DE60031244T2

DE60031244T2 - Reinigung von biologischen substanzen

Info

Publication number: DE60031244T2
Application number: DE60031244T
Authority: DE
Inventors: Henry Cary Kopf
Original assignee: NCSRT Inc
Current assignee: NCSRT Inc
Priority date: 1999-02-22
Filing date: 2000-02-22
Publication date: 2007-05-24
Anticipated expiration: 2020-02-23
Also published as: EP1154827A1; DE60031244D1; EP1154827A4; EP1154827B1; IL144421A; US6383380B1; WO2000048703A1; DK1154827T3; WO2000048703B1; IL144421A0; CA2361545A1; CA2361545C; AU3008300A; ATE342112T1; NZ513242A; WO2000048703A9; AU756832B2

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft allgemein ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Reinigen von biologischen Zielsubstanz(en), wie beispielsweise ausgewählten Proteinen, Antikörpern, Antigenen, Gerinnungsfaktoren, Glycoproteinen und Hormonen, aus Ausgangsflüssigkeiten, enthaltend verunreinigende Substanzen, die Molekulargewichte oder andere physikalische oder chemische, sich von der Zielsubstanz unterscheidende Eigenschaften aufweisen, wobei die Reinigung durch sequentielle Chromatographie- und Diafiltrations-Trennschritte in einem Querstromfiltrationssystem bewirkt wird.
Beschreibung des Standes der Technik
Für die Entfernen von Substanzen aus Flüssigkeitsproben werden verschiedene Reinigungsverfahren durchgeführt. Die Präzipitation, Zentrifugation, Filtration, Chromatographie und Verdampfung werden alle mit unterschiedlichem Erfolg im Hinblick auf die Ausbeute, den Zeitaufwand, die Reinheit und Kosten angewendet.
Im Bereich der biologischen Reinigung sind die Zentrifugation, Chromatographie und Filtration besonders nützlich, um äußerst wertvolle Substanzen aus den Flüssigkeitsproben mit Ausbeuten zu erhalten, die im Bereich von 10 bis 90 Prozent und bei einer Reinheit bis zu 95 Prozent liegen.
Bei den gegenwärtigen Zentrifugations-, Chromatographie- und Filtrationsanwendungen wird allgemein davon ausgegangen, dass die Aus beute und Reinheit im umgekehrten Verhältnis zueinander stehen und dass die Ausbeuten für jeden anschließenden Reinigungsschritt deutlich niedriger liegen. Es wird auch davon ausgegangen, dass diese Zentrifugations-, Chromatographie- und Filtrationsverfahren teuer und relativ langsam sind und eine Ausrüstung verwenden, die vor ihrer Wiederverwendung sehr schwer zu reinigen ist.
Ein besonderes Problem ist in dieser Hinsicht die Reinigung von Festbettchromatographiesäulen, bei denen unregelmäßige Strömungskanäle tendenziell durch das Chromatographieharz gebildet werden. Diese unregelmäßigen Strömungskanäle stellen ein besonderes Problem bei der Reinigung von biologischen Substanzen dar, da nachfolgende Chargen verunreinigt werden können, wenn die Säule nicht vollständig gereinigt wird.
Ein Beispiel ist die Reinigung von Plasmaproteinen auf Ionenaustausch- und Affinitätschromatographiesäulen. Wenn eine auf Virusfreiheit getestete Plasmacharge, wie später festgestellt wird, mit einem Virus verunreinigt ist, ist es nahezu unmöglich zu ermitteln, mit welcher Sicherheit das Virus aus der Säule entfernt wurde. Darüber hinaus ist, weil biologische Flüssigkeiten leicht das Bakterienwachstum unterstützen, eine einfache bakterielle Verunreinigung und ein Wachstum von Organismen in chromatographischen Säulen keineswegs selten. Bakterielle Organismen und die durch die Bakterien erzeugten Endotoxine haben unzählige Chargen von pharmazeutischen Produkten verunreinigt, was zu signifikanten finanziellen Verlusten sowie ungünstigen Reaktionen bei den Empfängern des Endprodukts geführt hat.
Die häufig beobachteten „Rattentunnel", die so problematisch für die Bewertung des Reinigungsverfahrens sind, machen auch einen wichtigen Teil der Funktion und Lösungsfähigkeit von Chromatographiesäulen zunichte.
Ein weiteres Problem von Festbettchromatographiesäulen ist eine Komprimierung des Harzes, insbesondere im Fall von weicheren Gelen, wie beispielsweise Agarose (z.B. Sepharose^® Gel, im Handel erhältlich von Pharmacia). Die gemeinschaftlichen Probleme des Tunnelns und des Komprimierens erhöhen die Chromatographiekosten erheblich, da sie große Mengen an überschüssiger Bindungskapazität erfordern. Ein weiteres Problem, das durch das Komprimieren und Tunneln bewirkt wird, ist ein Verlust der Reinheit. Eine hohe Reinheit erfordert eine gleichförmige Elution der Zielsubstanz. Ein Tunneln und Komprimieren verhindern eine gleichförmige Verteilung der Elutionsflüssigkeit, was zu einer ungenauen Trennung der Zielsubstanz von den verunreinigenden Substanzen, die ähnliche Elutionsprofile wie das Zielprodukt haben, sowie zu willkürlich eluierten, verunreinigende Substanzen, die in den komprimierten Medien eingeschlossen sind, führt.
Im Fall der Reinigung von monoklonalen Antikörpern ist es üblich, eine Säule mit einem zehnfachen Überschuss an Bindungskapazität zu packen. In einem gut verteilten System wäre es möglich, das ganze Zielprodukt mit nur einer dreifachen Überschusskapazität zu binden, wodurch die Kosten der Chromatographiemedien um das Dreifache gesenkt würden.
Ein üblicher Ansatz zum Reduzieren des Tunnelns und Komprimierens ist es, den Betriebsdruck der Säule durch ein Verringern der Strömungsrate zu senken. Obwohl die Praxis des Verringerns der Strömungsrate ein Komprimieren des Harzes reduziert, wird die Verarbeitungszeit erheblich erhöht und in vielen Fällen die Auflösung und die Ausbeute des Verfahrens negativ beeinflusst.
Eine Tangentialstromfiltration verwendet Membranen mit verschieden großen Poren zum Trennen von Substanzen in Flüssigkeiten durch Pumpen der Flüssigkeit parallel zur Membranoberfläche. Obwohl sich dieses Verfahren bei der Konzentration von Substanzen, die in Wasser und/oder Puffern suspendiert sind, als wirksam gezeigt hat, hat es sich bei der Reinigung von Verbindungen in Lösung nicht als sehr nützlich erwiesen. Das erste Problem dieses Verfahrens ist es, dass die Porengröße nicht gleichförmig genug ist, um die Trennung von zwei Partikeln mit nahezu gleicher Größe zu ermöglichen. Darüber hinaus binden Substanzen in dem Flüssigkeitsgemisch, insbesondere Proteine und Lipide, an die Membranoberfläche, ein Phänomen, das als „Gelschichtpolarisierung" bezeichnet wird, wodurch die effektive Porengröße sowie die Oberflächenchemie der Membran verändert werden.
Fließbettchromatographie ist eine weitere Einrichtung zum Trennen von Substanzen von flüssigen Gemischen. Fließbettchromatographie wird häufiger in der chemischen und Erdölindustrie verwendet. Fließbettsäulen sind oft 10 Fuß (3,05 Meter) hoch oder höher und haben einen Durchmesser von 9 bis 12 Zoll (22,86 bis 30,48 cm). Pharmazeutische und Bioverfahrenssäulen sind gewöhnlich weniger als 3 Fuß (91,44 cm) hoch und haben eine große Auswahl von Durchmessern, die im allgemeinen Bereich von 1 bis 24 Zoll (2,54 bis 60,96 cm) liegen, je nach den Komprimierungseigenschaften des Harzes. Die Vorteile eines Fließbetts sind höhere Strömungsraten bei niedrigeren Drücken im Vergleich zur Festbettchromatographie. Obwohl die höheren Strömungsraten bestimmte Vorteile gegenüber der chromatographischen Trennung bieten, weist das Verfahren mehrere Mängel auf. Das Verfahren erfordert Harze mit größerem Durchmesser, die gegenüber der Schwerkraft neutral oder schwimmfähig sind. Diese größeren Harze mit einem mittleren Durchmesser von 100 bis 300 μm haben eine geringere Oberfläche pro Volumeneinheit als kleinere Harze mit 1 bis 100 μm, die in Festbettsäulen verwendet werden, und dementsprechend haben sie eine geringere Oberflächenbindungskapazität.
Um den Oberflächenverlust zu minimieren und die Dichte zu reduzieren, haben die Fließbettharze einen stark porösen Aufbau. Allerdings sind diese Harzpartikel als Ergebnis ihrer porösen Beschaffenheit äußerst empfindlich gegenüber einer Rissbildung, wodurch kleine Feststoffe erzeugt werden, die die Einlass- und Auslassöffnungen der Säule blockieren.
Das wichtigste Problem beim Fließbett ist das Mischen. Da die Säule keine statischen Mischeinrichtungen enthält, wird das Bett in herkömmlicher Wiese mittels Luftströmen oder durch Rückführen der zu trennenden Flüssigkeit durch die Säule bei einer hohen Strömungsrate gemischt. Die hohe Strömungsrate und das begrenzte Mischen hemmen die gleichförmige Phasenänderung, die während der Elution des Produkts aus dem Harz erforderlich ist.
Als Ergebnis der oben beschriebenen Mängel des Standes der Technik gibt es einen zwingenden Bedarf an einem schnellen, gleichmäßigen, zeit- und kostengünstigen System zum Reinigen von biologischen Zielsubstanzen aus komplexen Flüssigkeitsquellen. Ein solches System überwindet günstigerweise die Probleme, die den oben beschriebenen verschiedenen Trennverfahren des Standes der Technik innewohnen. Ein solches System ist auch günstigerweise ohne weiteres skalierbar, kann an Verfahrensvolumen des Ausgangsmaterials im Bereich von Milliliter im Forschungslaboratorium bis Tausende Liter, die gewöhnlich bei der biopharmazeutischen Produktion angetroffen werden, angepasst werden. Schließlich ist ein solches System günstigerweise in der Lage, mit den Ausgangsflüssigkeiten von stark variierenden Eigenschaften, einschließlich viskösen komplexen Lösungen, verwendet zu werden.
Das Dokument US-A-5 556 545 offenbart ein Verfahren zu Gewinnung und Reinigung von Arsen aus einer Flüssigkeitsquelle, wobei das Arsen an Aluminiumoxid gebunden ist, das anschließend durch Querstromfiltration konzentriert wird. Die Aluminiumoxidregeneration erzeugt eine konzentrierte Asenlösung.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Reinigungsverfahren nach Anspruch 1, eine Vorrichtung nach Anspruch 62 und eine Verwendung nach Anspruch 80.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt eine allgemeine Darstellung eines Reinigungsverfahrens nach einer Ausführungsform der Erfindung unter Verwendung einer Vorrichtung, die auf einer Querstromfiltration beruht.
2 zeigt eine schematische Darstellung einer Vorrichtung, die zum Klären einer Ausgangsflüssigkeit, die nachfolgenden Reinigungsschritten zuzuführen ist, nützlich ist.
3 zeigt die mikroskopische Topographie eines Orbicell^® Kügelchens zur Verwendung in einem Chromatographieharz im Vergleich zu dem standardmäßigen porösen Kügelchen des Standes der Technik.
4 zeigt eine schematische Darstellung des Strömungswegs um ein Orbicell^® Kügelchen herum durch Vergleich mit den Strömungswegen um und durch ein standardmäßiges poröses Kügelchen des Standes der Technik.
5 zeigt eine schematische Darstellung einer Vorrichtung, die zum Durchführen der Querstromchromatographiereinigungs-, Elutions-, Gewinnungs- und Konzentrationsschritte des Verfahrens der vorliegen den Erfindung in einer Ausführung nützlich ist, bei der ein Querstromfiltermodul verwendet wird.
6 zeigt eine schematische Darstellung einer alternativen Vorrichtung, die zum Durchführen der Querstromchromatographiereinigungs-, Elutions-, Gewinnungs- und Konzentrationsschritte des Verfahrens der vorliegenden Erfindung in einer anderen Ausführungsform nützlich ist, wobei zusätzlich ein zweites Querstromfiltermodul von unterschiedlicher Porosität als das erste verwendet wird.
7 zeigt eine SDS Polyacrylamidgelelektrophoreseanalyse einer IgG Probe, die mittels des Verfahrens der vorliegenden Erfindung aus menschlichem Rohplasma gereinigt wurde.
8 zeigt eine SDS Polyacrylamidgelelektrophoreseanalyse einer IgG Probe, die mittels des Verfahrens der vorliegenden Erfindung aus Zellkulturmedien gereinigt wurde.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG UND BEVORZUGTE AUSFÜHRUNGSFORMEN
Definitionen, Materialien und Ausrüstung
In der Beschreibung der vorliegenden Erfindung werden wie nachfolgend definiert bestimmte Begriffe verwendet.
