JP6311306B2 - 細胞回収装置及び細胞培養システム - Google Patents

Description

本発明は、細胞培養装置へ細胞を導入し、細胞剥離装置から細胞を回収する細胞給排蓋体及び細胞導入装置及び細胞回収装置及び細胞培養システムに関するものである。

動物細胞、植物細胞等の細胞には、それぞれ培養の際に増殖用の足場を必要とする付着性の細胞と、増殖用の足場を必要としない浮遊性の細胞とがあり、培養した細胞は有用物質の生産等に広く使用されている。

動物細胞の培養方法として、例えば静置培養法がある。静置培養法により付着性の細胞を培養する場合には、例えばシャーレに培養液を導入し、ピペットで細胞を注入し、シャーレの底面に細胞を付着させるか、或は寒天等により固化させた培養液上に細胞を付着させることで、細胞の培養を行っている。

細胞を注入する際には、その都度シャーレの蓋を開ける必要がある為、バッチ作業となり、細胞の注入と培養を連続して行う連続培養を行うことができなかった。

又、ピペットでの細胞の注入を自動化した場合、シャーレの蓋の開閉や、ピペットを動作させるロボットが必要となる為、装置構成が複雑且つ高価なものとなる。

尚、特許文献１には、分注容器の蓋を開け、収容容器からチップに細胞懸濁液を吸引し、前記分注容器のウェル内に細胞懸濁液を吐出する工程を自動で行う様になっており、細胞懸濁液を吸引する際に前記チップの先端に空気層を形成することで、前記チップからの液だれを防止する送液方法、送液ユニット、及び自動培養システムが開示されている。

又、特許文献２には、作業空間の内部に、細胞培養のための各種操作が行われる作業テーブルと、パスボックスを通じて持込まれた容器に所定の細胞を植付ける等の所定の作業を自動で行うロボットアームとが設けられ、前記作業空間の確実な滅菌処理が行えると共に、クローズドされた空間において滅菌ガスを無害化することができる細胞自動培養装置が開示されている。

特開２０１３−１０２７２３号公報 特開２０１１−１６７４０５号公報

本発明は斯かる実情に鑑み、簡易な構成で細胞の連続培養を可能とする細胞給排蓋体及び細胞導入装置及び細胞回収装置及び細胞培養システムを提供するものである。

本発明は、容器の開口部を封止する細胞給排蓋体であって、内周面に螺子部が形成された蓋体本体と、該蓋体本体を貫通し延出する細胞給排管と、前記蓋体本体に接続され連通するエア給排管と、前記細胞給排管の外端部に設けられた無菌コネクタと、前記エア給排管の中途部に設けられたエアフィルタとを具備する細胞給排蓋体に係るものである。

又本発明は、更に導入手段を具備し、細胞懸濁液が封入された容器が前記細胞給排蓋体に封止され、前記細胞給排管が前記細胞懸濁液中に開口し、前記エア給排管が前記細胞懸濁液の液面より上方で開口し、前記導入手段により前記細胞給排管を介して前記容器内の前記細胞懸濁液が導入される細胞導入装置に係るものである。

又本発明は、更に回収手段を具備し、培地が封入された容器が前記細胞給排蓋体に封止され、前記細胞給排管が前記培地中に開口し、前記エア給排管が前記培地の液面より上方で開口し、前記回収手段により前記細胞給排管を介して前記容器内の前記培地中に細胞が回収される細胞回収装置に係るものである。

更に又本発明は、前記細胞導入装置と、該細胞導入装置に無菌コネクタを介して接続された細胞培養装置と、該細胞培養装置から細胞懸濁液が供給される細胞剥離装置と、該細胞剥離装置に無菌コネクタを介して接続された前記細胞回収装置とを具備し、前記細胞導入装置が前記細胞培養装置に前記細胞懸濁液を導入し、前記細胞培養装置が担体を培地に浮遊させて細胞を前記担体上で培養し、前記細胞剥離装置が前記細胞培養装置から供給された前記細胞懸濁液に含まれる前記担体から細胞を剥離させ、前記細胞回収装置が前記細胞剥離装置に剥離させた細胞を回収する細胞培養システムに係るものである。

