DE2940150A1

DE2940150A1 - Mikrotraeger-zellkultur

Info

Publication number: DE2940150A1
Application number: DE19792940150
Authority: DE
Inventors: Donald F Hollis; James F Monthony; Norman D Schwartz
Original assignee: Bio Rad Laboratories Inc
Current assignee: Bio Rad Laboratories Inc
Priority date: 1979-02-09
Filing date: 1979-10-03
Publication date: 1980-08-21
Also published as: CA1192155A; US4237218A; GB2043081B; JPS55108286A; GB2043081A

Description

1325-1-10.77?-

Mikroträger-Zellkultur

Die Erfindung betrifft das i'eld der Zellbiologie und insbesondere Träger, welche zum Züchten von bindungsabhängigen Zellen in vitro vorteilhaft sind.

Seit langem besteht Interesse zur Züchtung von primären Zellen, Diploidzellen des Menschen und anderen bindungsabhängigen Zellen in großen Mengen. Ein solches Interesse wird noch verstärkt, da die Nachfrage nach Zellen und Zellnebenprodukten für Forschung und kommerzielle Anwendungen zugenommen hat. Zahlreiche Techniken wurden für die Produktion von Zellen in großem Maßstab entwickelt. Typisch für diese Entwicklungen sind Rollflaschen, Mehrfachplattenzüchtungseinrichtungen und Spiralfilmzüchtungseinrichtungen, Hohlfasersysteme und Glashelixperfusionssysteme. Unglücklicherweise sind diese Techniken im allgemeinen mühselig und bedingen damit verbundene Probleme der Zellhandhabung und Beobachtung, der Medienperfusion, der Ansatzhomogenität und der Übertragung in größeren Maßstab.

In neuerer Zeit wurde eine alternative Technologie zur Zellmassenkultur entwickelt, welche diese Probleme beseitigt. Die ursprünglichen Versuche von van Wezel, Nature, 216 (1967), S. 64 verwendeten geladene Dextranperlen zur Kultur von anerkannten Zell-Linien, Diploidzellen des Menschen und primären Nierenzellen von Kaninchen. Anschließende Arbeiten von van Wezel, "Microcarrier Culture of Animal Cells" in Tissue Culture Methods and Applications, S. 372 (Herausgeber Kruse und Patterson, Academic Press, N.Y. (1973)) und anderen, ζ. B. Horng und McLimans, Biotechnol. Bioeng. 21 (1975), ti. 713 waren hauptsächlich auf die Ausschaltung von cytotoxischen Effekten dieser Perlen und auf die bessere Begrenzung der erforderlichen Merkmale von für die Zellkultur geeigneten Mikrokugeln Gerichtet. Schließlich fanden Thilly und Levine die Wichtigkeit der

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Ladungsdichte von Perlen, siehe Levine et al.,Somatic Cell Genetics, _3_ (1977), S. 14-9, und sie bestimmten Perlen mit einem Durchmesser von 150 um, welche 2 mäq/g Ladungsdichte trugen, als optimal für das Binden von Zellen und die Vermehrung, und in der US-Patentschrift 4- 036 693 ist ein Verfahren zur Behandlung von Perlen aus derivatisiertem Dextran beschrieben. Als Ergebnis wurden speziell behandelte Perlen für die Zellkultur optimiert, und es wurden Systeme für die routinemäßige Herstellung von großen Mengen an Zellen und Virenvaccinen entwickelt, siehe Giard et al., Applied and Environ. Microbiol. , *>± (1977), S. 668, van Hemert, Biotechnol. Bio eng., §_ (1964), S. 381 und Spier et al., Biotechnol. Bioeng., 1£ (1977), S. 1735.

Obwohl Perlen aus Dextran und derivatisiertem Dextran als Kulturträger bekannt sind und gebraucht wurden, sind mit ihrer Verwendung dennoch Probleme verbunden. Von ihnen ist nicht bekannt, daß sie gegenüber einem Angriff durch Enzyme oder Bakterien unempfindlich sind. Wichtiger ist jedoch, daß toxische Effekte und insbesondere der Anfangszellabbau beobachtet wurden. Obwohl frühere Arbeiten von Thilly und Levine dies als eine Punktion einer zu hohen DEAE-Funktionalitätsdichte zu erklären schienen, scheint es so zu sein, daß andere Parameter die weniger leicht zu definieren und zu steuern sind, hier eine Rolle spielen, siehe van Wezel et al., Process. Bio ehem., J5_ (1978), S. 6-°, 28. Darüber hinaus ist die Herstellung von Perlen auf ^-t^anbasis ein Vielstufsnverfahren. Typischerweise werden geladene Dextranteilchen so hergestellt, daß zunächst eine Dextranperle hergestellt wird und diese dann mit einer geladenen Gruppe wie DEAE zur Bildung des Endproduktes umgesetzt wird. Geladenes Dextran kann dann weiter behandelt werden, wie dies in der US-Patentschrift 4 036 693 angegeben wird, um die Steuerung von toxischen Effekten zu versuchen. Die Notwendigkeit für einen vollständig neuen Ilikroträger ist anerkannt, siehe van Wezel et al., id., S. 8. Zahlreiche Dimethylaminopropylmethacrylamidpolymerisate und -copolymerisate wurden

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BAD ORIGINAL

entwickelt und sind bekanntermaßen als Ionenaustauscherharze brauchbar. In den US-Patentschriften 2 567 836 und 3 287 305 sind typische Beispiele dieser Klasse von Copolymerisaten und bekannte Methoden ihrer Herstellung beschrieben.

Aufgabe der Erfindung sind daher neue Mikroträger, welche die zuvor genannten Nachteile nicht aufweisen.

Es wurde nun gefunden, daß unlösliche, kationische Acrylamidcopolymerisate in vorteilhafter Weise als Zellkulturträger verwendet werden können. Solche Acrylamidcopolymerisate sind Produkte mit einer Ladungsdichte von 0,050 - 0,150 mäq/ml, und sie sind biologisch inert, da sie gegenüber einem Angriff durch Enzyme oder Bakterien unzugänglich sind. Gemäß der Erfindung wird ein neuer Typ von Träger in Form von synthetischem, perlenförmigem Polymerisat für das Zellwachstum durch eine neue Einstufenreaktion hergestellt. Schließlich wurde eine Familie von neuen Copolymerisaten von Dimethylaminopropy!methacrylamid, Acrylamid und Methylen-bis-acrylamid hergestellt, welche als Zellkulturträger, als Träger für die Kryokonservierung von Zellen und als Medium für die Ionenaustauseherchromatografie von wäßrigen Proteinlösungen vorteilhaft ist.

Im folgenden werden bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung näher erläutert.