„Ausgangsflüssigkeit", wie hier verwendet, betrifft eine Flüssigkeit, enthaltend mindestens eine und möglicherweise zwei oder mehr biologische Substanzen oder Produkte von Wert, die aus anderen, auch vorhandenen Substanzen gereinigt werden sollen. In der Praxis der Erfindung können die Ausgangsflüssigkeiten zum Beispiel wässrige Lösungen, organische Lösungsmittelsysteme oder wässrige/organische Lösungsmittelgemische oder Lösungen sein. Die Ausgangsflüssigkeiten sind oft komplexe Gemische oder Lösungen, die viele biologische Moleküle, wie beispielsweise, Proteine, Antikörper, Hormone und Viren, sowie kleine Moleküle, wie beispielsweise Salze, Zucker, Lipide usw., enthalten. Obwohl bei einer typischen Ausgangsflüssigkeit biologischen Ursprungs von einer wässrigen Lösung oder Suspension ausgegangen werden kann, können auch organische Lösungsmittel enthalten sein, die in früheren Trennschritten, wie beispielsweise Präzipitationen, Extraktionen und dergleichen, verwendet werden. Beispiele für Ausgangsflüssigkeiten, die wertvollen biologischen Substanzen enthalten können, die für das Reinigungsverfahren der Erfindung zugänglich sind, umfassen einen Kulturüberstand von einem Bioreaktor, eine homogenisierte Zellsuspension, Plasma, Plasmafraktionen, Milch, Kolostrum und Käsemolke, sind aber nicht darauf beschränkt.
Der Begriff „Zielsubstanz" betrifft hier ein gewünschtes Produkt oder mehrere gewünschte Produkte, das bzw. die aus der Ausgangsflüssigkeit zu reinigen ist/sind. Zielsubstanzen sind biologische Produkte von Wert, zum Beispiel Immunglobuline, Gerinnungsfaktoren, Impfstoffe, Antigene, Antikörper, ausgewählte Proteine oder Glycoproteine, Peptide, Enzyme usw. Die Zielsubstanz kann in der Ausgangsflüssigkeit als Suspension oder in Lösung vorhanden sein. Zur Vereinfachung wird hier der Begriff „Zielsubstanz" im Singular verwendet, es ist aber davon auszugehen, dass er mehr als eine zu reinigende Substanz betreffen kann, entweder zusammen als Nebenprodukte oder getrennt (z.B. nacheinander) als einzelne gewonnene Komponenten.
„Verunreinigende Substanzen" betrifft Materialien in der Ausgangsflüssigkeit, die sich von der/den Zielsubstanz(en) unterscheiden und günstigerweise aus dem Endzielsubstanzprodukt(en) entfernt werden. Typische verunreinigende Substanzen umfassen Nukleinsäuren, Proteine, Peptide, Endotoxine, Viren usw. Verunreinigende Substanzen, die durch die Praxis des erfinderischen Verfahrens entfernt werden können, besitzen eine oder mehr Eigenschaften, die sich von denen des gewünschten Produkts unterscheiden, z.B. Molekulargewicht, Ladung, spezifische Affinität für verschiedene Liganden und so weiter. Viele verunreinigende Substanzen sind bioaktiv und ihr Entfernen zwingend erforderlich, damit das gereinigte Produkt in seiner Endanwendung verwendet werden kann. Darüber hinaus müssen, wegen schädlicher Wirkungen, die sie bei anschließenden Verwendungen auf die Zielprodukte ausüben können, bestimmte verunreinigende Substanzen aus der Reinigungsvorrichtung auf äußerst niedrige und vorzugsweise nicht nachweisbare Niveaus durch Reinigen entfernt werden. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ermöglicht eine äußerst wirksame Dekontamination, wie nachfolgend ausführlicher beschrieben ist.
„Querstromfilter" betrifft hier eine Art Filtermodul oder Filterkassette, die ein poröses Filterelement enthält, über deren Oberfläche das flüssige, zu filtrierende Medium in tangentialer Strömungsweise fließen gelassen wird, und zwar zur Permeation durch das Filterelement von ausgewählten Komponente(n) des flüssigen Mediums. Bei einem Querstromfilter dient die Scherkraft, die auf das Filterelement (Trennmembranoberfläche) durch die Strömung des flüssigen Mediums ausgeübt wird, dazu, der Anhäufung von Feststoffen an der Oberfläche des Filterelements entgegenzuwirken. Querstromfilter umfassen Mikrofiltrations-, Ultrafiltrations-, Nanofiltrations- und Umkehrosmosefiltersysteme. Das Querstromfilter kann mehrere Filterblätter (Filtrationsmembranen) in einer betriebsfähigen gestapelten Anordnung umfassen, wobei z.B. die Filterblätter sich mit den Permeat- und Retentatblättern abwechseln, und da die zu filternde Flüssigkeit quer zu den Filterblättern strömt, werden nicht eindringende Spezies, z.B. Feststoffe oder Spezies mit hohem Molekulargewicht und einem Durchmesser, der größer als die Porengröße des Filterblatts ist, zurückgehalten und gelangen in den Retentatstrom, und die Flüssigkeit sowie jede Permeatart diffundieren durch das Filterblatt und gelangen in den Permeatstrom. In der Praxis der vorliegenden Erfindung ist die Querstromfiltration das Trennverfahren. Querstromfiltermodule und Querstromfilterkassetten, die für eine solche Filtration nützlich sind, sind im Handel von North Carolina SRT, Inc. (Cary, North Carolina) erhältlich. Solche geeigneten Querstromfiltermodule und -kassetten werden verschiedentlich in den folgenden US-Patenten des Erfinders der vorliegenden Erfindung beschrieben: US-Patent Nr. 4,867,876, „Filterplatte, Filterplattenelement und diese enthaltendes Filter", erteilt am 19. September 1989; US-Patent Nr. 4,882,050, derselbe Titel, erteilt am 21. November 1989; US-Patent Nr. 5,034,124, derselbe Titel, erteilt am 11. September 1990; US-Patent Nr. 5,034,124, derselbe Titel, erteilt am 23. Juli 1991; US-Patent Nr. 5,049,268, derselbe Titel, erteilt am 17. September 1991; US-Patent Nr. 5,232,589, „Filterelement und Träger", erteilt am 3. August 1993; US-Patent Nr. 5,342,517, „Filterkassettenelement", erteilt am 30. August 1994; US-Patent Nr. 5,593,580, derselbe Titel, erteilt am 14. Januar 1997; und US-Patent Nr. 5,868,930, derselbe Titel, erteilt am 9. Februar 1999.
„Chromatographieharz" betrifft hier eine Festphase, die selektiv oder vorzugsweise eine oder mehr Komponenten der Ausgangsflüssigkeit bindet. In der Praxis der Erfindung können solche „Chromatographieharze" aus einer der Harzgruppen ausgewählt werden, die üblicherweise als Affinitäts-, Ionenaustausch- und Ionenfesthalteharze beschrieben werden. Die Harze müssen nur eine Chemie oder einen zugehörigen Liganden besitzen, der selektiv oder vorzugsweise eine interessante Substanz aus der Ausgangsflüssigkeit festhält. Nützliche Chromatographieharze umfassen typischerweise einen Träger und ein oder mehr, daran gebundene Ligand(en), die die selektive oder vorzugsweise Bindungsfähigkeit für die interessante(n) Zielsubstanz(en) zur Verfügung stellen. Nützliche Träger umfassen als veranschaulichendes Beispiel Polysaccharide, wie beispielsweise Agarose und Cellulose, or ganische Polymere, wie beispielsweise Polyacrylamid, Methylmethacrylat und Polystyroldivinylbenzol-Copolymere, wie beispielsweise Amberlite^® Harz, das im Handel von Rohm & Haas Chemical Co., Philadelphia, PA erhältlich ist. Es ist davon auszugehen, dass der Begriff „Harz", obwohl er auf dem Gebiet der Chromatographie häufig verwendet wird, hier nicht implizieren soll, dass nur organische Substrate zur Verwendung als Harzsubstrat geeignet sind, da anorganische Trägermaterialien, wie beispielsweise Silica und Gläser, auch von Nutzen sind. In der Praxis der vorliegenden Erfindung kann das Harz in Form von Kügelchen vorliegen, die im Allgemeinen kugelförmig sind, oder alternativ kann das Harz nützlicherweise in partikulärer oder getrennter Form vorliegen, und zwar mit anderen regelmäßigen Formen oder unregelmäßigen Formen. Das Harz kann von poröser oder nicht poröser Beschaffenheit sein und das Harz kann komprimierbar oder nicht komprimierbar sein. Bevorzugte Harze sind physikalisch und chemisch widerstandsfähig gegen den Bedingungen, die im Reinigungsverfahren angewendet werden, einschließlich Pumpen und Querstromfiltration, und Temperaturen, pH-Wert und anderen Aspekten der verwendeten Flüssigkeiten. Das Harz, wie es in der Praxis der vorliegenden Erfindung verwendet wird, hat vorzugsweise eine regelmäßige, allgemein sphärische Form, ist nicht porös und nicht komprimierbar.
„Affinitätsligand" betrifft ein Element, das selektiv oder vorzugsweise an eine Komponente der Ausgangsflüssigkeit durch eine spezielle Wechselwirkung mit einer Bindungsstelle der Komponente bindet. In der Praxis der Erfindung wird der Affinitätsligand typischerweise an einer Festphase, wie beispielsweise ein Harz, immobilisiert. Beispiele für Affinitätsliganden, die an den Harzträger gebunden werden können, um die in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlichen Chromatographieharze vorzusehen, umfassen: Protein A und Protein A Analoge, die selektiv an Immunglobuline binden; Farbstoffe; Antigene, die zur Reinigung von zugehörigen Antikörpern nützlich sind; Antikörper zur Reinigung von Antigenen; Substrate oder Substratanaloge zur Reinigung von Enzymen; und dergleichen. Affinitätsliganden und Verfahren zu ihrer Bindung an feste Trägermaterialien sind auf dem Fachgebiet der Reinigung bekannt. Siehe zum Beispiele die Bezugstexte Affinity Separations: A Practical Approach (Reihe Praktische Ansätze), Paul Matejtschuk (Hrsg.), Irl Pr: 1997; und Affinity Chromatography, Herbert Schott, Marcel Dekker, New York: 1997.
„Affinitätschromatographieharz" oder „Affinitätsharz" betrifft ein Chromatographieharz, das einen festen Träger oder ein festes Substrat mit Affinitätsliganden, die an deren Oberflächen gebunden sind, umfasst. Veranschaulichende, nicht einschränkende Beispiele von geeigneten Affinitätschromatographieharzen umfassen sphärische Kügelchen mit Affinitätsliganden, die an die Kügelchenoberflächen gebunden sind, wobei die Kügelchen aus Cellulose, Polystyrol-Divinylbenzol-Copolymer, Polymethylmethycrylat oder einem anderen geeigneten Material gebildet sind. In der Praxis der vorliegenden Erfindung sind starre Kügelchen, die einem Pumpen und einem Rückführen durch ein Querstromfiltrationsmodul unter Beibehaltung ihrer strukturellen Integrität widerstehen können (z.B. ohne signifikantes Brechen, das die Poren verstopfende Feststoffe erzeugt), bevorzugt. Besonders bevorzugt sind harte, nicht poröse Cellulosekügelchen mit gebundenen Affinitätsliganden. Eine veranschaulichende besonders bevorzugte Ausführungsform verwendet „Orbicell^®" Kügelchen (im Handel erhältlich von Accurate Polymers, Inc., Highland Park, IL), die kovalent, z.B. durch im Fachkönnen des Standes der Technik liegende, bekannte Verfahren, an geeignete Affinitätsliganden, z.B. Protein A, gebunden sein können.
„Ionenaustauschchromatographieharz" oder „Ionenaustauschharz" betrifft einen festen Träger, an den Liganden mit einer positiven oder negativen Ladung kovalent gebunden werden und der daher freie Gege nionen zum Austausch mit Ionen in einer Lösung zur Verfügung hat, mit der das Ionenaustauschharz in Kontakt gelangt.
„Kationenaustauschharze" betrifft ein Ionenaustauschharz mit kovalent gebundenen, negativ geladenen Liganden, das daher freie Kationen zum Austausch mit Kationen in einer Lösung, mit der das Harz in Kontakt gelangt, aufweist. Eine große Auswahl von Kationenaustauschharzen, zum Beispiel die, bei denen die kovalent gebundenen Gruppen Carboxylat oder Sulfonat sind, sind auf dem Fachgebiet bekannt. Im Handel erhältliche Kationenaustauschharze umfassen CMC Cellulose, SP Sephadex^® und Fast S-Sepharose^® (die beiden letzteren sind von Pharmacia erhältlich).
„Anionenaustauschharze" betrifft ein Ionenaustauschharz mit kovalent gebundenen, positiv geladenen Gruppen, wie beispielsweise quaternäre Aminogruppen. Im Handel erhältliche Anionenaustauschharze umfassen DEAE Cellulose, QAE Sephadex^® und Fast Q Sepharose^® (die beiden letzteren sind im Handel von Pharmacia erhältlich).
