KR101802908B1 - 막분취 배양기, 막분취 배양 키트, 이것을 사용한 줄기 세포 분취 방법, 및 분리막 - Google Patents

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Abstract

적어도 일부에 줄기 세포 투과용의 포어(121)를 갖는 막(12)을 포함해서 이루어지는 용기로 구성되는 상부 구조체(10)와, 상기 상부 구조체의 막을 침지시키는 양의 유체를 유지하는 용기로 구성되는 하부 구조체(13)를 포함해서 이루어지는 막분취 배양기(1), 이러한 막분취 배양기(1)와 세포 유주 인자를 포함해서 이루어지는 막분취 배양 키트 및 상기 상부 구조체(10)의 막(12)에 검체 세포 또는 검체 조직을 파종하는 공정과, 상기 하부 구조체(13)에 세포 유주 인자를 포함하는 배지를 충전하는 공정과, 상기 상부 구조체(10)의 막(12)을 상기 하부 구조체(13) 중의 배지에 접촉시키는 공정을 포함하는 줄기 세포 분취 방법 및 소수성 폴리머로 이루어지는 기재막과 비닐피롤리돈계 폴리머, 폴리에틸렌글리콜계 폴리머 및 비닐알코올계 폴리머로부터 선택되는 1개 이상의 친수성 폴리머가, 상기 기재막의 표면에 공유 결합에 의해 결합되어서 이루어지는 기능층을 구비해서 이루어지는 분리막이고, 상기 기능층을 구성하는 친수성 폴리머의 중량이 상기 분리막 전체 중량의 1.5중량%∼35중량%인 분리막.

Description

막분취 배양기, 막분취 배양 키트, 이것을 사용한 줄기 세포 분취 방법, 및 분리막{MEMBRANE-SEPARATION-TYPE CULTURE DEVICE, MEMBRANE-SEPARATION-TYPE CULTURE KIT, STEM CELL SEPARATION METHOD USING SAME, AND SEPARATION MEMBRANE}
본 발명은 임의의 생물종의 줄기 세포 및 치수 줄기 세포를 분취하기 위한 막분취 배양기, 막분취 배양 키트 및 이것을 사용한 줄기 세포 분취 방법에 관한것이다. 본 발명은 특히는 치수 재생을 위해 근관에 충전되는 치수 줄기 세포 또는 간엽계 줄기 세포를 분취하기 위한 막분취 배양기, 막분취 배양 키트 및 이것을 사용한 줄기 세포 분취 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 분리막, 표면 개질법 및 그것을 이용한 분리막의 제조에 관한 것이고, 분리 성능을 손상시키지 않고, 소수성의 폴리머로 이루어지는 막을 친수화하고, 세포를 투과 분리시킬 때의 막으로의 접착을 억제한 분리막을 제공하는 것이다. 따라서, 본 발명은 혈액 정화 분야나 재생 의료를 중심으로 한 세포 분리 정제하는 분야에 있어서 바람직하게 사용된다. 또한, 폴리머 표면 개질법은 폴리머 표면만의 개질을 간편하게 행할 수 있고, 동시에 멸균 처리도 행할 수 있기 때문에, 종래법에 비해 생산 효율화에 기여하는 것이 가능하다.
현재, 발수 치료 또는 감염 근관 치료의 생물학적 근관 충전재에 사용되는 치수 줄기 세포는 혈관 신생능, 신경 재생능 및 치수 재생능이 우수한 획분이다. 주로, 치수 유래 CD31-SP(side population) 세포, CD105+ 세포 또는 CXCR4+ 세포 등을 사용하고 있다. SP세포는 Hoechst 33342로 라벨링하고, 이 색소를 강하게 배출하는 획분을 플로우 사이토미터(flow cytometer)로, Hoechst Blue와 Hoechst Red에서 분취하는 것으로 줄기 세포가 많이 포함된다. 그러나, Hoechst 33342는 DNA 결합 색소이고, 또한 플로우 사이토미터의 사용을 필수로 하기 위해서, 세포의 안전성에 문제가 있다고 말해지고 있다.
한편, 줄기 세포에 특이적인 막 표면 항원에 대한 항체를 사용하는 경우, 플로우 사이토미터를 사용하지 않고, 자기 비즈를 사용하는 방법이 개발되어 있다. 예를 들면, 골수 줄기 세포로서, CD34나 CD133 항체 비즈가 알려져 있지만, 어느 정도의 조직 세포량을 필요로 한다. 따라서, 치수 조직으로부터 분취하는 경우는 부적합하다. 또한, 인간 치수의 경우, CD34 양성 세포 및 CD13 3양성 세포는 각각 치수 검체 세포의 0.01% 및 0.5%로 거의 존재하지 않아 기존(시판)의 자기 비즈법은 적합하지 않다. CD105나 CXCR4의 항체 비즈에서는 오더 메이드로 하기 때문에 매우 고가가 될 우려가 있다. 또한, 지방 조직으로부터 줄기 세포를 분리하는 기기로서, 효소 소화법 및 원심 분리법에 의한 세포 분리를 기본으로 하는 Celution 800/CRS system이 임상에서 이미 사용되고 있지만, 조직이 대량으로 필요하고, 얻어지는 세포는 헤테로한 집단에서 전구 세포를 많이 포함하고, 또한 고가이다. 또한, 골수 조직으로부터 줄기 세포를 분리하는 기기로서 Bone Marrow MSC Separation Device가 상품화되어 있다. 이것은 레이온과 폴리에틸렌으로 이루어지는 섬유에서 골수 간엽계 세포를 트랩함으로써 단시간(20분)으로 줄기 세포를 채취할 수 있다고 말해지고 있고, 비교적 저렴하지만, 골수 조직(골수액)이 비교적 대량으로 필요해서, 얻어지는 세포는 여전히 헤테로한 집단에서 전구 세포를 많이 포함한다. 따라서, 효소 소화법을 사용하지 않고, 고체의 조직으로부터 줄기 세포를 분취, 증폭시키는 장치는 아직 발명되지 않고 있다.
또한, 막분취기로서는 상부 구조로서 셀 컬처·인서트(폴리카보네이트 막(Polycarbonate Membrane) Transwell(등록 상표） Inserts, 2 × 105포어/cm2, 포어 사이즈 8㎛, 저면의 직경 6.4mm, 개구부의 직경 11.0mm, 높이 17.5mm)(Corning)를, 하부 구조로서 24 well plate(직경 15.0 mm, 개구부의 직경 15.0 mm, 높이 22.0 mm)(Falcon)에 삽입해서 사용할 수 있다. 그러나, PET막이나 폴리카보네이트막에서는 세포의 부착이 많고, 하층으로의 유주(遊走)를 효율적으로 행할 수는 없다. 또한, 개방 형상인 것으로부터 미생물에 의한 컨태미네이션의 위험이 커서 세포의 안전성을 담보할 수는 없다.
따라서, 인간 치수 조직 또는 인간 치수 세포로부터, 저렴하고 안전하게 효율적으로 줄기 세포를 분취하는 방법을 개발할 필요가 있다.
지금까지, 골수에 존재하는 CXCR4+ 세포, C-MET+ 세포 또는 LIF-R+ 세포를 각각, 그 리간드의 SDF1, HGF 또는 LIF의 농도 구배를 이용하고, 유주 chemotaxis 효과에 의해 골수의 줄기 세포로서 농축할 수 있는 것이 알려져 있다(비특허문헌 1).
또한 골수, 말초혈 및 제대혈의 줄기 세포(CXCR4+/lin-/CD133+/CD45+ 세포의 조혈 줄기 세포 및 CXCR4+/lin-/CD133+/CD45- 세포의 간엽계 줄기 세포)를 SDF1의 농도 구배로 동일하게 농축할 수 있는 것이 알려져 있다(비특허문헌 2). 이 경우, 기제의 Costar Transwell 24-well의 5㎛의 구경(포어 사이즈)의 필터의 하부의 챔버에 SDF-1을 넣고, 상부에 농축하고 싶은 세포를 넣고 있다. 그러나, 안전성을 고려한 경우, SDF-1은 아직 약사 인가를 받고 있지 않고, SDF-1를 대신하는 안전으로 유효한 유주 인자의 사용이 요구된다.
또한. 골수 줄기 세포의 유주에 유효한 인자로서, 혈소판 유래의 sphingosine-1-phosphate(S1P)(비특허문헌 3), 지방 줄기 세포의 유주에 유효한 인자로서하고, protocatechuic acid(비특허문헌 4)이 알려져 있다. 그러나, 여전히 아직까지도 안전성의 문제가 해결되지 않고 있다. 또한, 혈관 신생·신경 재생 및 치수 재생능이 우수한 치수 CD31-SP 세포는 SDF-1 또는 VEGF에 대하여 유주하는 것이 알려져 있다(비특허문헌 5). 그러나, 현재 시점에서, SDF-1 이외의 혈관 신생·신경 재생 및 치수 재생능이 우수한 치수 줄기 세포의 분취에 유효한 유주 인자는 명확하지 않다.
치수 줄기 세포를 안전, 또한 실용적으로, 분취할 수 있는 막분취 배양기 및 유주 인자가 요구된다. 또한, 인간 줄기 세포 이외에도, 여러 가지의 생물종에 있어서 줄기 세포로부터 각 조직으로의 분화 유도 기구의 해명이 생물학 연구에 있어서 요구되고 있다. 재생 의료의 진전에 따라서, 줄기 세포를 간편하게, 또한 안정하게 분취할 수 있는 막분취 배양기 및 유주 인자가 촉망되고 있다.
체액, 혈액이나 세포와 접촉하는 의료용의 분리막은 단백질이나 혈소판, 세포 등이 부착되면 분리막의 성능 저하나 생체 반응을 일으키는 원인이 되고, 세포 자신의 흡착도 촉진되는 등, 해결해야 할 과제가 많다. 또한, 정수기 등의 수처리막에 있어서도, 단백질이나 유기물의 부착이 분리막의 성능 저하를 야기한다. 이러한 문제에 대하여, 분리막을 친수화하는 것에 의한 해결이 시도되고 있고, 여러가지 검토가 이루어지고 있다. 예를 들면, 폴리술폰으로 이루어지는 막에 친수성 고분자인 폴리비닐피롤리돈을 제막 원액의 단계에서 혼합시켜서 성형함으로써 막에 친수성을 부여해서 오염을 억제하는 방법이 개시되어 있다(특허문헌 1). 그러나, 이들의 방법에서는 표면에 친수성을 부여하는데 제막 원액 중의 친수성 고분자량을 많이 할 필요가 있는 것이나, 기재가 되는 고분자와 상용성이 있는 친수성 고분자로 한정되는 것이나, 재료의 사용 용도에 따라서 최적인 원액 조성을 검토하지 않으면 안되는 등의 제약을 받는다.
또한, 특허문헌 2에는 폴리비닐아세탈디에틸아미노아세테이트와 친수화제를 막에 코팅해서 친수화를 도모하는 방법이 개시되어 있다. 이 방법에서는 폴리비닐아세탈디에틸아미노아세테이트가 친수화제를 덮어버려, 비부착에 관한 효과는 격감하는 것이 우려된다. 또한, 막을 폴리비닐아세탈디에틸아미노아세테이트 및 친수화제의 각 용액에 침지시키기 때문에, 막의 분리 성능이 저하하는 것도 우려된다.
형성된 막에 대하여, 고에너지선에 의해, 수불용화하는 폴리비닐피롤리돈 등의 친수성 성분을 수불용화시켜서 도입하는 방법(특허문헌 3)이나 폴리술폰계의 분리막을 폴리비닐피롤리돈 등의 친수성 고분자 용액과 접촉시킨 후, 방사선 가교에 의해 불용화한 피막층을 형성하는 방법(특허문헌 4)이 개시되어 있다. 그러나, 폴리비닐피롤리돈 등의 수성 고분자와 폴리술폰계 고분자는 분자간의 상호 작용이 약하기 때문에, 피막층을 형성시키는 것이 곤란하다고 하는 문제가 있었다.
그 때문에 어느 범위의 비누화도의 폴리비닐알코올 수용액을 폴리술폰계 분리막과 접촉시켜서, 폴리술폰과 아세트산 비닐의 소수성 상호 작용에 의해, 효율적으로 막표면의 피막층을 형성시키는 방법이 개시되어 있다(특허문헌 5). 그러나, 상기 문헌은 부착 억제에 관한 방법이 아니기 때문에, 본 발명자들이 검토한 결과, 폴리비닐알코올을 분리막에 단순하게 피복하면, 분리막의 성능 저하가 현저한 것을 알았다. 또한, 폴리비닐알코올의 수산기는 혈액과 접촉했을 때에, 보체를 활성화하기 쉬운 것이 알려져 있다.
또는 폴리비닐피롤리돈이나 폴리에틸렌글리콜과 같은 친수성 고분자로 재료표면을 피복하여도, 부착 억제 효과는 일시적으로밖에 억제될 수 없다고도 말해지고 있다(비특허문헌 6). 즉, 고성능한 분리막으로 혈액 적합성을 만족시키는 분리막 모듈은 아직 확립되지 않고 있다.
: 일본국 특허공고 평2-18695호 공보 : 일본국 특허공개 평8-131791호 공보 : 일본국 특허공고 평8-9668호 공보 : 일본국 특허공개 평6-238139호 공보 : 일본국 특허공개 2006-198611호 공보
: Kucia M., et al., Arch. Immunol. Ther. Exp. 2006 : Baumert B. et al., Folia Histochemica Et Cytobiologica 2008 : Meriane M., et al., Stem Cells 2006 : Wang H., et al., Eur. J. Pharmacol. 2008 : Iohara K.et al., STEM CELLS Volume 26, Issue 9, pages 2408-2418, September 2008 : 의료 나노테크놀로지 교오린 도서 pp115-116
종래의 플로우 사이토메트리나 자기 항체 비즈법에서는 임상에서 사용되는 기준(의약품 및 의약부 외품의 제조 관리 및 품질 관리의 기준에 관한 성령(GMP))을 만족하는 안전하고 고효율, 저렴한 분취 방법이 될 수 없다. 본 발명은 이러한 문제점을 감안하여 이루어진 것으로서, 치수 재생 치료 및 그 밖의 재생 치료에 대하여, 플로우 사이토메트리나 자기 항체 비즈를 사용하지 않고, 소량의 조직이라도 안전하고 고효율, 또한 저렴하게 소망의 줄기 세포를 얻을 수 있는 배양기, 이것에 사용하는 유주 인자 및 줄기 세포 분취 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한, 모든 생물종의 줄기 세포(배성 줄기 세포, iPS 세포 및 조직 줄기 세포)의 분취에 적용할 수 있는 막분취 배양기, 막분취 배양 키트 및 줄기 세포 분취 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 또 다른 목적은 분리막에 관한 종래 기술의 결점을 개량하고, 통상의 세포 배양용 인큐베이터나, 크린 벤치 중에서 사용할 수 있는 컴팩트성을 가지고, 구경에 의한 여과 성능뿐만 아니라, 표면 친화성을 개량한 고성능한 분리막을 제공하는 것에 있다.
본 발명자들은 상기 과제를 달성하기 위하여 예의 검토를 행한 결과, 세포 유주 인자의 농도 구배를 이용하여, 막 상부로부터 막 하부로 줄기 세포를 선택적으로 통과시킬 수 있고, 줄기 세포를 분취할 수 있는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하는데 이르렀다. 따라서, 본 발명은 일실시형태에 의하면, 막분취 배양기로서, 줄기 세포 투과용의 포어를 갖는 분리막이고, 저면의 적어도 일부가 형성된 용기 로 구성되는 상부 구조체와, 상기 상부 구조체의 막을 침지시키는 유체를 유지하는 용기로 구성되는 하부 구조체를 포함해서 이루어진다.
상기 분리막이 소수성 폴리머로 이루어지는 기재막과 비닐피롤리돈계 폴리머, 폴리에틸렌글리콜계 폴리머 및 비닐알코올계 폴리머로부터 선택되는 1개 이상의 친수성 폴리머가 상기 기재막의 표면에 공유 결합에 의해 결합되어서 이루어지는 기능층을 구비해서 이루어지고, 상기 기능층을 구성하는 친수성 폴리머의 중량이 상기 분리막 전체 중량의 1.5중량%∼35중량%인 것이 바람직하다.
상기 포어의 사이즈가 3㎛∼10㎛이고, 밀도가 1×105∼4×106포어/cm2인 것이 바람직하다.
상기 상부 구조체를 복수 구비하고, 상기 하부 구조체에 수납되어, 상기 복수의 상부 구조체의 각각을 로킹하는 복수의 홀을 형성한 판상 부재를 구비해서 이루어지는 프레임을 더 포함하는 것이 바람직하다.
또는 상기 상부 구조체를 복수 구비하고, 상기 하부 구조체에 수납되어, 상기 복수의 상부 구조체의 각각을 로킹하는 복수의 홀을 형성한 판상 부재를 구비해서 이루어지는 프레임을 더 포함하고, 상기 하부 구조체가 상기 복수의 상부 구조체의 각각에 대응하는 복수의 용기로 구성되는 것이 바람직하다.
또한, 상기 복수의 상부 구조체가 다른 포어 사이즈 및/또는 다른 포어 밀도의 막을 갖는 것이 바람직하다.
상기 상부 구조체와 하부 구조체를 복설(覆設)하거나 또는 밀봉할 수 있는 덮개 모양 구조체를 더 포함해서 이루어지는 것이 바람직하다.
상기 덮개 모양 구조체가 가스 도입구와 가스 배출구를 구비하는 가스 교환 장치를 더 포함해서 이루어지는 것이 바람직하다.
상기 덮개 모양 구조체의 적어도 일부가, 포어 사이즈가 1∼100nm인 포어를 갖는 막으로부터 형성되어 있는 것이 바람직하다.
상기 덮개 모양 구조체와 상기 하부 구조체의 사이에, 밀봉용의 탄성체가 부착되어 있는 것이 바람직하다.
온도 측정 장치와 온도 조절 장치를 포함하는 온도 조절 시스템을 더 구비하는 것이 바람직하다.
상기 하부 구조체가 배지 도입구와 배지 송출구를 구비하는 배지 교환 시스템을 더 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명은 또한 다른 국면에 의하면, 막분취 배양 키트로서, 상술의 어느 쪽에 기재된 막분취 배양기와, 상기 하부 구조체에 주입하기 위한 세포 유주 인자를 포함해서 이루어진다.
상기 세포 유주 인자가 SDF-1, G-CSF, bFGF, TGF-β, NGF, PDGF, BDNF, GDNF, EGF, VEGF, SCF, MMP3, Slit, GM-CSF, LIF, HGF, S1P, protocatechuic acid 및 혈청으로부터 선택되는 1개 이상인 것이 바람직하다.
상기 세포 유주 인자의 농도가, 1ng/㎖∼500ng/㎖인 것이 바람직하다.
상기 하부 구조체에 주입하기 위한 혈청을 더 포함하고, 상기 세포 유주 인자가 G-CSF 또는 bFGF인 것이 바람직하다.
본 발명은 또 다른 국면에 의하면, 상기의 어느 하나의 막분취 배양기를 사용한 줄기 세포 분취 방법으로서, 상기 상부 구조체의 막에 검체 세포 또는 검체 조직을 파종하는 공정과, 상기 하부 구조체의 용기에 세포 유주 인자를 포함하는 배지를 충전하는 공정과, 상기 상부 구조체의 막을 상기 하부 구조체 중의 배지에 접촉시키는 공정을 포함한다.
상기 세포 유주 인자가 SDF-1, G-CSF, bFGF, TGF-β, NGF, PDGF, BDNF, GDNF, EGF, VEGF, SCF, MMP3, Slit, GM-CSF, LIF, HGF, S1P, protocatechuic acid 및 혈청으로부터 선택되는 1개 이상인 것이 바람직하다.
상기 세포 유주 인자의 농도가 1ng/㎖∼500ng/㎖인 것이 바람직하다.
상기 검체 세포가 분리막 1mm2당 3×102cells∼3×104cells로 파종되는 것이 바람직하다.
본 발명은 또한 상기의 줄기 세포 분취 방법으로서, 상기 줄기 세포가 치수 줄기 세포이고, 상기 세포 유주 인자가 G-CSF 또는 bFGF이고, 상기 G-CSF 또는 bFGF의 농도가 50∼150ng/㎖이며, 상기 검체 세포가 분리막 1mm2당 3×102∼1.5×103cells로 파종되고, 또는 상기 검체 조직이 분리막 1mm2 당 0.1mg∼1mg으로 정치되고, 상기 세포 유주 인자를 포함하는 배지에 상기 배지의 체적에 대하여, 5∼20vol%의 혈청이 첨가된다.
본 발명은 또한 상기의 줄기 세포 분취 방법으로서, 상기 줄기 세포가 골수 줄기 세포 또는 지방 줄기 세포이고, 상기 세포 유주 인자가 G-CSF 또는 bFGF이고, 상기 G-CSF 또는 bFGF의 농도가 50∼150ng/㎖이며, 상기 검체 세포가 분리막 1mm2당 3×102∼1.5×103cells로 파종되고, 또는 상기 검체 조직이 분리막 1mm2당 0.1mg∼1mg으로 정치되고, 상기 세포 유주 인자를 포함하는 배지에 상기 배지의 체적에 대하여, 5∼20vol%의 혈청이 첨가된다.
본 발명자들은 또한, 분리막에 관한 상기 과제를 달성하기 위하여 예의 검토를 진행한 결과, 혈액 적합성이 우수하고, 단백질이나 유기물의 부착이 적은 본 발명의 분리막 및 분리막 모듈은 하기의 구성에 의해 달성되는 것을 찾아냈다.