本発明によれば、容器の開口部を封止する細胞給排蓋体であって、内周面に螺子部が形成された蓋体本体と、該蓋体本体を貫通し延出する細胞給排管と、前記蓋体本体に接続され連通するエア給排管と、前記細胞給排管の外端部に設けられた無菌コネクタと、前記エア給排管の中途部に設けられたエアフィルタとを具備するので、簡易な構成であり安価で製作可能であると共に、前記容器を無菌状態で封止し、大気環境下であっても前記無菌コネクタを介して前記細胞給排管と種々の配管とを無菌状態を維持して接続でき、汎用性を高めることができる。

又本発明によれば、更に導入手段を具備し、細胞懸濁液が封入された容器が前記細胞給排蓋体に封止され、前記細胞給排管が前記細胞懸濁液中に開口し、前記エア給排管が前記細胞懸濁液の液面より上方で開口し、前記導入手段により前記細胞給排管を介して前記容器内の前記細胞懸濁液が導入されるので、無菌コネクタを介して細胞培養装置と無菌状態を維持して接続することで、細胞の継代作業を細胞培養を継続したまま行うことができると共に、装置構成が簡易となり、製作コストの低減を図ることができる。

又本発明によれば、更に回収手段を具備し、培地が封入された容器が前記細胞給排蓋体に封止され、前記細胞給排管が前記培地中に開口し、前記エア給排管が前記培地の液面より上方で開口し、前記回収手段により前記細胞給排管を介して前記容器内の前記培地中に細胞が回収されるので、剥離させた細胞を１度に大量に回収できると共に、装置構成が簡易となり、製作コストの低減を図ることができる。

更に又本発明によれば、前記細胞導入装置と、該細胞導入装置に無菌コネクタを介して接続された細胞培養装置と、該細胞培養装置から細胞懸濁液が供給される細胞剥離装置と、該細胞剥離装置に無菌コネクタを介して接続された前記細胞回収装置とを具備し、前記細胞導入装置が前記細胞培養装置に前記細胞懸濁液を導入し、前記細胞培養装置が担体を培地に浮遊させて細胞を前記担体上で培養し、前記細胞剥離装置が前記細胞培養装置から供給された前記細胞懸濁液に含まれる前記担体から細胞を剥離させ、前記細胞回収装置が前記細胞剥離装置に剥離させた細胞を回収するので、前記細胞導入装置と前記細胞回収装置とを同様の構成とすることで、システム全体の部品点数を削減することができ、製作コストの低減を図ることができるという優れた効果を発揮する。

本発明の第１の実施例に係る細胞給排装置及びその周辺部の構成を示す構成図である。 本発明の第２の実施例に係る細胞導入装置及びその周辺部の構成を示す構成図である。 （Ａ）〜（Ｃ）は無菌コネクタ同士の結合について説明する説明図である。 （Ａ）〜（Ｃ）は本発明の第２の実施例に係る細胞導入装置の容器への細胞懸濁液の導入方法を説明する説明図である。 本発明の第３の実施例に係る細胞回収装置及びその周辺部の構成を示す構成図である。

以下、図面を参照しつつ本発明の実施例を説明する。

以下、本実施例に係る細胞培養システムについて説明する。該細胞培養システムは、主に、細胞導入装置１２（図２参照）、細胞培養装置１１（図２参照）、細胞剥離装置２１（図５参照）、細胞回収装置２２（図５参照）によって構成され、細胞の導入から培養、剥離、回収迄の一連の処理を行う。

前記細胞導入装置１２は、所定の細胞密度に調整した培地を前記細胞培養装置１１に導入する様になっている。又、前記細胞培養装置１１は培養槽（図示せず）を有し、該培養槽に培地を導入し、該培地中に細胞の付着した担体を浮遊させ、細胞が破損しない強さの剪断応力を与えることで、前記担体上に細胞を培養している。又、前記細胞剥離装置２１では、前記担体にＥＤＴＡ液等の剥離液を加え、細胞が前記担体から剥がれ易くした状態で、該担体と細胞との間に剪断応力を作用させ、細胞を剥離させている。更に、前記細胞回収装置２２は、前記細胞剥離装置２１にて剥離された細胞を培地中に回収する様になっている。

先ず、図１に於いて、本発明の第１の実施例に係る細胞給排装置１について説明する。該細胞給排装置１は、前記細胞導入装置１２と前記細胞回収装置２２とを兼用可能となっている。尚、以下に於いては、先ず該細胞給排装置１の一部である細胞給排蓋体２について説明する。又、以下に於いては、該細胞給排蓋体２の紙面に対して上側を外側、該細胞給排蓋体２の紙面に対して下側を内側としている。