„Dialyseflüssigkeit" oder „Dialysepuffer" oder „Diafiltrat" betreffen hier die in dem Diafiltrationsschritt verwendete Flüssigkeit, um verunreinigende Substanzen vom Zielsubstanz-Chromatographieharz-Komplex fortzuschaffen. Geeignete Dialyseflüssigkeiten helfen beim Entfernen von verunreinigenden Substanzen aus dem Harz, indem sie dahingehend wirken, dass die nicht spezifische Bindung von verunreinigenden Substanzen an das Chromatographieharz ohne das Verursachen einer signifikanten Dissoziation der gebundenen Zielsubstanz vom Harz aufbrechen. Die Dialyseflüssigkeit kann so einfach wie Wasser oder so komplex wie Mehrfachkomponentenlösungsmittelgemische sein, wie beispielsweise ein Lösungsmittelgemisch, das 80% Hexan, 15% Acetonitril und 5% Isopropanol enthält, wobei alle prozentualen Angaben auf das Volumen bezogen sind, und zwar bezogen auf das Gesamtvo lumen des Gemischs. Mehr als eine Dialyseflüssigkeit können nacheinander verwendet werden, z.B. mit den aufeinander folgenden Dialyseflüssigkeiten mit verschiedenen Eigenschaften, wie beispielsweise pH-Werte, Leitfähigkeit, Lösungsmittelkonzentration usw., die so aufgebaut sind, dass sie verschiedene verunreinigende Substanzarten, die nicht spezifisch mit dem Chromatographieharz verbunden sind, dissoziieren und entfernen. Ein Beispiel für eine Dialyseflüssigkeit, die zur Reinigung von ausgewählten Proteinen, wie beispielsweise Immunglobulinen, nützlich ist, ist eine wässrige, gepufferte 0,4 M NaCl Lösung.
„Waschflüssigkeit" oder „Waschpuffer", wie hier verwendet, steht synonym für Dialyseflüssigkeit oder Dialysepuffer, d.h. es handelt sich um Flüssigkeiten, die zum Wegspülen von verunreinigenden Substanzen aus dem Chromatographieharz, an das die Zielsubstanz gebunden sind, verwendet werden.
„Elutionsflüssigkeit" oder „Elutionspuffer" betrifft hier die Flüssigkeit, die zum Dissoziieren der Zielsubstanz weg vom Chromatographieharz verwendet wird, nachdem diese von verunreinigenden Substanzen gereinigt wurde. Die Elutionsflüssigkeit wirkt dahingehend, dass die Zielsubstanz ohne irreversible Denaturierung dissoziiert wird. Typische Elutionsflüssigkeiten sind auf dem Gebiet der Chromatographie bekannt und können höhere Salzkonzentrationen, freie Affinitätsliganden oder Analoge oder andere Substanzen aufweisen, die die Dissoziation der Zielsubstanz aus dem Chromatographieharz fördern. „Elutionsbedingungen" betrifft Verfahrensbedingungen, die dem mit der Zielsubstanz gebundenen Chromatographieharz auferlegt werden, die die (nicht denaturierte) Zielsubstanz aus dem Chromatographieharz dissoziieren, wie beispielsweise das Kontaktieren des mit der Zielsubstanz verbundenen Chromatographieharzes mit einer Elutionsflüssigkeit oder einem Elutionspuffer, um eine solche Dissoziation zu erzeugen.
„Reinigungsflüssigkeit" oder „Reinigungspuffer" betrifft hier die Flüssigkeit, die zum Waschen des Chromatographieharzes nach dem Beenden des Reinigungsverfahrens verwendet wird. Die Reinigungsflüssigkeit kann ein Detergens, ein Virus inaktivierendes Mittel oder relativ hohe Salzkonzentrationen enthalten und kann einen höheren oder niedrigeren pH-Wert als die Flüssigkeiten aufweisen, die während des Reinigungsverfahrens verwendet werden. Sein Zweck ist es, das Chromatographieharz vollständig zu dekontaminieren, um es für eine erneute Verwendung vorzubereiten. Typische Reinigungsflüssigkeiten sind auf dem Fachgebiet der Chromatographie bekannt.
„Speicherflüssigkeit" oder „Speicherpuffer" betrifft hier die Flüssigkeit, in der das Chromatographieharz zwischen den Anwendungen suspendiert wird. Speicherflüssigkeiten können zusätzlich zu Pufferionen auch Mikrobizide oder andere Konservierungsstoffe enthalten. Solche Speicherflüssigkeiten sind auf dem Gebiet der Chromatographie bekannt.
Reinigungsverfahren
Die 1 zeigt ein allgemeines Schema, das zum Reinigen einer Zielsubstanz in der Praxis der Erfindung verwendet werden kann, wie nachfolgend näher beschrieben. Zuerst wird die Ausgangsflüssigkeit wahlweise (a) geklärt, um potentiell störende Feststoffe zu entfernen, und (b) konzentriert oder verdünnt, wie es für die anschließenden Reinigungsschritte erforderlich ist. Wenn die Ausgangsflüssigkeit in ihrer ursprünglich zugeführten Form ausreichend frei von Feststoffen und/oder einer geeigneten Konzentration ist, können der eine oder beide Schritte (a) und (b) weggelassen werden.
Die Ausgangsflüssigkeit wird dann (1) auf einen ersten Behälter übertragen, wo sie mit einem Chromatographieharz kontaktiert wird, das selektiv oder vorzugsweise die Zielsubstanz bindet. Die Ausgangsflüs sigkeit wird (2) für eine ausreichende Kontaktzeit mit dem Chromatographieharz inkubiert, um ein Binden eines gewünscht hohen prozentualen Anteils an Zielsubstanz an das Chromatographieharz zu erreichen und um sich ergebende Harz-Ziel-Komplexe zu bilden. Während der Inkubation wird die Ausgangsflüssigkeit mit einer geeigneten Einrichtung gerührt, einschließlich einer Querstromfiltration, bei der das Permeat zum Behälter zurückgeführt wird, so dass ein Kontakt zwischen dem Harz und der Zielsubstanz vollständig sichergestellt ist.
Das Harz wird (3) durch ein Querstromfilter rückgeführt, wo (a) das Harz konzentriert wird; (b) das Harz gegen eine erste Diafiltratflüssigkeit diafiltriert wird, die so ausgewählt ist, dass sie nicht spezifisch bindende Komponenten aus dem Harz dissoziiert, während sie die Harz-Ziel-Komplexe nicht aufbricht; (c) die interessante Substanz aus dem Harz durch Behandlung mit einer zweiten Diafiltrationsflüssigkeit eluiert wird, die so ausgewählt ist, dass sie die spezifischen Ziel-Harz-Komplexe dissoziiert; (d) das Ziel vom Harz weg diafiltriert wird. Das Diafiltrat, das die Zielsubstanz enthält, wird (4) in einem zweiten Behälter festgehalten, und (S) die Zielsubstanz wird auf eine nützliche Konzentration konzentriert.
Der wahlweise erste Klärungsschritt wird durchgeführt, um verunreinigende Feststoff-Substanzen aus der Ausgangsflüssigkeit, deren mittlerer Durchmesser größer als die Porengröße des trennenden, in den anschließenden Schritten verwendeten Querstromfiltermoduls ist, zu entfernen. Dieser erste Klärungsschritt verhindert gegebenenfalls die Konzentration of Feststoffmaterial in der Chromatographieharzaufschlämmung und er verhindert zusätzlich, dass die verunreinigenden Feststoffsubstanzen sich während der späteren Schritte des Reinigungsverfahrens lösen und die gereinigte Zielsubstanz verunreinigen.
Der Klärungsschritt kann durch Verfahren erzielt werden, die auf dem Gebiet der Reinigung bekannt sind, zum Beispiel durch Zentrifugation, Schwerkrafttrennung, Präzipitation, durch Ausflockung unterstützte Sedimentation, Dekantieren, normale Filtration, Sieben, Absorption, Adsorption und Tangentialstromfiltration. Alternativ kann die Ausgangsflüssigkeit bereits ausreichend sauber sein, so dass dieser Schritt unnötig wird.
Die 2 zeigt ein schematisches Fließbild eines Systems 20 zur Klärung einer Ausgangsflüssigkeit durch Querstromfiltration und Weiterleiten der geklärten Ausgangsflüssigkeit an einen Behälter für nachfolgende Reinigungsschritte. Mit Bezug auf die 2 wird die Ausgangsflüssigkeit, die typischerweise ein Überstand oder eine Suspension ist, die von einem Fermenter oder Bioreaktor 21 stammt, über die Leitung 22 zum Behälter 23 geführt, der mit einem Wärmemantel 24 ausgestattet ist, um die Ausgangsflüssigkeit auf einer geeigneten Temperatur zu halten. Die Pumpe 28 wird aktiviert und die Ausgangsflüssigkeit wird vom Behälter 23 durch das Querstromfiltermodul 27 über die Leitungen 24, 25 und 26 zirkuliert, wobei sich die Ventile 30 und 32 in der geschlossenen Position befinden und das Ventil 31 wahlweise offen ist, um das Retentat für zusätzliche Filtrationszyklen zum Behälter 24 zurückzuführen. Ein Zusatzpuffer wird dem Behälter 23 über die Leitung 29 zugesetzt. Das Permeat (geklärte Ausgangsflüssigkeit) wird über die Leitung 33 zu einem zweiten Behälter 34 geführt, wo es für die anschließenden Reinigungsschritte verbleibt. Der Behälter 34 ist auch mit einem Wärmemantel 35 ausgestattet, um die geklärte Ausgangsflüssigkeit bei einer geeigneten Temperatur zu halten. Nach der Anwendung werden, wenn das System gespült und gereinigt werden soll, die Ventile 30 und 32 geöffnet und die Leitungen 36 und 37 leiten eine Waschflüssigkeit zu geeigneten Ablauf- und/oder Sammeleinrichtungen weiter.
Die Ausgangsflüssigkeit wird dann im Behälter 34 mit einem geeigneten Chromatographieharz kontaktiert, wie in der 2 gezeigt. Es ist möglich, das Chromatographieharz dem Behälter zuzusetzen, der bereits die (wahlweise geklärte) Ausgangsflüssigkeit enthält, oder alternativ kann das Chromatographieharz dem Behälter zugeführt werden und die Ausgangsflüssigkeit danach zugesetzt werden oder das Kontaktieren des Chromatographieharzes und die Ausgangsflüssigkeit können auf eine andere geeignete Weise durchgeführt werden, z.B. losweise, halblosweise oder kontinuierlich.
Geeignete Chromatographieharze zur Verwendung in diesem Schritt können in Form von Kügelchen oder anderen Feststoffen oder fein verteilten Formen vorliegen, die die Zielsubstanz binden können. Die Kügelchen haben vorzugsweise eine Größe mit einem Durchmesser, der etwa 1,5- bis 10-mal größer als die Porengröße des Trennfilters ist. Das Chromatographieharz kann aus jeder der Harzgruppen ausgewählt werden, die üblicherweise als Affinitäts-, Ionenaustausch- und Ionenfesthalteharze beschrieben sind, und eine große Vielzahl von derartigen Harzen ist bereits im Handel erhältlich. Die Harze besitzen eine Chemie oder Ligandenchemie, die die interessante Substanz festhält und die Zielsubstanz an das Harz bindet.
Ein besonders nützliches Chromatographieharz wird in Form von gleichförmig sphärischen, nicht porösen, harten, nicht agglomerierenden Partikeln zur Verfügung gestellt, die eine Größe im Bereich von etwa 0,1 bis 1000 μm aufweisen und eine geringe Affinität für die nicht spezifische Bindung haben. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst das Chromatographieharz Cellulosekügelchen mit einem Durchmesser von 1 bis 3 μm, wobei Protein A Liganden kovalent an deren Oberfläche gebunden sind. Solche Kügelchen sind zur Reinigung von monoklonalen Antikörpern aus einer Gewebekultur und Mausaszitesflüssigkeit äußerst nützlich. Derartige Kü gelchen sind im Handel unter dem Warenzeichen „Orbicell^®" von Accurate Polymers, Inc. (Highland Park, Illinois) erhältlich.
Die 3 veranschaulicht die Oberfläche und den Querschnitt von solchen Orbicell^® Kügelchen 2 und zeigt ihre große Oberfläche aber einen Mangel an innerer Porosität, weshalb solche Kügelchen im Gegensatz zu standardmäßigen porösen Kügelchen 3 eine hohe mechanische Festigkeit besitzen. Die hohe Festigkeit und Härte der Orbicell^® Kügelchen machen sie besonders für die Rückführung durch die Querstromfilter geeignet, da sie nicht dazu neigen, in kleinere Feststoffe aufbrechen, die die Filterporen verstopfen können, und sie sind nicht dazu neigen, unregelmäßige Strömungswege zu komprimieren und zu bilden. Andere Kügelchenarten von entsprechender Beschaffenheit für solche Orbicell^® Kügelchen sind im Handel erhältlich und werden nützlich in der Praxis der vorliegenden Erfindung verwendet.
Die 4 veranschaulicht schematisch die einfacheren Strömungswege, die bei Verwendung der Orbicell^® Kügelchen 4 im Gegensatz zu porösen Kügelchen 5 der bei bekannten Biotrennungen verwendeten Art vorhanden sind. In ihren physikalischen Eigenschaften sind solche bekannten porösen Kügelchen weniger vorteilhaft im Hinblick auf ihre Elastizität und Beständigkeit gegenüber einem Aufbrechen unter ausgedehnten Pump- und Rückführungsbedingungen als die nicht porösen Kügelchen, die vorzugsweise in der Praxis der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Ein zusätzlicher Vorteil von nicht porösen Kügelchen ist, dass verunreinigende Substanzen nur in der Pore festgehalten werden, um während des Elutionsschritts, der die Reinheit der Zielsubstanz senkt, auszueluieren.
