JP4732187B2

JP4732187B2 - 自動培養装置

Info

Publication number: JP4732187B2
Application number: JP2006049601A
Authority: JP
Inventors: 力鈴木; 大輔家島
Original assignee: Kaneka Corp
Current assignee: Kaneka Corp
Priority date: 2006-02-27
Filing date: 2006-02-27
Publication date: 2011-07-27
Anticipated expiration: 2026-02-27
Also published as: JP2007222120A

Description

本発明は、自動培養装置に関する。

細胞培養においては、培養器内の培地の交換、多量の培養細胞を得るために細胞密度を調整する継代培養等の作業が、一般に手作業により行われる。また、培養器内の細胞が汚染される、いわゆるコンタミネーションを回避するため、半導体製造分野で培われた技術を適用して生成されたクリーン環境に培養器を設置して、大気中の浮遊粉塵などの汚染物質を低減した雰囲気で注意深く行われる。

しかしながら、クリーン環境に培養器を設置しても、培養作業のために培養器が設置された恒温槽の扉などを開いて、培養器の蓋を開閉し、ピペットなどにより培養液を注入する手作業の際に、大気中の汚染物質が培養器内に侵入するおそれがある。

そこで、特許文献１には、クリーンな培養環境に保持された恒温槽内に培養器を設置するとともに、培地交換や継代処理を自動で行う自動培養装置が提案されている。これによれば、恒温槽の扉を開かずに、細胞培養を行えるから、コンタミネーションの問題を大幅に低減できる。

特開２００４−２２９６１９号公報

しかし、特許文献１に記載のように、クリーン環境の恒温槽内で自動的に培地交換や継代処理を行うようにしても、恒温槽内に汚染物質が微量でも残っていると、培養器の蓋を開閉する際などに、恒温槽内の汚染物質が培養器内に侵入するおそれを皆無にすることが難しい。

そこで、培養器を密閉状態にし、かつ薬品容器及び細胞回収容器等を培養器に気密に接続して、コンタミネーションの問題を回避することが考えられる。しかし、培養器を密閉状態にすると、培養器内に薬品を注入するときに培養器内の圧力が上昇し、薬品を円滑に注入しにくいという問題がある。同様に、培養器内の液体を排液するときに培養器内の圧力が負圧になり、円滑に排液しにくいという問題がある。

このような問題を解決するために、培養器の気相部に連通させて恒温槽内に開口させた吸排気ノズルを設け、薬品等の注入時及び排液時における培養器内の圧力変動を緩和することが考えられる。しかし、このような吸排気ノズルを設けると、吸排気ノズルを介して恒温槽内の汚染物質が培養器内に侵入するおそれがある。

本発明は、培養器を密閉構造に形成しても薬品等の注入及び排液を円滑にでき、かつ、コンタミネーションの問題を回避できる自動培養装置を実現することを課題とする。

本発明の自動培養装置は、培養環境に保持される恒温槽内に収納された細胞の培養器と、培養に必要な複数の薬品がそれぞれ貯留された複数の薬品容器と、前記培養器に連通された管路を介して前記各薬品容器内の薬品を前記培養器に供給する供給ポンプと、前記培養器に連通された管路を介して前記培養器内の液体を排出する排出ポンプとを備えてなり、前記培養器は、密閉して形成され、前記供給ポンプの吐出管路が接続される第１のノズルと、前記排出ポンプの吸引管路が接続される第２のノズルと、前記恒温槽内に開口された第３のノズルとが設けられ、該第３のノズルの開口端に、それぞれピンチ弁を介して吸気フィルターと排気フィルターが設けられ、さらに、前記ピンチ弁と前記供給ポンプと前記排出ポンプを駆動制御する制御装置が設けられ、前記制御装置は、前記供給ポンプを駆動制御する際、前記排気フィルターのピンチ弁を開いて前記供給ポンプを作動させ、前記供給ポンプを停止させて前記排気フィルターのピンチ弁を閉じるようにすることを特徴とする。また、前記制御装置は、前記排出ポンプを駆動制御する際、前記吸気フィルターのピンチ弁を開いて前記排出ポンプを作動させ、前記排出ポンプを停止させて前記吸気フィルターのピンチ弁を閉じるようにすることができる。

