在各种情况下，本公开内容的方法和系统还可以包括计算机系统上的软件程序及其使用。因此，用于分配/真空/再填充功能的同步化诸如协调和同步材料沉积装置运动、分配动作和真空致动的计算机化控制都在本公开内容的范围内。计算机系统可以被编程为在用户指定的碱基序列与材料沉积装置的位置之间进行接合(interface)，以将正确的试剂递送至基底的指定区域。
图4中示出的计算机系统400可以理解为可以从介质411和/或网络端口405读取指令的逻辑设备，网络端口405可以任选地连接至具有固定介质412的服务器409。系统，诸如图4中示出的系统，可以包括CPU 401、磁盘驱动器403、任选的输入装置诸如键盘415和/或鼠标416以及任选的监视器407。可以通过指示的通信媒介实现到本地或远程位置的服务器的数据通信。通信媒介可以包括传输和/或接收数据的任何手段。例如，通信媒介可以是网络连接、无线连接或互联网连接。这样的连接可以提供通过万维网的通信。设想与本公开内容相关的数据可以通过这样的网络或连接传输，以供图4中示出的一方422接收和/或查看。
如图5中示出的，高速缓冲存储器504可以连接至处理器502或并入处理器502中，以提供用于由处理器502最近使用或频繁使用的指令或数据的高速存储器。处理器502通过处理器总线508连接至北桥506。北桥506通过存储器总线512连接至随机存取存储器(RAM)510，并且管理处理器502对RAM 510的访问。北桥506还通过芯片组总线516连接至南桥514。南桥514继而连接至外围总线518。外围总线可以是例如PCI、PCI-X、PCI Express或其他外围总线。北桥和南桥通常被称为处理器芯片组，并且管理处理器、RAM与外围总线518上的外围组件之间的数据传输。在一些可选的架构中，北桥的功能可以并入处理器中，而不是使用单独的北桥芯片。在一些情况下，系统500可以包括附接至外围总线518的加速器卡(accelerator card)522。加速器可以包括现场可编程门阵列(FPGA)或用于加速某些处理的其他硬件。例如，加速器可以用于自适应数据重构或评价扩展集合处理中使用的代数表达。
软件和数据存储在外部存储器524中，并且可以加载到RAM 510和/或高速缓存存储器504中用于由处理器使用。系统500包括用于管理系统资源的操作系统；操作系统的非限制性实例包括：Linux、WindowsTM、MACOSTM、BlackBerry OSTM、iOSTM和其他功能等同的操作系统，以及运行在操作系统之上的用于根据本公开内容的示例性实例管理数据存储和优化的应用软件。在该实例中，系统500还包括连接至外围总线的网络接口卡(NIC)520和521，用于向外部存储器诸如网络附接存储器(NAS)和可以用于分布式并行处理的其他计算机系统提供网络接口。
图6是示出具有多于一个计算机系统602a和602b、多于一个手机和个人数据助理602c以及网络附接存储器(NAS)604a和604b的网络600的图。在示例性实例中，系统602a、602b和602c可以管理数据存储并和优化数据访问，用于存储在网络附接存储(NAS)604a和604b中的数据。数学模型可以用于数据，并且使用跨越计算机系统602a和602b以及手机和个人数据助理系统602c的分布式并行处理来评价。计算机系统602a和602b以及手机和个人数据助理系统602c还可以提供并行处理，用于对存储在网络附接存储器(NAS)604a和604b中的数据进行自适应数据重构。图6仅示出了实例，并且可以结合本公开内容的各种实例使用各种各样的其他计算机架构和系统。例如，刀片服务器可以用于提供并行处理。处理器刀片可以通过背板连接，以提供并行处理。存储器也可以通过单独的网络接口连接至背板或作为网络附接存储器(NAS)。在一些示例性实例中，处理器可以维持单独的存储空间，并且通过网络接口、背板或其他连接器传输数据，以供其他处理器的并行处理。在其他情况下，一些或所有处理器可以使用共享虚拟地址存储空间。
图7是根据示例性实例使用共享虚拟地址存储空间的多处理器计算机系统700的框图。该系统包括可以访问共享存储器子系统704的多于一个处理器702a-f。该系统在存储器子系统704中并入了多于一个可编程硬件存储器算法处理器(MAP)706a-f。每个MAP706a-f可以包括存储器708a-f和一个或更多个现场可编程门阵列(FPGA)710a-f。MAP提供可配置的功能单元，并且特定的算法或算法的一部分可以被提供给FPGA 710a-f，用于与各自的处理器紧密协作进行处理。例如，MAP可以用于评估关于数据模型的代数表达式，并在示例性实例中执行自适应数据重构。在这个实例中，出于这些目的，所有处理器都可以全局访问每个MAP。在一种配置中，每个MAP可以使用直接存储器访问(DMA)来访问相关的存储器708a-f，这允许其独立于各自的微处理器702a-f并与其异步地执行任务。在这种配置中，MAP可以将结果直接馈送到另一个MAP，用于流水线操作和算法的并行执行。
以上计算机体系架构和系统仅是实例，并且多种其他计算机、手机和个人数据助理架构和系统可以结合示例性实例使用，包括使用通用处理器、协处理器、FPGA和其他可编程逻辑装置的任何组合的系统、芯片上系统(SOC)、专用集成电路(ASIC)以及其他处理和逻辑元件。在一些情况下，计算机系统的全部或部分可以用软件或硬件来实现。任何种类的数据存储介质都可以与示例性实例结合使用，包括随机存取存储器、硬盘驱动器、闪存、磁带驱动器、磁盘阵列、网络附接存储器(NAS)以及其他本地或分布式数据存储装置和系统。
在示例性实例中，计算机系统可以使用在任何以上或其他体系架构和系统上执行的软件模块来实现。在其他情况下，系统的功能可以部分或完全在固件、可编程逻辑装置诸如图5中提及的现场可编程门阵列(FPGA)、芯片上系统(SOC)、专用集成电路(ASIC)或其他处理和逻辑元件中实现。例如，集合处理器和优化器可以通过使用硬件加速器卡，诸如图5中所示的加速器卡522，以硬件加速来实现。
阐述以下实施例是为了向本领域技术人员更清楚地说明本文公开的实施方案的原理和实践，并且不应被解释为限制任何要求保护的实施方案的范围。除非另有说明，否则所有部分和百分比均基于重量。
实施例
