JP6016785B2 - 膜分取培養器、膜分取培養キット、およびこれを用いた幹細胞分取方法、ならびに分離膜 - Google Patents
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Description
して、protocatechuic acid(非特許文献4)が知られている。しかし、やはりいまだに安全性の問題が解決されていない。さらに、血管新生・神経再生及び歯髄再生能に優れた歯髄CD31−SP細胞はSDF−1あるいはVEGFに対して遊走することが知られている(非特許文献5)。しかし、現在のところ、SDF−1以外の血管新生・神経再生及び歯髄再生能に優れた歯髄幹細胞の分取に有効な遊走因子は明らかではない。
本発明のさらなる目的は、分離膜に関する従来技術の欠点を改良し、通常の細胞培養用インキュベーターや、クリーンベンチの中で使用できるコンパクト性を持ち、孔径による濾過性能だけではなく、表面親和性を改良した、高性能な分離膜を提供することにある。
あるいは、前記上部構造体を複数備え、前記下部構造体に収納され、該複数の上部構造体の各々を係止する複数の穴を設けた板状部材を備えてなる枠体をさらに含み、前記下部構造体が、前記該複数の上部構造体の各々に対応する複数の容器から構成されることが好ましい。
あるいはまた、前記複数の上部構造体が、異なるポアサイズ及び/または異なるポア密度の膜を有することが好ましい。
前記細胞遊走因子が、SDF−1、G−CSF、bFGF、TGF−β、NGF、PDGF、BDNF、GDNF、EGF、VEGF、SCF、MMP3、Slit、GM−CSF、LIF、HGF、S1P、protocatechuic acid、及び血清から選択される一以上であることが好ましい。
前記細胞遊走因子の濃度が、1ng/ml〜500ng/mlであることが好ましい。
前記下部構造体に注入するための血清をさらに含み、前記細胞遊走因子がG−CSFまたはbFGFであることが好ましい。
前記細胞遊走因子が、SDF−1、G−CSF、bFGF、TGF−β、NGF、PDGF、BDNF、GDNF、EGF、VEGF、SCF、MMP3、Slit、GM−CSF、LIF、HGF、S1P、protocatechuic acid、及び血清から選択される一以上であることが好ましい。
前記細胞遊走因子の濃度が、1ng/ml〜500ng/mlであることが好ましい。
前記検体細胞が、分離膜1mm2あたり、3×102cells〜3×104cellsで播種されることが好ましい。
本発明はまた上記の幹細胞分取方法であって、前記幹細胞が骨髄幹細胞または脂肪幹細胞であり、前記細胞遊走因子がG−CSFまたはbFGFであり、前記G−CSFまたはbFGFの濃度が50〜150ng/mlであり、前記検体細胞が、分離膜1mm2あたり、3x102〜1.5x103cellsで播種され、あるいは前記検体組織が、分離膜1mm2あたり、0.1mg〜1mgで静置され、前記細胞遊走因子を含む培地に、該培地の体積に対し、5〜20vol%の血清が添加される
ビニルピロリドン系ポリマー、ポリエチレングリコール系ポリマー、およびビニルアルコール系ポリマーから選択される1以上の親水性ポリマーが、前記基材膜の表面に共有結合によって結合されてなる機能層とを備えてなる分離膜であって、前記機能層を構成する親水性ポリマーの重量が、前記分離膜全体の重量の、1.5重量%から35重量%である分離膜である。
前記基材膜が、1〜10μmの孔を有し、細胞分離のために用いられる分離膜であることが好ましい。
前記疎水性ポリマーが、スルホン系ポリマー、アミド系ポリマー、カーボネート系ポリマー、エステル系ポリマー、ウレタン系ポリマー、オレフィン系ポリマー及びイミド系ポリマーからなる群から選択されることが好ましい。
前記いずれかの分離膜が、細胞を透過分離するために用いられることが好ましい。
または、上記いずれかに記載の分離膜の製造方法であって、吸水率が2%を越える疎水性ポリマーからなる基材膜を、ビニルピロリドン系ポリマー、ポリエチレングリコール系ポリマー、およびビニルアルコール系ポリマーから選択される1以上の親水性ポリマーを10〜2000ppm含有する水溶液に浸漬する浸漬工程と、前記基材膜に高エネルギー線を照射して、膜表面をタンパク付着抑制性、細胞付着抑制性に改質する改質工程と、を備える。
前記疎水性ポリマーが、スルホン系ポリマー、アミド系ポリマー、カーボネート系ポリマー、エステル系ポリマー、ウレタン系ポリマー、オレフィン系ポリマー及びイミド系ポリマーからなる群から選択されることが好ましい。
または、成形体の表面改質方法であって、吸水率が2%を越える成形体を、ビニルピロリドン系ポリマー、ポリエチレングリコール系ポリマー、およびビニルアルコール系ポリマーから選択される1以上の親水性ポリマーを10〜2000ppm含有する水溶液に浸漬する浸漬工程と、前記成形体に高エネルギー線を照射して、成形体表面をタンパク付着抑制性、細胞付着抑制性に改質する改質工程と、を備える。
本発明はまた、これらの成形体の改質方法を使用して、上記いずれかに記載の分離膜を製造する方法である。