これによれば、薬品等の注入時には、排気フィルターのピンチ弁を開くことにより、培養器内から薬品の注入量に応じた量の空気が排気フィルターを介して排気されるから、培養器内の圧力上昇を抑えて、薬品を円滑に注入できる。また、排気フィルターによって培養器内の物質が恒温槽内に排出されるのを防止できる。また、培養器内の液体の排液時には、吸気フィルターのピンチ弁を開くことにより、培養器内に液体の排液量に応じた量の空気が吸気フィルターを介して吸気されるから、培養器内が負圧になるのを抑えて、液体を円滑に排出できる。また、吸気フィルターによって恒温槽内の汚染物質が培養器内に侵入するのを防止できる。その結果、培養器を密閉構造に形成しても薬品等の注入及び排液を円滑にでき、かつ、コンタミネーションの問題を回避できる。

さらに、吸気及び排気フィルターを流れる空気の流れを一方向にできるから、一度捕獲された汚染物質が、再び培養環境の雰囲気下に放散されることを抑制できる。

また、排出ポンプの吐出管路にピンチ弁を介して培養器内の培養細胞が回収される細胞回収容器を連結することができる。これによれば、自動培養装置の系外と接触することなく培養細胞を回収できるから、回収された培養細胞に汚染物質が混入することを防止できる。

また、排出ポンプの吐出管路にピンチ弁を介して培養器の廃液が排出される廃液容器を連結することができる。このように、廃液容器を培養器に気密に接続すれば、廃液の際に排出ポンプ又はピンチ弁が誤作動を起こしても、培養器へ汚染物質が侵入することを防止できる。

本発明によれば、培養器を密閉構造に形成しても薬品等の注入及び排液を円滑にでき、かつ、コンタミネーションの問題を回避できる自動培養装置を実現することができる。

以下、図１を用いて、本発明の一実施形態の自動培養装置の構成を説明する。図示のとおり、本実施形態の自動培養装置は、恒温槽であるインキュベータ３内に細胞を培養する密閉された培養器１が収納されている。インキュベータ３内は、図示していない環境保持手段により、温度と炭酸ガス濃度とが予め設定された環境条件に調整されるようになっている。つまり、インキュベータ３には、温度センサー、ヒータ、ＣＯ_２センサー、ＣＯ_２供給管等からなる環境保持手段が設けられ、温度、ＣＯ_２濃度、内圧等の培養環境を維持するように構成されている。

培養器１には、複数（図示例では３つ）の薬品容器である薬品バッグ５、７、９に貯留された複数の薬品（本実施形態では、洗浄液、剥離剤、培地）が、それぞれ供給ポンプ３５により培養器１に供給されるようになっている。すなわち、薬品バッグ５、７、９には、それぞれピンチ弁１７、１９、２１を介して複数の管路である送液チューブ２３、２５、２７が連通され、それらの送液チューブ２３、２５、２７は主管路である送液チューブ２９に共通に接続されている。送液チューブ２９には、薬品を加熱するヒータ３１と、ピンチ弁３３と、供給ポンプ３５とが設けられている。供給ポンプ３５の吐出側の送液チューブ２９は、培養器１に設けられたノズル６９に接続されている。

また、培養器１に挿入して設けられたノズル７１には、排出チューブ５９を介して培養器１内の液体を排出する排出ポンプ６１が接続されている。排出ポンプ６１の吐出側の排出チューブ５９には、細胞回収容器である細胞回収バッグ１１と、廃液容器６５が接続されている。つまり、排出チューブ５９にそれぞれピンチ弁４７、６３を有する排出チューブ５３、５８が分岐して設けられ、各ピンチ弁４７、６３の排出側に細胞回収バッグ１１と、廃液容器６５がそれぞれ接続されている。

