DE102004017860A1

DE102004017860A1 - Verfahren und Einrichtung zur Zellkultivierung sowie Zellkulturträger

Info

Publication number: DE102004017860A1
Application number: DE102004017860A
Authority: DE
Inventors: Akira Yamamoto; Ken Sugo; Yae Kurosawa; Kikuka Kishiro
Original assignee: Pentax Corp
Current assignee: Hoya Corp
Priority date: 2003-04-10
Filing date: 2004-04-13
Publication date: 2004-10-21
Also published as: GB2400378A; GB2413564B; GB2413564A; GB0408221D0; US20040248291A1; FR2853664A1; GB2400378B; GB0508065D0

Abstract

Ein Verfahren zur Zellkultivierung umfasst die Schritte: Zubereiten einer Zellkulturlösung, die zumindest zu kultivierende Zellen und körnige Zellkulturträger enthält, und Anwenden eines Magnetfeldes auf die Zellkulturlösung, um diese durch die Wirkung des Magnetfeldes zu rühren, wobei die Zellen an den Oberflächen der Zellkulturträger haften und wachsen. Die Zellkulturträger umfassen jeweils ein magnetisches Teilchen mit einer Deckschicht, die zumindest einen Teil der Oberfläche des magnetischen Teilchens bedeckt und auf der die Zellen haften können. Die Zellkulturträger werden durch Anwendung des Magnetfeldes in der Zellkulturlösung bewegt, wodurch letztere gerührt wird. Alternativ kann die Zellkulturlösung ferner magnetische Teilchen enthalten, die durch Anwendung des Magnetfeldes bewegt werden, um die Zellkulturlösung zu rühren.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Einrichtung zur Zellkultivierung sowie einen Zellkulturträger.

In den vergangenen Jahren ist die Technologie der Zellkultivierung auf unterschiedlichen Industrie- und Forschungsgebieten wie der Zellgewebsentwicklung, in Sicherheitstests für Arzneimittel, in der Herstellung von Proteinen zu Behandlungs- oder Diagnosezwecken und dergleichen zur Anwendung gekommen.

Seit kurzem erfolgt die Zellkultivierung nicht nur mehr an Hand der üblicherweise eingesetzten Plattenkulturen, sondern auch an Hand von dreidimensionalen, hochdichten Kulturen, auch als Mikroträgerkulturen bezeichnet. Während bei einer Plattenkultur eine Kulturflasche zum Einsatz kommt, werden bei einer Mikroträgerkultur eine Anzahl von perlenartigen Trägern verwendet, die als Gerüst für die Zellen dienen.

Bei einer solchen Mikroträgerkultur kommen unterschiedliche Arten von Zellkulturträgern zur Anwendung.

Bei einer Mikroträgerkultur ist es wichtig, die Zellkulturlösung während des Zellkultivierungsprozesses ausreichend lang zu rühren, um die Träger gleichmäßig in Suspension zu bringen, so dass die an den Trägern haftenden Zellen in gleicher Menge mit Nahrung versorgt werden.

In der Vergangenheit wurde bei einer solchen Mikroträgerkultur eine Schleuderflasche verwendet, der einen mit einer Rippe versehenen Rühranker aufweist. In einer solchen Schleuderflasche rotiert der Rühranker, wodurch eine Zellkulturlösung umgerührt wird (vergl. Japanische Patentveröffentlichung Hei 06-209761).

Bei einer Mikroträgerkultur, bei der eine solche Schleuderflasche verwendet wird, besteht jedoch, wenn die Rotationsgeschwindigkeit des Rührankers zu hoch ist, die Gefahr, dass die Rippe des Rührankers und die Träger stark miteinander kollidieren und sich deshalb die Zellen von den Trägern lösen oder beschädigt werden. Dadurch wird ein ausreichendes Zellwachstum unmöglich. Ist dagegen die Rotationsgeschwindigkeit des Rührankers zu gering, so besteht die Gefahr, dass sich die Träger in der Rührflasche nach unten absetzen und sie deshalb nicht gleichmäßig genug in der Zellkulturlösung suspendiert sind. In diesem Fall werden die Zellen nicht in gleicher Menge mit Nahrung versorgt, so dass die gewünschte Wachstumsrate nicht erreicht werden kann. Es ist deshalb äußerst wichtig, den Rühranker mit einer geeigneten Rotationsgeschwindigkeit zu drehen.

Den Rühranker mit einer geeigneten Rotationsgeschwindigkeit zu drehen, ist jedoch sehr schwierig und stellt deshalb ein schwerwiegendes Problem bei einer solchen Mikroträgerkultur dar, bei der die oben beschriebene Rührflasche verwendet wird. Außerdem ist es erforderlich, die Kultivierungsbedingungen, z.B. die Rotationsgeschwindigkeit des Rührankers, entsprechend der verwendeten Zellart, der Form der Flasche etc. einzustellen. Auch dies stellt ein Problem dar.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren und eine Einrichtung zur Zellkultivierung sowie einen Zellkulturträger anzugeben, die es ermöglichen, eine Zellkulturlösung gleichmäßig und sanft umzurühren.

Die Erfindung löst diese Aufgabe durch die Gegenstände der unabhängigen Ansprüche. Vorteilhafte Weiterbildungen sind in den Unteransprüchen angegeben.

Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst die Schritte: Zubereiten einer Zellkulturlösung, die zumindest zu kultivierende Zellen und körnige Zellkulturträger enthält, auf denen die Zellen haften und wachsen können, und Anwenden eines Magnetfeldes auf die Zellkulturlösung, um diese durch die Wirkung des Magnetfeldes zu rühren, wobei die Zellen an den Oberflächen der Zellkulturträger haften und dort wachsen.

Durch dieses Verfahren kann die Zellkulturlösung gleichmäßig und sanft gerührt werden, ohne dass sich die Zellen von den Zellkulturträgern lösen. Dies führt zu einem effizienten Zellwachstum.

In einer Ausführungsform der Erfindung sind die Zellkulturträger jeweils als magnetisches Teilchen mit einer Oberfläche und einer Deckschicht ausgebildet, die zumindest einen Teil der Oberfläche des magnetischen Teilchens bedeckt, so dass die Zellen auf der Deckschicht haften können. Die Zellkulturträger werden durch Anwendung des Magnetfeldes in der Zellkulturlösung bewegt, wodurch letztere gerührt wird. Dieses Verfahren ermöglicht es, die lediglich die Zellen und die Zellkulturträger enthaltende Zellkulturlösung zu rühren.

In dieser Ausführungsform wird vorzugsweise die Intensität und/oder die räumliche Anordnung des auf die Zellkulturlösung angewandten Magnetfeldes mit der Zeit geändert. Dadurch kann die Zellkulturlösung noch gleichmäßiger und sanfter gerührt werden.

Die Dichte jedes Zellkulturträgers liegt vorzugsweise im Bereich von 0,8 bis 2,5 g/cm³. Dies ermöglicht es, die Zellkulturlösung in ausreichendem Maße zu rühren.

Ist die mittlere Teilchengröße der Zellkulturträger als A μm und die maximale Länge der an dem jeweiligen Zellkulturträger anzuhaltenden Zelle als B μm definiert, so liegt das Verhältnis A/B vorzugsweise bei 2 bis 100. Dadurch kann die Oberfläche des Zellkulturträgers im Verhältnis zur Größe der Zelle ausreichend groß ausgebildet werden, was die Zellanhaftung und das Zellwachstum an der Oberflächen des Zellkulturträgers erleichtert.

Vorzugsweise liegt der mittlere Teilchendurchmesser der Zellkulturträger im Bereich von 50 bis 500 μm.

Die Deckschicht besteht vorzugsweise hauptsächlich aus einer Calciumphosphat-basierten Verbindung. Da eine solche Calciumphosphat-basierte Verbindung biologisch inert ist, ist die Gefahr einer Zellschädigung gering.

Vorzugsweise ist die Deckschicht aus feinen Teilchen der Calciumphosphat-basierten Verbindung gebildet, wobei diese Teilchen zum Teil in einem Oberflächenbereich eingebettet werden, der die Oberfläche des magnetischen Teilchens umfasst und an diese angrenzt. Dadurch wird eine ausgezeichnete Haftung zwischen der Deckschicht und dem magnetischen Teilchen erreicht.

Die Deckschicht kann hergestellt werden, indem die porösen Teilchen der Calciumphosphat-basierten Verbindung mit der Oberfläche des magnetischen Teilchens in Kollision gebracht werden. Dadurch wird die Herstellung der Deckschicht besonders einfach und zuverlässig.

Vorzugsweise werden die magnetischen Teilchen jeweils durch Mischen eines Harzmaterials und eines magnetischen Materials gebildet. Durch dieses Verfahren ist es möglich, die Dichte (spezifisches Gewicht) des magnetischen Teilchens und damit auch des Zellkulturträgers insgesamt einzustellen, indem das Mischverhältnis zwischen dem Harzmaterial und dem magnetischen Material geeignet festge legt wird. So können auch Form und Größe des jeweiligen Zellkulturträgers einfach eingestellt werden.

In einer anderen Ausführungsform der Erfindung enthält die Zellkulturlösung ferner magnetische Teilchen, die durch Anwendung des Magnetfeldes in der Zellkulturlösung bewegt werden. Dadurch wird die Zellkulturlösung gerührt. Bei diesem Verfahren ist es also möglich, einfach durch Zugabe der magnetischen Teilchen in die Zellkulturlösung zusätzlich zu den dort vorhandenen Zellen und Zellkulturträgern die Zellkulturlösung gleichmäßig und sanft zu rühren.

Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung ist eine Einrichtung zur Zellkultivierung vorgesehen. Diese Einrichtung umfasst ein Kultivierungsgefäß zur Aufnahme einer Zellkulturlösung, die zumindest zu kultivierende Zellen und körnige Zellkulturträger enthält, auf denen die Zellen haften und wachsen können, sowie mindestens einen Magnetfeldgenerator zum Anwenden eines Magnetfeldes auf die Zellkulturlösung, um diese durch die Wirkung des Magnetfeldes zu rühren. Mit dieser Einrichtung ist es möglich, die Zellkulturlösung gleichmäßig und sanft zu rühren, ohne dass sich die Zellen von den Zellkulturträgern lösen. Dies ermöglicht ein effizientes Zellwachstum. In einer vorteilhaften Weiterbildung dieser Einrichtung ist der Magnetfeldgenerator so ausgebildet, dass die Intensität und/oder die Anordnung des erzeugten Magnetfeldes mit der Zeit veränderbar ist. Dadurch ist es möglich, die Zellkulturlösung noch gleichmäßiger und sanfter zu rühren.

Vorzugsweise ist der Magnetfeldgenerator um die Außenfläche des Kultivierungsgefäßes herum angeordnet. In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung ist der Magnetfeldgenerator so angeordnet, dass er in Kontakt mit der Zellkulturlösung kommt. Außerdem kann der Magnetfeldgenerator in einer vorzugsweisen Weiterbildung in der Nähe des flüssigen Oberfläche der in dem Kultivierungsgefäß enthaltenen Zellkulturlösung angeordnet sein. Alle diese Ausgestaltungen ermöglichen es, die Zellkulturträger oder die magnetischen Teilchen in der Zellkulturlösung weitläufig nach oben und nach unten zu bewegen, um die Zellkulturlösung noch gleichmäßiger zu rühren.

Vorzugsweise umfasst der mindestens eine Magnetfeldgenerator zwei oder mehr Magnetfeldgeneratoren. Dadurch können die Zellkulturträger oder die magnetischen Teilchen in der Zellkulturlösung gemäß einem erwünschten, komplizierten Muster bewegt werden.