Mit Bezug auf die 5 wird die Chromatographieharz-Ausgangsflüssigkeits-Aufschlämmung für eine geeignete Kontaktzeit im Behälter 34 im Anschluss an die anfängliche, oben beschriebene Verar beitung mit Bezug auf die 2 inkubiert. Ein einfaches Inkubationsverfahren kann das Rühren oder Schütteln des die Aufschlämmung enthaltenden Behälters 34 umfassen. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Harz/Flüssigkeits-Aufschlämmung unter der Wirkung der Pumpe 38 durch die Leitung 36 und durch die Leitung 40 (mit der Ablassleitung 47, die das daran befestigte Ventil 40 enthält) über das trennende Querstromfiltermodul 42 rückgeführt, wobei die Flüssigkeit vom Filtermodul 42 durch die Leitung 44 mit dem Gegendruckventil 46 zum Behälter 34 in einer volumetrischen Strömungsrate rückgeführt wird, die ausreicht, um das Filter 42 sauber zu halten. Das Permeat wird zum Behälter 34 durch die Leitung 50 über das offene Ventil 58 durch die Leitung 56 rückgeführt, wobei für die Flüssigkeit im Behälter ein geeigneter Kontakt oder eine geeignete Inkubationszeit vorgesehen wird.
Die bevorzugte Kontakt(Inkubations)-Zeit im Behälter 34 hängt von dem bestimmten, verwendeten Chromatographieharz und seiner Konzentration der Bindungsstellen für die Zielsubstanz sowie der relativen Konzentration von Kügelchen und Zielsubstanz ab. Die Reaktionszeit der Chemie variiert von Ligand zu Ligand, aber je höher die Konzentration der verfügbaren Bindungsstellen im Vergleich zur Zielsubstanz ist, desto kürzer ist die bevorzugte Inkubationszeit. Es wird in Erwägung gezogen, dass überschüssiges Harz in verschiedenen Anwendungen bei 1,2- bis 10-fach höherer Konzentration als die Zielsubstanz optimiert werden kann. Eine weitere Erwägung bei der Optimierung des Verfahrens ist die Konzentration des Harzes, das in der Flüssigkeit suspendiert ist. Die Harzkonzentrationen im Bereich von 1 bis 64 Prozent (basierend auf dem Gewicht und bezogen auf das Gesamtgewicht des kombinierten Harzes und flüssigen Materials) können vorteilhaft verwendet werden, wobei etwa 10 bis etwa 50 Prozent Harzkonzentrationen (auf derselben Grundlage) als optimal angesehen werden.
Die Temperatur wird während des Inkubationsschritts durch den Wärmemantel 35 (oder eine andere Wärmeübertragungseinrichtung, wie beispielsweise eine Heizspirale, die sich im Flüssigkeitsvolumen im Behälter 34 befindet, eine Rückführungsheizvorrichtung, die sich außerhalb des Behälters befindet und durch die Flüssigkeit, die in der Heizeinheit auf eine geeignete Temperatur erwärmt wird, vom Behälter weg strömt und zum Flüssigkeitsvolumen des Behälters rückgeführt wird) gesteuert, um die Flüssigkeit und das Harzgemisch mit einer geeigneten Temperatur zu versehen und so die Wirkung der Zielsubstanz zu bewahren. Geeignete Temperaturen für einen solchen Zweck können ohne weiteres im Rahmen des Standes der Technik und ohne übermäßiges Experimentieren bestimmt werden.
Das Weiterleiten der Ausgangsflüssigkeit in den Behälter zum Kontakt mit dem Chromatographieharz (Schritt (1) oben) und die Inkubation der Ausgangsflüssigkeit mit dem Chromatographieharz (Schritt (2) oben) können übereinstimmend durch gleichzeitige Zugabe der Ausgangsflüssigkeit zum Chromatographieharzbehälter erzielt werden, während ein gleiches Volumen an harzfreier Flüssigkeit entfernt wird. Das steuernde Element in dieser Ausführungsform der Erfindung ist, dass die Verweilzeit der Ausgangsflüssigkeit im Behälter lang genug sein muss, um eine im Wesentlichen vollständige Bindung der Zielsubstanz an das Chromatographieharz zu ermöglichen. Dieses Ziel wird ohne weiteres durch das trennende Querstromfiltermodul 42 erzielt. Der Pemeatstrom, der gleich dem infundierten Ausgangsflüssigkeitsvolumen ist, wird aus der Schleife in der Leitung 64 mit dem darin angeordneten Ventil 66 entfernt. Das überschüssige Permeat wird in der Leitung 56 mit dem darin angeordneten Ventil 48 zurück zum Harzbehälter geschickt.
Die verunreinigenden Substanzen und die überschüssige Flüssigkeit werden getrennt und aus dem Chromatographieharz, das jetzt an die Zielsubstanz gebunden ist, mittels des trennenden Querstromfiltermoduls 42 heraus dialysiert. Die Harzaufschlämmung wird über das Querstromfiltermodul rückgeführt, um darin getrennt zu werden, und die Retentatflüssigkeit wird zum Behälter zurückgeführt. Die Permeatflüssigkeit wird auf eine oder mehrere der folgenden gerichtet: (1) einen Ablauf (durch die Leitung 52 mit dem darin enthaltenen Ventil 54); (2) einen zweiten Behälter (nicht gezeigt), der ein anschließendes Harz enthält (durch die Leitung 64 mit dem Ventil 66); (3) einen unabhängigen Verfahrensschritt. Das Harz kann auf Konzentrationen konzentriert werden, die im Bereich von etwa 0,1 bis etwa 64 Vol.-% liegen. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das Harz auf etwa 50 Vol.-% Harz konzentriert.
Das Volumen des Waschpuffers, der zum Waschen des Chromatographieharzes erforderlich ist, hängt von der Konzentration des Harzes in der Suspension ab. Zum Beispiel ist, wenn die Harzaufschlämmung 100 Liter einer 1%igen Harzlösung ausmacht, das zum 10-fachen Waschen des Harzes erforderliche Volumen 1.000 Liter. Wenn die Harzaufschlämmung 10 Liter einer 10%igen Harzlösung ist, dann beträgt das erforderliche Volumen 100 Liter.
Die zum Waschen des Chromatographieharzes erforderliche Zeit hängt wegen der Wirkung der Harzkonzentration auf die Strömungsrate im Querstromfiltermodul auch von der Konzentration des Harzes in Suspension ab. Zum Beispiel kann, wenn die Harzaufschlämmung 10 Liter einer 25%igen Harzlösung ist, das Permeat 100 l/m²-h betragen. Wenn die Harzaufschlämmung 5 Liter einer 40%igen Harzlösung ist, dann kann die Permeatrate bei nur 10 l/m²-h liegen. Daher liegt die Zeit, die zum zehnfachen Waschen der Chromatographieharzaufschlämmung mit Waschpuffer mittels eines 1,0 m² Querstromfiltermoduls benötigt wird, bei einer Stunde für eine 20%ige Suspensi on, und eine 40%ige Suspension erfordert eine Waschzeit von fünf Stunden.
Nach dem Konzentrieren des Harzes wird eine Diafiltration durch Zugabe einer geeigneten Dialyseflüssigkeit zum Behälter 34 begonnen. Geeignete Dialyseflüssigkeiten (oder „Diafiltrat" oder „Dialysepuffer") helfen beim Entfernen von verunreinigenden Substanzen aus dem Harz, indem sie dahingehend wirken, dass sie die nicht spezifische Bindung von verunreinigenden Substanzen an das Chromatographieharz aufbrechen, ohne eine signifikante Dissoziation der gebunden Zielsubstanz aus dem Harz zu bewirken. Die Dialyseflüssigkeit kann so einfach wie Wasser oder so komplex wie ein Mehrfachlösungsmittelgemisch, wie beispielsweise Lösungen aus 80% Hexan, 15% Acetonitril und 5% Isopropanol, sein.
Die Zahl der Dialysepufferwechsel während dieses Diafiltrationsschritts liegt vorzugsweise im Bereich von 3 bis 25. Die bevorzugte Zahl von Dialysepufferwechsel wird auf der Basis der Retentionsbeschaffenheit der verunreinigenden Substanzen im Hinblick auf das trennende Querstromfiltermodul 42 und die gewünschte Reinheit des Zielprodukts bestimmt. Ein Dialysepufferaustausch (Diafiltration) zum Entfernen der Endspuren von verunreinigenden Substanzen aus der Harzaufschlämmung wird durch Zugabe des Zusatzdialysepuffers zum Aufschlämmbehälter mit derselben Strömungsrate wie die Permeatrate erzielt. Dieses Verfahren kann leicht mittels Niveausteuerungen, Kraftmesszellen oder Strömungsmessern automatisiert werden. Der Umfang des Pufferaustauschs wird in Volumenwechsel gemessen, definiert als das Verhältnis des kumulativen Puffervolumens, das dem Harzaufschlämmbehälter zugesetzt wird, geteilt durch das Ausgangsvolumen der Harzaufschlämmung. Der Umfang des Wechsels oder der Verdünnung des ursprünglichen Überstands durch den zugesetzten Puffer ist eine geometrische Funktion. Nachfolgend wird eine Tabelle im Hinblick auf Überstandverdünnung und den Volumenwechsel für eine veranschaulichende Ausführungsform der Erfindung angegeben.
Das optimale trennende Querstromfiltermodul 42 hat vorzugsweise eine Membranporengröße, die 1,5- bis 10-mal kleiner als der mittlere Durchmesser der Chromatographieharzkügelchen ist. Die Kanalhöhe des trennenden Querstromfiltermoduls ist wünschenswerter Weise 1,2- bis 10-mal größer als der mittlere Durchmesser der Chromatographieharzkügelchen, um ein zufrieden stellendes Spiel und ein wirksames hydrodynamisches Verhalten des Filtermoduls vorzusehen. Ein sehr bevorzugter Aufbau des trennenden Querstromfiltermoduls ist ein offenes Kanalmodul mit gleichmäßiger Verteilung der Strömung zu den Retentatkanälen. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung haben die Chromatographieharzkügelchen einen mittleren Durchmesser von etwa 1 bis 3 μm, der Querstromfilter besitzt ein Filterelement mit einer mittleren Porengröße von etwa 0,6 μm und die Höhe des Retentatkanals ist 0,5 mm. Ein Querstromfiltermodul, das für diesen Zweck geeignet ist, ist im Handel von North Carolina SRT, Inc. (Cary, NC) erhältlich.
In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das Permeat aus dem Diafiltrationsschritt durch die Leitung 50 (enthaltend die Ablassleitung 64 mit dem darin angeordneten Ventil 66), das Ventil 62 und die Leitung 60 zu einem zusätzlichen Behälter 68 strömen gelassen, der ein zweites Harz, das eine zweite Trennung von Substanzen aus dem Ausgangsmaterial bewirkt, enthält.
Zum Beispiel werden Immunglobuline für spezifische Antigene nacheinander aus dem Plasma durch Verwendung einer Reihe von Affinitätschromatographieharzen gereinigt, die jeweils mit spezifischen viralen Antigenen verbunden sind. In einem anderen veranschaulichenden Beispiel werden Milchproteine nacheinander von Molke durch Verwendung einer Reihe von spezifischen Chromatographieharzen getrennt, die jeweils mit Zielproteine bindenden Liganden verbunden sind. Diese Liganden können Ionenaustauscher, Immunglobuline, native Proteine oder alle Affinitätsliganden sein, die selektiv oder vorzugsweise an die Zielproteine binden, und mit den Harzen verbunden sein. In einem noch anderen veranschaulichenden Beispiel werden die Plasmaproteine nacheinander aus dem Vollplasma oder aus den Plasmafraktionen durch Verwendung von Harzen gereinigt, die mit Antikörpern an die Zielproteine gebunden sind.
Nach der Diafiltration zur Entfernung von verunreinigenden Substanzen wird die Zielsubstanz eluiert und aus dem Chromatographieharz gewonnen. Die spezielle, für die Elution verwendete Chemie hängt von der Natur und Festigkeit der Wechselwirkung zwischen Chromatographieharz und Zielsubstanz ab. Das Elutions- und Gewinnungsverfahren ähnelt dem oben beschriebenen Diafiltrationsschritt. Eine geeignete Elutionsflüssigkeit, die die Zielsubstanz aus dem Chromatographieharz dissoziiert, wird dem Harzaufschlämmbehälter (z.B. dem Behälter 34 in der Leitung 48) mit einer Rate zugesetzt, die gleich der Permeatrate ist, bis die gewünschte Ausbeute erhalten wird. Dieses Verfahren ist äußerst nützlich, wenn das Chromatographieharz ein Ionenaustauschharz ist, weil die Steigerung der Ionenkonzentration ohne weiteres mittels eines Leitfähigkeitsmessers überwacht werden kann, und die Ionenkonzentration wird im Lauf der Zeit um eine bestimmte Rate erhöht. In dem Fall, in dem das Chromatographieharz ein Affinitätsharz ist, ist es nützlich, zuerst eine konzentrierte Form des Elutionspuffers dem Harzaufschlämmbehälter zuzugeben, um den Wechsel von Diafiltrationspuffer zu Elutionspuffer zu steigern.
Zum Beispiel wird bei der Elution von monoklonalen Antikörpern aus einem Protein A Harz der pH-Wert der Harzaufschlämmung auf einen geeigneten Wert gesenkt, z.B. in der Größenordnung von pH 2,5, und zwar unter Zugabe eines abgemessenen Volumens von 1,0 M Glycinpuffer. Die Harzaufschlämmung wird dann gegen 10 Volumen 0,1 M Glycinpuffer dialysiert.