また、供給ポンプ３５の吸入側の送液チューブ２９には、ピンチ弁４０を有する細胞注入チューブ３９を介して液溜め４３が連通されている。液溜め４３の上部開口はフィルム４５で覆われている。この液溜め４３には、培地等と懸濁状態にされた細胞が入ったシリンジ４１をフィルム４５に穿刺して、細胞が注入されるようになっている。また、送液チューブ２９のヒータ３１の上流側は、連通管であるガスチューブ３８を介してインキュベータ３内に連通されている。ガスチューブ３８のインキュベータ３内の開口端にはフィルター３７が設けられている。

また、インキュベータ３の系外には、培養器１内の状態を観察する顕微鏡８９が設けられている。顕微鏡８９には、図示していないカメラが接続されていて、図示していないモニターで、培養器１内を観察できるようになっている。

ここで、本実施形態で用いる各チューブは、細胞に対して無毒である製品、例えば、塩化ビニル、シリコン製のチューブを用いるのが好ましい。また、薬品バッグ５、７、９、細胞回収バッグ１１は、折りたたみ可能なやわらかい素材で作られ、細胞に対して無毒である材料で形成された輸液バッグを使用するのが好ましい。具体的には、例えば、塩化ビニル、シリコン製のバッグが好ましい。さらに、本実施形態のピンチ弁は、柔軟性を有するチューブを押し潰して流路を開閉する電磁駆動式の開閉弁が適用され、供給ポンプ３５と排出ポンプ６１は、柔軟性を有するチューブを円筒状に配列された複数のローラに巻きつけ、複数のローラを回転してチューブ内の流体を押し出す、いわゆるしごきポンプが適用されている。このようなローラポンプによれば、外気が侵入しないことから、コンタミネーションの予防に効果的である。このように構成される各ピンチ弁及び供給ポンプ３５と排出ポンプ６１、及び顕微鏡８９は、図示していない制御装置によって駆動制御されるようになっている。

次に、図２乃至図４に、培養器１の詳細な構成を示す。図２は本実施形態の培養器１の斜視外観図であり、図３は側面図、図４はノズル部の拡大図である。

図２に示すように、本実施形態の培養器１は、円形のシャーレである。培養器１の材質は、特に限定しないが細胞に対して無毒性であることが必要であり、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレートが好ましい。図３に示すように、培養器１の上部の開口には、蓋６７が溶着等により被せられて密閉されている。なお、密閉状態であれば他の形状のものを用いても構わない。例えば、矩形形状等が考えられる。

培養器１の側面には、ノズル６９、７１、７３が挿入して設けられている。ノズル６９、７１の先端は培養器１内の液層に位置され、ノズル７３の先端は培養器１の空気層に位置して設けられている。図１、図４に示すように、ノズル６９は送液チューブ２９を介して供給ポンプ３５の吐出側に接続され、ノズル７１は排出チューブ５９を介して排出ポンプ６１の吸引側に接続され、ノズル７３には、培養器１内の空気とインキュベータ３内の空気を交換するガス交換チューブ７５が接続される。

ガス交換チューブ７５には、培養器１内の空気をフィルター７７を介してインキュベータ３に排出するガス交換チューブ７９と、インキュベータ３内の空気をフィルター８１を介して培養器１内に吸い込むガス交換チューブ８３が接続されている。ガス交換チューブ７９、８３には、各々、ピンチ弁８５、８７が設けられている。フィルター３７、７７、８１は、例えば、菌、化学物質等といった汚染物質を捕獲する形式のフィルター、例えば、メンブレンフィルターが使用される。

このように構成される本実施形態の自動培養装置を用いた自動培養手順について、図５に示したフローチャートを参照して説明する。

（培養開始前）
培養開始前は、本実施形態の自動培養装置内は、γ線等で滅菌処理される。また、本実施形態の細胞回収バッグ１１は、塩化ビニル等の折り曲げ可能な素材で作られているため、内部に不潔な空気が入らない状態で取り付けることができるから、高い無菌状態を維持できる。滅菌処理が終了すると、図５に示すフローチャートに従って、制御装置の制御により細胞が培養される。