Die Erfindung wird im Folgenden an Hand der Figuren näher erläutert. Darin zeigen:
1 einen Querschnitt eines Zellkulturträgers, der in einem Zellkultivierungsverfahren nach einem ersten Ausführungsbeispiel verwendet wird,
2 einen Querschnitt eines Zellkulturträgers, der in einem Zellkultivierungsverfahren nach einem zweiten Ausführungsbeispiel verwendet wird,
3 einen Querschnitt eines magnetischen Teilchens, das in dem Zellkultivierungsverfahren nach zweitem Ausführungsbeispiel verwendet wird,
4 einen Querschnitt eines modifizierten magnetischen Teilchens, das in dem Zellkultivierungsverfahren nach zweitem Ausführungsbeispiel verwendet wird,
5 eine schematische, perspektivische Darstellung einer Zellkultivierungseinrichtung nach einem ersten Ausführungsbeispiel,
6 ein Zeitdiagramm, welches das Muster eines magnetischen Feldes zeigt, das von einem Magnetfeldgenerator der Zellkultivierungseinrichtung nach erstem Ausführungsbeispiel erzeugt wird,
7 eine schematische, perspektivische Darstellung einer Zellkultivierungseinrichtung nach einem zweiten Ausführungsbeispiel,
8 eine schematische, perspektivische Darstellung einer Zellkultivierungseinrichtung nach einem dritten Ausführungsbeispiel,
9 ein Zeitdiagramm, welches das Muster eines Magnetfeldes zeigt, das von einem Magnetfeldgenerator der Zellkultivierungseinrichtung nach drittem Ausführungsbeispiel erzeugt wird.
Die Erfindung wird auf eine Schleuderkultur angewandt, in der es Zellen ermöglicht wird, in einem Suspensionszustand in einer Zellkulturlösung (flüssiges Medium) zu wachsen, während die Zellkulturlösung gerührt wird.
In einer solchen Schleuderkultur werden, insbesondere wenn verankerungsabhängige Zellen kultiviert werden, die Zellen und Zellkulturträger in einer Zellkulturlösung in Suspension gebracht, und es wird den Zellen ermöglicht, in einem Zustand, in dem sie an den Oberflächen der Träger haften, zu wachsen.
Ein Zellkultivierungsverfahren, das mit solchen Zellkulturträgern arbeitet, wird als Mikroträgerkultivierung bezeichnet. Die Erfindung ist vorteilhaft auf diese Mikroträgerkultivierung anwendbar.
Im Folgenden werden ein Zellkultivierungsverfahren, Zellkulturträger sowie eine Zellkultivierungseinrichtung nach der Erfindung an Hand von bevorzugten Ausführungsbeispielen beschrieben, in denen die Erfindung auf die oben beschriebene Mikroträgerkultivierung angewandt wird.
Zunächst wird ein Zellkultivierungsverfahren nach einem ersten Ausführungsbeispiel beschrieben. Das erste Ausführungsbeispiel der Erfindung ist auf ein Zellkultivierungsverfahren gerichtet, das Verfahrensschritte umfasst, in denen eine Zellkulturlösung zubereitet wird, die zu kultivierende Zellen und granulöse oder körnige Zellkulturträger mit magnetischen Teilchen enthält, und die Zellkulturlösung mit einem Magnetfeld beaufschlagt wird, so dass die Zellkulturträger in der Zellkulturlösung durch die Wirkung des angelegten Magnetfeldes bewegt werden und so die Zellkulturlösung umrühren, während die Zellen an den Oberflächen der Zellkulturträger haften und darauf wachsen.
Wie oben beschrieben, werden in diesem Verfahren Zellkulturträger verwendet, die auf das Magnetfeld reagieren. 1 zeigt einen Querschnitt eines solchen Zellkulturträgers.
Nach 1 besteht ein Zellkulturträger 1 aus einem magnetischen Teilchen 2 und einer Deckschicht 3, welche die Oberfläche des magnetischen Teilchens 2 so bedeckt, dass Zellen auf ihr wachsen können. Wird der Zellkulturträger mit einem Magnetfeld beaufschlagt, so wird er in einer Zellkulturlösung bewegt, wodurch die Zellkulturlösung gleichmäßig und sanft gerührt wird. Es ist deshalb für die Zellen leicht, an der Oberfläche des Zellkulturträgers 1 zu haften. Außerdem wird jede Zelle in gleicher Menge mit Nahrung versorgt. Der Zellkulturträger 1 bildet demnach ein gutes Gerüst für das Zellwachstum.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren können mechanische Stöße auf die Zellkulturträger 1 vermieden werden, die bei dem herkömmlichen, mit einer Rührflasche arbeitenden Verfahren durch die Kollision einer Rührrippe mit den Zellkulturträgern auftreten. Dadurch kann verhindert werden, dass die an den Zellkulturträgern 1 haftenden Zellen von deren Oberflächen abfallen oder beschädigt werden.
Das magnetische Teilchen 2 bildet die Basis des jeweiligen Zellkulturteilchens 1. Das magnetische Teilchen 2 kann aus einem magnetischen Material bestehen. Vorzugsweise ist jedoch das magnetische Teilchen 2 aus einem Komposit- oder Verbundmaterial gebildet, das man durch Mischen eines Harzmaterials mit einem magnetischen Material erhält. Die Dichte (spezifisches Gewicht) des magnetischen Materials (d.h. des Zellkulturträgers 1) kann dabei in einfacher Weise eingestellt werden, indem das Mischverhältnis von Harzmaterial und magnetischem Material geeignet eingestellt wird. Ein weiterer Vorteil liegt darin, dass Form und Größe (z.B. mittlere Teilchengröße) des Zellkulturträgers 1 in einfacher Weise eingestellt werden können.
Das magnetische Teilchen 2 ist nach 1 vorzugsweise so aufgebaut, dass ein magnetisches Material (magnetisches Pulver) 22 in einem Basismaterial 21 dispergiert, d.h. verteilt ist, das hauptsächlich aus dem Harzmaterial besteht. Das magnetische Teilchen 2 kann vergleichsweise einfach hergestellt werden, indem ein Harzmaterial, dem das magnetische Material zugemischt worden ist, im geschmolzenen Zustand geformt oder granuliert wird. Es ist darauf hinzuweisen, dass bei dem in Form eines Verbundteilchens vorliegenden magnetischen Teilchen das magnetische Material nur in einem Teil des Basismaterials 21, der sich in der Nähe von dessen Oberfläche befindet, dispergiert sein kann.
Beispiele für das magnetische Material 22 sind eine ferromagnetische Legierung, die Eisenoxid, Fe, Ni, Co oder dergleichen als Hauptbestandteil enthält, Ferrit, Bariumferrit, Strontiumferrit und dergleichen. Diese magnetischen Materialien können allein oder in Kombination von zwei oder mehr Materialien eingesetzt werden.
Als Harzmaterial können verschiedene wärmehärtbare Harze und verschiedene thermoplastische Harze verwendet werden. Beispiele für thermoplastische Harze sind Polyamid, Polyethylen, Polypropylen, Polystyrol, Polyimid, ein Acrylharz und ein thermoplastisches Polyurethan. Beispiele für wärmehärtbare Harze sind ein Epoxyharz, ein Phenolharz, ein Melaminharz, ein Harnstoffharz, ein ungesättigtes Polyester, ein Alkydharz, ein wärmehärtendes Polyurethan und Ebonit. Diese Harzmaterialien können allein oder in Kombination von zwei oder mehr Materialien verwendet werden.
Das Harzmaterial kann mit organischen Pigmenten, anorganischen Pigmenten, sauren Farbstoffen, basischen Farbstoffen oder dergleichen gefärbt sein.
Die Deckschicht 3 besteht aus einem Material, an dem Zellen haften. Ein solches Material ist beispielsweise Polystyrol, Polyacrylamid, Cellulose, Dextran und dergleichen. Besonders bevorzugt ist jedoch ein Material, das eine Calciumphosphat-basierte Verbindung als Hauptbestandteil enthält. So ist eine Calciumphosphat-basierte Verbindung biologisch inert und damit hinsichtlich einer Zellschädigung vergleichsweise ungefährlich.
Enthält die Deckschicht 3 die Calciumphosphat-basierte Verbindung als Hauptbestandteil, so fängt sie von dem magnetischen Material 22 erzeugte Metallionen ein und verhindert so, dass die Metallionen in die Zellkulturlösung eluieren. Dadurch kann ein nachteiliger Einfluss auf die Zellen vermieden werden. Die Deckschicht 3 bildet also in diesem Fall eine Ionenschutzschicht.
Die Calciumphosphat-basierte Verbindung unterliegt keinen besonderen Beschränkungen. So können verschiedenartige Verbindungen mit einem Ca/P-Verhältnis von 1,0 bis 2,0 verwendet werden. Beispiele für eine solche Verbindung sind
(Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂), Ca₁₀(PO₄)₆F₂, Ca₁₀(PO₄)₆Cl₂, Ca₃(PO₄)₂, Ca₂P₂O₇, Ca(PO₃)₂ und CaHPO₄. Diese Verbindungen können allein oder in Kombination von zwei oder mehr Verbindungen verwendet werden.
Unter den genannten Calciumphosphat-basierten Verbindungen ist eine Verbindung, die Hydroxylapatit (Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂) als Hauptbestandteil enthält, am besten geeignet. Hydroxylapatit wird als Biomaterial eingesetzt, da Zellen mit hoher Effizienz an ihm haften und es nur eine sehr geringe Wahrscheinlichkeit aufweist, zellschädigend zu wirken.
Wird Fluorapatit (Ca₁₀(PO₄)₆F₂) verwendet, so beträgt der Fluorgehalt in der gesamten Calciumphosphat-basierten Verbindung vorzugsweise 5 Gew.-% oder weniger. Indem der Fluorgehalt in der gesamten Calciumphosphat-basierten Verbindung auf 5 Gew.-% oder weniger eingestellt wird, kann die Eluierung von Fluor aus der Deckschicht (d.h. aus dem Zellkulturträger) vermieden oder wenigstens minimiert werden. Deshalb kann auch eine Zellschädigung vermieden oder minimiert werden, so dass eine Herabsetzung der Effizienz des Zellwachstums verhindert werden kann.
Diese Calciumphosphat-basierten Verbindungen können nach bekannten Verfahren wie der Nass-Synthese, der Trocken-Synthese oder dergleichen synthetisiert werden. In diesem Fall enthält die resultierende Calciumphosphat-basierte Verbindung möglicherweise eine Substanz, die als Ergebnis der Synthese (z.B. als Rohmaterial oder dergleichen) zurückbleibt, und/oder ein sekundäres Reaktionsprodukt, das im Laufe der Synthese erzeugt worden ist.
Besteht die Deckschicht 3 hauptsächlich aus der Calciumphosphat-basierten Verbindung, so kann sie in der Weise ausgebildet werden, dass die Calciumphosphat-basierte Verbindung auf der Oberfläche des magnetischen Teilchens 2 adsorbiert wird. Vorzugsweise ist jedoch, wie in 1 gezeigt, die Deckschicht 3 aus feinen, aus der Calciumphosphat-basierten Verbindung bestehenden Teilchen 31 gebildet, die teilweise in einem Oberflächenbereich eingebettet sind, der die Oberfläche des magnetischen Teilchens 2 umfasst und an diese grenzt. Dieses sorgt für eine ausgezeichnete Haftung zwischen der Deckschicht 3 und dem magnetischen Teilchen 2, so dass eine Ablösung der Deckschicht 3 von der Oberfläche des magnetischen Teilchens 2 sicher vermieden wird. Der Zellkulturträger 1 hat deshalb eine ausreichende Festigkeit.
Die Deckschicht 3 kann gebildet werden, indem poröse Teilchen, die aus der Calciumphosphat-basierten Verbindung bestehen, in Kollision mit der Oberfläche des magnetischen Teilchens 2 gebracht werden. Auf diese Weise kann die Deckschicht 3 einfach und zuverlässig hergestellt werden.
Wenn die porösen Teilchen mit der Oberfläche des magnetischen Teilchens 2 kollidieren, brechen sie in die feinen Teilchen 31 auf, deren Teilchengröße durch die Kollision mit dem magnetischen Teilchen 2 deutlich verringert ist. Einige der Teilchen 31 werden teilweise in das magnetische Teilchen 2 eingebettet. Das magnetische Teilchen 2 fängt dabei die Teilchen 31 infolge seiner elastischen Wirkung ein, wodurch die Teilchen 31 auf der Oberfläche des magnetischen Teilchens 2 festgehalten werden.
Die porösen Teilchen werden vorzugsweise durch Agglomeration von aus der Calciumphosphat-basierten Verbindung bestehenden Primärteilchen hergestellt. Durch die Verwendung solcher poröser Teilchen kann die Oberfläche des magnetischen Teilchens 2 noch zuverlässiger beschichtet werden, da die porösen Teilchen bei ihrer Kollision mit den magnetischen Teilchen 2 besonders wirksam fragmentiert werden.
Die mittlere Teilchengröße der porösen Teilchen ist nicht auf einen bestimmten Wert beschränkt, liegt jedoch vorzugsweise bei 100 μm oder weniger. Übersteigt der mittlere Teilchendurchmesser der porösen Teilchen 100 μm, so ist die Geschwindigkeit der porösen Teilchen bei ihrer Kollision mit den magnetischen Teilchen 2 möglicherweise so gering, dass sie nicht effizient fragmentiert werden.
Die Kollision zwischen den magnetischen Teilchen 2 und den porösen Teilchen kann beispielsweise unter Verwendung eines handelsüblichen Hybridisierungsgerätes im trockenen Zustand erfolgen. Dabei erfolgt die Kollision z.B. bei einem Mischverhältnis zwischen den magnetischen Teilchen 2 und den porösen Teilchen von etwa 400:1 bis 50:1 (gewichtsbezogen) und einer Temperatur in dem Gerät, die gleich oder kleiner als die Erweichungstemperatur des Kunstharzmaterials ist, das als Hauptmaterial für die magnetischen Teilchen 2 verwendet wird (üblicherweise 80°C oder weniger).
Solche porösen Teilchen können beispielsweise auch in bekannter Weise wie folgt hergestellt werden.
Die porösen Teilchen können durch direktes Sprühtrocknen eines Breis hergestellt werden, der kristalline Teilchen (Primärteilchen) einer nach einem bekannten Nassverfahren synthetisierten Calciumphosphat-basierten Verbindung enthält, um körnige Sekundärteilchen zu erzeugen. Alternativ können solche Sekundärteilchen erzeugt werden, indem dem Brei ein Additiv zugegeben wird, z.B. in Form von die Viskosität einstellenden Teilchen aus einer organischen Verbindung, in Form von Fasern, die durch Erhitzen verdampft werden können, oder dergleichen, und dann der Brei sprühgetrocknet wird. Die so erhaltenen Sekundärteilchen können nach Bedarf auch noch gesintert werden.
Da die so erhaltenen Sekundärteilchen porös sind, können sie direkt zur Herstellung der Deckschicht 3 verwendet werden.