즉, 본 발명은 또 다른 형태에 의하면, 소수성 폴리머로 이루어지는 기재막과,
비닐피롤리돈계 폴리머, 폴리에틸렌글리콜계 폴리머 및 비닐알코올계 폴리머로부터 선택되는 1개 이상의 친수성 폴리머가 상기 기재막의 표면에 공유 결합에 의해 결합되어서 이루어지는 기능층을 구비해서 이루어지는 분리막으로서, 상기 기능층을 구성하는 친수성 폴리머의 중량이 상기 분리막 전체 중량의 1.5중량%∼35중량%인 분리막이다.
상기 기재막이 1∼10㎛인 홀을 갖고, 세포 분리를 위해서 사용되는 분리막인 것이 바람직하다.
상기 소수성 폴리머가 술폰계 폴리머, 아미드계 폴리머, 카보네이트계 폴리머, 에스테르계 폴리머, 우레탄계 폴리머, 올레핀계 폴리머 및 이미드계 폴리머로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.
상기 중 어느 하나의 분리막이 세포를 투과 분리하기 위해서 사용되는 것이 바람직하다.
본 발명은 다른 국면에 의하면, 상기 어느 것에 기재된 분리막의 제조 방법으로서, 흡수율이 2%이하인 소수성 폴리머로 이루어지는 기재막을 비닐피롤리돈계 폴리머, 폴리에틸렌글리콜계 폴리머 및 비닐알코올계 폴리머로부터 선택되는 1개 이상의 친수성 폴리머를 10∼2000ppm 함유하고, 또한 알코올을 0.01∼0.2% 함유하는 처리 수용액에 침지하는 침지 공정과 상기 기재막에 고에너지선을 조사하고, 막표면을 단백질 부착 억제성, 세포 부착 억제성으로 개질하는 개질 공정을 구비한다.
또한, 상기 어느 하나에 기재된 분리막의 제조 방법으로서, 흡수율이 2%를 초과하는 소수성 폴리머로 이루어지는 기재막을 비닐피롤리돈계 폴리머, 폴리에틸렌글리콜계 폴리머 및 비닐알코올계 폴리머로부터 선택되는 1개 이상의 친수성 폴리머를 10∼2000ppm 함유하는 수용액에 침지하는 침지 공정과, 상기 기재막에 고에너지선을 조사하고, 막표면을 단백질 부착 억제성, 세포 부착 억제성으로 개질하는 개질 공정을 구비한다.
상기 소수성 폴리머가 술폰계 폴리머, 아미드계 폴리머, 카보네이트계 폴리머, 에스테르계 폴리머, 우레탄계 폴리머, 올레핀계 폴리머 및 이미드계 폴리머로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.
본 발명은 다른 국면에 의하면, 성형체의 표면 개질 방법으로서, 흡수율이 2% 이하인 성형체를 비닐피롤리돈계 폴리머, 폴리에틸렌글리콜계 폴리머 및 비닐알코올계 폴리머로부터 선택되는 1개 이상의 친수성 폴리머를 10∼2000ppm 함유하고, 또한, 알코올을 0.01∼0.2% 함유하는 처리 수용액에 침지하는 침지 공정과 상기 성형체에 고에너지선을 조사하고, 성형체 표면을 단백질 부착 억제성, 세포 부착 억제성으로 개질하는 개질 공정을 구비한다.
또는 성형체의 표면 개질 방법으로서, 흡수율이 2%를 초과하는 성형체를 비닐피롤리돈계 폴리머, 폴리에틸렌글리콜계 폴리머 및 비닐알코올계 폴리머로부터 선택되는 1개 이상의 친수성 폴리머를 10∼2000ppm 함유하는 수용액에 침지하는 침지 공정과, 상기 성형체에 고에너지선을 조사하고, 성형체 표면을 단백질 부착 억제성, 세포 부착 억제성으로 개질하는 개질 공정을 구비한다.
본 발명은 또한 이들 성형체의 개질 방법을 사용하고, 상기 어느 하나에 기재된 분리막을 제조하는 방법이다.
(발명의 효과)
본 발명에 의하면, 막분취 배양기와 세포 유주 인자를 이용하여, 소량의 세포라도 안전하고, 고효율로 저렴하게 줄기 세포를 분취할 수 있다. 또한, 세포의 크기에 따라서, 투과용의 포어를 적절한 사이즈를 선택함으로써, 모든 생물종의 줄기 세포 분취에 범용할 수 있다. 또한 적절한 유주 인자를 선택함으로써, 배성 줄기 세포, iPS 세포 및 조직 줄기 세포를 포함하는 모든 줄기 세포의 분취에 대응할 수 있다. 또한, 막분취 배양의 분리막의 수를 변화시킴으로써, 다양한 조직 세포량에 대응할 수도 있다. 상부 구조체와 하부 구조체를 완전 밀봉형으로 함으로써, GMP에 대응하고, 임상에 실제로 사용할 수 있는 줄기 세포를 분취하는 것이 가능해진다. 또한, 본원 발명의 막분취 배양기는 실험용으로서도, 임상용으로서도, 널리 사용할 수 있고, 재생 의료의 진전에 크게 기여하는 것이다. 막분취 세포의 또 다른 이점으로서, 특히, 중고령자에게 있어서 막분취한 줄기 세포는 증폭에 따르는 형질 변화가 적다. 증폭에 따라서, senescence가 되기 어렵고, 노화하기 어렵기 때문에, 임상 사용에 있어서 유효하게 기능시킬 수 있다. 또한, 막분취기의 또 다른 이점으로서, 세포로부터 뿐만 아니라, 조직으로부터에서도 세포를 미리 효소 소화 등에 의해 분산시키지 않고 줄기 세포를 분취할 수 있어, 효소 소화의 시간 절약과 효소 미사용에 의한 안전성의 담보로 연결된다.
또한, 본 발명에 의한 분리막은 세포를 분리할 때에, 세포가 접착되어 분리효율을 떨어뜨리는 것을 억제한 것으로서, 분리막 기능층의 표면에 폴리머상으로 국재화하고 있는 것을 특징으로 하는 것이다. 제막 원액 중으로의 친수성 폴리머 혼합에 의하지 않고 성형한 분리막, 예를 들면 전자선을 투과시켜서 홀을 형성시킨 막표면의 단백질이나 세포 부착성 억제에 바람직하게 사용할 수 있다.
도 1은 제 1 실시형태에 따른 막분취 배양기의 모식도이다.
도 2는 제 2 실시형태에 따른 막분취 배양기의 모식도이다.
도 3은 제 3 실시형태에 따른 막분취 배양기의 구성을 나타낸 모식도이다.
도 4는 제 4 실시형태에 따른 막분취 배양기의 구성을 나타낸 모식도이다.
도 5는 제 5 실시형태에 따른 막분취 배양기의 구성을 나타낸 모식도이다.
도 6의 (a)는 TaxiScan에 의한 세포 유주 인자에 의한 개 CD105 양성 세포의 유주의 차이, 시간 경과를 나타내는 도면이고, (b)는 TaxiScan에 의한 세포 유주 인자 G-CSF의 각종 농도에 의한 개 CD105 양성 세포의 유주의 차이를 나타낸 도면이다.
도 7의 (a)는 TaxiScan에 의한 소 태아 혈청 농도 변화에 의한 인간 치수 검체 세포의 유주의 차이, 시간 경과를 나타내는 도면이고, (b)는 TaxiScan에 의한 소 태아 혈청과 비교한 세포 유주 인자 G-CSF 및 SDF-1(최종 농도 100ng/㎖)에 의한 인간 치수 검체 세포의 유주의 차이를 도시한 도면이다.
도 8의 (a)는 본 발명에 따른 막분취 배양기(2×105 포어/cm2, 포어 사이즈가 3㎛)를 사용하고, 1×105 cells/250㎕의 개 신선 초대 치수 세포를 분리막 상부에 파종하고, 분리막 하부 구조체에 10% 개 혈청을 포함하는 DMEM 중에 G-CSF를 100ng/㎖ 넣고, 6시간 후에 배지 교환해서 G-CSF를 제거하고, 또한 배양 후 1일의 치수 줄기 세포를 나타내는 도면이고, (b)는 본 발명에 따른 막분취 배양기(2×105포어/cm2, 포어 사이즈가 3㎛)를 사용하고, 1×105cells/250㎕의 개 신선 초대 치수 세포를 분리막 상부에 파종하고, 분리막 하부 구조체에 10% 개 혈청을 포함하는 DMEM 중에 G-CSF를 100ng/㎖ 넣고, 6시간 후에 배지 교환해서 G-CSF를 제거하고, 또한 배양 후 7일의 치수 줄기 세포를 나타내는 도면이고, (c)는 본 발명에 따른 막분취 배양기(2×105 포어/cm2, 포어 사이즈가 3㎛)를 사용하고, 1×105cells/250㎕의 개 신선 초대 치수 세포를 분리막 상부에 파종하고, 분리막 하부 구조체에 10% 개 혈청을 포함하는 DMEM 중에 SDF-1을 100ng/㎖ 넣고, 6시간 후에 배지 교환해서 SDF-1를 제거하고 또한 배양 후 1일의 치수 줄기 세포를 도시한 도면이다.
도 9의 (a)는 본 발명에 따른 막분취 배양기와 G-CSF를 이용하여 분취 배양한 치수 줄기 세포의 5대째의 시험관내에서의 혈관 유도능을 나타내는 도면이고, (b)는 본 발명에 따른 막분취 배양기와 G-CSF를 이용하여 분취 배양한 치수 줄기 세포의 5대째의 시험관내에서의 neurosphere형 성능을 도시한 도면이다.
도 10의 (a)는 본 발명에 따른 막분취 배양기와 G-CSF를 이용하여 분취 배양한 치수 줄기 세포를 개 발수 후의 근관내에 이식하고, 14일후의 치수 재생을 나타내는 도면이고, (b)는 (a)의 B에서 나타낸 개소의 고배율도이고, (c)는 (a)의 C에서 나타낸 개소의 고배율도이며, 근관내 재생 치수의 상아질 측벽에 분화되어서 병렬하는 상아 아세포를 나타내는 고배율도이다. (d)는 동 연령, 동 부위의 개의 정상 치수를 도시한 도면이다.
도 11은 본 발명에 따른 막분취 배양기(2×105포어/cm2, 포어 사이즈가 3㎛)를 사용하고, 1×105cells/250㎕의 인간 신선 초대 치수 세포를 분리막 상부에 파종하고, 분리막 하부 구조체에 10% 인간 혈청을 포함하는 DMEM 중에 G-CSF를 100ng/㎖ 넣고, 6시간 후에 배지 교환해서 G-CSF를 제거하고, 또한 배양 후 8일의 인간 치수 줄기 세포를 도시한 도면이다.
도 12의 (a)는 본 발명에 따른 막분취 배양기(1×105 포어/cm2, 포어 사이즈가 8㎛)를 사용하고, 1×105cells/100㎕의 인간 신선 초대 치수 세포를 분리막 상부에 파종하고, 분리막 하부 구조체에 10% 인간 혈청을 포함하는 DMEM를 넣고, 22시간 후에 배지 교환하고, 또한 배양 후 3일의 분취된 인간 치수 줄기 세포를 나타내는 도면이고, (b)는 동일한 막분취 배양기를 사용하고, 1×105cells/100㎕의 인간 신선 초대 치수 세포를 분리막 상부에 파종하고, 분리막 하부 구조체에 10% 인간 혈청을 포함하는 DMEM 중에 G-CSF를 10ng/㎖ 넣고, 22시간 후에 배지 교환해서 G-CSF를 제거하고, 또한 배양 후 3일의 인간 치수 줄기 세포를 나타내는 도면이고, (c)는 동일한 막분취 배양기을 사용하고, 1×105cells/100㎕의 인간 신선 초대 치수 세포를 분리막 상부에 파종하고, 분리막 하부 구조체에 10% 인간 혈청을 포함하는 DMEM 중에 G-CSF를 100ng/㎖ 넣고, 22시간 후에 배지 교환해서 G-CSF를 제거하고, 또한 배양 후 3일의 인간 치수 줄기 세포를 도시한 도면이다. (d)는 (a)의 10% 인간 혈청의 배양 후 7일의 인간 치수 줄기 세포를 도시한 도면이다. (e)는 (c)의 G-CSF를 100ng/㎖의 배양 후 7일의 인간 치수 줄기 세포를 도시한 도면이다.
도 13의 (a)는 본 발명에 따른 막분취 배양기(1×105 포어/cm2, 포어 사이즈가 8㎛)를 사용하고, 1×105 cells/100㎕의 돼지 신선 초대 치수 세포를 분리막 상부에 파종하고, 분리막 하부 구조체에 10% 소 태아 혈청을 포함하는 DMEM 중에 G-CSF를 100ng/㎖ 넣고, 22시간 후에 배지 교환해서 G-CSF를 제거하고 또한 배양 후 3일의 돼지 치수 줄기 세포를 나타내는 도면이고, (b)는 (a)에 있어서의 돼지 신선초대 치수 세포 대신에 돼지 신선 초대 골수 세포를 파종하고, 막분취, 배양 후 3일의 돼지 골수 줄기 세포를 나타내는 도면이고, (c)는 (a)에 있어서의 돼지 신선 초대 치수 세포 대신에 돼지 신선 초대 지방 세포를 파종하고, 배양 후 3일의 돼지 지방 줄기 세포를 도시한 도면이다. (d)는 (a)에 있어서의 돼지 신선 초대 치수 세포를 파종하고, 막분취, 배양 후 8일의 돼지 치수 줄기 세포를 나타내는 도면이다.
도 14는 각종 유주 인자에 의한 미분취의 인간 치수 검체 세포의 유주능의 비교를 나타내는 그래프이다.
도 15는 제제화되어 있는 유주 인자와 혈청에 의한 인간 치수 검체 세포의 유주능의 비교를 나타내는 그래프이다.
도 16은 각종 농도의 G-CSF를 이용하여 분취한 치수막 분취 세포의 인간 혈청에 의한 세포 증식능의 비교를 나타내는 그래프이다.
도 17은 각종 농도의 G-CSF를 이용하여 분취한 치수막 분취 세포의 100ng/㎖의 G-CSF에 의한 세포 증식능의 비교를 나타내는 그래프이다.
도 18은 각종 농도의 G-CSF를 이용하여 분취한 치수막 분취 세포의 G-CSF에 대한 세포 유주능의 비교를 나타내는 그래프이다.
도 19는 100ng/㎖의 G-CSF를 이용하여 분취한 치수, 골수, 지방막 분취 세포의 소 태아 혈청에 대한 세포 증식능의 검체 세포와의 비교를 나타내는 그래프이다.
도 20은 100ng/㎖의 G-CSF를 이용하여 분취한 치수, 골수, 지방막 분취 세포의 100ng/㎖의 G-CSF에 대한 세포 증식능의 검체 세포와의 비교를 나타내는 그래프이다.
도 21은 100ng/㎖의 G-CSF를 이용하여 분취한 치수, 골수, 지방막 분취 세포의 G-CSF에 대한 유주능의 검체 세포와의 비교를 나타내는 그래프이다.
도 22는 제 6 실시형태에 따른 막분취 배양기의 구성을 나타낸 모식도이다.
도 23의 (a)는 본 발명에 따른 막분취 배양기(1×105 포어/cm2, 포어 사이즈가 8㎛)를 사용하고, 2mg/200㎕의 세절한 개 신선 치수 조직을 막 상부에 정치하고, 막 하부 구조체에 10% 혈청을 포함하는 DMEM 중에 G-CSF를 100ng/㎖ 넣고, 24시간 후의 치수 줄기 세포를 나타내는 도면이고, (b)는 (a)와 동일하게 2mg/200㎕의 세절한 개 신선 지방 조직을 막 상부에 정치하고, 막 하부 구조체에 10% 혈청을 포함하는 DMEM 중에 G-CSF를 100ng/㎖ 넣고, 24시간 후의 지방 줄기 세포를 나타낸 도면이다.
이하에 본 발명을, 도면을 참조해서 상세하게 설명한다. 이하의 설명은 본 발명을 한정하는 것은 아니다.
(제 1 실시형태)
본 발명의 제 1 실시형태에 의한 막분취 배양기(1)는 상부 구조체(10)과 하부 구조체(13)로 구성된다. 상부 구조체(10)는 검체 세포(200) 또는 검체 조직을 포함하는 배지(100)를 넣고, 분리막(12) 상에 검체 세포(200) 또는 검체 조직을 유지하기 위한 것이다. 한편, 하부 구조체(13)는 유주 인자(도시하지 않음)를 포함하는 배지(300)를 넣고, 유주한 줄기 세포를 수취하기 위한 것이다.
상부 구조체(10)는 측면부(11)와 원형의 저면부로 이루어지는 용기이고, 저면부는 복수의 포어(121)를 갖는 분리막(12)에 의해 형성된다. 상부 구조체(10)는 그 내부에 배지(100)와 검체 세포(200) 또는 검체 조직을 수용할 수 있는 것이면 된다. 본 명세서에 있어서, 검체 세포란 효소 처리에 의해 조직으로부터 세포 사이의 접착을 산산히 분해해서 분취되지 않는 세포를 말한다. 또는 계대해서 분산된 세포를 말한다. 예를 들면, 100∼250㎕정도의 배지(100)와 검체 세포(200)를 수용할 수 있는 용기가 바람직하다. 검체 조직이란 세절하고 있지만, 효소 소화 처리하지 않는 분산되지 않는 조직을 말한다.
상부 구조체(10)의 저면을 구성하는 분리막(12)은 줄기 세포가 투과하기 위한 복수의 포어(121)를 갖는다. 포어 사이즈는 1㎛∼100㎛이고, 바람직하게는 3㎛∼10㎛이며, 더욱 바람직하게는 5㎛∼8㎛이다. 줄기 세포가 통과될 수 있게 하기 위해서이다. 또한, 포어 밀도는 2.5×103∼2.5×107 포어/cm2이고, 바람직하게는 1×105∼4×106 포어/cm2이다. 줄기 세포가 효율적으로 통과할 수 있게 하기 위해서, 개공율은 가능한 한 높을수록 좋다.
분리막(12)의 재료로서는 PET, 폴리카보네이트, 폴리술폰, 폴리프로필렌, 폴리 불화 비닐리덴, 폴리아미드 등의 소수성 폴리머를 기재로 하는 것을 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 분리막(12)의 두께는 10∼100㎛로 하는 것이 바람직하고, 10∼25㎛로 하는 것이 더욱 바람직하다. 줄기 세포의 유주시, 특히 줄기 세포가 포어를 통과할 시에 줄기 세포 표면에 상해를 주지 않도록 하기 위해서이다.
분리막(12)은 세포 비접착성으로 하기 위해서, 코트제에 의해 분리막 표면이 코팅되어 있는 것이 바람직하다. 특히는 검체 세포(200) 또는 검체 조직을 파종했을 때에, 검체 세포(200) 또는 검체 조직과 접촉하는 면이다, 상부 구조체(10)의 내측인 면에 코트제를 적용할 수 있다. 코트제로서는 기지의 세포 비접착성의 코트제, 예를 들면 에틸렌옥시드/프로필렌옥시드 공중합체(ADEKA CORPORATION의 상품명: 플루로닉 F108), 폴리2-히드록시에틸메타크릴레이트를 95% 에탄올에 5mg/㎖가 되도록 용해시킨 코트제(Folkman J & Moscona A, Nature 273:345-349, 1978, 일본국특허공개 평8-9966호 공보 등), 분기 폴리알킬렌글리콜 유도체(WO2009/072590) 등을 사용할 수 있지만, 이들에는 한정되지 않는다. 임의의 세포 비부착성의 코트제를 사용할 수 있다. 코트 두께는 PET, 폴리카보네이트, 폴리 불화 비닐리덴 등의 기재막에 세포의 비접착 특성을 충분하게 부여하는 범위이면 된다. 그러한 두께는 코트제의 종류에 따라서도 다르지만, 예를 들면 10∼100㎛로 하는 것이 바람직하고, 10∼25㎛로 하는 것이 더욱 바람직하다.
분리막(12)의 특히 바람직한 수식 방법에 대해서, 더욱 설명한다. 상기 코트제를 사용하는 방법에서는 분리막의 홀을 폐쇄시키거나, 또는 수계 배양액에 의해 용출시키거나, 유기 용제 잔존에 의한 세포로의 악영향이 우려되기 때문에, 이하와 같은 공유 결합법에 의한 분리막 표면 수식을 행하는 것이 바람직하다.
즉, 소망의 구경으로 고개공율로 개구시킨 소수성 폴리머로 이루어지는 기재막을 비닐피롤리돈계 폴리머, 에틸렌글리콜계 폴리머 및/또는 비닐 알코올계 폴리머 및 필요에 따라서 알코올을 첨가한 처리 수용액에 침지한 후, 고에너지선을 조사함으로써 표면 수식을 행하여 분리막을 제조한다.
폴리비닐피롤리돈계 폴리머란 폴리비닐피롤리돈, 비닐피롤리돈·아세트산비닐 공중합체, 비닐피롤리돈·비닐알코올 공중합체, 비닐피롤리돈·스티렌 공중합체, 비닐피롤리돈·디메틸아미노에틸메타크릴레이트 공중합체 및 이들의 변성 폴리머로 이루어진 군에서 선택되는 폴리머이고, 에틸렌글리콜계 폴리머는 측쇄에 에스테르기를 포함하는 것도 포함된다. 비닐 알코올계 폴리머는 비누화도에 의해 각종 종류의 것을 입수할 수 있지만, 한정하는 것은 아니다. 단, 이들 막표면 수식 폴리머는 수용성인 것이 바람직하다. 그 때문에, 예를 들면 수평균 분자량이 1만∼100만의 폴리머를 사용할 수 있지만, 수용성이면 이러한 분자량에는 한정되지 않는다. 이 처리 수용액에 있어서의 폴리피롤리돈계 폴리머의 농도는 10∼5000ppm이 바람직하다. 농도가 높아지면, 홀을 폐쇄하는 경우가 있기 때문에, 10∼2000ppm이 보다 바람직하다.
