SU1567623A1 - Способ получени магнитных микроносителей дл культивировани клеток эукариот - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к биотехнологии, в частности к усовершенствованному способу получени  магнитных микроносителей дл  культивировани  клеток эукариот. Целью изобретени   вл етс  упрощение способа и улучшение качества целевого продукта за счет увеличени  прироста клеток на микроносител х. Способ заключаетс  в обработке раствора желатина поперечно-сшивающим агентом - глутаровым альдегидом, размельчении блок-полимера с целью получени  частиц определенного размера и обработке полученных частиц протеолитическим ферментом. При этом предварительно провод т введение в раствор желатина частиц магнитного наполнител  размером 0,005 - 0,05 мкм (оксидов металлов переменной валентности) в соотношении магнитный наполнитель - желатин 1:(0,5 - 10). На полученных таким способом микроносител х прирост клеток перевиваемой линии RH повышаетс  в 1,6 - 2,5 раза по сравнению с микроносител ми, полученными по известному способу. Упрощение способа достигаетс  за счет исключени  стадии дисперсионной конденсации. 2 з.п. ф-лы, 1 табл.

Description

Изобретение относитс  к биотехнологии , в частности к усовершенствованному способу получени  магнитных микроносителей (ММН) дл  культивировани  поверхностно-зависимых клеток эукариот, и может найти широкое применение в ветеринарной и медицинской промышленности дл  выращивани  клеток и размножени  вирусов на них с целью создани  вакцин и сывороток, а

также дл  получени  секретируемых клетками эукариот важных биологически активных веществ, таких как |5- и у -интерфероны, активатор плаз- миногена, гормон роста и др.

Цель изобретени  - упрощение способа и улучшение качества целевого продукта за счет увеличени  прироста «леток на микроносител х.

Способ заключаетс  в диспергировании магнитного на опител  (МН) на основе оксидов металлов переменной валентности с размером частиц 0,005- 0,05 мкм в растворе желатина, обработке полученной суспензии глутаровым альдегидом и размельчении образующегос  гел  дл  получени  частиц микроносител . Последние обрабатывают про- jg теолитическими ферментами до исчезновени  шероховатости поверхности. 8 качестве оксидов металлов используют оксиды железа, кобальта и никел , а соотношение магнитного носител  и желатина устанавливают равным 1:0,5 - 1:10, Использование предлагаемого способа позвол ет значительно упростить процесс получени  микроносителей за счет исключени  стадии дисперсионной конденсации, на которой примен ют специальную аппаратуру и органические растворители, а также улучшить качество целевого продукта за счет увеличени  прироста клеток в 1,6-2,5 раза.

П р и- м е р 1 . Соли, FeS04-7H20 (35 О и FeClv&H20 (50 г), раствор в 0,15 М растворе NaCl, стерилизую при 120°С и 0,7 ати в течение 20 ми Получают 300 г ММН с содержанием , 8,5 Fe,04. В процессе обработки ММ протеиназами осуществл ют визуальн контроль под микроскопом и .обработ ферментами ведут до исчезновени  ш ооховатости частиц.

П р v, м е р 2. ММН получают по примеру 1, но на 5,0 г осадка добавл ют 200 мл 25 -ного раствора желатина (весовое соотношение МН и желатина 1:10). получают 250 г ММН 15 с содержанием 2% Fe }0Л.

П р и м е р 3. ММН получают по примеру 1, но на 25 г осадк.  Ге304 добавл ют 50 мп 5%-ного рдстсора желатина (весовое соотношение МН и желатина .1 :0,5) . Получают 125 г ММ с содержанием 25 e20j.

П р и м е р Ц„ ММН получают по примеру 1, но к 1,1 г осадка Fe304 добавл ют 200 мл 25%-ного раствора желатина (весовое соотношение ПН и желатина 1:12), Получают г ММН с содержанием 0,9% .

П р и м е р 5. К25г осадча Fe который

20

25

и промыт по пример о.

ют а 110 мл Н20 каждую, растворы объ

един ют и при перемешивании постелен- 0 ПРИ перемешивании и добавл ют

но приливают 100 мл гидрооки200 мл 25 ного раствора желттина аоде (соотношение МН и желатина 1: Полученну суспензию, содержащую ч тицы МН - Ге г04 - с размером 0, ОО З подвергают дальнейшей обработке, д ба л   55 мп 25 -ного водного раст ра глут ipoBoro альдегида. Далее ве процесс провод т по примеру 1, Пол чают 35U г ММН с содержанием 16,2% .