以下实施例是为了说明本公开内容的各种实施方案而提供，并不意味着以任何方式限制本公开内容。本发明实施例以及本文描述的方法目前代表优选实施方案，是示例性的，并且不意图作为对本公开内容范围的限制。本领域技术人员将会想到其中的变化和其他用途，其包含在由权利要求书的范围限定的本公开内容的精神内。
实施例1：装置表面的官能化
将装置官能化以支持多核苷酸文库的附接和合成。首先使用包含90％ H2SO4和10％ H2O2的食人鱼溶液(piranha solution)湿清洗装置表面20分钟。在几个烧杯中用DI水冲洗装置，在DI水鹅颈式水龙头下保持5min，并且用N2干燥。随后将该装置浸泡在NH4OH(1:100；3mL:300mL)中5min，使用手持式喷枪(handgun)用DI水冲洗，在三个连续的烧杯中用DI水浸泡各1min，并且然后使用手持式喷枪再次用DI水冲洗。然后通过将装置表面暴露于O2对装置进行等离子体清洗。使用SAMCO PC-300仪器在下游模式下以250瓦进行等离子体蚀刻O2持续1min。
将经清洗的装置表面使用YES-1224P气相沉积烘箱系统用以下参数，用包含N-(3-三乙氧基甲硅烷基丙基)-4-羟基丁酰胺的溶液进行主动官能化：0.5托至1托，60min，70℃，135℃蒸发器。将装置表面使用Brewer Science 200X旋转涂覆器涂覆抗蚀剂。将SPRTM3612光致抗蚀剂以2500rpm持续40秒旋转涂覆在装置上。将装置在Brewer热板上在90℃预烘烤30min。使用Karl Suss MA6掩模对准仪对装置进行光刻术。将装置曝光2.2秒并在MSF 26A中显影1min。用手持式喷枪冲洗剩余的显影剂，并将装置在水中浸泡5min。将装置在烘箱中在100℃烘烤30min，随后使用Nikon L200目视检查蚀刻术缺陷。使用清除工艺(descumprocess)用SAMCO PC-300仪器以250瓦进行O2等离子体蚀刻1min，来去除残余抗蚀剂。
用与10μL轻质矿物油混合的100μL全氟辛基三氯硅烷溶液将装置表面钝化官能化(passively functionalize)。将装置放置在室中，泵送10min，并且然后关闭泵的阀门，并静置10min。将室通向空气。通过在70℃在500mL NMP中进行两次浸泡5min，伴随以最大功率的超声波处理(在Crest系统上为9)，对装置进行抗蚀剂剥离。然后将装置在室温在500mL异丙醇中浸泡5min，伴随以最大功率的超声波处理。将装置浸入300mL的无水乙醇(200proofethanol)中，并用N2吹干。官能化的表面被活化用作多核苷酸合成的支持物。
实施例2：在寡核苷酸合成装置上合成50-mer序列
将二维寡核苷酸合成装置组装到流动池中，该流动池连接至流动池(AppliedBiosystems“ABI394 DNA Synthesizer”)。将二维寡核苷酸合成装置用N-(3-三乙氧基甲硅烷基丙基)-4-羟基丁酰胺(Gelest)均匀官能化，以使用本文描述的多核苷酸合成方法合成50bp的示例性多核苷酸(“50-mer多核苷酸”)。
50-mer的序列如SEQ ID NO.:2中描述。5'AGACAATCAACCATTTGGGGTGGACAGCCTTGACCTCTAGACTTCGGCAT##TTTTTTT TTT3'(SEQ ID NO.:2)，其中#表示胸苷-琥珀酰己酰胺CED亚磷酰胺(CLP-2244，来自ChemGenes)，其是可裂解的接头，能够在脱保护期间从表面释放寡核苷酸。
根据表3中的方案和ABI合成仪，使用标准DNA合成化学(偶联、加帽、氧化和脱封闭)进行合成。
表3：合成方案
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亚磷酰胺/活化剂组合以类似于通过流动池递送本体试剂(bulk reagent)的方式递送。没有进行干燥步骤，因为环境在整个时间内用试剂保持“湿润”。
将限流器从ABI 394合成仪中移除，以实现更快的流动。在没有限流器的情况下，酰胺类(amidites)(在ACN中的0.1M)、活化剂(在ACN中的0.25M苯甲酰基硫代四唑(“BTT”；30-3070-xx，来自GlenResearch)和Ox(在20％吡啶、10％水和70％ THF中的0.02M I2)的流量大致为～100uL/sec，乙腈(“ACN”)和加帽试剂(1:1的CapA和CapB混合物，其中CapA是在THF/吡啶中的乙酸酐，并且CapB是在THF中的16％1-甲基咪唑)的流量大致为～200uL/sec，并且脱封闭剂(在甲苯中的3％二氯乙酸)的流量大致为～300uL/sec(相比之下，在有限流器的情况下，所有试剂的流量均为约50uL/秒)。观察完全推出氧化剂的时间，相应地调整化学物质流动时间的定时，并且在不同化学物质之间引入额外的ACN洗涤。在多核苷酸合成后，将芯片在75psi的气态氨中脱保护过夜。向表面施加五滴水以回收多核苷酸。然后在BioAnalyzer小RNA芯片上分析回收的多核苷酸。
实施例3：在寡核苷酸合成装置上合成100-mer序列
使用与实施例2中描述的合成50-mer序列相同的方法在两个不同的硅芯片上合成100-mer多核苷酸(“100-mer多核苷酸”：5’CGGGATCCTTATCGTCATCGTCGTACAGATCCCGACCCATTTGCTGTCCACCAGTCATGCT AGCCATACCATGATGATGATGATGATGAGAACCCCGCAT##TTTTTTTTTT3’，其中#表示胸苷-琥珀酰己酰胺CED亚磷酰胺(CLP-2244，来自ChemGenes)；SEQ ID NO.:3)，第一个硅芯片用N-(3-三乙氧基甲硅烷基丙基)-4-羟基丁酰胺均匀官能化，并且第二个硅芯片用11-乙酰氧基十一烷基三乙氧基硅烷和n-癸基三乙氧基硅烷的5/95混合物官能化，并且在BioAnalyzer仪上分析从表面提取的多核苷酸。
来自两个芯片的所有10个样品使用正向引物(5'ATGCGGGGTTCTCATCATC3'；SEQ IDNO.:4)和反向引物(5'CGGGATCCTTATCGTCATCG3'；SEQ ID NO.:5)在50uL PCR混合物(25uLNEB Q5主混合物、2.5uL 10uM正向引物、2.5uL 10uM反向引物、1uL从表面提取的多核苷酸、和补至50uL的水)中进一步PCR，使用以下热循环程序：
98℃，30sec
