JP2004313008A - 細胞培養方法および細胞培養装置 - Google Patents
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Abstract
【課題】培養液を均一かつ緩やか（マイルド）に撹拌することができ、細胞を効率よく増殖させ得る細胞培養方法および細胞培養装置を提供すること。
【解決手段】本発明の細胞培養装置１００は、細胞と粒状の細胞培養担体１と磁性粒子２とを含む培養液１４０を収納する培養容器１１０と、培養液１４０中で磁性粒子２を移動させるための磁場を発生する磁場発生装置１２０と、コントローラ１３０と、加温装置１５０とを有している。この細胞培養装置１００では、培養液１４０へ磁場を与え、培養液１４０中で磁性粒子２を移動させることにより、培養液１４０を撹拌し、細胞を細胞培養担体１の表面に付着させ、増殖させる。
【選択図】図４
【解決手段】本発明の細胞培養装置１００は、細胞と粒状の細胞培養担体１と磁性粒子２とを含む培養液１４０を収納する培養容器１１０と、培養液１４０中で磁性粒子２を移動させるための磁場を発生する磁場発生装置１２０と、コントローラ１３０と、加温装置１５０とを有している。この細胞培養装置１００では、培養液１４０へ磁場を与え、培養液１４０中で磁性粒子２を移動させることにより、培養液１４０を撹拌し、細胞を細胞培養担体１の表面に付着させ、増殖させる。
【選択図】図４
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、細胞培養方法および細胞培養装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年、細胞培養技術が、細胞組織工学、医薬品等の安全性試験、治療や診断を目的としたタンパク質の生産等、様々な産業、研究分野で応用されている。
【０００３】
現在、この細胞培養には、付着依存性細胞を大量に効率よく培養するために、培養フラスコによる平面培養ではなく、細胞の足場となるビーズ状の担体を用いた三次元高密度培養（マイクロキャリヤー培養）が用いられている。
【０００４】
このマイクロキャリヤー培養には、各種の担体（細胞培養担体）が用いられている。
【０００５】
ところで、マイクロキャリヤー培養では、担体を均一に懸濁させ、付着させた各細胞に偏りなく栄養を供給するため、細胞培養を行っている間は、培養液を十分に撹拌することが重要となる。
【０００６】
これまで、このマイクロキャリヤー培養には、一般に、羽根（フィン）が形成された撹拌子を用い、これを回転させながら培養液の撹拌を行うスピンナーフラスコが使用されている（特許文献１参照）。
【０００７】
しかしながら、スピンナーフラスコを用いるマイクロキャリヤー培養では、撹拌子の回転速度が速過ぎると、羽根と担体とが激しく衝突して細胞が担体から脱落したり、破壊されてしまう場合があり、細胞を十分に増殖させることができない。一方、撹拌子の回転速度が遅過ぎると、担体がスピンナーフラスコ中で沈んでしまい、培養液中に均一に懸濁されない。このような場合、細胞への栄養供給に偏りが生じ、期待する程の増殖率が得られないため、攪拌子を適度な回転速度で回転させることが極めて重要となる。
【０００８】
ところが、スピンナーフラスコを用いるマイクロキャリヤー培養では、攪拌子を適度な回転速度で回転させることが非常に難しいという問題がある。また、用いる細胞の種類やフラスコの形状等に応じて、培養条件（攪拌子の回転速度等）の設定が必要であるという問題もある。
【０００９】
【特許文献１】
特開平０６−２０９７６１号公報
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、均一かつ緩やか（マイルド）に培養液を撹拌することができる細胞培養方法および細胞培養装置を提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
このような目的は、下記（１）〜（２７）の本発明により達成される。
【００１２】
（１） 細胞と、粒状の細胞培養担体と、磁性粒子とを含む培養液へ磁場を与え、前記培養液中で前記磁性粒子を移動させることにより、前記培養液を撹拌し、前記細胞を前記細胞培養担体の表面に付着させ、増殖させることを特徴とする細胞培養方法。
【００１３】
本発明によれば、均一かつ緩やかに培養液を撹拌することができ、その結果、細胞を効率よく増殖させることができる。
【００１４】
（２） 前記培養液へ与える磁場の強度を、経時的に変化させる上記（１）に記載の細胞培養方法。
これにより、培養液をより均一に攪拌することができる。
【００１５】
（３） 前記培養液へ与える磁場の位置を、経時的に変化させる上記（１）または（２）に記載の細胞培養方法。
これにより、培養液をより均一に攪拌することができる。
【００１６】
（４） 前記細胞培養担体は、主として樹脂材料で構成された基材と、該基材の表面の少なくとも一部を覆うように形成され、前記細胞が付着し得る被覆層とを有するものである上記（１）ないし（３）のいずれかに記載の細胞培養方法。
【００１７】
これにより、細胞培養担体に、細胞を付着、増殖させる機能を好適に発揮させつつ、その形状、大きさ（平均粒径等）、物性（密度等）の調整が容易となる。
【００１８】
（５） 前記被覆層は、主としてリン酸カルシウム系化合物で構成されている上記（１）ないし（４）のいずれかに記載の細胞培養方法。
【００１９】
リン酸カルシウム系化合物は、生物学的に不活性であり、細胞に対してダメージを与えるおそれが極めて低いことから好ましい。
【００２０】
（６） 前記被覆層は、前記基材の表面付近に、主としてリン酸カルシウム系化合物で構成された粒子の一部が貫入することにより形成されたものである上記（５）に記載の細胞培養方法。
これにより、被覆層と基材との密着性を優れたものとすることができる。
【００２１】
（７） 前記被覆層は、前記基材の表面に、主としてリン酸カルシウム系化合物で構成された多孔質粒子を衝突させることにより形成されたものである上記（６）に記載の細胞培養方法。
かかる方法によれば、容易かつ確実に、被覆層を形成することができる。
【００２２】
（８） 前記細胞培養担体の密度は、０．８〜１．４ｇ／ｃｍ３である上記（１）ないし（７）のいずれかに記載の細胞培養方法。
これにより、細胞培養担体を培養液中でより均一に懸濁させることができる。
【００２３】
（９） 前記細胞培養担体の平均粒径をＡ［μｍ］とし、前記細胞培養担体に付着させる細胞の最大長さをＢ［μｍ］としたとき、Ａ／Ｂが２〜１００である上記（１）ないし（８）のいずれかに記載の細胞培養方法。
【００２４】
これにより、細胞培養担体の表面積を細胞の大きさ（サイズ）に対して十分に大きくすることができるため、細胞が細胞培養担体の表面に付着、増殖するのがより容易となる。
【００２５】
（１０） 前記細胞培養担体の平均粒径をＡ［μｍ］とし、前記磁性粒子の平均粒径をＣ［μｍ］としたとき、Ｃ／Ａが０．０２〜１０である上記（１）ないし（９）のいずれかに記載の細胞培養方法。
【００２６】
これにより、磁性粒子の移動による培養液の攪拌を十分に行うことができ、細胞培養担体を培養液中でより均一に懸濁させることができる。
【００２７】
（１１） 前記細胞培養担体の平均粒径は、５０〜５００μｍである上記（１）ないし（１０）のいずれかに記載の細胞培養方法。
【００２８】
これにより、細胞が細胞培養担体の表面に付着、増殖するのがより容易となるとともに、細胞培養担体を培養液中でより均一に懸濁させることができる。
【００２９】
（１２） 前記磁性粒子は、樹脂材料と磁性材料とを複合化してなるものである上記（１）ないし（１１）のいずれかに記載の細胞培養方法。
【００３０】
これにより、樹脂材料と磁性材料との配合比率（混合比率）を設定することで、容易に磁性粒子の密度（比重）を調整することができるとともに、磁性粒子の形状、大きさ（平均粒径等）等の調整が容易となる。
【００３１】
（１３） 前記磁性粒子の密度は、０．８〜２．５ｇ／ｃｍ３である上記（１）ないし（１２）のいずれかに記載の細胞培養方法。
これにより、培養液の撹拌を十分に行うことができる。
【００３２】
（１４） 前記磁性粒子の平均粒径は、１０〜５００μｍである上記（１）ないし（１３）のいずれかに記載の細胞培養方法。
これにより、培養液の撹拌を十分に行うことができる。
【００３３】
（１５） 前記磁性粒子は、その表面の少なくとも一部を覆うように形成され、前記細胞が付着し得る被覆層を有する上記（１）ないし（１４）のいずれかに記載の細胞培養方法。
【００３４】
これにより、磁性粒子の表面にも細胞を付着させ、増殖させることが可能となり、細胞の増殖効率をより向上させることができる。
【００３５】
（１６） 前記被覆層は、主としてリン酸カルシウム系化合物で構成されている上記（１５）に記載の細胞培養方法。
【００３６】
リン酸カルシウム系化合物は、生物学的に不活性であり、細胞に対してダメージを与えるおそれが極めて低いことから好ましい。
【００３７】
（１７） 前記被覆層は、前記磁性粒子の表面付近に、主としてリン酸カルシウム系化合物で構成された粒子の一部が貫入することにより形成されたものである上記（１６）に記載の細胞培養方法。
これにより、被覆層と基材との密着性を優れたものとすることができる。
【００３８】
（１８） 前記被覆層は、前記磁性粒子の表面に、主としてリン酸カルシウム系化合物で構成された多孔質粒子を衝突させることにより形成されたものである上記（１７）に記載の細胞培養方法。
かかる方法によれば、容易かつ確実に、被覆層を形成することができる。
【００３９】
（１９） 前記磁性粒子と前記細胞培養担体との混合比は、容積比で１０：９０〜５０：５０である上記（１）ないし（１８）のいずれかに記載の細胞培養方法。
【００４０】
これにより、培養液を十分に撹拌することができるとともに、細胞培養担体からの細胞の脱落を防止することもできる。
【００４１】
（２０） 上記（１）ないし（１９）のいずれかに記載の細胞培養方法に用いることを特徴とする細胞培養装置。
【００４２】
本発明によれば、均一かつ緩やかに培養液を撹拌することができ、その結果、細胞を効率よく増殖させることができる。
【００４３】
（２１） 細胞と、粒状の細胞培養担体と、磁性粒子とを含む培養液を収納する培養容器と、
前記培養液中で前記磁性粒子を移動させるための磁場を発生する磁場発生装置とを有することを特徴とする細胞培養装置。
【００４４】
本発明によれば、均一かつ緩やかに培養液を撹拌することができ、その結果、細胞を効率よく増殖させることができる。
【００４５】
（２２） 前記磁場発生装置は、発生する磁場の強度を経時的に変化させるよう構成されている上記（２１）に記載の細胞培養装置。
これにより、培養液をより均一に攪拌することができる。
【００４６】
（２３） 前記磁場発生装置は、発生する磁場の位置を経時的に変化させるよう構成されている上記（２１）または（２２）に記載の細胞培養装置。
これにより、培養液をより均一に攪拌することができる。
【００４７】
（２４） 前記磁場発生装置は、前記培養容器の外周部に設けられている上記（２１）ないし（２３）のいずれかに記載の細胞培養装置。
【００４８】
（２５） 前記磁場発生装置は、前記培養液に接触して設けられている上記（２１）ないし（２３）のいずれかに記載の細胞培養装置。
【００４９】
（２６） 前記磁場発生装置は、前記培養容器内に収納された前記培養液の液面付近に設けられている上記（２１）ないし（２５）のいずれかに記載の細胞培養装置。
【００５０】
これにより、磁性粒子を上下方向に大きく移動させることができ、培養液をより均一に撹拌することができる。
【００５１】
（２７） 前記磁場発生装置を複数個有する上記（２１）ないし（２６）のいずれかに記載の細胞培養装置。
【００５２】
これにより、磁性粒子の培養液中での移動をより複雑なパターンとすることができる。
【００５３】
【発明の実施の形態】
本発明は、細胞を懸濁させた培養液（液体培地）を撹拌しながら、細胞を浮遊状態で増殖させる撹拌培養に適用される。
【００５４】
ここで、この撹拌培養では、特に細胞が付着依存性細胞の場合、細胞とともに、細胞を付着させる細胞培養担体を培養液中に懸濁し、この細胞培養担体の表面に細胞を付着させた状態で増殖させることが行われる。
【００５５】
細胞培養担体を用いる培養方法は、特にマイクロキャリヤー培養と称され、本発明は、このマイクロキャリヤー培養に好適に用いることができる。
【００５６】
以下、本発明の細胞培養方法および細胞培養装置をマイクロキャリヤー培養に適用した場合を一例として説明する。
【００５７】
まず、本発明の細胞培養方法について説明する。
本発明の細胞培養方法は、細胞と、粒状の細胞培養担体と、磁性粒子とを含む培養液へ磁場を与え、培養液中で磁性粒子を移動させることにより、培養液を撹拌し、細胞を細胞培養担体の表面に付着させ、増殖させるものである。すなわち、本発明の細胞培養方法により、細胞の培養を行う際には、まず、細胞および細胞培養担体とともに、磁性粒子を培養液中に添加する。そして、この培養液に磁場を与え、培養液中で磁性粒子を移動させることにより、培養液を撹拌する。この状態で、細胞を細胞培養担体の表面に付着させ、増殖させる。
【００５８】
本発明によれば、均一かつ緩やかに培養液を撹拌することができ、その結果、細胞を効率よく増殖させることができる。
【００５９】