си аммони . Выпадает тонкодисперсный осадок магнетита Ре30ф, который трижды промывают подкисленной дистиллированной водой. К промытому осадку (25 г) добавл ют 00 мл 25%-ного иаствора желатина при 50°С в воде (весовое соотношение МН и желатина 1:1) и при перемешивании до однородной суспензии нагревают в течение 20 мин при 5.0°С. Средний размер частиц магнитного наполнител  0,005 мкм. К образовавшейс  суспензии добавл ют 35 мл 253-ного водного раствора глу- тарового альдегида и интенсивно пе- ремеливают в течение 15 мин После выдерживани  в течение 15 мин при 20°С блок гел  продавливают через сито с диаметром отверстий 200 мкм. Полученные частицы отмывают водой от глутарового альдегида, затем обрабатывают 200 мл 0,25%-ного раствора трипсина в 0,01 М фосфатном буфере (рН 7,6) в течение 3 мин при комнатной температуре и посто нном перемешивании . Дл  удалени  остатков фермента частицы микроносител  промывают 0,01%-ным раствором этилендиамин- тетрауксусной кислоты, суспендируют

g

в 0,15 М растворе NaCl, стерилизуют при 120°С и 0,7 ати в течение 20 мин. Получают 300 г ММН с содержанием 8,5 Fe,04. В процессе обработки ММН протеиназами осуществл ют визуальной контроль под микроскопом и .обработку ферментами ведут до исчезновени  ше- ооховатости частиц.

П р v, м е р 2. ММН получают по примеру 1, но на 5,0 г осадка добавл ют 200 мл 25 -ного раствора желатина (весовое соотношение МН и желатина 1:10). получают 250 г ММН 5 с содержанием 2% Fe }0Л.

П р и м е р 3. ММН получают по примеру 1, но на 25 г осадк.  Ге304 добавл ют 50 мп 5%-ного рдстсора желатина (весовое соотношение МН и желатина .1 :0,5) . Получают 125 г ММН с содержанием 25 e20j.

П р и м е р Ц„ ММН получают по примеру 1, но к 1,1 г осадка Fe304 добавл ют 200 мл 25%-ного раствора желатина (весовое соотношение ПН и желатина 1:12), Получают г ММН с содержанием 0,9% .

П р и м е р 5. К25г осадча Fe,G4, который

0

5

и промыт по примеру о.

0 ПРИ перемешивании и добавл ют

5

0

5

0

5

200 мл 25 ного раствора желттина о аоде (соотношение МН и желатина 1:2) Полученну суспензию, содержащую частицы МН - Ге г04 - с размером 0, ОО З мкм, подвергают дальнейшей обработке, до- ба л   55 мп 25 -ного водного раствора глут ipoBoro альдегида. Далее весь процесс провод т по примеру 1, Получают 35U г ММН с содержанием 16,2% .

П р и м е р 6. Соли, 5 г FeCi 6Н70 и 2 г СоСЬ-6НгО, раствор ют в 50 мл воды каждую, растворы объедин ют , нагревают до 90°С и при перемешивании приливают 150 мл 25%-но о оаствора гидроокиси натри . Перемешивают в течение 10 мин. Обр ззовав- шийс  осадок- с размером частиц 0,03 мкм промывают раствором сол ной кислоты (0,05 М) до рН 6-8. К промытому осадку добавл ют 00 мл 20%-ного раствора желатина в воде (соотношение МН и желатина 1:3), перемешивают до образовании однородной суспензии и нагревают в течение 30 мин при 90°С. Все дальнейшие операции, начина  с добавлени  35 мл 25%-ного раствора глутарового альдегида, осуществл ют по примеру 1. Получают

00 г ММН с содержанием 6,% феррита кобальта.

Пример. Соли, 51 г Fed, 6Н20 и 20 г NiClj,, раствор ют в 50 мл воды каждую, растворы объедин ют и нагревают до 90°С. При перемешивании добавл ют 150 мл 25%-ного раствора гидроокиси натри  и продолжают перемешивание в течение 0 мин при той же температуре. Образовавшийс  осадок (NiFe40.4 с размером частиц 0,05 мкм) промывают раствором 0,05 М сол ной кислоть, до рН 6-8. К промытому осадку добавл от АОО мл 20%-ного раствора желатина (соотношение МН и желатина 1:3), перемешивают до образовани  однородной суспензии и нагревают в течение 30 мин при 90°С Все дальнейшие операции, начина  с добавлени  35 мл 25 -ного раствора глутарового альдегида, осуществл ют по примеру 1. Получают 10 г микроносител  с содержанием 6,8 феррита никел .

П р и м е р 8. Процесс осуцествл  ют по примеру 1 , но иные частицы после отмывки в 4- и от г утаровог альдегида обращать аают 0 мл П,20%-н го раствора - синг в Э,01 М фосфатном буфер-, Ч 7,6. Получают 295 г ММН с содержанием Я,5 ,

П р и м э р 3. Го-ihvjib. микроносител , полученные по призеру 1, помещают в 0,25%-ный раствор юллагрназы в 0,15 М фо-.фатном буфере с рН 7,6 (из ра чр-ta )0 мл раствора фермента из 250 г микроносител ) и выдерживает , перемешива  при комнатной температуре до образовани  гладкой поверхности гранул, которое фиксируют визуальным наблюдением под микроскопом . Врем  обработки 3,5 мин. Затем остатки фермента удалит, а продукт промывают по примеру 1.