또한, 기재막의 표면 수식을 효율적으로 행하기 위해서, 기재막의 흡수율이 2% 이하인 경우에는 이 처리 수용액에는 알코올을 더 첨가하는 것이 바람직하다. 또한, 기재막의 흡수율이란 100㎛ 이하인 막두께의 기재막을 23℃ 24시간 수중에 침지하고, 중량 증가량을 측정하고, 이 중량 증가율의 값을 흡수율로 해서 정의한다.
흡수율이 2% 이하인 경우에 첨가하는 알코올로서는 잔존한 경우의 안전성을 고려하면 에탄올이 바람직하지만, 이것에 한정되지 않는다. 알코올의 농도는 처리 수용액의 중량에 대하여, 1중량% 이하가 바람직하고, 안전을 위해서는 0.5중량%이하, 또는 0.1중량% 이하가 바람직하다.
고에너지선으로서는 UV, 전자선, γ선 중 어느 하나를 사용할 수 있지만, 전자선 또는 γ선이 반응률을 높이기 쉽기 때문에 보다 바람직하다. 조사하는 선량은 5∼35kGy가 바람직하고, 특히 배양 장치 전체를 예를 들면 멸균 선량으로서 확인되고 있는 25kGy상당의 선량으로 조사함으로써 표면 수식과 멸균을 동시에 실시하는 것도 가능하다.
이렇게 하여 얻어진 분리막은 세포 비부착성의 관점으로부터 유용하고, 본 실시형태에 있어서의 막분취 장치에 유효하게 사용할 수 있다.
상부 구조체(10)의 측면부(11)의 재료로서는 일반적으로 세포 배양기로서 사용되는 통상의 것을 사용할 수 있고, 폴리에틸렌테레프탈레이트(PET), 폴리스티렌, 폴리프로필렌(PP), 폴리카보네이트 등의 플라스틱제로 할 수 있다.
상부 구조체(10)의 치수는 특정한 크기에는 한정되지 않지만, 예를 들면 저면부의 직경을 5∼8mm로 할 수 있다. 측면부(11)의 상단에 의해 규정되는 용기 개구부의 직경이, 예를 들면 6∼10mm로 할 수 있다. 저면부(12)로부터 개구부까지의 높이, 즉 용기의 깊이는 예를 들면 10∼15mm로 할 수 있다. 또한, 이러한 값은 일례이고, 상부 구조체(10)를 구성하는 용기의 치수는 검체 세포나 검체 조직의 종류나 채취하는 줄기 세포의 종류 등, 목적에 의해, 당업자가 적당하게, 결정할 수 있다.
다음에 하부 구조체(13)는 저면부와 측면부로 이루어지고, 상면에 개구부를 갖는 용기이다. 하부 구조체(13)의 재료로서는 측면도 저면도 동일한 것을 사용할 수 있고, 폴리스티렌, 글래스 등을 사용하는 것이 바람직하다. 세포 부착성, 세포 증식성을 부여하기 위해서이다. 또한, 하부 구조체는 저면부와 측면부가 고정되어서 일체로 되어 있는 것이 반드시 필요로 되지 않고, 실시형태에 따라서는 하부 구조체의 저면부를 하부 구조체와는 다른 별도의 부재로 구성할 수도 있다.
하부 구조체(13)는 상부 구조체(10)를 착탈 가능하게 적재할 수 있다. 적재했을 때에, 상부 구조체(10)를 구성하는 용기의 분리막(12)이 하부 구조체(13)에 수용된다. 이것은 후술하는 줄기 세포 분취 방법에 있어서, 하부 구조체(13)에 넣는 배지와 상부 구조체(10)를 구성하는 분리막(12)이 접촉하고, 분리막의 양측에서 줄기 세포의 통과를 가능하게 하기 위해서이다. 도시하는 실시형태에 있어서, 분리막(12)은 하부 구조체(13)의 저면에 접하지 않고, 분리막(12)과 하부 구조체(13)의 저면부의 사이에 공극이 형성된다. 이 공극에 배지를 충전시킬 수 있다.
하부 구조체(13)와 상부 구조체(10)의 적재시의 위치 관계를 고정하기 위해서, 도시하지 않는 유지 기구를 더 가져도 좋다. 유지 기구는 상부 구조체(10) 또는 하부 구조체(13)의 한쪽에 설치되어도 좋고, 쌍방에 설치되어도 좋다. 유지 기구로서는 예를 들면, 상부 구조체(10)의 측면 상단 또는 측면의 소정의 높이로부터, 개구부의 외측에 연장되는 플랜지 또는 클로형의 부재이어도 된다. 이러한 유지 기구는 하부 구조체(13)의 측면 상단에 접하고, 상부 구조체(10)를 소정의 높이로 유지할 수 있다. 유지 기구의 다른 예로서는 상부 구조체(10)에 형성되고, 상부 구조체(10)의 저면보다 아래로 연장되는 다리 형상의 부재이어도 된다. 이러한 유지 기구는 하부 구조체(13)의 저면에 접하고, 상부 구조체(10)를 소정의 높이로 유지할 수 있다. 이 때, 하부 구조체의 저면에도, 상기 다라 형상의 부재에 감합하고, 고정하는 부재를 설치할 수 있다.
하부 구조체(13)의 치수의 일례로서는 상기 상부 구조체(10)의 치수와의 관계에서, 예를 들면 저면부의 직경을 7∼15mm로 할 수 있다. 또한, 하부 구조체(13)의 측면부의 상단에 의해 규정되는 용기 개구부의 직경의 치수도 동일하다고 할 수 있다. 하부 구조체(13)의 깊이는 상부 구조체(10)의 깊이보다도 깊은 것이 바람직하고, 예를 들면 11∼20mm로 할 수 있다.
또한, 본 실시형태에 있어서는 원형의 저면 및 개구부를 갖고, 저면의 직경이 개구부의 직경보다도 작은 형상의 상부 구조체를 일례로서 설명하지만, 저면부(12)의 형상은 원형으로는 한정되지 않고, 타원형, 사각형, 다각형 또는 임의의 형상으로 할 수 있다. 또한, 저면부의 치수와 개구부의 치수의 관계도 본 실시형태와 같이 한정되지 않고, 저면부와 개구부와의 치수가 동일하여도 된다. 또한, 상부 구조체는 그 저면의 적어도 일부에 복수의 포어를 갖는 분리막을 갖고, 분리막 상에 세포를 파종하고, 유지할 수 있으면, 저면과 측면이 연속한 구체의 일부의 면을 포함해서 구성되는 것이 좋다. 하부 구조체(13)도 또한 본 실시형태에 있어서는 원형을 일례로서 설명하지만, 저면 및 개구부의 형상은 특정한 형상으로는 한정되지 않는다. 또한, 하부 구조체는 저면과 측면이 명확하게 구별할 수 있는 것일 필요는 없고, 저면과 측면이 연속한 구체의 일부의 면을 포함해서 구성되는 것이어도 된다.
이러한 막분취 배양기(1)는 포유류를 포함하는 임의의 생물 조직 또는 세포로부터 줄기 세포를 분취하기 위해서 사용할 수 있다. 분취할 수 있는 줄기 세포로서는 예를 들면 배성 줄기 세포, iPS 세포 및 조직 줄기 세포가 열거된다. 특히는 인간을 포함하는 포유류의 치수를 재생하는 목적에서, 치수 세포 또는 간엽계 세포로부터, 치수 줄기 세포 또는 간엽계 줄기 세포를 분취하기 위해서 사용할 수 있다. 간엽계 줄기 세포에는 예를 들면 골수 줄기 세포, 지방 줄기 세포, 양막 줄기 세포, 제대혈 줄기 세포가 포함된다. 그러나, 본 실시형태에 따른 막분취 배양기(1)의 용도는 이들에는 한정되지 않는다.
분취의 목적으로 하는 상기 치수 줄기 세포 또는 다른 조직 줄기 세포는 상세하게는 치수 또는 다른 조직(예를 들면, 골수, 지방 조직, 양막, 치근막, 활막, 제대) 유래의 CD105 양성 세포, CXCR4 양성 세포, SSEA-4 양성 세포, FLK-1 양성 세포, CD31 음성 또한 CD146 음성 세포, CD24 양성 세포, CD150 양성 세포, CD29 양성 세포, CD34 양성 세포, CD44 양성 세포, CD73 양성 세포, CD90 양성 세포, FLK-1 양성 세포, G-CSFR 양성 및 SP 세포 중 적어도 어느 하나를 포함하는 것이 바람직하다. 상기 SP세포가 CXCR4 양성, SSEA-4 양성, FLK-1 양성, CD31 음성 또한 CD146 음성, CD24 양성, CD105 양성, CD150 양성, CD29 양성 세포, CD34 양성 세포, CD44 양성 세포, CD73 양성 세포, CD90 양성 세포, FLK-1 양성 또는 G-CSFR 양성 중 어느 하나인 것이 바람직하다.
다음에, 본 실시형태에 의한 막분취 배양기(1)를 줄기 세포 분취 방법의 관점으로부터 설명한다. 줄기 세포 분취 방법은 상부 구조체(10)의 분리막(12) 상에 검체 세포(200) 또는 검체 조직을 파종하는 공정과, 하부 구조체(13)에 세포 유주 인자를 포함하는 배지(300)를 주입하는 공정과, 분리막(12)을 배지(300)에 접촉시키는 공정을 포함한다. 이들 공정에 의해, 하부 구조체(13)에 넣은 세포 유주 인자의 농도 구배를 이용하여, 분리막(12) 상부로부터 줄기 세포를 선택적으로 통과시킬 수 있고, 줄기 세포를 분취할 수 있다.
상부 구조체(10)의 분리막(12) 상에 검체 세포(200) 또는 검체 조직을 파종하는 공정에 있어서는 예를 들면, Nakashima, Archs oral Biol 36, 1991에 의해 기지의 방법에 의해 취득할 수 있는 검체 세포(200)를 배지(100)에 용해시키고, 상부 구조체(10)의 분리막(12) 상에 파종한다. 줄기 세포의 분취원으로서 사용하는 검체 세포(200)로서는 치수 세포 또는 간엽계 세포가 열거된다. 간엽계 세포에는 골수, 지방 조직, 양막, 치근막, 활막, 제대 유래의 세포가 포함되지만, 이들에는 한정되지 않는다. 또한, 배성 줄기 세포, iPS 세포를 분취하는 경우에는 분취원으로서 사용하는 검체 세포(200)로서는 배 및 배반포, 유전자 도입 또는 단백 도입 등을 실시한 체세포를 사용할 수 있다. 검체 조직을 사용하는 경우에는 세절 후 배지에 침지하고, 상부 구조체(10)의 분리막(12) 상에 정치한다.
검체 세포는 분리막 1mm2당 3×102cells∼3×104cells로 파종한다. 예를 들면, 직경 6.5mm의 분리막에 대해서는 세포 밀도가 1×102cells/100㎕∼1×107cells/100㎕인 것이 바람직하고, 1×104cells/100㎕∼1×106cells/100㎕인 것이 더욱 바람직하다. 세포 밀도가 지나치게 낮으면 증식하기 어렵고, 지나치게 높으면 유주하기 어렵기 때문이다. 또한, 분취하는 줄기 세포의 종류에 의해, 필요로 하는 검체 세포의 양은 다르고, 예를 들면 1×103cells의 치수 줄기 세포를 분취할 경우에 필요한 치수 조직으로부터의 검체 세포는 아주 작게, 예를 들면 1×105cells 정도가 된다. 특히, 치수 줄기 세포를 분취하는 경우의 가장 바람직한 검체 세포의 밀도는 3×102∼1.5×103cells/mm2이다. 한편, 동량의 골수 줄기 세포 또는 지방 줄기 세포를 분취하는 경우에 필요한 검체 세포는 예를 들면 각각 3×105cells 및 1×106cells 정도가 필요로 되는 경우가 있다. 또한, iPS 세포를 분취하는 경우에는 검체 세포(200)의 양은 도입 효율에 의해 다르다. 이러한 필요로 하는 검체 세포의 양은 당업자에게는 기지이고, 적당하게 결정할 수 있다. 또한, 검체 조직을 사용하는 경우에는 검체 조직은 분리막 1mm2당 0.1mg∼1mg으로 정치할 수 있다.
하부 구조체(13)에 세포 유주 인자를 포함하는 배지(300)를 주입하는 공정에 있어서는 배지에 세포 유주 인자를 용해시켜, 하부 구조체(13)에 주입한다. 하부 구조체(13)에 넣는, 배지에 첨가하는 세포 유주 인자가 SDF-1, G-CSF, bFGF, TGF-β, NGF, PDGF, BDNF, GDNF, EGF, VEGF, SCF, MMP3, Slit, GM-CSF, LIF, HGF, S1P, protocatechuic acid 및 혈청 중 적어도 어느 하나인 것이 바람직하다. 특히 유주 활성, 및 임상 사용에 있어서의 안전성의 관점으로부터, G-CSF 또는 bFGF가 가장 바람직하다. 또한, 상기 세포 유주 인자의 농도가 1ng/㎖∼500ng/㎖인 것이 바람직하다. 지나치게 옅으면 유주 효과가 없을 경우가 있고, 지나치게 진하면 줄기 세포가 분화되어버릴 우려가 있기 때문이다. 특히는 G-CSF 또는 bFGF를 세포 유주 인자로서 사용하는 경우에는 G-CSF 또는 bFGF의 농도가 50∼150ng/㎖인 것이 바람직하고, 약 100ng/㎖ 전후, 예를 들면 95∼105ng/㎖인 것이 특히 바람직하다. 가장 많은 줄기 세포 분취가 가능하고, 또한 분취한 줄기 세포에 있어서, 혈관 신생 인자, 신경 영양 인자의 mRNA 발현도 높은 값이 되기 때문이다.
사용하는 배지로서는 둘베코사 제작의 개변 이글 배지, EBM2 등을 사용할 수 있지만, 이들에는 한정되지 않는다. 줄기 세포의 배양에 사용할 수 있는 임의의 배지라도 된다. 배지의 양은 하부 구조체(13)의 용량에 의해 적당하게 결정할 수 있다. 배지에는 세포 유주 인자와 아울러, 혈청을 첨가하는 것이 바람직하다. 혈청은 세포 유주 활성을 촉진하는 효과가 있기 때문이다. 인간 줄기 세포를 분취하기 위해서는 인간 혈청을 사용하는 것이 바람직하고, 소 태아 혈청도 사용할 수 있다. 혈청의 첨가량은 배지의 체적에 대하여, 5∼20vol%로 하는 것이 바람직하다.
분리막(12)을 배지(300)에 접촉시키는 공정에서도 상부 구조체(10)를 하부 구조체(13)에 적층하고, 분리막(12)의 외측을 배지(300)에 충분하게 접촉시킨다. 이것에 의해 세포 유주 인자의 농도 구배가 가능하다. 그 결과로서, 검체 세포(200) 또는 검체 조직 중의 줄기 세포가 포어(121)를 통과하고, 하부 구조체(13)에 유주하고, 줄기 세포의 분취가 가능하게 된다. 접촉시킨 후의 작용 시간은 40∼50시간으로 하는 것이 바람직하다.
또한, 상기에 있어서는 상부 구조체(10)에 검체 세포(200) 또는 검체 조직을 하부 구조체(13)에 세포 유주 인자를 포함하는 배지를 각각 넣은 후에, 상부 구조체(10)를 하부 구조체에 적재하고, 분리막(12)을 배지에 접촉시키도록 설명했지만, 이들 3개의 공정은 순서에 상관없다. 상부 구조체(10)와 하부 구조체(13)를 조합시킨 후에 각각 파종, 주입해도 좋고, 실질적으로 동시에 행해도 된다.
또한, 이러한 줄기 세포 배양 방법은 특정한 용기의 형상에 의하지 않고 실시할 수도 있고, 그 경우, 줄기 세포 배양 방법은 포어를 갖는 분리막의 세포 비접착성의 면에 검체 세포 또는 검체 조직을 접촉시키는 공정과, 상기 분리막의 타방의 면에 세포 유주 인자를 포함하는 배지를 접촉시키는 공정을 포함한다.
본 실시형태에 의한 막분취 배양기(1) 및 이것을 사용한 줄기 세포 분취 방법에 의하면, 안전하면서, 또한 효율적으로 줄기 세포를 분취할 수 있다.
본 발명은 제 2 실시형태에 의하면, 가스 교환 시스템 및 배지 교환 시스템을 구비하는 막분취 배양기이다. 도 2는 본 실시형태에 의한 막분취 배양기(2)의 개념도이다. 막분취 배양기(2)는 상부 구조체(20)와 하부 구조체(23)에 더해서, 덮개 모양 구조체(24)를 더 포함한다.
상부 구조체(20)와 하부 구조체(23)의 기본적인 구조, 재료 및 기능은 제 1 실시형태에 있어서 설명한 바와 같다. 본 실시형태에 있어서는 하부 구조체(23)가 또한, 배지 도입구(231)와 배지 송출구(232)를 구비한다. 이들은 배지 교환 시스템을 구성한다. 배지 도입구(231) 및 배지 송출구(232)는 하부 구조체(23)의 용기 내부와 외부를 연통하는 개구부이다. 이러한 개구부에 의해, 하부 구조체(23)와 외부와의 사이에서, 세포 유주 인자 및/또는 분취한 줄기 세포를 포함하는 배지를 연통할 수 있다. 즉, 배지 송출구(232)로부터, 분취한 줄기 세포를 포함하는 배지(d)를 인출할 수 있고, 배지 도입구(231)로부터 세포 유주 인자를 포함하는 신선한 배지(c)를 도입할 수 있다. 그 때문에, 배지 도입구(231) 및 배지 송출구(232)는 도시하지 않는 않은 관에 접속되어 있어도 된다. 이러한 배지의 교환 기구에 의해, GMP에도 대응할 수 있는 비개방계(밀봉계)에 의한 세균이나 바이러스, 마이코플라자 감염을 시키지 않고, 안전성과 효율을 높인다고 하는 이점을 갖는다.
한편, 덮개 모양 구조체(24)는 상부 구조체(20)에 적재하고, 상부 구조체(20)의 개구부 및 하부 구조체(23)의 개구부를 덮는 덮개 모양 구조체이다. 덮개 모양 구조체가 하부 구조체(23) 또는 상부 구조체(20)와 하부 구조체(23)의 양쪽에 밀착하고, 막분취 배양기(2)를 외기로부터 밀폐하는 것이 바람직하다. 밀폐의 목적에서, 하부 구조체(23)의 측면 상단에 고무 또는 실리콘제의 패킹을 구비할 수 있다.
덮개 모양 구조체(24)는 또한, 가스 도입구(241)와 가스 배출구(242)를 구비한다. 이들은 가스 교환 시스템을 구성한다. 가스 도입구(241)와 가스 배출구(242)는 덮개 모양 구조체의 내부와 외부를 연통하는 개구부이다. 가스 도입구(241)와 가스 배출구(242)는 도시하지 않는 관에 접속되어 있어도 된다. 예를 들면, 가스 도입구(241)로부터 막분취 배양기(2) 내부에 CO2, N2 등의 불활성 가스(a)를 보내고, 가스 배출구(242)로부터, CO2 등을 포함하는 사용 완료 가스(b)를 배출할 수 있다.
덮개 모양 구조체(24)에 있어서는 포어 사이즈가 100nm 이하, 특히는 1∼100nm, 바람직하게는 10∼100nm의 복수의 포어를 형성한 실리콘 막을 더 구비할 수 있다. 실리콘 막은 덮개 모양 구조체에 있어서, 가스 도입구(241) 및 가스 배출구(242)를 덮도록 설치할 수 있다. 외부로부터의 마이코플라즈마의 침입 경로를 단절시키기 위해서이다. 이러한 가스 교환 시스템(24)을 구비하는 것은 GMP에도 대응할 수 있는 비개방계(밀봉계)에 의한 안전성과 효율 및 생존률을 향상시킨다고 하는 이점을 갖는다.
본 실시형태에 의한 막분취 배양기는 도시하지 않는 온도 조절 시스템을 더 구비해도 된다. 온도 조절 시스템은 밀봉된 막분취 배양기(2)의 내부의 온도를 측정하는 온도 측정 장치와, 막분취 배양기(2)의 외부로부터 막분취 배양기(2)를 가열하고, 또는 냉각하는 가열·냉각 장치로 구성된다. 온도 조절 시스템을 구비함으로써 예를 들면 하부 구조체(23)에 온도 감수성의 배지 시스템을 이용하여, 온도 조절 관리할 수도 있게 된다.
또한, 본 실시형태에 있어서는 배지의 교환 기구와 가스 교환 시스템(24)의 양쪽을 구비하는 막분취 배양기(2)에 관하여 설명했지만, 본 발명의 막분취 배양기는 이것에 한정되지 않고, 어느 한쪽을 구비하는 것이어도 된다. 제 2 실시형태에 의한 막분취 배양기(2)에 의하면, 보다 안전하고, 또한 순환식으로 배지 교환을 특히 필요로 하지 않는 배양을 행할 수 있고, 조직 재생에 바람직한 줄기 세포를 효율적으로 얻을 수 있다.
본 발명은 제 3 실시형태에 의하면, 덮개 모양 구조체를 구비하는 막분취 배양기이다. 도 3은 본 실시형태에 의한 막분취 배양기(3)의 구성을 나타낸 개념도이다. 막분취 배양기(3)는 상부 구조체(30)와 하부 구조체(33)에 더해서, 덮개 모양 구조체(34)를 더 포함한다.