また、本発明による分離膜は、細胞を分離する際に、細胞が接着して分離効率を落とすことを抑制した物であって、分離膜機能層の表面に、ポリマ状で局在化していることを特徴とするものである。製膜原液中への親水性ポリマー混合によらず成型した分離膜、例えば電子線を透過させて孔を形成させた膜表面の、蛋白質や細胞付着性抑制に好適に用いることができる。
本発明の、第1実施形態による膜分取培養器1は、上部構造体10と下部構造体13とから構成される。上部構造体10は、検体細胞200あるいは検体組織を含む培地100を入れ、分離膜12上に検体細胞200あるいは検体組織を保持するためのものである。一方、下部構造体13は、遊走因子(図示せず)を含む培地300を入れ、遊走した幹細胞を受け取るためのものである。
り取得することができる検体細胞200を培地100に溶解させ、上部構造体10の分離膜12上に播種する。幹細胞の分取源として用いる検体細胞200としては、歯髄細胞あるいは間葉系細胞が挙げられる。間葉系細胞には、骨髄、脂肪組織、羊膜、歯根膜、滑膜、臍帯由来の細胞が含まれるが、これらには限定されない。また、胚性幹細胞、iPS細胞を分取する場合には、分取源として用いる検体細胞200としては、胚及び胚盤胞、遺伝子導入あるいは蛋白導入などを施した体細胞を用いることができる。検体組織を使用する場合は、細切後培地に浸漬し、上部構造体10の分離膜12上に静置する。
播種する。例えば、直径6.5mmの分離膜に対しては、細胞密度が1×102cells/100μl〜1×107cells/100μlであることが好ましく、1×104cells/100μl〜1×106cells/100μlであることがさらに好ましい。細胞密度が低すぎると増殖しにくく、高すぎると遊走しにくいためである。なお、分取する幹細胞の種類によって、必要とする検体細胞の量は異なり、例えば、1×103cellsの歯髄幹細胞を分取する場合に必要な歯髄組織からの検体細胞は、ごくわずか、例えば1×105cells程度でよい。特に歯髄幹細胞を分取する場合のもっとも好ましい検体細胞の密度は、3x102〜1.5x103cells/mm2である。いっぽう、同量の骨髄幹細胞もしくは脂肪幹細胞を分取する場合に必要な検体細胞は、例えばそれぞれ3×105cellsおよび1×106cells程度が必要となる場合がある。また、iPS細胞を分取する場合には、検体細胞200の量は、導入効率により異なる。このような必要とする検体細胞の量は、当業者には既知であり、適宜、決定することができる。また、検体組織を使用する場合には、検体組織は、分離膜1mm2あたり、0.1mg〜1mgで静置することができる。
本実施形態による分離膜は、疎水性ポリマーからなる基材膜と、ビニルピロリドン系ポリマー、ポリエチレングリコール系ポリマー、およびビニルアルコール系ポリマーから選択される1以上の親水性ポリマーが、前記基材膜の表面に共有結合によって結合されてなる機能層とを備えてなる分離膜であって、前記機能層を構成する親水性ポリマーの重量が、前記分離膜全体の重量の、1.5重量%から35重量%である分離膜である。
浸漬する工程においては、成形体の全部を処理水溶液に浸漬してもよく、表面改質を行いたい成形体の部分のみを処理水溶液に浸漬しても良い。
real time水平化学走化性分析はイヌ4代目の歯髄幹細胞CD31−SP細胞を用いた。TAXIScan−FL(Effector Cell Institute,東京)は、6μmの孔のあいたsilicon及びガラスプレートの間に、細胞の大きさに最適化(8μm)したチャンネルを形成し、チャンネル内の一端に細胞(105cells/mlを1μl)を注入した。10ng/μlの各種遊走因子を一定濃度勾配に形成させるように1μlずつ反対側にいれた。遊走のvideo像から、30分ごとの遊走細胞数を4時間まで計測した。図6(a)は遊走因子による遊走能の違いを時間経過で示す。BDNFは非常に早く歯髄幹細胞が遊走し、2時間でプラトーに達した。SDF−1およびbFGFも比較的早く遊走が進んだ。GDNF、VEGF、MMP3、G−CSFともに徐々に遊走細胞が増加し、4時間後には、PDGF、GM−CSF以外、ほぼ同一の遊走細胞数となった。
TAXIScan−FLのマイクロチャンネルにイヌ4代目の歯髄幹細胞CD31−SP細胞を105cells/mlを1μl注入し、G−CSFの濃度を、0、0.1、1、5、10、20、40、100ng/μlで1μlずつ、反対側にいれ、遊走のvideo像から、30分ごとの遊走細胞数を1時間半まで計測した。図6(b)はG−CSFの濃度の違いによる遊走能の違いを時間経過で示す。10ng/μlが最も遊走細胞数が多く、ついで、5、40、20、100、1、0.1ng/μlの順に、遊走細胞数の減少がみられた。
TAXIScan−FLのマイクロチャンネルにヒトの歯髄幹細胞を105cells/mlを1μl注入し、ヒト血清の濃度を、0、5、10、15、20%で1μlずつ、反対側にいれ、遊走のvideo像から、3時間ごとの遊走細胞数を24時間まで計測した。さらに、ヒト血清10%および20%と、100ng/mlのGCSFおよびSDF−1を用いた場合における遊走能を比較した。図7(a)は血清の濃度の違いによる遊走能の違いを時間経過で示す。20%が最も遊走細胞数が多く、ついで、15、10、5%の順に、遊走細胞数の減少がみられた。図7(b)はG−CSF、SDF−1による遊走能の時間経過で示す。G−CSF、SDF−1は20%血清よりも遊走細胞数が多かった。