Оптимальное весовое соотношение МН и желатина 1:(0,). Получение ММН при BtcoLOM соотношении ченее 1: :0,5 затруднитеп-но из-Зй возрастани  в зкости раствора, а лри соотношении более 1:10 нецелесообразно, так как приводит к получению с низким содержанием МН (менее 2%), а также к снижению прироста клеток.

Использование частиц h. мемее 0,005 мкм невозможно, так как этот размер имеет однодоменна  частица МН5 а более 0,05 мкм нежелательно, так как уменьшаетс  прирост клеток.

,

10

5676236

С целью получени  гладкой поверхности магнитного микроносител , котора  необходима дл  эффективного прикреплени  клеток, частицы микроносител  обрабатывают протеолитическими ферментами. Используют трипсин, - химотрипсин и коллагеназу при концентрации 0,2-0,25. В процессе проведени  обработки осуществл ют .визуальный контроль под микроскопом за поверхностью гранул и обработку ферментом ведут до исчезновени  шероховатости поверхности. Это врем  S составл ет обычно 2,,5 мин. Более длительна  чЗработка нежелательна, так как при этом разрушаютс  гранулы м кроносителр, Нежелательно также использование более высоких концентраций ферментов ввиду того, что сокращаетс  впем  обпаботки, что создает сложность в установлении момента окоч аени  этой стадии.

20

5 На микроносител х, полученных согласно примерам 1-9, выращивают поверхностно-зависимые клетки почек эмбриона человека перевиваемой линии RH. Культивирование провод т на среде 199, содержащей 3-10% бычьей сыворотки , во флаконах объемом 250 мл с магнитной мешалкой. Клетки высевают , использу  на начальном этапе 20% объема (30 мл) питательной среды от конечного. госле засева кпеток сус- периодически перемешивают по 1-2 мич с интервалом 30 мин в течение ч. По окончании процесса прикреплени  клеток к микроносител м объем среды довод т до конечного (150 мл), концентраци  клеток при этом составл ет (,010 кл/мл, и устача пивают посто нный режим работы мешалки - 0 об/мин. Концентраци 

микроносителей в конечном объеме среды составл в ; см3 глотного осадка на Ю мл питательно среды, что ot-ч с- печивает площадь около 15 см2 на 1 мл среды. Процесс культивировани 

осуществл ют при 37 С в течение 7сут. На 3 сут куле ивировани  среду замен ют на . По окончании процесса клетки снимают, обрабатыва  их 20 мл раствора, содержащего 0,025% трипсина и 0,02% ЗДТА. Количество выросших клетск определ ют, подсчитыва  их в гемоцитометре после окрашивани  три- Пановым синим, Коэффициент прироста клеток рассчитывают по отношению

концентрации выросших клеток к их посевной концентрации.

В таблице приведены сравнительные данные по культивированию перевиваемой линии RH-клеток почек эмбриона человека.

Таким образом, предлагаемый способ позвол ет упростить технологию получени  магнитных микроносителей дл  культивировани  клеток эукариот благодар  Исключению стадий дисперсионной поликонденсации и улучшить качество микроносителей за счет увеличени  коэффициента прироста клеток на предлагаемых магнитных микроносител х в 1,6-2,5 раза по сравнению с носител ми, полученными по известному способу. Кроме того, магнитные микроносители, получаемые предлагаемым способом, содержат заданное количество магнитного носител , что позвол ет использовать их в процессе магнитоуправл емого культивировани .

Claims (3)

1. Способ получени  магнитных микроносителей дл  культивировани  клеток эукариот, включающий смешивание раствора желатина с магнитным наполнителем из оксидов металлов переменной валентности, получение частиц Микроносител  с проведением обработки желатина глутаровым альдегидом, отличающийс  тем, что, с целью упрощени  способа и улучшени  качества целевого продукта за счет увеличени  прироста клеток на микроносител х , в качестве магнитного наполнител  используют частицы оксидов ме- таллов переменной валентности размером 0,005-0,05 мкм, обработку желати

5

на глутаровым альдегидом провод т пе- пед получением частиц микроносител , а частицы микроносител  получают размельчением гел  с последующей обработкой их протеолитическими ферментами до исчезновени  шероховатости поверхности .

2.Способ по п.1, отличающий с   тем, что соотношение магнитный наполнитель и желатин устанавливают равным 1:0,5-1:10.

3.Способ поп.1, отли ча ю - щ и и с   тем, что в качестве оксидов металлов переменной валентности используют оксиды железа, кобальта или никел .