Sollen poröse Teilchen mit einer höheren Porosität verwendet werden, so können diese beispielsweise wie folgt hergestellt werden.
Zunächst wird ein Brei zubereitet, in dem die oben beschriebenen Sekundärteilchen suspendiert sind, und der Brei durch Nassformen, Trockenpressen oder dergleichen in eine Blockform gebracht. Dabei kann dem Brei eine organische Verbindung zugegeben werden, die in dem folgenden Sinterprozess verdampft wird, um Poren zu erzeugen. Der Porendurchmesser kann auch an Stelle der Zugabe einer solchen organischen Verbindung durch Einstellen der Prozessbedingungen, z.B. der Sintertemperatur oder dergleichen, kontrolliert werden. Der so erhaltene Block wird dann bei einer Temperatur im Bereich von etwa 400 bis 1300°C gesintert. Liegt die Sintertemperatur unter 400°C, so ist zu befürchten, dass die organische Verbindung nicht vollständig verdampft oder der Block nicht ausreichend gesintert wird. Erfolgt dagegen das Sintern bei einer 1300°C übersteigenden Temperatur, so ist zu befürchten, dass der resultierende Sinterkörper übermäßig dicht wird oder sich die Calciumphosphat-basierte Verbindung zersetzt.
Anschließend wird der gesinterte Block zermahlen und klassifiziert, um Teilchen mit der gewünschten Teilchengröße zu erhalten.
Der Porendurchmesser der porösen Teilchen kann eingestellt werden, indem beispielsweise die Größe der Primärteilchen, die Viskosität des Breis, die Art des Additivs oder dergleichen geeignet eingestellt werden.
Das so erhaltene poröse Teilchen hat vorzugsweise eine spezifische Oberfläche von 10 m²/g oder mehr und einen Porendurchmesser von etwa 500 bis 1000 Å. Der Zellkulturträger 1, der unter Verwendung der den oben beschriebenen Anforderungen genügenden porösen Teilchen hergestellt wird, ermöglicht es den Zellen, noch effizienter an seiner Oberfläche zu haften und zu wachsen.
Das Verfahren zum Herstellen der Deckschicht 3 und damit zum Herstellen des Zellkulturträgers 1 ist nicht auf das oben beschriebene Verfahren beschränkt.
Die Deckschicht 3 kann dicht oder porös sein.
Die mittlere Dicke der Deckschicht 3 ist nicht auf einen bestimmten Wert beschränkt, liegt jedoch vorzugsweise im Bereich von etwa 0,1 bis 5 μm, noch besser im Bereich von etwa 0,5 bis 2 μm. Ist die mittlere Dicke der Deckschicht 3 kleiner als der vorstehend genannte untere Grenzwert, so ist zu befürchten, dass ein Teil der Oberfläche des magnetischen Teilchens 2 in dem Zellkulturträger 3 freiliegt. Übersteigt dagegen die mittlere Dicke der Deckschicht 3 den vorstehend genannten oberen Grenzwert, so wird es schwierig, die Dichte des Zellkulturträgers 1 einzustellen.
Es ist von Vorteil, dass der Zellkulturträger 1 bei Anlegen eines Magnetfeldes leicht in einer Zellkulturlösung bewegt werden kann und sich bei Abschalten des Magnetfeldes in der Zellkulturlösung nach unten absetzt oder abscheidet. Durch Verwendung der Zellkulturträger 1 kann die Zellkulturlösung einfach und zuverlässig gerührt werden.
Unter diesem Gesichtspunkt liegt die Dichte (spezifisches Gewicht) jedes Zellkulturträgers 1 vorzugsweise im Bereich von etwa 0,8 bis 2,5 g/cm³, noch besser im Bereich von etwa 1,0 bis 1,2 g/cm³. Ist die Dichte der Zellkulturträger 1 zu klein, so wird es für die Zellkulturträger 1 schwierig, sich bei Beseitigung des Magnetfeldes in der Zellkulturlösung nach unten abzusetzen. Ist dagegen die Dichte der Zellkulturträger 1 zu groß, so muss ein übermäßig großes Magnetfeld angelegt werden, um die Zellkulturträger 1 in der Zellkulturlösung zu bewegen. In beiden Fällen besteht die Gefahr, dass die Zellkulturlösung nicht ausreichend gerührt wird.
Die Abmessung des Zellkulturträgers 1 ist nicht auf einen bestimmten Wert beschränkt. Vorteilhaft ist sie jedoch beispielsweise wie folgt gewählt.
Ist die mittlere Teilchengröße des Zellkulturträgers 1 als A (μm) und die maximale Länge einer Zelle, die an dem Zellkulturträger 1 haften darf, als B (μm) definiert, so liegt das Verhältnis A/B vorzugsweise bei etwa 2 bis 100, noch besser bei etwa 5 bis 50. Wird das Verhältnis A/B auf einen Wert eingestellt, der in dem vorstehend genannten Bereich liegt, so kann die Oberfläche jedes Zellkulturträgers 1 bezogen auf die Größe der Zelle ausreichend vergrößert werden, wodurch es den Zellen möglich wird, noch einfacher an der Oberfläche des jeweiligen Zellkulturträgers 1 zu haften und dort zu wachsen.
Aus praktischen Erwägungen liegt der mittlere Teilchendurchmesser der Zellkulturteilchen 1 vorzugsweise im Bereich von etwa 50 bis 500 μm, noch besser im Bereich von etwa 100 bis 300 μm. Indem der mittlere Teilchendurchmesser der Zellkulturteilchen 1 auf einen innerhalb des oben angegebenen Bereichs liegenden Wert eingestellt wird, können die oben beschriebenen Wirkungen noch weiter verbessert werden.
Um es einer noch größeren Zahl an Zellen zu ermöglichen, an den Oberflächen der Zellkulturträger 1 zu haften und zu wachsen, ist vorzugsweise weitgehend die gesamte Oberfläche jedes magnetischen Teilchens 2 mit der Deckschicht 3 bedeckt, wie dies in dem vorliegenden Ausführungsbeispiel der Fall ist. Jedoch kann der jeweilige Zellkulturträger 1 auch so aufgebaut sein, dass nur ein Teil der Oberfläche des magnetischen Teilchens 2 in Abhängigkeit der mit dem Zellkulturträger 1 zu kultivierenden Zellart, der Art des das magnetische Teilchen 2 bildenden Materials oder dergleichen mit der Deckschicht 3 bedeckt ist. Bei diesem Aufbau liegt also ein Teil der Oberfläche des magnetischen Teilchens 2 durch die in der Deckschicht 3 vorhandenen Lücken frei.
Im Folgenden werden ein Zellkultivierungsverfahren nach einem zweiten Ausführungsbeispiel sowie in diesem Verfahren verwendete Zellkulturträger und magnetische Teilchen beschrieben.
Das zweite Ausführungsbeispiel ist auf ein Zellkultivierungsverfahren gerichtet, das Verfahrensschritte enthält, in denen eine Zellkulturlösung, die zu kultivierende Zellen, körnige Zellkulturteilchen und magnetische Teilchen enthält, zubereitet und die Zellkulturlösung mit einem Magnetfeld beaufschlagt wird, um die magnetischen Teilchen in der Zellkulturlösung zu bewegen und so die Zellkulturlösung zu rühren, wodurch es den Zellen ermöglicht wird, an den Oberflächen der Zellkulturträger zu haften und zu wachsen.
Bei dem Zellkultivierungsverfahren nach zweitem Ausführungsbeispiel werden zunächst die magnetischen Teilchen sowie die Zellen und die Zellkulturträger der Zellkulturlösung zugegeben. Dann werden durch Beaufschlagung der Zellkulturlösung mit einem Magnetfeld die magnetischen Teilchen in der Zellkulturlösung bewegt, so dass letztere gerührt wird. In diesem Zustand haften und wachsen die Zellen an den Oberflächen der Zellkulturträger.
In diesem Ausführungsbeispiel ist es möglich, eine Zellkulturlösung gleichmäßig und sanft zu rühren, was zu einem effizienten Zellwachstum führt.
Wie später noch genauer beschrieben wird, ermöglicht es dieses Zellkulturverfahren durch zeitliche Änderung der Intensität oder der räumlichen Anordnung eines auf die Zellkulturlösung angewandten Magnetfeldes die Zellkulturlösung gleichmäßig zu rühren.
Im Folgenden werden die Komponenten des Zellkulturverfahrens nach zweitem Ausführungsbeispiel nacheinander beschrieben.
2 ist ein Querschnitt, der den Aufbau des in dem Zellkultivierungsverfahren nach zweitem Ausführungsbeispiel verwendeten Zellkulturträgers zeigt. 3 ist ein Querschnitt, der den Aufbau des in dem Zellkultivierungsverfahren nach zweitem Ausführungsbeispiel verwendeten magnetischen Teilchens zeigt. 4 ist ein Querschnitt, der eine Modifizierung des in dem Zellkultivierungsverfahren nach zweitem Ausführungsbeispiel verwendeten magnetischen Teilchens zeigt.
Zellkulturträger 1A
Wie in dem ersten Ausführungsbeispiel dient ein Zellkulturträger 1A als Gerüst für das Zellwachstum und ist körnig oder partikelförmig (vorzugsweise weitgehend sphärisch) ausgebildet.
Als Zellkulturträger kann ein (üblicherweise in einer Mikroträgerkultur eingesetzter) Träger verwendet werden, der aus einem Material besteht, das als Hauptbestandteil Polystyrol, Polyacrylamid, Cellulose, Dextran oder dergleichen enthält. In dem zweiten Ausführungsbeispiel werden jedoch die Zellkulturträger 1A verwendet, die jeweils den in 2 gezeigten Aufbau haben. Jeder dieser Zellkulturträger 1A besteht aus einem Basiskörper 11 und einer Deckschicht 12, welche die Oberfläche des Basiskörpers 11 bedeckt, so dass es Zellen ermöglicht wird, an der Deckschicht 12 zu haften.
Der in 2 gezeigte Aufbau des Zellkulturträgers 1A erlaubt es, dass die Zellen in geeigneter Weise an dem Zellkulturträger 1A haften und wachsen. Außerdem erleichtert es dieser Aufbau, Form, Größe (z.B. mittlere Teilchengröße) und physikalische Eigenschaften (z.B. Dichte) des Zellkulturträgers 1A einzustellen. Im Folgenden wird der Zellkulturträger 1A genauer beschrieben.
Der Basiskörper 11 besteht vorzugsweise aus einem Harzmaterial. Die Verwendung dieses Basiskörpers 11 führt zu einer weiteren Verbesserung der oben beschriebenen technischen Wirkung.
Als Harzmaterial können verschiedenartige wärmehärtbare Harze und verschiedenartige thermoplastische Harze verwendet werden. Beispiele für ein thermoplastisches Harz sind Polyamid, Polyethylen, Polypropylen, Polystyrol, Polyamid, ein Acrylharz und ein thermoplastisches Polyurethan. Beispiele für ein wärmehärtbares Harz sind ein Epoxyharz, ein Phenolharz, ein Melaminharz, ein Harnstoffharz, ein ungesättigtes Polyester, ein Alkydharz, ein wärmehärtbares Polyurethan und Ebonit. Diese Harze können allein oder in Kombination von zwei oder mehr Materialien verwendet werden.
Außerdem kann das Harz Material mit organischen Pigmenten, anorganischen Pigmenten, sauren Farbstoffen, basischen Farbstoffen oder dergleichen gefärbt sein.
Als die Deckschicht 12 bildendes Material kann ein beliebiges Material verwendet werden, sofern Zellen an ihm haften können. Insbesondere ist ein Material geeignet, das eine Calciumphosphat-basierte Verbindung als Hauptmaterial enthält. Die Calciumphosphat-basierte Verbindung ist deshalb von Vorteil, da sie biologisch inert ist und nur eine geringe Wahrscheinlichkeit dafür besteht, dass sie Zellen schädigt.
Die Calciumphosphat-basierte Verbindung unterliegt keinen besonderen Beschränkungen. Es sind verschiedenartige Verbindungen mit einem Ca/P-Verhältnis von 1,0 bis 2,0 verwendbar. Beispiele für eine solche Verbindung sind (Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂), Ca₁₀(PO₄)₆F₂, Ca₁₀(PO₄)₆Cl₂, Ca₃(PO₄)₂, Ca₂P₂O₇, Ca(PO₃)₂ und CaHPO₄. Diese Verbindungen können allein oder in Kombination von zwei oder mehr Verbindungen verwendet werden.
Unter den genannten Calciumphosphat-basierten Verbindungen ist eine Verbindung, die Hydroxylapatit (Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂) als Hauptbestandteil enthält, am besten geeignet. Hydroxylapatit wird als Biomaterial verwendet, da Zellen mit hoher Effizienz an ihm haften und nur eine geringe Wahrscheinlichkeit besteht, dass es die Zellen schädigt.
Wird Fluorapatit (Ca₁₀(PO₄)₆F₂) verwendet, so beträgt der Fluorgehalt in der gesamten Calciumphosphat-basierten Verbindung 5 Gew.-% oder weniger. Indem der Fluorgehalt in der gesamten Calciumphosphat-basierten Verbindung auf 5 Gew.-% oder weniger eingestellt wird, kann die Eluierung von Fluor aus der Deckschicht 12 und damit aus dem Zellkulturträger 1A verhindert oder zumindest minimiert werden. Dementsprechend kann eine Zellschädigung vermieden oder zumindest minimiert werden, so dass eine Reduzierung der Effizienz des Zellwachstums verhindert wird.
Diese Calciumphosphat-basierten Verbindungen können nach bekannten Verfahren wie der Nass-Synthese, der Trocken-Synthese oder dergleichen synthetisiert werden. In diesem Fall enthält die resultierende Calciumphosphat-basierte Verbindung möglicherweise eine Substanz, die als Ergebnis der Synthese (z.B. ein Rohmaterial) zurückbleibt, und/oder ein sekundäres Reaktionsprodukt, das im Laufe der Synthese gebildet wird.
Wird die Deckschicht 12 aus der Calciumphosphat-basierten Verbindung gebildet, so kann sie in der Weise hergestellt werden, dass man die Calciumphosphat-basierte Verbindung auf der Oberfläche des Basiskörpers 11 adsorbieren lässt. Wie in 2 gezeigt, ist die Deckschicht 12 vorzugsweise aus Teilchen 12 der Calciumphosphat-basierten Verbindung gebildet, die teilweise in einen Oberflächenbereich eingebettet sind, der die Oberfläche des Basiskörpers 11 umfasst und an diese angrenzt. Dadurch wird für eine ausgezeichnete Haftung zwischen der Deckschicht 12 und dem Basiskörper 11 gesorgt. Diese Haftung verhindert, dass sich die Deckschicht 12 von der Oberfläche des Basiskörpers 11 löst. Der Zellkulturträger 1A hat deshalb eine ausreichende Festigkeit.
In diesem Fall kann die Deckschicht 12 beispielsweise gebildet werden, indem poröse Teilchen, die hauptsächlich aus der Calciumphosphat-basierten Verbindung bestehen, in Kollision mit der Oberfläche des Basiskörpers 11 gebracht werden. In einem solchen Verfahren kann die Deckschicht 12 einfach und zuverlässig gebildet werden. Durch die Kollision der porösen Teilchen mit der Oberfläche des Basiskörpers 11 brechen die porösen Teilchen in feine Teilchen 13 auf, die beträchtlich kleiner sind als die mit dem Basiskörper 11 kollidierenden Teilchen. Die Teilchen 13 werden so teilweise in den Basiskörper 11 eingebettet. Bei dieser Einbettung fängt der Basiskörper 11 die Teilchen 13 infolge seiner elasti schen Wirkung ein, wodurch die Teilchen 13 an dem Basiskörper 11 festgehalten werden.