본 실시형태에 있어서, 상부 구조체(30)는 원형의 저면을 갖는 축상부와 개구부를 갖는 원추대형부로 구성되는 하나의 용기이다. 상부 구조체(30)에 있어서는 저면의 직경보다도 개구부의 직경이 크도록 구성된다. 원추대형부의 개구부에는 외측으로 돌출하는 플랜지로 이루어지는 유지 기구(35)를 구비한다.
도시하는 하부 구조체(33)는 직경이 동일한 원형의 저면과 개구부를 구비한 관상 부재이다. 개구부 가까이에는 홈을 구비하고, 홈에는 밀봉용의 탄성체(331)를 유지하고 있다. 홈은 1중이어도 되고, 2중이어도 된다. 이 때에 사용되는 밀봉용의 탄성체의 재질은 실리콘 고무 등과 같이 조성이 명확한 합성 고무 등이 바람직하다. 또한, 원통의 중앙부 부근이며, 탄성체(331)를 형성한 홈과 저면의 사이에는 원통의 내벽면으로부터 내측으로 돌출되는 플랜지로 이루어지는 유지 기구(335)를 구비한다. 유지 기구(335)는 상부 구조체(30)의 유지 기구(35)와 계합하고, 상부 구조체(30)를 하부 구조체(33) 내부의 소정의 위치에 유지한다.
상부 구조체(30)와 하부 구조체(33)의 상기 이외의 기본적인 구조, 재료 및 기능은 제 1 실시형태에 있어서 설명한 바와 같다.
덮개 모양 구조체(34)는 상기 상부 구조체(30)와 하부 구조체(33)를 복설하거나 또는 밀봉할 수 있는 부재이다. 덮개 모양 구조체(34)는 상부 구조체(30)의 상방으로부터, 상부 구조체(30)와 하부 구조체(33)의 개구부를 덮는 것이면 되고, 그 재질은 제 1 실시형태에 있어서 설명한 하부 구조체와 같은 재질이다. 덮개 모양 구조체(34)에는 가스 교환 기구(도시하지 않음)를 더 구비하는 것이 바람직하다. 이 가스 교환 기구로서는 예를 들면, 덮개 모양 구조체(34)의 모든 면 또는 일부에 형성된 포어 사이즈가 100nm 이하, 특히는 1∼100nm, 바람직하게는 10∼100nm의 복수의 포어이어도 된다. 다른 예로서는 덮개 모양 구조체(34)의 적어도 일부에, 예를 들면, 가스 라인 필터용의 사불화 에틸렌(PTFE) 라미네이트막과 같은 고분자막에 의한 가스 통풍막을 부설해도 된다. 또한, 덮개 모양 구조체(34)는 제 2 실시형태 있어서 설명한 것 같은 가스 도입구과 가스 배출구를 더 구비하는 것이어도 된다.
덮개 모양 구조체(34)는 하부 구조체(33)와 조합되면, 상기 하부 구조체(33)의 홈에 유지되는 탄성체(331)에 밀착될 수 있다. 이러한 구성에 의해, 간단하게 밀봉을 실시할 수 있지만, 가스 교환 기능(도시하지 않음)을 더 구비함으로써 줄기 세포에 압력 변화를 주지 않는 구조를 제공하고 있다.
본 실시형태에 의한 이러한 덮개 모양 구조체(34)와 하부 구조체(33)를 구비하는 것은 복설의 경우에는 컨태미네이션의 위험율을 저감하고, 밀봉의 경우에는 예를 들면, 마이코플라즈마와 같은 컨태미네이션을 회피하고, 온도 변화에 의한 압력 변화도 회피한다고 하는 이점을 갖는다.
본 발명은 제 4 실시형태에 의하면, 복수의 상부 구조체를 구비해서 이루어지는 막분취 배양기이다. 도 4는 본 실시형태에 의한 막분취 배양기(4)의 구성을 나타낸 개념도이다. 막분취 배양기(4)는 복수의 상기 상부 구조체(40)와 복수의 상기 상부 구조체(40)를 로킹하는 프레임(45)과, 복수의 상기 상부 구조체(40)의 분리막을 침지시키는 유체를 정리해서 유지하는 용기로 구성되는 하부 구조체(43)를 포함한다.
본 실시형태에 있어서, 개개의 상부 구조체(40)의 구조는 제 3 실시형태와 동일해도 된다. 복수의 상부 구조체(40)는 각각이 다른 포어 사이즈 및/또는 포어밀도의 분리막을 구비하는 것이어도 좋고, 또는 모두 동일한 것이어도 된다.
프레임(45)은 하부 구조체(43) 중에 수납되는 구조체이며, 복수의 상부 구조체(40)를 각 홀(451)에 별개로 지지한다. 즉, 프레임(45)은 하부 구조체(40)로부터, 유지 기구(453)에 의해 일정한 높이로 유지되는 판상 부재에 형성된 복수의 홀(451)을 구비하는 상하가 개구된 부재이다. 격자상의 칸막이(452)는 판상 부재 상측의 영역을 단락지어서 구획을 형성하고, 하나의 구획에 하나의 홀(451)이 존재하고 있다. 프레임(45)의 재질은 제 1 실시형태에 있어서 설명한 하부 구조체와 동일이어도 된다. 또한, 유지 기구(453)는 판상 부재의 변연으로부터 하방으로 연장되는 다리 형상 부재이다. 유지 기구(453)는 판상 부재의 변연에만, 외부 프레임과 같이 형성되어 있고, 판상 부재상측의 칸막이(452)에 대응하는 개소에 슬릿이 형성되어 있다. 도 4는 24개의 홀을 갖는 프레임(45)의 구조를 나타내고 있지만, 프레임(45)의 홀의 수는 2개 홀이어도 96개 홀이어도 되고, 홀의 수는 한정되지 않는다. 또한, 프레임(24)의 판상 부재에 형성된 홀의 배치도 도시하는 형태로는 한정되지 않는다. 또한, 본 실시형태에 있어서의 유지 기구(453)는 판상 부재로부터 하방으로 연장되는 다리 형상 부재이지만, 하부 구조체의 내벽으로부터 내측으로 연장되는 플랜지를 설치하고, 이것에 계류시켜도 된다.
프레임(45)의 각 홀(451)에는 상부 구조체(40)를 착탈 가능하게 삽입할 수 있다. 상부 구조체(40)를 삽입했을 때, 상부 구조체(40)의 저면을 구성하는 분리막이 홀(451)과 하부 구조체(43)의 저면 내벽과의 사이에 위치하도록, 홀(451)이 상부 구조체(40)를 로킹한다. 즉, 홀(451)의 직경은 상부 구조체(40)의 저면의 직경보다도 크면서, 또한 개구부의 직경보다도 작도록 형성된다.
하부 구조체(43)는 프레임(45)을 착탈 가능하게 수용하는 용기이다. 하부 구조체(43)에는 홈이 1중의 형태로 부설되어 있다. 홈에는 제 3 실시형태에서 설명한 탄성체(431)가 형성되어 있다. 후술하는 덮개 모양 구조체(44)와 밀착시켜서, 막분취 배양기(4)의 내부를 밀폐하기 위해서이다. 그 밖의 하부 구조체(43)의 구조, 재료 및 기능은 제 1 실시형태에 있어서 설명한 바와 같다. 하부 구조체(43)는 배지 도입구과 배지 송출구(도시하지 않음)를 더 구비하고 있어도 된다. 도시하는 하부 구조체는 방형의 저면을 갖지만, 하부 구조체는 방형으로 한정되지 않고, 예를 들면 원형 또는 타원형이어도 된다.
덮개 모양 구조체(44)는 복수의 상부 구조체(40)의 상방으로부터, 복수의 상부 구조체(40)와 하부 구조체(43)의 개구부를 덮는다. 덮개 모양 구조체(44)의 기본적인 구조, 재료 및 기능은 제 3 실시형태에 있어서 설명한 바와 같다. 또한, 덮개 모양 구조체(44)는 제 3 실시형태에 있어서 예시한 가스 교환 기구(도시하지 않음)를 구비하는 것이어도 되고, 가스 도입구와 가스 배출구를 더 구비하는 것이어도 된다.
이러한 프레임(42)과 하부 구조체(43)를 구비하는 것은 예를 들면, iPS 세포와 같이 목적으로 하는 줄기 세포의 수가 적을 경우, 대량의 조직 세포를 검체로서 사용하고, 또한 단일의 하부 구조체로 수집할 수 있다고 한 이점을 갖는다.
본 발명은 제 5 실시형태에 의하면, 복수의 상부 구조체와 복수의 용기로 구성되다 하부 구조체를 구비하는 막분취 배양기이다. 도 5는 본 실시형태에 의한 막분취 배양기(5)의 구성을 나타낸 개념도이다.
막분취 배양기(5)는 복수의 상부 구조체(50)와 상기 프레임(55)과 각각의 상기 상부 구조체(50)의 분리막을 침지시키는 유체를 각각 개별적으로 유지하는 복수의 용기로 구성되는 하부 구조체(53)를 포함한다.
상부 구조체(50)의 기본적인 구조 및 기능에 대해서는 제 4 실시형태에 있어서 설명한 바와 같다. 본 실시형태에 있어서도, 복수의 상부 구조체(50)는 각각이 다른 포어 사이즈 및/또는 포어 밀도의 분리막을 구비하는 것이어도 되고, 또는 모두 동일한 것이어도 된다.
프레임(55)의 기본적인 구조 및 기능에 대해서는 제 4 실시형태에 있어서 설명한 바와 같지만, 본 실시형태에 있어서, 프레임(55)의 하부의 유지 기구(553)에는 하부 구조체(53)의 칸막이(532)와의 간섭을 회피하기 위해서, 복수의 슬릿이 형성되어 있다.
한편, 본 실시형태에 의한 하부 구조체(53)는 상기 복수의 상부 구조체의 각각에 대응하는 복수의 용기로 구성된다. 구체적으로는 하부 구조체의 본체가 격자상의 칸막이(532)에 의해 구분되어 있는 구획으로 구성되는 복수의 용기로 이루어진다. 격자상의 칸막이(532)는 하부 구조체(53)와 일체가 되어서 형성되는 것이라도 되고, 하부 구조체(53)에 착탈 가능한 부재라도 좋지만, 사용시에 칸막이(532)에 의해 형성되는 각 용기간에서의 물질의 연통할 수 없는 정도로 하부 구조체에 고정되어 있다.
하부 구조체(53)에는 프레임(55)을 적재하고, 수용할 수 있다. 적재했을 때, 하부 구조체(53)의 복수의 용기의 각각에 프레임(52)의 각 홀(551)이 대응한다. 또한, 하부 구조체(53)의 칸막이(532) 상에, 프레임(55)의 분리(552)가 중첩된다. 또한, 프레임(52)의 각 홀(551)에는 복수의 상기 구조체(50)의 각각을 적재할 수 있다. 이 때, 하부 구조체(53)의 하나의 용기와 하나의 상기 구조체(50)의 조합이 독립된 막분취 배양기로서 기능한다. 따라서, 칸막이(532)로 구획된 용기에는 상부 구조체(50)의 분리막을 침지시키는 유체를 각각 유지할 수 있다. 예를 들면, 다른 유주 인자 및/또는 배지를 포함한, 다른 종류의 유체를 별개의 용기에 넣어서, 막분리를 행할 수 있다.
본 실시형태에 의한 막분취 배양기(5)는 도시하지 않는 덮개 모양 구조체를 더 구비해도 좋다. 덮개 모양 구조체는 제 3 실시형태에 있어서 예시한 가스 교환기구(도시하지 않음)를 구비하는 것이어도 되고, 가스 도입구와 가스 배출구를 더 구비하는 것이어도 된다. 도시하는 하부 구조체(53)는 밀봉용의 홈을 가지지 않는 것이고, 복설하는 덮개 모양 구조체와 조합되어 사용할 수 있다.
제 5 실시형태에 의한 막분취 배양기(5)를 사용함으로써, 예를 들면 지금까지 분취한 경우가 없는 줄기 세포를 분취하는데 있어서, 상부 구조체의 포어 사이즈를 복수 배치하고, 여러 가지의 세포 유주 인자를 포함하는 배지를 복수 배치해서 조합시킴으로써 분취 조건의 스크리닝을 한번에 행할 수 있다고 한 이점을 갖는다.
본 발명은 제 6 실시형태에 의하면, 계대 배양을 가능하게 하는, 폐쇄계 막분취 배양기이다. 도 22는 본 실시형태에 의한 막분취 배양기(6)의 구성을 나타낸 개념도이다.
막분취 배양기(6)는 상부 구조체(60), 하부 구조체(63)에 더해, 디쉬(66)를 필수적인 구성으로 한다. 상부 구조체(60)의 기본적인 구조, 재료 및 기능은 제 1 실시형태에 있어서 설명한 바와 같다. 상부 구조체(60)의 개구부에는 상부 구조체(60)의 상방으로부터 개구부를 덮는, 덮개 모양 구조체(64)가 형성된다. 덮개 모양 구조체(64)는 도입구(65)를 구비한다. 도입구(65)는 덮개 모양 구조체(64)를 관통해서 형성되는 바람직하게는 실리콘제의 관이고, 상부 구조체(60)가 구성하는 용기 내부와 외부를 연통한다. 도입구(65)는 주로 막분취 배양기(6)의 내부에, 세절치수 조직 또는 치수 검체 세포를 외계로부터 오염시키지 않고 폐쇄계로 삽입하기 위해서 사용된다. 도입구(65)로부터는 폐쇄계로 배지 교환도 가능하다. 상부 구조체(60)가 구비하는 막(62)의 구조, 재료 및 기능은 상기 제 1 실시형태와 동일하다. 한편, 본 실시형태에 있어서의 하부 구조체(63)에는 측면부와 일체가 되어서 고정된 저면부가 존재하지 않고, 측면부만으로 구성되는 것 이외는 제 1 실시형태와 동일한 구성을 갖는다.
디쉬(66)는 저면부와 측면부로 구성되는 세포 배양이 가능한 용기이다. 디쉬(66)에는 배지의 회수구(661)가 형성되고, 외계로부터 오염되지 않고 폐쇄계로 배지 교환이나 배양 상청의 회수 또는 세포 회수가 가능하다. 디쉬(66)의 저면부로서, 용기의 내측에 면한 표면에는 도시하지 않는 표면 처리층이 형성된다. 표면 처리층은 세포 부착 및 증폭성이 우수한 특성을 갖고, 또한 열 또는 광 또는 그들의 양쪽에 대하여 반응하고, 분해 가능한 것이 바람직하다. 일실시형태에 의하면, 표면 처리층은 특정한 파장의 광조사에 반응하고, 표면 처리층을 구성하는 물질이 분해도록 설계할 수 있다. 일례로서, 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)를 디쉬(66)의 저면부로서, 용기의 내측에 면한 표면에 그래프트 중합시킨 표면 처리층을 형성할 수 있다. 이 표면 처리층은 37℃에서는 소수성을 유지하고 있지만, 30℃정도까지 온도를 내림으로써 상변화해서 친수성으로 변화되기 때문에 층표면에 부착된 세포를 박리시키는 것이 가능해진다. 다른 실시형태에 의하면, 표면 처리층은 특정한 온도 변화에 반응하고, 표면 처리층을 구성하는 물질이 분해하도록 설계할 수 있다. 일례로서는 콜라겐을 포함해서 이루어지는 표면 처리층을 형성할 수 있다. 이 경우, 콜라겐의 변성 온도까지, 온도를 높임으로써 표면 처리층이 분해하고, 층표면에 부착된 세포를 박리시키는 것이 가능해진다.
디쉬(66)의 상부에는 디쉬(66)의 상방으로부터, 디쉬(66)의 개구부를 덮는 덮개 모양 구조체(67)를 더 구비한다. 덮개 모양 구조체(67)는 디쉬(66)의 내부를 밀폐하고, 또한 상부 구조체(60)와 하부 구조체(63)의 적층체가 연직 방향으로 이동해도 밀폐 상태를 유지하도록 구성된다.
본 실시형태에 있어서는 하부 구조체(63)가 디쉬(66)의 내부에, 연직 방향으로 이동 가능하게 설치되어서 사용된다. 도 22(a)는 막분취를 행할 때의 설치 형태를 나타내는 개념도이다. 이 때, 막(62)과 하부 구조체(63)의 측면부와 디쉬(66)의 저면부가 폐쇄된 공간을 구성하고, 상부 구조체(60)로부터 유주한 세포를 공간의 내부에 유지한다. 디쉬(66)의 직경은 하부 구조체(63)의 직경의 약 7∼10배인 것이 바람직하다. 또한, 도 6은 각 부재를 명확하게 표시하기 위해서 축척을 변경해서 기재하고 있다.
하부 구조체(63)는 연직 방향, 상향으로 이동시키고, 고정하는 것이 가능하다. 배지의 교환 또는 줄기 세포의 회수를 위해서 하부 구조체(63)를 이동시켰을 때의 막분취 배양기(6)의 개념도를 도 22(b)에 나타낸다. 이 경우에도 덮개 모양 구조체(67)가 디쉬(66)를 밀폐할 수 있다.
다음에 제 6 실시형태에 따른 막분취 배양기(6)를 폐쇄계 배양 방법의 관점으로부터 설명한다. 폐쇄계 배양 방법은 막분취를 행하는 공정과, 줄기 세포를 증식시키는 공정과, 줄기 세포를 계대하는 공정과, 줄기 세포를 증폭하고, 회수하는 공정을 포함한다. 막분취를 행하는 공정에서는 제 1 실시형태에서 설명한 방법을 따라서 줄기 세포의 막분취를 행한다. 이러한 공정에 있어서, 상부 구조체(60)로부터 하부 구조체(63)에 유주한 세포는 하부 구조체(63)의 측벽부에 의해 둘러싸여진 디쉬(66)의 저면에 부착된다. 다음에 줄기 세포를 증식시키는 공정에서는 상부 구조체(60)와 하부 구조체의 적층체를 연직 방향 상향으로 이동시키고, 배지의 회수구(661)을 통해서 10% 혈청을 포함하는 DMEM 등의 증식 배지에 교환을 해서 유주 인자를 제거하고, 상부 구조체(60)와 하부 구조체의 적층체를 연직 방향 하향으로 이동시키고, (66)의 저면부에 접촉시켜 고정함으로써, 줄기 세포를 증식시킨다. 또한, 줄기 세포를 계대하는 공정을 실시한다. 이 때, 상부 구조체(60)와 하부 구조체의 적층체를 연직 방향 상향으로 이동시키고, 고정한다. 그리고, 표면 처리층에 광을 부여하거나 또는 열을 부여하거나, 또는 온도를 내림으로써 표면층을 분해시켜, 증식한 줄기 세포를 박리시킨다. 이 때, 하부 구조체(63)의 측벽부와 디쉬(66)의 저면부가 접촉하지 않고 있으므로, 줄기 세포는 디쉬(66) 전체에 확산된다. 그리고, 줄기 세포를 증폭하고, 회수하는 공정에서는 배지의 회수구(661)를 통하여, 계대 줄기 세포를 회수할 수 있다. 이 때, 회수구(661)에 원심 튜브를 연결시키고, 폐쇄계로 원심 분리하여 세포 또는 배양 상청을 회수할 수 있다. 또한, 각 공정에 있어서, 배지 교환은 배지의 회수구(661)를 통하여 행할 수 있다.
본 실시형태에 있어서는 디쉬(66)에 표면 처리층을 형성함으로써 종래, 세포를 배양 용기로부터 박리하기 위해서 통상 사용하는 트립신 등의 효소를 세포 박리에 사용할 필요를 없게 할 수 있다. 이 세포 배양 상청 및 세포는 효소를 포함하고 있지 않기 때문에, 원심해서 세정하지 않더라도 그대로 이식에 사용하는 것이 가능하다.
본 발명은 제 7 실시형태에 의하면, 막분취 배양 키트이다. 막분취 배양 키트는 막분취 배양기와 세포 유주 인자를 포함한다. 막분취 배양기로서는 상기 제 1 실시형태로부터 제 6 실시형태에 있어서의 막분취 배양기(1)∼(6) 중 어느 하나 또는 그 변형 형태의 것을 사용할 수 있다.
세포 유주 인자가 SDF-1, G-CSF, bFGF, TGF-β, NGF, PDGF, BDNF, GDNF, EGF, VEGF, SCF, MMP3, Slit, GM-CSF, LIF, HGF, S1P, protocatechuic acid 및 혈청 중 적어도 어느 하나인 것이 바람직하다. 또한, 상기 세포 유주 인자의 농도가 1ng/㎖∼500ng/㎖인 것이 바람직하다. 효율적으로 줄기 세포를 유주시키기 위해서다. 즉, 지나치게 옅으면 유주 효과가 없을 경우가 있고, 지나치게 진하면 분화되어버릴 경우가 있기 때문이다. 세포 유주 인자는 배지에 첨가해서 사용할 수 있다. 따라서, 본 실시형태에 의한 키트는 배지도 포함하는 것이어도 좋다. 이 때, 배지는 둘베코사 제작의 개변 이글 배지, EBM2 등을 사용할 수 있지만, 이들에는 한정되지 않는다.
특히 바람직하게는 본 실시형태에 따른 키트는 세포 유주 인자로서, G-CSF,또는 bFGF를, 바람직하게는 50∼150ng/㎖의 농도로 한 것을 키트의 구성 부재로서 포함한다. 또한, 세포 유주 인자에 더해서, 배지에 첨가하는 성분으로서, 인간 자기 혈청 또는 소 태아 혈청을 키트의 구성 부재로서 포함해도 좋다. 이들의 혈청은 배지의 체적에 대하여, 5∼20vol%의 농도로 첨가하도록 구성된다. 키트는 제 1 실시형태로부터 제 5 실시형태에 있어서의 장치 및 방법의 설명에 따라서, 제조하고, 사용할 수 있다.