（ステップＳ１）
培養開始の信号が出されると、培地の注入が行われる。培地の注入は、ピンチ弁２１、３３、８５を開き、供給ポンプ３５を作動させると、薬品バッグ９に貯留された培地が培養器１に注入される。この際、培養器１内の空気は、フィルター７７から矢印Ｂ方向に培地の注入量に応じて排気されるから、培養器１内の圧力上昇を抑えて、円滑に培養器１内に薬品を注入することができる。また、フィルター７７によって培養器１内の物質がインキュベータ３内に排出されるのを防止できる。

また、薬品が所定量供給されるとピンチ弁２１が閉じられ、フィルター３７を介して送液チューブ２９にインキュベータ３内の空気が流入する。これにより、送液チューブ２７、２９に残留していた薬品は、供給ポンプ３５によって速やかに培養器１に供給される。その結果、送液チューブ２７、２９等に残留した薬品による送液チューブの目詰まりを防止できる。薬品が必要量供給されると、供給ポンプ３５を停止させて、ピンチ弁３３、８５を閉じる。

（ステップＳ２）
培地の注入が終了すると、細胞液の注入が行われる。まず、予め、細胞と培地等が懸濁状態にされた細胞液を、シリンジ４１をフィルム４５に穿刺して、液溜め４３に注入しておく。細胞液の注入は、ピンチ弁４０、８５を開き、供給ポンプ３５を作動させることにより、液溜め４３の細胞液が培養器１に供給される。
この際、培養器１内の空気は、フィルター７７により矢印Ｂ方向に排気されるので、培養器１内の圧力上昇を抑えて、円滑に細胞液を培養器１に供給できる。細胞液の注入が終了すると、供給ポンプ３５を停止させ、ピンチ弁４０、８５を閉じる。

（ステップＳ３）
細胞液が注入されると、設定期間、静置して細胞を増殖させる。例えば、３日程静置して細胞を増殖させる。この設定期間は、細胞の種類等によって変更される。また、細胞の増殖速度に従って、変更してもかまわない。

（ステップＳ４）
３日間放置後、空気送りを実行する。本実施形態の培養器１内部は、細胞培養中は密閉状態にあり、適時、培養器１内を換気する必要がある。ピンチ弁３３、８５を開き、供給ポンプ３５を動作させて、フィルター３７を介してインキュベータ３内の空気を培養器１内に注入しつつ、フィルター７７を介して培養器１内の空気をインキュベータ３内に排出する。一定時間、空気送りを行った後、供給ポンプ３５を停止させ、ピンチ弁３３、８５を閉じる。なお、本実施形態では、空気送りは１回としているが、後述する培地交換、細胞回収以外の時間は、何回行ってもよく、また常時連続して実施しても構わない。

（ステップＳ５）
空気送りが終了し、設定期間の間、放置した後、培地交換を行う。培地交換は、培地中に溶出する細胞の代謝物質の排出、及び培地の栄養分補給のため、定期的に行われる。通常、ステップＳ３からステップＳ５の動作は３日〜７日おきに実施するが、この期間は、予め設定、もしくは細胞の増殖状況に応じて任意に変更できる。培地交換では、培養器１内の培地を排出した後に、新たな培地を培養器１内に注入する。

培地を排出する際には、ピンチ弁６３、８７を開き、排出ポンプ６１を作動させる。培養器１内部には、矢印Ｃ方向から培養器１内の培地の排出量に応じた量のインキュベータ３内の空気がフィルター８１を介して吸気されるから、培養器１内の圧力が負圧になるのを抑えて、円滑に培養器１内の培地を排出することができる。また、フィルター８１によってインキュベータ３内の汚染物質が培養器１内に侵入するのを防止できる。培地の排出が終了すると、排出ポンプ６１を停止させ、ピンチ弁６３、８７を閉じる。培地を注入する際には、ステップＳ１と同様な操作が行われる。

（ステップＳ６）
培地の交換が終了すると、培地交換回数が、予め設定した培地交換回数に達しているか否か判断される。設定値に達していればステップＳ７の操作が行われ、達していなければステップＳ４に戻る。この設定回数は、予め設定しているが、細胞の培養速度等に従って変更しても構わない。