Wie bereits zuvor beschrieben, wurden neue Mikroträger für Zellkulturen durch die erfindungsgemäße Copolymerisationsreaktion entwickelt. Die Träger gemäß der Erfindung sind hydrophile, positiv geladene (in wäßriger Lösung bei einem pH-Wert von 7) Produkte der Polymerisation eines hydrophilen Monomeren, eines kationischen Monomeren und eines vernetzenden Monomeren mit Ladungsdichten von etwa 0,050 - 0,150 mäq/ml. Da die Hauptanwendung dieser Polymerisate in der Zellkultur liegt, wurde die funktioneile Ladungsdichte in Milliäquivalent Amin pro

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Einheit von vollhydratisiertem und abgesetztem Volumen in Lösungen von physiologischer balzkonzentration gemessen und angegeben. Diese Eigenschaft hängt von der lonenstärke der Lösung ab, und die angegebenen Werte sind so zu verstehen, daß sie in 0,15 M Natriumchlorid bei pK = 7>2 oder Lösungen von äquivalenter lonenstärke gemessene Werte darstellen. Insbesondere ergibt der Einbau eines tertiären Aminderivates in die Polyinerisationsreaktion von Acrylamid und einem vernetzenden Mittel ein in Wasser unlösliches, hydrophiles Teilchen, an welchem sich Zeilen binden und reproduzieren. Die Steuerung des Derivatisierungsgrades durch die Verwendung eines funktionellen Monomeren erlaubt eine L'instufenherstellung von für das Zellwachstum vorteilhaften Teilchen. Die erfindungsgenäßen Copolymerisate besitzen eine reproduzierbare Zusammensetzung, und die Eigenschaften können einfach durch Veränderung des Verhältnisses von in die ursprüngliche Lösung eingegebenen Monomeren modifiziert werden.

Hydrophile Monomere, welche bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung brauchbar sind, sind Derivate von Acrylsäure und besitzen im allgemeinen die folgende i'ormel:

CK₂=C -Z

worin sind:

R- = H oder ein niederer Alkylrest, vorzugsweise ein Methylrest, und
O
Z = CN oder C-X, und

X = ein niederer Alkoxyrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, ein Hydroxyniederalkoxyrest, ein mit einem niederen Alkylrest substituierter oder nicht-substituierter Aminrest, z. B. ein Hydroxyniederalkylaaninrest, oder

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ein Aminrest oder NH₂-ReSt, vorzugsweise ein NH₂-ReSt oder ein Rest eines primären Niederalkylamins. Typische dieser Monomeren sind Acrylamid, Methacrylamid, Hydroxyniederalkylacrylate, d. h. Hydroxyäthyl-, Hydroxypropyl- und Hydroxybutylacrylate, Acrylnitrile, Methacrylnitril und niedere Alkylacrylanide und Hydroxyniederalkylacrylamide, d. h. N-Methylacrylainid, K-Athylacrylamid, N-Hydroicyäthylacry.lainid, N-Hydroxypropylacrylamid. Bei einer bevorzugten Ausiührungsform ist X = KHp ^un& besonders bevorzugt ist das Monomere Acrylamid.

Kationische Monomere, welche bei der Durchführung der Erfindung brauchbar sind, sind Substanzen, welche eine basische, tertiäre Aminogruppe aufweisen, welche mit einem quaternisierenden Mittel quaternisiert werden kann. Im allgemeinen sind es basische Amide, welche eine tertiäre Aminogruppe aufweisen. Mehr spezifisch besitzen sie folgende allgemeine .Formel:

R₂ O R₃
CH₂=C -C-Y-U;

worin sind:

Y =0, N-K, CH₂ und vorzugsweise K-H,

A = ein Anion, ζ. Β. Halogenid, typischerweise Chlorid, R₂ = H oder ein niederer Alkylrest, z. B. der Methylrest, η = eine ganze Zahl von O bis 6, vorzugsweise 1 bis 4- und besonders bevorzugt 3>

R^ und R^ = jeweils ein niederer Alkylrest mit 1 bis 4 Koh lenstoffatomen,

Er = H oder ein niederer Alkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoff atome ,
sowie Salze hiervon.

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Beispiele von geeigneten Amiden sind:

Acrylsäure-T-diäthylaminopropylanid (N- (!"-Diäthylaminopropyl)-acrylamid),

Methacrylsäure-T'-dimethylaminopropylamid, Acrylsäure-r-di-(hydroxyäthyl)-aminopropylamid, Methacrylsäure-ß-diäthylaminoäthylamid, Acrylsäure-ß-dimechylaminoäthylamid.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist das kationische Monomere Dimethylaminopropy!methacrylamid (DMPPiA).

Bei der Durchführung der Erfindung brauchbare Vernetzungsreagentien sind Di- oder PoIy-νiny!monomere wie Alkylendiacrylate mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen in der Alkylenkette, Alkylendimethacrylate, Dicarbonsäure-diallylaminamide, üligo- oder Polyglykoldiacrylate, Alkylen-bis-acrylainide und Alkylen-bis-methacrylamide. Typische dieser Vernetzungsmittel sind Athylenglykoldiacrylat, Athylenglykoldimethacrylat, Athylendiamindiacrylainid, Ν,Ν'-Diallyltartardiamid, Ν,Ν'-Dihydroxyäthylen-bis-acrylamid und N,N'-Methylenbis-acrylamid. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist das vernetzende Monomere Alkylen-bis-acrylamid oder -methacrylamid und besonders bevorzugt Methylen-bis-acrylamid.

Besonders brauchbare, erfindungsgemäße Copolymerisate sind solche Polymerisationsprodukte, in welchen die Ladungsdichte in gequollenem Zustand in Salzlösung 0,050 - 0,150 mäq/ml, vorzugsweise 0,060 - 0,105 mäq/ml und besonders bevorzugt 0,0?0 - 0,085 mäq/ml beträgt. Typi;.„nerweise macht das hydrophile Monomere 40 bis 75 Gew.-%, das vernetzende Monomere 3 bis 10 Gew.-% und das kationische Monomere 20 bis 45 Gew.-% aus.

Neue Copolymerisate gemäß der Erfindung sind die Polymerisationsprodukte von Acrylamid, Methylen-bis-acrylamid und LMAPMA. Typischerweise liegt das DMAPMA-monomere in einer Menge von

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etwa 20 bis 4-5 Gew.-fr des Copolymerisates vor, das Acrylamidmonomere macht etwa 40 bis 75 Gew.-fr aus und das vernetzende Monomere macht etwa 3 bis 10 Gew.-fr aus. Das Gewichtsverhältnis von reaktiven Monomeren zu Wasser liegt typischerweise bei etwa 1 : 5 "bis 1 : 15·

Solche Vinylcopolymerisate können nach auf dem Fachgebiet an sich bekannten Polymerisationsmethoden hergestellt werden. Typische dieser Methoden und Bedingungen sind in der US-Patentschrift 3 287 305 beschrieben.

Lie Dichte der Kugeln ist kritisch. Hinsichtlich der Gewichtsdichte müssen sie ausreichend schwer sein, um nicht zu schwimmen und, falls sie nicht gerührt werden, sich abzusetzen, jedoch leicht genug, um in Suspension untermildem Rühren zu verbleiben. Ein starkes Rühren ist nicht erwünscht, da die wachsenden Zellen abgespalten werden könnten. Perlen gemäß der Erfindung haben üblicherweise eine Dichte, welche etwas größer als diejenige von Wasser ist, d. h. oberhalb von 1,0 g/ml jedoch geringer als 1 ,2 g/ml. Typischerweise entsprechen 4- g Trockengewicht an Perlen 76 ml gequollenen Perlen.