Eine Modifikation des Elutionsschritts umfasst die Verwendung eines Querstromfiltermoduls mit unterschiedlich großen Poren. Zum Beispiel ist es beim Eluieren eines Plasmaproteins aus dem Chromatographieharz von Nutzen, die Querstrommembran zu einer Membran zu ändern, die alle verunreinigenden Viren oder Protein-Virus-Komplexe zurückhält, die während des früheren Diafiltrationsschritts 3(a) nicht entfernt wurden.
Für eine solche Modifikation (siehe 6) ist das erste Querstromfilter 83 and das zweite Filter ist 42. Die Harzaufschlämmung wird zuerst konzentriert und durch das Querstromfilter 83 mittels einer Pumpe 38 durch die Leitung 40 diafiltriert, wobei das Ventil 47 geschlossen und das Ventil 81 offen ist. Vom Filter 83 wird die diafiltrierte Aufschlämmung durch das offene Ventil 91 und die Leitung 89 vorbei an dem geschlossenen Ventil 46 zurück zum Behälter 34 strömen gelassen. Das Permeat dieses Schritts kann zum Ablass oder eine anschließende Reinigung durch die Leitung 93 und das offene Ventil 99 strömen. Für den Elutionsschritt werden die Ventile 81 und 91 geschlossen und die Ventile 57 und 46 werden geöffnet, so dass das eluierte Permeat durch das dichtere Filter 42 zum Behälter 68 durch das offene Ventil 62 und die Leitung 60 strömen kann. Das Filtermodul 83 ist mit der das Ventil 99 enthaltenden Leitung 93 verbunden sowie mit der Leitung 85, die das Ventil 87 enthält, um der Permeatströmung aus dem Filtermodul oder dem Durchströmen des anderen Stoffaustauschelements Rechnung zu tragen (mit oder gegen die Strömung auf der gegenüberliegenden Seite des Filterelements von der zu filtrierenden Flüssigkeit) und so den Stoffaustauschgradienten und die Strömung von bestimmten Spezies in oder aus der Retentatflüssigkeit zu maximieren.
Die Diafiltrations- und Elutionsvorgänge können alle im ersten Behälter 34 wie in der 6 gezeigt durchgeführt werden und das sich ergebende Permeat, das die Zielsubstanz umfasst, kann dann für eine abschließende Behandlung, z.B. eine Pufferung oder eine andere Behandlung, an den zweiten Behälter 69, unter zusätzlicher Filtration im Querstromfilter 82 und ein abschließendes Sammeln in den Sammelbehälter 80 weitergeleitet werden. Bei einer solchen Anordnung kann ein Teil des Permeats aus dem ersten Querstromfiltermodul 83 in der Leitung 93 durch ein anderes Querstromfilter, wie beispielsweise ein Nanofilter, rückgeführt werden, um die verwendete Puffermenge zu minimieren.
Es ist daher erwünscht, dass eine Anzahl von alternativen Vorrichtungsanordnungen konstruiert, angeordnet und betrieben wird, um das Trennverfahren der vorliegenden Erfindung in verschiedenen Ausführungen durchzuführen.
In einer anderen veranschaulichenden Ausführungsform der Erfindung wird ein Milchprotein aus einem Ionenaustauschharz eluiert, um ein Proteinprodukt von erhöhter Reinheit unter Verwendung eines trennenden Querstrommoduls mit unterschiedlich großen Poren zu erzeugen und so eine Größentrennung aufgrund der Tatsache zu bewirken, dass der Ionenaustausch nicht die Spezifität von teureren Affinitätsharzen aufweist.
Die veranschaulichte 6 zeigt ein Reinigungssystem, das zwei Querstromfiltermodule mit unterschiedlich großen Poren verwendet, die für einen solchen Zweck verwendet werden können. Im System der 6 wird das System entsprechend im Hinblick auf die 5 nummeriert und dieselben nummerierten Elemente werden dementsprechend gebildet, angeordnet und betrieben. Allerdings umfasst das System, wie in der 6 gezeigt ist, ein anderes Querstromfiltermodul 83, das in paralleler Strömungsbeziehung zum Filtermodul 42 kopiert wird, wobei sich das Filtermodul 42 in einer Abzweigleitung 55 mit einem Strömungssteuerventil 57 befindet und wobei sich das zweite Filtermodul 83 mit der Leitung 40 mit dem Ventil 81 und der Leitung 89 mit dem Ventil 91 befindet.
Das zweite Filtermodul 83 wird auch mit den Leitungen 85 mit dem darin befindlichen Ventil 87 und der Leitung 93 verbunden, die wiederum mit der Leitung 95 mit den darin befindlichen Ventilen 97 und 99 verbunden ist, so dass Permeat vom zweiten Filtermodul wahlweise abgelassen und/oder zum Behälter 34 rückgeführt werden kann, wie gezeigt, oder alternativ so dass ein anderes Stoffaustauschelement mit der Strömung oder gegen die Strömung unter Filtration des Flüssigkeitsdampfs an eine gegenüberliegende Seite des/der Stoffaustauschelements/-e im Querstromfiltermodul weitergeleitet werden kann.
In einer speziellen Ausführungsform des Systems mit der allgemeinen in der 6 gezeigten Anordnung und Gestaltung kann das Filtermodul 42 Filter(Membran)-Element(e) mit einer mittleren Porengröße von 0,04 μm enthalten, und das Filtermodul 83 kann Filter(Membran)-Element(e) mit einer mittleren Porengröße von 0,6 μm enthalten. Es wird davon ausgegangen, dass die Art und Beschaffenheit des/der Filterelement(e) in den Filtermodulen, die in der Praxis der vorliegenden Erfindung verwendet werden, stark variieren kann, wie für den Durchschnittsfachmann ohne weiteres ersichtlich ist, und leicht mit im Handel verfügbaren Filterelementen, die für einen solchen Zweck geeignet sind, ausgeführt werden kann.
Es ist wichtig festzustellen, dass die eluierte Zielsubstanz, z.B. Protein oder Peptid, in wünschenswerter Weise in einem Behälter unter geeigneten Bedingungen, wie beispielsweise Temperatur, pH-Wert und Salzkonzentrationen, festgehalten wird. Es kann notwendig sein, den pH-Wert zu erhöhen oder zu senken wie auch die Temperatur zu senken, um eine Inaktivierung oder einen Verlust des reinen Produkts zu verhindern. Zum Beispiel sollten Immunglobuline, die von Protein A Harzen eluiert werden, in einem temperaturgesteuerten Behälter mit Tris Puffer, pH 8, bei 4°C bis 10°C gesammelt werden, wodurch der pH-Wert wieder in den neutralen Bereich gelangt und das Eluat gekühlt wird, um eine Denaturierung der Immunglobuline zu vermeiden.
Um die Vorrichtung für eine nachfolgende Verwendung nach einer Elution der Zielsubstanz und Weiterleitung an den Festhaltebehälter fertig zu stellen, wird der Elutionspuffer zu einem Reinigungspuffer gewechselt und anschließend zu einem Lagerungspuffer, so dass das Chromatographieharz erneut verwendet werden kann. Während dieses Schritts, wird das Permeat zum Ablass geführt.
Die eluierte Zielsubstanz, die im Festhaltebehälter eingeschlossen ist, kann dann mittels eines zusätzlichen Querstromfiltermoduls oder eines anderen geeigneten Schritts, wie beispielsweise einer Präzipitation, eines Gefriertrocknens, Verdampfens oder einer Zentrifugation konzent riert werden, um die Elutionspuffer zu entfernen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Querstromfiltermodul verwendet. Das Filtermedium hat vorzugsweise eine Porengröße, die kleiner als der mittlere Durchmesser der Zielsubstanz und größer als die Ionen des Elutionspuffers sind, so dass die Zielsubstanz auf einen geeigneten Grad konzentriert und die verunreinigenden Ionen durch Diafiltration entfernt werden können.
Zum Beispiel kann IgG, das aus Protein A Harz gereinigt und eluiert wird, konzentriert und mittels einer Membran mit einem Molekulargewicht von 30.000 mittels Diafiltration von den Salzen des Elutionspuffers befreit werden. Ein solches Querfiltrationsmodul ist im Handel von North Carolina SRT, Inc. (Cary, NC) erhältlich.
Die oben beschriebenen Verfahren finden bei der Reinigung von biologischen Zielsubstanzen breite Anwendung. Die Ausgangsflüssigkeiten können aus einer großen Palette von Materialien ausgewählt werden, einschließlich Serum; Plasma und Plasmafraktionen; Vollblut; Milch; Kolostrum; Molke; Bakterien-, Hefe-, Pilz-, Insekten- oder Tierzell- oder Gewebekulturflüssigkeiten und Gewebehomogenate. Die Zielsubstanzen können aus dem extrem breiten Bereich von biologischen Substanzen ausgewählt werden, die zur Filtrationsreinigung angepasst sind und die selektiv oder vorzugsweise an ein Chromatographieharz gebunden sein können, einschließlich – aber nicht ausschließlich – an Proteine, Glycoproteine, Hormone, Antigene, Antikörper, Gerinnungsfaktoren, Immunglobuline und Enzyme. Die Chromatographieharze werden auf der Basis der Beschaffenheit der Zielsubstanz ausgewählt, wobei dem Fachmann eine große Auswahl von wohlverstandenen Ionenaustausch- und Affinitätsliganden zur Verfügung steht und auf der Grundlage der hier erfolgten Offenbarung und Lehren im Rahmen des Fachgebiets ohne weiteres ausgeführt werden kann.
Zum Beispiel ist das Verfahren der Erfindung zum Reinigen von IgGs aus Ausgangsflüssigkeiten nützlich, die aus Serum, Plasma, Plasmafraktionen, Vollblut, Milch, Kolostrum und Molke ausgewählt sind. Gerinnungsfaktoren können aus Plasma, Vollblut, Serum und Gewebekultur gereinigt werden.
Es ist gezeigt worden, dass das Verfahren der Erfindung einen kosten- und zeiteffektiven Weg zur Verfügung stellt, um IgGs aus Ausgangsflüssigkeiten, wie beispielsweise Plasma und Gewebekulturflüssigkeiten, zu reinigen.
Ein spezieller Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft das Verarbeiten einer Ausgangsflüssigkeit, um eine gereinigte Zielsubstanz daraus zu gewinnen, wie allgemein nachfolgend beschrieben, wobei aber die Ausgangsflüssigkeit biologisch ungünstige verunreinigende Substanzen aufweisen kann, wie beispielsweise bakterielle Spezies, virale Spezies, antigene Spezies usw. als verunreinigende Substanzen. Die Erfindung zieht die Behandlung der Ausgangsflüssigkeit oder ein anderes Verfahren oder einen Produktstrom im Verfahren in Betracht, um eine solche verunreinigende Substanz zu inaktiveren und ihre nachteiligen Eigenschaften auszuschalten. Beispielhaft kann die verunreinigende Substanz eine virale Spezies, z.B. HIV, Hepatitis-Virus usw., enthalten, und deren Inaktivierung kann eine virizide Behandlung umfassen.
Daher betrifft die Erfindung in einem speziellen Aspekt ein Verfahren zum Reinigen von mindestens einer biologischen Zielsubstanz aus einer Ausgangsflüssigkeit, enthaltend eine bioaktive verunreinigende Substanz, umfassend die Schritte:
Kontaktieren der Ausgangsflüssigkeit mit einem Chromatographieharz;
Inkubieren der Ausgangsflüssigkeit mit dem Chromatographieharz über eine ausreichend lange Kontaktzeit, um an das Chromatographieharz mindestens eine Zielsubstanz von der Ausgangsflüssigkeit zu binden;
Rückführen des Chromatographieharzes in ein Querstromfilter (z.B. ein einzelnes Querstromfilter oder mehr als ein Querstromfilter), wobei die folgenden Schritte durchgeführt werden:
Konzentration und Diafiltration des Chromatographieharzes;
Elution der Zielsubstanz aus dem Chromatographieharz; und
Trennung der Zielsubstanz aus dem Chromatographieharz durch Diafiltration;
Gewinnen der Zielsubstanz; und
wahlweise Konzentrieren der Zielsubstanz;
weiter umfassend das Inaktivieren der bioaktiven verunreinigenden Substanz während des Verfahrens.
Eine solche Inaktivierung kann das Kontaktieren der bioaktiven verunreinigenden Substanz mit einem Inaktivierungsmittel umfassen, z.B. als Anfangsschritt des Verfahrens oder während der Inkubation der Ausgangsflüssigkeit mit dem Chromatographieharz, während des Querstromfiltrationsverfahrens (durch Zugabe des Inaktivierungsmittels zum die Zielsubstanzen enthaltenden Strom während des Filtrationsvorgangs), oder auf eine andere geeignete Weise. Das Inaktivierungsmittel kann in jeder geeigneten Form eingeführt werden, z.B. als gebundene Spezies auf einem Chromatographieharzkügelchen, das ansonsten zur Bindung an ein oder mehrere Zielsubstanzen funktionali siert ist, oder als gebundene Spezies auf einem Kügelchen, an das nur das Inaktivierungsmittel gebunden ist, wobei die inaktivierenden speziesgebundenen Kügelchen eine Populationskomponente einer Gesamtpopulation von Kügelchen umfassen, die sowohl die inaktivierenden speziesgebundenen Kügelchen als auch die Kügelchen, die zur Bindung an ein oder mehrere Zielsubstanzen funktionalisiert sind, aufweisen.