細胞非接着性にコートしたセルカルチャー・インサートのPET膜(2×105ポア/cm2、ポアサイズが3μm)を底面に取り付けた、底面の直径6.4mm、開口部の直径11.0mm、高さ17.5mmの、PET製の上部構造体と、底面の直径15.0mm、開口部の直径15.0mm、高さ22.0mmの、ポリスチレン製の下部構造体とから構成される、膜分取培養器を組み立てた。PET膜表面にはあらかじめ、膜部分への細胞付着抑制性付与のため、ポリビニルピロリドンーポリ酢酸ビニル共重合体(ビニルピロリドン/ 酢酸ビニル(6/4)共重合体(BASF社製、“コリドンVA64“))1000ppm 水溶液に、0.1%エタノールを添加した水溶液に浸漬し、封止した上でγ線25kGyを照射して修飾して分離膜を調製した。この上部構造体の膜上部に、1×105cells/250μlのイヌ新鮮初代歯髄細胞を播種し、下部構造体に10%イヌ血清を含むダルベッコ社製の改変イーグル培地(DMEM)中にG−CSFあるいはSDF−1を最終濃度で100ng/ml入れた。6時間後に培地交換し、G−CSFを取り除いてさらに10%イヌ血清を含むDMEM中で培養した。図8(a)、(b)および(c)に遊走し、付着、さらに増殖した歯髄幹細胞の位相差顕微鏡像を示す。いずれの遊走因子においても、星状で突起を有する細胞が付着し、フローサイトメトリーでCD31−SP細胞、CD105+細胞あるいはCXCR4+細胞を分取した場合と同様に、増殖することが明らかとなった。
膜分取培養器でG−CSFおよびSDF−1を用いて膜分取した上記歯髄幹細胞を3代継代後、2%血清を含むDMEM中に1×106cells/mlで細胞を分散させ、各種幹細胞表面抗原マーカーの抗体(CD29、CD31、CD34、CD44、CD73、CD90、CD105、CD146、CD150、CXCR4)を用いて4℃で30分ラベル後、フローサイトメトリーを行った。すなわち、マウスIgG1 negative control(AbD Serotec Ltd.)、マウスIgG1 negative control (fluorescein isothiocyanate, FITC) (MCA928F) (AbD Serotec)、マウスIgG1 negative control(Phycoerythrin−Cy5、PE−Cy5)(MCA928C)(AbD Serotec),マウスIgG1 negative control(Alexa 647)(MRC OX−34)(AbD Serotec)、以下に対する抗体:CD29(PE−Cy5)(MEM−101A)(eBioscience)、CD31(FITC)(Qbend10)(Dako)、CD34(Allophycocyanin,APC)(1H6)(R&D Systems,Inc.)、CD44(Phycoerythrin−Cy7,PE−Cy7)(IM7)(eBioscience),CD73(APC)(AD2)(BioLegend),CD90(FITC)(YKIX337.217)(AbD Serotec)、anti−human CD105(PE) (43A3) (BioLegend)CD146(FITC)(sc−18837)(Santa Cruz,Biotech,Santa Cruz,CA,USA),CD150(FITC)(A12)(AbD Serotec)、CXCR4(FITC)(12G5)(R&D)を用いて90分、4℃でラベルした。コントロールとして、フローサイトメトリーで分取したイヌ歯髄CD105+細胞を用いた。
三代目から五代目において歯髄膜分取細胞の血管、神経への分化誘導を行った。結果を図9に示す。図9(a)に示すように、膜分取歯髄幹細胞は血管内皮細胞への分化能を示した。また、図9(b)に示すように、膜分取歯髄幹細胞はneurosphere形成を示した。
イヌ(Narc,Chiba,Japan)永久歯完全根尖完成歯を全部歯髄除去し、細胞画分を移植して歯髄を再生させる実験的モデルを確立した。sodium pentobarbital(Schering−Plough,Germany)で全身麻酔後、上顎第二切歯及び下顎第三切歯の完全歯髄除去を行い、根尖部を#70K−file(MANI.INC,Tochigi,Japan)を用いて0.7mmに拡大した。根尖側に実施例2で膜分取した歯髄幹細胞を、歯冠側にG−CSFを移植した。即ち、5x105個の、四代目の膜分取歯髄幹細胞をcollagen TE(新田ゼラチン,Osaka,Japan)とともにDiIラベリング後、根管内の下部に自家移植した。根管上部は更にcollagen TEとともに最終濃度15ng/μlのG−CSFを移植した。窩洞はリン酸亜鉛セメント(Elite Cement,GC,Tokyo,Japan)及びボンディング材(Clearfil Mega Bond,Kuraray)で処理した後、コンポジットレジン(Clearfil FII,Kuraray,Kurashiki,Japan)で修復した。コントロールとして、歯髄CD105陽性細胞を用いた。14日後に標本を作製した。形態分析のために4%paraformaldehyde(PFA)(Nakarai Tesque,Kyoto,Japan)で4℃一晩固定し、10%蟻酸にて脱灰後、paraffin wax(Sigma)に包埋した。paraffin切片(厚さ5μm)をhematoxylin−eosin(HE)染色し、形態学的に観察した。