98℃，10sec；63℃，10sec；72℃，10sec；重复12个循环
72℃，2min
PCR产物也在BioAnalyzer上运行，在100-mer位置显示出锐峰。接下来，克隆PCR扩增的样品，并进行Sanger测序。表4总结了从芯片1的点1-5采集的样品和从芯片2的点6-10采集的样品的Sanger测序结果。
表4：测序结果
点 错误率 循环效率
1 1/763bp 99.87％
2 1/824bp 99.88％
3 1/780bp 99.87％
4 1/429bp 99.77％
5 1/1525bp 99.93％
6 1/1615bp 99.94％
7 1/531bp 99.81％
8 1/1769bp 99.94％
9 1/854bp 99.88％
10 1/1451bp 99.93％
因此，合成的多核苷酸的高质量和一致性在具有不同表面化学的两个芯片上重复。总之，89％的测序的100-mer是没有错误的完美序列，对应于262个中的233个。
表5总结了从来自点1-10的多核苷酸样品获得的序列的错误特征。
表5：错误特征
实施例4：抗体支架的设计
为了产生支架，进行了重链结构分析、库测序分析和异源二聚体高通量测序数据集的特异性分析。每个重链与每个轻链支架关联。将每个重链支架分配5个不同的长CDRH3环选项。将每个轻链支架分配5个不同的L3支架。重链CDRH3茎选自存在于跨越个体和跨越V-基因片段两者中通常观察到的长H3环茎(N末端和C末端上的10个氨基酸)。轻链支架L3选自包含长H3的异源二聚体。使用基于来自蛋白数据库(PDB)和深度测序数据集的信息的直接异源二聚体，其中CDR H1、H2、L1、L2、L3和CDRH3茎是固定的。然后将多种支架格式化以在噬菌体上展示，以评估表达。
结构分析
分析了约2,017个抗体结构，从其中观察到具有至少25个氨基酸长度的长CDRH3的22个结构。重链包括以下：IGHV1-69，IGHV3-30，IGHV4-49和IGHV3-21。鉴定出的轻链包括以下：IGLV3-21、IGKV3-11、IGKV2-28、IGKV1-5、IGLV1-51、IGLV1-44和IGKV1-13。在分析中，多次观察到四种异源二聚体组合包括：IGHV4-59/61-IGLV3-21、IGHV3-21-IGKV2-28、IGHV1-69-IGKV3-11和IGHV1-69-IGKV1-5。对序列和结构的分析鉴定出了一些结构中的CDRH3内二硫键，其中在茎中堆积了大的侧链，诸如酪氨酸，为长H3稳定性提供了支持。还观察到二级结构，包括β-转角-β片层和“锤头”亚结构域。
库分析
对通过无偏倚5’RACE从12名健康对照获得的1,083,875个IgM+/CD27-初始B细胞受体(BCR)序列和1,433,011个CD27+序列进行了库分析。12名健康对照包括相等数目的男性和女性，并且由4名高加索个体、4名亚洲个体和4名西班牙裔个体构成。库分析显示，小于1％的人类库包含具有比21个氨基酸长的CDRH3的BCR。在长CDR3亚库中观察到V基因偏倚，其中IGHV1-69、IGHV4-34、IGHV1-18和IGHV1-8在具有长H3环的BCR中显示出偏好富集。观察到IGHV3-23、IGHV4-59/61、IGHV5-51、IGHV3-48、IGHV3-53/66、IGHV3-15、IGHV3-74、IGHV3-73、IGHV3-72和IGHV2-70对长环的偏倚。显示IGHV4-34支架是自身反应性的，并且具有短的半衰期。
还基于5’RACE参考库设计了用于长环的可行的N末端和C末端CDRH3支架变异。观察到约81,065个氨基酸长度为22个氨基酸或更长的CDRH3。通过跨V基因支架的比较，避免了支架特异性H3茎变异，以便允许支架多样性克隆到多个支架参考中。
异源二聚体分析
对支架进行异源二聚体分析。测定支架的变体序列和长度。
结构分析
使用变体序列的GPCR支架进行结构分析，并且测定长度。
实施例5：GPCR抗体文库的产生
基于GPCR-配体相互作用表面和支架布置，设计并且从头合成文库。参见实施例4。对于重链可变结构域设计了10个变体序列，对于重链互补决定区3设计了237个变体序列，并且对于轻链可变结构域设计了44个变体序列。遵循与实施例1-3中描述的类似方法，将片段合成为三个片段。
在从头合成之后，对于重链可变结构域产生10个变体序列，对于重链互补性决定区3产生236个变体序列，并且对于包含轻链可变结构域和CDRL3的区设计43个变体序列，并且其中对于轻链可变结构域设计9个变体。这产生了具有约105种多样性(10×236×43)的文库。这通过使用下一代测序(NGS)用1600万个读段得到确认。
然后测试各种轻链和重链的表达和蛋白折叠。重链可变结构域的10个变体序列包括以下：IGHV1-18、IGHV1-69、IGHV1-8 IGHV3-21、IGHV3-23、IGHV3-30/33rn、IGHV3-28、IGHV3-74、IGHV4-39和IGHV4-59/61。在10个变体序列中，IGHV1-18、IGHV1-69和IGHV3-30/33rn表现出改进的特征，诸如改进的热稳定性。轻链可变结构域的9个变体序列包括以下：IGKV1-39、IGKV1-9、IGKV2-28、IGKV3-11、IGKV3-15、IGKV3-20、IGKV4-1、IGLV1-51和IGLV2-14。在9个变体序列中，IGKV1-39、IGKV3-15、IGLV1-51和IGLV2-14表现出改进的特征，诸如改进的热稳定性。
实施例6：GPCR文库
本实施例描述了GPCR文库的产生。
材料和方法
稳定细胞系和噬菌体文库的产生
将克隆到pCDNA3.1(+)载体(ThermoFisher)中的具有N末端FLAG标签和C末端GFP标签的全长人类GLP-1R基因(UniProt-P43220)转染到悬浮的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中，以产生表达GLP-1R的稳定细胞系。通过FACS确认了靶表达。然后通过GFP>80％表达GLP-1R的细胞直接用于基于细胞的选择。