Die porösen Teilchen werden vorzugsweise durch Agglomeration von Primärteilchen der Calciumphosphat-basierten Verbindung hergestellt. Durch Verwendung solcher poröser Teilchen kann die Oberfläche des Basiskörpers 11 noch zuverlässiger beschichtet werden, da diese porösen Teilchen bei der Kollision mit dem Basiskörper 11 noch effizienter fragmentiert werden.
Die mittlere Teilchengröße der porösen Teilchen ist nicht auf einen bestimmten Wert beschränkt, liegt jedoch vorzugsweise bei 100 μm oder weniger. Übersteigt die mittlere Teilchengröße der porösen Teilchen 100 μm, so ist möglicherweise die Geschwindigkeit dieser Teilchen bei ihrer Kollision mit dem Basiskörper 11 so gering, dass die porösen Teilchen nicht effizient fragmentiert werden.
Die Kollision zwischen den Basiskörpern 11 und den porösen Teilchen erfolgt beispielsweise unter Verwendung eines handelsüblichen Hybridisierungsgerätes im trockenen Zustand. Dabei beträgt beispielsweise das Mischverhältnis zwischen den Basiskörpern 11 und den porösen Teilchen etwa 400:1 bis 50:1 (gewichtsbezogen), und die Temperatur in dem Gerät ist gleich oder kleiner als die Erweichungstemperatur des Harzmaterials, welches das Hauptmaterial des Hauptkörpers 11 bildet (üblicherweise 80°C oder weniger).
Solche poröse Teilchen können in bekannter Weise beispielsweise auch wie folgt hergestellt werden.
Um körnige Sekundärteilchen zu erhalten, können die porösen Teilchen beispielsweise durch direktes Sprühtrocknen eines Breis (Schlämme) hergestellt werden, der kristalline Teilchen (Primärteilchen) einer nach einem bekannten Nassverfahren synthetisierten Calciumphosphat-basierten Verbindung enthält. Alternativ können solche Sekundärteilchen hergestellt werden, indem ein Additiv wie ein die Viskosität einstellendes Mittel, Teilchen einer organischen Verbindung, Fasern, die durch Erhitzung verdampft werden können, oder dergleichen dem Brei zugegeben und der Brei anschließend sprühgetrocknet wird. Die so erhaltenen Sekundärteilchen können nach Bedarf auch gesintert werden.
Da die so erhaltenen Sekundärteilchen porös sind, können sie direkt zur Ausbildung der Deckschicht 12 verwendet werden.
Sind poröse Teilchen mit einer noch höheren Porosität erwünscht, so können diese Teilchen beispielsweise in folgender Weise hergestellt werden.
Zunächst wird ein Brei, in dem die oben beschriebenen Sekundärteilchen suspendiert sind, zubereitet und dieser Brei durch Nassformen, Trockenformen oder dergleichen in eine Blockform gebracht. Dem Brei kann auch eine organische Verbindung zugegeben werden, die in dem folgenden Sinterprozess verdampft wird, um Poren auszubilden. Der Porendurchmesser kann auch an Stelle der Zugabe einer solchen organischen Verbindung durch Einstellen der Prozessbedingungen, wie z.B. der Sintertemperatur, kontrolliert werden. Anschließend wird der so erhaltene Block bei einer Temperatur im Bereich von etwa 400 bis 1300°C gesintert. Ist die Sintertemperatur kleiner als 400°C, so ist zu befürchten, dass die organische Verbindung nicht vollständig verdampft oder der Block nicht ausreichend gesintert wird. Wird dagegen der Sinterprozess bei einer Temperatur höher als 1300°C durchgeführt, so ist zu befürchten, dass der resultierende Sinterkörper übermäßig dicht wird oder sich die Calciumphosphat-basierte Verbindung zersetzt.
Anschließend wird der so gesinterte Block zermahlen und klassifiziert, um Teilchen mit der gewünschten Teilchengröße zu erhalten.
Der Porendurchmesser in dem porösen Teilchen kann beispielsweise dadurch eingestellt werden, dass die Größe der Primärteilchen, die Viskosität des Breis, die Art des Additivs oder dergleichen geeignet eingestellt werden.
Das so erhaltene poröse Teilchen hat vorzugsweise eine spezifische Oberfläche von 10 m²/g oder mehr und einen Porendurchmesser von etwa 500 bis 1000 Å. Der Zellkulturträger 1A, der unter Verwendung der die oben beschriebenen Anforderungen erfüllenden porösen Teilchen hergestellt ist, ermöglicht es den Zellen, noch effizienter an seiner Oberfläche zu haften und zu wachsen.
Das Verfahren zum Herstellen der Deckschicht 12 und damit des Zellkulturträgers 1A ist nicht auf das oben beschriebene Verfahren beschränkt.
Die Deckschicht 12 kann dicht oder porös sein.
Die mittlere Dicke der Deckschicht 12 ist nicht auf einen bestimmten Wert beschränkt, liegt jedoch vorzugsweise im Bereich von etwa 0,1 bis 5 μm, noch besser im Bereich von etwa 0,5 bis 2 μm. Ist die mittlere Dicke der Deckschicht 12 kleiner als der oben angegebene untere Grenzwert, so ist zu befürchten, dass ein Teil der Oberfläche des Basiskörpers 11 in dem Zellkulturträger 1A freiliegt. Übersteigt dagegen die mittlere Dicke der Deckschicht 12 den vorstehend angegebenen oberen Grenzwert, so wird es schwierig, die Dichte des Zellkulturträgers 1A einzustellen.
Der Zellkulturträger 1A hat vorzugsweise eine Dichte (spezifisches Gewicht), die nahe bei der Dichte von Wasser liegt. Insbesondere liegt die Dichte des Zellkulturträgers 1A vorzugsweise im Bereich von etwa 0,8 bis 1,4 g/m³, noch besser im Bereich von etwa 0,9 bis 1,2 g/m³. Indem die Dichte des Zellkulturträgers 1A auf einen im vorstehend angegebenen Bereich liegenden Wert eingestellt wird, können die Zellkulturträger 1A noch gleichmäßiger in einer Zellkulturlösung suspendiert werden.
Die Abmessung des Zellkulturträgers 1A ist nicht auf einen bestimmten Wert beschränkt. Sie ist jedoch vorzugsweise wie folgt festgelegt.
Ist die mittlere Teilchengröße der Zellkulturträger 1A als A (μm) und die maximale Länge einer Zelle, die auf den Zellkulturträger 1A haften soll, als B (μm) definiert, so liegt das Verhältnis A/B vorzugsweise bei etwa 2 bis 100, noch besser bei etwa 5 bis 50. Indem das Verhältnis A/B auf ein in dem vorstehenden Bereich liegenden Wert eingestellt wird, kann die Oberfläche des jeweiligen Zellkulturträgers 1A bezogen auf die Größe der Zelle ausreichend vergrößert werden, was es den Zellen erlaubt, noch einfacher an der Oberfläche des Zellkulturträgers 1A zu haften und zu wachsen.
Ist die mittlere Teilchengröße der Zellkulturträger 1A und die mittlere Teilchengröße von später genauer beschriebenen magnetischen Teilchen 2A als C (μm) definiert, so liegt das Verhältnis C/A vorzugsweise bei etwa 0,02 bis 10, noch besser bei etwa 0,3 bis 3. Indem das Verhältnis C/A auf einen im vorstehenden Bereich liegenden Wert eingestellt wird, ist es möglich, eine Zellkulturlösung kraft der Bewegung der magnetischen Teilchen 2A in ausreichendem Maße zu rühren (vergl. weiter unten), wodurch die Zellkulturträger 1A noch gleichmäßiger in der Zellkulturlösung suspendiert werden können.
Die mittlere Teilchengröße der Zellkulturträger 1A liegt vorzugsweise im Bereich von etwa 50 bis 500 μm, noch besser im Bereich von etwa 100 bis 300 μm. Indem die mittlere Teilchengröße der Zellkulturträger 1A auf einen im vorstehenden Bereich liegenden Wert eingestellt wird, können die oben beschriebenen technischen Wirkungen weiter verbessert werden.
Um es einer großen Zahl von Zellen zu ermöglichen, an der Oberfläche des oben beschriebenen Zellkulturträgers 1A zu haften und zu wachsen, ist vorzugsweise weitgehend die gesamte Oberfläche des Basiskörpers 11 mit der Deckschicht 12 wie in dem vorliegenden Ausführungsbeispiel bedeckt. Jedoch kann der Zellkulturträger 1A auch so aufgebaut sein, dass in Abhängigkeit der Zellart, die auf dem Zellkulturträger 1A haften soll, der Art des den Basiskörper 11 bildenden Materials oder dergleichen nur ein Teil der Oberfläche des Basiskörpers 11 mit der Deck schicht 12 bedeckt ist. Bei diesem Aufbau liegt also ein Teil der Oberfläche des Basiskörpers 11 durch die in der Deckschicht 12 ausgebildeten Lücken frei.
Magnetisches Teilchen 2A
Die magnetischen Teilchen 2A können in einer Zellkulturlösung durch Anwendung eines Magnetfeldes bewegt werden. Werden die magnetischen Teilchen 2A durch die gesamte Zellkulturlösung bewegt, so wird letztere gleichmäßig und sanft gerührt, was im Ergebnis dazu führt, dass die Zellkulturträger 1A gleichmäßig in der Zellkulturlösung suspendiert werden.
Die Zellen können deshalb leicht an den Oberflächen der Zellkulturträger 1A haften und werden gleichmäßig mit Nahrung versorgt. Außerdem können mechanische Stöße auf die Zellkulturträger 1A vermieden werden, die in dem herkömmlichen, mit einer Schleuderflasche arbeitenden Verfahren infolge der Kollision einer Rührrippe und der Zellkulturträger verursacht werden. Dadurch wird verhindert, dass die an den Zellkulturträgern 1A haftenden Zellen von deren Oberflächen fallen. Außerdem wird eine Schädigung der Zellen vermieden. Die Erfindung sorgt demnach für ein noch effizienteres Zellwachstum.
Ein Vorteil der Erfindung liegt darin, dass die magnetischen Teilchen 2A mit Anlegen eines Magnetfeldes leicht bewegt werden können und sich mit Beseitigung des Magnetfeldes in einer Zellkulturlösung nach unten absetzen (abscheiden) können. Dadurch kann die Zellkulturlösung noch einfacher und zuverlässiger gerührt werden.
Unter diesem Gesichtspunkt liegt die Dichte (spezifisches Gewicht) der magnetischen Teilchen 2A vorzugsweise im Bereich von etwa 0,8 bis 2,5 g/cm³, noch besser im Bereich von etwa 1,2 bis 1,9 g/cm³. Ist die Dichte der magnetischen Teilchen 2A zu gering, so setzen sie sich nach Beseitigung des Magnetfeldes nur schwer in der Zellkulturlösung nach unten ab. Ist dagegen die Dichte der magnetischen Teilchen 2A zu hoch, so wird ein starkes Magnetfeld benötigt, um die magnetischen Teilchen 2A in der Zellkulturlösung zu bewegen. In beiden Fällen besteht die Befürchtung, dass die Zellkulturlösung nicht ausreichend gerührt werden kann.
Das magnetische Teilchen 2A kann als Ganzes aus einem magnetischen Material bestehen. Vorzugsweise besteht es jedoch aus einem Komposit- oder Verbundmaterial, das man durch Mischen eines Harzmaterials und eines magnetischen Materials erhält. Indem das Mischungsverhältnis zwischen dem Harzmaterial und dem magnetischen Material geeignet eingestellt wird, kann die Dichte (spezifisches Gewicht) des magnetischen Teilchens 2A in einfacher Weise eingestellt werden. Außerdem liegt ein Vorteil darin, dass Form und Größe (z.B. mittlere Teilchengröße) des magnetischen Teilchens 2A einfach eingestellt werden können.
Wie in 3 gezeigt, hat das magnetische Teilchen (Komposit- oder Verbundteilchen) 2A vorzugsweise einen Aufbau, in dem ein magnetisches Material (magnetisches Pulver) 22 in einem aus einem Harzmaterial bestehenden Basiskörper 21 dispergiert, d.h. verteilt ist. Solche magnetischen Teilchen 2A können vergleichsweise einfach hergestellt werden, indem beispielsweise das das magnetische Material 22 enthaltende Harzmaterial im geschmolzenen Zustand in Teilchen geformt wird (Granulierung). In diesem Zusammenhang ist darauf hinzuweisen, dass das in Form des Verbundteilchens vorliegende magnetische Teilchen 2A auch einen Aufbau haben kann, in dem das magnetische Material 22 nur in der Nähe der Oberfläche des Basiskörpers 21 dispergiert ist.
Beispiele für das magnetische Material 22 sind eine ferromagnetische Legierung, die Eisenoxid, Fe, Li, Co oder dergleichen als Hauptbestandteil enthält, Ferrit, Bariumferrit, Strontiumferrit und dergleichen. Diese magnetischen Materialien können allein oder in Kombination von zwei oder mehr Materialien verwendet werden.
Für das Harzmaterial kann das gleiche Material wie das oben für den Basiskörper 11 des Zellkulturträgers 1A beschriebene Material verwendet werden.
Die mittlere Teilchengröße der magnetischen Teilchen 2A liegt vorzugsweise im Bereich von 10 bis 500 μm, noch besser im Bereich von etwa 100 bis 300 μm. Ist die mittlere Teilchengröße der magnetischen Teilchen 2A zu klein, so kann in der Zellkulturlösung eine turbulente Strömung nicht in ausreichendem Maße erzeugt werden. Ist dagegen die mittlere Teilchengröße der magnetischen Teilchen 2A zu groß, so wird ein starkes Magnetfeld benötigt, um die magnetischen Teilchen 2A in der Zellkulturlösung zu bewegen. In beiden Fällen ist zu befürchten, dass die Zellkulturlösung nicht ausreichend gerührt werden kann. Außerdem ist darauf hinzuweisen, dass bei einer zu geringen mittleren Teilchengröße der magnetischen Teilchen 2A die Befürchtung besteht, dass die magnetischen Teilchen 2A leicht agglomerieren.
Die Menge an magnetischen Teilchen 2A, die der Zellkulturlösung zuzugeben wird, ist nicht auf einen bestimmten Wert beschränkt. Vorzugsweise werden jedoch die magnetischen Teilchen 2A in einer Menge zugegeben, in der das Mischverhältnis zwischen den magnetischen Teilchen 2A und den Zellkulturträgern 1A im Bereich von etwa 10:90 bis 50:50 (insbesondere etwa 20:80 bis 40:60) in Vol.-% beträgt. Ist die der Zellkulturlösung zugegebene Menge an magnetischen Teilchen 2A zu klein, so ist zu befürchten, dass die Zellkulturlösung nicht ausreichend gerührt werden kann. Ist dagegen die der Zellkulturlösung zugegebene Menge an magnetischen Teilchen zu groß, so besteht die Befürchtung, dass die Kollisionsfrequenz zwischen den magnetischen Teilchen 2A und den Zellkulturträgern 1A so stark zunimmt, dass sich die Zellen von den Zellkulturträgern 1A lösen.