본 실시형태에 따른 막분취 배양 키트에 의하면, 막분취 배양기 및 분취에 사용하는 세포 유주 인자를 사용하고, 제 1 실시형태에서 상술한 줄기 세포 분취 방법을 보다 조속히 실시할 수 있다.
본 발명은 제 8 실시형태에 의하면, 분리막이다.
본 실시형태에 의한 분리막은 소수성 폴리머로 이루어지는 기재막과, 비닐피롤리돈계 폴리머, 폴리에틸렌글리콜계 폴리머 및 비닐알코올계 폴리머로부터 선택되는 1개 이상의 친수성 폴리머가 상기 기재막의 표면에 공유 결합에 의해 결합되어서 이루어지는 기능층을 구비해서 이루어지는 분리막으로서, 상기 기능층을 구성하는 친수성 폴리머의 중량이 상기 분리막 전체 중량의 1.5중량%∼35중량%인 분리막이다.
막의 구멍을 폐쇄시키거나, 또는 수계 배양액에 의해 용출시키거나, 유기 용제잔존에 의한 세포로의 악영향이 우려되기 때문에, 본 발명에 있어서는 공유 결합법에 의한 막표면 수식을 행하는 것이 바람직하다. 즉, 소망의 구경으로 고개공율로 개구시킨 기재막을 비닐피롤리돈계 폴리머 및/또는 에틸렌글리콜계 폴리머 및/또는 비닐알코올계 폴리머, 및 경우에 따라서, 알코올을 첨가한 처리 수용액에 침지한 후, 고에너지선을 조사함으로써 기재막의 표면 수식을 행할 수 있다.
본 발명의 분리막의 기재막이 되는 폴리머에는 소수성 폴리머가 바람직하게 사용된다. 본 발명에 있어서, 소수성 폴리머란 20℃의 물 100g에 대한 용해도가 0.001g 미만인 폴리머를 나타낸다. 구체적으로는 소수성 폴리머는 술폰계 폴리머, 아미드계 폴리머, 카보네이트계 폴리머, 에스테르계 폴리머, 우레탄계 폴리머, 올레핀계 폴리머 및 이미드계 폴리머로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리머이어도 좋지만, 이들에 한정되지 않는다. 단, 이들 기재막을 구성하는 소수성 폴리머의 흡수율에 의해, 표면 개질 조건을 변경함으로써, 보다 효율적으로 단백질이나 세포의 부착 억제성을 부여할 수 있다.
기재막은 2개의 영역을 분리하기 위한 막이면, 홀이 열려 있을 필요는 없다. 물질 투과를 위해서는 예를 들면 투석막과 같이 40∼80nm의 홀이 열려 있는 것, 세포 분리를 위해서는 1∼10㎛의 홀이 열려 있는 것 등, 사용 목적에 따라서 구경을 선택하면 된다. 특히, 본 발명의 분리막은 세포의 주화성을 이용한 분리에 바람직하게 사용하는 것이 가능하고, 이 경우에는 3∼8㎛의 구경이 사용되기 쉽다.
이들 기재막을 구성하는 폴리머는 대개 소수성이 강하고, 단백질이나 세포 등을 많이 부착하는 경향이 있다. 특히, 활성화된 단백질이나 혈소판, 부착성 세포는 막표면에 부착되기 쉽기 때문에, 균일하게, 일정량 이상 표면 개질, 즉 친수성 폴리머의 공유 결합이 필요하다고 하는 결론에 도달했다.
비닐피롤리돈계 폴리머란 폴리비닐피롤리돈, 비닐피롤리돈·아세트산 비닐 공중합체, 비닐피롤리돈·비닐알코올 공중합체, 비닐피롤리돈·스티렌 공중합체, 비닐피롤리돈·디메틸아미노에틸메타크릴레이트 공중합체 및 이들의 변성 폴리머로 이루어진 군에서 선택되는 폴리머가 있고, 에틸렌글리콜계 폴리머는 측쇄에 에스테르기를 포함하는 것도 포함된다. 비닐알코올계 폴리머는 비누화도에 의해 여러가지 종류의 것을 입수할 수 있지만, 한정하는 것은 아니다. 본 발명에서는 이들 폴리머를 친수성 폴리머라 표현한다. 단, 이들 막표면 수식을 위한 친수성 폴리머는 수용성인 것이 바람직하다. 그 때문에, 예를 들면 수평균 분자량이 1만∼100만의 폴리머를 사용할 수 있지만, 수용성이면 이러한 분자량에는 한정되지 않는다.
본 발명에 있어서, 수용성의 폴리머란 20℃의 물 100g에 대한 용해도가 1g 이상, 바람직하게는 10g 이상인 폴리머를 말한다. 본 발명에 따른 분리막이 이러한 수용성 폴리머를 함유하고 있는 것이 단백질, 혈소판이나 부착성 세포 등의 부착 억제의 관점으로부터 바람직하다. 표면의 적당한 친수성과 소수성의 밸런스가 단백질이나 혈소판의 부착 억제를 위해서 중요한 것은 아닌가라고 생각되고 있다. 실제로, 보다 친수성이 강한 수용성 폴리머가 존재한 경우에는 단백질, 혈소판이나 부착성 세포 등의 부착 억제 효과가 더욱 향상하는 것이 확인되었다.
분리막에 함유되는 수용성 폴리머량은 분리막 전체 중량의 1.5중량% 이상이 바람직하고, 보다 바람직하게는 5중량% 이상이다. 또한, 함유량이 지나치게 많아도 효과는 바뀌지 않기 때문에, 40중량% 이하가 바람직하고, 보다 바람직하게는 35중량% 이하이다.
또한, 친수성 폴리머가 수용성 유닛과 에스테르기의 유닛을 갖는 공중합체이면, 1분자 중에서 적당한 친수성과 소수성의 밸런스가 얻어지므로 바람직하다. 따라서, 공중합체로서는 그래프트 공중합체보다도 블록 공중합체나 교호 공중합체, 랜덤 공중합체가 바람직하게 사용된다. 이것은 그래프트 중합체에서는 주쇄에 그래프트한 유닛 부분이 단백질 등과 접촉하는 기회가 많기 때문에, 공중합체로서의 특성보다도, 그래프트쇄 부분의 특성이 큰 영향을 주기 때문이라 생각된다. 또한, 블록 공중합체보다도 교호 공중합체, 랜덤 공중합체가 보다 바람직하다. 블록 공중합체에서는 각각의 유닛의 특성이 뚜렷이 나뉘기 때문이라고 생각된다. 1분자 중에서 친수성과 소수성의 밸런스라고 하는 점에서는 랜덤 공중합체 및 교호 공중합체에서 선택되는 적어도 하나를 갖는 공중합체가 바람직하게 사용된다. 에스테르기 함유 폴리머 중의 에스테르기 유닛의 몰비는 0.3 이상, 0.7 이하가 바람직하다. 에스테르기 유닛의 몰비가 0.3 미만이면, 에스테르기의 부착 억제 효과가 저감한다. 또한, 0.7을 초과하면, 수용성 유닛의 효과가 저감한다.
분리막 표면에 존재하는 표면 개질 폴리머인 친수성 폴리머의 존재량은 예를 들면, 원소 분석이나 핵자기 공명(NMR) 측정, ESCA와 전반사 적외 분광법(이하, ATR라고 기재하는 경우가 있음)을 조합함으로써 알 수 있다. 이것은 ESCA는 표면의 약10nm까지의 깊이를 측정하는 것이고, ATR은 표면 측정이지만, 수㎛까지의 깊이의 조성을 측정하는 것에 의한다. 폴리술폰 분리막을 예로 들면, 막 중의 임의의 개소에 있어서의 폴리술폰 유닛의 존재량에 대한 친수성 폴리머의 존재량의 비를 유닛량비로 하면, ESCA에서 얻어진 유닛량비의 값이 ATR에서 얻어진 값보다도 30%이상 크면, 본 발명에서 말하는 막표면의 에스테르기 함유 폴리머 존재량이 막내부 보다도 30%이상 크다고 할 수 있다. 또한, 각 측정의 값은 3점의 평균값으로 한다.
다음에 본 실시형태를 성형체의 표면 개질 방법의 관점으로부터 설명한다. 성형체의 표면 개질 방법은 소수성 폴리머로 이루어지는 성형체를, 비닐피롤리돈계 폴리머, 폴리에틸렌글리콜계 폴리머 및 비닐알코올계 폴리머로부터 선택되는 1개 이상의 친수성 폴리머를 10∼2000ppm 함유하고, 또한 경우에 의해, 알코올을 0.01∼0.2중량% 함유하는 처리 수용액에 침지하는 침지 공정과 침지 공정에 의해 얻어진 성형체에 고에너지선을 조사하고, 성형체 표면을 단백질 부착 억제성, 세포 부착 억제성으로 개질하는 개질 공정을 구비한다. 이러한 성형체의 표면 개질 방법은 성형체가 특정한 기재막의 경우에는 상기에서 설명한 분리막의 제조 방법이라고도 할 수 있다. 이 방법은 간편하면서, 또한 소량으로 실시할 수 있기 때문에 바람직한 방법이다.
여기서 말하는 소수성 폴리머로 이루어지는 성형체는 막으로 한정되지 않고, 특정한 형상을 갖는 성형체이면 된다. 막을 사용하는 경우에는 상기 분리막의 구성에 있어서 기재막으로서 설명한 것이며 되고, 그 경우에는 분리막의 제조 방법이 된다.
처리 수용액은 소수성 폴리머로 이루어지는 성형체를 침지하기 위한 수용액이다. 처리 수용액에 있어서는 비닐피롤리돈계 폴리머, 폴리에틸렌글리콜계 폴리머 및 비닐알코올계 폴리머로부터 선택되는 1개 이상의 친수성 폴리머를, 합계의 농도로 10∼5000ppm이 되도록 포함하는 것이 바람직하고, 10∼2000ppm이 보다 바람직하다. 또한, 구체적인 농도는 친수성 폴리머의 종류에 따라 다른 경우가 있다. 친수성 폴리머 용액의 농도가 낮으면, 소수성 폴리머로 이루어지는 성형체를 충분히 코팅할 수 없을 경우가 있다. 또한, 농도가 지나치게 높으면, 예를 들면 성형체가 막일 경우에는 홀을 폐쇄하거나, 용출물이 증가하거나, 분리막 성능의 저하가 야기되거나 하는 경우가 많다. 또한, 후술과 같이 알코올을 첨가함으로써, 또한 효율적으로 표면 개질을 행할 수 있기 때문에 보다 저농도를 설정할 수 있다.
또한, 표면 수식을 효율적으로 행하기 위해서, 소수성 폴리머로 이루어지는 성형체의 소재의 흡수율에 의해, 처리 수용액의 조성을 변경하는 것이 바람직하다.여기서, 본 발명이 있어서, 소수성 폴리머로 이루어지는 성형체의 흡수율이란 성형체의 소재를 30∼100㎛의 막두께인 막으로 했을 경우에, 정제수로 세정 후, 건조한 막을 23℃의 물에 24시간 침지하고, 이 사이의 중량 증가율을 측정한다. 이 중량 증가율이 흡수율이다. 또한, 성형체가 분리막의 경우에는 200㎛ 이하의 막두께이면 그대로 정제수로 세정 후 건조하고, 23℃의 물에 24시간 침지하고, 이 사이의 중량증가율로부터 산출할 수 있다.
소수성 폴리머로 이루어지는 성형체의 흡수율이 2% 이하인 경우에는 이 처리 수용액에 알코올을 더 첨가하는 것이 바람직하다. 알코올을 공존시킴으로써 소수성 폴리머로 이루어지는 성형체의 표면을 한번에 덮을 수 있기 때문이다. 첨가하는 알코올로서는 잔존했을 경우의 안전성을 고려하면 에탄올이 바람직하지만, 이것에 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 글리세린과 같은 다가 알코올을 사용하는 것도 가능하다. 첨가하는 알코올의 농도는 처리 수용액 전체 중량의 1중량% 이하가 바람직하고, 안전을 위해서는 0.5중량% 이하, 또는 0.1중량% 이하가 바람직하다. 알코올을 이용하여 흡착 효율을 높여 둠으로써 효율적으로 표면 개질을 행할 수 있기 때문에, 보다 저농도의 친수성 폴리머의 사용이라도 동정도의 표면 개질을 실현할 수 있다. 즉, 친수성 폴리머의 사용량을 감할 수 있고, 생산시의 코스트 저감에 효과가 있다.
한편, 소수성 폴리머로 이루어지는 성형체의 흡수율이 2%를 넘는 경우에는 처리 수용액에 알코올을 넣을 필요는 없다.
침지하는 공정에 있어서는 성형체의 전부를 처리 수용액에 침지해도 좋고, 표면 개질을 행하고 싶은 성형체의 부분만을 처리 수용액에 침지해도 좋다.
개질 공정에 있어서 사용하는 고에너지선으로서는 UV, 전자선, γ선, X선을 사용할 수 있다. 전자선 또는 γ선이 반응율을 높이기 쉽기 때문에 보다 바람직하다. 또한, 잔류 독성의 적음이나 간편함의 점으로부터는 γ선이나 전자선을 사용하는 것이 바람직하다. 조사하는 선량은 5∼35kGy가 바람직하고, 특히 배양 장치 전체를 예를 들면, 멸균 선량으로서 확인되고 있는 25kGy 상당의 선량으로 조사함으로써 표면 수식과 멸균을 동시에 실시하는 것도 가능하다. 그러나, 조사 선량이 100kGy 이상이면 생산성이 나빠지고, 폴리머의 분해 등이 일어나기 때문에, 바람직하지 못하다.
또한, 고에너지선을 조사할 때에, 산소가 존재하면, 산소 라디칼 등이 발생하고, 소수성 폴리머로 이루어지는 성형체가 분해되어버리는 것이 알려져 있다. 따라서, 방사선 조사할 때의 성형체 주위의 산소 농도는 10체적% 이하인 것이 바람직하다.
제 8 실시형태에 의한 분리막은 높은 부착 억제성을 가지므로, 수처리용 분리막이나 생체 성분 분리막으로서 적합하게 사용할 수 있다. 또한, 본 실시형태에 의한 개질 방법은 막 뿐만 아니라, 각종 성형체에도 적용할 수 있고, 용이하게 높은 효율로 표면 개질을 실시할 수 있다. 이러한 표면 개질 방법은 특히, 혈액 정화용 모듈에 적합하다. 여기서, 혈액 정화용 모듈이란 혈액을 체외로 순환시켜서, 혈 중의 노폐물이나 유해 물질을 제거하는 기능을 갖은 모듈을 말하고, 인공 신장이나 외독소 흡착 칼럼 등이 있다.
이하에, 본 발명을 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이하의 실시예에 의해 하등 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
[TaxiScan에 의한 치수 줄기 세포의 유주에 유효한 유주 인자의 비교]
real time 수평 화학 주화성 분석은 개 4대째의 치수 줄기 세포 CD31-SP 세포를 사용했다. TAXIScan-FL(Effector Cell Institute, 동경)은 6㎛의 홀이 있는 silicon 및 글래스 플레이트 사이에, 세포의 크기로 최적화(8㎛)한 채널을 형성하고, 채널내의 일단에 세포(105cells/㎖을 1㎕)를 주입했다. 10ng/㎕의 각종 유주 인자를 일정 농도 구배로 형성시키도록 1㎕씩 반대측에 넣었다. 유주의 video상으로부터, 30분 마다의 유주 세포수를 4시간까지 계측했다. 도 6(a)는 유주 인자에 의한 유주능의 차이를 시간 경과로 나타낸다. BDNF는 매우 신속하게 치수 줄기 세포가 유주하고, 2시간으로 플래토우(plateau)에 달했다. SDF-1 및 bFGF도 비교적 신속히 유주가 진행되었다. GDNF, VEGF, MMP3, G-CSF 모두 서서히 유주 세포가 증가하고, 4시간 후에는 PDGF, GM-CSF 이외에, 거의 동일한 유주 세포수가 되었다.
[TaxiScan에 의한 치수 줄기 세포의 유주에 유효한 유주 인자의 농도]
TAXIScan-FL의 마이크로 채널에 개 4대째의 치수 줄기 세포 CD31-SP 세포를 105cells/㎖를 1㎕주입하고, G-CSF의 농도를 0, 0.1, 1, 5, 10, 20, 40, 100ng/㎕로 1㎕씩, 반대측에 넣어, 유주의 video상으로부터, 30분 마다의 유주 세포수를 1시간 반까지 계측했다. 도 6(b)은 G-CSF의 농도의 차이에 의한 유주능의 차이를 시간 경과로 나타낸다. 10ng/㎕가 가장 유주 세포수가 많고, 이어서, 5, 40, 20, 100, 1, 0.1ng/㎕의 순서로, 유주 세포수의 감소가 보였다.
[TaxiScan에 의한 치수 줄기 세포의 유주에 유효한 혈청의 농도]
TAXIScan-FL의 마이크로 채널에 인간의 치수 줄기 세포를 105cells/㎖을 1㎕ 주입하고, 인간 혈청의 농도를 0, 5, 10, 15, 20%로 1㎕씩, 반대측에 넣어, 유주의 video상으로부터, 3시간 마다의 유주 세포수를 24시간까지 계측했다. 또한, 인간 혈청 10% 및 20%와 100ng/㎖의 GCSF 및 SDF-1을 사용했을 경우에 있어서의 유주능을 비교했다. 도 7(a)은 혈청의 농도의 차이에 의한 유주능의 차이를 시간 경과로 나타낸다. 20%가 가장 유주 세포수가 많고, 이어서, 15, 10, 5%의 순으로, 유주 세포수의 감소가 보여졌다. 도 7(b)는 G-CSF, SDF-1에 의한 유주능의 시간 경과로 나타낸다. G-CSF, SDF-1은 20% 혈청보다도 유주 세포수가 많았다.
[치수 줄기 세포의 분취]
세포 비접착성에 코트한 셀 컬처·인서트의 PET 막(2×105 포어/cm2, 포어 사이즈가 3㎛)을 저면에 장착한 저면의 직경 6.4mm, 개구부의 직경 11.0mm, 높이 17.5mm의 PET제의 상부 구조체와 저면의 직경 15.0mm, 개구부의 직경 15.0mm, 높이 22.0mm의 폴리스티렌제의 하부 구조체로 구성되는 막분취 배양기를 조립했다. PET막 표면에는 미리, 막부분으로의 세포 부착 억제성 부여를 위해서, 폴리비닐피롤리돈-폴리아세트산비닐 공중합체(비닐피롤리돈/아세트산 비닐(6/4) 공중합체(BASF사 제작, "코리돈 VA64")) 1000ppm 수용액에 0.1% 에탄올을 첨가한 수용액에 침지하고, 밀봉한 상에서 γ선 25kGy를 조사해서 수식해서 분리막을 조제했다. 이 상부 구조체의 막 상부에, 1×105cells/250㎕의 개 신선 초대 치수 세포를 파종하고, 하부 구조체에 10% 개 혈청을 포함하는 둘베코사 제작의 개변 이글 배지(DMEM) 중에 G-CSF 또는 SDF-1을 최종 농도로 100ng/㎖ 넣었다. 6시간 후에 배지 교환하고, G-CSF를 제거하고 또한 10% 개 혈청을 포함하는 DMEM 중으로 배양했다. 도 8(a), (b) 및 (c)에 유주하고, 부착, 또한 증식한 치수 줄기 세포의 위상차 현미경상을 나타낸다. 모든 유주 인자에 있어서, 성상으로 돌기를 갖는 세포가 부착되고, 플로우 사이토메트리에서 CD31-SP 세포, CD105+ 세포 또는 CXCR4+ 세포를 분취했을 경우와 같이 증식하는 것이 명확하게 되었다.
[분취한 치수 줄기 세포의 특징화]
막분취 배양기에서 G-CSF 및 SDF-1을 사용해서 막분취한 상기 치수 줄기 세포를 3대 계대 후, 2% 혈청을 포함하는 DMEM 중에 1×106 cells/㎖로 세포를 분산시키고, 각종 줄기 세포 표면 항원 마커의 항체(CD29, CD31, CD34, CD44, CD73, CD90, CD105, CD146, CD150, CXCR4)을 사용해서 4℃에서 30분 라벨 후, 플로우사이토메트리를 행했다. 즉, 마우스 IgG1 negative control(AbD Serotec Ltd.), 마우스 IgG1 negative control(fluorescein isothiocyanate，FITC)(MCA928F)(AbD Serotec), 마우스 IgG1 negative control(Phycoerythrin-Cy5, PE-Cy5)(MCA928C) (AbD Serotec), 마우스 IgG1 negative control(Alexa 647)(MRC OX-34)(AbD Serotec), 이하에 대한 항체: CD29(PE-Cy5)(MEM-101A)(eBioscience), CD31(FITC) (Qbend10)(Dako), CD34(Allophycocyanin, APC)(1H6)(R&D Systems, Inc.), CD44(Phycoerythrin-Cy7, PE-Cy7)(IM7)(eBioscience), CD73(APC)(AD2)(BioLegend), CD90(FITC)(YKIX337.217)(AbD Serotec), anti-human CD105(PE)(43A3)(BioLegend) CD146(FITC)(sc-18837)(Santa Cruz, Biotech, Santa Cruz, CA, USA), CD150(FITC)(A12)(AbD Serotec), CXCR4(FITC)(12G5)(R&D)을 이용하여 90분, 4℃에서 라벨링했다. 컨트롤로서, 플로우 사이토메트리로 분취한 개 치수 CD105+ 세포를 사용했다.
