DE69909644T2

DE69909644T2 - Chromatographisches verfahren mit verwendung eines wirbelbetts

Info

Publication number: DE69909644T2
Application number: DE69909644T
Authority: DE
Inventors: Patrik Leijon
Original assignee: Amersham Bioscience AB
Current assignee: Cytiva Sweden AB
Priority date: 1998-10-31
Filing date: 1999-10-31
Publication date: 2004-06-09
Anticipated expiration: 2019-11-01
Also published as: EP1131146A1; AU1589800A; AU768241B2; DE69909644D1; US6610200B1; AU1432400A; EP1131146B1; CA2350690A1; CA2348298A1; ATE245048T1; WO2000025883A1; WO2000025884A1; AU767183B2; EP1131147A1; JP2002528737A; JP4458679B2; CA2350690C; US6706191B1; JP2002528256A

Description

Technischer Bereich
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren der Flüssig-Chromatographie mit einer Folge von Schritten, von denen mindestens zwei aufeinander folgende Schritte (Schritt 1 und Schritt 2) im Wirbelbett- bzw. Flüssigbettmodus durch die Verwendung einer Aufwärtsströmung ablaufen.
Bezüglich der verschiedenen Erscheinungsformen der Erfindung wird auf die ebenfalls vorgenommene Internationale Patentanmeldung verwiesen, die sich aus SE 9803813-6 und SE 9803737-7 ableitet. Diese Internationale Patentanmeldung wird hiermit durch Verweis aufgenommen.
Hintergrundtechnologie
Flüssig-chromatographische Prozesse werden auf Teilchenmatrizen in Form von Fest- oder Wirbel- bzw. Flüssigbetten angewendet. Die Prozesse enthalten im typischen Fall mindestens einen Schritt nach Typ b) unten und einen oder mehrere funktionale Schritte, die unter den übrigen Schritten (a, c, d, e, f) ausgewählt werden.

a) Ausgleichen der Teilchen mit einer Flüssigkeit, mit der die Teilchen für Einfang/Bindung konditioniert werden,
b) Einfang einer oder mehrerer, in einer Flüssigkeitsprobe vorhandener Verbindungen durch die Teilchen,
c) Waschen der Teilchen, an die die vorerwähnten einzelnen oder mehreren Verbindungen gebunden worden sind,
d) Abtrennung von mindestens einer der vorerwähnten einzelnen oder mehreren Verbindungen von den Teilchen,
e) Reinigen der Teilchen, und
f) Regenerieren der Teilchen.