Das Inaktivierungsmittel für die virale Spezies kann jedes geeignete Mittel sein. Wie in einem solchen Kontext verwendet, soll der Begriff Mittel breit ausgelegt werden und alle antiviralen Moleküle, Komplexierungs- oder Festhaltemittel umfassen, die die virale Spezies nicht lebensfähig oder nicht infektiös machen, virale Transkriptionsinhibitoren, virizide Verfahrens(Aussetzungs-)-Bedingungen usw. Spezielle Beispiele umfassen Iod, Chlor, Lösungsmittel-Detergens-Zusammensetzungen und ultraviolette oder andere virizide Bestrahlungen. Was die Verwendung von viralen Festhaltemitteln anbelangt, kann eine virale Rezeptorspezies dazu verwendet werden, das Virus in der Ausgangsflüssigkeit festzuhalten. Eine Klasse von spezifischen viralen Festhaltemitteln weist Sialinsäuren oder Nonulosaminsäuren, wie beispielsweise N-Acetylneuraminsäure, N-Glycolylneuraminsäure, N,I⁷-Diacetylneuraminsäure, N,O⁴-Diacetylneuraminsäure und N,O,O-Triacetylneuraminsäure, auf. Demgemäß kann das Chromatographieharz Mikrokügelchen mit einer an das Mikrokügelchen gebundenen Festhaltemittelspezies aufweisen, z.B. ein Mikrokügelchen, das mit einer Sialinsäure an seiner Oberfläche funktionalisiert ist.
Gemäß einem weiteren speziellen Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Reinigen von einer oder mehr biologischen Zielsubstanzen aus einer Ausgangsflüssigkeit, die die Zielsubstanzen zusammen mit einer oder mehr viralen Spezies enthält. Ein solches Verfahren umfasst die folgenden Schritte:
Kontaktieren der Zielflüssigkeit mit einem viralen Inaktivierungsmittel für die eine oder mehr virale(n) Spezies;
Konzentrieren der Zielsubstanz(en) in der Ausgangsflüssigkeit durch Tangentialstromfiltration in einem Tangentialstromfilter, umfassend eine Membran, die dahingehend wirksam ist, dass sie mindestens 90 Gew.-% der Zielsubstanz(en) bei einer solchen Filtration konzentriert;
Kontaktieren der Ausgangsflüssigkeit mit einem Chromatographieharz;
Inkubieren der Ausgangsflüssigkeit mit dem Chromatographieharz für eine ausreichend lange Kontaktzeit, um eine gewünschte Fraktion der Zielsubstanz(en) zu binden;
Rückführen des Chromatographieharzes in einem Querstromfilter, wobei die folgenden Schritte durchgeführt werden:
Konzentrieren des Chromatographieharzes und Trennen der verunreinigenden Substanzen aus der chromatographieharzgebundenen Zielsubstanz durch Diafiltration in einem Filter, umfassend eine Membran, die dahingehend wirksam ist, dass sie das Harz zurückhält und die Spezies, die nicht an das Harz gebunden sind, durchlässt;
Eluieren der Zielsubstanz aus dem Chromatographieharz durch Kontakt mit einer Elutionsmembran, die dahingehend wirksam ist, dass sie das Harz zurückhält und die Zielsubstanz(en) durchlässt;
Trennen der Zielsubstanz aus dem Chromatographieharz durch Diafiltration;
Wiedergewinnen der Zielsubstanz(en); und
wahlweise Konzentrieren der Zielsubstanz(en), z.B. durch Kontakt mit einer Konzentrationsmembran, die dahingehend wirksam ist, dass sie ein Konzentrat erzeugt, das mindestens 90 Gew.-% Zielsubstanz(en) umfasst.
Eine andere Verfahrensvariation im Rahmen der Erfindung umfasst ein Verfahren zum Reinigen von einer oder mehr biologischen Zielsubstanzen aus einer Ausgangsflüssigkeit, enthaltend solche Zielsubstanzen. Das Verfahren umfasst:
Kontaktieren der Ausgangsflüssigkeit mit einem Chromatographieharz;
Rückführen des Chromatographieharzes in mindestens ein Querstromfilter, wobei die folgenden Schritte durchgeführt werden:
Konzentration der Zielsubstanz und des Chromatographieharzes in der Ausgangsflüssigkeit durch Tangentialstromfiltration;
Diafiltration des Chromatographieharzes in einem Filter, umfassend eine Membran, die dahingehend wirksam ist, dass sie das Harz zurückhält und Spezies durchlässt, die nicht an das Harz gebunden sind;
Elution der Zielsubstanz aus dem Chromatographieharz durch Kontakt mit einer Elutionsmembran, die dahingehend wirksam ist, dass sie das Harz zurückhält und die Zielsubstanz(en) durchlässt;
Trennen der Zielsubstanz aus dem Chromatographieharz durch Diafiltration unter Gewinnung der Zielsubstanz(en); und
wahlweise Konzentrieren der Zielsubstanz(en).
Bei dem oben beschriebenen Verfahren kann die Ausgangsflüssigkeit ein oder mehr pathogene Organismen enthalten und das Verfahren kann in einem solchen Fall weiter den Schritt des Kontaktierens der Ausgangsflüssigkeit mit einem viralen Inaktivierungsmittel für diese ein oder mehr pathogenen Organismen umfassen.
Das Chromatographieharz kann ein Mikrokügelchen von der Art umfassen, die zum Beispiel im US-Patent 4,828,984 von Schwartz, erteilt am 9. Mai 1989 für „Zusammensetzung, Synthese und Verwendung von nachgebildeten Zellen" oder im US-Patent 4,774,189 von Schwartz, erteilt am 27. September 1988 für „Fluoreszierende Kalibrierungsmikrokügelchen zum Nachbilden von gefärbten Zellen" beschrieben ist, wobei die Offenbarungen hier durch Bezugnahme jeweils vollständig aufgenommen werden. Das US-Patent 4,774,189 von Schwartz beschreibt Mikrokügelchen, die mit Antigenspezies funktionalisiert sind, wobei die antigenen Spezies durch primäre Amine auf deren Molekülen über Oberflächenepoxidgruppen auf den Kügelchen an das Mikrokügelchen gebunden sind.
Die Merkmale und Vorteile der Erfindung werden in näheren Einzelheiten mit Bezug auf die folgenden, nicht einschränkenden Beispiele gezeigt.
Beispiel 1. Reinigung von IgG aus menschlichem Rohplasma
Unter Verwendung der Vorrichtung, die schematisch in der 5 gezeigt ist, wurde IgG durch das Verfahren der Erfindung aus menschlichem Rohplasma gereinigt.
Die 7 zeigt eine SDS Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE), die durchgeführt wird, um die Wirksamkeit einer solchen Reinigung zu beurteilen. Die Spur 701 ist eine Kalibrierungsprobe, die meh rere Peptide mit bekanntem Molekulargewicht enthält. Die Spuren 702 und 703 sind 20 μl bzw. 40 μl Proben der Probe nach der fünffachen Diafiltration durch Querstromchromatographie. Die Spuren 704 und 705 sind 20 μl bzw. 40 μl Proben des Überstands der Chromatographieharzkügelchen nach der Diafiltration. Die Spuren 706 und 707 sind 40 μl Proben von β-Mercaptoethanolverdau der Materialien, die in den Spuren 702 bzw. 704 verwendet werden.
Beispiel 2. Reinigung von IgG aus Gewebekulturflüssigkeit
Unter Verwendung der schematisch in der 5 gezeigten Vorrichtung wurde IgG aus Gewebekulturflüssigkeit gereinigt. Die Gewebekulturflüssigkeit (20,0 l Gewebekultur mit einer Konzentration von 50 μg/ml IgG) wurde durch Filtration mittels eines TRIPORT Filtermoduls (North Carolina SRT, Inc., Cary, NC) geklärt. Das Permeat wurde auf einen Behälter mit einer Suspension von Orbicell^® Protein A Kügelchen (Accurate Polymers, Ltd., Highland Park, IL) gerichtet. Die Suspension von Kulturflüssigkeit und Kügelchen wurden durch eine vollständige Rückführung durch das TRIPORT Filtermodul 15 Minuten lang bei Umgebungstemperatur inkubiert. Die Suspension wurde fünffach konzentriert und dann zehnfach mit 0,4 M NaCl diafiltriert. Die Elution von gebundenem IgG wurde durch Bewegen der Permeatleitung zu einem Abschreckbehälter, der einen Neutralisierungspuffer enthielt, und Wechseln des Dialysepuffers zu einem Säureelutionspuffer durchgeführt. Das neutralisierte Eluat wurde konzentriert und dann zehnfach diafiltriert, um Salze mit niedrigem Molekulargewicht, die sich während der Säureneutralisation gebildet hatten, zu entfernen. Die Endausbeute betrug etwa 100 ml gereinigtes IgG bei einer Konzentration von 10 mg/ml. Die gesamte Verfahrenszeit war 75 Minuten und die Ausbeute an gereinigtem IgG betrug 90–94%.

Claims

Verfahren zum Reinigung einer biologischen Zielsubstanz aus einer Ausgangsflüssigkeit, die mindestens eine biologische Substanz oder ein biologisches Produkt enthält, umfassend die Schritte des Kontaktierens der Ausgangsflüssigkeit mit einem Chromatographieharz zum selektiven oder bevorzugten Binden der Zielsubstanz daran und des Querstromfilterns des Chromatographieharzes mit daran gebundener Zielsubstanz unter Elutionsbedingungen zur Gewinnung eines Filtrats, das die biologische Zielsubstanz umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Ausgangsflüssigkeit Serum, Plasma, eine Plasmafraktion, Vollblut, Milch, Kolostrum, Molke, eine Zellflüssigkeit, Gewebekulturflüssigkeit oder Gewebehomogenat umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die biologische Zielsubstanz einen Impfstoff, einen Gerinnungsfaktor, ein Immunglobulin, ein Antigen, einen Antikörper, ein Protein, ein Glycoprotein, ein Peptid oder ein Enzym umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1 zum Reinigen von einer oder mehr biologischen Zielsubstanzen aus einer Ausgangsflüssigkeit, wobei: das Chromatographieharz selektive Affinität für ein oder mehr biologische Zielsubstanzen besitzt und aus der Gruppe bestehend aus Affinitätschromatographieharzen und Ionenaustauschharzen ausgewählt ist; die Ausgangsflüssigkeit mit dem Chromatographieharz für eine ausreichende Kontaktzeit inkubiert wird, um zu ermöglichen, dass das Harz se lektiv eine gewünschte Fraktion von einem oder mehr biologischen Zielsubstanzen bindet; das Chromatographieharz in einen Querstromfilter rückgeführt wird, wobei die folgenden Schritte durchgeführt werden: das Chromatographieharz wird konzentriert und verunreinigende Substanzen werden aus den mittels Chromatographieharz gebundenen, ein oder mehr biologischen Zielsubstanzen durch Diafiltration ausgeschieden; die ein oder mehr biologischen Zielsubstanzen werden aus dem Chromatographieharz eluiert; und die ein oder mehr biologischen Zielsubstanzen werden aus dem Chromatographieharz durch Diafiltration ausgeschieden; die ein oder mehr biologischen Zielsubstanzen wiedergewonnen werden; und wahlweise die ein oder mehr biologischen Zielsubstanzen konzentriert werden.
Verfahren nach Anspruch 4, weiter umfassend eine anfängliche Klärung der Ausgangsflüssigkeit.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei die anfängliche Klärung mittels Querstromfiltration durchgeführt wird, um Feststoffteilchen zu entfernen.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei die anfängliche Klärung mittels Querstromfiltration durchgeführt wird, um störende Substanzen zu entfernen.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei die eluierten, ein oder mehr biologischen Zielsubstanzen in einem Querstromfiltermodul konzentriert und diafiltriert werden.
Verfahren nach Anspruch 4, weiter umfassend das Aussetzen eines durch Konzentration und Diafiltration des Chromatographieharzes erzeugten Permeats vor der Elution weiteren Reinigungsschritten.
Verfahren nach Anspruch 4, weiter umfassend das Kontaktieren der eluierten, ein oder mehr biologischen Zielsubstanzen mit einem zweiten Chromatographieharz zur weiteren Reinigung.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Chromatographieharz ein oder mehr Affinitätsligandenarten umfasst, die aus der Gruppe bestehend aus Protein A, Protein A-Analogen; Antikörpern; bakteriellen Antigenen; viralen Antigenen; und Farbstoffen ausgewählt sind.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei die ein oder mehr biologischen Zielsubstanzen ein Immunglobulin umfassen.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Ausgangsflüssigkeit ein oder mehr Flüssigkeiten umfasst, die aus der Gruppe bestehend aus Serum, Plasma, Plasmafraktionen, Vollblut, Milch, Kolostrum, Molke, Zellflüssigkeiten, Gewebekulturflüssigkeiten und Gewebehomogenaten ausgewählt sind.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Ausgangsflüssigkeit aus der Gruppe bestehend aus Plasma, Vollblut, Serum und Gewebekultur ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei die ein oder mehr biologischen Zielsubstanzen aus der Gruppe bestehend aus Impfstoffen, Gerinnungsfaktoren, Immunglobulinen, Antigenen, Antikörpern, Proteinen, Glycoproteinen, Peptiden, Enzymen ausgewählt sind.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Chromatographieharz ein Ionenaustauscherharz umfasst.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Chromatographieharz ein Affinitätschromatographieharz umfasst.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei das Affinitätschromatographieharz harte, nicht poröse Celluloseperlen umfasst, die mit den Affinitätsliganden gekoppelt sind.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei die Aftinitätsliganden aus der Gruppe bestehend aus Protein A und Protein A-Analogen ausgewählt sind.