표 1은 상기 막분취 배양기에서 분취 배양한 치수 줄기 세포의 3대째의 플로우 사이토메트리에 의한 줄기 세포의 표면 항원의 발현을 나타내는 표이다. 개 치수 CD105+ 세포와 동일하게, 막분취 배양기로 분취한 세포는 G-CSF를 사용한 경우, CD105 양성률이 95.1%이고, SDF-1를 사용한 경우, 89.5%이었다. 또한, CD29, CD44, CD73, CD90는 양쪽 획분 모두 95% 이상이고, 줄기 세포·전구 세포가 많이 포함된다고 생각되었다. 또한, CXCR4에 대해서는 플로우 사이토메트리로 분취한 개 치수CD105+ 세포에 비교해서 절반이고, 또한 CD31, CD146은 거의 음성이었다.
Figure 112013085119608-pct00001
이어서, totalRNA를 Trizol(Invitrogen)를 이용하여, G-CSF를 사용한 막분취 치수 줄기 세포의 3대째로부터 분리하고, ReverTra Ace-α(Toyobo)로 First-strand cDNA를 합성하고, Light Cycler-Fast Start DNA master SYBR Green I (Roche Diagnostics)로 라벨링한 후, 줄기 세포 마커(CXCR4, Sox2, Stat3, Bmi1)의 real time RT-PCR을 Light Cycler(Roche Diagnostics)로, 95℃에서 10초, 62℃에서 15초, 72℃에서 8초의 프로그램으로 행했다. 또한, 혈관 유도 인자 및 신경 영양 인자로서, matrix metalloproteinase(MMP)-3, VEGF-A, granulocyte-monocyte colony-stimulating factor(GM-CSF), NGF, BDNF를 사용했다. 컨트롤로서, 치수CD105+ 세포 및 미분취의 치수 검체 세포를 사용하고, β-actin으로 표준화했다.
표 2는 줄기 세포 마커, 혈관 유도 인자 및 신경 영양 인자의 real time RT-PCR 해석에 사용하는 프라이머를 나타낸다.
Figure 112013085119608-pct00002
표 3에, G-CSF를 사용한 개 막분취 치수 줄기 세포 및 치수 CD105+ 세포의 3대째의 real time RT-PCR에 의한 줄기 세포 마커, 혈관 유도 인자 및 신경 영양 인자의 mRNA의 치수 검체 세포와 비교했을 경우의 값을 나타낸다. 혈관 유도 인자·신경 영양 인자의 VEGF, GDNF는 거의 같은 발현량을 나타내고, GM-CSF, MMP3은 막분취 세포가 10 이상 높고, BDNF 및 NGF는 CD105 양성 세포쪽이 높은 발현이 보였다. 줄기 세포 마커 CXCR4 및 Bmi1은 막분취 세포쪽이 대단히 높고, Stat3 발현은 거의 동등하고, Sox 2는 막분취 세포쪽이 약간 낮았다.
Figure 112013085119608-pct00003
[in vitro에 있어서의 다분화능]
3대째부터 5대째에 있어서 치수 막분취 세포의 혈관, 신경으로의 분화 유도를 행했다. 결과를 도 9에 나타낸다. 도 9(a)에 나타내는 바와 같이, 막분취 치수 줄기 세포는 혈관 내피 세포로의 분화능을 나타냈다. 또한, 도 9(b)에 나타내는 바와 같이, 막분취 치수 줄기 세포는 neurosphere 형성을 나타냈다.
실시예 2
[막분취 치수 줄기 세포의 발골 후 근관내 자가 이식에 의한 치수 재생]
개(Narc, Chiba, Japan) 영구치 완전 근첨 완성치를 전부 치수 제거하고, 세포 획분을 이식해서 치수를 재생시키는 실험적 모델을 확립했다. sodium pentobarbital(Schering-Plough, Germany)로 전신 마취 후, 상악 제 2 절치 및 하악 제 3 절치의 완전 치수 제거를 행하고, 근첨부를 #70K-file(MANI.INC, Tochigi, Japan)을 이용하여 0.7mm로 확대했다. 근첨측에 실시예 2에서 막분취한 치수 줄기 세포를, 치관측에 G-CSF를 이식했다. 즉 5×105개의 4대째의 막분취 치수 줄기 세포를 collagen TE(Nitta Gelatin Inc., Osaka, Japan)와 아울러 DiI 라벨링 후, 근관내의 하부에 자가 이식했다. 근관 상부는 collagen TE와 아울러 최종농도 15ng/㎕의 G-CSF를 더 이식했다. 와동(窩洞)은 인산 아연 시멘트(Elite Cement, GC, Tokyo, Japan) 및 본딩재(Clearfil Mega Bond, Kuraray)로 처리한 후, 컴포짓 레진(Clearfil FII, Kuraray, Kurashiki, Japan)으로 수복했다. 컨트롤로서, 치수 CD105 양성 세포를 사용했다. 14일 후에 표본을 제작했다. 형태 분석을 위해서 4% paraformaldehyde(PFA)(Nakarai Tesque, Kyoto, Japan)로 4℃ 밤새 고정하고, 10% 포름산으로 탈회 후, paraffin wax(Sigma)로 포매했다. paraffin 절편(두께 5㎛)을 hematoxylin-eosin(HE) 염색하고, 형태학적으로 관찰했다.
도 10(a)은 G-CSF 및 막분취 치수 줄기 세포 자가 이식에 의한 치수 재생을 나타내는 도면이다. 도 10(b)는 도 10(a)에 있어서의 사각으로 둘러싼 에리어(b)의 확대도이다. 도 10(c)는 도 10(a)에 있어서의 사각으로 둘러싼 에리어 C의 확대도이다. 도 10(a), 도 10(b) 및 도 10(c)에 나타내는 바와 같이, 막분취 치수 줄기 세포를 G-CSF와 아울러 이식하면, 치수 유사 조직이 14일까지 형성되었다. 도 10(b)에 나타내는 바와 같이 재생 조직 중의 세포는 방추형 또는 성상이고, 정상 치수 조직의 세포(도 10(d))에 유사하고 있었다. 도 10(c)에 나타내는 바와 같이 상아 아세포 유사 세포는 근관의 상아질벽에 부착되고, 세관 내로 돌기를 연장하고 있었다.
실시예 3
[인간 막분취 치수 줄기 세포]
막분취 배양기(1×105 포어/cm2, 포어 사이즈가 8㎛)를 사용하고, 1×105 cells/100㎕의 인간 신선 초대 치수 세포를 막 상부에 파종했다. 막 하부 구조체에는 10% 인간 혈청만 또는 10% 인간 혈청을 포함하는 DMEM 중에 G-CSF를 10ng/㎖ 또는 100ng/㎖ 넣었다. 22시간 후에 배지 교환해서 G-CSF를 제거해서 10% 인간 혈청을 포함하는 DMEM 중에서 더 배양했다. 도 11에 유주하고, 부착, 또한 증식한 치수 줄기 세포의 위상차 현미경상을 나타낸다. 도 12(a), (b), (c)에 나타내는 바와 같이 10% 인간 혈청, G-CSF10ng/㎖ 및 100ng/㎖ 모두에 있어서 성상으로 돌기를 갖는 세포가 부착되고, 플로우 사이토메트리로 CD31-SP 세포, CD105+ 세포 또는 CXCR4+ 세포를 분취한 경우와 동일하게 증식하는 것이 명확하게 되었다(도 12(d), (e)).
실시예 4
[막분취 조직 줄기 세포]
본 발명에 따른 막분취 배양기(1×105 포어/cm2, 포어 사이즈가 8㎛)를 사용하고, 1×105cells/100㎕의 돼지 치수 세포, 골수 세포, 지방 세포를 막 상부에 파종하고, 막 하부 구조체에 10% 소 태아 혈청을 포함하는 DMEM 중에 G-CSF를 100ng/㎖ 넣고, 22시간 후에 배지 교환하고 G-CSF를 제거하고, 10% 소 태아 혈청을 포함하는 DMEM 중에서 더 배양했다. 도 13(a), (b), (c)에 나타내는 바와 같이, 치수, 골수, 지방 모두 성상으로 돌기를 갖는 세포가 부착되고, 도 13(d)에 나타내는 바와 같이 플로우 사이토메트리로 CD31-SP 세포, CD105+ 세포를 분취했을 경우와 같이 증식하는 것이 명확하게 되었다.
실시예 5
[1. TAXIScan에 의한 치수 줄기 세포의 유주에 유효한 유주 인자의 비교]
인간 미분취의 치수 세포를 이용하여, TAXIScan-FL(Effector Cell Institute, 동경)에 의한 Real time 수평 화학 주화성 분석을 행했다. 6㎛의 홀이 있는 silicon 및 글래스 플레이트0 사이에, 세포의 크기에 최적화(8㎛)된 채널을 형성하고, 채널내의 일단에 세포(105 cells/㎖를 1㎕)를 주입했다. 10ng/㎕의 각종 유주 인자(BDNF, GDNF, NGF, PDGF, G-CSF, SDF-1, bFGF, VEGF, LIF 및 GM-CSF)를 일정 농도 구배로 형성되도록 1㎕씩 반대측에 넣었다. 유주의 video상으로부터, 3시간마다의 유주 세포수를 15시간까지 계측했다. 또한, 유주 인자로서 G-CSF 및 bFGF를 이용하여, 10% 소 태아 혈청을 첨가했을 경우의 유주능의 변화를 검토했다.
각종 유주 인자를 사용했을 경우의 유주능의 측정 결과를 도 14에 나타낸다. 각종 유주 인자에 의한 유주능의 차이를 시간 경과로 보면, BDNF, GDNF, NGF, PDGF, G-CSF에 있어서, 유주 세포가 많이 보였다. SDF-1, bFGF, LIF에 있어서도, 비교적 많이 유주 세포가 보였다. GM-CSF에서는 그다지 유주가 보이지 않았다.따라서, 이후, 임상에서 사용되는 기준(의약품 및 의약 부외품의 제조 관리 및 품질 관리의 기준에 관한 성령: GMP)을 만족하는 약제가 용이하게 입수될 수 있고, 일본에서 약사 인가 완료된 G-CSF 및 bFGF를 유주 인자로서 비교 검토했다.
G-CSF 및 bFGF에 의한 유주능의 측정 결과를 도 15에 나타낸다. G-CSF 및 bFGF을 첨가한 경우, 10% 혈청만의 경우보다도 유주능이 높고, G-CSF 및 bFGF의 각각 10% 혈청을 첨가하면 유주가 더욱 촉진되었다. 그 중에서도, G-CSF쪽이 bFGF보다 유주를 촉진하는 것이 명확하게 되었다. 이 결과로부터, 막 유주 분취에는 G-CSF에 10% 혈청을 첨가해서 행하는 것이 유효한 것이 확인되었다.
상기한 바와 같이, 줄기 세포 마커의 발현은 G-CSF 10ng/㎖로 분취한 막분취세포는 플로우 사이토미터로 분취한 CD105+ 세포와 비교해서 유사한 줄기 세포 마커 발현율이었다. G-CSF 100ng/㎖로 분취한 막분취 세포는 CD105+세포와 비교해서 CXCR4, G-CSFR 발현율이 높고, 줄기 세포가 보다 많이 포함되어 있는 것이 시사되었다. 또한, G-CSF 100ng/㎖에서의 막분취 세포는 CD105+ 세포와 비교해서, 보다 높은 세포 증식능, 유주능을 갖고 있었다. 또한, 혈관 신생 인자, 신경 영양 인자의 mRNA 발현에 관해서도 G-CSF 100ng/㎖로 분취했을 때, 가장 높은 발현을 나타내는 것이 확인되었다. 발명자들은 치수 CD105+ 세포가 혈관 유도능, 신경 유도능이 높고, 치수 재생능이 높은 것을 이미 보고하고 있지만, G-CSF 100ng/㎖로 분취한 막분취 세포에 관해서도 CD105+ 세포와 동일하게 치수·상아질 재생에 유용한 것이 본 실험 결과에 의해 시사되었다.
[2. 막분취기를 사용한 치수 줄기 세포 분취를 위한 파종 세포수]
막분취기로서는 상부 구조로서, 셀 컬처·인서트(폴리카보네이트 기재막(Polycarbonate Membrane) Transwell(등록상표）Inserts, 2×105 포어/cm2, 포어 사이즈 8㎛, 저면의 직경 6.4mm, 개구부의 직경 11.0mm, 높이 17.5 mm)(Corning)을 하부 구조로서 24 well plate(직경 15.0mm, 개구부의 직경 15.0mm, 높이 22.0mm)(Falcon)에 삽입해서 사용했다. 단, 폴리카보네이트 기재막으로의 세포 비접착성 부여를 위해서, 폴리비닐피롤리돈―폴리아세트산비닐 공중합체(비닐피롤리돈/아세트산 비닐(6/4) 공중합체(BASF사 제작, "코리돈 VA64")) 1000ppm 수용액에 0.1% 에탄올을 첨가한 수용액에 침지하고, 밀봉한 상태에서 γ선 25kGy를 조사해서 수식하고, 분리막을 조제했다. 폴리비닐피롤리돈―폴리아세트산비닐 공중합체가 기재막 표면에 공유 결합되지만, 폴리머 자신의 안전성은 높고, 동시에 사용한 에탄올에 관해서도 γ선 조사에 의해 분해되어서 저농도화하는 것 등으로부터, 이 표면 수식의 안전성은 높다. 이 분리막 상부에, 인간 2대째 치수 세포를 2×104cells/100㎕, 1×105cells/100㎕ 파종하고, 하부 구조체의 24 well 중에 10% 인간 혈청을 포함하는 둘베코사 제작의 개변 이글 배지(DMEM) 중에 G-CSF를 최종 농도로 100ng/㎖ 넣고, 48시간 후에 G-CSF를 제거하고, 10% 인간 혈청을 포함하는 DMEM에 배지 교환하고, 24well 하부에 부착된 세포수를 위상차 현미경 하에서 측정했다.
그 결과, 분취 세포율은 2×104cells/100㎕에서 5%, 1×105cells/100㎕에서 1%이었다. 이러한 결과로부터, 세포수에 의해 세포의 분취 효율이 다른 것이 시사되었다.
[3. 막분취기를 사용한 치수 줄기 세포 분취를 위한 유주 인자 작용 시간]
막분취기의 분리막 상부에 인간 2대째 치수 세포를 2×104cells/100㎕ 파종하고, 하부 구조체의 24well 중에, 10% 인간 혈청을 포함하는 DMEM 중에 G-CSF를 최종 농도로 100ng/㎖ 넣고, 12, 24, 48시간, 72시간 후에 24well 하부에 부착된 세포수를 위상차 현미경 하에서 측정했다.
G-CSF 작용 시간을 12, 24, 48, 72시간으로 하고, 각각에 있어서 부착 세포수를 측정한 결과, 12시간 후에는 분취 세포율은 0.3%, 24시간 후에는 1.7%, 48시간 후에는 5%, 72시간 후에서도 5%이었다.
[4. 막분취기를 사용한 치수 줄기 세포 분취를 위한 G-CSF 농도]
막분취기의 분리막 상부에, 인간 2대째 치수 세포를 2×104cells/100㎕ 파종하고, 하부 구조체의 24well 중에 10% 인간 혈청을 포함하는 둘베코사 제작의 개변 이글 배지 중에 G-CSF를 최종 농도로 0, 10, 100, 500ng/㎖ 넣었다. 48시간 후에 G-CSF를 제거하고, 10% 인간 혈청을 포함하는 DMEM에 배지 교환하고, 24well 하부에 부착된 세포수를 위상차 현미경 하에서 측정했다. 또한, 배양해서 70% 컨플루언트(confluent) 후에 계대했다.
각종 농도의 G-CSF를 이용하여 막분취한 상기 치수 줄기 세포를 6대 계대 후, 플로우 사이토메트리를 이용하여, 줄기 세포 표면 항원 마커 발현율을 측정했다. 즉, 2% 혈청을 포함하는 DMEM 중에 1×106cells/㎖로 세포를 분산시키고, 줄기 세포 마커 항체를 이용하여 4℃에서 30분 라벨링 후, 플로우 사이토메트리를 행했다. 즉, 마우스 IgG1 negative control(AbD Serotec Ltd.), 햄스터 IgG(PE-cy7)(eBio299Arm)(eBioscience), rat IgG2b(PE-cy7)(RTK4530)(Biolegend), 마우스 IgG1(APC)(NOPC-21)(Biolegend), 마우스 IgG1(RPE)(SFL928PE)(AbD Serotec), 마우스 IgG1(Alexa647)(F8-11-13)(AbD Serotec), 마우스 IgG2a (FITC)(S43.10)(MACS), 마우스 IgG1(FITC)(MOPC-21)(Biolegend), 이하에 대한 항체 : CD29(Phycoerythrin, PE-cy7)(eBio299Arm)(eBioscience), CD31(PE)(WM59)(BD Pharmingen), CD44(PE-cy7)(IM7)(eBioscience), CD73(APC)(AD2)(Biolegend), CD90(Alexa647)(F15-42-1)(AbD Serotec), CD105(PE)(43A3)(Biolegend), CD146(Alexa647)(OJ79c)(AbD Serotec), CXCR4(FITC)(12G5)(R&D Systems), G-CSFR(CD114)(FITC)(38660)을 이용하여 90분, 4℃에서 라벨링했다. 컨트롤로서, 플로우 사이토메트리로 분취한 인간 치수 CD105+ 세포 및 미분취의 인간 치수 검체 세포를 사용했다.
이어서, total RNA를 Trizol(Invitrogen)을 이용하여, 각종 농도의 G-CSF를 사용한 막분취 세포의 6대째로부터 분리하고, ReverTra Ace-α TOYOBO)로 First-strand cDNA를 합성하고, Light Cycler-Fast Start DNA master SYBR Green I (Roche Diagnostics)로 라벨링한 후, 혈관 유도 인자, 신경 영양 인자의 real time RT-PCR을 Light Cycler(Roche Diagnostics)로, 95℃에서 10초, 65℃에서 15초, 72℃에서 8초의 프로그램으로 행했다. 혈관 유도 인자 및 신경 영양 인자로서, granulocyte-monocyte colony-stimulating factor(GM-CSF), matrix metalloproteinase(MMP)-3, VEGF-A, brain-derived neurotrophic factor(BDNF), nerve growth factor(NGF), neurotrophin-3(NT-3)의 프라이머(표 4)를 사용했다. 컨트롤로서, 치수 CD105+ 세포 및 미분취의 인간 치수 검체 세포를 사용하고, β -actin으로 표준화했다.
Figure 112013085119608-pct00004
또한, in vitro에 있어서, 7대째의 치수막 분취 세포의 혈관, 신경, 지방, 상아질·뼈로의 분화 유도를 통상의 방법에 따라서 행했다. 또한, 각종 G-CSF 농도에 의해 분취한 인간 막분취 세포의 인간 10% 혈청 또는 G-CSF 100ng/㎖ 자극에 의한 세포 증식능 및 10% 인간 혈청 및 G-CSF 100ng/㎖에 의한 세포 유주능을 비교했다.
Plate에 부착, 또한 증식한 치수 줄기 세포를 위상차 현미경상으로 관찰했다. 6대째 미분취의 인간 치수 검체 세포, 6대째 인간 치수 CD105+ 세포, 10% 혈청만으로 막분취해서 배양 7일 후의 막분취 세포, G-CSF 10 ng/㎖+10% 혈청으로 막분취해서 배양 7일 후의 막분취 세포, G-CSF 100ng/㎖+10% 혈청으로 막분취해서 배양7일 후의 막분취 세포, G-CSF 500ng/㎖+10% 혈청으로 막분취해서 배양 7일 후의 막분취 세포에 대해서, 위상차 현미경상을 얻었다. 10% 인간 혈청, G-CSF 0, 10ng/㎖, 100ng/㎖, 500ng/㎖의 모든 농도를 사용한 경우에, 성상으로 돌기를 갖는 세포의 부착, 증식이 보였다. 부착 세포수를 측정한 바, G-CSF 100 ng/㎖에서는 분취 세포율이 5%이고, 이어서 500ng/㎖에서 4%, 10 ng/㎖에서 3%, 0ng/㎖에서 2%이었다.
다음에 플로우 사이토메트리에 의한 줄기 세포 표면 마커의 해석을, 표 5에 나타낸다. 플로우 사이토메트리로 줄기 세포 마커 발현율을 비교한 바, CD29, CD44, CD73, CD90은 거의 양성으로 차이가 보이지 않았다. CD105는 미분취 인간 치수 검체 세포에서는 19%인 것에 대해, G-CSF 10ng/㎖ 및 100ng/㎖에 있어서, 컨트롤의 CD105+ 세포와 같이 90% 이상이었다. 또한, G-CSF 500ng/㎖ 및 0ng/㎖에서 막분취한 것에서는 CD105 발현율은 각각 67% 및 58%로 낮았다. CXCR4은 미분취 인간 치수 검체 세포에서는 4.5%, CD105+ 세포에서는 8%, G-CSF 0ng/㎖에서는 5%로 낮은 발현율이었다. 이것에 대하여 G-CSF 100ng/㎖에서는 가장 높게 15%이고, G-CSF 10ng/㎖, 500ng/㎖에서도 10% 이상이었다. 한편, G-CSF의 리셉터인 G-CSFR은 CD105+ 세포 18%에 대하여, G-CSF 100ng/㎖는 가장 높게 76%이고, G-CSF 500ng/㎖, 10ng/㎖의 순으로 감소가 보였다. 이상의 것으로부터, CD105, CXCR4 및 G-CSFR의 양성률이 가장 높은 G-CSF 100ng/㎖로 막분취한 세포가 줄기 세포·전구 세포를 가장 많이 포함할 가능성이 시사되었다.