Die Ladungsdichte der erfindungsgemäßen Copolymerisatperlen, gemessen durch den Amingehalt, liegt üblicherweise zwischen etwa 0,050 - 0,150 mäq/ml, vorzugsweise 0,060 - 0,105 mäq/ml und besonders bevorzugt 0,070 - 0,085 mäq/ml, in Salzlösung. Die Ladungsdichte ist eine Funktion des Verhältnisses von kationischen Monomeren, vernetzendem Monomeren und hydrophilem Monomeren. Die Ladungsdichte kann schließlich erhöht werden, indem der Anteil an kationischem Monomeren erhöht wird, obwohl eine solche Zugabe auch das Quellen erhöht. Ein erhöhtes Quellen ergibt eine Abnahme der Ladungsdichte. Die Erhöhung der Menge an vernetzendem Monomerem setzt das Quellen herab und ergibt dichtere Perlen.

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Die Perlengrößenverteilung innerhalb eines schmalen Bereiches kann wichtig sein. Stark variierende Größen von Perlen "besitzen unterschiedliche Sedimentierungseigenschaften, welche eine nicht-homogene Suspension von Perlen bedingen könnten. Eine solche Abtrennung von Perlen kann ebenfalls die Zellen von einer gleichförmigen Bindung an die Suspension der Perlen hindern, was ein nicht-optimales Wachstum verglichen mit einer zugänglichen Gesamtoberfläche ergibt. Ein schmaler Teilchenbereich erleichtert auch einfachere Berechnungen der Oberfläche. Typische Träger gemäß der Erfindung besitzen einen Durchmesser von etwa 100 bis 200 um, vorzugsweise von 120 bis 180 um und besonders bevorzugt von etwa 15O .um für ein optimales Zellwachstum.

Die Ladung der Perlen wird typischerweise gesteuert, um eine optimale Zellvermehrung mit einer großen Vielzahl von Zellstämmen zu fördern. Die erfindungsgemäßen Träger sind mit einer tertiären Aminogruppe, typischerweise Dimethylaminopropylgruppe, positiv geladen.

Die Oberfläche ist bei der vorliegenden Erfindung sehr groß im Vergleich zu anderen bekannten Zellträgern. Ein Gramm von trockenen Perlen (19 nl) ergibt eine annähernde Oberfläche von

ρ
etwa 47OO cm . Dies ist vergleichbar mit 7 Rollflaschen von

ρ
1,89 1 oder 63 - 75 cm -Kolben. Die Inerteigenschaften der erfindungsgemäßen Polyacrylamid-copolymerisatträger macht sie für die Zellkultur besonders geeignet, da sie gegenüber einem bakteriellen oder enzymatischen Angriff unzugänglich sind.

Die Erfindung wird anhand von Beispielen näher erläutert, wobei hier die folgenden Abkürzungen verwendet sind:

MBA - Ν,Ν'-Methylen-bis-acrylamid
DMAPMA - Dimethylaminopropylmethacrylamid PVAc - Polyvinylacetat
TEMED - N,N,N¹ ,ii'-Te trame thy !ethylendiamin.

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Beispiele 1 und 2

Herstellung des Copolymerisates aus DMAP, Acrylamid und MBA

Dieses erfindungsgemäße, neue Copolymerisat wurde in einer Vielzahl von Verhältnissen der Bestandteile hergestellt. Die Polymerisation wurde in einer Zweiphasenemulsion zur Herstellung von kugelförmigen Perlen mit einem erwünschten Größenbereich durchgeführt. Diese spezifischen Beispiele wurden mit Monomerenverhältnissen von Acrylamid, MBA und DMAPMA von 61,3 : 6,4 : 32,3 in Beispiel 1 und mit Verhältnissen von Acrylamid, MBA und DMAPMA von 55,3 : 5,8 : 38,9 in Beispiel 2 durchgeführt. Die Ladungsdichte des Copolymerisates in Lösung ist eine Punktion des Ausmaßes des auftretenden Quellens, das seinerseits von dem Verhältnis von MBA : Acrylamid : DMAPMA. abhängig ist. Andere nicht im einzelnen dargestellte Beispiele umfaßten Verhältnisse von Acrylamid, MBA und DMAPMA von

(A) 70,2 : 7,3 : 22,5 und

(B) 55,0 : 6,0 : 39,0,

was eine Ladungsdichte von 1,2 mäq/g (0,060 mäq/ml) bzw. 1,4 mäq/g (0,074 mäq/ml) an Amin ergab.

26,4 g DMAPMA wurden zu 660 ml 0,1 N NaCl zugesetzt und mit 6 N HCl auf pH = 7,0 eingestellt. Es wurden 5,22 g MBA und 50,0 g Acrylamid zu dem Gemisch zugesetzt, und es wurde bei Umgebungstemperatur in einem 1000-ml-Kunststoffbecherglas mit Np entgast. Die organische Phase wurde durch Auflösen von 0,69 g PVAc in 200 ml CHCl^ und Zugabe dieses Gemisches zu 1000 ml CHCIt in einem 2-1-Reaktionsgefäß hergestellt. Dieses 1200 ml CHC1,-Gemisch wurde mit N₂ entgast.

Nach der vollständigen Auflösung des Monomeren (30 Minuten) wurden 660 mg (NH^)₂S₂Og zugesetzt und für 2 Minuten unter N₂

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gerührt. Der Rühren wurde abgestellt und das Gemisch wurde in den die organische Phase enthaltenden Reaktor eingegossen. Der Reaktor wurde mit (1) einem Kühler, (2) einem Thermometer, (3) einem Trichter, (4·) einer Rührvorrichtung und (5) einem Np-Einleitungsrohr versehen. Die zwei Phasen wurden unter No vermischt und nach 3 Minuten \airden 2,4· ml TEMED zugesetzt, und der Trichter wurde entfernt und durch einen Glasstopfen ersetzt. Die Reaktion wurden unter N₂ durchgeführt. Nach 20 Minuten war die Temperatur des Reaktionsgemisches um 1 C angestiegen. Die Reaktion wurde nach 1,5 Stunden durch Entfernen von No und Zugabe von 200 ml H₂O abgeschlossen. Das Gemisch wurde stehengelassen, bis sich die CHCl^-Schicht abgetrennt hatte. Das CHCl, wurde entfernt und es wurden 300 ml CH^OH zugesetzt. Die erhaltenen Perlen wurden in CH^OH bis zur Dehydratisierung gewaschen und dann unter Vakuum getrocknet.

Das Material wurde analysiert, wobei gefunden wurde, daß es 1,32 mäq/g (0,069 mäq/ml) an geladenem Amin aufwies.