また、このような細胞培養方法では、培養液へ与える磁場の強度や位置を、経時的に変化させることにより、培養液をより均一に攪拌することができる。
【００６０】
ここで、磁場の強度を経時的に変化させる方法としては、例えば、磁場の発生をオン／オフする方法、磁場の強度を増減する方法等が挙げられる。
【００６１】
また、磁場の位置を経時的に変化させる方法としては、例えば、複数の磁場発生装置からの磁場を経時的に切り替える方法、培養液と磁場発生装置とを相対的に移動させる方法等が挙げられる。
【００６２】
以下、各構成要素について、順次説明する。
図１は、本発明で用いられる細胞培養担体の構成を示す断面図、図２は、本発明で用いられる磁性粒子の構成を示す断面図、図３は、本発明で用いられる磁性粒子の他の構成を示す断面図である。
【００６３】
［細胞培養担体１］
細胞培養担体１は、細胞の増殖の足場となるものであり、粒状（好ましくは、ほぼ球状）をなすものである。
【００６４】
細胞培養担体１としては、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、セルロース、デキストラン等を主材料とするもの（これらは、通常、マイクロキャリヤー培養において用いられるものである。）が使用可能である他、図１に示すように、基材１１と、基材１１の表面を覆うように形成され、細胞が付着し得る被覆層１２とを有する構成のものを用いることもできる。
【００６５】
細胞培養担体１として、図１に示す構成のものを用いることにより、細胞培養担体１に、細胞を付着、増殖させる機能を好適に発揮させつつ、その形状、大きさ（平均粒径等）、物性（密度等）の調整が容易となる。
【００６６】
基材１１は、樹脂材料を主材料とするものが好適である。これにより、前記効果をより向上させることができる。
【００６７】
樹脂材料としては、各種熱硬化性樹脂、各種熱可塑性樹脂を用いることができ、具体的には、熱可塑性樹脂としては、例えば、ポリアミド、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリイミド、アクリル樹脂、熱可塑性ポリウレタン等、熱硬化性樹脂としては、例えば、エポキシ樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、尿素樹脂、不飽和ポリエステル、アルキド樹脂、熱硬化性ポリウレタン、エボナイド等が挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００６８】
また、樹脂材料は、有機顔料、無機顔料、酸性染料、塩基性染料等で着色されたものであってもよい。
【００６９】
被覆層１２の構成材料は、細胞が付着し得るものであればよいが、特に、リン酸カルシウム系化合物を主材料とするものが好適である。リン酸カルシウム系化合物は、生物学的に不活性であり、細胞に対してダメージを与えるおそれが極めて低いことから好ましい。
【００７０】
リン酸カルシウム系化合物としては、特に限定されず、Ｃａ／Ｐ比が１．０〜２．０の各種化合物を用いることができ、例えば、Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２、Ｃａ１０（ＰＯ４）６Ｆ２、Ｃａ１０（ＰＯ４）６Ｃｌ２、Ｃａ３（ＰＯ４）２、Ｃａ２Ｐ２Ｏ７、Ｃａ（ＰＯ３）２、ＣａＨＰＯ４等のうちの１種または２種以上を混合して用いることができる。
【００７１】
これらの中でも、リン酸カルシウム系化合物としては、ハイドロキシアパタイト（Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２）を主成分とするものが最適である。ハイドロキシアパタイトは、生体材料として用いられるものであり、細胞が極めて効率よく付着することができ、かつ、細胞に対するダメージを与える可能性が特に低い。
【００７２】
また、フッ素アパタイト（Ｃａ１０（ＰＯ４）６Ｆ２）を用いる場合には、全リン酸カルシウム系化合物中のフッ素含有率を、５重量％以下とするのが好ましい。全リン酸カルシウム系化合物中のフッ素含有率を、５重量％以下とすることにより、被覆層１２（細胞培養担体１）からのフッ素の溶出が防止または極めて少量とされるので、細胞へのダメージは、無いかまたは極めて小さいものとすることができ、その結果、細胞の増殖効率が低下するのが防止される。
【００７３】
なお、これらのリン酸カルシウム系化合物は、公知の湿式合成法、乾式合成法などによって合成することができる。この場合、リン酸カルシウム系化合物中には、その合成の際に残存する物質（原料等）または合成の過程で生じる二次反応生成物等が含まれていてもよい。
【００７４】
被覆層１２を主としてリン酸カルシウム系化合物で構成する場合、この被覆層１２は、基材１１の表面に、リン酸カルシウム系化合物を吸着させることにより形成されたものであってもよいが、図１に示すように、基材１１の表面付近に、主としてリン酸カルシウム系化合物で構成された粒子１３（以下、単に「粒子１３」と言う。）の一部が貫入することにより形成されたものであるのが好ましい。これにより、被覆層１２と基材１１との密着性を優れたものとすることができる。このため、被覆層１２の基材１１の表面からの剥離を好適に防止すること、すなわち、細胞培養担体１の強度を優れたものとすることができる。
【００７５】
また、この場合、被覆層１２は、例えば、基材１１の表面に、主としてリン酸カルシウム系化合物で構成された多孔質粒子（以下、単に「多孔質粒子」と言う。）を衝突させることにより形成することができる。かかる方法によれば、容易かつ確実に、被覆層１２を形成することができる。
【００７６】
基材１１の表面に多孔質粒子を衝突させると、多孔質粒子は、基材１１に衝突する際に、破砕されて比較的小さい粒径の粒子１３となり、その一部が基材１１に貫入する。このとき、粒子１３の一部が基材１１に貫入すると、基材１１は、自らの弾性力により粒子１３を掴み込むようにして固定する。
【００７７】
また、多孔質粒子は、リン酸カルシウム系化合物の一次粒子を凝集結合させることにより製造されたものを用いるのが好ましい。このような多孔質粒子は、基材１１に衝突した際に、より効率よく破砕されるので、基材１１の表面をより確実に被覆することができる。
【００７８】
多孔質粒子の平均粒径は、特に限定されないが、１００μｍ以下であるのが好ましい。多孔質粒子の平均粒径が１００μｍを超えると、基材１１への衝突時の速度が低くなり、多孔質粒子が効率よく破砕されない場合がある。
【００７９】
この基材１１と多孔質粒子との衝突は、例えば、市販のハイブリダイゼーション装置を用いて、乾式で行うことができる。このときの条件は、例えば、基材１１と多孔質粒子との混合比が、重量比で４００：１〜５０：１程度、装置内の温度が、基材１１の主材料として用いた樹脂材料の軟化温度以下（通常、８０℃以下）とされる。
【００８０】
また、このような多孔質粒子は、例えば、次のような公知の方法で製造することができる。
【００８１】
すなわち、多孔質粒子は、公知の方法で湿式合成したリン酸カルシウム系化合物の結晶粒子（一次粒子）を含むスラリーを、直接噴霧乾燥などにより二次粒子に造粒するか、または、前記スラリーに粘度調整剤、加熱により消失する有機化合物粒子または繊維等の添加物を加えて、噴霧乾燥などにより二次粒子に造粒する。なお、得られた二次粒子は、必要に応じて焼成するようにしてもよい。
【００８２】
この二次粒子自体が多孔質粒子となっているので、この二次粒子をそのまま被覆層１２の形成に使用することができる。
【００８３】
さらに、より高気孔率の多孔質粒子が好ましい場合には、例えば、次の方法で製造するようにする。
【００８４】
まず、前記二次粒子を再びスラリー状に懸濁して、湿式成形または加圧による乾式成形等により、ブロック体に成形する。なお、この際、後の焼成工程で消散して、気孔を形成するための有機化合物を添加してもよい。また、かかる有機化合物を添加せずに、例えば焼成温度等の他の条件を調節することにより、気孔径を制御することもできる。次いで、得られたブロック体を４００〜１３００℃程度の温度範囲で焼成する。焼成温度が４００℃未満では、有機化合物の熱消失、ブロック体の焼結等が充分に行われないおそれがある。一方、焼成を１３００℃を超える高温で行うと、焼結体が緻密化し過ぎたり、リン酸カルシウム系化合物が分解を起こすおそれがある。次いで、このように焼成したブロック体を粉砕後、分級して所望の粒径のものとする。
【００８５】
この多孔質粒子の気孔径は、例えば、前記一次粒子の大きさ、スラリーの粘度、添加物等を適宜設定することによって、調整することができる。
【００８６】
このようにして得られる多孔質粒子は、その比表面積が１０ｍ２／ｇ以上、かつ、細孔径（気孔径）が５００〜１０００Å程度であることが好ましい。かかる条件を満足する多孔質粒子を用いて製造される細胞培養担体１は、その表面への細胞の付着の効率、付着した細胞の増殖の効率をより向上させることができる。
【００８７】
なお、被覆層１２の形成方法（細胞培養担体１の製造方法）は、これに限定されるものではない。
【００８８】
このような被覆層１２は、緻密質なものまたは多孔質なもののいずれであってもよい。
【００８９】
また、被覆層１２の平均厚さは、特に限定されないが、０．１〜５μｍ程度であるのが好ましく、０．５〜２μｍ程度であるのがより好ましい。被覆層１２の平均厚さが前記下限値未満である場合、細胞培養担体１では、部分的に基材１１が露出してしまうおそれがある。一方、被覆層１２の平均厚さが前記上限値を超えた場合、細胞培養担体１の密度の調整が困難となる。
【００９０】
このような細胞培養担体１は、その密度（比重）が水の密度に近いのものであるのが好ましい。具体的には、細胞培養担体１の密度は、０．８〜１．４ｇ／ｃｍ３程度であるのが好ましく、０．９〜１．２ｇ／ｃｍ３程度であるのがより好ましい。これにより、細胞培養担体１を培養液中でより均一に懸濁させることができる。
【００９１】
また、細胞培養担体１の大きさ（サイズ）も、特に限定されないが、例えば、次のようなものが好ましい。
【００９２】
すなわち、細胞培養担体１の平均粒径をＡ［μｍ］とし、細胞培養担体１に付着させる細胞の最大長さをＢ［μｍ］としたとき、Ａ／Ｂが２〜１００程度であるのが好ましく、５〜５０程度であるのがより好ましい。これにより、細胞培養担体１の表面積を細胞の大きさ（サイズ）に対して十分に大きくすることができるため、細胞が細胞培養担体１の表面に付着、増殖するのがより容易となる。
【００９３】
また、細胞培養担体１の平均粒径をＡ［μｍ］とし、後述する磁性粒子２の平均粒径をＣ［μｍ］としたとき、Ｃ／Ａが０．０２〜１０程度であるのが好ましく、０．３〜３程度であるのがより好ましい。これにより、磁性粒子２の移動による培養液の攪拌（後述参照）を十分に行うことができ、細胞培養担体１を培養液中でより均一に懸濁させることができる。
【００９４】
具体的には、細胞培養担体１の平均粒径は、５０〜５００μｍ程度であるのが好ましく、１００〜３００μｍ程度であるのがより好ましい。これにより、前述したような効果をより向上させることができる。
【００９５】
以上説明したような細胞培養担体１は、その表面により多くの細胞を付着させ、増殖させる観点からは、本実施形態のように、基材１１の表面のほぼ全てが被覆層１２で覆われているのが好ましいが、付着させる細胞の種類や、基材１１の構成材料の種類等によっては、その表面の一部が被覆層１２で覆われたような構成（換言すれば、基材１１の一部が被覆層１２から露出する構成）であってもよい。
【００９６】
［磁性粒子２］
磁性粒子２は、磁場が与えられることにより、培養液中で移動し得るものである。この磁性粒子２が、培養液の全体に亘って移動することにより、培養液は、均一かつ緩やか（マイルド）に撹拌され、その結果、細胞培養担体１は、培養液中で均一に懸濁される。
【００９７】
このため、細胞が細胞培養担体１の表面に付着し易くなるとともに、付着した細胞には、均一に栄養が供給されることになる。また、従来のスピンナーフラスコを用いた培養のように、羽根と細胞培養担体１とが衝突して生じる激しい衝撃が細胞培養担体１に加わるのを防止することができるので、付着した細胞が細胞培養担体１の表面から脱落することや、細胞が破壊されるのを防止することができる。このようなことから、本発明によれば、細胞をより効率よく増殖させることができる。
【００９８】
磁性粒子２は、磁場を与えることにより容易に移動可能であり、また、磁場を取り除いたときには培養液中で沈降（沈殿）し得るものであるのが好ましい。これにより、培養液をより容易かつ確実に攪拌することができる。
【００９９】
かかる観点からは、磁性粒子２の密度（比重）は、０．８〜２．５ｇ／ｃｍ３程度であるのが好ましく、１．２〜１．９ｇ／ｃｍ３程度であるのがより好ましい。磁性粒子２の密度が小さ過ぎると、磁場を取り除いた際に、磁性粒子２が培養液中で沈降し難くなり、一方、磁性粒子の密度が大き過ぎると、磁性粒子２を培養液中で移動させるのに大きな磁場が必要となり、いずれの場合も、培養液の撹拌を十分に行えないおそれがある。
【０１００】
磁性粒子２は、その全体が磁性材料で構成されたものであってもよいが、樹脂材料と磁性材料とを複合化してなる複合化粒子であるのが好ましい。これにより、樹脂材料と磁性材料との配合比率（混合比率）を設定することで、容易に磁性粒子２の密度（比重）を調整することができる。また、磁性粒子２の形状、大きさ（平均粒径等）等の調整が容易となるという利点もある。