Verfahren nach Anspruch 12 zum Reinigen eines Immunglobulins aus einer Ausgangsflüssigkeit, wobei: die ein oder mehr biologischen Zielsubstanzen das Immunglobulin sind; das Chromatographieharz Protein A umfasst, das mit harten, nicht porösen kugelförmigen Perlen gekoppelt ist; und die Ausgangsflüssigkeit mit dem Chromatographieharz für eine ausreichende Kontaktzeit inkubiert wird, um zu ermöglichen, dass das Harz eine gewünschte Fraktion des Immunglobulins bindet.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei die Ausgangsflüssigkeit aus der Gruppe bestehend aus Gewebekulturflüssigkeit und menschlichem Rohplasma ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei der Schritt des Inkubierens der Ausgangsflüssigkeit mit dem Chromatographieharz durch Rückführen der Ausgangsflüssigkeit und des Chromatographieharzes zwischen einem Querstromfiltermodul und einem Behälter, der die Ausgangsflüssigkeit und das Chromatographieharz enthält, durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, geeignet zum Reinigen einer Flüssigkeit, die eine biologische Zielsubstanz enthält, wobei das Chromatographieharz selektive Affinität für die biologische Zielsubstanz enthält und aus der Gruppe bestehend aus Affinitätschromatographieharzen und Ionenaustauscherharzen ausgewählt ist; wobei das Verfahren die Schritte des Rückführens des Chromatographieharzes mit daran gebundener Zielsubstanz zu einem Querstromfilter und Abtrennen der biologischen Zielsubstanz aus dem Chromatographieharz unter Elutions- und Diafiltrationsbedingungen zur Gewinnung des die biologische Zielsubstanz umfassenden Filtrat umfasst.
Verfahren nach Anspruch 23, wobei die Flüssigkeit vor dem Kontaktieren mit dem Chromatographieharz geklärt wird.
Verfahren nach Anspruch 24, wobei die Klärung die verunreinigenden Substanzen, die für die Reinigung der Flüssigkeit ungünstig sind, entfernt.
Verfahren nach Anspruch 23, wobei das Querstromfiltrieren das Diafiltrieren des Chromatographieharzes mit daran gebundener biologischer Zielsequenz mit einem Puffer umfasst.
Verfahren nach Anspruch 23, wobei die biologische Zielsubstanz nach der Elutionsabkopplung der biologischen Zielsubstanz vom Chromatographieharz aus dem Chromatographieharz diafiltriert wird.
Verfahren nach Anspruch 23, wobei das Querstromfiltrieren ein Permeat erzeugt und das Permeat weiter gereinigt wird.
Verfahren nach Anspruch 28, wobei die weitere Reinigung des Permeats das Kontaktieren des Permeats mit einem zweiten Chromatographieharz zum Binden einer ausgewählten Permeatart, das Querstromfiltrieren des ausgewählten, artgebundenen zweiten Chromatographieharzes durch Rückführens des zweiten Chromatographieharzes in einen zweiten Quer stromfilter und das Auftrennen der ausgewählten Art unter Elutions- und Diafiltrationsbedingungen zur Erzeugung eines die ausgewählte Art als Reinigungsprodukt enthaltenden Filtrats umfasst.
Verfahren nach Anspruch 23, wobei das die biologische Zielsubstanz umfassende Filtrat weiter gereinigt wird.
Verfahren nach Anspruch 30, wobei weiter die Reinigung des Filtrats, das die biologische Zielsubstanz beinhaltet, das Kontaktieren des Filtrats mit einem zweiten Chromatographieharz zum Binden der biologischen Zielsubstanz, das Querstromfiltrieren des zweiten Chromatographieharzes mit daran gebundener, biologischer Zielsubstanz durch Rückführen des zweiten Chromatograhieharzes in einen zweiten Querstromfilter und das Abtrennen der ausgewählten Art unter Elutions- und Diafiltrationsbedingungen zur Erzeugung eines Filtrats, das weiter gereinigte biologische Zielsubstanz als Reinigungsprodukt enthält, umfasst.
Verfahren nach Anspruch 23, wobei der Schritt des Kontaktierens der Flüssigkeit mit einem Chromatographieharz zum Binden der biologischen Zielsubstanz daran die Zugabe der Flüssigkeit zu einer Rückführungsschleife des Chromatographieharzes mittels eines Querstromfilters vor dem Einführen der Elutionsbedingungen umfasst.
Verfahren nach Anspruch 32, wobei der Querstromfilter gebaut, angeordnet und betrieben wird, um Permeatflüssigkeit mit im Wesentlichen gleicher Rate abzugeben, wenn die Flüssigkeit zum Zwecke des Kontaktierens zugesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 23, wobei das Kontaktieren der Flüssigkeit und des Chromatographieharzes die Zugabe der Flüssigkeit zu einem Rührbehälter mit konstantem Volumen, der Chromatographieharz enthält, umfasst.
Verfahren nach Anspruch 23, wobei das Querstromfiltrieren mittels eines Querstromfilters durchgeführt wird, der aus der Gruppe bestehend aus ein oder mehr Hohlfaserfiltern; Spiralfiltern; Platten-Rahmen-Filtern; Kassettenfiltern; Rohrfiltern; Rührzellen; und Keramikfiltern ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 23, wobei das Harz ein oder mehr kompatible Eigenschaften aufweist, die aus der Gruppe bestehend aus Kugelform; unregelmäßige Form; poröse Beschaffenheit; nicht poröse Beschaffenheit; komprimierbare Beschaffenheit; und nicht komprimierbare Beschaffenheit ausgewählt sind.
Verfahren nach Anspruch 23, wobei das Chromatographieharz mindestens einen Ligand umfasst, der aus der Gruppe bestehend aus Protein A, Antikörpern; und Antigenen ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 23, das durchgeführt wird, um eine Auftrennung zu bewirken, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Auftrennen der Flüssigkeit zur Erzeugung eines Impfstoffs oder einer Impfstoffkomponente; Auftrennen des Plasmas oder der Plasmafraktion in ihre Bestandteile; Auftrennen des Kolostrums in seine Bestandteile; Auftrennen der Milch in ihre Bestandteile; Auftrennen der Molke in ihre Bestandteile; Auftrennen einer Fermentationsflüssigkeit in ihre Bestandteile; Auftrennen der Insektenzellkulturflüssigkeit in ihre Bestandteile; Auftrennen der Viruskulturflüssigkeit in ihre Bestandteile; Abtrennen eines Immunglobulins aus einer Immunglobulin enthaltenden Bakterien-, Hefe-, Pilz, Insektenzellen- oder Tierzellenkultur; Abtrennen eines Immunglobulins aus Serum; Abtrennen eines Immunglobulins aus Plasma oder einer Plasmafraktion; Abtrennen eines Immunglobulins aus Vollblut; Abtrennen eines Immunglobulins aus Milch; Abtrennen eines Immunglobulins aus Kolostrum; Abtrennen eines Immunglobulins aus Molke; Abtrennen eines Immunglobulins aus Aszitesflüssigkeit; Abtrennen eines Gerinnungsfaktors aus Vollblut; Abtrennen eines Gerinnungsfaktors aus Plasma; Abtrennen eines Gerinnungsfaktors aus Serum; Abtrennen eines Gerinnungsfaktors aus einer Bakterien-, Hefe-, Pilz-, Insektenzellen- oder Tierzellenkultur, die Gerinnungsfaktor enthält; Abtrennen eines Gerinnungsfaktors aus Milch; Abtrennen eines Gerinnungsfaktors aus Molke Abtrennen eines Gerinnungsfaktors aus Kolostrum; Abtrennen eines Gerinnungsfaktors aus Aszitesflüssigkeit; Abtrennen eines Proteins aus einer Bakterien-, Hefe-, Pilz-, Insektenzellen- oder Tierzellenkultur, die Protein enthält; Abtrennen eines Antigens aus einer Bakterien-, Hefe-, Pilz-, Insektenzellen- oder Tierzellenkultur, die Antigen enthält; Abtrennen eines Antigens aus einer dieses enthaltenden Viruskultur; Abtrennen eines Hormons aus einer Bakterien-, Hefe-, Pilz-, Insektenzellen- oder Tierzellenkultur, die Hormon enthält; Abtrennen eines Hormons aus Serum; Abtrennen eines Hormons aus einer Plasmafraktion; Abtrennen eines Hormons aus Plasma; Abtrennen eines Hormons aus Vollblut; Abtrennen eines Hormons aus Milch; Abtrennen eines Hormons aus Molke; Abtrennen eines Hormons aus Kolostrum; Abtrennen eines Hormons aus Aszitesflüssigkeit; Abtrennen eines Hormons aus Gewebe; Abtrennen eines Hormons aus einer Viruskultur; Abtrennen eines Glycoproteins aus einer Bakterien-, Hefe-, Pilz-, Insektenzellen- oder Tierzellenkultur, die Glycoprotein enthält; Abtrennen eines Glycoproteins aus Serum; Abtrennen eines Glycoproteins aus Plasma; Abtrennen eines Glycoproteins aus einer Plasmafraktion; Abtrennen eines Glycoproteins aus Vollblut; Abtrennen eines Glycoproteins aus Milch; Abtrennen eines Glycoproteins aus Molke; Abtrennen eines Glycoproteins aus Kolostrum; Abtrennen eines Glycoproteins aus Aszitesflüssigkeit; und Abtrennen eines Glycoproteins aus Gewebe.
Verfahren nach Anspruch 1, das zum Auftrennen einer Flüssigkeit in einem Trennsystem geeignet ist, umfassend die Schritte des Klärens des Perfusats eines Bioreaktors in einem ersten Querstromfiltrationsmodul zum Erzeugen eines Permeats, des Strömenlassens des Permeats zu einem Affinitätschromatographieharzbehälter und des Kontaktierens des Permeats mit einem darin befindlichen Affinitätschromatographieharz, des Rückführens des Affinitätschromatographieharzes und des Permeats in das zweite Querstromfiltrationsmodul zur Konzentration, Diafiltration und Elution zur Erzeugung eines Eluats, und des Strömenlassens des Eluats zum dritten Querstromfiltrationsmodul zur Konzentration und Diafiltration darin.
Verfahren nach Anspruch 39, wobei der Bioreaktor von der Bauart ist, die aus der Gruppe bestehend aus Hohlfaserbioreaktoren und Zellkulturbioreaktoren ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 23, wobei zwei oder mehr Chromatographieharze verwendet werden, um zwei oder mehr biologische Zielsubstanzen gleichzeitig zu reinigen.
Verfahren nach Anspruch 41, wobei die Chromatographieharze Affinitätsliganden umfassen, die Antigene sind, und wobei die biologischen Zielsubstanzen Antikörper sind.
Verfahren nach Anspruch 23, wobei das Chromatographieharz Harzpartikel umfasst, wobei mindestens einige der Harzpartikel mehrere Affinitätsliganden haben, wodurch unterschiedliche biologische Zielsubstanzen von einem einzelnen Harzpartikel gebunden werden können.
Verfahren nach Anspruch 4 zum Reinigen von mindestens einer biologischen Zielsubstanz aus einer Ausgangsflüssigkeit, die eine bioaktive verunreinigende Substanz enthält, umfassend das Inaktivieren der bioaktiven verunreinigenden Substanz während des Verfahrens.
Verfahren nach Anspruch 44, wobei die bioaktive verunreinigende Substanz eine bioaktive Art umfasst, die aus der Gruppe bestehend aus Bakterien, Hefen, Viren und Immunantigenen ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 45, wobei die bioaktive verunreinigende Substanz ein Virus umfasst.
Verfahren nach Anspruch 46, wobei die bioaktive verunreinigende Substanz HIV umfasst.
Verfahren nach Anspruch 44, wobei das Inaktivieren das Kontaktieren der bioaktiven verunreinigenden Substanz mit einem Inaktivierungsmittel umfasst.
Verfahren nach Anspruch 48, wobei das Inaktivieren das Kontaktieren der bioaktiven Substanz mit einem Inaktivierungsmittel als Anfangsschritt des Verfahrens umfasst.
Verfahren nach Anspruch 48, wobei die Inaktivierung das Kontaktieren der bioaktiven verunreinigenden Substanz mit einem Inaktivierungsmittel während der Inkubation der Ausgangsflüssigkeit mit dem Chromatographieharz umfasst.
Verfahren nach Anspruch 48, wobei das Inaktivieren das Kontaktieren der bioaktiven verunreinigenden Substanz mit einem Inaktivierungsmittel während des Querstromfiltrationsvorgangs umfasst.
Verfahren nach Anspruch 48, wobei das Inaktivierungsmittel eine an Mikrokügelchen gebundene Inaktivierungsmittelart umfasst.
Verfahren nach Anspruch 48, wobei das Inaktivierungsmittel ein an Mikrokügelchen gebundenes Festhaltemittel für die bioaktive verunreinigende Substanz umfasst.
Verfahren nach Anspruch 48, wobei das Inaktivierungsmittel Strahlung umfasst.