19,6 g NaCl, 17,7 g DMAPMA, 25 g Acrylamid und 2,61 g MBA wurden zu 330 ml H2O in einem 1-1-Kunststoffbecherglas bei einem auf 7»0 eingestellten pH-Wert und unter Durchleiten von Np durch das Gemisch zugesetzt. Nach dem Rühren bis zur Auflösung sämtlicher Feststoffe wurden 330 mg (NH^)₂S₂Og zugesetzt und das Gemisch für 2 Minuten gerührt. Die Monoinerenlösung wurde in einen 2-l~^eaktor gegeben, v/elcher 600 ml CHCl^ und PJTAc wie in Beispiel 1 enthielt und mit (1) einem Rührer, (2) einem Kühler, (3) dem Gaseinleitungsrohr, (4) einem Trichter und (5) einem Thermometer ausgerüstet war. Die Emulsion wurde für 5 Minuten gerührt und es wurden 0,4- ml TEMED zugesetzt. Der Trichter wurde entfernt und durch einen Glasstopfen ersetzt· Die Reakt ions temperatur stieg innerhalb von 4-0 Minuten auf 35 ⁰C Die Reaktion wurde für weitere 2 Stunden fortgeführt, danach wurden 200 ml HpO zugesetzt. Das CHCl, wurde entfernt

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und es wurden 300 ml KeOH unter Kühren zugesetzt. Das Polymerisat wurde mit MeOH gewaschen und unter Vakuum getrocknet. Hierbei wurden 4-9 g Polymerisatperlen mit einem Gehalt von 1,75 mäq/g (0,105 mäq/ml) an Amin erhalten.

Eine allgemeine Arbeitsweise, welche zum Züchten von bindungsabhängigen Zellen unter Verwendung der erfindungsgemäßen Copolymerisatperlen als Zellträger brauchbar ist, umfaßt folgende Stufen:

1. Eine Suspension von sterilen Perlen wird zur gleichförmigen Dispersion der Perlen gut geschüttelt.

2. 25 ml der Suspension der gut dispergierten Perlen wird in ein steriles 50-ml-Zentrifugenglas eingefüllt und die Perlen werden sich am Boden absetzen gelassen, was annähernd 5 Minuten erfordert.

3· Die überstehende Salzlösung wird abgesaugt und es erfolgt ein Zusatz auf 50 ml an vollständigem Zuchtungsmedium zu dem Perlenpellet (z. B. Dulbecco's modifiziertes Eagle-Medium mit 10 % fetalem Kalbsserum).

4. Es wird gut vermischt und in einensterilen250-nl-Rührkolben gegeben, der mit einem freibeweglichen Rührstab und einem mit Polytetrafluoräthylen überzogenen Stabmagnet, der wenigstens 15 nun vom Boden des Behälters aufgehängt ist, ausgerüstet ist (z. B. Bellco Glass, Inc., Vineland, New Jersey).

5· Aus einer Monoschichtkultur wird ein Zelleninoculum von 3 x 10' Zellen hergestellt und gründlich in 20 ml vollständigem Medium suspendiert. Hierbei ist zu beachten, daß die Zellen ohne Klumpen oder Aggregate gut dispergiert sind.

6, Das Zelleninoculum wird in den Rührkolben eingefüllt und das Gesamtvolumen wird mit vollständigem Medium auf 100 ml gebracht.

7· Die Rührkultur wird bei 37 °C auf einem nicht-geheizten Magnetrührer bei sehr geringer Geschwindigkeit (60 bis 90 Upm) gerührt, was gerade ausreicht, um die Suspension in Bewegung zu halten.

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8. Je nach Erfordernis wird durch Entfernung des Kolbens von den Rührer und Abaetzeniassen der Perlen nachgefüllt. Verbrauchtes Mediun wird abgesaugt und mit der gewünschten Menge an frischem Medium ersetzt.

9- Das Zuchtungsmedium sollte bei 1 χ 10 Zellen/ml und danach, alle 4-8 Stunden oder je nach Notwendigkeit entsprechend der Wachstumsrate gewechselt werden. (Ein rascheres Wachsen der Zellen kann häufigere Wechsel des Mediums erfordern.) 10. Der pH-Wert wird regelmäßig überwacht, da dieser die Wachstumsrate der Kultur stark beeinflußt.

Bei einer Kührkultur können die mit Zellen bedeckten Perlen zum Absetzen aus der Suspension gebracht v/erden, indem lediglich der Magnetrührer abgeschaltet wird. Kein Zentrifugieren ist erforderlich. Das iTührmedium kann dann abgesaugt v/erden, wobei eine hochkonzentrierte Zellpräparation zurückbleibt, welche zur Virusproduktion, für Experimentierzwecke oder zur Verwendung der Herstellung neuer Kulturen geeignet ist.

Die Zellen können von den Perlen nach konventionellen, auf dem Fachgebiet bekannten Mitteln, z. B. durch i'rypsin, entfernt werden. Nach der Entfernung des Züchtungsmediums und dem nachfolgenden Spülen mit Ca-freier und Mg-freier Salzlösung werden die Perlen dann in einer Trypsinlösung erneut suspendiert und bei 37 °C gerührt. Von der der Trypsinbehandlung unterzogenen Kultur sollten in häufigen Intervallen Proben für die mikroskopische Beobachtung abgezogen werden, und wenn ersichtlich ist, daß sich die Zellen abrunden und ablösen, wird der Ablösungsprozess durch kräftiges Pipettieren oder kurze Erhöhung der Rührgeschwindigkeit abgeschlossen.

Eine einfache, für die Abtrennung im Labormaßstab entwickelte Methode von mit Trypsin behandelten, gemäß der Erfindung gezüchteten Zellen verwendet ein gewebtes Nylonmaschenfiltermaterial (Warenbezeichnung Nytex) mit einer Porengröße von 63 /um in

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einem geeigneten Halter (Biorad Unipore Trichterhalter, Katalog-Nr. 3-4-2-0012). Die Anordnung aus Filter und Halter kann im Autoklaven sterilisiert werden, so daß die gesamte Trennung von Perlen/Zellen unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden kann. Der Trichterhalter besitzt eine Befestigungskaminer, welche zum Sammeln der Zellen an einem zweiten, kleinen Porenfilter unterhalb befestigt v/erden kann.

Das Auszählen der Zellen kann in einfacher und genauer Weise ohne Notwendigkeit einer Trypsinbehandlung durchgeführt werden, indem eine einfache Färbung mit Kristallviolett/Citrat und ein Hämocytometer verwendet werden. Diese Arbeitsweise erfordert nur wenige Minuten, wodurch eine regelmäßige Überwachung des gemäß der Erfindung durchgeführten Zeliwachstums möglich wird.

Obwohl das erfindungsgemäße Verfahren in einer Rührkultur durchgeführt wurde, können die Copolymerxsatperlen auch in stationärer Kultur oder Rollkultur verwendet werden, was Vorteile einer erhöhten Oberfläche und Zellausbeute mit den existierenden Gewebekultur-Lab or gerät on möglich macht. Die folgende Arbeitsweise kann mit entweder Glasbehältern oder behandelten Kunststoffbehältern durchgeführt werden:

1. Eine sterile Perlensuspension wird zur gleichförmigen Dispersion der Perlen kräftig geschüttelt.

2. Eine Überschußmenge des Perlengemisches wird in einen Gewebekulturbehälter gegossen (z. B. 25 ml in einen 150-cm -Kolben, 50 ml in eine 850-cm^-üchüttelflasche oder KoIl flasche).

3. Der Behälter wird 5 Minuten stehengelassen (der Kolben wird flach auf seine Seite gelegt oder die Flasche wird auf einen bei normaler Geschwindigkeit laufenden Walzenapparat aufgesetzt), um ein geeignetes Haften der Perlen an der gesamten Oberfläche des Behälters sicherzustellen.