种系重链IGHV1-69、IGHV3-30和种系轻链IGKV1-39、IGKV3-15、IGLV1-51、IGLV2-14框架组合用于GPCR聚焦噬菌体展示文库，并且所有六种CDR多样性由类似于以上实施例1-3合成的寡核苷酸池编码。还对CDR进行了筛选，以确保它们不包含可制造性缺陷、隐蔽剪接位点或常用的核苷酸限制性位点。重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)通过(G4S)3接头连接。通过NotI限制性消化将所得scFv(VH-接头-VL)基因文库克隆到pADL 22-2c(AntibodyDesign Labs)噬菌体展示载体中，并且电穿孔到TG1电感受态大肠杆菌(E.coli)细胞中。(Lucigen)。最终的文库具有大小为1.1×1010的多样性，这通过NGS得到验证。
用于分离激动剂GLP-1R scFv克隆的淘选和筛选策略
在淘选表达GLP-1R的CHO细胞之前，用5％ BSA/PBS封闭噬菌体颗粒，并且耗尽CHO亲本细胞上的非特异性结合物。对于CHO亲本细胞的耗尽，将输入噬菌体等分试样与1×108个CHO亲本细胞在室温(RT)以14rpm/min旋转1小时。然后将细胞通过在台式Eppendorf离心机5920RS/4x1000转子中以1,200rpm离心10min进行沉淀，以耗尽非特异性CHO细胞结合物。然后将耗尽CHO细胞结合物的噬菌体上清液转移至1×108个表达GLP-1R的CHO细胞中。将噬菌体上清液和表达GLP-1R的CHO细胞在RT以14rpm/min旋转1小时，以选择GLP-1R结合物。在孵育后，将细胞用1×PBS/0.5％ Tween洗涤几次，以去除非结合克隆。为了洗脱与GLP-1R细胞结合的噬菌体，将细胞与胰蛋白酶在PBS缓冲液中在37℃孵育30分钟。将细胞通过以1,200rpm离心10min进行沉淀。将富集GLP-1R结合克隆的输出上清液在TG1大肠杆菌细胞中扩增，以用作下一轮选择的输入噬菌体。将这种选择策略重复五轮。每一轮针对CHO亲本背景进行耗尽。来自一轮的扩增的输出噬菌体被用作随后轮的输入噬菌体，并且在每一随后轮的选择中，增加洗涤的严格性，伴随更多的洗涤。在五轮选择后，对来自第4轮和第5轮的每一轮的500个克隆进行Sanger测序，以鉴定独特克隆。
下一代测序分析
从所有淘选轮的输出细菌储备液中小提(miniprep)噬菌粒DNA。使用正向引物ACAGAATTCATTAAAGAGGAGAAATTAACC和反向引物TGAACCGCCTCCACCGCTAG从噬菌粒DNA中PCR扩增可变重链(VH)。使用KAPA HyperPlus文库制备试剂盒(Kapa Biosystems，产品号KK8514)将PCR产物直接用于文库制备。为了添加文库的多样性，将样品掺入购自Illumina,Inc.(产品号FC-110-3001)的15％ PhiX Control。然后将文库装载到Illumina的600循环MiSeq试剂盒v3(Illumina，产品号MS-102-3003)上，并且在MiSeq仪上运行。
重新格式化和高通量(HT)IgG纯化
使用Expifectamine(ThermoFisher,A14524)用以2:1比例的重链和轻链DNA转染Expi293细胞，并且在转染后4天，在细胞存活力降至80％以下之前收获上清液。使用具有蛋白A磁珠的King Fisher(ThermoFisher)或Phynexus蛋白A柱吸头(Hamilton)进行纯化。对于在体内小鼠研究中评价的IgG克隆的大规模产生，使用Akta HPLC纯化系统(GE)。
IgG表征和质量控制。通过LabChip GXII Touch HT蛋白表达高灵敏度测定对阳性GLP-1R结合物(命中者(hit))的纯化IgG进行纯度表征。使用二硫苏糖醇(DTT)将IgG还原为VH和VL。使用Lunatic(UnChain)测量IgG浓度。用于体内小鼠研究的IgG通过HPLC进一步表征，并且测试内毒素水平(nexgen-PTSTMEndotoxin Testing,Charles River)，每kg给药少于5EU。
结合测定和流式细胞术
将GLP-1R IgG克隆在偶联至流式细胞术分析的结合测定中测试如下：将表达FLAG-GLP-1R-GFP的CHO细胞(CHO-GLP-1R)和CHO-亲本细胞与100nM IgG在冰上孵育1h，洗涤三次，并且与Alexa 647缀合的山羊抗人类抗体(1:200)(Jackson ImmunoResearchLaboratories,109-605-044)在冰上孵育30min，随后三次洗涤，在每次洗涤步骤之间离心以使细胞沉淀。所有孵育和洗涤都在包含PBS+1％ BSA的缓冲液中进行。对于滴定，IgG从100nM开始以1:3向下系列稀释至0.046nM。通过流式细胞术分析细胞，并且通过测量GFP信号与Alexa 647信号来鉴定命中者(命中者是特异性结合CHO-GLP-1R的IgG)。将用100nMIgG结合测定的流式细胞术数据呈现为点图。将用IgG滴定结合试验的分析呈现为绘制IgG浓度与MFI(平均荧光强度)的结合曲线。
配体竞争测定
配体竞争测定包括将原代IgG与1μM GLP-1(7-36)共孵育。对于每个数据点，在流式缓冲液(PBS+1％ BSA)中制备IgG(600nM)，并且以1:3向下稀释8个滴定点。用流式缓冲液(PBS+1％ BSA)类似地制备肽GLP-1 7-36(2μM)。每个孔包含100,000个细胞，向其中添加50μL IgG和50μL肽(＝正)或没有肽的单独的缓冲液(＝负)。将细胞和IgG/肽混合物在冰上孵育1hr，并且在洗涤后，添加在PBS+1％ BSA中以1:200稀释的二抗(山羊抗人类APC，JacksonImmunoResearch Laboratories，产品号109-605-044)。将其在冰上孵育30min(每孔50μL)，然后洗涤并且重悬在60μL缓冲液中。最后，在IQue3Screener上以每孔4秒的速率测量测定读出。
结果
基于GPCR结合基序和GPCR抗体的聚焦GPCR的抗体文库的设计