Figure 112013085119608-pct00005
G-CSF 100ng/㎖에서의 막분취 세포를 이용하여 다분화능을 검토했다. G-CSF 농도(100ng/㎖)에 의해 분취된 막분취 세포의 혈관 유도능, 신경 유도능을 위상차현미경 화상에 의해 조사했다. 막분취 세포에서는 CD105+ 세포와 같이, 매트리겔 상에서 6시간 후에 색상(索狀) 구조가 보이고, 혈관 내피 세포로의 분화능을 나타냈다. 미분취 인간 치수 검체 세포에서는 장시간 관찰해도 색상 구조 형성은 보이지 않았다. 미분취의 인간 치수 검체 세포에서는 거의 확인되지 않았지만, G-CSF 100ng/㎖에서의 막분취 세포는 유도 14일에서 CD105+ 세포와 동일하게 neurosphere 형성이 보였다. G-CSF 농도(100ng/㎖)에 의해 분취된 막분취 세포의 지방 유도능을 광학 현미경 화상에 의해 조사했다. 지방 유도는 모든 세포 획분에 있어서 관찰되었지만, 지방 마커 mRNA의 발현량은 미분취의 인간 치수 검체 세포와 비교해서 높았다. 매우 바람직한 G-CSF 농도(100ng/㎖)에 의해 분취한 막분취 세포의 뼈·상아질 유도능을 광학 현미경 화상에 의해 조사했다. 뼈·상아질 유도도 모든 세포 획분에 있어서 관찰되었다. 뼈·상아질 마커 mRNA 발현량은 미분취의 인간 치수 검체 세포와 비교하고, 막분취 세포에서는 발현량이 낮았다.
Real time RT-PCR에 의해 혈관 유도 인자 및 신경 영양 인자의 mRNA 발현을 해석한 결과를, 표 6에 나타낸다.
Figure 112013085119608-pct00006
미분취의 인간 치수 검체 세포와 비교하여 혈관 유도 인자·신경 영양 인자의 GM-CSF, MMP3은 막분취 세포가 모든 농도에서 10배 이상 높고, VEGF, BDNF, GDNF, NGF 및 NT-3은 CD105+ 세포와 거의 동일하게 또는 2배(G-CSF 100ng/㎖에서의 막분취 세포에 있어서)의 발현량을 나타내고, 미분취의 인간 치수 검체 세포에 비해서 높은 발현이 보였다. 줄기 세포 마커에 대해서는 Sox2가 막분취 세포에 있어서 발현량이 10배 이상 높고, Oct4 , Nanog, Rex1에 관해서는 CD105+ 세포와 거의 동일하게 또는 2배(G-CSF 100ng/㎖에서의 막분취 세포에 있어서)의 발현량이었다.
인간 혈청에 의한 세포 증식능의 비교(*p < 0.05)의 그래프를 도 16에 나타낸다. 혈청에 대한 증식능은 모든 세포 획분에 있어서 유의차는 확인되지 않았다. G-CSF(100ng/㎖)에 의한 세포 증식능의 비교(**p<0.01, *p<0.05 : vs 미분취 인간 치수 검체 세포, ##p<0.01 : vs 치수 CD105+ 세포)를 도 17에 나타낸다. G-CSF에 대한 증식능은 G-CSF 100ng/㎖, 500ng/㎖에서의 막분취 세포가 가장 높고, 미분취의 인간 치수 검체 세포 및 CD105+ 세포와 비교하고, 유의차가 보였다. 농도가 다른 G-CSF에 대한 세포 유주능의 비교(**p<0.01, *p<0.05 : vs 미분취 인간 치수 검체 세포, ##p<0.01, #p<0.05 : vs 치수 CD105+ 세포)를 도 18에 나타낸다. G-CSF에 의한 유주능은 G-CSF 100ng/㎖에서의 막분취 세포가 가장 높고, 미분취의 인간 치수 검체 세포 및 CD105+ 세포에 비해서 유의차가 보였다.
[5. 마우스 하지 허혈 모델을 사용한 in vivo에 있어서의 혈관 신생능]
마우스 하지 허혈 모델을 제작하고, 허혈 부위에 미분취의 인간 치수 검체 세포, G-CSF 100ng/㎖에서의 막분취 세포, CD105+ 세포를 이식하고, 14일 후에 혈류량을 레이저 도플러(Doppler) 해석하고, 혈관 신생은 동결 절편을 제작하고, BS-1 lectin 염색에 의한 면역 조직학적 해석을 행했다.
레이저 도플러 해석의 결과, 검체 세포의 이식에서는 혈류량의 개선이 그다지 확인되지 않았지만, 막분취 세포를 이식함으로써 CD105+ 세포를 이식했을 때와 동일하게 현저한 혈류량의 개선이 확인되었다. 또한, 동결 절편을 제작하고, BS-1 lectin염색을 행하면, 막분취 세포의 이식에 의해, CD105+ 세포의 이식시와 동일하게 혈관 신생이 확인되었다.
[6. SCID 마우스를 사용한 in vivo에 있어서의 치수 재생능]
인간 발거치를 슬라이싱 후, 일단을 시멘트로 봉쇄하고, 미분취의 인간 치수 검체 세포, G-CSF 100ng/㎖에서의 막분취 세포, CD105+ 세포를 Scaffold로서 콜라겐과 함께 주입하고, SCID 마우스의 피하에 이식하고, 3주간 후, 치수 재생능을 비교했다. 형태를 HE 염색으로, 신경 재생능 및 혈관 신생능을 각각 PGP9.5, BS1 lectin 염색, Ki67 염색에 의해 면역 조직학적으로 해석했다. 이식 세포의 국재에 대해서는 인간 특이적 유전자 Alu에 대한 in situ hybridization에 의해 해석했다. 또한, 재생 치수 조직에 있어서의 치수 특이적 마커 mRNA 발현을 정상 치수 조직과 비교했다.
HE 염색의 결과, 인간 막분취 세포의 이식에 의해, CD105+ 세포의 이식시와 동일하게 치수 유사 조직의 형성이 확인되었다. 한편, 미분취의 검체 세포의 이식에서는 치수 유사 조직의 형성은 소량이었다. 또한, BS1 lectin, PGP9.5염색의 결과, 막분취 세포의 이식에 의해, CD105+ 세포의 이식시와 동일하게 혈관 신생, 신경 재생이 확인되었다. 또한, 이식 세포의 증식은 거의 보이지 않고, Alu의 in situ hybridization의 결과, 재생 치수 유사 조직을 형성하고 있는 것은 숙주의 마우스 세포인 것이 명확하게 되었다.
재생 치수 유사 조직이 치수인 것을 mRNA 발현 레벨로 조사한 결과를 표 7에 나타낸다.
Figure 112013085119608-pct00007
치수 특이적 마커인 TRH-DE, 치수에 있어서 발현이 높은 것이 보고되고 있는 Syndecan, Tenascin C의 발현이 정상 치수와 동일하고, 치근막, 지방 조직, 뼈·상아질 마커 mRNA의 발현은 확인되지 않았다. 이것으로부터, 막분취 세포의 이식에 의해 확인된 재생 치수 유사 조직은 치수인 것이 명확하게 되었다.
실시예 6
[치수, 골수, 지방 줄기 세포막 분취법]
[1. 막분취기를 사용한 치수, 골수, 지방 줄기 세포 분취]
골수, 지방 세포로부터 막분취법에 의해 치수 세포와 동일하게 줄기 세포를 분취할 수 있는지를 검토했다. 막분취기로서는 상부 구조로서, 셀 컬처·인서트(폴리카보네이트 기재막(Polycarbonate Membrane) Transwell(등록상표) Inserts, 2×105포어/cm2, 포어 사이즈 8㎛, 저면의 직경 6.4mm, 개구부의 직경 11.0mm, 높이 17.5mm)(Corning)을 하부 구조로서 24well plate(직경 15.0 mm, 개구부의 직경 15.0mm, 높이 22.0mm)(Falcon)에 삽입해서 사용했다. 폴리카보네이트 기재막은 세포가 접착하지 않도록 표면 코트 처리했다. 폴리카보네이트 기재로의 세포 비접착성 부여를 위해, 폴리비닐피롤리돈―폴리아세트산비닐 공중합체(비닐피롤리돈/아세트산비닐(6/4) 공중합체(BASF사 제작, "코리돈 VA 64"))1000ppm 수용액에, 0.1% 에탄올을 첨가한 처리 수용액에 폴리카보네이트 기재막을 침지하고, 밀봉한 상에서 γ선 25kGy를 조사해서 수식하는 표면 코트 처리를 미리 행하여 분리막을 조제했다. 이 분리막 상부에, 돼지 2대째 치수, 골수, 지방 세포를 1.5×104cells/100㎕ 파종하고, 하부 구조체의 24well 중에 10% FBS를 포함하는 둘베코사 제작의 개변 이글 배지(DMEM) 중에 G-CSF를 최종 농도로 100ng/㎖ 넣고, 24시간 후에 G-CSF를 제거하고, 10% FBS를 포함하는 DMEM에 배지 교환해서 배양하고, 70% 컨플루언트 후에 계대했다.
그 결과, 치수 줄기 세포 분취시와 동일한 조건에서, 골수, 지방 세포에 있어서도 분리막 하부에 세포가 분취되는 것을 확인했다.
[2. 줄기 세포 표면 항원 마커 양성률의 측정]
돼지 치수, 골수, 지방막 분취 세포를 5대 계대 후, 플로우 사이토메트리를 이용하여, 줄기 세포 표면 항원 마커 양성률을 측정했다. 2% FBS를 포함하는 PBS 중에 1×106cells/㎖로 세포를 분산시키고, 줄기 세포 마커 항체를 이용하여 4℃에서 60분간 라벨링 후, 플로우 사이토메트리를 행했다. 구체적으로는 마우스 IgG1 negative control(AbD Serotec Ltd.), 햄스터 IgG(PE-cy7)(eBio299Arm)(eBioscience), 래트 IgG2b(PE-cy7)(RTK4530)(Biolegend), 마우스 IgG1(APC)(NOPC-21)(Biolegend), 마우스 IgG1(RPE)(SFL928PE)(AbD Serotec), 마우스 IgG1(Alexa647)(F8-11-13)(AbD Serotec), 마우스 IgG2a(FITC)(S43.10)(MACS), 마우스 IgG1(FITC)(MOPC-21)(Biolegend), 이하에 대한 항체 : CD29(Phycoerythrin, PE-cy7)(eBioHMb1-1)(eBioscience), CD31(PE)(LCI-4)(AbD Serotec), CD44(PE-cy7)(IM7)(eBioscience), CD73(APC)(AD2)(Biolegend), CD90(Alexa647)(F15-42-1)(AbD Serotec), CD105(FITC)(MEM-229)(Abcam), CXCR4(FITC)(12G5)(R&D Systems), G-CSFR(CD114)(Alexa 488)(S1390)(Abcam)을 이용하여 60분, 4℃에서 라벨링했다. 라벨링 후, Hepes를 최종 농도 0.01M, FBS를 2%가 되도록 첨가한 Hank's Buffer를 가해, 플로우 사이토메트리를 행했다. 음성 컨트롤로서, 미분취의 치수, 골수, 지방 검체 세포를 사용했다.
플로우 사이토메트리에 의한 줄기 세포 마커 발현율의 비교 결과를 표 8에 나타낸다.
Figure 112013085119608-pct00008
CD29 , CD44, CD73, CD90은 거의 양성으로 막분취 세포와 미분취의 검체 세포간에서 차이는 확인되지 않았다. CD105은 미분취 검체 세포에서는 치수, 골수, 지방 세포에서 각각, 14.7%, 22.3%, 25.9%이었던 것에 대해, 막분취 세포에서는 각각 70.8%, 73.2%, 61.7%로 모두 미분취 검체 세포와 비교해서 양성률이 높았다. 또한, CXCR4은 미분취 검체 세포에서는 치수, 골수, 지방에 있어서 5.9%, 4.1%, 2.8%이었던 것에 대해, 막분취 세포는 14.1%, 14.2%, 7.0%로 양성률이 높았다. 또한, G-CSF의 수용체인 G-CSFR에 관해서도, 미분취 검체 세포에 있어서 23.7%, 21.9%, 23.6%이었던 것에 대해, 막분취 세포에서는 74.2%, 48.5%, 49.5%로 양성률이 높았다. 이상의 것으로부터, 막분취법에 의해, 골수, 지방 세포로부터 치수 세포와 동일하게 CD105, CXCR4 및 G-CSFR의 양성률이 높은, 줄기 세포·전구 세포를 분취할 수 있는 것이 확인되었다.
[3. 혈관 신생 인자, 신경 영양 인자, 줄기 세포 마커 mRNA 발현의 해석]
이어서, Real time RT-PCR로 혈관 신생 인자, 신경 영양 인자, 줄기 세포 마커 mRNA 발현의 해석을 행했다. total RNA를 Trizol(Invitrogen)을 이용하여, 5대 계대한 치수, 골수, 지방막 분취 세포와 각각의 미분취 검체 세포로부터 추출하고, DNase(Roche) 처리 후, ReverTra Ace-α(TOYOBO)로 First-strand cDNA를 합성하고, Light Cycler-Fast Start DNA master SYBR Green I(Roche Diagnostics)로 라벨링 후, 혈관 신생 인자, 신경 영양 인자, 줄기 세포 마커의 real time RT-PCR를 Light Cycler(Roche Diagnostics)로, 95℃에서 10초, 65℃ 또는 60℃로 15초, 72℃에서 8초의 프로그램으로 행했다. 혈관 신생 인자 및 신경 영양 인자, 줄기 세포 마커로서 사용한 프라이머를 표 9에 나타낸다. granulocyte-monocyte colony-stimulating factor(GM-CSF), vascula endothelin growth factor(VEGF)-A, matrix metalloproteinase(MMP)-3, chemokine(C-X-C motif) receptor(CXCR)-4, brain-derived neurotrophic factor(BDNF), glial cell line-derived neurotrophic factor(GDNF), nerve growth factor(NGF), nanog homeobox(Nanog), SRY(sex determining region Y)-box 2(Sox2), signal transducer and activator of transcription(STAT)-3, telomerase reverse transcriptase(Tert), Bmi1 polycomb ring finger oncogene(Bmi-1)의 프라이머는 β-actin으로 표준화했다.
Figure 112013085119608-pct00009
혈관 유도 인자 및 신경 영양 인자의 mRNA발현을 해석한 결과를 표 10에 나타낸다. 막분취 세포는 미분취의 검체 세포와 비교하고, GM-CSF, MMP3, BDNF는 약 5∼10배 발현량이 높고, VEGF, GDNF, NGF는 CD105+ 세포와 거의 동일하게 또는 2배(G-CSF 100ng/㎖에서의 막분취 세포에 있어서)의 발현량을 나타내고, 미분취의 치수 검체 세포와 비교해서 높은 발현이 보였다.
Figure 112013085119608-pct00010
[4. 혈관 유도능, 세포 증식능, 세포 유주능의 해석]
in vitro에 있어서, 5대째의 치수, 골수, 지방막 분취 세포의 혈관 유도능, 세포 증식능, 세포 유주능을 조사했다. 혈관 유도능에 대해서는 EGM-2(Lonza) 배지에 분산된 세포를 matrigel 상에서 3차원 배양하고, 관강형 성능을 비교했다. 세포 증식능에 대해서는 10% FBS 또는 G-CSF 100ng/㎖ 자극에 의한 세포 증식능을 테트라칼라원(생화학 바이오 비지니스)을 이용하여 측정했다. 또한, G-CSF에 대한 세포 유주능을 TAXIScan-FL에 의한 Real time 수평 화학 주화성 분석을 했다. 즉, 6㎛의 홀이 있는 silicon 및 글래스 플레이트 사이에, 세포의 크기로 최적화(8㎛)한 채널을 형성하고, 채널내의 일단에 돼지 치수, 골수, 지방막 분취 세포, 미분취의 각종 검체 세포(105cells/㎖를 1㎕)를 주입했다. 10ng/㎕의 각종 유주 인자를 일정 농도 구배가 형성되도록 1㎕씩 반대측에 넣었다. 유주의 video상으로부터, 3시간마다의 유주 세포수를 24시간까지 계측했다.
혈관 유도에 대해서는 막분취 세포는 치수, 골수, 지방 유래가 모두 matrigel 상에서 5시간 후에 색상 구조가 보이고, 혈관 내피 세포로의 분화능을 나타냈다.
한편, 미분취 검체 세포에서는 장시간 관찰해도 색상 구조 형성은 보이지 않았다.
소 태아 혈청에 의한 세포 증식능을 나타내는 그래프를 도 19에, G-CSF에 의한 세포 증식능을 나타내는 그래프를 도 20에 나타낸다. FBS, G-CSF에 의한 세포 증식능은 모두 막분취 세포에 있어서, 미분취의 검체 세포와 비교해서 높았다. G-CSF에 의한 세포 유주수를 측정한 그래프를 도 21에 나타낸다. G-CSF에 의한 세포 유주능은 모두 미분취 검체 세포와 비교해도 막분취 세포의 유주능이 가장 높은 것이 확인되었다.
실시예 7
[치수 및 지방 신선 조직으로부터의 직접적인 줄기 세포막 분취법]
치수, 지방 조직으로부터, 효소 소화하지 않고, 직접적으로 막분취법에 의해 세포와 동일하게 줄기 세포를 분취할 수 있는지를 검토했다. 막분취기로서는 상부 구조로서, 셀 컬처·인서트(표면 수식된 폴리카보네이트 기재막 Transwell(등록 상표）Inserts, 2×105포어/cm2, 포어 사이즈 8㎛, 저면의 직경 6.4mm, 개구부의 직경 11.0mm, 높이 17.5mm)(Corning)을 하부 구조로서 24well plate(직경 15.0mm, 개구부의 직경 15.0mm, 높이 22.0mm)(Falcon)에 삽입해서 사용했다. 또한, 이 폴리카보네이트 기재막도, 상기 실시예 6과 동일하게 사전에 세포 비부착성의 처리를 행하고, 분리막을 조제하고, 막분취 장치에 조립했다. 이 폴리카보네이트막 상부에, 세절한 개 신선 치수 조직 또는 지방 조직을 정치시키고, 하부 구조체의 24well 중에 10% FBS를 포함하는 둘베코사 제작의 개변 이글 배지(DMEM) 중에 G-CSF를 최종 농도로 100ng/㎖ 넣고, 24시간 후에 G-CSF를 제거하고, 10% FBS를 포함하는 DMEM에 배지 교환해서 배양하고, 70% 컨플루언트 후에 계대했다.
24시간 후에 유주 부착한 치수 줄기 세포 및 지방 줄기 세포를 도 23에 나타낸다. 그 결과, 검체 세포로부터 분취시와 동일한 조건에서, 치수 조직 및 지방 조직에 있어서도 막 하부에 세포가 분취되는 것이 확인되었다.
실시예 8
다음에, 본 발명에 따른 분리막의 실시예와 비교예를 들어서 본 발명을 설명하지만, 본 발명은 이들의 예로 한정되는 것은 아니다.
[1. 측정 방법]
(1) X선 광전자 분광법(ESCA) 측정
분리막의 내표면 및 외표면을 각 3점 측정했다. 측정 샘플은 초순수로 린싱한 후, 실온, 0.5Torr에서 10시간 건조된 후, 측정에 제공했다. 측정 장치, 조건으로서는 이하와 같았다.
측정 장치： ESCLAB220iXL
여기 X선 ： monochromatic AlKa 1, 2선(1486.6eV)
X선 직경 : 0.15mm
광전자 탈출 각도 : 90°(시료 표면에 대한 검출기의 경사)
또한, 원소 분석법에 의해 본 발명의 분리막을 분석함으로써, 분리막 표면의 친수성 폴리머의 양은 예를 들면, 질소량(a(원자수%))과 황량(b(원자수%))의 값 등으로부터, 산출할 수 있다. 또한, 폴리아크릴로니트릴의 경우에는 2200cm-1 부근의 니트릴기 유래의 C≡N의 피크의 강도(ACN)와 ACO의 비를 상기와 동일하게 하여 필름으로 검량선을 작성하고, 내부의 아세트산 비닐 유닛량비를 구했다.
(2) 적외 흡수 스펙트럼에 의한 친수성 폴리머 분포의 측정 방법
분리막을 초순수로 린싱한 후, 실온, 0.5Torr에서 10시간 건조시켰다. 이 건조 분리막의 표면을 JASCO사 제작 IRT-3000의 현미 ATR법에 의해 측정했다. 측정은 시야 영역(애퍼쳐)을 100㎛×100㎛로 하고, 적산 회수를 1점에 대해서 30회, 애퍼쳐를 3㎛씩 움직이고, 종횡각 5점의 합계 25점으로 측정을 행했다. 또한, 표면 개질을 행하지 않는 막과의 스펙트럼의 측정으로부터, 친수성 폴리머의 부착량을 산출했다.
(3) 막의 인간 혈소판 부착 시험 방법
원통상으로 자른 Falcon(등록상표) 튜브(18mmΦ, No.2051)로 분리막을 평가 해야할 면이 원통 내부에 오도록 설치하고, 파라 필름으로 간극을 메웠다. 이 원통관내를 생리 식염액으로 세정 후, 생리 식염액으로 채웠다. 정상인 볼런티어의 정맥피를 채혈 후, 즉시 헤파린을 50U/ml가 되도록 첨가했다. 상기 원통관내의 생리 식염액을 폐기 후, 상기 혈액을 채혈 후 10분 이내에, 원통관내에 1.0ml 넣어서 37℃에서 1시간 진탕시켰다. 그 후, 중공사막을 10ml의 생리 식염액으로 세정하고, 2.5중량% 글루타르 알데히드 생리 식염액으로 혈액 성분의 고정을 행하고, 20ml의 증류수로 세정했다. 세정한 분리막을 상온 0.5Torr에서 10시간 감압 건조했다. 이 분리막을 주사형 전자 현미경의 시료대에 양면 테이프로 접착했다. 그 후에 스퍼터링에 의해, Pt-Pd의 박막을 중공사막 표면에 형성시켜서, 시료로 했다. 이 분리막의 내표면을 필드 에미션형 주사형 전자 현미경(Hitachi Ltd. 제작 S800)으로, 배율 1500배로 시료의 내표면을 관찰하고, 1시야 중(4.3×103㎛2)의 부착 혈소판수를 카운트했다. 중공사 길이 방향에 있어서의 중앙 부근에서, 다른 10시야에서의 부착 혈소판수의 평균값을 혈소판 부착수(개/4.3×103㎛2)로 했다.