4. Der Überschuß an Perlen wird herausgegossen (diese können in die Originalflasche zurückgebracht werden, und, falls sie

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steril sind, können sie erneut verwendet werden) und es wird einmal mit steriler Salzlösung oder Wachstumsmedium gespült. Dies sollte eine gleichmäßige Monoschicht der Perlen ergeben, welche fest an der Oberfläche des Behälters haften.

5. Der vorbereitete Behälter ist jetzt für die Impfung mit Zellen nach routinemäßigen Methoden vorbereitet. Es ist jedoch darauf hinzuweisen, daß ein solcher Behälter jetzt eine 3-4—fach größere Oberfläche als zuvor, welche für das Zellwachstum verfügbar ist, besitzt. Daher muß er mit einem entsprechend höheren Inoculum an Zellen beimpft werden. Weiterhin erfordert die höhere Konzentration an Zellen eine besondere Aufmerksamkeit für eine regelmäßige Nachfüllung und pH-Kontrolle.

6. Zellen, welche von selbst auf den Perlen und den Behälteroberflächen haften, sind leicht unter dem Mikroskop beobachtbar. Die Zellen können dann von diesen Oberflächen unter Anwendung der standardmäßigen Trypsinbehandlungstechniken geerntet werden.

Zellwachstumsträger gemäß der Erfindung liefern ebenfalls Zellträger für die Produktion von Viren. Die Virusinoculation und die Erntezeit werden durch die Verwendung eines einzelnen Behälters im Vergleich zu Dutzenden von Itollflaschen oder Kolben, stark reduziert. Zusätzlich kann die Vir'enkonzentration in Abhängigkeit von der Art des Virus und der für eine optimale Virusausbeute erforderlichen Inkubationszeit durch Herabsetzung der Menge an Nährmedium in einem vorgegebenen Behälter erhöht werden.

Die Zellen können direkt auf den Wachstumsträgern gemäß der Erfindung gefroren und hierauf aufbewahrt v/erden. Die Perlen mit den daran gebundenen Zellen (in der Log-Phase des Wachstums) sollten in frisches, vollständiges Medium mit 10 % Dimethylsulfoxid überführt, in Flaschen abgefüllt und unter Anwendung normaler Arbeitsweisen gefroren werden. Nach dem Auftauen sollten die Träger mit den anhaftenden Zellen frei von Gefriermedium

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gewaschen und in frisches Medium überführt werden. Die Zellen sollten sich wiederbeleben und auf den Perlen bis zum Zusammenfließen weiterwachsen.

Die folgenden Beispiele 3 "bis 8 zeigen, daß die Brauchbarkeit der bevorzugten Ausführungsforn mit Dimethylaminopropylpolyacrylamid zum Zwecke des Züchtens von Zellen in Rührkultur mit derjenigen von I)EAE-D ext ran vergleichbar und besser als mit anderen Acrylamidpolymerisaten wie Aninoäthylacrylanid ist.

In Beispiel 3 wurden drei unterschiedliche Typen von sphärischen Perlen mit vergleichbaren Ladungsdichten in einer Rührkultur miteinander verglichen. Es wurde gefunden, daß die Aminoäthylpolyacrylamidperlen ein besseres Zellwachstum als die ütyroldivinylbenzolperlen ergaben, was jedoch nicht vergleichbar mit dem auf DEAE-Dextran-Mikroträgern erzielten Wachstum war. In Beispiel 4- wurden die Aminoäthylpolyacrylamidperlen hinsichtlich des Vernetzungsgrades modifiziert, so daß sie den Perlen aus DEAE-Dextran stärker ähnlich waren. Ein Vergleich in Rührkultur zeigte ein besseres Verhalten der Polyacrylamidperlen, das dennoch demjenigen von DEAE-Dextranperlen unterlegen war.

in Beispiel 5 wurde die geladene Gruppe auf den Polyacrylamidperlen von einer primären Amingruppe zu einer tertiären Amingruppe geändert, und die Einstufencopolymerisation des die Ladung liefernden Monomeren mit den beiden anderen Monomeren, welche sonst noch die Polyacrylamidperlen ausmachen, wurde durchgeführt. EdmethylaminoproRylpolyacrylamidperlen, hergestellt wie in den Beispielen 1 und 2 mit drei unterschiedlichen Ladungsdichten wurden mit DEAE-Dextran in einer Rührkultur verglichen. Die Perlen mit Ladungsdichten von 1,2 und 1,4 mäq/g förderten das Zellwachstum in vergleichbarer Weise, wie dies auf DEAE-Dextran erreicht wurde.

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Schließlich zeigen die Beispiele 6 und. 7 die Leistungsfähigkeit von DMAP-polyacrylajnidzellträgerperlen mit einer Ladungsdichte von 1,32 mäq/g (0,069 mäq/ml) bei der Förderung des Wachstums von zwei anderen Zellstämmen.

Beisp_iel_3_

Dieses Beispiel betrifft den Vergleich des '.vachstums von Hep-2-Zellen auf vier unterschiedlichen Typen von Perlenmikroträgern. Epidermoide Carcinomazellen aus dem Kehlkopf des Menschen (Hep-2, American Type Culture Collection GC^₁ L'j>) wurden in parallel durchgeführten liünrkulturen zum Vergleich der das Wachstum fördernden Eigenschaften von vier unterschiedlichen Typen von sphärischen Kikroträgern verwendet;, riädich handelsüblichen Trägern AG1-X1 und AÜ1-X2 (Bio-Kad Kr. -14-0-1113 bzw. Hr. 14-0-1231), die aus Styroldivinylbenzoianionenaustauscherharzen bestanden, AE-P30, einem Aminoäthyipolyaci-ylumidgel mit einer Ausschlußgrenze von 30 000 DaIton, und DEAE-Dextran (Diäthylamincäthyldextran) -anionenaustauschern, die von der Anmelderin hergestellt werden waren. Die vier Typen von Perlen, welche sämtlich positiv geladen waren, unterschieden sich hinsichtlich der Ladungsdichte und des Vernetzungegrades. Die -baaunrcdichten betrugen für DEAE-Dextran = 2,2 mäq/g, für AE-P30 = 2,?i? mäo/g, für AG1-X1 = 3,2 mäq/g und far AG1-X2 =3,5 mäq/g. Alle Perlen v;aren in mit Phosphat gepufferter Salzlösung hydratisiert und im Autoklaven behandelt. Die Größe der hydratisieren Perlen lag im Bereich von 150 bis 3OO um in Salzlösung.

Die Hep-2-Zellen wurden aus einer 850 cm Gewebekultur-HoHflasche, auf der sie bis zum Zusammenfließen gezüchtet worden waren, geerntet. Nach dem Spülen der .Flasche mit mit Phosphat gepufferter Salzlösung wurde das Ablösen der Zellen unter Verwendung von 20 ml einer Lösung mit 0,0p ^L/o Trypsin und 0,02 % EDTA (Äthylendiamintetraessigsäure) bewerkstelligt. Die Trypsinbehandlung wurde dadurch angehalten, daß zu der Zellsuspension 100 ml frisches HhPI 1640 Medium, das 10 >o fetales Kalbsserum

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enthielt, zugesetzt wurden. Im Anschluß an das Zentrifugieren bei 1000 Upm während 10 Minuten wurde die überstehende Flüssigkeit abgesaugt und durch 10 ml frisches Medium ersetzt. Eine Probe der Zellsuspension wurde abschließend mit Trypanblau gefärbt und mittels eines Hämocytometer^ ausgezählt, um die Gesamtanzahl von zugänglichen, lebensfähigen Zellen zu bestimmen.