【０１０１】
この複合化粒子（磁性粒子２）の形態としては、図２に示すように、主として樹脂材料で構成された基材２１中に磁性材料（磁性粉体）２２が分散されたものが好適である。かかる磁性粒子２は、例えば、磁性材料２２を混合した溶融状態の樹脂材料を粒状に成形（造粒）することにより、比較的容易に製造することができる。なお、複合化粒子は、磁性材料２２が基材２１の表面付近にのみ分散されたものであってもよい。
【０１０２】
この磁性材料２２としては、例えば、酸化鉄、Ｆｅ、Ｎｉ、Ｃｏ等を主成分とする強磁性合金、フェライト、バリウムフェライト、ストロンチウムフェライト等が挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。
【０１０３】
また、樹脂材料としては、細胞培養担体１の基材１１で挙げたものと同様のものを用いることができる。
【０１０４】
磁性粒子２の平均粒径は、１０〜５００μｍ程度であるのが好ましく、１００〜３００μｍ程度であるのがより好ましい。磁性粒子２の平均粒径が小さ過ぎると、培養液に十分な乱流を生じさせることができず、一方、磁性粒子２の平均粒径が大き過ぎると、磁性粒子２を培養液中で移動させるのに大きな磁場が必要となり、いずれの場合も、培養液の撹拌を十分に行えないおそれがある。なお、磁性粒子２の平均粒径が小さ過ぎると、磁性粒子２同士が容易に凝集してしまうおそれもある。
【０１０５】
このような磁性粒子２の培養液中への添加量は、特に限定されないが、前記磁性粒子と前記細胞培養担体との混合比が、容積比で１０：９０〜５０：５０程度（特に、２０：８０〜４０：６０程度）となるように混合するのが好ましい。磁性粒子２の培養液中への添加量が少な過ぎると、培養液を十分に撹拌することができないおそれがある。一方、磁性粒子２の培養液中への添加量が多過ぎると、磁性粒子２と細胞培養担体１とが衝突する頻度が高くなり、これにより、細胞培養担体１から細胞が脱落するおそれがある。
【０１０６】
また、このような磁性粒子２には、例えば、図３に示すように、その表面の少なくとも一部（図示の構成では、表面のほぼ全体）を覆うように形成され、細胞を付着し得る被覆層２３を有する構成のものを用いることもできる。これにより、磁性粒子２の表面にも細胞を付着させ、増殖させることが可能となり、細胞の増殖効率をより向上させることができる。
【０１０７】
この被覆層２３の構成は、細胞培養担体１の被覆層１２で記載したのと同様の構成とするのが好ましい。すなわち、被覆層２３は、主としてリン酸カルシウム系化合物で構成されたものであるのが好ましい。また、この被覆層２３は、磁性粒子２の表面付近に、主としてリン酸カルシウム系化合物で構成された粒子２４の一部が貫入することにより形成されたものであるのが好ましく、この場合、磁性粒子２の表面に、主としてリン酸カルシウム系化合物で構成された多孔質粒子を衝突させることにより形成されたものであるのが好ましい。
【０１０８】
特に、リン酸カルシウム系化合物を主材料として被覆層２３を形成することにより、磁性材料２２から生じる金属イオンを被覆層２３で捕捉して、培養液中に金属イオンが溶出するのを防止することもできる。これにより、細胞への悪影響を防止することができる。この場合、被覆層２３は、イオンバリヤ層として機能する。
【０１０９】
［培養液］
培養液１４０は、用いる細胞の種類等により適宜選択され、特に限定されないが、例えば、ダルベッコＭＥＭ培地、ニッスイＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地、ＭＣＤＢ−１０４培地等を用いることができる。
【０１１０】
また、これらの培養液１４０中には、必要に応じて、例えば、血清、アルブミン等の血清タンパク質、各種ビタミン類、アミノ酸、塩類等の添加剤を添加するようにしてもよい。
【０１１１】
次に、このような細胞培養方法に用いられる細胞培養装置（本発明の細胞培養装置）について説明する。
【０１１２】
＜第１実施形態＞
まず、本発明の細胞培養装置の第１実施形態について説明する。
【０１１３】
図４は、本発明の細胞培養装置の第１実施形態を示す模式図、図５は、磁場発生装置が発生する磁場のパターンを示す図である。
【０１１４】
図４に示す細胞培養装置１００は、培養容器１１０と、磁場発生装置１２０と、コントローラ（制御部）１３０と、加温装置１５０とを有している。コントローラ１３０が電源に接続されることにより、細胞培養装置１００の各部の作動に必要な電力が供給される。
【０１１５】
培養容器１１０は、培養液１４０を収納するものであり、上部に培養液１４０を供給・排出するための開口部１１１が形成されている。この開口部１１１は、必要に応じて栓体１１２によって閉塞され、培養容器１１０内の気密性が保たれるようになっている。
【０１１６】
培養容器１１０の形状、容量等は、特に限定されず、用いる細胞の種類、培養液１４０の種類等に応じて適宜設定される。
【０１１７】
磁場発生装置１２０は、培養液１４０中で磁性粒子２を移動させるための磁場を発生するものであり、電磁石１２１と、この電磁石１２１を収納する非磁性体カバー（図示せず）とを有している。
【０１１８】
本実施形態では、電磁石１２１は、金属製の環状の芯材１２２と、この芯材１２２の外周部にラセン状に巻回された導線１２３とで構成され、導線１２３に通電することにより周辺に磁場を発生する。
【０１１９】
非磁性体カバーは、電磁石１２１を保護、固定する機能を有するものであり、例えば、アクリル系樹脂、シリコーン系樹脂等の各種樹脂材料等で構成されている。
【０１２０】
このような磁場発生装置１２０の内側には、培養容器１１０が設けられている。換言すれば、磁場発生装置１２０は、培養容器１１０の外周部に設けられている。なお、磁場発生装置１２０は固定部材（図示せず）により、固定・保持されている。磁場発生装置１２０の培養容器１１０の高さ方向における設置位置は、培養液１４０を培養容器１１０内に収納（貯留）したときに、培養液１４０の液面付近とするのが好ましい。これにより、磁性粒子２を上下方向に大きく移動させることができ、培養液１４０をより均一に撹拌することができる。
【０１２１】
また、磁場発生装置１２０と培養容器１１０との離間距離（図２中ｄ）は、特に限定されないが、磁場発生装置１２０と培養容器１１０とができるだけ接近しているのが好ましく、特に、これらが接触（密着）して設けられているのが好ましい。
【０１２２】
磁場発生装置１２０は、発生する磁場の強度を経時的に変化させるよう構成されている。この磁場発生装置１２０が発生する磁場のパターンとしては、例えば、一定間隔でオン／オフするパターン（図５（ａ）参照）が挙げられる。磁場を発生させると、磁性粒子２が磁場発生装置１２０側に引き寄せられ、培養液１４０中で浮上する。また、この状態から磁場の発生を停止すると、磁場発生装置１２０側に引き寄せられた磁性粒子２がその自重によって沈降する。このような磁性粒子２の上下移動の繰り返しにより培養液１４０には乱流が生じ、培養液１４０が均一かつ緩やかに撹拌される。
【０１２３】
磁場の最大強度（絶対値）は、磁性粒子２の密度（比重）、培養液１４０の組成や容積等に応じて適宜設定され、特に限定されないが、０．１〜１００Ｗｂ／ｍ２程度であるのが好ましく、０．２〜５０Ｗｂ／ｍ２程度であるのがより好ましい。磁場の最大強度（磁束密度）が小さ過ぎると、磁性粒子２を磁場発生装置１２０側に十分に引き寄せることが困難となり、培養液１４０の撹拌が不十分になるおそれがある。また、磁場の最大強度を前記上限値を超えて大きくしても、消費電力が無駄にかかるばかりか、磁場が細胞へ悪影響を及ぼすおそれがある。
【０１２４】
なお、磁場発生装置１２０が発生する磁場のパターンは、一定間隔でオン／オフするパターン（図５（ａ）参照）に限らず、例えば、発生する磁場の強度を一定間隔で増減させるパターン（図５（ｂ）参照）、発生する磁場の強度や向き等を連続的に変化させるパターン（図５（ｃ）参照）等であってもよい。また、これらのパターンは、任意に組み合わせるようにしてもよい。
【０１２５】
コントローラ１３０は、電源から供給される電流の条件（例えば、種類、量、方向、時間、周波数等）を変化させる機能を有するものである。そして、コントローラ１３０は、電源から供給される電流を変換して、所定の条件（パターン）の電流を電磁石１２１（磁場発生装置１２０）に供給する。例えば、磁場発生装置１２０に間欠的に磁場を発生させる場合、電源から供給される交流電流をパルス電流に変換し、電磁石１２１に供給する。
【０１２６】
また、コントローラ１３０には、加温装置１５０が電気的に接続されている。この加温装置１５０は、例えば、ヒータ、ペルチェ素子等が内蔵されており、コントローラ１３０の制御により培養液１４０を加温する。
【０１２７】
次に、このような細胞培養装置１００の使用方法（細胞培養方法）の一例を説明する。
【０１２８】
［１］ まず、細胞培養担体１および磁性粒子２に、それぞれ滅菌処理を施す。これにより、細胞培養担体１および磁性粒子２の表面に存在する微生物やカビ等の数を低減、または、これらを完全に死滅させることができる。これにより、微生物やカビ等による細胞へのダメージが低減または除去され、細胞は、より効率よく増殖することができる。
【０１２９】
この滅菌処理には、例えば、細胞培養担体１および磁性粒子２と滅菌液とを接触させる方法、オートクレーブ滅菌、ガス滅菌、放射線滅菌等を用いることができるが、これらの中でも、細胞培養担体１および磁性粒子２と滅菌液とを接触させる方法が好適である。かかる方法によれば、大量の細胞培養担体１および磁性粒子２を、より効率よく滅菌することができる。
【０１３０】
滅菌液を用いる場合、滅菌処理後の細胞培養担体１および磁性粒子２を洗浄して、細胞培養担体１および磁性粒子２の表面に付着した滅菌液を除去する。
【０１３１】
［２］ 次に、前記工程［１］終了後の細胞培養担体１および磁性粒子２と、細胞（付着させる細胞）とを培養液１４０に添加（混合）し、この培養液１４０を、細胞培養装置１００の培養容器１１０内に収納（貯留）する。
【０１３２】
ここで、細胞には、例えば、目的とするタンパク質をコードする遺伝子を含むシャトルベクター（ベクター）を移入しておくようにする。
【０１３３】
この細胞としては、例えば、動物細胞、植物細胞、細菌、ウイルス等が挙げられるが、これらの中でも、特に、動物細胞が好適である。細胞として動物細胞を用いることにより、本発明をより広範な技術分野へ適用することが可能となるとともに、タンパク質の生産を行う場合には、より複雑な構造を有するもの（例えば、糖タンパク質等）の生産を好適に行うことができる。
【０１３４】
［３］ 次に、細胞培養装置１００を作動させると、前述のようにして培養液１４０には、磁場発生装置１２０から所定のパターンの磁場が与えられる（印加される）。これにより、培養液１４０中で磁性粒子２が移動し、この磁性粒子２の移動により培養液１４０が攪拌され、細胞培養担体１は、培養液１４０中に均一に懸濁される。
【０１３５】
また、このとき、加温装置１５０により培養液１４０は加温される。この培養液１４０の加温の温度は、培養する細胞の種類等に応じて適宜設定され、特に限定されないが、通常、４〜４０℃程度、好ましくは２５〜３７℃程度とされる。
【０１３６】
このような状態で、培養液１４０中では、細胞が細胞培養担体１の表面に付着し、その表面で増殖する。特に、磁性粒子２の移動による培養液１４０の攪拌は、均一かつ緩やかに行われるため、細胞の培養を極めて効率よく行うことができる。
【０１３７】
そして、増殖した細胞は、目的とするタンパク質を生産（産生）して、このタンパク質を、例えば培養液１４０中へ放出したり、細胞内に蓄積したり等する。
【０１３８】
なお、このとき、必要に応じて、酸素ガスを含むガスを供給しつつ、細胞の培養を行うようにしてもよい。
【０１３９】
［４］ 次に、生産されたタンパク質を回収する。例えば、培養液１４０中に放出されたタンパク質を回収する場合には、次のようにすることができる。
【０１４０】
すなわち、前記工程［３］における培養液１４０の攪拌を停止して、細胞培養担体１および磁性粒子２が培養液１４０中で沈殿した後上清を採取するか、または、培養液１４０を濾過して濾液を採取する。そして、この採取液（上清または濾液）を処理（例えば、クロマトグラフィー等）することにより、目的とするタンパク質を容易に回収することができる。
【０１４１】
＜第２実施形態＞
次に、本発明の細胞培養装置の第２実施形態について説明する。
【０１４２】
図６は、本発明の細胞培養装置の第２実施形態を示す模式図である。
以下、第２実施形態について説明するが、前記第１実施形態との相違点を中心に説明し、同様の事項については、その説明を省略する。
【０１４３】
図６に示す細胞培養装置１００では、磁場発生装置１２０の構成が異なり、それ以外は、前記第１実施形態の細胞培養装置１００と同様である。
【０１４４】
すなわち、第２実施形態の磁場発生装置１２０は、直線状（円柱状）の芯材１２２の外周部にラセン状に導線１２３が巻回されてなる電磁石１２１を有している。なお、磁場発生装置１２０は、磁場に影響を与えない材料を主材料として構成される防水カバーで覆うことが好ましい。
【０１４５】
この磁場発生装置１２０は、培養容器１１０に装着される栓体１１２に挿通された状態で、固定（固着）されている。そして、本実施形態では、細胞の培養を行う際に、磁場発生装置１２０は、培養液１４０に接触するように設置される。