In 4 ist beispielhaft ein magnetisches Teilchen 2A mit einem modifizierten Aufbau gezeigt, bei dem zumindest ein Teil der Oberfläche (in 4 weitgehend die gesamte Oberfläche) des magnetischen Teilchens 2A mit einer Deckschicht 23 bedeckt ist, die eine Zellanhaftung ermöglicht. Das magnetische Teilchen 2A ermöglicht es Zellen, an seiner Oberfläche zu haften und zu wachsen. Dadurch wird die Effizienz des Zellwachstums weiter verbessert.
Die Deckschicht 23 hat den gleichen Aufbau wie die Deckschicht 12 des Zellkulturträgers 1A. Die Deckschicht 23 besteht also vorzugsweise hauptsächlich aus der Calciumphosphat-basierten Verbindung. Außerdem ist die Deckschicht 23 vorzugsweise aus feinen Teilchen 24 gebildet, die hauptsächlich aus der Calciumphosphat-basierten Verbindung bestehen und teilweise in einen Oberflächenbereich eingebettet sind, der die Oberfläche des magnetischen Teilchens umfasst und an diese angrenzt. Die Deckschicht 23 wird vorzugsweise in der Weise ausgebildet, dass poröse Teilchen, die hauptsächlich aus der Calciumphosphat-basierten Verbindung bestehen, mit der Oberfläche des magnetischen Teilchens 2A in Kollision gebracht werden.
Wird die Deckschicht 23 unter Verwendung der Calciumphosphat-basierten Verbindung als Hauptmaterial hergestellt, so fängt sie von dem magnetischen Material 22 erzeugte Metallionen ein und verhindert so die Eluierung dieser Metallionen in die Zellkulturlösung. Dadurch wird ein nachteiliger Einfluss auf die Zellen vermieden. Die Deckschicht 23 bildet also in diesem Fall eine Ionensperrschicht.
Zellkulturlösung
In den Verfahren zur Zellkultivierung nach erstem und zweitem Ausführungsbeispiel kann die gleiche Zellkulturlösung eingesetzt werden. Dabei wird eine Zellkulturlösung 140 in Abhängigkeit beispielsweise der zu verwendenden Zellart geeignet ausgewählt und sie ist nicht auf eine bestimmte Lösung beschränkt. Beispiele für eine verwendbare Zellkulturlösung sind Dulbecco's MEM, Nissui MEM, BME, MCDB-104 Medium und dergleichen.
Die Zellkulturlösung 140 enthält beispielsweise Serum, Serumprotein wie Albumin sowie nach Bedarf Zusätze wie z.B. verschiedenartige Vitamine, Aminosäure und Salze.
Im Folgenden wird unter Bezugnahme auf die 5 bis 9 eine Einrichtung zur Zellkultivierung beschrieben, die in den oben erläuterten Verfahren zur Zellkultivierung nach erstem und zweitem Ausführungsbeispiel verwendet werden kann.
Erstes Ausführungsbeispiel
Im Folgenden wird ein erstes Ausführungsbeispiel der Zellkultivierungseinrichtung beschrieben.
5 zeigt in einer schematischen, perspektivischen Darstellung eine Zellkultivierungseinrichtung 100 nach dem ersten Ausführungsbeispiel. 6 ist ein Zeitdiagramm, welches das Muster eines Magnetfeldes zeigt, das ein Magnetfeldgenerator 120 der Zellkultureinrichtung 100 erzeugt.
Die Zellkultivierungseinrichtung 100 nach 5 umfasst ein Kultivierungsgefäß 110, den vorstehend genannten Magnetfeldgenerator 120, eine Steuerung 130, und eine Heizvorrichtung 150. Die Steuerung 130 ist an eine Stromquelle ange schlossen, aus der elektrische Energie zugeführt wird, die zum Betrieb der einzelnen Komponenten der Kultivierungseinrichtung 100 erforderlich ist.
Das Kultivierungsgefäß 100 bildet eine Komponente zur Aufnahme der Zellkulturlösung 140 und hat an seinem oberen Teil eine Öffnung 111, durch welche die Zellkulturlösung 104 eingebracht und entnommen wird. Die Öffnung 111 wird nach Bedarf mit einem Stöpsel 112 verschlossen, um die Luftdichtigkeit innerhalb des Kultivierungsbehälters 110 zu gewährleisten.
Form, Fassungsvermögen sowie weitere Eigenschaften des Kultivierungsbehälters 110 unterliegen keinen besonderen Beschränkungen und werden je nach der zu verwendenden Zellart, der Art der Zellkulturlösung 140 und dergleichen geeignet festgelegt.
Der Magnetfeldgenerator 120 bildet eine Komponente zum Erzeugen eines Magnetfeldes, um die in dem Zellkultivierungsverfahren nach erstem Ausführungsbeispiel verwendeten Zellkulturträger 1 oder die in dem Zellkultivierungsverfahren nach zweitem Ausführungsbeispiel verwendeten magnetischen Teilchen 2A in der Zellkulturlösung 140 zu bewegen. Der Magnetfeldgenerator 120 hat einen Elektromagneten 121 und eine nicht-magnetische Abdeckung (nicht gezeigt), in der der Elektromagnet 121 aufgenommen ist.
In dem vorliegenden Ausführungsbeispiel besteht der Elektromagnet 121 aus einem ringförmigen, metallischen Kernmaterial 122 und einem Leiter 123, der spiralig um die Außenfläche des Kernmaterials 122 gewickelt ist. Der elektrische Stromfluss durch die Leiter 123 erzeugt ein Magnetfeld in der Nähe des Leiters 123.
Die nicht-magnetische Abdeckung dient dem Schutz und der Fixierung des Elektromagneten 121 und kann aus verschiedenartigen Harzmaterialien bestehen, z.B. einem Acryl-basierten Harz oder einem Silikon-basierten Harz.
Das Kultivierungsgefäß 110 befindet sich innerhalb des Magnetfeldgenerators 120. Dabei umgibt der Magnetfeldgenerator 120 die Außenfläche des Kultivierungsgefäßes 110. Der Magnetfeldgenerator 120 ist über ein nicht gezeigtes Befestigungselement fixiert und gehalten. Der Magnetfeldgenerator 120 befindet sich in vertikaler Richtung des Kultivierungsgefäßes 110 vorzugsweise in einer Höhe nahe der Oberfläche der Zellkulturlösung 140, wenn diese in dem Kultivierungsgefäß 110 gespeichert (aufgenommen) ist. Indem die Position des Magnetfeldgenerators 120 auf eine solche Höhe eingestellt wird, können die Zellkulturträger 1 oder die magnetischen Teilchen 2A in vertikaler Richtung weitläufig bewegt werden, so dass die Zellkulturlösung 140 besonders gleichmäßig umgerührt werden kann.
Der Abstand zwischen dem Magnetfeldgenerator 120 und dem Kultivierungsgefäß 110, der in 5 mit d bezeichnet ist, unterliegt keiner besonderen Einschränkung. Vorzugsweise ist jedoch der Magnetfeldgenerator 120 so nah wie möglich an dem Kultivierungsgefäß 110 angeordnet. Dabei sind die genannten Komponenten vorzugsweise so angeordnet, dass sie in (engen) Kontakt miteinander kommen.
Der Magnetfeldgenerator 120 ist so ausgebildet, dass er die Intensität des erzeugten Magnetfeldes mit der Zeit ändern kann. Ein Beispiel für das Muster eines durch den Magnetfeldgenerator 120 zu erzeugenden Magnetfeldes ist in 6(a) gezeigt, wo das Magnetfeld in regelmäßigen Intervallen intermittierend erzeugt wird. Mit Erzeugen eines Magnetfeldes werden die Zellkulturträger 1 oder die magnetischen Teilchen 2A zur Seite des Magnetfeldgenerators 120 hin angezogen, so dass die Zellkulturträger 1 oder die magnetischen Teilchen 2A in der Zellkulturlösung 140 aufsteigen. In diesem Zustand wird die Magnetfelderzeugung gestoppt, so dass sich die Zellkulturträger 1 oder die magnetischen Teilchen 2A, die zur Seite des Magnetfeldgenerators 120 hin angezogen worden sind, unter ihrem Eigengewicht absetzen. Indem wiederholt eine solche vertikale Bewegung der Zellkulturträger 1 oder der magnetischen Teilchen 2A bewirkt wird, wird eine turbulente Strömung in der Zellkulturlösung 140 erzeugt, so dass die Zellkulturlösung 140 gleichmäßig und sanft umgerührt wird.
Die Maximalintensität (Absolutwert) des Magnetfeldes wird in Abhängigkeit der Dichte (spezifisches Gewicht) des jeweiligen Zellkulturträgers 1 oder des magnetischen Teilchens 2A, in Abhängigkeit der Zusammensetzung und des Volumens der Zellkulturlösung 140 und dergleichen geeignet festgelegt. Sie ist nicht auf einen bestimmten Wert beschränkt, liegt jedoch vorzugsweise im Bereich von etwa 0,1 bis 100 Wb/m², noch besser im Bereich von etwa 0,2 bis 50 Wb/m². Ist die Maximalintensität des magnetischen Feldes (magnetische Flussdichte) zu gering, so ist zu befürchten, dass die Zellkulturträger 1 oder die magnetischen Teilchen 2A nicht ausreichend zur Seite des Magnetfeldgenerators 120 hin angezogen werden, so dass die Zellkulturlösung 140 nicht ausreichend umgerührt wird. Liegt dagegen die Maximalintensität des Magnetfeldes über dem vorstehend genannten oberen Grenzwert, so ist zu befürchten, dass das Magnetfeld möglicherweise einen schädlichen Einfluss auf die Zellen hat. Außerdem wird elektrische Energie vergeudet.
Das Muster des Magnetfeldes, das der Magnetfeldgenerator 120 erzeugt, ist nicht auf das in 6(a) gezeigte Muster beschränkt, nach dem das Magnetfeld intermittierend in regelmäßigen Intervallen erzeugt wird. Verwendbar sind beispielsweise auch ein Muster, bei dem die Intensität des zu erzeugenden Magnetfeldes nach 6(b) in regelmäßigen Intervallen erhöht und verringert wird, ein Muster, bei dem beispielsweise die Intensität, die Richtung oder dergleichen des zu erzeugenden Magnetfeldes nach 6(c) kontinuierlich geändert werden, oder andere Muster. Diese Muster können nach Wunsch miteinander kombiniert werden.
Die Steuerung 130 hat die Funktion, die Zustände (z.B. Art, Stärke, Richtung, Zeit, Frequenz, etc.) des von der Stromquelle zugeführten elektrischen Stroms zu ändern. Die Steuerung 130 wandelt den von der Stromquelle zugeführten elektrischen Strom in einen Strom, der vorbestimmte Bedingungen erfüllt (elektrischer Strom mit einem vorbestimmten Muster), und führt diesen gewandelten elektrischen Strom dem Elektromagneten 121 des Magnetfeldgenerators 120 zu. Erzeugt beispielsweise der Magnetfeldgenerator 120 das Magnetfeld intermittierend, so wandelt die Steuerung 120 einen von der Stromquelle zugeführten Wechselstrom in einen gepulsten Strom und führt diesen gepulsten Strom dem Elektromagneten 121 zu.
Die Heizvorrichtung 150 ist elektrisch mit der Steuerung 130 verbunden. Die Heizvorrichtung 150 umfasst beispielsweise eine Heizung, ein Pettier-Element oder dergleichen und erhitzt die Zellkulturlösung 140 unter der Kontrolle der Steuerung 130.
Im Folgenden wird die Funktionsweise der Zellkultivierungseinrichtung 100, d.h. das mit dieser Einrichtung arbeitende Zellkultivierungsverfahren, beschrieben.
<1> Zunächst werden die Zellkulturträger 1 (in dem Zellkultivierungsverfahren nach erstem Ausführungsbeispiel) oder die Zellkulturträger 1A und die magnetischen Teilchen 2A (in den Zellkultivierungsverfahren nach zweitem Ausführungsbeispiel) einer Sterilisierung unterzogen. Dadurch werden Mikroorganismen oder Schimmelpilze, die auf den Oberflächen der Zellkulturträger 1, 1A und gegebenenfalls den magnetischen Teilchen 2A vorhanden sind, in ihrer Zahl reduziert oder sogar vollständig abgetötet. Die Gefahr, dass Mikroorganismen oder Schimmelpilze die Zellen schädigen, ist so verringert oder gar ausgeschlossen, wodurch ein besonders effizientes Zellwachstum möglich wird.
Zur Sterilisierung wird beispielsweise ein Verfahren, in dem die Zellkulturträger 1, 1A und gegebenenfalls die magnetischen Teilchen 2A in Kontakt mit sterilisierenden Lösungen gebracht werden, eine Autoklav-Sterilisierung, eine Gas-Sterilisierung, eine Strahlungs-Sterilisierung oder dergleichen angewandt. Unter diesen Verfahren ist das Verfahren, bei dem die Zellkulturträger 1, 1A und gegebenenfalls die magnetischen Teilchen 2A in Kontakt mit einer sterilisierenden Lösung gebracht werden, besonders geeignet. Mit einem solchen Verfahren ist es nämlich möglich, eine große Zahl an Zellkulturträgern 1, 1A und gegebenenfalls magnetischen Teilchen 2A wirksam zu sterilisieren.
Bei Anwendung einer sterilisierenden Lösung werden die Zellkulturträger 1, 1A und gegebenenfalls die magnetischen Teilchen 2A nach der Sterilisierung gewaschen, um die sterilisierende Lösung, die an den Oberflächen der Zellkulturträger 1, 1A und gegebenenfalls der magnetischen Teilchen 2A haften, zu entfernen.
<2> Nach Abschluss des oben beschriebenen Prozesses <1> werden die Zellkulturträger 1, 1A und gegebenenfalls die magnetischen Teilchen 2A sowie Zellen (die an den Trägern 1A und den magnetischen Teilchen 2A haften sollen) der Zellkulturlösung 140 zugegeben oder zugemischt. Die so erhaltene Zellkulturlösung 140 wird anschließend in das Kultivierungsgefäß 110 der Zellkultivierungseinrichtung 100 eingebracht.
Im Vorfeld wurde beispielsweise ein Shuttle-Vektor (Vektor), der ein ein Zielprotein-codierendes Gen enthält, in jede Zelle eingebracht.
Beispiele für die verwendete Zelle sind eine Tierzelle, eine Pflanzenzelle, ein Bakterium und ein Virus. Von diesen Zellen ist eine Tierzelle besonders geeignet. Die Verwendung einer Tierzelle ermöglicht die Anwendung der Erfindung in weiten technischen Gebieten. Soll außerdem ein Protein erzeugt werden, so kann eines mit einer komplexeren Struktur (z.B. Glykoprotein) hergestellt werden.
<3> Wie oben beschrieben, beaufschlagt der Magnetfeldgenerator die Zellkulturlösung 140 bei Inbetriebnahme der Zellkultivierungseinrichtung 100 mit einem Magnetfeld, das ein vorbestimmtes Muster aufweist. Dadurch werden die Zellkulturträger 1, 1A und gegebenenfalls die magnetischen Teilchen 2A in der Zellkulturlösung 140 bewegt und durch diese Bewegung die Zellkulturlösung 140 umgerührt, so dass die Zellkulturträger 1, 1A und gegebenenfalls die magnetischen Teilchen 2A gleichmäßig in der Zellkulturlösung suspendiert werden.