혈소판 부착 억제성이 양호한 재료로서는 혈소판 부착수가 40(개/4.3×103㎛2) 이하, 또는 20(개/4.3×103㎛2) 이하, 바람직하게는 10(개/4.3×103㎛2) 이하이다.
(4) 세포 투과성 평가
BD사 제작 셀 컬처·인서트에, 본 발명 분리막을 부착한 것을 사용하고, 간엽계 줄기 세포『 Mesenchymal Stem Cell 』프로모셀사를 사용해 분화 배양 배지로서 #C-28011 Mesenchymal Stem Cell Adipogenic Differentiation Medium, Ready-to-use(간엽계 줄기 세포 증식 배지)를 개변 BD사 제작 셀 컬처·인서트 하부에 넣고, 상부에는 상기 세포와 배양용 배지(Mesenchymal Stem Cell Expansion Media, Human/Mouse, StemXVivo)를 넣고, 또한 하부의 배지에 GCSF를 최종 농도로 100 ng/㎖ 넣어 37℃의 CO2 인큐베이터 중에서 12시간 방치했다. 이 때에 상부로부터 하부 샤알레로 낙하한 세포수를 위상차 현미경을 이용하여 계측했다.
PET막, 폴리카보네이트막, PP막, 폴리술폰막, 폴리아미드막의 흡수율은 폴리아미드막이 4.2%로, 2%를 초과하고 있는 것에 반해 그 이외는 2% 이하이었다. 또한, 폴리머 흡수율은 사용한 기재막을 23℃ 24시간 수중에 침지하고, 중량 증가량을 취해서 흡수율로 했다.
흡수율에 따라서, 폴리카보네이트로 이루어지는 막 및 폴리아미드막(「나일론 66」)을 이용하여, 하기 표 기재 조건에 따른 표면 처리를 실시했다. 사용한 막은 「셀 컬처·인서트」의 막의 부분에 적당하게 바꿔서 설치하고, G-CSF 유주 인자에 의한 세포 유주에 의해, 하부 샤알레에 투과 부착한 세포수를 카운트했다. PET로 이루어지는 막을 사용한 경우에서는 에탄올(EtOH) 첨가계에 있어서, 세포의 부착성은 억제되고 있고, 하부 샤알레에 낙하 부착한 세포는 많아지고 있는 것이 확인되었다. 동일하게 폴리아미드막에 있어서는 EtOH를 첨가하지 않는 계로 세포 부착 억제성이 발현되는 것이 확인된다.
또한, 표면으로의 친수성 폴리머의 결합량에 대해서는 원소 분석법, ESCA, IR법에 의해 적당하게 분석해서 구했다. 사용한 친수성 폴리머는 이하와 같았다.
PVP : 폴리비닐피롤리돈(K90, K30) Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. 제품
PVA : 폴리비닐알코올(Kuraray사 제작)
VA64 : 폴리비닐피롤리돈/폴리아세트산비닐 공중합체(BASF사 제작 코리돈 VA64)
[폴리카보네이트 막으로의 처리 결과]
구경 8㎛의 폴리카보네이트막이 사용되고 있는 셀 컬처·인서트를 사용하고, 각 조건의 수용액에 침지하고, 밀봉한 상에서 γ선 25kGy를 조사해서 표면 개질했다. 막 상부에, 인간 간엽계 줄기 세포를 1×104cells/100㎕ 파종하고, 24well 하부에 부착된 세포수를 위상차 현미경 하에서 측정하고, 분리 성능을 평가했다. 결과를 이하의 표 11에 나타낸다.
Figure 112013085119608-pct00011
[폴리아미드 막으로의 처리 결과]
구경 8㎛의 폴리아미드막을 셀 컬처·인서트의 막부분에 바꿔서 설치하고, 각 조건의 수용액에 침지하고, 밀봉한 상에서 γ선 25kGy를 조사해서 표면 개질했다. 막 상부에 인간 간엽계 줄기 세포를 1×104cells/100㎕ 파종 하고, 24well 하부에 부착된 세포수를 위상차 현미경 하에서 측정하고, 분리 성능을 평가했다. 결과를 이하의 표 12에 나타낸다.
Figure 112013085119608-pct00012
[친수성 폴리머의 영향]
구경 8㎛의 폴리카보네이트막이 사용되고 있는 셀 컬처·인서트를 사용하고, 각 조건의 수용액에 침지하고, 밀봉한 상에서 γ선 25kGy를 조사해서 표면 개질했다. 막 상부에 인간 간엽계 줄기 세포를 1×104cells/100㎕ 파종하고, 24well 하부에 부착된 세포수를 위상차 현미경 하에서 측정하고, 분리 성능을 평가했다. 결과를 이하의 표 13에 나타낸다.
Figure 112013085119608-pct00013
[혈소판 부착성의 확인]
PET로 이루어지는 홀이 열려 있지 않은 필름을 이용하여 각 조건에서 혈소판 부착수를 계측했다. 결과를 이하의 표 14에 나타낸다.
Figure 112013085119608-pct00014
[폴리카보네이트 막으로의 처리 결과]
구경 5㎛의 폴리카보네이트 막이 사용되고 있는 셀 컬처·인서트를 사용하고, 각 조건의 수용액에 침지하고, 밀봉한 상에서 γ선 25kGy를 조사해서 표면 개질했다. 막 상부에, 인간 2대째 치수 세포를 2×104cells/100㎕ 파종하고, 하부 구조체의 24well 중에 10% 인간 혈청을 포함하는 둘베코사 제작의 개변 이글 배지(DMEM) 중에 G-CSF를 최종 농도로 100ng/㎖ 넣고, 48시간 후에 G-CSF를 제거하고, 10% 인간 혈청을 포함하는 DMEM에 배지 교환하고, 24well 하부에 부착된 세포수를 위상차 현미경 하에서 측정했다. 결과를 표 15에 나타낸다.
Figure 112013085119608-pct00015
[폴리아미드 막으로의 처리 결과]
다음에 구경 5㎛의 폴리아미드 막을 셀 컬처·인서트의 막부분에 바꿔서 설치하고, 각 조건의 수용액에 침지하고, 밀봉한 상에서 γ선 25kGy를 조사해서 표면 개질했다. 상기와 동일하게 해서 얻은 결과를 표 16에 나타낸다.
Figure 112013085119608-pct00016
1, 2, 3, 4, 5 : 막분취 배양기 10, 20, 30, 40, 50, 60 : 상부 구조체
12, 22, 32, 62 : 분리막 121, 221 : 포어
13, 23, 33, 43, 53, 63 : 하부 구조체
231 : 배지 도입구 232 : 배지 송출구
24, 34, 44 : 덮개 모양 구조체 241 : 가스 도입구
242 : 가스 배출구 331, 431 : 탄성체
35, 335 : 유지 기구 45, 55 : 프레임
451, 551 : 홀 452, 552 : 칸막이
453, 553 : 유지 기구 64 : 덮개 모양 구조체
65 : 도입구 66 : 디쉬
67 : 덮개 모양 구조체 661 : 배지의 회수구
100 : 배지 200 : 검체 세포
300 : 배지 a : 불활성 가스
b : 배출 가스 c : 배지
d : 사용 완료 배지
<110> National Institute for Longevity Sciences <120> Membrane-based sorting incubator, membrane-based sorting kit and method for isolating stem cells using thereof <130> 2204-PCT <150> JP2011-075861 <151> 2011-03-30 <160> 76 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Canine forward primer for Sox2 <400> 1 agctagtctc caagcgacga 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Canine reverse primer for Sox2 <400> 2 ccacgtttgc aactgtccta 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Canine forward primer for Bmi1 <400> 3 cactcccgtt cagtctcctc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Canine reverse primer for Bmi1 <400> 4 ccagatgaag ttgctgacga 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Canine forward primer for CXCR4 <400> 5 ctgtggcaaa ctggtacttc 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Canine reverse primer for CXCR4 <400> 6 tcaacaggag ggcaggtatc 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Canine forward primer for Stat3 <400> 7 gtggtgacgg agaagcaaca 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Canine reverse primer for Stat3 <400> 8 ttctgtctgg tcaccgactg 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Canine forward primer for GM-CSF <400> 9 gcagaacctg cttttcttgg 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Canine reverse primer for GM-CSF <400> 10 ccctcagggt caaacacttc 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Canine forward primer for MMP3 <400> 11 ccctctgatt cctccaatga 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Canine reverse primer for MMP3 <400> 12 ggatggccaa aatgaagaga 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Canine forward primer for VEGF-A <400> 13 ctacctccac catgccaagt 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Canine reverse primer for VEGF-A <400> 14 acgcaggatg gcttgaagat 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Canine forward primer for BDNF <400> 15 gttggccgac acttttgaac 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Canine reverse primer for BDNF <400> 16 cctcatcgac atgtttgcag 20 <210> 17 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Canine forward primer for GDNF <400> 17 gccgagcagt gactcaaac 19 <210> 18 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Canine reverse primer for GDNF <400> 18 tctcgggtga ccttttcag 19 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Canine forward primer for NGF <400> 19 caacaggact cacaggagca 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Canine reverse primer for NGF <400> 20 atgttcacct ctcccagcac 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Canine forward primer for beta-actin <400> 21 aagtacccca ttgagcacgg 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Canine reverse primer for beta-actin <400> 22 atcacgatgc cagtggtgcg 20 <210> 23 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human forward primer for Oct4 <400> 23 cagtgcccga aacccacac 19 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human reverse primer for Oct4 <400> 24 ggagacccag cagcctcaaa 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human forward primer for Nanog <400> 25 cagaaggcct cagcacctac 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human reverse primer for Nanog <400> 26 attgttccag gtctggttgc 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human forward primer for Sox2 <400> 27 aatgccttca tggtgtggtc 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human reverse primer for Sox2 <400> 28 cggggccggt atttataatc 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human forward primer for Rex1 <400> 29 tggacacgtc tgtgctcttc 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human reverse primer for Rex2 <400> 30 ctcgaacctt ccagatcacc 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human forward primer for Stat3 <400> 31 gtggtgacgg agaagcagca 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human reverse primer for Stat3 <400> 32 ttctgcctgg tcactgactg 20 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human forward primer for CXCR4 <400> 33 ccgtggcaaa ctggtacttt 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human reverse primer for CXCR4 <400> 34 tcagcaggag ggcagggatc 20 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human forward primer for GM-CSF <400> 35 gcctggagct gtacaagcag 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human reverse primer for GM-CSF <400> 36 cagcagtcaa aggggatgac 20 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human forward primer for MMP3 <400> 37 cctcaggaag cttgaacctg 20 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human reverse primer for MMP3 <400> 38 gggaaaccta gggtgtggat 20 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human forward primer for VEGF-A <400> 39 atggcagaag gagaccagaa 20 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human reverse primer for VEGF-A <400> 40 atggcgatgt tgaactcctc 20 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human forward primer for BDNF <400> 41 aaacatccga ggacaaggtg 20 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human reverse primer for BDNF <400> 42 cgtgtacaag tctgcgtcct 20 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human forward primer for GDNF <400> 43 ccaacccaga gaattccaga 20 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human reverse primer for GDNF <400> 44 agccgctgca gtacctaaaa 20 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human forward primer for NGF <400> 45 atacaggcgg aaccacactc 20 <210> 46 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human reverse primer for NGF <400> 46 gcctggggtc cacagtaat 19 <210> 47 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human forward primer for NT-3 <400> 47 agactcgctc aattccctca 20 <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human reverse primer for NT-3 <400> 48 ggtgtccatt gcaatcactg 20 <210> 49 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human forward primer for beta-actin <400> 49 ggacttcgag caagagatgg 20 <210> 50 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human reverse primer for beta-actin <400> 50 agcactgtgt tggcgtacag 20 <210> 51 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Porcine forward primer for Nanog <400> 51 ccccgaagca tccatttcc 19 <210> 52 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Porcine reverse primer for Nanog <400> 52 cgagggtctc agcagatgac at 22 <210> 53 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Porcine forward primer for Sox2 <400> 53 aatgccttca tggtgtggtc 20 <210> 54 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Porcine reverse primer for Sox2 <400> 54 cggggccggt atttataatc 20 <210> 55 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Porcine forward primer for Stat3 <400> 55 gtggtgacag agaagcagca 20 <210> 56 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Porcine reverse primer for Stat3 <400> 56 ttctgcctgg tcactgactg 20 <210> 57 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Porcine forward primer for Tert <400> 57 caggtgtacc gcctcctg 18 <210> 58 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Porcine reverse primer for Tert <400> 58 ccagatgcag tcttgcactt 20 <210> 59 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Porcine forward primer for Bmi1 <400> 59 atatttacgg tgcccagcag 20 <210> 60 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Porcine reverse primer for Bmi1 <400> 60 gaagtggccc attccttctc 20 <210> 61 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Porcine forward primer for CXCR4 <400> 61 ccgtggcaaa ctggtacttt 20 <210> 62 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Porcine reverse primer for CXCR4 <400> 62 tcaacaggag ggcaggtatc 20 <210> 63 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Porcine forward primer for GM-CSF <400> 63 gccctgagcc ttctaaacaa 20 <210> 64 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Porcine reverse primer for GM-CSF <400> 64 gtgctgctca tagtgcttgg 20 <210> 65 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Porcine forward primer for MMP3 <400> 65 acccagatgt ggagttcctg 20 <210> 66 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Porcine reverse primer for MMP3 <400> 66 ggagtcactt cctcccagat t 21 <210> 67 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Porcine forward primer for VEGF-A <400> 67 atggcagaag gagaccagaa 20 <210> 68 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Porcine reverse primer for VEGF-A <400> 68 atggcgatgt tgaactcctc 20 <210> 69 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Porcine forward primer for BDNF <400> 69 ttcaagaggc ctgacatcgt 20 <210> 70 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Porcine reverse primer for BDNF <400> 70 agaagaggag gctccaaagg 20 <210> 71 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Porcine forward primer for GDNF <400> 71 acggccatac acctcaatgt 20 <210> 72 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Porcine reverse primer for GDNF <400> 72 ccgtctgttt ttggacaggt 20 <210> 73 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Porcine forward primer for NGF <400> 73 tggtgttggg agaggtgaat 20 <210> 74 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Porcine reverse primer for NGF <400> 74 ccgtgtcgat tcggataaa 19 <210> 75 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Porcine forward primer for beta-actin <400> 75 ctcttccagc cctccttcct 20 <210> 76 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Porcine reverse primer for beta-actin <400> 76 acgtcgcact tcatgatcga 20

Claims (32)

  1. 저면의 적어도 일부가 줄기 세포 투과용의 포어를 갖는 분리막으로 형성된 용기로 구성되는 상부 구조체와,
    상기 상부 구조체의 막을 침지시키는 유체를 유지하는 용기로 구성되는 하부 구조체를 포함하는 막분취 배양기로서,
    상기 분리막은 소수성 폴리머로 이루어지는 기재막과,
    폴리비닐피롤리돈-폴리아세트산비닐 공중합체가 상기 기재막의 표면에 공유 결합에 의해 결합되어 이루어지는 기능층을 구비해서 이루어지고,
    상기 기능층을 구성하는 폴리비닐피롤리돈-폴리아세트산비닐 공중합체의 중량이 상기 분리막 전체 중량의 31중량%~35중량%이고,
    상기 포어 사이즈가 3㎛∼10㎛이고, 밀도가 1×105∼4×106 포어/cm2인 것을 특징으로 하는 막분취 배양기.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 상부 구조체를 복수 구비하고,
    상기 하부 구조체에 수납되고, 상기 복수의 상부 구조체의 각각을 로킹하는 복수의 홀을 형성한 판상 부재를 구비해서 이루어지는 프레임을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 막분취 배양기.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 상부 구조체를 복수 구비하고,
    상기 하부 구조체에 수납되고, 상기 복수의 상부 구조체의 각각을 로킹하는 복수의 홀을 형성한 판상 부재를 구비해서 이루어지는 프레임을 더 포함하고,
    상기 하부 구조체가 상기 복수의 상부 구조체의 각각에 대응하는 복수의 용기로 구성되는 것을 특징으로 하는 막분취 배양기.
  6. 제 4 항에 있어서,
    상기 복수의 상부 구조체는 다른 포어 사이즈 및/또는 다른 포어 밀도의 막을 갖는 것을 특징으로 하는 막분취 배양기.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 상부 구조체와 하부 구조체를 복설하거나 또는 밀봉할 수 있는 덮개 모양 구조체를 더 포함해서 이루어지는 것을 특징으로 하는 막분취 배양기.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 덮개 모양 구조체는 가스 도입구와 가스 배출구를 구비하는 가스 교환 장치를 더 포함해서 이루어지는 것을 특징으로 하는 막분취 배양기.
  9. 제 7 항에 있어서,
    상기 덮개 모양 구조체의 적어도 일부는 포어 사이즈가 1∼100nm인 포어를 갖는 막으로 형성되어 있는 것을 특징으로 하는 막분취 배양기.
  10. 제 7 항에 있어서,
    상기 덮개 모양 구조체와 상기 하부 구조체의 사이에 밀봉용의 탄성체가 부착되어 있는 것을 특징으로 하는 막분취 배양기.
  11. 제 7 항에 있어서,
    온도 측정 장치와 온도 조절 장치를 포함하는 온도 조절 시스템을 더 구비하는 것을 특징으로 하는 막분취 배양기.
  12. 제 1 항에 있어서,
    상기 하부 구조체는 배지 도입구와 배지 송출구를 구비하는 배지 교환 시스템을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 막분취 배양기.
  13. 제 1 항에 기재된 막분취 배양기와 상기 하부 구조체에 주입하기 위한 세포 유주 인자를 포함해서 이루어지는 것을 특징으로 하는 막분취 배양 키트.
  14. 제 13 항에 있어서,
    상기 세포 유주 인자는 SDF-1, G-CSF, bFGF, TGF-β, NGF, PDGF, BDNF, GDNF, EGF, VEGF, SCF, MMP3, Slit, GM-CSF, LIF, HGF, S1P, protocatechuic acid 및 혈청으로부터 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 하는 막분취 배양 키트.
  15. 제 13 항에 있어서,
    상기 세포 유주 인자의 농도는 1ng/㎖∼500ng/㎖인 것을 특징으로 하는 막분취 배양 키트.
  16. 제 13 항에 있어서,
    상기 하부 구조체에 주입하기 위한 혈청을 더 포함하고, 상기 세포 유주 인자는 G-CSF 또는 bFGF인 것을 특징으로 하는 막분취 배양 키트.
  17. 제 1 항에 기재된 막분취 배양기를 사용한 줄기 세포 분취 방법으로서,
    상기 상부 구조체의 막에 검체 세포 또는 검체 조직을 파종하는 공정과,
    상기 하부 구조체의 용기에 세포 유주 인자를 포함하는 배지를 충전하는 공정과,
    상기 상부 구조체의 막을 상기 하부 구조체 중의 배지에 접촉시키는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 줄기 세포 분취 방법.
  18. 제 17 항에 있어서,
    상기 세포 유주 인자는 SDF-1, G-CSF, bFGF, TGF-β, NGF, PDGF, BDNF, GDNF, EGF, VEGF, SCF, MMP3, Slit, GM-CSF, LIF, HGF, S1P, protocatechuic acid 및 혈청으로부터 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 하는 줄기 세포 분취 방법.
  19. 제 17 항에 있어서,
    상기 세포 유주 인자의 농도는 1ng/㎖∼500ng/㎖인 것을 특징으로 하는 줄기 세포 분취 방법.
  20. 제 17 항에 있어서,
    상기 검체 세포는 분리막 1mm2당 3×102cells∼3×104cells로 파종되는 것을 특징으로 하는 줄기 세포 분취 방법.
  21. 제 17 항에 있어서,
    상기 줄기 세포는 치수 줄기 세포이고, 상기 세포 유주 인자는 G-CSF 또는 bFGF이고, 상기 G-CSF 또는 bFGF의 농도는 50∼150ng/㎖이고, 상기 검체 세포는 분리막 1mm2당 3×102∼1.5×103cells로 파종되거나, 또는 상기 검체 조직은 분리막 1mm2당 0.1mg∼1mg으로 정치되고, 상기 세포 유주 인자를 포함하는 배지에 상기 배지의 체적에 대하여 5∼20vol%의 혈청이 첨가되는 것을 특징으로 하는 줄기 세포 분취 방법.
  22. 제 17 항에 있어서,
    상기 줄기 세포는 골수 줄기 세포 또는 지방 줄기 세포이고, 상기 세포 유주 인자는 G-CSF 또는 bFGF이고, 상기 G-CSF 또는 bFGF의 농도는 50∼150ng/㎖이고, 상기 검체 세포는 분리막 1mm2당 3×102∼1.5×103cells로 파종되거나, 또는 상기 검체 조직은 분리막 1mm2당 0.1mg∼1mg으로 정치되고, 상기 세포 유주 인자를 포함하는 배지에 상기 배지의 체적에 대하여 5∼20vol%의 혈청이 첨가되는 것을 특징으로 하는 줄기 세포 분취 방법.
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