膜分取培養器(1×105ポア/cm2、ポアサイズが8μm)を用い、1×105cells/100μlのヒト新鮮初代歯髄細胞を膜上部に播種した。膜下部構造体には、10%ヒト血清のみ、あるいは10%ヒト血清を含むDMEM中にG−CSFを10ng/mlあるいは100ng/ml入れた。22時間後に培地交換してG−CSFを取り除いてさらに10%ヒト血清を含むDMEM中で培養した。図11に遊走し、付着、さらに増殖した歯髄幹細胞の位相差顕微鏡像を示す。図12(a)、(b)、(c)に示すように、10%ヒト血清、G−CSF10ng/mlおよび100ng/mlいずれにおいても、星状で突起を有する細胞が付着し、フローサイトメトリーでCD31−SP細胞、CD105+細胞あるいはCXCR4+細胞を分取した場合と同様に、増殖することが明らかとなった(図12(d)、(e))。
本発明にかかる膜分取培養器(1×105ポア/cm2、ポアサイズが8μm)を用い、1×105cells/100μlのブタ歯髄細胞、骨髄細胞、脂肪細胞を膜上部に播種し、膜下部構造体に10%ウシ胎児血清を含むDMEM中にG−CSFを100ng/ml入れ、22時間後に培地交換してG−CSFを取り除いてさらに10%ウシ胎児血清を含むDMEM中で培養した。図13(a)、(b)、(c)に示すように、歯髄、骨髄、脂肪とも、星状で突起を有する細胞が付着し、図13(d)に示すように、フローサイトメトリーでCD31−SP細胞、CD105+細胞を分取した場合と同様に、増殖することが明らかとなった。
ヒト未分取の歯髄細胞を用いて、TAXIScan-FL (Effector Cell Institute, 東京)によるReal time水平化学走化性分析を行った。6μmの孔のあいたsilicon及びガラスプレートの間に、細胞の大きさに最適化(8μm)したチャンネルを形成し、チャンネル内の一端に細胞(105 cells/mlを1 μl)を注入した。10ng/μlの各種遊走因子(BDNF, GDNF,NGF,PDGF,G-CSF,SDF-1,bFGF,VEGF,LIFおよびGM-CSF)を一定濃度勾配に形成させるように1 μlずつ反対側にいれた。遊走のvideo像から、3時間ごとの遊走細胞数を15時間まで計測した。さらに、遊走因子としてG-CSFおよびbFGFを用いて、10%ウシ胎児血清を添加した場合の遊走能の変化を検討した。
膜分取器としては、上部構造として、セルカルチャー・インサート(ポリカーボネート基材膜(Polycarbonate Membrane)Transwell(登録商標) Inserts、2x105ポア/cm2、ポアサイズ 8 μm、底面の直径6.4 mm、開口部の直径11.0 mm、高さ17.5 mm) (Corning)を、下部構造として24 well plate (直径15.0 mm、開口部の直径15.0 mm、高さ22.0 mm) (Falcon)に挿入して用いた。ただし、ポリカーボネート基材膜への細胞非接着性付与のため、ポリビニルピロリドンーポリ酢酸ビニル共重合体(ビニルピロリドン/ 酢酸ビニル( 6 / 4 ) 共重合体( B A S F 社製、“コリドンV A 6 4 “ )) 1000ppm 水溶液に、0.1%エタノールを添加した水溶液に浸漬し、封止した上でγ線25kGyを照射して修飾し、分離膜を調製した。ポリビニルピロリドンーポリ酢酸ビニル共重合体が、基材膜表面に共有結合されるが、ポリマー自身の安全性は高く、同時に用いたエタノールについてもγ線照射によって分解されて低濃度化することなどから、この表面修飾の安全性は高い。この分離膜上部に、ヒト2代目歯髄細胞を2x104cells/100μl、1x105cells/100μl播種し、下部構造体の24 well中に10%ヒト血清を含むダルベッコ社製の改変イーグル培地 (DMEM) 中にG-CSFを最終濃度で100 ng/ml入れ、48時間後にG-CSFを取り除き、10%ヒト血清を含むDMEMに培地交換し、24 well下部に付着した細胞数を、位相差顕微鏡下で測定した。
膜分取器の分離膜上部にヒト2代目歯髄細胞を2x104cells/100μl播種し、下部構造体の24 well中に、10%ヒト血清を含むDMEM中にG-CSFを最終濃度で100 ng/ml入れ、12、24、48時間、72時間後に24 well下部に付着した細胞数を位相差顕微鏡下で測定した。
膜分取器の分離膜上部に、ヒト2代目歯髄細胞を2x104 cells/100μl 播種し、下部構造体の24 well中に、10%ヒト血清を含むダルベッコ社製の改変イーグル培地 (DMEM) 中にG-CSFを最終濃度で0, 10, 100, 500 ng/ml入れた。48時間後にG-CSFを取り除き、10%ヒト血清を含むDMEMに培地交換し、24 well下部に付着した細胞数を位相差顕微鏡下で測定した。さらに培養して、70 %コンフルエント後に継代した。