Die Zellkulturlösung 140 wird dabei mit der Heizvorrichtung 150 erwärmt. Die Temperatur der Zellkulturlösung 140 wird beispielsweise in Abhängigkeit der zu kultivierenden Zellart etc. geeignet festgelegt und ist nicht auf einen bestimmten Wert beschränkt. Üblicherweise liegt die Temperatur im Bereich von etwa 4 bis 40°C, noch besser im Bereich von etwa 25 bis 37°C.
Unter solchen Bedingungen haften die Zellen an den Oberflächen der Zellkulturträger 1, 1A und gegebenenfalls der magnetischen Teilchen 2A in der Zellkulturlösung 140. Da die Zellkulturlösung 140 durch die Bewegung der magnetischen Teilchen 2A gleichmäßig und sanft gerührt wird, können die Zellen mit hoher Effizienz kultiviert werden.
Die gewachsenen Zellen erzeugen dann ein Zielprotein. Dieses Protein wird beispielsweise in die Zellkulturlösung 140 freigesetzt oder in den Zellen gesammelt.
Die Zellkultivierung kann nach Bedarf unter Zufuhr eines Sauerstoff enthaltenden Gases durchgeführt werden.
<4> Das erzeugte Protein wird anschließend gesammelt. Wird das Protein in die Zellkulturlösung 140 freigesetzt, so kann es beispielsweise folgendermaßen gesammelt werden.
In obigem Prozess <3> wird das Rühren der Zellkulturlösung 140 gestoppt und dann ein Überstand gesammelt, nachdem sich die Zellkulturträger 1, 1A und gegebenenfalls die magnetischen Teilchen 2A in der Zellkulturlösung 140 nach unten abgesetzt haben. Alternativ kann die Zellkulturlösung 140 gefiltert werden, um so das resultierende Filtrat zu sammeln. Die gesammelte Lösung (Überstand oder Filtrat) wird dann in vorbestimmter Weise behandelt (z.B. Chromatografie), wodurch das Zielprotein in einfacher Weise gesammelt werden kann.
Zweites Ausführungsbeispiel
Im Folgenden wird eine Zellkultivierungseinrichtung nach einem zweiten Ausführungsbeispiel beschrieben.
7 ist eine schematische, perspektivische Darstellung der Zellkultivierungseinrichtung 100 nach zweitem Ausführungsbeispiel.
Das zweite Ausführungsbeispiel wird im Folgenden im Hinblick auf seine Unterschiede gegenüber dem ersten Ausführungsbeispiel beschrieben. Übereinstimmende Merkmale werden nicht nochmals beschrieben.
Die Zellkultivierungseinrichtung 100 nach 7 und die Zellkultivierungseinrichtung 100 nach erstem Ausführungsbeispiel sind abgesehen vom Aufbau des Magnetfeldgenerators 120 gleich.
Der Magnetfeldgenerator 120 nach zweitem Ausführungsbeispiel umfasst den Elektromagneten 121, der dadurch gebildet ist, dass der Leiter 123 spiralig um die Außenfläche eines geraden (zylindrischen) Kernmaterials 122 gewickelt ist. Der Magnetfeldgenerator 120 ist vorzugsweise mit einer wasserfesten Abdeckung bedeckt, die hauptsächlich aus einem Material besteht, das ein Magnetfeld unbeeinflusst lässt.
Der Magnetfeldgenerator 120 wird dadurch fixiert, dass er durch den an dem Kultivierungsgefäß 110 anzubringenden Stöpsel 112 geführt wird. In diesem Ausführungsbeispiel ist der Magnetfeldgenerator 120 so angeordnet, dass er sich während der Zellkultivierung in Kontakt mit der Zellkulturlösung 140 befindet.
Das Muster des von dem Magnetfeldgenerator 120 zu erzeugenden Magnetfeldes kann beispielsweise eines der in 6 gezeigten, oben beschriebenen Muster sein.
Die Zellkultivierungseinrichtung 100 nach zweitem Ausführungsbeispiel weist die gleiche Funktion und Wirkung wie die des ersten Ausführungsbeispiels auf.
Drittes Ausführungsbeispiel
Im Folgenden wird eine Zellkultivierungseinrichtung 100 nach einem dritten Ausführungsbeispiel beschrieben.
8 ist eine schematische, perspektivische Darstellung, welche die Zellkultivierungseinrichtung 100 nach drittem Ausführungsbeispiel zeigt. 9 ist ein Zeitdiagramm, welches die Muster eines von dem Magnetfeldgenerator 120 zu erzeugenden Magnetfeldes zeigt.
Das dritte Ausführungsbeispiel wird im Folgenden im Hinblick auf seine Unterschiede gegenüber dem ersten Ausführungsbeispiel beschrieben. Übereinstimmende Merkmale werden deshalb nicht nochmals beschrieben.
Die Zellkultivierungseinrichtung 100 nach 8 und die Zellkultivierungseinrichtung 100 nach erstem Ausführungsbeispiel sind abgesehen vom Aufbau des Magnetfeldgenerators 120 gleich.
Der Magnetfeldgenerator 120 nach drittem Ausführungsbeispiel hat mehrere, z.B. vier Elektromagnete 121A bis 121D.
Die Elektromagnete 121A bis 121D sind in Umfangsrichtung des Kultivierungsgefäßes 110 in etwa gleichen Abständen voneinander angeordnet.
Dieser Aufbau ermöglicht es durch sukzessives Umschalten unter den elektrisch zu speisenden Elektromagneten 121A bis 121D, d.h. durch Ändern der Anordnung des zu erzeugenden Magnetfeldes mit der Zeit, das Bewegungsmuster der Zellkulturträger 1, 1A und gegebenenfalls der magnetischen Teilchen 2A in der Zellkulturlösung 140 komplizierter zu gestalten. Dadurch können die Zellkulturträ ger 1, 1A und gegebenenfalls die magnetischen Teilchen 2A noch gleichmäßiger in der Zellkulturlösung 140 suspendiert werden, was im Ergebnis zu einem noch effizienteren Zellwachstum führt.
Ein Beispiel für das Muster des durch die einzelnen Elektromagneten 121A bis 121D erzeugten Magnetfeldes (Umschalten zwischen den elektrisch zu speisenden Elektromagneten 121A bis 121D) ist in 9 gezeigt. Dabei erzeugt eines der Elektromagneten ein Magnetfeld, während die anderen Elektromagneten gerade kein Magnetfeld erzeugen. Die Umschaltung unter den Elektromagneten erfolgt in der Weise, dass ein Magnetfeld sukzessive (synchron) erzeugt wird. Dadurch ist es möglich, die Zellkulturträger 1, 1A und gegebenenfalls die magnetischen Teilchen 2A entlang der Innenfläche des Kultivierungsgefäßes 110 zu bewegen. Das Muster des von den Elektromagneten 121A bis 121D zu erzeugenden Magnetfeldes ist nicht auf das in 9 gezeigte Muster beschränkt. Es kann beispielsweise auch ein Muster zur Anwendung kommen, das sich durch wahlweises Kombinieren der in 6 gezeigten Muster ergibt.
Die Elektromagnete 121A bis 121D können, was beispielsweise die Windungszahl des Leiters 123, ihre Gesamtform oder ihre Gesamtgröße betrifft, untereinander gleich oder aber verschieden voneinander ausgebildet sein.
Die Zellkultivierungseinrichtung 100 nach drittem Ausführungsbeispiel weist die gleiche Funktion und technische Wirkung wie die des ersten Ausführungsbeispiels auf.
Die Erfindung ist nicht auf die oben beschriebenen Zellkultivierungseinrichtungen beschränkt, so lange die Einrichtungen die beabsichtigen Funktionen erzielen. An diesen Einrichtungen können verschiedenartige Änderungen und Ergänzungen vorgenommen werden. Außerdem können die Merkmale von zwei oder mehreren der oben beschriebenen Ausführungsbeispiele nach Belieben miteinander kombiniert werden.
In den oben beschriebenen Ausführungsbeispielen ist jeweils der Magnetfeldgenerator fixiert. Der Magnetfeldgenerator und das Kultivierungsgefäß können jedoch auch relativ zueinander bewegbar sein, um die Anordnung des auf die Zellkulturlösung wirkenden Magnetfeldes mit der Zeit zu ändern. Beispielsweise kann der Magnetfeldgenerator gegenüber dem Kultivierungsgefäß in vertikaler oder horizontaler Richtung bewegt werden. Er kann auch auf das Kultivierungsgefäß zu oder von diesem weg oder aber entlang dessen Umfangsrichtung bewegt werden. Auch können diese Bewegungen des Magnetfeldes miteinander kombiniert werden.
Außerdem kann die Erfindung vorsehen, dass der Magnetfeldgenerator die Intensität des auf die Zellkulturlösung anzuwendenden Magnetfeldes zeitlich gemäß den oben beschriebenen Mustern ändert, während er relativ zu dem Kultivierungsgefäß bewegt wird, um auch die Anordnung des auf die Zellkulturlösung anzuwendenden Magnetfeldes zeitlich zu ändern.
In den Ausführungsbeispielen umfasst der Magnetfeldgenerator den Elektromagneten. An Stelle des Elektromagneten können jedoch auch Permanentmagnete verwendet werden. In diesem Fall ist der Magnetfeldgenerator zusätzlich mit einem Verstellmechanismus ausgestattet, um die Permanentmagnete relativ zu dem Kultivierungsgefäß zu bewegen, so dass die Zellkulturträger und/oder die magnetischen Teilchen infolge der Bewegung der Permanentmagnete in der Zellkulturlösung bewegt werden. Die Permanentmagnete können dabei in unterschiedlichen Richtungen bewegt werden. z.B. nach oben und nach unten, nach rechts und nach links, schräg und in Umfangsrichtung sowie in einer beliebigen Kombination dieser Richtungen.
Außerdem können in den oben beschriebenen Zellkultivierungsverfahren nach erstem und zweitem Ausführungsbeispiel auch andere Zellkulturträger zusammen mit den oben beschriebenen Zellkulturträgern verwendet werden. Solche andere Zellkulturträger sind beispielsweise Träger, die aus einem Material bestehen, das als Hauptbestandteil Polystyrol, Polyacrylamid, Cellulose, Dextran und derglei chen enthält, und Träger, die jeweils aus einem hauptsächlich aus einem Harzmaterial bestehenden Basiskörper und einer Deckschicht gebildet sind, welche die Oberfläche des Basiskörpers bedeckt und aus einem Material besteht, das eine Zellanhaftung ermöglicht.
Beispiele
Im Folgenden werden praktische Beispiele für die Zellkultivierungsverfahren nach erstem und zweitem Ausführungsbeispiel beschrieben.
Zellkultivierungsverfahren nach erstem Ausführungsbeispiel 1. Zubereitung der Zellkulturträger I-A
Zunächst wurden 50 g Nylon-Teilchen (Basiskörper) mit einem mittleren Teilchendurchmesser von 150 μm und einer Dichte von 1,90 g/cm³ sowie 0,25 g Hydroxylapatit-Teilchen (durch Agglomeration von Primärteilchen erhaltene poröse Teilchen) mit einem Ca/P-Verhältnis von 1,67 und einem mittleren Teilchendurchmesser von 10 μm zubereitet.
Die Hydroxylapatit-Teilchen hatten jeweils eine spezifische Oberfläche von 45 m²/g und einen Porendurchmesser von 600 Å.
Anschließend wurden die Nylon-Teilchen und die Hydroxylapatit-Teilchen in ein System mit der Bezeichnung NARA HYBRIDIZATION SYSTEM NHS-1 (von Nara Machinery Co., Ltd., Nennleistung 5,5 kW, Nennstrom 23 A) eingebracht. Dieses System wurde 5 Minuten mit 6400 U/min bei 32 bis 50°C betrieben. Auf diese Weise wurden mit Hydroxylapatit bedeckte Zellkulturträger I-A mit dem in 1 gezeigten Aufbau hergestellt.
Die so hergestellten Zellkulturträger I-A hatten eine mittlere Teilchengröße von 151 μm (die mittlere Dicke der Deckschicht aus Hydroxylapatit betrug 1 μm) und eine Dichte von 1,92 g/cm³.
Zellkulturträaer I-B
Zunächst wurden 50 g Nylon-Teilchen (Basiskörper) mit einer mittleren Teilchengröße von 150 μm und einer Dichte von 1,02 g/cm³ sowie 0,25 g Hydroxylapatit-Teilchen (durch Agglomeration von Primärteilchen erhaltene poröse Teilchen) mit einem Ca/P-Verhältnis von 1,67 und einer mittleren Teilchengröße von 10 μm zubereitet.
Die Hydroxylapatit-Teilchen hatten jeweils eine spezifische Oberfläche von 45 m²/g und einen Porendurchmesser von 600 Å.
Anschließend wurden die Nylon-Teilchen und die Hydroxylapatit-Teilchen in das System NARA HYBRIDISATION SYSTEM NHS-1 (von Nara Machinery Co., Ltd., Nennleistung 5,5 kW, Nennstrom 23 A) eingebracht. Anschließend wurde dieses System 5 Minuten mit 6400 U/min bei 32 bis 50°C betrieben. Auf diese Weise wurden mit Hydroxylapatit beschichtete Zellkulturträger I-B mit dem in 1 gezeigten Aufbau hergestellt.
Die so hergestellten Zellkulturträger I-B hatten eine mittlere Teilchengröße von 151 μm (die mittlere Dicke der Deckschicht aus Hydroxylapatit betrug 1 μm) und eine Dichte von 1,03 g/cm³.
Zellkulturträger I-C
Es wurden Dextran-Teilchen mit einer mittleren Teilchengröße von 200 μm und einer Dichte von 1,03 g/cm³ (gefertigt von Pharmacia) als Zellkulturträger I-C bereitgestellt.
2. Zellkultur
2-1 Zellkultur, abgeleitet aus menschlichem Osteosarkom (HOS)
Diese aus dem menschlichen Osteosarkom abgeleitete Zelle hat eine maximale Länge von etwa 20 μm.
Beispiel 1a-1
1,5 g der Zellkulturträger I-A und 30 mL einer Suspension, die 2 × 10⁵ aus menschlichem Osteosarkom (HOS) abgeleitete Zellen je Milliliter (/mL) enthielt, wurden einer Menge von 100 mL einer Zellkulturlösung mit der Bezeichnung Nissui MEM zugegeben. Es ist darauf hinzuweisen, dass 10 Vol.-% fötales Rinderserum der Zellkulturlösung Nissui MEM zugegeben wurden.
Diese Zellkulturlösung wurde in ein Kultivierungsgefäß (hitzebeständiges Glasgefäß von IWAKI-PYREX) einer Zellkultivierungseinrichtung nach 5 eingebracht, worauf die Zellkultivierung erfolgte. Als Kultivierungsbedingungen wurden das in 6(a) gezeigte Muster der Magnetfelderzeugung, ein Impulsintervall von 2 Sekunden, eine Temperatur der Zellkulturlösung von 37°C und ein Kultivierungszeitraum von 5 Tagen festgelegt.
Beispiel Ia-2
Die Zellkultivierung wurde in gleicher Weise wie in Beispiel Ia-1 vorgenommen, abgesehen davon, dass das Impulsintervall auf 10 Sekunden geändert wurde.
Beispiel Ia-3
Die Zellkultivierung wurde in gleicher Weise wie in Beispiel Ia-1 vorgenommen, abgesehen davon, dass die 1,5 g der Zellkulturträger I-A durch 0,6 g der Zellkulturträger I-A und 0,8 g der Zellkulturträger I-B ersetzt wurden.
Beispiel Ia-4
Die Zellkultivierung wurde in gleicher Weise wie in Beispiel Ia-1 vorgenommen, abgesehen davon, dass die 1,5 g der Zellkulturträger I-A durch 0,6 g der Zellkulturträger I-A um 0,8 g der Zellkulturträger I-C ersetzt wurden.
Vergleichsbeispiel Ia-1
Es wurden 1,5 g der Zellkulturträger I-B und 30 mL einer Suspension, die 2 × 10⁵ Zellen, abgeleitet aus menschlichem Osteosarkom (HOS), je mL (/mL) enthielt, einer Menge von 100 mL der Zellkulturlösung Nissui MEM zugegeben. Dabei wurden 10 Vol-% fötales Rinderserum der Zellkulturlösung Nissui MEM zugegeben.