Verfahren nach Anspruch 48, wobei das Inaktivierungsmittel ein Mittel umfasst, das aus der Gruppe bestehend aus Iod, Chlor, Lösungsmittel-Detergens-Zusammensetzungen und ultravioletter Strahlung ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 4 zum Reinigen von ein oder mehr biologischen Zielsubstanzen aus einer Ausgangsflüssigkeit, die die ein oder mehr biologischen Zielsubstanzen enthält, wobei: das Chromatographieharz in mindestens einen Querstromfilter rückgeführt wird, wobei: die ein oder mehr biologischen Zielsubstanzen und das Chromatographieharz in der Ausgangsflüssigkeit durch Tangentialstromfiltration konzentriert werden; das Chromatographieharz in einem Filter, umfassend eine Membran, die dahingehend wirksam ist, dass sie das Harz zurückhält und Arten durchlässt, die nicht an das Harz gebunden sind, diafiltriert wird; die ein oder mehr biologischen Zielsubstanzen aus dem Chromatographieharz durch Kontakt mit einer Elutionsmembran eluiert werden, die dahingehend wirksam ist, dass sie das Harz zurückhält und die ein oder mehr biologischen Substanzen durchlässt.
Verfahren nach Anspruch 56 zum Reinigen von ein oder mehr biologischen Zielsubstanzen aus einer Ausgangsflüssigkeit, die die ein oder mehr biologischen Zielsubstanzen zusammen mit ein oder mehr Virusarten enthält, umfassend: das Kontaktieren der Ausgangsflüssigkeit mit einem Virusinaktivierungsmittel für die ein oder mehr Virusarten; das Konzentrieren der ein oder mehr biologischen Zielsubstanzen in der Ausgangsflüssigkeit durch Tangentialstromfiltration in einem Tangentialstromfilter, umfassend eine Membran, die dahingehend wirksam ist, dass sie mindestens 90 Gew.-% der einen oder mehr biologischen Zielsubstanzen bei einer solchen Filtration konzentriert.
Verfahren nach Anspruch 56, wobei die Ausgangsflüssigkeit ein oder mehr pathogene Organismen enthält, weiter umfassend das Kontaktieren der Ausgangsflüssigkeit mit einem Virusinaktivierungsmittel für die ein oder mehr pathogenen Organismen.
Verfahren nach Anspruch 56, umfassend das Konzentrieren der ein oder mehr biologischen Zielsubstanzen durch Kontakt mit einer Konzentrationsmembran, die dahingehend wirksam ist, dass sie ein Konzentrat erzeugt, das mindestens 90 Gew.-% der ein oder mehr biologischen Zielsubstanzen umfasst.
Verfahren nach Anspruch 56, wobei das Chromatographieharz Mikrokügelchen umfasst.
Verfahren nach Anspruch 60, wobei die Mikrokügelchen Oberflächenepoxidfunktionalität aufweisen und die Mikrokügelchen mit Antigenarten funktionalisiert sind, die durch primäre Amine auf ihren Molekülen an die Mik rokügelchen durch die Oberflächenepoxidfunktionalität auf den Kügelchen gebunden sind.
Reinigungsvorrichtung zum Auftrennen und Konzentrieren einer biologischen Zielsubstanz aus einer Ausgangsflüssigkeit, umfassend: einen Behälter (34) zum Kontaktieren der Ausgangsflüssigkeit mit einem Chromatographieharz mit selektiver Affinität für die Zielsubstanz; ein Querstromfilter (42) zum Diafiltrieren des Chromatographieharzes zur Gewinnung der Zielsubstanz daraus; ein Strömungskreis, der den Behälter (34) und das Querstromfilter (42) zum Strömen einer Flüssigkeit, die das Chromatographieharz enthält, aus dem Behälter (34) zum Querstromfilter (42) und zum Rückführen des Chromatographieharzes aus dem Querstromfilter (42) zurück zum Behälter (34) verbindet; ein Chromatographieharz im Strömungskreis, einen Behälter (34) und ein Querstromfilter (42) zum selektiven Binden der Zielsubstanz; eine Zuführeinrichtung (33) für die Ausgangsflüssigkeit, die in Zuführbeziehung mit dem Behälter (34) verbunden ist; eine Einrichtung zur Abgabe eines eine biologische Zielsubstanz enthaltenden Stroms aus der Vorrichtung (ein oder mehrere von 44, 47, 50, 52); und eine Einrichtung zum Rückführen der Flüssigkeit und des Chromatographieharzes durch den Strömungskreis als Harz/Flüssigkeits-Aufschlämmung.
Vorrichtung nach Anspruch 62, wobei die Zuführeinrichtung für die Ausgangsflüssigkeit einen Bioreaktor (21) umfasst.
Vorrichtung nach Anspruch 62, wobei die Zuführeinrichtung für die Ausgangsflüssigkeit einen Fermenter (21) umfasst.
Vorrichtung nach Anspruch 62, weiter umfassend eine Einrichtung (ein oder mehrere von 44, 50, 52) zur Abgabe eines eine biologische Zielsubstanz enthaltenden Stroms aus dem Querstromfilter (42).
Vorrichtung nach Anspruch 65, wobei die Einrichtung den die biologische Zielflüssigkeit enthaltenden Strom als Permeat (50) aus dem Querstromfilter (42) abgibt.
Vorrichtung nach Anspruch 62, wobei das Querstromfilter (42) eine Membran mit durchschnittlicher Porengröße von 0,04 μm bis 0,6 μm als Stoffaustauschelement umfasst.
Vorrichtung nach Anspruch 62, weiter umfassend ein zweites Querstromfilter (82), das mit dem Strömungskreis gekoppelt ist, zum parallelen Strömungsbetrieb mit dem ersten Querstromfilter (42), wobei jedes Querstromfilter eine Membran mit unterschiedlich großen Poren als Stoffaustauschelement aufweist.
Vorrichtung nach Anspruch 67, weiter umfassend einen zweiten Kontaktierungsbehälter (68), der in Aufnahmebeziehung zur Einrichtung (50) zur Abgabe eines eine biologische Zielsubstanz enthaltenden Stroms als Permeat aus dem Querstromfilter (42) angeordnet ist, wobei der zweite Behälter mit einem zweiten Strömungskreis, der ein zweites Querstromfilter (82) umfasst, zum weiteren Behandeln des die biologische Zielsubstanz enthaltenden Stroms gekoppelt ist.
Reinigungsvorrichtung zum Auftrennen und Konzentrieren einer biologischen Zielsubstanz aus einer Ausgangsflüssigkeit, umfassend: einen ersten Behälter (34), der so gebaut und angeordnet ist, dass er ein Festphasenchromatographieharzmaterial hält und dass selektiv Flüssigkeit in den und aus dem ersten Behälter (34) strömt; ein Festphasenchromatographieharzmaterial, das sich im ersten Behälter (34) befindet, wobei das Festphasenchromatographieharzmaterial selektive Affinität für die biologische Zielsubstanz aufweist und aus der Gruppe bestehend aus Affinitätschromatographieharzen und Ionenaustauscherharzen ausgewählt ist; ein erstes Querstromfiltrationsmodul (42) zum Auftrennen von Flüssigkeiten in Permeat- und Retentatströme, ausgestattet mit einer Einrichtung zum Strömenlassen einer Flüssigkeit in und Permeat- und Retentatflüssigkeitsströmen aus dem ersten Querstromfiltrationsmodul (42); einen zweiten Behälter (68), der zum Fangen und Halten des Permeatflüssigkeitsstroms aus dem ersten Querstromfiltrationsmodul (42) und zum selektiven Strömen der Flüssigkeit in und aus dem zweiten Behälter (68) gebaut und angeordnet ist; ein zweites Querstromfiltrationsmodul (82) zum Konzentrieren eines Flüssigkeitsstroms, das mit einer Einrichtung zum Strömen von Flüssigkeit in und Permeat- und Retentatflüssigkeitsströmen aus dem zweiten Querstromfiltrationsmodul (82) ausgestattet ist; einen Sammelbehälter (80), der so gebaut und angepasst ist, dass er den konzentrierten Flüssigkeitsstrom aus dem zweiten Querstromfiltrationsmodul (82) festhält; und Leitungs-, Ventil- und Pumpeneinrichtungen, gebaut und angeordnet zum: Zuführen von Zusatzflüssigkeiten zum ersten (34) und zweiten (68) Behälter; selektiven Strömen einer Ausgangsflüssigkeit zum ersten Behälter (34), der mit dem Festphasenchromatographieharzmaterial beschickt ist, um eine Aufschlämmung zu bilden; Inkubieren der Ausgangsflüssigkeit mit dem Festphasenchromatographieharzmaterial durch Rückführen der Aufschlämmung aus dem ersten Behälter (34) zum ersten Querstromfiltrationsmodul (42) und Rückführen sowohl der Permeat- als auch Retentatflüssigkeitsströme zum ersten Behälter (34); Rückführen der Aufschlämmung in ein Querstromfilter (42) in einem Strömungsweg, geeignet zum: Konzentrieren der Aufschlämmung und Auftrennen der verunreinigenden Substanzen aus der Aufschlämmung durch Diafiltration; Eluieren der Zielsubstanz aus dem Chromatographieharzmaterial; und Auftrennen der Zielsubstanz aus dem Chromatographieharzmaterial durch Diafiltration; Festhalten der Zielsubstanz im zweiten Behälter (68); Konzentrieren der Zielsubstanz durch Strömenlassen durch das zweite Querstromfiltrationsmodul (82); und Rückgewinnen der konzentrierten Zielsubstanz im Sammelbehälter (80).
Vorrichtung nach Anspruch 70, wobei der erste (34) und zweite (68) Behälter mit Wärmehüllen ausgestattet sind, um geeignete Verfahrenstemperaturen aufrechtzuerhalten.
Vorrichtung nach Anspruch 70, wobei das Chromatographieharzmaterial harte, kugelförmige, nicht poröse Celluloseperlen umfasst.
Vorrichtung nach Anspruch 70, wobei das Chromatographieharzmaterial Protein A umfasst.
Vorrichtung nach Anspruch 62 oder Anspruch 70, wobei die Vorrichtung so gebaut und angeordnet ist, dass sie alle Diafiltrations- und Elutionsvorgänge im ersten Behälter (34) durchführt und für die abschließende Behandlung das sich ergebende Permeat an einen zweiten Behälter (68) weiterleitet.
Vorrichtung nach Anspruch 62 oder Anspruch 74, umfassend ein zweites Querstromfiltrationsmodul (82) zum Konzentrieren eines Flüssigkeitsstroms, das mit Einrichtungen zum Strömenlassen von Flüssigkeit in und Permeat- und Retentatflüssigkeitsströmen aus dem zweiten Querstromfiltrationsmodul (82) ausgestattet ist; und die Leitungs-, Ventil- und Pumpeinrichtungen weiter einen Aufbau und eine Anordnung haben zum: Konzentrieren der biologischen Zielsubstanz durch Strömenlassen durch das zweite Querstromfiltrationsmodul (82).
Vorrichtung nach Anspruch 75, weiter umfassend: einen Bioreaktor (21); ein drittes Querstromfiltrationsmodul zum Konzentrieren eines Flüssigkeitsstroms, wobei das dritte Querstromfiltrationsmodul mit einer Einrichtung zum Strömenlassen von Flüssigkeit in und Permeat- und Reten tatflüssigkeitsströmen aus dem dritten Querstromfiltrationsmodul ausgestattet ist; und die Vorrichtung weiter einen Aufbau und eine Anordnung hat zum: Klären des Perfusats des Bioreaktors im dritten Querstromfiltrationsmodul (72), um ein Permeat zu erzeugen; Strömenlassen des Permeats zum Chromatographieharzbehälter (34) und Strömenlassen des Chromatographieharzes und Permeats zum ersten Querstromfiltrationsmodul (42) zur Konzentration, Diafiltration und Elution, um ein Eluat zu erzeugen; und Strömenlassen des Eluats zum zweiten Querstromfiltrationsmodul (82) zur Konzentration und Diafiltration darin.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 62 bis 69, 74 und 75, weiter umfassend eine Wärmeübertragungseinrichtung (ein oder mehrere von 35, 70) zum Steuern der Temperatur während des Inkubationsschritts.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 62 bis 69, 74, 75 und 77, wobei das Chromatographieharzmaterial harte, nicht poröse Celluloseperlen mit gebundenen Aftinitätsliganden umfasst.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 62 bis 69, 74, 75, 77 und 78, wobei das Chromatographieharzmaterial Protein A als Affinitätsligand umfasst.
Verwendung einer Vorrichtung zum Reinigen einer biologischen Zielsubstanz aus einer Ausgangsflüssigkeit; wobei die Vorrichtung einen Behälter (34), ein Querstromfilter (42), einen Strömungskreis, der den Behälter und das Querstromfilter (42) miteinander verbindet, ein Chromatographieharz mit selektiver Affinität für die bio logische Zielsubstanz, eine Zuführeinrichtung (33) für die Ausgangsflüssigkeit, die in Zuführbeziehung mit dem Behälter (34) verbunden ist, und eine Einrichtung zum Umwälzen der Flüssigkeit und des Chromatographieharzes durch den Strömungskreis umfasst; und wobei: die Ausgangsflüssigkeit mit einem Chromatographieharz im Behälter (34) kontaktiert wird, das Chromatographieharz mittels des Querstromfilters (42) diafiltriert wird, um die biologische Zielsubstanz daraus zu gewinnen, und die Flüssigkeit, die das Chromatographieharz enthält, aus dem Behälter (34) zum Querstromfilter (42) durch den Strömungskreis strömt und aus dem Querstromfilter (42) zurück zum Behälter (34) über den Strömungskreis rückgeführt wird.