（ステップＳ７）
ステップＳ７では、空気送りが行われるが、ステップＳ４と同様な操作であることから説明を省略する。

（ステップＳ８）
空気送りが終了すると、設定期間、静置して細胞を増殖させる。この設定期間は、細胞の種類等によって変更される場合がある。また、細胞の増殖速度に従って、変更してもかまわない。

（ステップＳ９）
設定期間、静置すると、培養細胞の回収が行われる。培養細胞の回収では、培養器１内部の培地の排出、薬品バッグ５に貯留された洗浄液の注入及び排出をした後、薬品バッグ７に貯留された剥離剤を培養器１に注入して培養細胞を剥離させ、細胞回収バッグ１１に培養細胞を回収する。

培養器１内の培地の排出は、ステップＳ５で述べた培地排出と同様な操作で行われるため説明を省略する。続いて、洗浄液の注入では、ピンチ弁１７、３３、８５を開き、供給ポンプ３５を作動させて、洗浄液を培養器１に注入する。必要量の洗浄液が注入されると、供給ポンプ３５を停止して、ピンチ弁１７、３３、８５を閉じる。その後の洗浄液の排出は、ステップＳ５で述べた培地排出と同様な操作で行われるため説明を省略する。

剥離剤の注入では、ピンチ弁１９、３３、８５を開き、供給ポンプ３５を動作させて、剥離剤を培養器１に注入する。剥離剤の注入が終了すると、供給ポンプ３５を停止させて、ピンチ弁１９、３３、８５を閉じる。しばらく放置すると、培養器１の底部に付着した培養細胞が浮き上がる。その後、ピンチ弁２１、３３、８５を開き、供給ポンプ３５を動作させて、培養器１内部に培地を注入する。培地の注入が終了すると、供給ポンプ３５を停止させて、ピンチ弁２１、３３、８５を閉じる。

ここで、培地中の血清は、剥離剤の効果を減少させ、再び培養器１に培養細胞が付着するため、速やかに細胞回収バッグ１１に培養細胞を回収する。培養細胞の回収では、ピンチ弁４７、８７を開き、排出ポンプ６１を動作させることにより、培養器１内の培養細胞が、細胞回収バッグ１１に回収される。細胞の回収が終了すると、排出ポンプ６１を停止させて、ピンチ弁４７、８７を閉じる。培養された細胞が回収された細胞回収バッグ１１は、排出チューブ５３を熱シールすると共に、切断して装置から切り離す。このように、自動培養装置の系外と接触することなく細胞を回収できるから、コンタミネーションを防ぐことができる。

また、コンタミネーションを防ぐ装置を設け、細胞が回収された細胞回収バッグを切断した後の排出チューブ５９に、新たに、チューブごと細胞回収バッグを接続すれば、大量の細胞を得ることができる。

以上説明したように、本実施形態によれば、薬品等の注入時には、フィルター７７のピンチ弁８５を開くことにより、培養器１内から薬品の注入量に応じた量の空気がフィルター７７を介して排気されるから、培養器１内の圧力上昇を抑えて、薬品を円滑に注入できる。また、フィルター７７によって培養器１内の物質がインキュベータ３内に排出されるのを防止できる。また、培養器１内の液体の排液時には、フィルター８１のピンチ弁８７を開くことにより、培養器１内に液体の排液量に応じた量の空気がフィルター８１を介して吸気されるから、培養器１内が負圧になるのを抑えて、液体を円滑に排出できる。また、フィルター８１によってインキュベータ３内の汚染物質が培養器１内に侵入するのを防止できる。よって、培養器１を密閉構造に形成しても薬品等の注入及び排液を円滑にでき、かつ、コンタミネーションの問題を回避できる自動培養装置を実現することができる。