Diese Zellkulturlösung wurde in eine Schleuderflasche (von Shibata Scientific Technology Ltd.) eingebracht, worauf die Zellkultivierung erfolgte. Als Kultivierungsbedingungen wurden eine Rotationsgeschwindigkeit des Rührankers von 30 U/min, eine Temperatur der Zellkulturlösung von 37°C und ein Kultivierungszeitraum von 5 Tagen festgelegt.
Vergleichsbeispiel Ia-2
Es wurde eine Zellkultivierung in gleicher Weise wie in Vergleichsbeispiel Ia-1 durchgeführt, abgesehen davon, dass die Rotationsgeschwindigkeit des Rührankers auf 60 U/min geändert wurde.
Vergleichsbeispiel Ia-3
Es wurde eine Zellkultivierung in gleicher Weise wie in Vergleichsbeispiel Ia-1 durchgeführt, abgesehen davon, dass die Zellkulturträger I-B durch die z Kontaktflächen 1-C ersetzt wurden.
2-2 Zellkultur, abgeleitet von Affenniere (Verozellen)
Diese Zelle ist aus einer Affenniere abgeleitet und hat eine maximale Länge von etwa 20 μm.
Beispiele Ib-1 bis Ib-4 und Vergleichsbeispiele Ib-1 bis Ib-3
Die Zellkultivierung erfolgte in gleicher Weise wie in den Vergleichsbeispielen Ia-1 bis Ia-4 und in den Vergleichsbeispielen Ia-1 bis Ia-3, abgesehen davon, dass die aus dem menschlichen Osteosarkom abgeleiteten Zellen durch die aus einer Affenniere abgeleiteten Zellen ersetzt wurden.
2-3 Zellkultur, abgeleitet von Stechmücke (C6/36)
Diese von einer Steckmücke (Moskito) abgeleitete Zelle hat eine maximale Länge von etwa 20 um.
Beispiele Ic-1 bis Ic-4 und Vergleichsbeispiele Ic-1 bis Ic-3
Die Zellkultivierung erfolgte in gleicher Weise wie in den Beispielen Ia-1 bis Ia-4 und den Vergleichbeispielen Ia-1 bis Ia-3, abgesehen davon, dass die aus dem menschlichen Osteosarkom abgeleiteten Zellen durch die aus einer Stechmücke abgeleiteten Zellen ersetzt wurden.
3. Bewertung
In jedem der Beispiele sowie der Vergleichsbeispiele wurde eine vorbestimmte Menge der Zellkulturlösung nach 3 Stunden, 1 Tag, 3 Tagen und 5 Tagen seit Beginn der Kultivierung (Rührbeginn) als Probe entnommen und die Zahl der Zellen ermittelt, die an den Oberflächen der Zellkulturträger (15 mg) hafteten. Die Zellen wurden gezählt, indem die mit EDTA oder Trypsin behandelten Zellen mit Trypanblau verfärbt wurden.
Die Ergebnisse sind in den Tabellen 1 bis 3 angegeben.
Tabelle 1 (aus menschlichem Osteosarkom (HOS) abgeleitete Zellen)
Tabelle 2 (aus Affenniere abgeleitete Zellen (Verozellen))
Tabelle 3 (aus Stechmücke abgeleitete Zellen (C6/36))
Wie aus den Tabellen hervorgeht, weisen alle erfindungsgemäßen Beispiele ungeachtet der Zellart eine höher Zellkultivierungseffizienz als die Vergleichsbeispiele auf.
Auch eine Änderung des Impulsintervalls des auf die Magnetfelderzeugung bezogenen Musters führte in den erfindungsgemäßen Beispielen zu keiner besonders großen Variation der Zellwachstumseffizienz. Daraus wird deutlich, dass es nicht erforderlich ist, die Kultivierungsbedingungen in Abhängigkeit beispielsweise der Zellart in den erfindungsgemäßen Beispielen streng genau einzustellen.
Dagegen zeigten die Vergleichsbeispiele, in denen zur Kultivierung eine Schleuderflasche verwendet wurde, in Abhängigkeit der Rotationsgeschwindigkeit des Rührankers eine große Variation der Zellkultivierungseffizienz. In den Vergleichsbeispielen variierte also der Zustand des Zellwachstums ungeachtet der Zellart in Abhängigkeit der Rotationsgeschwindigkeit des Rührankers stark. Daraus geht hervor, dass die Optimierung der Kultivierungsbedingungen äußerst schwierig ist. Außerdem stellte sich in den Vergleichsbeispielen heraus, dass sich die Zellen von den Zellkulturträgern lösten.
Die in den oben beschriebenen erfindungsgemäßen Beispielen vorgenommenen Zellkultivierungen wurden auch unter Verwendung der Zellkultivierungseinrichtungen nach den 5, 7 und 8 sowie unter Variation des Magnetfeldmusters durchgeführt. Die Ergebnisse waren die gleichen wie die oben beschriebenen.
Zellkultivierungsverfahren nach zweitem Ausführungsbeispiel
1. Zubereitung der Zellkulturträger und der magnetischen Teilchen
Zellkulturträger II-A
Zunächst wurden 50 g Nylon-Teilchen (Basiskörper) mit einer mittleren Teilchengröße von 150 μm und einer Dichte von 1,02 g/cm³ sowie 0,25 g Hydroxylapatitteilchen (durch Agglomeration von Primärteilchen erzeugte poröse Teilchen) mit einem Ca/P-Verhältnis von 1,67 und einer mittleren Teilchengröße von 10 μm zubereitet.
Die Hydroxylapatitteilchen hatten jeweils eine spezifische Oberfläche von 45 m²/g und einen Porendurchmesser von 600 Å.
Anschließend wurden die Nylon-Teilchen und die Hydroxylapatitteilchen in das System mit der Bezeichnung NARA HYBRIDIZATION SYSTEM NHS-1 (von Nara Machinery Co., Ltd., Nennleistung von 5,5 kW, Nennstrom 23A) eingebracht. Das System wurde dann 5 Minuten mit 6400 U/min bei 32 bis 50°C betrieben. Auf diese Weise wurden mit Hydroxylapatit versehene Zellkulturträger II-A mit dem in 2 gezeigten Aufbau hergestellt.
Der so hergestellte Zellkulturträger II-A hatte eine mittlere Teilchengröße von 151 μm (die mittlere Dicke der Deckschicht aus Hydroxylapatit betrug 1 μm) und eine Dichte von 1,03 g/cm³.
Zellkulturträger II-B
Es wurden Dextran-Teilchen mit einer mittleren Teilchengröße von 200 μm und einer Dichte von 1,03 g/cm³ (gefertigt von Pharmacia) als Zellkulturteilchen II-B zubereitet.
Zellkulturträger II-C
Es wurden Nylon-Teilchen mit einem mittleren Teilchendurchmesser von 150 μm und einer Dichte von 1,02 g/cm³ als Zellkulturträger II-C zubereitet.
Magnetische Teilchen II-A
Es wurden Ferrit/Nylon-Verbundteilchen mit dem in 3 gezeigten Aufbau sowie mit einer mittleren Teilchengröße von 150 μm und einer Dichte von 1,90 g/cm³ als magnetischen Teilchen II-A zubereitet.
Magnetische Teilchen II-B
Zunächst wurden 50 g Ferrit/Nylon-Verbundteilchen mit einer mittleren Teilchengröße von 150 μm und einer Dichte von 1,90 g/cm³ sowie 0,25 g Hydroxylapatitteilchen (durch Agglomeration von Primärteilchen erhaltene poröse Teilchen) mit einem Ca/P-Verhältnis von 1,67 und einer mittleren Teilchengröße von 10 μm zubereitet.
Die Hydroxylapatitteilchen hatten eine spezifische Oberfläche von 45 m²/g und einen Porendurchmesser von 600 Å.
Anschließend wurden die Ferrit/Nylon-Verbundteilchen und die Hydroxylapatitteilchen in das System mit der Bezeichnung NARA HYBRIDISATION SYSTEM NHS-1 (von Nara Machinery Co., Ltd., Nennleistung 5,5 kW, Nennstrom 23 A) eingebracht. Dieses System wurde dann 5 Stunden mit 6400 U/min bei 32 bis 50°C betrieben. Auf diese Weise wurden mit Hydroxylapatit beschichtete magnetischen Teilchen II-B hergestellt.
Die so hergestellten magnetischen Teilchen II-B hatten eine mittlere Teilchengröße von 151 μm (die mittlere Dicke der Deckschicht aus Hydroxylapatit betrug 1,0 μm) und eine Dichte von 1,93 g/cm³.
2. Zellkultur
2-1 Zellkultur, abgeleitet aus menschlichem Osteosarkom (HOS)
Diese aus menschlichem Osteosarkom abgeleitete Zelle hat eine Maximallänge von etwa 20 μm.
Beispiel IIa-1
Es wurden 0,8 g der Zellkulturträger II-A, 0,6 g der magnetischen Teilchen II-A sowie 30 mL einer Suspension, die je Milliliter (/mL) 2 × 10⁵ aus menschlichem Osteosarkom (HOS) abgeleitete Zellen enthielt, einer Menge von 100 mL der Zellkulturlösung Nissui MEM zugegeben. Dabei wurden auch 10 Vol.-% fötales Rinderserum der Zellkulturlösung Nissui MEM zugegeben. Das Volumenverhältnis zwischen den Zellkulturträger II-A und den magnetischen Teilchen II-A betrug 70:30.
Diese Zellkulturlösung wurde in ein Kultivierungsgefäß (wärmebeständiges Glasgefäß von IWAKI-PYREX) einer Zellkultivierungseinrichtung nach 5 eingebracht, worauf die Zellkultivierung durchgeführt wurde. Als Kultivierungsbedingungen wurden das in 6(a) gezeigte Muster der Magnetfelderzeugung, ein Impulsintervall von 2 Sekunden, eine Temperatur der Zellkulturlösung von 37°C sowie ein Kultivierungszeitraum von 5 Tagen festgelegt.
Beispiel IIa-2
Die Zellkultivierung erfolgte in gleicher Weise wie in Beispiel IIa-1, mit Ausnahme, dass das Impulsintervall auf 10 Sekunden geändert wurde.
Beispiel IIa-3
Die Zellkultivierung erfolgte in gleicher Weise wie in Beispiel I-A, abgesehen davon, dass die magnetischen Teilchen II-A durch die magnetischen Teilchen II-B ersetzt wurden. Das Volumenverhältnis zwischen den Zellkulturträgern II-A und den magnetischen Teilchen II-B betrugt 70:30.
Beispiel IIa-4
Die Zellkultivierung erfolgte in gleicher Weise wie in Beispiel IIa-1, abgesehen davon, dass die 0,8 g der Zellkulturträger II-A durch 0,2 g der Zellkulturträger II-B ersetzt wurden.
Vergleichsbeispiel IIa-1
Es wurden 0,8 g der Zellkulturträger A und 30 mL einer Suspension, die je Milliliter 2,5 × 105 aus menschlichem Osteosarkom (HOS) abgeleitete Zellen enthielt, einer Menge von 100 mL der Zellkulturlösung Nissui MEM zugegeben. Dabei wurden auch 10 Vol.-% fötales Rinderserum der Zellkulturlösung Nissui MEM zugegeben.
Diese Zellkulturlösung wurde in eine Schleuderflasche (von Shibata Scientific Technology Ltd.) eingebracht, worauf die Zellkultivierung durchgeführt wurde. Dabei waren die Kultivierungsbedingungen durch eine Rotationsgeschwindigkeit des Rührankers von 30 U/min, einer Temperatur der Zellkulturlösung von 37°C und einem Kultivierungszeitraum von 5 Tagen festgelegt.
Vergleichsbeispiel IIa-2
Es wurde eine Zellkultivierung in gleicher Weise wie in Vergleichsbeispiel IIa-1 vorgenommen, abgesehen davon, dass die Rotationsgeschwindigkeit des Rührankers auf 60 U/min geändert wurde.
Vergleichsbeispiel IIa-3
Es wurde eine Zellkultivierung in gleicher Weise wie in Vergleichsbeispiel IIa-1 vorgenommen, abgesehen davon, dass die Zellkulturträger II-A durch die Zellkulturträger II-C ersetzt wurden.
2-2 Zellkultur, abgeleitet aus Affenniere (Verozellen)
Diese aus einer Affenniere abgeleitete Zelle hat eine Maximallänge von etwa 20 μm.
Beispiele IIb-1 bis IIb-4 und Vergleichsbeispiele IIb-1 bis IIb-3
Es wurde eine Zellkultivierung in gleicher Weise wie in den Beispielen IIa-1 bis IIa-4 und den Vergleichsbeispielen IIa-1 bis IIa-3 vorgenommen, abgesehen davon, dass die aus menschlichem Osteosarkom abgeleiteten Zellen durch die aus einer Affenniere abgeleiteten Zellen ersetzt wurden.
2-3 Zellkultur, abgeleitet aus einer Steckmücke (C6/36)
Diese aus einer Steckmücke (Moskito) abgeleitete Zelle hat eine Maximallänge von 20 μm.
Beispiele IIc-1 bis IIc-4 und Vergleichsbeispiele IIc-1 bis IIc-3
Es wurde eine Zellkultivierung in gleicher Weise wie in den Beispielen IIa-1 bis IIa-4 und in den Vergleichsbeispielen IIa-1 bis IIa-3 vorgenommen, abgesehen davon, dass die aus menschlichem Osteosarkom abgeleiteten Zellen durch die aus einer Stechmücke abgeleiteten Zellen ersetzt wurden.
3. Bewertung
In jedem der Beispiele und der Vergleichsbeispiele wurde eine vorbestimmte Menge der Zellkulturlösung, nach 3 Stunden, 1 Tag, 3 Tagen und 5 Tagen seit Beginn der Kultivierung (Ruhrbeginn) als Probe entnommen. Anschließend wurde die Zahl der an den Oberflächen der Zellkulturträger (15 mg) haftenden Zellen ermittelt. Die Zellen wurden gezählt, indem die mit EDTA oder Trypsin behandelten Zellen mit Trypanblau gefärbt wurden.
Die Ergebnisse sind in den Tabellen 4 bis 6 angegeben.
Tabelle 4 (aus menschlichem Osteosarkom (HOS) abgeleitete Zellen)
Tabelle 5 (aus Affenniere abgeleitete Zellen (Verozellen))
Tabelle 6 (aus Stechmücke abgeleitete Zellen (C6/36))
Wie aus den Tabellen hervorgeht, weisen alle erfindungemäßen Beispiele ungeachtet der Zellart eine höhere Zellkultivierungseffizienz als die Vergleichsbeispiele auf.
Auch eine Änderung des Impulsintervalls des auf die Magnetfelderzeugung bezogenen Musters führte in den erfindungemäßen Beispielen nicht zu einer großen Variation der Zellwachstumseffizienz. Daraus geht hervor, dass es in den erfindungsgemäßen Beispielen nicht erforderlich ist, die Kultivierungsbedingungen beispielsweise in Abhängigkeit der Zellart streng genau einzustellen.
Dagegen zeigten die Vergleichsbeispiele, in denen zur Kultivierung eine Rührflasche verwendet wurde, in Abhängigkeit der Rotationsgeschwindigkeit des Rührankers eine große Variation in der Effizienz der Zellkultivierung. In den Vergleichsbeispielen variierte also der Zustand des Zellwachstums ungeachtet der Zellart stark in Abhängigkeit der Rotationsgeschwindigkeit des Rührankers. Daraus wird deutlich, dass die Optimierung der Kultivierungsbedingungen äußerst schwierig ist. Außerdem stellte sich in den Vergleichsbeispielen heraus, dass sich die Zellen von den Zellkulturträgern lösten.
In gleicher Weise wie in den oben beschriebenen erfindungsgemäßen Beispielen wurde eine Zellkultivierung unter Verwendung der Zellkultivierungseinrichtungen nach den 5, 7 und 8 sowie unter Variation des auf die Magnetfelderzeugung bezogenen Musters durchgeführt. Die Ergebnisse waren die gleichen wie in den oben beschriebenen Beispielen.
Wie aus obiger Beschreibung hervorgeht, ermöglicht es die Erfindung, eine Zellkulturlösung gleichmäßig und sanft zu rühren, wodurch ein effizientes Zellwachstum möglich wird.
Indem die Strukturen der Zellkulturträger und der magnetischen Teilchen geeignet eingestellt werden, kann die vorstehend genannte technische Wirkung noch weiter verbessert werden.