【０１４６】
磁場発生装置１２０が発生する磁場のパターンは、例えば、前述した図５に示すパターンとすることができる。
【０１４７】
このような第２実施形態の細胞培養装置１００においても、前記第１実施形態と同様の作用・効果が得られる。
【０１４８】
＜第３実施形態＞
次に、本発明の細胞培養装置の第３実施形態について説明する。
【０１４９】
図７は、本発明の細胞培養装置の第３実施形態を示す模式図、図８は、磁場発生装置が発生する磁場のパターンを示す図である。
【０１５０】
以下、第３実施形態について説明するが、前記第１実施形態との相違点を中心に説明し、同様の事項については、その説明を省略する。
【０１５１】
図７に示す細胞培養装置１００では、磁場発生装置１２０の構成が異なり、それ以外は、前記第１実施形態の細胞培養装置１００と同様である。
【０１５２】
すなわち、第３実施形態の磁場発生装置１２０は、４つ（複数）の電磁石１２１Ａ〜１２１Ｄを備えている。
【０１５３】
そして、各電磁石１２１Ａ〜１２１Ｄは、培養容器１１０の周方向に沿って、ほぼ等間隔で設けられている。
【０１５４】
このような構成により、通電する電磁石１２１Ａ〜１２１Ｄを順次切り替えると、すなわち、発生する磁場の位置を経時的に変化させると、磁性粒子２の培養液１４０中での移動をより複雑なパターンとすることができる。これにより、細胞培養担体１を培養液１４０中でより均一に懸濁させることができ、その結果、細胞をより効率よく増殖させることができる。
【０１５５】
各電磁石１２１Ａ〜１２１Ｄが発生する磁場のパターン（各電磁石１２１Ａ〜１２１Ｄへの通電の切替）は、例えば、図８に示すようにすることができる。すなわち、１つの電磁石が磁場を発生している間は、他の電磁石は磁場を発生しないようにし、磁場を発生する電磁石を順次（同期させて）切り替えていく。これにより、磁性粒子２を培養容器１１０の内面に沿って移動させることができる。
【０１５６】
なお、各電磁石１２１Ａ〜１２１Ｄが発生する磁場のパターンは、図８に示すものに限定されず、例えば、図５に示すようなパターンを任意に組み合わせたものであってもよい。
【０１５７】
また、各電磁石１２１Ａ〜１２１Ｄは、互いに、例えば導線１２３の巻回数、全体形状、大きさ等が同じであってもよく、異なっていてもよい。
【０１５８】
このような第３実施形態の細胞培養装置１００においても、前記第１実施形態と同様の作用・効果が得られる。
【０１５９】
以上、本発明の細胞培養方法および細胞培養装置について説明したが、本発明は、これらに限定されるものではなく、各部の構成は、同様の機能を発揮する任意の構成のものに置換することができ、また、任意の構成を付加することもできる。また、各前記実施形態の任意の２以上の構成を組み合わせるようにしてもよい。
【０１６０】
また、各前記実施形態では、磁場発生装置が固定された構成のものであったが、本発明では、磁場発生装置と培養容器とが相対的に移動可能に設けられ、培養液へ与える磁場の位置を経時的に変化させる構成であってもよい。このような構成としては、磁場発生装置を培養容器に対して、例えば、上下方向へ、左右方向へ、接近離間させる方向へ、周方向に沿って、または、これらを組み合わせて移動させる構成等が挙げられる。
【０１６１】
さらに、本発明では、磁場発生装置は、前述したようなパターンで培養液へ与える磁場の強度を経時的に変化させるとともに、培養容器に対して相対的に移動可能に設けられ、培養液へ与える磁場の位置を経時的に変化させる構成とされていてもよい。
【０１６２】
また、各前記実施形態では、磁場発生装置は、電磁石を備える構成のものであったが、電磁石に代えて永久磁石を用いることもできる。
【０１６３】
【実施例】
次に、本発明の具体的実施例について説明する。
【０１６４】
１．細胞培養担体および磁性粒子の用意
［細胞培養担体Ａ］
まず、平均粒径１５０μｍ、密度１．０２ｇ／ｃｍ３のナイロン粒子（基材）５０ｇと、Ｃａ／Ｐ比１．６７、平均粒径１０μｍのハイドロキシアパタイト粒子（一次粒子が凝集結合した多孔質粒子）０．２５ｇとを用意した。
【０１６５】
なお、ハイドロキシアパタイト粒子は、その比表面積が４５ｍ２／ｇ、かつ、その細孔径が６００Åであった。
【０１６６】
次に、これらナイロン粒子およびハイドロキシアパタイト粒子をＮＡＲＡハイブリダイゼーションシステムＮＨＳ−１（（株）奈良機械製作所製、定格動力５．５ｋＷ、定格電流２３Ａ）に投入し、この装置を６４００回転／分、３２〜５０℃で５分間稼動させた。これにより、表面がハイドロキシアパタイトで被覆された細胞培養担体Ａ（図１参照）を得た。
【０１６７】
なお、得られた細胞培養担体Ａは、平均粒径１５１μｍ（ハイドロキシアパタイト被覆層の平均厚さ１μｍ）、密度１．０３ｇ／ｃｍ３であった。
【０１６８】
［細胞培養担体Ｂ］
細胞培養担体Ｂとして、平均粒径２００μｍ、密度１．０３ｇ／ｃｍ３のデキストラン粒子（ファルマシア社製）を用意した。
【０１６９】
［細胞培養担体Ｃ］
細胞培養担体Ｃとして、平均粒径１５０μｍ、密度１．０２ｇ／ｃｍ３のナイロン粒子を用意した。
【０１７０】
［磁性粒子Ａ］
磁性粒子Ａとして、平均粒径１５０μｍ、密度１．９０ｇ／ｃｍ３のフェライト複合化ナイロン粒子（図２参照）を用意した。
【０１７１】
［磁性粒子Ｂ］
まず、平均粒径１５０μｍ、密度１．９０ｇ／ｃｍ３のフェライト複合化ナイロン粒子５０ｇと、Ｃａ／Ｐ比１．６７、平均粒径１０μｍハイドロキシアパタイト粒子（一次粒子が凝集結合した多孔質粒子）０．２５ｇとを用意した。
【０１７２】
なお、ハイドロキシアパタイト粒子は、その比表面積が４５ｍ２／ｇ、かつ、その細孔径が６００Åであった。
【０１７３】
次に、これらフェライト複合化ナイロン粒子およびハイドロキシアパタイト粒子をＮＡＲＡハイブリダイゼーションシステムＮＨＳ−１（（株）奈良機械製作所製、定格動力５．５ｋＷ、定格電流２３Ａ）に投入し、この装置を６４００回転／分、３２〜５０℃で５分間稼動させた。これにより、表面がハイドロキシアパタイトで被覆された磁性粒子Ｂを得た。
【０１７４】
なお、得られた磁性粒子Ｂは、平均粒径１５１μｍ（ハイドロキシアパタイト被覆層の平均厚さ１．０μｍ）、密度１．９３ｇ／ｃｍ３であった。
【０１７５】
２．細胞の培養
２−１． ヒト骨肉腫由来細胞（ＨＯＳ）の培養
このヒト骨肉腫由来細胞は、最大長さが約２０μｍの細胞である。
【０１７６】
（実施例１Ａ）
細胞培養担体Ａ：０．８ｇと、磁性粒子Ａ：０．６ｇと、２×１０５個／ｍＬのヒト骨肉腫由来細胞（ＨＯＳ）懸濁液：３０ｍＬとを、ニッスイＭＥＭ培地（培養液）１００ｍＬに添加した。なお、ニッスイＭＥＭ培地中には、１０ｖｏｌ％のウシ胎児血清を添加して用いた。
また、細胞培養担体Ａと磁性粒子Ａとの容積比は、７０：３０であった。
【０１７７】
この培養液を、図４に示すような細胞培養装置の培養容器（ＩＷＡＫＩ−ＰＹＲＥＸ社製、耐熱広口ガラス瓶）に収納して、細胞の培養を行った。なお、培養条件は、発生する磁場のパターン：図５（ａ）、パルス間隔：２秒、培養液の温度：３７℃、培養の日数：５日間とした。
【０１７８】
（実施例２Ａ）
パルス間隔を１０秒とした以外は、前記実施例１Ａと同様にして、細胞の培養を行った。
【０１７９】
（実施例３Ａ）
磁性粒子Ａに代えて、磁性粒子Ｂを用いた以外は、前記実施例１Ａと同様にして、細胞の培養を行った。
なお、細胞培養担体Ａと磁性粒子Ｂとの容積比は、７０：３０であった。
【０１８０】
（実施例４Ａ）
細胞培養担体Ａ：０．８ｇに代えて、細胞培養担体Ｂ：０．２ｇを用いた以外は、前記実施例１Ａと同様にして、細胞の培養を行った。
【０１８１】
（比較例１Ａ）
細胞培養担体Ａ：０．８ｇと、２×１０５個／ｍＬのヒト骨肉腫由来細胞（ＨＯＳ）懸濁液：３０ｍＬとを、ニッスイＭＥＭ培地（培養液）１００ｍＬに添加した。なお、ニッスイＭＥＭ培地中には、１０ｖｏｌ％のウシ胎児血清を添加して用いた。
【０１８２】
この培養液を、スピンナーフラスコ（柴田科学社製）に収納して、細胞の培養を行った。なお、培養条件は、撹拌子の回転速度：３０ｒｐｍ、培養液の温度：３７℃、培養の日数：５日間とした。
【０１８３】
（比較例２Ａ）
攪拌子の回転速度を６０ｒｐｍとした以外は、前記比較例１Ａと同様にして、細胞の培養を行った。
【０１８４】
（比較例３Ａ）
細胞培養担体Ａに代えて、細胞培養担体Ｃを用いた以外は、前記比較例１Ａと同様にして、細胞の培養を行った。
【０１８５】
２−２． サル腎臓由来細胞（Ｖｅｒｏ）の培養
このサル腎臓由来細胞は、最大長さが約２０μｍの細胞である。
【０１８６】
（実施例１Ｂ〜４Ｂ、比較例１Ｂ〜３Ｂ）
サル腎臓由来細胞を用いた以外は、それぞれ、前記実施例１Ａ〜４Ａおよび比較例１Ａ〜３Ａと同様にして、細胞の培養を行った。
【０１８７】
２−３． 蚊由来細胞（Ｃ６／３６）の培養
この蚊由来細胞は、最大長さが約２０μｍの細胞である。
【０１８８】
（実施例１Ｃ〜４Ｃ、比較例１Ｃ〜３Ｃ）
蚊由来細胞を用いた以外は、それぞれ、前記実施例１Ａ〜４Ａおよび比較例１Ａ〜３Ａと同様にして、細胞の培養を行った。
【０１８９】
３．評価
各実施例および各比較例において、それぞれ、培養開始（撹拌開始）から３時間後、１日後、３日後、５日後に、各培養液の所定量を採取し、細胞培養担体（１５ｍｇ）の表面に付着している細胞の数を計測した。この細胞数の計測は、ＥＤＴＡまたはトリプシン処理した細胞をトリパンブルー染色することにより行った。
その結果を、表１〜表３に示す。
【０１９０】
【表１】
【０１９１】
【表２】
【０１９２】
【表３】
【０１９３】
各表に示すように、各実施例（本発明）では、いずれも、細胞の種類によらず、各比較例に対して、細胞の培養効率が高いことが明らかとなった。
【０１９４】
また、実施例（本発明）では、磁場の発生パターンのパルス間隔を変更した場合でも、細胞の増殖効率に大きな変動は、認められなかった。このことから、実施例では、細胞の種類等に応じた培養条件の厳密な設定を要しないことが判る。
【０１９５】
これに対して、スピンナーフラスコを用いる培養である比較例では、攪拌子の回転速度の違いにより、細胞の培養効率が大きく変動するものであった。すなわち、比較例では、いずれの細胞も、その育成状態が攪拌子の回転速度の違いにより大きく異なるものであった。このため、培養条件の最適化が極めて難しいことが判る。
また、比較例では、細胞培養担体からの細胞の脱落も認められた。
【０１９６】
なお、図４、図６および図７に示すような細胞培養装置を用いて、磁場のパターンを種々変更して、各前記実施例と同様にして細胞の培養を行ったが、前記と同様の結果が得られた。
【０１９７】
【発明の効果】
以上述べたように、本発明によれば、培養液を均一かつ緩やか（マイルド）に撹拌することができ、細胞を効率よく増殖させることができる。
【０１９８】
また、細胞培養担体および磁性粒子の構成を適宜設定することにより、前記効果をより向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明で用いられる細胞培養担体の構成を示す断面図である。
【図２】本発明で用いられる磁性粒子の構成を示す断面図である。
【図３】本発明で用いられる磁性粒子の他の構成を示す断面図である。
【図４】本発明の細胞培養装置の第１実施形態を示す模式図である。
【図５】磁場発生装置が発生する磁場のパターンを示す図である。
【図６】本発明の細胞培養装置の第２実施形態を示す模式図である。
【図７】本発明の細胞培養装置の第３実施形態を示す模式図である。
【図８】磁場発生装置が発生する磁場のパターンを示す図である。
【符号の説明】
１ 細胞培養担体
１１ 基材
１２ 被覆層
１３ 粒子
２ 磁性粒子
２１ 基材
２２ 磁性材料
２３ 被覆層
２４ 粒子
１００ 細胞培養装置
１１０ 培養容器
１１１ 開口部
１１２ 栓体
１２０ 磁場発生装置
１２１ 電磁石
１２１Ａ〜１２１Ｄ 電磁石
１２２ 芯材
１２３ 導線
１３０ コントローラ
１４０ 培養液
１５０ 加温装置
【発明の属する技術分野】
本発明は、細胞培養方法および細胞培養装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年、細胞培養技術が、細胞組織工学、医薬品等の安全性試験、治療や診断を目的としたタンパク質の生産等、様々な産業、研究分野で応用されている。
【０００３】
現在、この細胞培養には、付着依存性細胞を大量に効率よく培養するために、培養フラスコによる平面培養ではなく、細胞の足場となるビーズ状の担体を用いた三次元高密度培養（マイクロキャリヤー培養）が用いられている。
【０００４】
このマイクロキャリヤー培養には、各種の担体（細胞培養担体）が用いられている。
【０００５】
ところで、マイクロキャリヤー培養では、担体を均一に懸濁させ、付着させた各細胞に偏りなく栄養を供給するため、細胞培養を行っている間は、培養液を十分に撹拌することが重要となる。
【０００６】
これまで、このマイクロキャリヤー培養には、一般に、羽根（フィン）が形成された撹拌子を用い、これを回転させながら培養液の撹拌を行うスピンナーフラスコが使用されている（特許文献１参照）。
【０００７】