Es wurden üührkulturen hergestellt, indem zuerst vier sterile Rohrkolben mit Dulbecco's modifizierten Eagle-Medium, ergänzt mit 10 % fetalem Kalbsserum plus Antibiotika partiell gefüllt wurden. In jeden Kolben wurden dann die sterilen, hydratisierten Perlen bis zu einer Endkonzentration von 10 ml abgesetztem Bettvolumen auf 100ml Kultur zugesetzt. Schließlich wurden alle Kolben nach dem Impfen jeder Kultur mit 1 χ 10^ Zellen/ml bis zu den endgültigen Kuiturvolunina mit zusätzlichem Medium aufgefüllt. Die Kolben wurden dann auf einen auf 90 - 100 Upm eingestellten Magnetrührer in einem Inkubator von $7 ⁰C angeordnet.

Die Kulturen wurden drei Tage ohne Wechseln des Mediums inkubiert und dann auf Zellendichte und -morphologie mikroskopisch untersucht. Die Zellen hafteten an den Perlen aus DEAE-Dextran gut bis zu einer dem Zusammenfließen nahekommenden Zellendichte. Die Zellen waren mit einer sauberen, epithelähnlichen Morphologie gut ausgebreitet. Im Gegensatz dazu hafteten die Zellen an den Perlen aus AE-P30 nur bis zur Hälfte der zuvor angegebenen Dichte, wobei zahlreiche abgerundete Zellen in dem überstehenden Medium beobachtet wurden. Die Zellen waren ungleichmäßig unter den Perlen verteilt und in ihrem Aussehen im allgemeinen granular. Die Zellen hafteten nur minimal an Perlen aus sowohl AG1-X1 als auch AG1-X2, wobei der größte Teil des Zelleninocuiums in der Suspension zurückblieb. Der pH-Wert des Medium blieb zwischen 7,0 und 7,2 in den Kulturen auf DEAE-Dextran und AE-P30 stabil, während in den Kulturen auf AG1-X1 und AG1-X2 das

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Phenolrot vollständig durch die Perlen absorbiert wurde und der pH-Wert auf Werte weit oberhalb 8,0 anstieg.

3eisOiel_4-

Dieses Beispiel betrifft einen Vergleich des Wachstums von Hep-2-Zellen auf perlenf örinigen I^v!ikroträgern aus Aminoäthylpolyacrylamid und aus DEAE-Dextran.

Die das Wachstum fördernden Eigenschaften von Aminoäthylpolyacrylamidperlen mit einer Ausschlußgrenze von 100 000 DalOon (AE-PIOO-Perlen) wurden mit denjenigen von im Handel erhältlichen Mikroträgern aus DEAE-Dextran (Flow Laboratories Nr. 60-005-10) unter Verwendung von parallel betriebenen Hührkulturen von Hep-2-Zellen verglichen. Beide Perltypen waren in mit Phosphat gepufferter Salzlösung suspendiert und im Autoklaven behandelt worden, wobei die Größe der nassen Perlen 120 - 300 um betrug.

ρ Die Hep-2-Zellen iifurden aus einem 150 cm (iewebekulturkolben, auf welchem sie bis zum Zusammenfließen gewachsen waren, geerntet. Es wurde die gleiche Arbeitsweise wie in Beispiel 3 mit der Ausnahme angewandt, daß 6 ml von i'rypsin-EDTA für das Ablösen der Zellen und 30 ml HPMI 1640-rledium mit 10 % fetalem Kalbsserum zum Abstoppen der 'Irypsinbehandlung verwendet wurden.

Es wurden zwei Rührkulturen entsprechend den Angaben in Beispiel 3 hergestellt. Das verwendete Kulturmedium war HPMI 1640-Medium, ergänzt mit 10 % fetalem Kalbsserum, 100 E/ml Penicillin und 50 ug/ml Streptomycin. Die Perlen wurden in einer Konzentration von 2 g Trockengewicht pro Liter Kultur und die Zellen in einer Konzentration von 1 χ 10VmI zugesetzt.

Die Kulturen wurden während 7 Tagen bei 37 ⁰C inkubiert, wobei das Medium in dieser Zeitspanne zweimal erneuert wurde. Zum Wechsel des Mediums wurden die Kolben zuerst von dem Magnetrührer abgenommen und die Perlen sich absetzen gelassen. Dann

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wurden etwa 50 % des überstehenden Mediums abgesaugt und durch, frisches Medium ersetzt. Eine tägliche Überwachung des Zeilwachst uns wurde durch Entnahme von 2 dl Proben der gut gemischten Kultursuspension und deren Zentrifugieren bei 1000 Upm während 10 Minuten durchgeführt. Das überstehende Medium wurde dann dekantiert und durch ein gleiches Volumen von 0,1 M Citrat-0,1 % Kristallviolett ersetzt. Nach einstündiger Inkubation bei 37 °C wurden die freigesetzten Kerne mit einem Hämocytometer ausgezählt.

Obwohl die Zellen auf beiden Perlentypen hafteten, sich vermehrten und eine gute Morphologie beibehielten, zeigten die folgenden Beobachtungen, daß sich Aminoäthylpolyacrylamid nicht so gut verhielt wie DEAE-Dextran. (1) Die Aininoäthylpolyacrylamidkultur zeigte eine eintägige Verzögerungsphase, während der etwa 10 - 20 % des ursprünglichen Zellinocuiums verloren ging. (2) Sobald beide Kulturen die Log-Phase erreichten, war die ZeIlverdoppelungsrate auf Aminoäthylpolyacrylamid sehr viel langsamer als auf DEAE-Dextran (Verdoppelungszeiten von 60 Stunden bzw. 47 Stunden). (3) Die Endzelidichte auf Aminoäthylpolyacrylamid nach sieben Tagen betrug nur die Hälfte des Wertes auf DEAE-Dextran.

3eisp_iel_5

Dieses Beispiel betrifft das Wachstum von Hep-2-Zellen auf perlenförmigen Zellträgern aus Dimethylaminopropylpolyacrylamid und einem Vergleich von drei Ladungsdichten.

Das Wachstum von Hep-2-Zellen auf Perlen aus Dimethylaminopropylpolyacrylamid wurde mit demjenigen auf den im Handel erhältlichen DEAE-Dextran-Mikroträgern von Beispiel 4 verglichen. Die Perlen wurden nach den in den Beispielen 1 und 2 beschriebenen Arbeitsweisen so hergestellt, daß sie drei verschiedene Ladungsdichten aufwiesen nämlich 1,2 mäq/g (0,060 mäq/ml), 1,4 mäq/g (0,074 mäq/ial)

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und 1,75 mäq/g (0,105 mäq/ml). Alle Perlen wurden in mit Phosphat gepufferter Salzlösung vor der Verwendung einer Autoklavenbehandlung unterzogen. Die Größen der nassen Perlen betrugen 100 - 180 um für die Copolymerisatperlen und 120 300 um

für die DEAE-Dextran-Perlen.