Claims

Verfahren zur Zellkultivierung, umfassend folgende Schritte: Zubereiten einer Zellkulturlösung, die zumindest zu kultivierende Zellen und körnige Zellkulturträger enthält, auf denen das Anhaften und Wachsen der Zellen möglich ist, und Anwenden eines Magnetfeldes auf die Zellkulturlösung, um diese durch die Wirkung des Magnetfeldes zu rühren, wobei die Zellen an den Oberflächen der Zellkulturträger haften und wachsen.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellkulturträger jeweils ein magnetisches Teilchen mit einer Oberfläche und einer Deckschicht umfassen, die zumindest einen Teil der Oberfläche des magnetischen Teilchens bedeckt, so dass Zellen an ihr haften können, wobei die Zellkulturträger durch die Anwendung des Magnetfeldes in der Zellkulturlösung bewegt werden, wodurch die Zellkulturlösung gerührt wird.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass sich die Intensität des auf die Zellkulturlösung angewandten Magnetfeldes zeitlich ändert.
Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass sich die Anordnung des auf die Zellkulturlösung angewandten Magnetfeldes zeitlich ändert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Dichte jedes Zellkulturträgers im Bereich von 0,8 bis 2,5 g/cm³ liegt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, gekennzeichnet durch ein Verhältnis A/B gleich 2 bis 100, wenn die mittlere Teilchengröße der Zellkulturträger als A μm und die maximale Länge der an dem jeweiligen Zellkulturträger anzuhaltenden Zelle als B μm definiert ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die mittlere Teilchengröße der Zellkulturträger im Bereich von 50 bis 500 μm liegt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Deckschicht hauptsächlich aus einer Calciumphosphat-basierten Verbindung hergestellt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Deckschicht aus feinen Teilchen der Calciumphosphat-basierten Verbindung hergestellt wird, wobei die Teilchen teilweise in einem Oberflächenbereich eingebettet werden, der die Oberfläche des magnetischen Teilchens umfasst und an diese angrenzt.
Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Teilchen der Calciumphosphat-basierten Verbindung aus porösen Teilchen gebildet werden und dass die Deckschicht durch Kollision dieser porösen Teilchen mit der Oberfläche des magnetischen Teilchens gebildet wird.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die magnetischen Teilchen jeweils durch Mischen eines Harzmaterials und eines magnetischen Materials gebildet werden.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellkulturlösung ferner magnetische Teilchen enthält und diese magnetischen Teilchen durch Anwenden des Magnetfeldes in der Zellkulturlösung bewegt werden, wodurch diese gerührt wird.
Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Intensität des auf die Zellkulturlösung angewandten Magnetfeldes zeitlich geändert wird.
Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Anordnung des auf die Zellkulturlösung angewandten Magnetfeldes zeitlich geändert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellkulturträger jeweils einen Basiskörper aus einem Harzmaterial mit einer Oberfläche und einer Deckschicht umfassen, die zumindest einen Teil der Oberfläche des Basiskörpers bedeckt, so dass die Zellen an der Deckschicht haften können.
Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Deckschicht hauptsächlich aus einer Calciumphosphat-basierten Verbindung hergestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Deckschicht aus feinen Teilchen der Calciumphosphat-basierten Verbindung gebildet wird, wobei die Teilchen zum Teil in einem Oberflächenbereich eingebettet werden, der die Oberfläche des Basiskörpers umfasst und an diese angrenzt.
Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Teilchen der Calciumphosphat-basierten Verbindung aus porösen Teilchen gebildet werden und die Deckschicht durch Kollision dieser porösen Teilchen mit der Oberfläche des magnetischen Teilchens gebildet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Dichte jedes Zellkulturträgers im Bereich von 0,8 bis 1,4 g/cm³ liegt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 19, gekennzeichnet durch ein Verhältnis A/B gleich 2 bis 100, wenn die mittlere Teilchengröße der Zellkulturträger als A μm und die maximale Länge der an dem jeweiligen Zellkulturträger anzuhaltenden Zelle als B μm definiert ist.
Verfahren nach Anspruch 12, gekennzeichnet durch ein Verhältnis C/A gleich 0,02 bis 10, wenn die mittlere Teilchengröße der Zellkulturträger als A μm und die mittlere Teilchengröße der magnetischen Teilchen als C μm definiert ist.
Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die mittlere Teilchengröße der Zellkulturträger im Bereich von 50 bis 500 μm liegt.
Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die magnetischen Teilchen jeweils durch Mischen eines Harzmaterials und eines magnetischen Materials gebildet sind.
Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Dichte jedes magnetischen Teilchens im Bereich von 0,8 bis 2,5 g/cm³ liegt.
Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die mittlere Teilchengröße der magnetischen Teilchen im Bereich von 10 bis 500 μm liegt.
Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die magnetischen Teilchen jeweils eine Deckschicht aufweisen, die zumindest einen Teil der Oberfläche des jeweiligen magnetischen Teilchens bedeckt, so dass die Zellen an der Deckschicht haften können.
Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass die Deckschicht hauptsächlich aus einer Calciumphosphat-basierten Verbindung hergestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass die Deckschicht aus feinen Teilchen der Calciumphosphat-basierten Verbindung gebildet wird, wobei diese Teilchen zum Teil in einem Oberflächenbereich ein gebettet werden, der die Oberfläche des magnetischen Teilchens umfasst und an diese angrenzt.
Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass die Teilchen der Calciumphosphat-basierten Verbindung aus porösen Teilchen gebildet werden und dass die Deckschicht durch Kollision dieser porösen Teilchen mit der Oberfläche des magnetischen Teilchens gebildet wird.
Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass das volumenbezogene Mischverhältnis der magnetischen Teilchen zu den Zellkulturträgern im Bereich von 10:90 bis 50:50 liegt.
Zellkulturträger, dessen Oberfläche für das Anhaften und Wachsen von Zellen bestimmt ist, umfassend ein magnetisches Teilchen mit einer Oberfläche und eine Deckschicht, die zumindest einen Teil der Oberfläche des magnetischen Teilchens bedeckt und so ausgebildet ist, dass die Zellen auf ihr haften können.
Zellkulturträger nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, dass seine Dichte im Bereich von 0,8 bis 2,5 g/cm³ liegt.
Zellkulturträger nach Anspruch 31 oder 32, gekennzeichnet durch ein Verhältnis A/B gleich 2 bis 100, wenn die mittlere Teilchengröße des Zellkulturträgers als A μm und die maximale Länge der an dem Zellkulturträger anzuhaltenden Zelle als B μm definiert ist.
Zellkulturträger nach einem der Ansprüche 31 bis 33, dadurch gekennzeichnet, dass die Teilchengröße des Zellkulturträgers im Bereich von 50 bis 500 μm liegt.
Zellkulturträger nach einem der Ansprüche 31 bis 34, dadurch gekennzeichnet, dass die Deckschicht hauptsächlich aus einer Calciumphosphat-basierten Verbindung besteht.
Zellkulturträger nach Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, dass die Deckschicht aus feinen Teilchen der Calciumphosphat-basierten Verbindung gebildet ist, wobei diese feinen Teilchen zum Teil in dem magnetischen Teilchen nahe dessen Oberfläche eingebettet sind.
Zellkulturträger nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, dass die feinen Teilchen der Calciumphosphat-basierten Verbindung aus porösen Teilchen gebildet sind und dass die Deckschicht durch Kollision dieser porösen Teilchen mit der Oberfläche des magnetischen Teilchens gebildet ist.
Zellkulturträger nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, dass das magnetische Teilchen durch Mischen eines Harzmaterials und eines magnetischen Materials gebildet ist.
Einrichtung zur Zellkultivierung, umfassend ein Kultivierungsgefäß zur Aufnahme einer Zellkulturlösung, die zumindest zu kultivierende Zellen und körnige Zellkulturträger enthält, an denen die Zellen haften und wachsen können, und mindestens einen Magnetfeldgenerator zum Anwenden eines Magnetfeldes auf die Zellkulturlösung, um diese durch die Wirkung des Magnetfeldes zu rühren.
Einrichtung nach Anspruch 39, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellkulturträger jeweils ein magnetisches Teilchen mit einer Oberfläche und einer Deckschicht umfassen, die zumindest einen Teil der Oberfläche des magnetischen Teilchens bedeckt und so ausgebildet ist, dass die Zellen auf ihr haften können, wobei die Zellkulturträger durch die Anwendung des Magnetfel des in der Zellkulturlösung bewegt und dadurch die Zellkulturlösung gerührt wird.
Einrichtung nach Anspruch 39, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellkulturlösung ferner magnetische Teilchen enthält und dass diese magnetischen Teilchen durch Anwendung des Magnetfeldes in der Zellkulturlösung bewegt werden, wodurch die Zellkulturlösung gerührt wird.
Einrichtung nach einem der Ansprüche 39 bis 41, dadurch gekennzeichnet, dass der Magnetfeldgenerator so ausgebildet ist, dass die Intensität des erzeugten Magnetfeldes zeitlich veränderbar ist.
Einrichtung nach einem der Ansprüche 39 bis 42, dadurch gekennzeichnet, dass der Magnetfeldgenerator so ausgebildet ist, dass die Anordnung des erzeugten Magnetfeldes zeitlich veränderbar ist.
Einrichtung nach einem der Ansprüche 39 bis 43, dadurch gekennzeichnet, dass der Magnetfeldgenerator um die Außenfläche des Kultivierungsgefäßes herum angeordnet ist.
Einrichtung nach einem der Ansprüche 39 bis 43, dadurch gekennzeichnet, dass der Magnetfeldgenerator so ausgebildet ist, dass er in Kontakt mit der Zellkulturlösung kommt.
Einrichtung nach einem der Ansprüche 39 bis 44, dadurch gekennzeichnet, dass der Magnetfeldgenerator nahe der flüssigen Oberfläche der in dem Kultivierungsgefäß enthaltenen Zellkulturlösung angeordnet ist.
Einrichtung nach einem der Ansprüche 39 bis 46, dadurch gekennzeichnet, dass der mindestens eine Magnetfeldgenerator zwei oder mehr Magnetfeldgeneratoren umfasst.