マウス下肢虚血モデルを作製し、虚血部位に未分取のヒト歯髄検体細胞、G-CSF100 ng/mlでの膜分取細胞、CD105+細胞を移植し、14日後に血流量をレーザードップラー解析し、血管新生は、凍結切片を作製して、BS-1 lectin染色による免疫組織学的解析を行った。
ヒト抜去歯をスライス後、一端をセメントで封鎖し、未分取のヒト歯髄検体細胞、G-CSF100 ng/mlでの膜分取細胞、CD105+細胞をScaffoldとしてコラーゲンと共に注入し、SCIDマウスの皮下に移植して、3週間後、歯髄再生能を比較した。形態をHE染色にて、神経再生能および、血管新生能を各々、PGP9.5、BS1 lectin染色、Ki67染色により免疫組織学的に解析した。移植細胞の局在については、ヒト特異的遺伝子Alu に対するin situ hybridizationによって解析した。さらに、再生歯髄組織における歯髄特異的マーカーmRNA発現を正常歯髄組織と比較した。
[1. 膜分取器を用いた歯髄、骨髄、脂肪幹細胞分取]
骨髄、脂肪細胞から膜分取法によって歯髄細胞と同様に幹細胞を分取できるかを検討した。膜分取器としては、上部構造として、セルカルチャー・インサート(ポリカーボネート基材膜(Polycarbonate Membrane)Transwell(登録商標)Inserts、2x105ポア/cm2、ポアサイズ8 μm、底面の直径6.4 mm、開口部の直径11.0 mm、高さ17.5 mm) (Corning)を、下部構造として24 well plate (直径15.0 mm、開口部の直径15.0 mm、高さ22.0 mm) (Falcon)に挿入して用いた。ポリカーボネート基材膜は、細胞が接着しないように表面コート処理した。ポリカーボネート基材への、細胞非接着性付与のため、ポリビニルピロリドンーポリ酢酸ビニル共重合体(ビニルピロリドン/ 酢酸ビニル( 6 / 4 ) 共重合体( B A S F 社製、“コリドンV A 6 4 “ )) 1000ppm 水溶液に、0.1%エタノールを添加した処理水溶液にポリカーボネート基材膜を浸漬し、封止した上でγ線25kGyを照射して修飾する表面コート処理を予め行って分離膜を調製した。この分離膜上部に、ブタ2代目歯髄、骨髄、脂肪細胞を1.5x104cells/100 μl播種し、下部構造体の24 well中に10%FBSを含むダルベッコ社製の改変イーグル培地 (DMEM) 中にG-CSFを最終濃度で100 ng/ml入れ、24時間後にG-CSFを取り除き、10%FBSを含むDMEMに培地交換して培養し、70 %コンフルエント後に継代した。
ブタ歯髄、骨髄、脂肪膜分取細胞を5代継代後、フローサイトメトリーを用いて、幹細胞表面抗原マーカー陽性率を測定した。2%FBSを含むPBS中に1x106 cells/mlで細胞を分散させ、幹細胞マーカー抗体を用いて4℃で60分間ラベル後、フローサイトメトリーを行った。具体的には、マウスIgG1 negative control (AbD Serotec Ltd.)、ハムスターIgG (PE-cy7) (eBio299Arm) (eBioscience)、ラットIgG2b (PE-cy7) (RTK4530) (Biolegend)、マウスIgG1 (APC) (NOPC-21) (Biolegend)、マウスIgG1 (RPE) (SFL928PE) (AbD Serotec)、マウスIgG1 (Alexa647) (F8-11-13) (AbD Serotec)、マウスIgG2a (FITC) (S43.10) (MACS)、マウスIgG1 (FITC) (MOPC-21) (Biolegend)、以下に対する抗体:CD29 (Phycoerythrin, PE-cy7) (eBioHMb1-1) (eBioscience)、CD31 (PE) (LCI-4) (AbD Serotec)、CD44 (PE-cy7) (IM7) (eBioscience)、CD73 (APC) (AD2) (Biolegend)、CD90 (Alexa647) (F15-42-1) (AbD Serotec)、CD105 (FITC) (MEM-229) (Abcam)、CXCR4 (FITC) (12G5) (R&D Systems)、G-CSFR (CD114) (Alexa 488) (S1390) (Abcam)を用いて60分、4℃でラベルした。ラベル後、Hepesを終濃度0.01M、FBSを2%になるように添加したHank’s Bufferを加え、フローサイトメトリーを行った。陰性コントロールとして、未分取の歯髄、骨髄、脂肪検体細胞を用いた。