Es wurden vier parallel durchgeführte Rürhkulturen entsprechend den Angaben in Beispiel 4 hergestellt, wobei aus drei zusammenfließenden 150-cm -Kolben geerntete Hep-2-Zellen verwendet wurden. Es wurde Dulbecco's modifiziertes Eagle-Kedium mit 10 % fetalem Kalbsserum plus Antibiotika als Kulturmedium verwendet. Um äquivalente Oberflächen für das Wachstum bereitzustellen, wurden die Copolymerisatperlen in einer Konzentration von 1 g Trockengewicht pro Liter Kultur und die DEAE-Dextranperlen in einer Konzentration von 2 g pro Liter zugesetzt. Die Zellen wurden dann in einer Menge von 1 χ 10⁵ Zellen/ml eingeimpft. Die Kulturen wurden während acht Tagen bei 37 ⁰G unter regelmäßigem Wechsel des Mediums inkubiert. Während dieser Zeitspanne wurde das Zellwachstum entsprechend den Angaben von Beispiel 4 täglich überwacht.

Die Zellwachs tunisrat en waren auf allen Perlen vergleichbar. Unterschiede ergaben sich hinsichtlich der Zellmorphologie, des Verlustes an Zellinoculum und der maximalen Zelldichte. Hinsichtlich dieser Werte waren die Copolymerisatzellträger mit der höchsten Ladungsdichte den drei anderen Proben der Perlen unterlegen. Die Zellen behielten eine ausgezeichnete Morphologie sowohl auf den Proben mit 1,2 mäq/g als auch 1,4· mäq/g als auch auf dem DEAE-Dextran bei. Im Gegensatz dazu waren die Zellen auf der Probe mit 1,75 mäq/g abnormal abgeflacht und besaßen ein stark granulatförmiges Aussehen. Sowohl bei der Probe mit 1,2 mäq/g als auch der DEAE-Probe wurde kein Verlust an Zellinoculum festgestellt. Die Probe mit 1,4- mäq/g erreichte die gleiche hohe Zelldichte wie DEAE-Dextran.

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Beisniel 6

Dieses Beispiel betrifft das Wachstum von VEKO-Zellen auf perlenförmigen Zellträgern aus Dimethylaminopropylpolyacrylamid.

Nierenzellen der afrikanischen, grünen Meerkatze (VEEO, American Type Culture Collection CCLdI) wurden in einer üührkultur auf den entsprechend der in Beispiel 1 Geschriebenen Arbeitsweise hergestellten Pei-len gezüchtet. Diese Zellträger besaßen eine Ladungsdichte von 1,32 mäq/g (0,069 mäq/ml), was den Proben rait niedrigerer Ladungsdichte von Beispiel 5 vergleichbar ist.

Die VEHO-Zellen wurden aus zv/ei zusammenfließenden 150-cm Kolben, wie in Beispiel 4, geerntet. Das verwendete Kulturmedium war EP?!I 164G-Medium, ergänzt mit 10 % fetalem Kalbsseruin, 100 E/ml Penicillin und 50 ng/ml otreptomycin. Die Perlen vmrden in einer Konzentration von 5 C Trockengewicht pro Liter Kultur und die Zellen in einer Menge von 2 χ 10^/ml zugesetzt. Die Zellen wurden unmittelbar nach dem Impfen und während der 16-tägigen Inkubation ausgezählt. Nach dem fünften Tag der Züchtung wurde das Medium täglich mit Ausnahme des Wochenendes an den Tagen und 11 erneuert.

Es trat kein Verlust an Zellinoculum auf, und das Wachstum war bis zu einer Konzentration von 7 x 10 Zellen/ml exponentiell. Die Verdoppelungszeit der Kultur betrug 6? .Stunden.

Beispiel_7

Dieses Beispiel betrifft die Züchtung von BiiK-21I)'-Zellen. Von einer Verankerung abhängige Nierenzellen von Babyhamster wurden in einer Rührkultur auf den in Beispiel 1 hergestellten Perlen gezüchtet. Die Kultur wurde entsprechend den Angaben in Beispiel 6 jedoch mit der Ausnahme hergestellt, daß die Perlen in einer Konzentration von ^zf g/l und die Zellen in einer Menge von 3 x 10^/ml zugesetzt wurden. Die Zellen wurden unmittelbar

nach, dem Einimpfen und während der fünftägigen Inkubation ausgezählt. Das Medium wurde am ersten und am zweiten Tag der Züchtung erneuert.

Es trat kein Verlust des Zellinoculuns auf, und das Zellwachstuin war bis zu einer Konzentration von 1,2 χ 10 Zellen/ml exponentiell. Die Verdoppelungszeit der Kultur betrug 25 Stunden.

£eispiel_8

Dieses Beispiel betrifft die Gefrierlagerung von Zellen auf Mikrokugeln.

Hierenzeilen von der afrikanischen, grünen Meerkatze (VERO, American Type Culture Collection CCL 8") wurden in einer F.üarkultur auf den in Beispiel 1 hergestellten I-erien gezüchtet. In dct.JjOg-Phase dec Wachstums mit einer Konzentration von 9»8 χ '\Qr Zellen/ml wurden ^O ml der rut suspendierten itührkultur entfernt und 5 Minuten bei 1000 up::: zentrifugiert. Die überstehende flüssigkeit wurde encfernr, und die Perlen v/urden erneu"U in frischem, vollständigem Medium (ΚΡΙΊΙ 164-0) mit 10 % I)YiUQ bis zu einem Gesamtendvolumen von 10 ml resuspendiert. Jeweils zwei Ampullen von 5 ml wurden bis auf einem Volumen von 4· ml mit der Suspension gefüllt und für die Lagerung verschlossen. Die Ampullen wurden allmählich tiefgefroren, nämlich 1 Stunde bei -20 C, 1 Stunde bei -4-0 ⁰C und dann in flüssigem Stickstoff.

Die Ampullen wurden etwa 60 ?age danach aufgetaut. Die Perlen wurden mit frischem Medium zur Entfernung von LnSO gewaschen und in einer Kührkultur mit frischen, vollständigem Medium erneut gestartet. Kach dreitägiger Züchtung ohne Wechsel des Mediums wurde festgestellt, daß zahlreiche Zellen rund und in Suspension vorlagen, daß jedoch einige ai: den Perlen hafteten und eine gute Morphologie zu haben schienen.

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Beisj)iel_2

Dieses Beispiel zeigt die Verwendbarkeit der erfindungsgemäßen, neuen Copolymerisate als Ionenaustauschermatrix und Praktionierungsmatrix.

Hierzu diente die Gammaglobulinisolierung aus Kaninchenserum.