分析所有已知的GPCR相互作用，包括GPCR与配体、肽、抗体、内源性胞外环和小分子的相互作用，以对GPCR结合分子决定簇作图。使用与大约50个GPCR(http://www.gpcrdb.org)的ECD结合的近150个肽、配体或抗体的晶体结构来鉴定GPCR结合基序。从该分析中提取了超过1000个GPCR结合基序。此外，通过分析GPCR的所有解析结构(zhanglab.ccmb.med.umich.edu/GPCR-EXP/)，鉴定了来自GPCR的内源性胞外环的超过2000个结合基序。最后，通过分析与GPCR结合的超过100个小分子配体的结构，鉴定了可能能够重演这些配体的许多结构接触的5个氨基酸(Tyr、Phe、His、Pro和Gly)的减少的氨基酸文库。具有这种减少的氨基酸多样性的亚文库被放置在CxxxxxC基序内。总计鉴定了超过5000个GPCR结合基序(图9A-图9E)。这些结合基序被放置在五个不同的茎区之一中：CARDLRELECEEWTxxxxxSRGPCVDPRGVAGSFDVW、CARDMYYDFxxxxxEVVPADDAFDIW、CARDGRGSLPRPKGGPxxxxxYDSSEDSGGAFDIW、CARANQHFxxxxxGYHYYGMDVW、CAKHMSMQxxxxxRADLVGDAFDVW。
这些茎区选自具有超长HCDR3的结构抗体。特别地选择抗体种系来耐受这些超长HCDR3。对具有比21个氨基酸长的人类抗体的结构和序列分析揭示了具有长CDR3的抗体中的V基因偏倚。最后，基于该分析选择了种系IGHV(IGHV1-69和IGHV3-30)、IGKV(IGKV1-39和IGKV3-15)和IGLV(IGLV1-51和IGLV2-14)基因。
除了HCDR3多样性，其他5个CDR中也引入了有限的多样性。IGHV1-69结构域中存在416个HCDR1和258个HCDR2变体；在IGHV3-30结构域中存在535个HCDR1和416个HCDR2变体；在IGKV1-39结构域中存在490个LCDR1、420个LCDR2和824个LCDR3变体；在IGKV3-15结构域中存在490个LCDR1、265个LCDR2和907个LCDR3变体；在IGLV1-51结构域中存在184个LCDR1、151个LCDR2和824个LCDR3变体；在IGLV2-14结构域中存在967个LCDR1、535个LCDR2和922个LCDR3变体(图10)。这些CDR变体是通过比较种系CDR与在12个人类供者中至少2个的V基因库中的CDR中观察到的单突变、双突变和三突变的近种系空间来选择的。所有CDR都被预先筛选，以去除可制造性缺陷、隐蔽剪接位点或核苷酸限制性位点。将CDR合成为寡核苷酸池，并且并入选择的抗体支架中。重链(VH)和轻链(VL)基因通过(G4S)3接头连接。将所得scFv(VH-接头-VL)基因池克隆到噬菌粒展示载体中的M13基因-3次要外壳蛋白(M13 gene-3minor coat protein)N末端处。GPCR文库的最终大小为1×1010的scFv格式。对最终噬菌体文库进行下一代测序(NGS)，以分析文库中的HCDR3长度分布，用于与来自三名健康成人供者的B细胞群体中的HCDR3长度分布进行比较。所使用的来自三名健康供者的HCDR3序列来源于公共可用的数据库，该数据库具有超过3700万个B细胞受体序列31。GPCR文库中的HCDR3长度比该B细胞库序列中观察到的HCDR3长度长得多。平均而言，GPCR文库中的中位数HCDR3长度(显示双相分布模式)比天然B细胞库序列中观察到的中位数长度(15个至17个氨基酸)长两倍或三倍(33个至44个氨基酸)(图11)。HCDR3在GPCR文库中的双相长度分布主要是由用于呈现HCDR3内的基序的两组茎(8aa、9aaxxxxx10aa、12aa)和(14aa、16aaxxxxx18aa、14aa)引起的。
实施例7：VHH文库
开发了合成的VHH文库。对于具有定制CDR多样性的‘VHH比率’文库，使用ClustalOmega对2391个VHH序列(iCAN数据库)进行比对，以确定每个位置处的共有序列(consensus)，并且框架来源于每个位置处的共有序列。分析所有2391个序列的CDR的位置特异性变异，并且在文库设计中引入这种多样性。对于具有混编的CDR多样性的‘VHH混编’文库，扫描iCAN数据库以寻找纳米抗体序列中的独特CDR。鉴定出1239个独特CDR1、1600个独特CDR2和1608个独特CDR3，并且框架来源于iCAN数据库中的2391个序列之间每个框架位置处的共有序列。单独合成每个独特CDR，并在共有序列框架中进行混编，以产生理论多样性为3.2×109的文库。然后使用限制性酶消化将文库克隆到噬菌粒载体中。对于‘VHH h混编’文库(具有混编的CDR多样性的合成“人类”VHH文库)，扫描iCAN数据库以寻找纳米抗体序列中的独特CDR。鉴定出1239个独特CDR1、1600个独特CDR2和1608个独特CDR3，并且框架1、3和4来源于人类种系DP-47框架。框架2来源于iCAN数据库中的2391个序列之间每个框架位置处的共有序列。单独合成每个独特CDR，并使用NUGE工具在部分人源化框架中进行混编，以产生理论多样性为3.2×109的文库。然后使用NUGE工具将文库克隆在噬菌粒载体中。
使用Carterra SPR系统来评估VHH-Fc变体的结合亲和力和亲和力分布。VHH-Fc对TIGIT显示出一系列亲和力，低端为12nM KD，并且高端为1685nM KD(数据未示出)。图12提供了VHH-Fc克隆的ELISA、蛋白A(mg/ml)和KD(nM)的具体值。
实施例8.A2A受体的超免疫免疫球蛋白文库
使用如实施例7中描述的类似方法产生超免疫免疫球蛋白(IgG)文库。简言之，超免疫IgG文库是从分析人类初始和记忆B细胞受体序列(这些序列由来自3名健康供者中每一个的多于3700万个独特IgH序列组成)数据库中产生的。从分析中收集了多于200万个CDRH3序列，并且使用类似于实施例1-3的方法单独构建。将CDRH3序列并入实施例9中描述的VHH h混编文库中。最终的文库多样性被确定为1.3×1010。设计的示意图可以参见图13。
88个独特克隆中的73个具有超过亲本细胞2倍的靶细胞MFI值。88个独特克隆中的15个具有超过亲本细胞20倍的靶细胞MFI值。腺苷A2A受体变体A2AR-90-007的数据参见图14A-图14B。
本实施例显示了具有高亲和力和亚纳摩尔范围内的KD值的A2AR的VHH文库的产生。
实施例9.具有不同CDR的GPCR文库
使用CDR随机化方案产生GPCR文库。
简言之，GPCR文库是基于GPCR抗体序列设计的。分析了超过60种不同的GPCR抗体，并且使用CDR随机化方案修饰了来自这些GPCR的序列。