しかしながら、スピンナーフラスコを用いるマイクロキャリヤー培養では、撹拌子の回転速度が速過ぎると、羽根と担体とが激しく衝突して細胞が担体から脱落したり、破壊されてしまう場合があり、細胞を十分に増殖させることができない。一方、撹拌子の回転速度が遅過ぎると、担体がスピンナーフラスコ中で沈んでしまい、培養液中に均一に懸濁されない。このような場合、細胞への栄養供給に偏りが生じ、期待する程の増殖率が得られないため、攪拌子を適度な回転速度で回転させることが極めて重要となる。
【０００８】
ところが、スピンナーフラスコを用いるマイクロキャリヤー培養では、攪拌子を適度な回転速度で回転させることが非常に難しいという問題がある。また、用いる細胞の種類やフラスコの形状等に応じて、培養条件（攪拌子の回転速度等）の設定が必要であるという問題もある。
【０００９】
【特許文献１】
特開平０６−２０９７６１号公報
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、均一かつ緩やか（マイルド）に培養液を撹拌することができる細胞培養方法および細胞培養装置を提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
このような目的は、下記（１）〜（２７）の本発明により達成される。
【００１２】
（１） 細胞と、粒状の細胞培養担体と、磁性粒子とを含む培養液へ磁場を与え、前記培養液中で前記磁性粒子を移動させることにより、前記培養液を撹拌し、前記細胞を前記細胞培養担体の表面に付着させ、増殖させることを特徴とする細胞培養方法。
【００１３】
本発明によれば、均一かつ緩やかに培養液を撹拌することができ、その結果、細胞を効率よく増殖させることができる。
【００１４】
（２） 前記培養液へ与える磁場の強度を、経時的に変化させる上記（１）に記載の細胞培養方法。
これにより、培養液をより均一に攪拌することができる。
【００１５】
（３） 前記培養液へ与える磁場の位置を、経時的に変化させる上記（１）または（２）に記載の細胞培養方法。
これにより、培養液をより均一に攪拌することができる。
【００１６】
（４） 前記細胞培養担体は、主として樹脂材料で構成された基材と、該基材の表面の少なくとも一部を覆うように形成され、前記細胞が付着し得る被覆層とを有するものである上記（１）ないし（３）のいずれかに記載の細胞培養方法。
【００１７】
これにより、細胞培養担体に、細胞を付着、増殖させる機能を好適に発揮させつつ、その形状、大きさ（平均粒径等）、物性（密度等）の調整が容易となる。
【００１８】
（５） 前記被覆層は、主としてリン酸カルシウム系化合物で構成されている上記（１）ないし（４）のいずれかに記載の細胞培養方法。
【００１９】
リン酸カルシウム系化合物は、生物学的に不活性であり、細胞に対してダメージを与えるおそれが極めて低いことから好ましい。
【００２０】
（６） 前記被覆層は、前記基材の表面付近に、主としてリン酸カルシウム系化合物で構成された粒子の一部が貫入することにより形成されたものである上記（５）に記載の細胞培養方法。
これにより、被覆層と基材との密着性を優れたものとすることができる。
【００２１】
（７） 前記被覆層は、前記基材の表面に、主としてリン酸カルシウム系化合物で構成された多孔質粒子を衝突させることにより形成されたものである上記（６）に記載の細胞培養方法。
かかる方法によれば、容易かつ確実に、被覆層を形成することができる。
【００２２】
（８） 前記細胞培養担体の密度は、０．８〜１．４ｇ／ｃｍ３である上記（１）ないし（７）のいずれかに記載の細胞培養方法。
これにより、細胞培養担体を培養液中でより均一に懸濁させることができる。
【００２３】
（９） 前記細胞培養担体の平均粒径をＡ［μｍ］とし、前記細胞培養担体に付着させる細胞の最大長さをＢ［μｍ］としたとき、Ａ／Ｂが２〜１００である上記（１）ないし（８）のいずれかに記載の細胞培養方法。
【００２４】
これにより、細胞培養担体の表面積を細胞の大きさ（サイズ）に対して十分に大きくすることができるため、細胞が細胞培養担体の表面に付着、増殖するのがより容易となる。
【００２５】
（１０） 前記細胞培養担体の平均粒径をＡ［μｍ］とし、前記磁性粒子の平均粒径をＣ［μｍ］としたとき、Ｃ／Ａが０．０２〜１０である上記（１）ないし（９）のいずれかに記載の細胞培養方法。
【００２６】
これにより、磁性粒子の移動による培養液の攪拌を十分に行うことができ、細胞培養担体を培養液中でより均一に懸濁させることができる。
【００２７】
（１１） 前記細胞培養担体の平均粒径は、５０〜５００μｍである上記（１）ないし（１０）のいずれかに記載の細胞培養方法。
【００２８】
これにより、細胞が細胞培養担体の表面に付着、増殖するのがより容易となるとともに、細胞培養担体を培養液中でより均一に懸濁させることができる。
【００２９】
（１２） 前記磁性粒子は、樹脂材料と磁性材料とを複合化してなるものである上記（１）ないし（１１）のいずれかに記載の細胞培養方法。
【００３０】
これにより、樹脂材料と磁性材料との配合比率（混合比率）を設定することで、容易に磁性粒子の密度（比重）を調整することができるとともに、磁性粒子の形状、大きさ（平均粒径等）等の調整が容易となる。
【００３１】
（１３） 前記磁性粒子の密度は、０．８〜２．５ｇ／ｃｍ３である上記（１）ないし（１２）のいずれかに記載の細胞培養方法。
これにより、培養液の撹拌を十分に行うことができる。
【００３２】
（１４） 前記磁性粒子の平均粒径は、１０〜５００μｍである上記（１）ないし（１３）のいずれかに記載の細胞培養方法。
これにより、培養液の撹拌を十分に行うことができる。
【００３３】
（１５） 前記磁性粒子は、その表面の少なくとも一部を覆うように形成され、前記細胞が付着し得る被覆層を有する上記（１）ないし（１４）のいずれかに記載の細胞培養方法。
【００３４】
これにより、磁性粒子の表面にも細胞を付着させ、増殖させることが可能となり、細胞の増殖効率をより向上させることができる。
【００３５】
（１６） 前記被覆層は、主としてリン酸カルシウム系化合物で構成されている上記（１５）に記載の細胞培養方法。
【００３６】
リン酸カルシウム系化合物は、生物学的に不活性であり、細胞に対してダメージを与えるおそれが極めて低いことから好ましい。
【００３７】
（１７） 前記被覆層は、前記磁性粒子の表面付近に、主としてリン酸カルシウム系化合物で構成された粒子の一部が貫入することにより形成されたものである上記（１６）に記載の細胞培養方法。
これにより、被覆層と基材との密着性を優れたものとすることができる。
【００３８】
（１８） 前記被覆層は、前記磁性粒子の表面に、主としてリン酸カルシウム系化合物で構成された多孔質粒子を衝突させることにより形成されたものである上記（１７）に記載の細胞培養方法。
かかる方法によれば、容易かつ確実に、被覆層を形成することができる。
【００３９】
（１９） 前記磁性粒子と前記細胞培養担体との混合比は、容積比で１０：９０〜５０：５０である上記（１）ないし（１８）のいずれかに記載の細胞培養方法。
【００４０】
これにより、培養液を十分に撹拌することができるとともに、細胞培養担体からの細胞の脱落を防止することもできる。
【００４１】
（２０） 上記（１）ないし（１９）のいずれかに記載の細胞培養方法に用いることを特徴とする細胞培養装置。
【００４２】
本発明によれば、均一かつ緩やかに培養液を撹拌することができ、その結果、細胞を効率よく増殖させることができる。
【００４３】
（２１） 細胞と、粒状の細胞培養担体と、磁性粒子とを含む培養液を収納する培養容器と、
前記培養液中で前記磁性粒子を移動させるための磁場を発生する磁場発生装置とを有することを特徴とする細胞培養装置。
【００４４】
本発明によれば、均一かつ緩やかに培養液を撹拌することができ、その結果、細胞を効率よく増殖させることができる。
【００４５】
（２２） 前記磁場発生装置は、発生する磁場の強度を経時的に変化させるよう構成されている上記（２１）に記載の細胞培養装置。
これにより、培養液をより均一に攪拌することができる。
【００４６】
（２３） 前記磁場発生装置は、発生する磁場の位置を経時的に変化させるよう構成されている上記（２１）または（２２）に記載の細胞培養装置。
これにより、培養液をより均一に攪拌することができる。
【００４７】
（２４） 前記磁場発生装置は、前記培養容器の外周部に設けられている上記（２１）ないし（２３）のいずれかに記載の細胞培養装置。
【００４８】
（２５） 前記磁場発生装置は、前記培養液に接触して設けられている上記（２１）ないし（２３）のいずれかに記載の細胞培養装置。
【００４９】
（２６） 前記磁場発生装置は、前記培養容器内に収納された前記培養液の液面付近に設けられている上記（２１）ないし（２５）のいずれかに記載の細胞培養装置。
【００５０】
これにより、磁性粒子を上下方向に大きく移動させることができ、培養液をより均一に撹拌することができる。
【００５１】
（２７） 前記磁場発生装置を複数個有する上記（２１）ないし（２６）のいずれかに記載の細胞培養装置。
【００５２】
これにより、磁性粒子の培養液中での移動をより複雑なパターンとすることができる。
【００５３】
【発明の実施の形態】
本発明は、細胞を懸濁させた培養液（液体培地）を撹拌しながら、細胞を浮遊状態で増殖させる撹拌培養に適用される。
【００５４】
ここで、この撹拌培養では、特に細胞が付着依存性細胞の場合、細胞とともに、細胞を付着させる細胞培養担体を培養液中に懸濁し、この細胞培養担体の表面に細胞を付着させた状態で増殖させることが行われる。
【００５５】
細胞培養担体を用いる培養方法は、特にマイクロキャリヤー培養と称され、本発明は、このマイクロキャリヤー培養に好適に用いることができる。
【００５６】
以下、本発明の細胞培養方法および細胞培養装置をマイクロキャリヤー培養に適用した場合を一例として説明する。
【００５７】
まず、本発明の細胞培養方法について説明する。
本発明の細胞培養方法は、細胞と、粒状の細胞培養担体と、磁性粒子とを含む培養液へ磁場を与え、培養液中で磁性粒子を移動させることにより、培養液を撹拌し、細胞を細胞培養担体の表面に付着させ、増殖させるものである。すなわち、本発明の細胞培養方法により、細胞の培養を行う際には、まず、細胞および細胞培養担体とともに、磁性粒子を培養液中に添加する。そして、この培養液に磁場を与え、培養液中で磁性粒子を移動させることにより、培養液を撹拌する。この状態で、細胞を細胞培養担体の表面に付着させ、増殖させる。
【００５８】
本発明によれば、均一かつ緩やかに培養液を撹拌することができ、その結果、細胞を効率よく増殖させることができる。
【００５９】
また、このような細胞培養方法では、培養液へ与える磁場の強度や位置を、経時的に変化させることにより、培養液をより均一に攪拌することができる。
【００６０】
ここで、磁場の強度を経時的に変化させる方法としては、例えば、磁場の発生をオン／オフする方法、磁場の強度を増減する方法等が挙げられる。
【００６１】
また、磁場の位置を経時的に変化させる方法としては、例えば、複数の磁場発生装置からの磁場を経時的に切り替える方法、培養液と磁場発生装置とを相対的に移動させる方法等が挙げられる。
【００６２】
以下、各構成要素について、順次説明する。
図１は、本発明で用いられる細胞培養担体の構成を示す断面図、図２は、本発明で用いられる磁性粒子の構成を示す断面図、図３は、本発明で用いられる磁性粒子の他の構成を示す断面図である。
【００６３】
［細胞培養担体１］
細胞培養担体１は、細胞の増殖の足場となるものであり、粒状（好ましくは、ほぼ球状）をなすものである。
【００６４】
細胞培養担体１としては、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、セルロース、デキストラン等を主材料とするもの（これらは、通常、マイクロキャリヤー培養において用いられるものである。）が使用可能である他、図１に示すように、基材１１と、基材１１の表面を覆うように形成され、細胞が付着し得る被覆層１２とを有する構成のものを用いることもできる。
【００６５】
細胞培養担体１として、図１に示す構成のものを用いることにより、細胞培養担体１に、細胞を付着、増殖させる機能を好適に発揮させつつ、その形状、大きさ（平均粒径等）、物性（密度等）の調整が容易となる。
【００６６】
基材１１は、樹脂材料を主材料とするものが好適である。これにより、前記効果をより向上させることができる。
【００６７】
樹脂材料としては、各種熱硬化性樹脂、各種熱可塑性樹脂を用いることができ、具体的には、熱可塑性樹脂としては、例えば、ポリアミド、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリイミド、アクリル樹脂、熱可塑性ポリウレタン等、熱硬化性樹脂としては、例えば、エポキシ樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、尿素樹脂、不飽和ポリエステル、アルキド樹脂、熱硬化性ポリウレタン、エボナイド等が挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００６８】
また、樹脂材料は、有機顔料、無機顔料、酸性染料、塩基性染料等で着色されたものであってもよい。
【００６９】
被覆層１２の構成材料は、細胞が付着し得るものであればよいが、特に、リン酸カルシウム系化合物を主材料とするものが好適である。リン酸カルシウム系化合物は、生物学的に不活性であり、細胞に対してダメージを与えるおそれが極めて低いことから好ましい。