2,5 ml Antiziegen-Immunoglobulin-G-serum von Kaninchen wurde 16 Stunden gegen 2 1 0,02 M K₂HPO₄, pH = 8,0, 0,02 % NaN₅ dialysiert. Das zurückbleibende Produkt wurde 10 Minuten bei 2000 χ g zentrifugiert, hierbei wurden 3,9 dl überstehende Flüssigkeit erhalten. 1,5 Ql der überstehenden Serumflüssigkeit wurden auf 9 dl in Beispiel 1 hergestelltes Copolymerisat (1,0 χ 11-cm-Säule), die mit 0,02 M K₂HPO₄, pH = 8,0, 0,02 % NaN₅ ins Gleichgewicht gesetzt worden waren, aufgebracht. Das Gel wurde mit Startpufferlösung eluiert und die i'raktionen, welche nicht durch die Säule gebundenes Protein enthalren, wurden vereinigt. Eine Immunoelektrophorese nach Grabar-V/illiams an. der nichtgebundenen Proteinfraktion zeigte nur die Anwesenheit von Gammaglobulin. Die umgekehrte Hadialirmunodiffusion dieser Globulinfraktion an einem Agarosegel, das Ziegen-IgG enthielt, zeigte, daß 68 % der anfänglichen Antikörperaktivität in der nichtgebundenen Globulinfraktion wiedergewonnen wurden. Die angewandte Arbeitsweise ist eine Methode, welche häufig zur Isolierung der Gammaglobulinfraktion von Serum unter Verwendung von DEAE-Cellulose angewandt wird. Die Methode liefert typischerweise eine Gammaglobulinfraktion, welche von 65 bis 70 % der anfänglichen aktiven Antikörper enthält. Das verwendete Volumen von abgesetztem Copolymerisat ist äquivalent zu dem Volumen von DEAE-Cellulose (Bio-Rad High-Capacity Cellex Ω), das normalerweise verwendet wird. Das Copolymerisat hatte dieselben guten Eigenschaften wie DEAE-Cellulose bei diesem Versuch.

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Claims

PATENTANWÄLTE DIPL.-ING. R. SPLANEMANN dipl-chem. dr. B. REITZNER ZUOEL. VERTRETER BEIM EPA · PROFESSIONAL REPRESENTATIVES BEFORE EPO ■ MANDATAIRES AQREES PRES L'OEB 8OOO München 2 3. Oktober 1979 Bio-Rad Laboratories, Inc. ]'™ Wright Avenue, Richmond, Kalif. τ.ι«:52β« (V.St.A.) Un„r. Akte: I325-I-IO.772 Ihr Zeichen: Pat ent anmeldung Mikroträpier-Zellkultur Patentansprüche

1. Zellträger zur Züchtung von bindungsabhängigen Zellen, dadurch gekennzeichnet, daß er ein unlösliches, kati.onisch.es Copolymerisat umfaßt, das bei der Copolymerisation von

a) einem hydrophilen Monomeren,

b) einem vernetzenden Monomeren in i'orm von Di- und PoIyviny!verbindungen, und

c) einem kationischen Monomeren der folgenden Formel:

Z₂O R₃ ₉ CHp=C-C-Y-(CHp)-N-R. Α^θ

worin sind:

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Konten : Deutsche Bonk AG. München, Konlo-Nr. 2014 009 ■ Poiticheck : München 600 60-807

Y = O, NH oder CH₂,

Ep = H oder ein niederer Alkylrest, η = eine ganze Zahl von O bis 6, E, und E^ jeweils ein niederer Alkylrest, E₁- - H oder ein niederer Alkylrest, und A ein Anion,

hergestellt worden ist, wobei das Copolymerisat eine Ladungsdichte von 0,050 bis 0,150 mäq/ml besitzt.

2. Zellträger nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß er unter Verwendung eines hydrophilen Monomeren der folgenden Formel hergestellt worden ist:

CH₂=C -Z

worin sind:

E^ = H oder ein niederer Alkylrest, und 0

Il

Z = CN oder -C-X, worin X ein niederer Alkoxy-, Amin-, niederer Alkylamin-, Hydroxylaminrest oder NH₂ ♦

3. Zellträger nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß er. unter Verwendung eines vernetzenden Monomeren in Form von Alkylendiaciylaten, Alkylendinethacrylaten, Oligo- oder Poly-glykc iacrylaten, Alkylen-bis-acrylamiden oder Alkylenbis-methacrylamiden hergestellt worden ist.

4. Zellträger nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß er unter Verwendung von Alkylen-bis-acrylamid als vernetzendem Monomeren hergestellt worden ist.

5· Zellträger nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß er unter Verwendung eines hydrophilen Monomeren hergestellt worden ist, in welchem X = NH₂ ist.

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6. Zellträger nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß er unter Verwendung eines kationischen Monomeren hergestellt worden ist, in welchem Y = K-H ist.

7. Zellträger nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß er unter Verwendung eines kationischen Monomeren hergestellt worden ist, in welchem Hp und R- jeweils ein niederer Alkylrest und R,- = H sind.

8. Zellträger nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Monomeren a) , b) und c) in Mengen von 25 "bis 4-5, 4O "bis 75 bzw. 3 bis 10 Gew.-% vorhanden sind.

9. Zellträger nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das hydrophile Monomere 30 bis 38 Gew.-70, das kationische Monomere 60 bis 75 Gew.-% und das vernetzende Monomere 7 "bis 9 Gew.-% ausmachen.

10. Zellträger nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Copolymerisat Perlen mit einem Durchmesser von etwa 120 bis 180 11m aufweist.

11. Neue polymere Zusammensetzungen, dadurch gekennzeichnet, daß das Copolymerisat 20 bis 4-5 Gew.-/i Dimethylaminopropylmethacrylamid, 4-0 bis 75 Gew.-^CA> Acrylamid und 3 "bis 10 Gew.-% Methylen-bis-acrylamid umfaßt.

12. Zusammensetzung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Gewichtsverhältnis von Acrylamid zu Methylen-bis-acrylamid zu Dimethyl-aminopropylmethacrylamid 70,2 : 7»3 : 22,5 beträgt.

13· Zusammensetzung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Gewichtsverhältnis von Acrylamid zu Methylen-bis-acrylamid zu Dimethyl-aminopropy!methacrylamid 55 : 6 : 39 beträgt.

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14. Zusammensetzung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Gewichtsverhältnis von Acrylamid zu Methylen-bisacrylamid zu Dimethyl-aminopropylmethacrylamid 61,3 : 6,4 : 32,3 beträgt.

15· Verfahren zur Züchtung von bindungsabhängigen Zellen, dadurch gekennzeichnet, daß es die Stufen der Bereitstellung einer Zellträger nach Anspruch 1 umfassenden Suspension, eines Inokulums der Zellen und eines nährstoffhaltigen Züchtungsmediums und das ausreichende Rühren zum Inbewegunghalten der Suspension bei einer Temperatur zwischen 20 C und 45 ⁰C umfaßt.

16. Verfahren zur Lagerung von bindungsabhängigen Zellen, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen auf Zellträgern gezüchtet werden, daß die auf diesen Trägern vorliegenden Zellen gefroren werden und daß die Zellen und die Träger in einer durch Tieftemperatur geschützten Umgebung gehalten werden, wobei die Zellen in Klutur wiederbelebt und wiedergestartet . und zur Konfluenz gezüchtet werden können.

17.Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen nach der Methode nach Anspruch 15 gezüchtet werden.

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