重链IGHV3-23设计参见图15A。如图15A中所见，IGHV3-23 CDRH3具有四种不同的长度：23个氨基酸、21个氨基酸、17个氨基酸和12个氨基酸，每个长度具有其残基多样性。四个长度的比率如下：长度为23个氨基酸的CDRH3为40％、长度为21个氨基酸的CDRH3为30％、长度为17个氨基酸的CDRH3为20％、并且长度为12个氨基酸的CDRH3为10％。CDRH3多样性确定为9.3×108，并且全重链IGHV3-23多样性为1.9×1013。
重链IGHV1-69设计参见图15B。如图15B中所见，IGHV1-69 CDRH3具有四种不同的长度：20个氨基酸、16个氨基酸、15个氨基酸和12个氨基酸，每个长度具有其残基多样性。四个长度的比率如下：长度为20个氨基酸的CDRH3为40％、长度为16个氨基酸的CDRH3为30％、长度为15个氨基酸的CDRH3为20％、并且长度为12个氨基酸的CDRH3为10％。CDRH3多样性确定为9×107，并且全重链IGHV-69多样性为4.1×1012。
轻链IGKV 2-28和IGLV 1-51的设计参见图15C。分析抗体轻链CDR序列的位置特异性变异。选择了具有固定CDR长度的两种轻链框架。κ链和轻链的理论多样性分别为13800和5180。
最终的理论多样性被确定为4.7×1017，并且最终产生的Fab文库具有6×109的多样性。参见图15D。
实施例10.具有不同CDR的腺苷A2A受体文库
使用实施例9中类似描述的CDR随机化方案产生腺苷A2A受体文库。
简言之，腺苷A2A受体文库是基于GPCR抗体序列设计的。分析了超过60种不同的GPCR抗体，并且使用CDR随机化方案修饰了来自这些GPCR的序列。将使用CDR随机化方案设计的腺苷A2A受体变体IgG纯化并测定，以确定基于细胞的亲和力测量值并且用于功能分析。
实施例11.A2A变异免疫球蛋白
在多种功能测定中测定了产生的A2AR变体免疫球蛋白。
首先，将A2AR免疫球蛋白scFv噬菌体文库在细胞和固定的A2a蛋白上淘选，并且进行筛选。来自每轮选择的输出噬菌体数目参见表7-表8。
表7.
表8.
实施例12.筛选抗体结合
测定来自表15-表18中列出的组中选择的A2AR免疫球蛋白与表中列出的靶的结合。
HEK293-A2a细胞
使用100nM IgG产生显示使用来自变体文库的免疫球蛋白与HEK293-A2a细胞结合的流式细胞术数据，并且与在亲本细胞中检测到的结合进行比较。使用来自免疫文库的变体的结合示于图16A-图16N中。对照示于图16O中，显示细胞与人类腺苷A2aR单克隆抗体(MAB9497)的结合。以从100nM开始滴定的浓度评估选择的变体的结合。所得曲线示于图17A-图17H中。用IgG浓度与MFI(平均荧光强度)绘制结合曲线。使用来自小鼠免疫文库的变体的结合示于图18A-图18N中。对照示于图18O中，显示细胞与人类腺苷A2aR单克隆抗体(MAB9497)的结合。以从100nM开始滴定的浓度评估选择的变体的结合。所得曲线示于图19A-图19G中。用IgG浓度与MFI(平均荧光强度)绘制结合曲线。
蛋白结合
在从100nM滴定中测定来自表15-表18的纯化的A2a免疫球蛋白的结合。选择的变体的结果示于图20A-图20G中。
实施例13.cAMP测定中的激动剂响应
根据制造商的说明，以384孔形式使用2500个细胞/孔使用cAMP测定进行激动剂剂量响应测定。在室温用NECA和CGS21680进行细胞刺激持续30min。在EnVision板阅读器上以激光模式读取读数。数据示于图21中。用至少16个背景信号点和16个最大信号点计算NECA的Z’因子(Z’＝0.80)。NECA的计算的EC50(M)＝2.7×10-7，并且CGS21680的计算的EC50(M)＝4.3×10-7。
实施例14.cAMP测定中的拮抗剂响应
根据制造商的说明，以384孔形式使用2500个细胞/孔和1μM NECA(参考激动剂)使用cAMP测定进行拮抗剂剂量响应测定。在室温用ZM241385进行细胞刺激持续30min。在EnVision板阅读器上以激光模式读取读数。数据示于图22中。ZM241385的计算的IC50(M)＝1.25×10-5。
实施例15.A2A cAMP拮抗剂滴定
根据制造商的说明，将细胞以3000个/孔铺板，并且在室温与固定的100nM IgG预孵育1hr，随后在室温用NECA滴定刺激持续30min。缓冲液是PBS+0.1％ BSA+0.5mM IBMX。结果示于图23中。绝对IC50示于表9中，指示A2A-1是负别构调节剂。
表9.
+无Ab A2A-1 R&D对照抗体
IC50 0.03040 0.2816 2.253
实施例16.别构cAMP测定
测定A2A-1和A2A-9的别构调节。将细胞与滴定的IgG在室温预孵育1hr，随后用固定的NECA浓度刺激。结果示于图24中。IC50值示于表10中，指示A2A-1是负别构调节剂。
表10.
A2A-1 A2A-9 R&D对照抗体
绝对IC50 1.833 4.106 9.432
实施例17.cAMP别构A2A Perkin Elmer
如实施例15中描述测定A2A-9。所得响应曲线示于图25中。A2A-9的计算的IC50示于表11中。
表11.
A2A-9 R&D对照抗体 无抗体
绝对IC50 ～0.4513 ～0.5126 ～0.2556
实施例18.A2A cAMP拮抗剂滴定
如实施例16中描述测定A2A-9。所得响应曲线示于图26中。计算的IC50值示于表12中。结果表明A2A-9是拮抗剂。
表12.
A2A-9 R&D对照抗体
绝对IC50 4.106 9.432
实施例19.A2A拮抗cAMP测定
测定选择的变体与靶的结合。将免疫球蛋白以一式三份滴定，并且在细胞上孵育1小时，随后与0.5μM NECA孵育30分钟。显示在665nm/615nm处的相对荧光单位(RFU)比率与对数标度的nM IgG的结合曲线示于图27A-图27C中。最终结合研究在产生的文库中发现了功能抗体，如表13和表14中列出的。
表13.
靶 文库 重新格式化 功能
HEK293-A2a细胞 小鼠免疫 14
A2a蛋白 人源化合成 95 2
A2a蛋白+ZM241385 人源化合成 95 3
A2a蛋白 小鼠免疫 12 1
A2a蛋白+ZM241385 小鼠免疫 22 0
表14.