【００７０】
リン酸カルシウム系化合物としては、特に限定されず、Ｃａ／Ｐ比が１．０〜２．０の各種化合物を用いることができ、例えば、Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２、Ｃａ１０（ＰＯ４）６Ｆ２、Ｃａ１０（ＰＯ４）６Ｃｌ２、Ｃａ３（ＰＯ４）２、Ｃａ２Ｐ２Ｏ７、Ｃａ（ＰＯ３）２、ＣａＨＰＯ４等のうちの１種または２種以上を混合して用いることができる。
【００７１】
これらの中でも、リン酸カルシウム系化合物としては、ハイドロキシアパタイト（Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２）を主成分とするものが最適である。ハイドロキシアパタイトは、生体材料として用いられるものであり、細胞が極めて効率よく付着することができ、かつ、細胞に対するダメージを与える可能性が特に低い。
【００７２】
また、フッ素アパタイト（Ｃａ１０（ＰＯ４）６Ｆ２）を用いる場合には、全リン酸カルシウム系化合物中のフッ素含有率を、５重量％以下とするのが好ましい。全リン酸カルシウム系化合物中のフッ素含有率を、５重量％以下とすることにより、被覆層１２（細胞培養担体１）からのフッ素の溶出が防止または極めて少量とされるので、細胞へのダメージは、無いかまたは極めて小さいものとすることができ、その結果、細胞の増殖効率が低下するのが防止される。
【００７３】
なお、これらのリン酸カルシウム系化合物は、公知の湿式合成法、乾式合成法などによって合成することができる。この場合、リン酸カルシウム系化合物中には、その合成の際に残存する物質（原料等）または合成の過程で生じる二次反応生成物等が含まれていてもよい。
【００７４】
被覆層１２を主としてリン酸カルシウム系化合物で構成する場合、この被覆層１２は、基材１１の表面に、リン酸カルシウム系化合物を吸着させることにより形成されたものであってもよいが、図１に示すように、基材１１の表面付近に、主としてリン酸カルシウム系化合物で構成された粒子１３（以下、単に「粒子１３」と言う。）の一部が貫入することにより形成されたものであるのが好ましい。これにより、被覆層１２と基材１１との密着性を優れたものとすることができる。このため、被覆層１２の基材１１の表面からの剥離を好適に防止すること、すなわち、細胞培養担体１の強度を優れたものとすることができる。
【００７５】
また、この場合、被覆層１２は、例えば、基材１１の表面に、主としてリン酸カルシウム系化合物で構成された多孔質粒子（以下、単に「多孔質粒子」と言う。）を衝突させることにより形成することができる。かかる方法によれば、容易かつ確実に、被覆層１２を形成することができる。
【００７６】
基材１１の表面に多孔質粒子を衝突させると、多孔質粒子は、基材１１に衝突する際に、破砕されて比較的小さい粒径の粒子１３となり、その一部が基材１１に貫入する。このとき、粒子１３の一部が基材１１に貫入すると、基材１１は、自らの弾性力により粒子１３を掴み込むようにして固定する。
【００７７】
また、多孔質粒子は、リン酸カルシウム系化合物の一次粒子を凝集結合させることにより製造されたものを用いるのが好ましい。このような多孔質粒子は、基材１１に衝突した際に、より効率よく破砕されるので、基材１１の表面をより確実に被覆することができる。
【００７８】
多孔質粒子の平均粒径は、特に限定されないが、１００μｍ以下であるのが好ましい。多孔質粒子の平均粒径が１００μｍを超えると、基材１１への衝突時の速度が低くなり、多孔質粒子が効率よく破砕されない場合がある。
【００７９】
この基材１１と多孔質粒子との衝突は、例えば、市販のハイブリダイゼーション装置を用いて、乾式で行うことができる。このときの条件は、例えば、基材１１と多孔質粒子との混合比が、重量比で４００：１〜５０：１程度、装置内の温度が、基材１１の主材料として用いた樹脂材料の軟化温度以下（通常、８０℃以下）とされる。
【００８０】
また、このような多孔質粒子は、例えば、次のような公知の方法で製造することができる。
【００８１】
すなわち、多孔質粒子は、公知の方法で湿式合成したリン酸カルシウム系化合物の結晶粒子（一次粒子）を含むスラリーを、直接噴霧乾燥などにより二次粒子に造粒するか、または、前記スラリーに粘度調整剤、加熱により消失する有機化合物粒子または繊維等の添加物を加えて、噴霧乾燥などにより二次粒子に造粒する。なお、得られた二次粒子は、必要に応じて焼成するようにしてもよい。
【００８２】
この二次粒子自体が多孔質粒子となっているので、この二次粒子をそのまま被覆層１２の形成に使用することができる。
【００８３】
さらに、より高気孔率の多孔質粒子が好ましい場合には、例えば、次の方法で製造するようにする。
【００８４】
まず、前記二次粒子を再びスラリー状に懸濁して、湿式成形または加圧による乾式成形等により、ブロック体に成形する。なお、この際、後の焼成工程で消散して、気孔を形成するための有機化合物を添加してもよい。また、かかる有機化合物を添加せずに、例えば焼成温度等の他の条件を調節することにより、気孔径を制御することもできる。次いで、得られたブロック体を４００〜１３００℃程度の温度範囲で焼成する。焼成温度が４００℃未満では、有機化合物の熱消失、ブロック体の焼結等が充分に行われないおそれがある。一方、焼成を１３００℃を超える高温で行うと、焼結体が緻密化し過ぎたり、リン酸カルシウム系化合物が分解を起こすおそれがある。次いで、このように焼成したブロック体を粉砕後、分級して所望の粒径のものとする。
【００８５】
この多孔質粒子の気孔径は、例えば、前記一次粒子の大きさ、スラリーの粘度、添加物等を適宜設定することによって、調整することができる。
【００８６】
このようにして得られる多孔質粒子は、その比表面積が１０ｍ２／ｇ以上、かつ、細孔径（気孔径）が５００〜１０００Å程度であることが好ましい。かかる条件を満足する多孔質粒子を用いて製造される細胞培養担体１は、その表面への細胞の付着の効率、付着した細胞の増殖の効率をより向上させることができる。
【００８７】
なお、被覆層１２の形成方法（細胞培養担体１の製造方法）は、これに限定されるものではない。
【００８８】
このような被覆層１２は、緻密質なものまたは多孔質なもののいずれであってもよい。
【００８９】
また、被覆層１２の平均厚さは、特に限定されないが、０．１〜５μｍ程度であるのが好ましく、０．５〜２μｍ程度であるのがより好ましい。被覆層１２の平均厚さが前記下限値未満である場合、細胞培養担体１では、部分的に基材１１が露出してしまうおそれがある。一方、被覆層１２の平均厚さが前記上限値を超えた場合、細胞培養担体１の密度の調整が困難となる。
【００９０】
このような細胞培養担体１は、その密度（比重）が水の密度に近いのものであるのが好ましい。具体的には、細胞培養担体１の密度は、０．８〜１．４ｇ／ｃｍ３程度であるのが好ましく、０．９〜１．２ｇ／ｃｍ３程度であるのがより好ましい。これにより、細胞培養担体１を培養液中でより均一に懸濁させることができる。
【００９１】
また、細胞培養担体１の大きさ（サイズ）も、特に限定されないが、例えば、次のようなものが好ましい。
【００９２】
すなわち、細胞培養担体１の平均粒径をＡ［μｍ］とし、細胞培養担体１に付着させる細胞の最大長さをＢ［μｍ］としたとき、Ａ／Ｂが２〜１００程度であるのが好ましく、５〜５０程度であるのがより好ましい。これにより、細胞培養担体１の表面積を細胞の大きさ（サイズ）に対して十分に大きくすることができるため、細胞が細胞培養担体１の表面に付着、増殖するのがより容易となる。
【００９３】
また、細胞培養担体１の平均粒径をＡ［μｍ］とし、後述する磁性粒子２の平均粒径をＣ［μｍ］としたとき、Ｃ／Ａが０．０２〜１０程度であるのが好ましく、０．３〜３程度であるのがより好ましい。これにより、磁性粒子２の移動による培養液の攪拌（後述参照）を十分に行うことができ、細胞培養担体１を培養液中でより均一に懸濁させることができる。
【００９４】
具体的には、細胞培養担体１の平均粒径は、５０〜５００μｍ程度であるのが好ましく、１００〜３００μｍ程度であるのがより好ましい。これにより、前述したような効果をより向上させることができる。
【００９５】
以上説明したような細胞培養担体１は、その表面により多くの細胞を付着させ、増殖させる観点からは、本実施形態のように、基材１１の表面のほぼ全てが被覆層１２で覆われているのが好ましいが、付着させる細胞の種類や、基材１１の構成材料の種類等によっては、その表面の一部が被覆層１２で覆われたような構成（換言すれば、基材１１の一部が被覆層１２から露出する構成）であってもよい。
【００９６】
［磁性粒子２］
磁性粒子２は、磁場が与えられることにより、培養液中で移動し得るものである。この磁性粒子２が、培養液の全体に亘って移動することにより、培養液は、均一かつ緩やか（マイルド）に撹拌され、その結果、細胞培養担体１は、培養液中で均一に懸濁される。
【００９７】
このため、細胞が細胞培養担体１の表面に付着し易くなるとともに、付着した細胞には、均一に栄養が供給されることになる。また、従来のスピンナーフラスコを用いた培養のように、羽根と細胞培養担体１とが衝突して生じる激しい衝撃が細胞培養担体１に加わるのを防止することができるので、付着した細胞が細胞培養担体１の表面から脱落することや、細胞が破壊されるのを防止することができる。このようなことから、本発明によれば、細胞をより効率よく増殖させることができる。
【００９８】
磁性粒子２は、磁場を与えることにより容易に移動可能であり、また、磁場を取り除いたときには培養液中で沈降（沈殿）し得るものであるのが好ましい。これにより、培養液をより容易かつ確実に攪拌することができる。
【００９９】
かかる観点からは、磁性粒子２の密度（比重）は、０．８〜２．５ｇ／ｃｍ３程度であるのが好ましく、１．２〜１．９ｇ／ｃｍ３程度であるのがより好ましい。磁性粒子２の密度が小さ過ぎると、磁場を取り除いた際に、磁性粒子２が培養液中で沈降し難くなり、一方、磁性粒子の密度が大き過ぎると、磁性粒子２を培養液中で移動させるのに大きな磁場が必要となり、いずれの場合も、培養液の撹拌を十分に行えないおそれがある。
【０１００】
磁性粒子２は、その全体が磁性材料で構成されたものであってもよいが、樹脂材料と磁性材料とを複合化してなる複合化粒子であるのが好ましい。これにより、樹脂材料と磁性材料との配合比率（混合比率）を設定することで、容易に磁性粒子２の密度（比重）を調整することができる。また、磁性粒子２の形状、大きさ（平均粒径等）等の調整が容易となるという利点もある。
【０１０１】
この複合化粒子（磁性粒子２）の形態としては、図２に示すように、主として樹脂材料で構成された基材２１中に磁性材料（磁性粉体）２２が分散されたものが好適である。かかる磁性粒子２は、例えば、磁性材料２２を混合した溶融状態の樹脂材料を粒状に成形（造粒）することにより、比較的容易に製造することができる。なお、複合化粒子は、磁性材料２２が基材２１の表面付近にのみ分散されたものであってもよい。
【０１０２】
この磁性材料２２としては、例えば、酸化鉄、Ｆｅ、Ｎｉ、Ｃｏ等を主成分とする強磁性合金、フェライト、バリウムフェライト、ストロンチウムフェライト等が挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。
【０１０３】
また、樹脂材料としては、細胞培養担体１の基材１１で挙げたものと同様のものを用いることができる。
【０１０４】
磁性粒子２の平均粒径は、１０〜５００μｍ程度であるのが好ましく、１００〜３００μｍ程度であるのがより好ましい。磁性粒子２の平均粒径が小さ過ぎると、培養液に十分な乱流を生じさせることができず、一方、磁性粒子２の平均粒径が大き過ぎると、磁性粒子２を培養液中で移動させるのに大きな磁場が必要となり、いずれの場合も、培養液の撹拌を十分に行えないおそれがある。なお、磁性粒子２の平均粒径が小さ過ぎると、磁性粒子２同士が容易に凝集してしまうおそれもある。
【０１０５】
このような磁性粒子２の培養液中への添加量は、特に限定されないが、前記磁性粒子と前記細胞培養担体との混合比が、容積比で１０：９０〜５０：５０程度（特に、２０：８０〜４０：６０程度）となるように混合するのが好ましい。磁性粒子２の培養液中への添加量が少な過ぎると、培養液を十分に撹拌することができないおそれがある。一方、磁性粒子２の培養液中への添加量が多過ぎると、磁性粒子２と細胞培養担体１とが衝突する頻度が高くなり、これにより、細胞培養担体１から細胞が脱落するおそれがある。
【０１０６】
また、このような磁性粒子２には、例えば、図３に示すように、その表面の少なくとも一部（図示の構成では、表面のほぼ全体）を覆うように形成され、細胞を付着し得る被覆層２３を有する構成のものを用いることもできる。これにより、磁性粒子２の表面にも細胞を付着させ、増殖させることが可能となり、細胞の増殖効率をより向上させることができる。
【０１０７】
この被覆層２３の構成は、細胞培養担体１の被覆層１２で記載したのと同様の構成とするのが好ましい。すなわち、被覆層２３は、主としてリン酸カルシウム系化合物で構成されたものであるのが好ましい。また、この被覆層２３は、磁性粒子２の表面付近に、主としてリン酸カルシウム系化合物で構成された粒子２４の一部が貫入することにより形成されたものであるのが好ましく、この場合、磁性粒子２の表面に、主としてリン酸カルシウム系化合物で構成された多孔質粒子を衝突させることにより形成されたものであるのが好ましい。