ついで、Real time RT-PCRにて血管新生因子、神経栄養因子、幹細胞マーカーmRNA発現の解析を行った。total RNAをTrizol (Invitrogen)を用いて、5代継代した歯髄、骨髄、脂肪膜分取細胞とそれぞれの未分取検体細胞から抽出し、DNase (Roche) 処理後、ReverTra Ace-α(TOYOBO)にてFirst-strand cDNAを合成し、Light Cycler-Fast Start DNA master SYBR Green I (Roche Diagnostics)でラベル後、血管新生因子、神経栄養因子、幹細胞マーカーのreal time RT-PCRをLight Cycler (Roche Diagnostics) にて、95℃で10秒、65℃または60℃で15秒、72℃で8秒のプログラムで行った。血管新生因子および神経栄養因子、幹細胞マーカーとして用いたプライマーを表9に示す。granulocyte-monocyte colony-stimulating factor (GM-CSF)、vascula endothelin growth factor (VEGF)-A、matrix metalloproteinase (MMP)-3、chemokine (C-X-C motif) receptor (CXCR)-4、brain-derived neurotrophic factor (BDNF)、glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF)、nerve growth factor (NGF)、nanog homeobox (Nanog)、SRY (sex determining region Y)-box 2 (Sox2)、signal transducer and activator of transcription (STAT)-3、telomerase reverse transcriptase (Tert)、Bmi1 polycomb ring finger oncogene (Bmi-1) のプライマーは、β-actin で標準化した。
in vitroにおいて、5代目の歯髄、骨髄、脂肪膜分取細胞の血管誘導能、細胞増殖能、細胞遊走能を調べた。血管誘導能については、EGM-2 (Lonza) 培地に分散した細胞をmatrigel上で三次元培養し、管腔形成能を比較した。細胞増殖能については、10%FBSあるいはG-CSF 100 ng/ml刺激による細胞増殖能をテトラカラーワン (生化学バイオビジネス)を用いて測定した。また、G-CSFに対する細胞遊走能を、TAXIScan-FLによるReal time水平化学走化性分析を行った。すなわち、6 μmの孔のあいたsilicon及びガラスプレートの間に、細胞の大きさに最適化(8 μm)したチャンネルを形成し、チャンネル内の一端にブタ歯髄、骨髄、脂肪膜分取細胞、未分取の各種検体細胞 (105cells/mlを1 μl)を注入した。10 ng/μlの各種遊走因子を一定濃度勾配が形成させるように1 μlずつ反対側にいれた。遊走のvideo像から、3時間ごとの遊走細胞数を24時間まで計測した。
歯髄、脂肪組織から、酵素消化せずに、直接的に、膜分取法によって細胞と同様に幹細胞を分取できるかを検討した。膜分取器としては、上部構造として、セルカルチャー・インサート(表面修飾されたポリカーボネート基材膜Transwell(登録商標) Inserts、2x105ポア/cm2、ポアサイズ8 μm、底面の直径6.4 mm、開口部の直径11.0 mm、高さ17.5 mm) (Corning)を、下部構造として24 well plate (直径15.0 mm、開口部の直径15.0 mm、高さ22.0 mm) (Falcon)に挿入して用いた。なお、このポリカーボネート基材膜も、上記実施例6と同様に、事前に細胞非付着性の処理を行い、分離膜を調製して、膜分取装置に組み込んだ。このポリカーボネート膜上部に、細切したイヌ新鮮歯髄組織あるいは脂肪組織を静置させ、下部構造体の24 well中に10%FBSを含むダルベッコ社製の改変イーグル培地 (DMEM) 中にG-CSFを最終濃度で100 ng/ml入れ、24時間後にG-CSFを取り除き、10%FBSを含むDMEMに培地交換して培養し、70 %コンフルエント後に継代した。
(1)X線光電子分光法(ESCA)測定
分離膜の内表面および外表面を各3点測定した。測定サンプルは、超純水でリンスした後、室温、0.5Torrにて10時間乾燥させた後、測定に供した。測定装置、条件としては、以下の通りとした。
測定装置: ESCLAB220iXL
励起X線: monochromatic AlKa1,2線(1486.6eV)
X線径: 0.15mm
光電子脱出角度:90°(試料表面に対する検出器の傾き)
分離膜を超純水でリンスした後、室温、0 . 5 T o r rにて1 0 時間乾燥させた。この乾燥分離膜の表面をJ A S C O 社製I R T − 3 0 0 0の顕微A T R 法により測定した。測定は視野領域( アパーチャ) を1 0 0 μ m × 1 0 0 μmとし、積算回数を1 点につき3 0 回、アパーチャを3 μ m ずつ動かし、縦横各5 点、の計2 5 点で測定を行った。また、表面改質を行っていない膜とのサスペクトルの測定から、親水性ポリマーの付着量を算出した。