靶 文库 重新格式化 功能
HEK293-A2a细胞 免疫 14
A2a蛋白 合成 95 2
A2a蛋白+ZM241385 合成 95 5
A2a蛋白 免疫 29 4
A2a蛋白+ZM241385 免疫 10 5
实施例20.A2AR细胞功能cAMP测定
使用A2A细胞系进行别构和拮抗cAMP测定。
简言之，将细胞与100nM的抗A2AR抗体预孵育，随后进行从100uM开始3X滴定的NECA刺激。来自功能别构cAMP测定的数据参见图28A-图28C。ZM241385作为拮抗剂发挥作用。“无Ab”仅作为激动剂发挥作用。
对于功能拮抗cAMP测定，将细胞与从100nM开始3X滴定的抗A2AR抗体预孵育，随后以0.5uM NECA刺激。数据参见图29A-29C。还将细胞与从100nM开始3X滴定的抗A2AR抗体预孵育，随后以10uM NECA刺激。数据参见图30A-图30C。
基于这些数据，对于NECA滴定、IgG滴定(NECA 0.5uM)和IgG滴定(NECA 10uM)，A2AR变体A2A-17、A2A-19、A2A-24、A2A-26和A2A-27在cAMP测定中表现出改进的功能。
实施例21.T细胞活化测定
发现根据前述实施例开发的变体A2A-77是hA2a的高亲和力结合物(图31A)。A2A-77在体外被确定为功能拮抗剂(图31B)并且在体外具有高特异性(图31C)。发现A2A-77与具有表达A2AR的细胞(包括T细胞、NK细胞、树突状细胞和巨噬细胞)的食蟹猴PBMC结合(图31D)。进行了进一步的研究以确定在T细胞活化测定中的作用。
简言之，在37℃将每孔2×105个PBMC与从100nM开始滴定的拮抗剂ZM-241385或A2aR免疫球蛋白一起孵育30分钟，随后在37℃用1μM的A2AR激动剂NECA处理30分钟。然后将细胞用涂覆有抗CD3ε/CD28抗体的磁珠活化。在孵育3天后，收集上清液用于检测IFN-g释放并且评价T细胞活化。ZM-241385是有效的，并且用作选择性小分子A2A拮抗剂对照。
数据参见图32A-图32H。如图32A-图32B中所见，用变体A2A-81、A2A-51、2A-53、A2A-77、A2A-31和A2A-78观察到T细胞活化。进一步观察到A2A-77具有5.92nM的IC50(图32C)。图32D-图32G中的数据显示，在使用更多NECA抑制T细胞活化时，A2A-77和A2A-81不能像在低NECA中那样恢复T细胞活化。A2A-51在高NECA中仍然效果良好。
本实施例表明A2A-77是A2AR功能拮抗剂，阻断免疫抑制。
实施例22.示例性序列
表15.可变重链CDR
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表16.可变轻链CDR
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表17.可变重链序列
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表18.可变轻链
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实施例23：A2A-77和A2A-81的体内细胞分析
细胞结合测定
评估A2A-77和A2A-81在从100nM开始滴定的浓度的结合。所得曲线示于图33A中，并且结果示于表19中。用IgG浓度与MFI(平均荧光强度)绘制结合曲线。A2A-77和A2A-81两者都是hA2a受体的高亲和力结合物。
表19
A2A-77 A2A-81 对照A2A
IC50 6.436 6.813 8.723
A2A拮抗cAMP测定
将免疫球蛋白以一式三份滴定，并且在细胞上孵育1小时，随后与0.5μM NECA孵育30分钟。显示在665nm/615nm处的相对荧光单位(RFU)比率与对数标度的nM IgG的结合曲线示于图33B中。绝对IC50示于表20中，指示A2A-77和A2A-81在体外是功能拮抗剂。
表20
A2A-77 A2A-81
IC50 3.53 8.67
交叉反应性
测定A2A-77和A2A-81与HA1、hA2b、hA3和mA2受体的交叉反应性。结果描绘于图33C中。A2A-77和A2A-81两者均显示出体外特异性。
原代T细胞活化测定
如以上描述进行原代T细胞活化测定。数据参见图33D和表21。用变体A2A-77和A2A-81观察到T细胞活化。A2A-81显示出相比于A2A-77改进的活性。
表21
A2A-77 A2A-81
EC50 5.92 1.71
实施例24：结肠癌模型的体内研究
将带有人类结肠癌(Colo205)的小鼠分为4组。第1组是同种型对照，第2组小鼠用抗PD1治疗，第3组小鼠用变体A2A-77治疗，并且第4组小鼠用变体A2A-81治疗。在30天内测量肿瘤体积。结果描绘于图34A-图34D中。变体A2A-81比变体A2A-77或抗PD-1抗体更好地使肿瘤尺寸消退。
对用10mg/kg变体A2A-51(第5组)、A2A-28(第6组)、Ab7/PD1TAO15(第7组)和AZD4635(第8组)治疗的小鼠进行了另外的研究。还根据图34E中的时间表用20mg/kg治疗小鼠。数据参见图34F-图34K。
数据显示，A2A-77和A2A-51表现出减小肿瘤体积的能力，并且PD1TAO15表现出与比较抗PD1抗体类似的结果。与单一治疗或抗PD1抗体治疗相比，在组合治疗中没有观察到差异。参见图35K。
在每个治疗组中测量淋巴和骨髓区室两者中的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。结果描绘于图35A-图35M中。TIL CD8+细胞在用A2A-77变体治疗的组中比用A2A-81变体治疗的组中增加更多。TIL-M1肿瘤相关巨噬细胞在A2A-81变体中比A2A-77变体中增加更多。
在中期和终末样品中测量外周血的裂解全血(LWB)的细胞谱。结果描绘于图36A-图36C、图37A-图37G和图38A-图38G中。T细胞活化后外周血中的细胞因子水平描绘于图39中。终末血清中细胞因子水平的结果描绘于图40A-图40G中。
在中期和终末样品中测量外周血的裂解全血(LWB)的细胞谱。结果描绘于图41A-图41C、图42A-图42G和图43A-图43G中。终末血清样品中细胞因子水平的结果描绘于图44A-图44G中。
实施例25：A2bR细胞功能cAMP测定
交叉反应性
评估A2b交叉结合物在HEK293T细胞中的特异性，测定交叉反应性。结果描绘于图45和表22中。
表22
图46描绘了对选择的A2b抗体进行的功能cAMP测定。将CHO-K1细胞与A2b抗体孵育。接下来，使用NECA刺激细胞。A2b的活化基于细胞系中3’-5’-环腺苷单磷酸(cAMP)的产生来监测。
进行了功能别构cAMP测定。将细胞与100nM的抗A2A-17、A2A-19、A2A-26、A2A-27、A2A-35、A2A-36、A2A-83和A2A-84预孵育，随后进行从300nM开始3x滴定的NECA刺激。结果描绘于图47A中。
进行功能拮抗cAMP测定。首先，将细胞与从100nM开始3X滴定的A2A-17、A2A-19、A2A-26、A2A-27、A2A-35、A2A-36和A2A-83预孵育。接下来，进行以10nM浓度的NECA刺激。结果描绘于图47B-图47C中。
以高水平IgC和低配体水平进行拮抗cAMP测定。将细胞与从1000nM开始3X滴定的A2A-17、A2A-19、A2A-26、A2A-27、A2A-35、A2A-36、A2A-83和A2A-72预孵育。接下来，以5nM的浓度进行NECA刺激。结果描绘于图47D中。A2A-27显示出作为与A2b交联的A2a拮抗剂同时也是A2b拮抗剂的特性。A2b的特性描绘于表23中。
表23
实施例26.IgG1和IgG4重新格式化A2AR抗体