【０１０８】
特に、リン酸カルシウム系化合物を主材料として被覆層２３を形成することにより、磁性材料２２から生じる金属イオンを被覆層２３で捕捉して、培養液中に金属イオンが溶出するのを防止することもできる。これにより、細胞への悪影響を防止することができる。この場合、被覆層２３は、イオンバリヤ層として機能する。
【０１０９】
［培養液］
培養液１４０は、用いる細胞の種類等により適宜選択され、特に限定されないが、例えば、ダルベッコＭＥＭ培地、ニッスイＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地、ＭＣＤＢ−１０４培地等を用いることができる。
【０１１０】
また、これらの培養液１４０中には、必要に応じて、例えば、血清、アルブミン等の血清タンパク質、各種ビタミン類、アミノ酸、塩類等の添加剤を添加するようにしてもよい。
【０１１１】
次に、このような細胞培養方法に用いられる細胞培養装置（本発明の細胞培養装置）について説明する。
【０１１２】
＜第１実施形態＞
まず、本発明の細胞培養装置の第１実施形態について説明する。
【０１１３】
図４は、本発明の細胞培養装置の第１実施形態を示す模式図、図５は、磁場発生装置が発生する磁場のパターンを示す図である。
【０１１４】
図４に示す細胞培養装置１００は、培養容器１１０と、磁場発生装置１２０と、コントローラ（制御部）１３０と、加温装置１５０とを有している。コントローラ１３０が電源に接続されることにより、細胞培養装置１００の各部の作動に必要な電力が供給される。
【０１１５】
培養容器１１０は、培養液１４０を収納するものであり、上部に培養液１４０を供給・排出するための開口部１１１が形成されている。この開口部１１１は、必要に応じて栓体１１２によって閉塞され、培養容器１１０内の気密性が保たれるようになっている。
【０１１６】
培養容器１１０の形状、容量等は、特に限定されず、用いる細胞の種類、培養液１４０の種類等に応じて適宜設定される。
【０１１７】
磁場発生装置１２０は、培養液１４０中で磁性粒子２を移動させるための磁場を発生するものであり、電磁石１２１と、この電磁石１２１を収納する非磁性体カバー（図示せず）とを有している。
【０１１８】
本実施形態では、電磁石１２１は、金属製の環状の芯材１２２と、この芯材１２２の外周部にラセン状に巻回された導線１２３とで構成され、導線１２３に通電することにより周辺に磁場を発生する。
【０１１９】
非磁性体カバーは、電磁石１２１を保護、固定する機能を有するものであり、例えば、アクリル系樹脂、シリコーン系樹脂等の各種樹脂材料等で構成されている。
【０１２０】
このような磁場発生装置１２０の内側には、培養容器１１０が設けられている。換言すれば、磁場発生装置１２０は、培養容器１１０の外周部に設けられている。なお、磁場発生装置１２０は固定部材（図示せず）により、固定・保持されている。磁場発生装置１２０の培養容器１１０の高さ方向における設置位置は、培養液１４０を培養容器１１０内に収納（貯留）したときに、培養液１４０の液面付近とするのが好ましい。これにより、磁性粒子２を上下方向に大きく移動させることができ、培養液１４０をより均一に撹拌することができる。
【０１２１】
また、磁場発生装置１２０と培養容器１１０との離間距離（図２中ｄ）は、特に限定されないが、磁場発生装置１２０と培養容器１１０とができるだけ接近しているのが好ましく、特に、これらが接触（密着）して設けられているのが好ましい。
【０１２２】
磁場発生装置１２０は、発生する磁場の強度を経時的に変化させるよう構成されている。この磁場発生装置１２０が発生する磁場のパターンとしては、例えば、一定間隔でオン／オフするパターン（図５（ａ）参照）が挙げられる。磁場を発生させると、磁性粒子２が磁場発生装置１２０側に引き寄せられ、培養液１４０中で浮上する。また、この状態から磁場の発生を停止すると、磁場発生装置１２０側に引き寄せられた磁性粒子２がその自重によって沈降する。このような磁性粒子２の上下移動の繰り返しにより培養液１４０には乱流が生じ、培養液１４０が均一かつ緩やかに撹拌される。
【０１２３】
磁場の最大強度（絶対値）は、磁性粒子２の密度（比重）、培養液１４０の組成や容積等に応じて適宜設定され、特に限定されないが、０．１〜１００Ｗｂ／ｍ２程度であるのが好ましく、０．２〜５０Ｗｂ／ｍ２程度であるのがより好ましい。磁場の最大強度（磁束密度）が小さ過ぎると、磁性粒子２を磁場発生装置１２０側に十分に引き寄せることが困難となり、培養液１４０の撹拌が不十分になるおそれがある。また、磁場の最大強度を前記上限値を超えて大きくしても、消費電力が無駄にかかるばかりか、磁場が細胞へ悪影響を及ぼすおそれがある。
【０１２４】
なお、磁場発生装置１２０が発生する磁場のパターンは、一定間隔でオン／オフするパターン（図５（ａ）参照）に限らず、例えば、発生する磁場の強度を一定間隔で増減させるパターン（図５（ｂ）参照）、発生する磁場の強度や向き等を連続的に変化させるパターン（図５（ｃ）参照）等であってもよい。また、これらのパターンは、任意に組み合わせるようにしてもよい。
【０１２５】
コントローラ１３０は、電源から供給される電流の条件（例えば、種類、量、方向、時間、周波数等）を変化させる機能を有するものである。そして、コントローラ１３０は、電源から供給される電流を変換して、所定の条件（パターン）の電流を電磁石１２１（磁場発生装置１２０）に供給する。例えば、磁場発生装置１２０に間欠的に磁場を発生させる場合、電源から供給される交流電流をパルス電流に変換し、電磁石１２１に供給する。
【０１２６】
また、コントローラ１３０には、加温装置１５０が電気的に接続されている。この加温装置１５０は、例えば、ヒータ、ペルチェ素子等が内蔵されており、コントローラ１３０の制御により培養液１４０を加温する。
【０１２７】
次に、このような細胞培養装置１００の使用方法（細胞培養方法）の一例を説明する。
【０１２８】
［１］ まず、細胞培養担体１および磁性粒子２に、それぞれ滅菌処理を施す。これにより、細胞培養担体１および磁性粒子２の表面に存在する微生物やカビ等の数を低減、または、これらを完全に死滅させることができる。これにより、微生物やカビ等による細胞へのダメージが低減または除去され、細胞は、より効率よく増殖することができる。
【０１２９】
この滅菌処理には、例えば、細胞培養担体１および磁性粒子２と滅菌液とを接触させる方法、オートクレーブ滅菌、ガス滅菌、放射線滅菌等を用いることができるが、これらの中でも、細胞培養担体１および磁性粒子２と滅菌液とを接触させる方法が好適である。かかる方法によれば、大量の細胞培養担体１および磁性粒子２を、より効率よく滅菌することができる。
【０１３０】
滅菌液を用いる場合、滅菌処理後の細胞培養担体１および磁性粒子２を洗浄して、細胞培養担体１および磁性粒子２の表面に付着した滅菌液を除去する。
【０１３１】
［２］ 次に、前記工程［１］終了後の細胞培養担体１および磁性粒子２と、細胞（付着させる細胞）とを培養液１４０に添加（混合）し、この培養液１４０を、細胞培養装置１００の培養容器１１０内に収納（貯留）する。
【０１３２】
ここで、細胞には、例えば、目的とするタンパク質をコードする遺伝子を含むシャトルベクター（ベクター）を移入しておくようにする。
【０１３３】
この細胞としては、例えば、動物細胞、植物細胞、細菌、ウイルス等が挙げられるが、これらの中でも、特に、動物細胞が好適である。細胞として動物細胞を用いることにより、本発明をより広範な技術分野へ適用することが可能となるとともに、タンパク質の生産を行う場合には、より複雑な構造を有するもの（例えば、糖タンパク質等）の生産を好適に行うことができる。
【０１３４】
［３］ 次に、細胞培養装置１００を作動させると、前述のようにして培養液１４０には、磁場発生装置１２０から所定のパターンの磁場が与えられる（印加される）。これにより、培養液１４０中で磁性粒子２が移動し、この磁性粒子２の移動により培養液１４０が攪拌され、細胞培養担体１は、培養液１４０中に均一に懸濁される。
【０１３５】
また、このとき、加温装置１５０により培養液１４０は加温される。この培養液１４０の加温の温度は、培養する細胞の種類等に応じて適宜設定され、特に限定されないが、通常、４〜４０℃程度、好ましくは２５〜３７℃程度とされる。
【０１３６】
このような状態で、培養液１４０中では、細胞が細胞培養担体１の表面に付着し、その表面で増殖する。特に、磁性粒子２の移動による培養液１４０の攪拌は、均一かつ緩やかに行われるため、細胞の培養を極めて効率よく行うことができる。
【０１３７】
そして、増殖した細胞は、目的とするタンパク質を生産（産生）して、このタンパク質を、例えば培養液１４０中へ放出したり、細胞内に蓄積したり等する。
【０１３８】
なお、このとき、必要に応じて、酸素ガスを含むガスを供給しつつ、細胞の培養を行うようにしてもよい。
【０１３９】
［４］ 次に、生産されたタンパク質を回収する。例えば、培養液１４０中に放出されたタンパク質を回収する場合には、次のようにすることができる。
【０１４０】
すなわち、前記工程［３］における培養液１４０の攪拌を停止して、細胞培養担体１および磁性粒子２が培養液１４０中で沈殿した後上清を採取するか、または、培養液１４０を濾過して濾液を採取する。そして、この採取液（上清または濾液）を処理（例えば、クロマトグラフィー等）することにより、目的とするタンパク質を容易に回収することができる。
【０１４１】
＜第２実施形態＞
次に、本発明の細胞培養装置の第２実施形態について説明する。
【０１４２】
図６は、本発明の細胞培養装置の第２実施形態を示す模式図である。
以下、第２実施形態について説明するが、前記第１実施形態との相違点を中心に説明し、同様の事項については、その説明を省略する。
【０１４３】
図６に示す細胞培養装置１００では、磁場発生装置１２０の構成が異なり、それ以外は、前記第１実施形態の細胞培養装置１００と同様である。
【０１４４】
すなわち、第２実施形態の磁場発生装置１２０は、直線状（円柱状）の芯材１２２の外周部にラセン状に導線１２３が巻回されてなる電磁石１２１を有している。なお、磁場発生装置１２０は、磁場に影響を与えない材料を主材料として構成される防水カバーで覆うことが好ましい。
【０１４５】
この磁場発生装置１２０は、培養容器１１０に装着される栓体１１２に挿通された状態で、固定（固着）されている。そして、本実施形態では、細胞の培養を行う際に、磁場発生装置１２０は、培養液１４０に接触するように設置される。
【０１４６】
磁場発生装置１２０が発生する磁場のパターンは、例えば、前述した図５に示すパターンとすることができる。
【０１４７】
このような第２実施形態の細胞培養装置１００においても、前記第１実施形態と同様の作用・効果が得られる。
【０１４８】
＜第３実施形態＞
次に、本発明の細胞培養装置の第３実施形態について説明する。
【０１４９】
図７は、本発明の細胞培養装置の第３実施形態を示す模式図、図８は、磁場発生装置が発生する磁場のパターンを示す図である。
【０１５０】
以下、第３実施形態について説明するが、前記第１実施形態との相違点を中心に説明し、同様の事項については、その説明を省略する。
【０１５１】
図７に示す細胞培養装置１００では、磁場発生装置１２０の構成が異なり、それ以外は、前記第１実施形態の細胞培養装置１００と同様である。
【０１５２】
すなわち、第３実施形態の磁場発生装置１２０は、４つ（複数）の電磁石１２１Ａ〜１２１Ｄを備えている。
【０１５３】
そして、各電磁石１２１Ａ〜１２１Ｄは、培養容器１１０の周方向に沿って、ほぼ等間隔で設けられている。
【０１５４】
このような構成により、通電する電磁石１２１Ａ〜１２１Ｄを順次切り替えると、すなわち、発生する磁場の位置を経時的に変化させると、磁性粒子２の培養液１４０中での移動をより複雑なパターンとすることができる。これにより、細胞培養担体１を培養液１４０中でより均一に懸濁させることができ、その結果、細胞をより効率よく増殖させることができる。
【０１５５】
各電磁石１２１Ａ〜１２１Ｄが発生する磁場のパターン（各電磁石１２１Ａ〜１２１Ｄへの通電の切替）は、例えば、図８に示すようにすることができる。すなわち、１つの電磁石が磁場を発生している間は、他の電磁石は磁場を発生しないようにし、磁場を発生する電磁石を順次（同期させて）切り替えていく。これにより、磁性粒子２を培養容器１１０の内面に沿って移動させることができる。
【０１５６】
なお、各電磁石１２１Ａ〜１２１Ｄが発生する磁場のパターンは、図８に示すものに限定されず、例えば、図５に示すようなパターンを任意に組み合わせたものであってもよい。
【０１５７】
また、各電磁石１２１Ａ〜１２１Ｄは、互いに、例えば導線１２３の巻回数、全体形状、大きさ等が同じであってもよく、異なっていてもよい。
【０１５８】
このような第３実施形態の細胞培養装置１００においても、前記第１実施形態と同様の作用・効果が得られる。
【０１５９】
以上、本発明の細胞培養方法および細胞培養装置について説明したが、本発明は、これらに限定されるものではなく、各部の構成は、同様の機能を発揮する任意の構成のものに置換することができ、また、任意の構成を付加することもできる。また、各前記実施形態の任意の２以上の構成を組み合わせるようにしてもよい。
【０１６０】