円筒状に切ったFalcon( 登録商標)チューブ(18 m m Φ 、N o . 2 0 5 1 ) に分離膜を評価すべき面が、円筒内部にくるように取り付け、パラフィルムで隙間を埋めた。この円筒管内を生理食塩液で洗浄後、生理食塩液で満たした。健常者ボランティアの静脈血を採血後、直ちにヘパリンを5 0 U / m l になるように添加した。前記円筒管内の生理食塩液を廃棄後、前記血液を、採血後1 0 分以内に、円筒管内に1 . 0 m l 入れて3 7 ℃ にて1 時間振盪させた。その後、中空糸膜を10 m l の生理食塩液で洗浄し、2 . 5 重量% グルタルアルデヒド生理食塩液で血液成分の固定を行い、2 0 m l の蒸留水にて洗浄した。洗浄した分離膜を常温0 . 5 T o r r にて1 0 時間減圧乾燥した。この分離膜を走査型電子顕微鏡の試料台に両面テープで貼り付けた。その後、スパッタリングにより、P t − P d の薄膜を中空糸膜表面に形成させて、試料とした。この分離膜の内表面をフィールドエミッション型走査型電子顕微鏡( 日立社製S 8 0 0 ) にて、倍率1 5 0 0 倍で試料の内表面を観察し、1 視野中( 4 . 3 × 10 3 μm 2 ) の付着血小板数を数えた。中空糸長手方向における中央付近で、異なる1 0 視野での付着血小板数の平均値を血小板付着数( 個/ 4 . 3 × 1 0 3 μm2 ) とした。
BD社製セルカルチャー・インサートに、本発明分離膜を貼り付けたものを用い、間葉系幹細胞『 Mesenchymal Stem Cell 』プロモセル社を用い分化培養培地として#C-28011 Mesenchymal Stem Cell Adipogenic Differentiation Medium, Ready-to-use(間葉系幹細胞増殖培地)を、改変BD社製セルカルチャー・インサート下部に入れ、上部には上記細胞をと培養用培地(Mesenchymal Stem Cell Expansion Media, Human/Mouse, StemXVivo)を入れ、さらに下部の培地にG?CSFを最終濃度で100 ng/ml入れ37℃のCO2インキュベーター中で12時間放置した。このときに、上部から下部シャーレへ落下した細胞数を、位相差顕微鏡を用いて計測した。
PVP:ポリビニルピロリドン(K90,K30)東京化成品
PVA:ポリビニルアルコール(クラレ社製)
VA64:ポリビニルピロリドン/ポリ酢酸ビニル共重合体(BASF社製コリドンVA64)
孔径8μmのポリカーボネート膜が使われているセルカルチャー・インサートを用い、各条件の水溶液に浸漬し、封止した上でγ線25kGyを照射して表面改質した。膜上部に、ヒト間葉系幹細胞を1x104cells/100μl播種し、24 well下部に付着した細胞数を、位相差顕微鏡下で測定し、分離性能を評価した。結果を以下の表11に示す。
孔径8μmのポリアミド膜をセルカルチャー・インサートの膜部分に張り替え、各条件の水溶液に浸漬し、封止した上でγ線25kGyを照射して表面改質した。膜上部に、ヒト間葉系幹細胞を1x104cells/100μl播種し、24 well下部に付着した細胞数を、位相差顕微鏡下で測定し、分離性能を評価した。結果を以下の表12に示す。
孔径8μmのポリカーボネート膜が使われているセルカルチャー・インサートを用い、各条件の水溶液に浸漬し、封止した上でγ線25kGyを照射して表面改質した。膜上部に、ヒト間葉系幹細胞を1x104cells/100μl播種し、24 well下部に付着した細胞数を、位相差顕微鏡下で測定し、分離性能を評価した。結果を以下の表13に示す。
PETからなる孔の開いていないフィルムを用いて各条件で血小板付着数を計測した。結果を以下の表14に示す。
孔径5μmのポリカーボネート膜が使われているセルカルチャー・インサートを用い、各条件の水溶液に浸漬し、封止した上でγ線25kGyを照射して表面改質した。膜上部に、ヒト2代目歯髄細胞を2x104cells/100μl播種し、下部構造体の24 well中に10%ヒト血清を含むダルベッコ社製の改変イーグル培地 (DMEM) 中にG-CSFを最終濃度で100 ng/ml入れ、48時間後にG-CSFを取り除き、10%ヒト血清を含むDMEMに培地交換し、24 well下部に付着した細胞数を、位相差顕微鏡下で測定した。結果を表15に示す。
次に、孔径5μmのポリアミド膜をセルカルチャー・インサートの膜部分に張り替え、各条件の水溶液に浸漬し、封止した上でγ線25kGyを照射して表面改質した。上記と同様にして得た結果を、表16に示す。
10、20、30、40、50、60 上部構造体
12、22、32、62 分離膜
121、221 ポア
13、23、33、43、53、63 下部構造体
231 培地取込口
232 培地送出口
24、34、44 蓋状構造体
241 ガス取込口
242 ガス排出口
331、431 弾性体
35、335 保持機構
45、55 枠体
451、551 穴
452、552 仕切り
453、553 保持機構
64 蓋状構造体
65 導入口
66 ディッシュ
67 蓋状構造体
661 培地の回収口
100 培地
200 検体細胞
300 培地
a 不活性ガス
b 排出ガス
c 培地
d 使用済培地
Claims (20)