将抗体改造为IgG1或IgG4。然后在原代T细胞活化测定中测定重新格式化的抗体，该测定测量细胞因子释放。数据参见图48A-图48E。如数据中所见，在将实例重新格式化为IgG4后，IgG4比IgG1具有更好的T细胞活化活性。
实施例27：结肠癌模型的体内研究
将带有人类结肠癌(HuCD34NCG-Colo205)的小鼠分为两个集合：第1集合分为8组，并且第2集合分为6组。在第1集合中，第1组是同种型对照，第2组小鼠用抗PD1治疗，第3组小鼠用变体Ab3治疗，第4组小鼠用变体Ab4治疗，第5组小鼠用变体Ab5治疗，第6组小鼠用变体Ab6治疗，第7组小鼠用变体Ab7治疗，第8组小鼠用AZD4635治疗。第1集合中除了第8组外的每一组都按照Q3Dx6时间表给予10mg/kg的剂量，第8组按照每天两次的时间表给予50mg/kg的剂量。在第2集合中，第1组是同种型对照组，第2组小鼠用抗PD1治疗，第3组小鼠用Ab4治疗，第4组小鼠用Ab4+抗PD1治疗，第5组小鼠用AB7治疗，并且第6组小鼠用Ab4+AB7治疗。第2集合中的每组按照Q3Dx6时间表给予20mg/kg的总剂量。在30天内测量肿瘤体积。
虽然本文已经示出和描述了本公开内容的优选的实施方案，但是对于本领域技术人员将明显的是，这样的实施方案仅以实例的方式提供。在不偏离本公开内容的情况下，本领域技术人员现将想到许多变化、改变和替代。应当理解，在实践本公开内容时可以使用本文描述的本公开内容的实施方案的各种替代方案。所附权利要求旨在限定本公开内容的范围，并由此覆盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物。

Claims (24)

1.一种用于活化T细胞的方法，包括施用抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段包含与SEQ ID NO:6-717中列出的序列至少约90％相同的序列。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述抗体或抗体片段包含与SEQ ID NO:35-44中任一项中列出的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述抗体或抗体片段包含SEQ ID NO:35-44中任一项中列出的氨基酸序列。
4.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述抗体是单克隆抗体、多克隆抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、移植抗体、人类抗体、人源化抗体、合成抗体、嵌合抗体、骆驼源化抗体、单链Fv(scFv)、单链抗体、Fab片段、F(ab′)2片段、Fd片段、Fv片段、单结构域抗体、分离的互补决定区(CDR)、双特异抗体、仅包含单个单体可变结构域的片段、二硫键连接的Fv(sdFv)、胞内抗体、抗独特型(抗-Id)抗体或其抗原结合片段。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述抗体或抗体片段以小于约75nM的KD与腺苷2A受体结合。
6.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述抗体或抗体片段以小于约50nM的KD与腺苷2A受体结合。
7.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述抗体或抗体片段以小于约25nM的KD与腺苷2A受体结合。
8.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述抗体或抗体片段以小于约10nM的KD与腺苷2A受体结合。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述抗体或抗体片段包括在T细胞活化测定中小于约20nM的IC50。
10.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述抗体或抗体片段包括在T细胞活化测定中小于约10nM的IC50。
11.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述抗体或抗体片段包括在T细胞活化测定中小于约7.5nM的IC50。
12.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述抗体或抗体片段包括在T细胞活化测定中小于约5nM的IC50。
13.一种抗体或抗体片段，包含与SEQ ID NO:6-717中列出的序列至少约90％相同的序列。
14.根据权利要求13所述的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包含与SEQ IDNO:35-44中任一项中列出的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列。
15.根据权利要求13所述的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包含SEQ IDNO:35-44中任一项中列出的氨基酸序列。
16.根据权利要求13-14中任一项所述的抗体或抗体片段，其中所述抗体是单克隆抗体、多克隆抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、移植抗体、人类抗体、人源化抗体、合成抗体、嵌合抗体、骆驼源化抗体、单链Fv(scFv)、单链抗体、Fab片段、F(ab′)2片段、Fd片段、Fv片段、单结构域抗体、分离的互补决定区(CDR)、双特异抗体、仅包含单个单体可变结构域的片段、二硫键连接的Fv(sdFv)、胞内抗体、抗独特型(抗-Id)抗体或其抗原结合片段。
17.根据权利要求13-15中任一项所述的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段以小于约75nM的KD与腺苷2A受体结合。
18.根据权利要求13-15中任一项所述的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段以小于约50nM的KD与腺苷2A受体结合。
19.根据权利要求13-15中任一项所述的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段以小于约25nM的KD与腺苷2A受体结合。
20.根据权利要求13-15中任一项所述的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段以小于约10nM的KD与腺苷2A受体结合。
21.根据权利要求13-20中任一项所述的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括在T细胞活化测定中小于约20nM的IC50。
22.根据权利要求13-20中任一项所述的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括在T细胞活化测定中小于约10nM的IC50。
23.根据权利要求13-20中任一项所述的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括在T细胞活化测定中小于约7.5nM的IC50。
24.根据权利要求13-20中任一项所述的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包括在T细胞活化测定中小于约5nM的IC50。
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