該細胞給排蓋体２は、蓋体本体３と、細胞給排管４と、エア給排管５とを有している。前記蓋体本体３の内周面には螺子部（図示せず）が形成され、前記細胞給排管４は前記蓋体本体３を上方（外部）から貫通し、下方（内部）に延出している。前記エア給排管５は、前記蓋体本体３に上方から接続され、下方（内部）と連通している。

又、前記細胞給排管４の外側端には無菌コネクタ６が設けられ、前記エア給排管５の外側中途部にはエアフィルタ７が設けられている。前記無菌コネクタ６は、前記細胞給排管４内の無菌状態が維持される様、無菌シール１６（図３参照）等の封止部材によって封止されている。尚、前記蓋体本体３、前記細胞給排管４、前記エア給排管５、前記無菌コネクタ６、前記エアフィルタ７により前記細胞給排蓋体２が構成される。

図１中、８は所定の形状、容積を有する容器、例えば遠沈管を示している。該遠沈管８の上端部外周面には螺子部（図示せず）が形成されており、該遠沈管８と前記蓋体本体３とは螺合可能となっている。該蓋体本体３と前記遠沈管８とを螺合させることで、該遠沈管８が気密に閉塞され、該遠沈管８の内部が無菌状態で封止される様になっている。

又、前記エア給排管５には、導入手段或は回収手段として、例えばシリンジ９が接続可能となっており、前記細胞給排蓋体２と前記遠沈管８と前記シリンジ９とにより前記細胞給排装置１が構成される。

前記シリンジ９により、前記遠沈管８の内部にエアを供給し、或は該遠沈管８内のエアを吸引することで、該遠沈管８内の圧力を増減可能であり、該遠沈管８の圧力の増減により、前記細胞給排管４を介して培地等所要の液体の給排を行うことができる。

次に、図２〜図４に於いて、本発明の第２の実施例について説明する。第２の実施例に於いては、細胞給排装置１を細胞培養装置１１に細胞を導入する為の細胞導入装置１２として用いている。尚、図２〜図４中、図１中と同等のものには同符号を付し、その説明を省略する。

図２中、１１は細胞培養装置を示しており、該細胞培養装置１１には、培養槽（図示せず）に細胞懸濁液１３を導入する為の細胞導入管１４が接続され、該細胞導入管１４は前記細胞培養装置１１の外部に延出している。前記細胞導入管１４の外側端には無菌コネクタ１５が設けられ、該無菌コネクタ１５は無菌コネクタ６と結合可能となっている。

図３（Ａ）〜図３（Ｃ）に無菌コネクタの例を示す。図３（Ａ）に示される様に、細胞給排管４に設けられた前記無菌コネクタ６は、例えば雄コネクタであり、端面には等角度ピッチで複数の爪部１７が突出形成されている。前記無菌コネクタ６の端面には無菌シール１６が貼設され、前記細胞給排管４内を無菌状態で封止している。又、前記無菌コネクタ１５は例えば雌コネクタであり、端面には前記爪部１７が嵌合可能な凹部１８が形成されている。前記無菌コネクタ１５の端面には無菌シール１９が貼設され、前記細胞導入管１４内を無菌状態で封止している。

前記無菌コネクタ６と前記無菌コネクタ１５を結合する際には、図３（Ｂ）に示される様に、前記爪部１７と前記凹部１８とを嵌合させ、前記無菌コネクタ６と前記無菌コネクタ１５の端面同士を密着させた状態で、前記無菌シール１６と前記無菌シール１９とを同時に引抜くことで、前記細胞給排管４と前記細胞導入管１４とが無菌状態を維持して連通する様になっている（図３（Ｃ）参照）。

前記細胞培養装置１１に細胞を導入する前段階として、先ず、図４（Ａ）に示される様に、クリーンベンチ等の無菌環境下に於いて、遠沈管８から細胞給排蓋体２を取外す。次に、図４（Ｂ）に示される様に、細胞が付着した担体を含み細胞密度等が調整された培地（以下細胞懸濁液）１３を前記遠沈管８内に導入する。前記細胞給排蓋体２により前記遠沈管８を気密に封止することで、前記細胞懸濁液１３は前記遠沈管８内に貯溜され、該遠沈管８には空間８′が残置される（図４（Ｃ）参照）。