また、各前記実施形態では、磁場発生装置が固定された構成のものであったが、本発明では、磁場発生装置と培養容器とが相対的に移動可能に設けられ、培養液へ与える磁場の位置を経時的に変化させる構成であってもよい。このような構成としては、磁場発生装置を培養容器に対して、例えば、上下方向へ、左右方向へ、接近離間させる方向へ、周方向に沿って、または、これらを組み合わせて移動させる構成等が挙げられる。
【０１６１】
さらに、本発明では、磁場発生装置は、前述したようなパターンで培養液へ与える磁場の強度を経時的に変化させるとともに、培養容器に対して相対的に移動可能に設けられ、培養液へ与える磁場の位置を経時的に変化させる構成とされていてもよい。
【０１６２】
また、各前記実施形態では、磁場発生装置は、電磁石を備える構成のものであったが、電磁石に代えて永久磁石を用いることもできる。
【０１６３】
【実施例】
次に、本発明の具体的実施例について説明する。
【０１６４】
１．細胞培養担体および磁性粒子の用意
［細胞培養担体Ａ］
まず、平均粒径１５０μｍ、密度１．０２ｇ／ｃｍ３のナイロン粒子（基材）５０ｇと、Ｃａ／Ｐ比１．６７、平均粒径１０μｍのハイドロキシアパタイト粒子（一次粒子が凝集結合した多孔質粒子）０．２５ｇとを用意した。
【０１６５】
なお、ハイドロキシアパタイト粒子は、その比表面積が４５ｍ２／ｇ、かつ、その細孔径が６００Åであった。
【０１６６】
次に、これらナイロン粒子およびハイドロキシアパタイト粒子をＮＡＲＡハイブリダイゼーションシステムＮＨＳ−１（（株）奈良機械製作所製、定格動力５．５ｋＷ、定格電流２３Ａ）に投入し、この装置を６４００回転／分、３２〜５０℃で５分間稼動させた。これにより、表面がハイドロキシアパタイトで被覆された細胞培養担体Ａ（図１参照）を得た。
【０１６７】
なお、得られた細胞培養担体Ａは、平均粒径１５１μｍ（ハイドロキシアパタイト被覆層の平均厚さ１μｍ）、密度１．０３ｇ／ｃｍ３であった。
【０１６８】
［細胞培養担体Ｂ］
細胞培養担体Ｂとして、平均粒径２００μｍ、密度１．０３ｇ／ｃｍ３のデキストラン粒子（ファルマシア社製）を用意した。
【０１６９】
［細胞培養担体Ｃ］
細胞培養担体Ｃとして、平均粒径１５０μｍ、密度１．０２ｇ／ｃｍ３のナイロン粒子を用意した。
【０１７０】
［磁性粒子Ａ］
磁性粒子Ａとして、平均粒径１５０μｍ、密度１．９０ｇ／ｃｍ３のフェライト複合化ナイロン粒子（図２参照）を用意した。
【０１７１】
［磁性粒子Ｂ］
まず、平均粒径１５０μｍ、密度１．９０ｇ／ｃｍ３のフェライト複合化ナイロン粒子５０ｇと、Ｃａ／Ｐ比１．６７、平均粒径１０μｍハイドロキシアパタイト粒子（一次粒子が凝集結合した多孔質粒子）０．２５ｇとを用意した。
【０１７２】
なお、ハイドロキシアパタイト粒子は、その比表面積が４５ｍ２／ｇ、かつ、その細孔径が６００Åであった。
【０１７３】
次に、これらフェライト複合化ナイロン粒子およびハイドロキシアパタイト粒子をＮＡＲＡハイブリダイゼーションシステムＮＨＳ−１（（株）奈良機械製作所製、定格動力５．５ｋＷ、定格電流２３Ａ）に投入し、この装置を６４００回転／分、３２〜５０℃で５分間稼動させた。これにより、表面がハイドロキシアパタイトで被覆された磁性粒子Ｂを得た。
【０１７４】
なお、得られた磁性粒子Ｂは、平均粒径１５１μｍ（ハイドロキシアパタイト被覆層の平均厚さ１．０μｍ）、密度１．９３ｇ／ｃｍ３であった。
【０１７５】
２．細胞の培養
２−１． ヒト骨肉腫由来細胞（ＨＯＳ）の培養
このヒト骨肉腫由来細胞は、最大長さが約２０μｍの細胞である。
【０１７６】
（実施例１Ａ）
細胞培養担体Ａ：０．８ｇと、磁性粒子Ａ：０．６ｇと、２×１０５個／ｍＬのヒト骨肉腫由来細胞（ＨＯＳ）懸濁液：３０ｍＬとを、ニッスイＭＥＭ培地（培養液）１００ｍＬに添加した。なお、ニッスイＭＥＭ培地中には、１０ｖｏｌ％のウシ胎児血清を添加して用いた。
また、細胞培養担体Ａと磁性粒子Ａとの容積比は、７０：３０であった。
【０１７７】
この培養液を、図４に示すような細胞培養装置の培養容器（ＩＷＡＫＩ−ＰＹＲＥＸ社製、耐熱広口ガラス瓶）に収納して、細胞の培養を行った。なお、培養条件は、発生する磁場のパターン：図５（ａ）、パルス間隔：２秒、培養液の温度：３７℃、培養の日数：５日間とした。
【０１７８】
（実施例２Ａ）
パルス間隔を１０秒とした以外は、前記実施例１Ａと同様にして、細胞の培養を行った。
【０１７９】
（実施例３Ａ）
磁性粒子Ａに代えて、磁性粒子Ｂを用いた以外は、前記実施例１Ａと同様にして、細胞の培養を行った。
なお、細胞培養担体Ａと磁性粒子Ｂとの容積比は、７０：３０であった。
【０１８０】
（実施例４Ａ）
細胞培養担体Ａ：０．８ｇに代えて、細胞培養担体Ｂ：０．２ｇを用いた以外は、前記実施例１Ａと同様にして、細胞の培養を行った。
【０１８１】
（比較例１Ａ）
細胞培養担体Ａ：０．８ｇと、２×１０５個／ｍＬのヒト骨肉腫由来細胞（ＨＯＳ）懸濁液：３０ｍＬとを、ニッスイＭＥＭ培地（培養液）１００ｍＬに添加した。なお、ニッスイＭＥＭ培地中には、１０ｖｏｌ％のウシ胎児血清を添加して用いた。
【０１８２】
この培養液を、スピンナーフラスコ（柴田科学社製）に収納して、細胞の培養を行った。なお、培養条件は、撹拌子の回転速度：３０ｒｐｍ、培養液の温度：３７℃、培養の日数：５日間とした。
【０１８３】
（比較例２Ａ）
攪拌子の回転速度を６０ｒｐｍとした以外は、前記比較例１Ａと同様にして、細胞の培養を行った。
【０１８４】
（比較例３Ａ）
細胞培養担体Ａに代えて、細胞培養担体Ｃを用いた以外は、前記比較例１Ａと同様にして、細胞の培養を行った。
【０１８５】
２−２． サル腎臓由来細胞（Ｖｅｒｏ）の培養
このサル腎臓由来細胞は、最大長さが約２０μｍの細胞である。
【０１８６】
（実施例１Ｂ〜４Ｂ、比較例１Ｂ〜３Ｂ）
サル腎臓由来細胞を用いた以外は、それぞれ、前記実施例１Ａ〜４Ａおよび比較例１Ａ〜３Ａと同様にして、細胞の培養を行った。
【０１８７】
２−３． 蚊由来細胞（Ｃ６／３６）の培養
この蚊由来細胞は、最大長さが約２０μｍの細胞である。
【０１８８】
（実施例１Ｃ〜４Ｃ、比較例１Ｃ〜３Ｃ）
蚊由来細胞を用いた以外は、それぞれ、前記実施例１Ａ〜４Ａおよび比較例１Ａ〜３Ａと同様にして、細胞の培養を行った。
【０１８９】
３．評価
各実施例および各比較例において、それぞれ、培養開始（撹拌開始）から３時間後、１日後、３日後、５日後に、各培養液の所定量を採取し、細胞培養担体（１５ｍｇ）の表面に付着している細胞の数を計測した。この細胞数の計測は、ＥＤＴＡまたはトリプシン処理した細胞をトリパンブルー染色することにより行った。
その結果を、表１〜表３に示す。
【０１９０】
【表１】
【表２】
【表３】
各表に示すように、各実施例（本発明）では、いずれも、細胞の種類によらず、各比較例に対して、細胞の培養効率が高いことが明らかとなった。
【０１９４】
また、実施例（本発明）では、磁場の発生パターンのパルス間隔を変更した場合でも、細胞の増殖効率に大きな変動は、認められなかった。このことから、実施例では、細胞の種類等に応じた培養条件の厳密な設定を要しないことが判る。
【０１９５】
これに対して、スピンナーフラスコを用いる培養である比較例では、攪拌子の回転速度の違いにより、細胞の培養効率が大きく変動するものであった。すなわち、比較例では、いずれの細胞も、その育成状態が攪拌子の回転速度の違いにより大きく異なるものであった。このため、培養条件の最適化が極めて難しいことが判る。
また、比較例では、細胞培養担体からの細胞の脱落も認められた。
【０１９６】
なお、図４、図６および図７に示すような細胞培養装置を用いて、磁場のパターンを種々変更して、各前記実施例と同様にして細胞の培養を行ったが、前記と同様の結果が得られた。
【０１９７】
【発明の効果】
以上述べたように、本発明によれば、培養液を均一かつ緩やか（マイルド）に撹拌することができ、細胞を効率よく増殖させることができる。
【０１９８】
また、細胞培養担体および磁性粒子の構成を適宜設定することにより、前記効果をより向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明で用いられる細胞培養担体の構成を示す断面図である。
【図２】本発明で用いられる磁性粒子の構成を示す断面図である。
【図３】本発明で用いられる磁性粒子の他の構成を示す断面図である。
【図４】本発明の細胞培養装置の第１実施形態を示す模式図である。
【図５】磁場発生装置が発生する磁場のパターンを示す図である。
【図６】本発明の細胞培養装置の第２実施形態を示す模式図である。
【図７】本発明の細胞培養装置の第３実施形態を示す模式図である。
【図８】磁場発生装置が発生する磁場のパターンを示す図である。
【符号の説明】
１ 細胞培養担体
１１ 基材
１２ 被覆層
１３ 粒子
２ 磁性粒子
２１ 基材
２２ 磁性材料
２３ 被覆層
２４ 粒子
１００ 細胞培養装置
１１０ 培養容器
１１１ 開口部
１１２ 栓体
１２０ 磁場発生装置
１２１ 電磁石
１２１Ａ〜１２１Ｄ 電磁石
１２２ 芯材
１２３ 導線
１３０ コントローラ
１４０ 培養液
１５０ 加温装置
Claims (27)
- 細胞と、粒状の細胞培養担体と、磁性粒子とを含む培養液へ磁場を与え、前記培養液中で前記磁性粒子を移動させることにより、前記培養液を撹拌し、前記細胞を前記細胞培養担体の表面に付着させ、増殖させることを特徴とする細胞培養方法。
- 前記培養液へ与える磁場の強度を、経時的に変化させる請求項１に記載の細胞培養方法。
- 前記培養液へ与える磁場の位置を、経時的に変化させる請求項１または２に記載の細胞培養方法。
- 前記細胞培養担体は、主として樹脂材料で構成された基材と、該基材の表面の少なくとも一部を覆うように形成され、前記細胞が付着し得る被覆層とを有するものである請求項１ないし３のいずれかに記載の細胞培養方法。
- 前記被覆層は、主としてリン酸カルシウム系化合物で構成されている請求項１ないし４のいずれかに記載の細胞培養方法。
- 前記被覆層は、前記基材の表面付近に、主としてリン酸カルシウム系化合物で構成された粒子の一部が貫入することにより形成されたものである請求項５に記載の細胞培養方法。
- 前記被覆層は、前記基材の表面に、主としてリン酸カルシウム系化合物で構成された多孔質粒子を衝突させることにより形成されたものである請求項６に記載の細胞培養方法。
- 前記細胞培養担体の密度は、０．８〜１．４ｇ／ｃｍ３である請求項１ないし７のいずれかに記載の細胞培養方法。
- 前記細胞培養担体の平均粒径をＡ［μｍ］とし、前記細胞培養担体に付着させる細胞の最大長さをＢ［μｍ］としたとき、Ａ／Ｂが２〜１００である請求項１ないし８のいずれかに記載の細胞培養方法。
- 前記細胞培養担体の平均粒径をＡ［μｍ］とし、前記磁性粒子の平均粒径をＣ［μｍ］としたとき、Ｃ／Ａが０．０２〜１０である請求項１ないし９のいずれかに記載の細胞培養方法。
- 前記細胞培養担体の平均粒径は、５０〜５００μｍである請求項１ないし１０のいずれかに記載の細胞培養方法。
- 前記磁性粒子は、樹脂材料と磁性材料とを複合化してなるものである請求項１ないし１１のいずれかに記載の細胞培養方法。
- 前記磁性粒子の密度は、０．８〜２．５ｇ／ｃｍ３である請求項１ないし１２のいずれかに記載の細胞培養方法。
- 前記磁性粒子の平均粒径は、１０〜５００μｍである請求項１ないし１３のいずれかに記載の細胞培養方法。
- 前記磁性粒子は、その表面の少なくとも一部を覆うように形成され、前記細胞が付着し得る被覆層を有する請求項１ないし１４のいずれかに記載の細胞培養方法。
- 前記被覆層は、主としてリン酸カルシウム系化合物で構成されている請求項１５に記載の細胞培養方法。
- 前記被覆層は、前記磁性粒子の表面付近に、主としてリン酸カルシウム系化合物で構成された粒子の一部が貫入することにより形成されたものである請求項１６に記載の細胞培養方法。
- 前記被覆層は、前記磁性粒子の表面に、主としてリン酸カルシウム系化合物で構成された多孔質粒子を衝突させることにより形成されたものである請求項１７に記載の細胞培養方法。
- 前記磁性粒子と前記細胞培養担体との混合比は、容積比で１０：９０〜５０：５０である請求項１ないし１８のいずれかに記載の細胞培養方法。
- 請求項１ないし１９のいずれかに記載の細胞培養方法に用いることを特徴とする細胞培養装置。
- 細胞と、粒状の細胞培養担体と、磁性粒子とを含む培養液を収納する培養容器と、
前記培養液中で前記磁性粒子を移動させるための磁場を発生する磁場発生装置とを有することを特徴とする細胞培養装置。 - 前記磁場発生装置は、発生する磁場の強度を経時的に変化させるよう構成されている請求項２１に記載の細胞培養装置。
- 前記磁場発生装置は、発生する磁場の位置を経時的に変化させるよう構成されている請求項２１または２２に記載の細胞培養装置。
- 前記磁場発生装置は、前記培養容器の外周部に設けられている請求項２１ないし２３のいずれかに記載の細胞培養装置。
- 前記磁場発生装置は、前記培養液に接触して設けられている請求項２１ないし２３のいずれかに記載の細胞培養装置。
- 前記磁場発生装置は、前記培養容器内に収納された前記培養液の液面付近に設けられている請求項２１ないし２５のいずれかに記載の細胞培養装置。
- 前記磁場発生装置を複数個有する請求項２１ないし２６のいずれかに記載の細胞培養装置。
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