特に、フィルター７７、８１を流れる空気の流れを一方向にできるから、一度捕獲された物質が、再び培養環境の雰囲気下に放散されることを抑制できる。

また、大量の細胞を得るために細胞回収バックを付け替えるようにすれば、複数の培養器に細胞を植え直す必要がないから、培養器のコストを抑えることができ、また、自動培養装置をコンパクト化できる。この場合、継続的に細胞を培養でき、断続的に細胞を回収できるため、細胞を培養しながら、複数回に分けて、培養細胞を患者に注入することができる。このため、細胞療法などの用途にも好適となる。すなわち、再生医療においては、培養細胞は一度に大量の細胞を利用する場合の他に、少しずつ細胞を利用することもある。例えば、白血病治療などにおいて、間葉系幹細胞を補助的に利用するような場合、数度に分けて培養した間葉系幹細胞を患者に注入することができる。

また、本実施形態の培養器１は、ノズル６９、７１、７３を培養器１の側面に設けているから、複数の培養器１を重ねてインキュベータ３内に設置することができる。なお、使用する培養器が１個の場合は、蓋６７にノズルを設けても構わない。

本発明の一実施形態の自動培養装置の全体構成を示す図である。本発明の一実施形態の培養器の斜視外観図である。図２の培養器の側面図である。図２の培養器のノズル部の拡大図である。本発明の一実施形態の自動培養装置の動作手順のフローチャートである。

符号の説明

１培養器
３インキュベータ
５、７、９薬品バッグ
１１細胞回収バッグ
１７、１９、２１、４７ピンチ弁
３５供給ポンプ
６１排出ポンプ
６９、７１、７３ノズル
３７、７７、８１フィルター

Claims

培養環境に保持される恒温槽内に収納された細胞の培養器と、培養に必要な複数の薬品がそれぞれ貯留された複数の薬品容器と、前記培養器に連通された管路を介して前記各薬品容器内の薬品を前記培養器に供給する供給ポンプと、前記培養器に連通された管路を介して前記培養器内の液体を排出する排出ポンプとを備えてなり、前記培養器は、密閉して形成され、前記供給ポンプの吐出管路が接続される第１のノズルと、前記排出ポンプの吸引管路が接続される第２のノズルと、前記恒温槽内に開口された第３のノズルとが設けられ、該第３のノズルの開口端に、それぞれピンチ弁を介して吸気フィルターと排気フィルターが設けられ、さらに、前記ピンチ弁と前記供給ポンプと前記排出ポンプを駆動制御する制御装置が設けられ、
前記制御装置は、前記供給ポンプを駆動制御する際、前記排気フィルターのピンチ弁を開いて前記供給ポンプを作動させ、前記供給ポンプを停止させて前記排気フィルターのピンチ弁を閉じることを特徴とする自動培養装置。
培養環境に保持される恒温槽内に収納された細胞の培養器と、培養に必要な複数の薬品がそれぞれ貯留された複数の薬品容器と、前記培養器に連通された管路を介して前記各薬品容器内の薬品を前記培養器に供給する供給ポンプと、前記培養器に連通された管路を介して前記培養器内の液体を排出する排出ポンプとを備えてなり、前記培養器は、密閉して形成され、前記供給ポンプの吐出管路が接続される第１のノズルと、前記排出ポンプの吸引管路が接続される第２のノズルと、前記恒温槽内に開口された第３のノズルとが設けられ、該第３のノズルの開口端に、それぞれピンチ弁を介して吸気フィルターと排気フィルターが設けられ、さらに、前記ピンチ弁と前記供給ポンプと前記排出ポンプを駆動制御する制御装置が設けられ、
前記制御装置は、前記排出ポンプを駆動制御する際、前記吸気フィルターのピンチ弁を開いて前記排出ポンプを作動させ、前記排出ポンプを停止させて前記吸気フィルターのピンチ弁を閉じることを特徴とする自動培養装置。
前記制御装置は、前記排出ポンプを駆動制御する際、前記吸気フィルターのピンチ弁を開いて前記排出ポンプを作動させ、前記排出ポンプを停止させて前記吸気フィルターのピンチ弁を閉じることを特徴とする請求項1に記載の自動培養装置。
前記排出ポンプの吐出管路にピンチ弁を介して前記培養器内の培養細胞が回収される細胞回収容器が連結されていることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項に記載の自動培養装置。
前記排出ポンプの吐出管路にピンチ弁を介して前記培養器の廃液が排出される廃液容器が連結されていることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載の自動培養装置。