この時、前記細胞給排管４は、前記細胞懸濁液１３中且つ前記遠沈管８の底部近傍で開口し、エア給排管５は前記空間８′に開口する様になっている。

次に、前記細胞給排蓋体２で封止された前記遠沈管８をクリーンベンチから取出し、前記エア給排管５に導入手段であるシリンジ９を接続する。前記細胞給排管４の外側端部は前記無菌コネクタ６により封止され、又前記エア給排管５の中途部にはエアフィルタ７が設けられているので、前記遠沈管８の内部は無菌状態が維持される。

前記細胞培養装置１１に前記細胞懸濁液１３を供給する際には、前記爪部１７と前記凹部１８とを嵌合させ、前記無菌コネクタ６と前記無菌コネクタ１５とを密着させた状態で、前記無菌シール１６と前記無菌シール１９とを同時に引抜くことで、前記無菌コネクタ６と前記無菌コネクタ１５とを結合させ、前記細胞給排管４と前記細胞導入管１４とを無菌状態を維持して連通させる。

この状態で、前記シリンジ９により、前記遠沈管８内にエアを供給して加圧することで、該遠沈管８内の前記細胞懸濁液１３が、前記細胞給排管４、前記細胞導入管１４を介して前記細胞培養装置１１の培養槽（図示せず）内に導入される。

尚、前記シリンジ９により前記遠沈管８内にエアが供給される際には、前記エアフィルタ７によりエアの除菌が行われるので、前記シリンジ９の接続をクリーンベンチ内で行う必要はない。

上述の様に、第２の実施例では、前記細胞導入装置１２の前記細胞給排管４と、前記細胞培養装置１１の前記細胞導入管１４とが、前記無菌コネクタ６，１５を介して無菌状態を維持して接続可能であり、前記細胞懸濁液１３を前記細胞培養装置１１の培養槽（図示せず）に無菌状態を維持したまま導入可能となっている。

従って、前記細胞懸濁液１３を導入する際に、その都度前記培養槽を開放する必要がなく、細胞の培養を継続したまま新しい細胞を無菌状態を維持したまま導入できるので、細胞の継代作業を前記培養槽を開放することなく連続培養したまま行うことができる。

又、前記細胞給排管４と前記細胞導入管１４とを無菌状態を維持して接続可能であり、接続を無菌環境下で行う必要がないので、大気環境下での接続が可能となり、実施環境の制約が減少し、前記細胞導入装置１２の汎用性を高めることができる。

又、前記細胞懸濁液１３の導入を行う給排手段が前記シリンジ９であり、前記細胞懸濁液１３の導入を行う為のロボットを必要としないので、装置構成が簡易となり、製作コストの低減を図ることができる。

次に、図５に於いて、本発明の第３の実施例について説明する。第３の実施例に於いては、細胞給排装置１を細胞剥離装置２１から細胞を回収する為の細胞回収装置２２として用いている。尚、図５中、図２中と同等のものには同符号を付し、その説明を省略する。

図５中、２１は細胞剥離装置を示しており、該細胞剥離装置２１には、担体から剥離させた細胞を回収する為の細胞回収管２４が外部に延出し、該細胞回収管２４の外側端には無菌コネクタ２５が設けられている。

尚、該無菌コネクタ２５の構造は第２の実施例に於ける無菌コネクタ１５と同様であるので、無菌コネクタ６との結合方法についての説明は省略する。

前記細胞剥離装置２１から細胞を回収する前段階として、予め遠沈管８内に細胞を含まない培地２３を導入する。該培地２３を導入する際には、第２の実施例に於ける細胞導入装置１２の場合と同様、クリーンベンチ等の無菌環境下に於いて行われる。

尚、前記遠沈管８内に導入される前記培地２３の液量は、細胞を剥離する際に用いられる剥離液を充分に希釈可能な液量、例えば剥離液の１０倍程度とするのが望ましい。

この時、細胞給排管４は、前記培地２３内且つ前記遠沈管８の底部近傍で開口し、エア給排管５は空間８′に開口する様になっている。

次に、細胞給排蓋体２で封止された前記遠沈管８をクリーンベンチから取出し、前記エア給排管５に回収手段であるシリンジ９を接続する。前記細胞給排管４の外側端部は無菌コネクタ６により封止され、又前記エア給排管５の中途部にはエアフィルタ７が設けられているので、前記遠沈管８の内部は無菌状態が維持される。