- 幹細胞透過用のポアを有する分離膜で、底面の少なくとも一部が形成された容器から構成される上部構造体と、
前記上部構造体の膜を浸漬させる流体を保持する容器から構成される下部構造体と
を含んでなる、膜分取培養器であって
前記分離膜が、
疎水性ポリマーからなる基材膜と、
ビニルピロリドン系ポリマー、ポリエチレングリコール系ポリマー、およびビニルアルコール系ポリマーから選択される1以上の親水性ポリマーが、前記基材膜の表面に共有結合によって結合されてなる機能層と
を備えてなり、前記機能層を構成する親水性ポリマーの重量が、前記分離膜全体の重量の、1.5重量%から35重量%であり、
前記ポアのサイズが3μm〜10μmであり、密度が1×105〜4×106ポア/cm2である、膜分取培養器。 - 前記上部構造体を複数備え、
前記下部構造体に収納され、該複数の上部構造体の各々を係止する複数の穴を設けた板状部材を備えてなる枠体をさらに含む、請求項1に記載の膜分取培養器。 - 前記上部構造体を複数備え、
前記下部構造体に収納され、該複数の上部構造体の各々を係止する複数の穴を設けた板状部材を備えてなる枠体をさらに含み、
前記下部構造体が、前記該複数の上部構造体の各々に対応する複数の容器から構成される、請求項1に記載の膜分取培養器。 - 前記複数の上部構造体が、異なるポアサイズ及び/または異なるポア密度の膜を有する、請求項2または3に記載の膜分取培養器。
- 前記上部構造体と下部構造体とを覆設するまたは密封できる蓋状構造体をさらに含んでなる、請求項1〜4のいずれかに記載の膜分取培養器。
- 前記蓋状構造体が、ガス取込口と、ガス排出口とを備えるガス交換装置をさらに含んでなる、請求項5に記載の膜分取培養器。
- 前記蓋状構造体の少なくとも一部が、ポアサイズが、1〜100nmのポアを有する膜から形成されている、請求項5または6に記載の膜分取培養器。
- 前記蓋状構造体と前記下部構造体との間に、密封用の弾性体が付されている、請求項5〜7のいずれかに記載の膜分取培養器。
- 温度測定装置と、温度調節装置とを含む温度調節システムをさらに備える、請求項5〜8のいずれかに記載の膜分取培養器。
- 前記下部構造体が、培地取込口と、培地送出口とを備える培地交換システムをさらに含む、請求項1〜9のいずれかに記載の膜分取培養器。
- 請求項1〜10のいずれかに記載の膜分取培養器と、前記下部構造体に注入するための細胞遊走因子とを含んでなる、膜分取培養キット。
- 前記細胞遊走因子が、SDF−1、G−CSF、bFGF、TGF−β、NGF、PDGF、BDNF、GDNF、EGF、VEGF、SCF、MMP3、Slit、GM−CSF、LIF、HGF、S1P、protocatechuic acid、及び血清から選択される一以上である、請求項11に記載のキット。
- 前記細胞遊走因子の濃度が、1ng/ml〜500ng/mlである、請求項11または12に記載のキット。
- 前記下部構造体に注入するための血清をさらに含み、前記細胞遊走因子がG−CSFまたはbFGFである、請求項11に記載のキット。
- 前記上部構造体の膜に検体細胞または検体組織を播種する工程と、
前記下部構造体の容器に細胞遊走因子を含む培地を充填する工程と、
前記上部構造体の膜を、前記下部構造体中の培地に接触させる工程と
を含む、請求項1〜10のいずれかに記載の膜分取培養器を用いた幹細胞分取方法。 - 前記細胞遊走因子が、SDF−1、G−CSF、bFGF、TGF−β、NGF、PDGF、BDNF、GDNF、EGF、VEGF、SCF、MMP3、Slit、GM−CSF、LIF、HGF、S1P、protocatechuic acid、及び血清から選択される一以上である、請求項15に記載の方法。
- 前記細胞遊走因子の濃度が、1ng/ml〜500ng/mlである、請求項15または16に記載の方法。
- 前記検体細胞が、分離膜1mm2あたり、3×102cells〜3×104cellsで播種される、請求項15〜17のいずれかに記載の方法。
- 請求項15に記載の幹細胞分取方法であって、前記幹細胞が歯髄幹細胞であり、前記細胞遊走因子がG−CSFまたはbFGFであり、前記G−CSFまたはbFGFの濃度が50〜150ng/mlであり、前記検体細胞が、分離膜1mm2あたり、3x102〜1.5x103cellsで播種され、あるいは前記検体組織が、分離膜1mm2あたり、0.1mg〜1mgで静置され、前記細胞遊走因子を含む培地に、該培地の体積に対し、5〜20vol%の血清が添加される、幹細胞分取方法。
- 請求項15に記載の幹細胞分取方法であって、前記幹細胞が骨髄幹細胞または脂肪幹細胞であり、前記細胞遊走因子がG−CSFまたはbFGFであり、前記G−CSFまたはbFGFの濃度が50〜150ng/mlであり、前記検体細胞が、分離膜1mm2あたり、3x102〜1.5x103cellsで播種され、あるいは前記検体組織が、分離膜1mm2あたり、0.1mg〜1mgで静置され、前記細胞遊走因子を含む培地に、該培地の体積に対し、5〜20vol%の血清が添加される、幹細胞分取方法。
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