前記細胞剥離装置２１から細胞を回収する際には、前記無菌コネクタ６と前記無菌コネクタ２５とを結合し、前記細胞給排管４と前記細胞回収管２４とを無菌状態を維持して連通させる。

この状態で、前記シリンジ９により、前記遠沈管８内のエアを吸引して減圧することで、前記細胞剥離装置２１から、前記細胞回収管２４、前記細胞給排管４を介して、細胞が剥離液と共に前記遠沈管８内の前記培地２３中に回収される。

第３の実施例に於いては、前記細胞給排管４と前記細胞回収管２４とが、前記無菌コネクタ６，２５を介して無菌状態を維持して接続可能であり、前記細胞剥離装置２１にて剥離させた細胞を１度に大量に回収することができる。

又、前記細胞給排管４と前記細胞回収管２４とを無菌状態を維持して接続可能であり、接続を無菌環境下で行う必要がないので、大気環境下での接続が可能となり、実施環境の制約が減少することで、前記細胞回収装置２２の汎用性を高めることができる。

又、前記培地２３の液量は、前記細胞と共に回収される剥離液を充分に希釈可能な液量となっているので、剥離液の細胞への悪影響を抑止できる。

又、細胞の回収を行う給排手段が前記シリンジ９であり、細胞の回収を行う為のロボットを必要としないので、構成が簡易となり、製作コストの低減を図ることができる。

又、第２の実施例と第３の実施例では、細胞導入装置１２と細胞回収装置２２は共に細胞給排装置１であり、該細胞給排装置１が前記細胞導入装置１２と前記細胞回収装置２２とを兼用できるので、細胞培養システム全体の部品点数を削減することができ、製作コストの低減を図ることができる。

尚、第２の実施例、第３の実施例では、前記細胞給排蓋体２により封止する容器を前記遠沈管８としているが、前記細胞給排蓋体２により開口部を封止可能な容器であればどの様な容器、どの様な形状であってもよい。

又、導入手段或は回収手段として、前記細胞導入管１４、前記細胞回収管２４にポンプを設け、該ポンプにより前記細胞懸濁液１３の導入、細胞の回収を行ってもよい。この場合、前記シリンジ９を省略することができる。

１ 細胞給排装置 ２ 細胞給排蓋体
３ 蓋体本体 ４ 細胞給排管
５ エア給排管 ６ 無菌コネクタ
７ エアフィルタ ８ 遠沈管
９ シリンジ １１ 細胞培養装置
１２ 細胞導入装置 １３ 細胞懸濁液
１４ 細胞導入管 １５ 無菌コネクタ
２１ 細胞剥離装置 ２２ 細胞回収装置
２４ 細胞回収管 ２５ 無菌コネクタ

Claims (2)

1. 容器の開口部を封止する細胞給排蓋体と、回収手段を具備し、前記細胞給排蓋体は内周面に螺子部が形成された蓋体本体と、該蓋体本体を貫通し延出する細胞給排管と、前記蓋体本体に接続され連通するエア給排管と、前記細胞給排管の外端部に設けられた無菌コネクタと、前記エア給排管の中途部に設けられたエアフィルタとを有し、培地が封入された前記容器が前記細胞給排蓋体に封止され、前記細胞給排管が前記培地中に開口し、前記エア給排管が前記培地の液面より上方で開口し、前記回収手段により前記細胞給排管を介して前記容器内の前記培地中に細胞が回収されることを特徴とする細胞回収装置。
2. 請求項１に記載の細胞回収装置を用いた細胞培養システムであって、細胞導入装置と、該細胞導入装置に無菌コネクタを介して接続された細胞培養装置と、該細胞培養装置から細胞懸濁液が供給される細胞剥離装置と、該細胞剥離装置に無菌コネクタを介して接続された前記細胞回収装置とを具備し、前記細胞導入装置が前記細胞培養装置に前記細胞懸濁液を導入し、前記細胞培養装置が担体を培地に浮遊させて細胞を前記担体上で培養し、前記細胞剥離装置が前記細胞培養装置から供給された前記細胞懸濁液に含まれる前記担体から細胞を剥離させ、前記細胞回収装置が前記細胞剥離装置に剥離させた細胞を回収することを特徴とする細胞培養システム。

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