Der Einfangschritt (Typ b) definiert zusammen mit den ausgewählten Schritten eine tatsächliche Folge in einem bestimmten chromatographischen Prozess. In einer tatsächlichen Folge kann es auch andere als die oben angeführten (a–f) geben. Eine typische Folge besteht aus den Schritten a, b, c, d, e, f(a), b, c, d, e, f(a), ..., möglicherweise mit zusätzlich in die gegebene Folge eingefügten Schritten. f(a) bedeutet, dass Schritt a und Schritt f zusammenfallen können und dass chromatographische Prozesse zyklisch ablaufen können.
Bei jedem Schritt werden die Teilchen mit einer geeigneten Flüssigkeit (Lösung/ Puffer) behandelt, die wässerig oder nicht wässerig ist.
Der Begriff „Einfang" schließt ein, dass die Verbindung an die Teilchen gebunden wird. Die Bindung kann über die Bildung von Affinitätsbindungen, kovalenten Bindungen, Einschluss in die Teilchen usw. erfolgen. Beispiele für Affinität sind Bioaffinität, Ionenwechselwirkung, hydrophobische Wechselwirkung usw. Die eingefangene Verbindung kann eine Verbindung sein, die gereinigt werden soll, oder eine verunreinigende Substanz, die man von einer anderen Verbindung abtrennen oder aus der Flüssigkeit entfernen möchte, die beim Einfangschritt verwendet wird.
Die im Abtrennschritt verwendete Flüssigkeit enthält im typischen Fall ein Mittel, das die eingefangene Verbindung, z. B. einen Puffer, der einen geeigneten pH-Wert erzeugt, ein Salz, das eine geeignete ionische Stärke ergibt, und eine(n) Affinitätsliganden/-struktur auf den Teilchen, abtrennt. Der Begriff „abtrennen" schließt das Ablösen durch Aufbrechen der Affinitätsbindungen, kovalenten Bindungen usw. ein. Kovalente Bindungen können durch chemische Reaktionen oder enzymatisch aufgebrochen werden.
Die Flüssigkeit, die in einem Schritt verwendet wird, kann sich kontinuierlich oder stufenweise während eines Schrittes ändern. Die Abtrennung mit Hilfe eines Gradienten z. B. ist typisch für Elution an Festbetten, ist aber bisher selten bei Flüssigbetten (Shiloach et al., Sep. Sci. Techn 34(1)(1999) 29–40). Ein weiteres Beispiel ist das Ändern einer Waschlösung während eines Waschschritts.
In Festbetten kann der Abtrennschritt typischerweise aus einem oder mehreren Teilschritten bestehen. Zum Beispiel kann der Einfangschritt das Einfangen von zwei oder mehr Verbindungen bedeuten, die sich unterschiedlich an die Teilchen binden. Zum Beispiel können die Verbindungen unterschiedliche Bedingungen und unterschiedliche Zusammensetzungen der Flüssigkeit erfordern.
Schritte können ganz oder teilweise zusammenfallen. Zum Beispiel bezieht sich der Regenerationsschritt in erster Linie auf die Regeneration der Teilchen, die in einem zweiten Zyklus des Prozesses verwendet werden sollen, und fällt dann mit dem Ausgleichschritt des zweiten Durchlaufs zusammen. Der Einfangschritt kann bedeuten, dass die Verbindung nur gehemmt wird, was darauf hinweist, dass der Ablöseschritt zur selben Zeit abläuft. Falls ein verunreinigender Stoff von den Teilchen eingefangen wird, möglicherweise in Verbindung mit dem Durchlauf durch die zu reinigende Verbindung, kann die Abtrennung während des Reinigungsschritts erfolgen.
Reinigungsschritte werden oft cip (= Reinigung am Ort) genannt. Cip-Schritte sind normalerweise mit einer hohen Konzentration der gelösten Substanz, wie z. B. NaOH, in der verwendeten Flüssigkeit verbunden. Das bedeutet, dass die zum Reinigen verwendete Flüssigkeit oft die höchste Dichte in einer tatsächlichen Folge besitzt.
Jeder Schritt kann im Flüssig- oder Festbettmodus mit vertikaler Strömung durchgeführt werden, die entweder nach oben oder nach unten verläuft. Die Strömungsrichtung kann zwischen den verschiedenen Schritten wechseln. Pfropfenströmung ist oft von Vorteil in der Chromatographie, insbesondere bei den Einfangschritten.
Für die verschiedenen Schritte einer tatsächlichen Folge kann dasselbe Gefäß oder können verschiedene Gefäße verwendet werden.
Während der verschiedenen Schritte werden die Teilchen so in ein Gefäß eingebracht, wie dies im Fachgebiet bekannt ist. Siehe WO 9520427 (Amersham Pharmacia Biotech AB), WO 9218237 (Amersham Pharmacia Biotech AB), unsere ebenfalls eingereichte Internationale Patentanmeldung, die aus SE 9803813-6 und SE 9803737-7 usw. abgeleitet ist. Geeignete Gefäße haben eine Einlass- und eine Auslassseite. Das Gefäß wird im typischen Fall senkrecht aufgestellt, wobei der Auslass an der Oberseite senkrecht nach oben zeigt und der Einlass an der Unterseite senkrecht nach unten zeigt. Die Verhältnisse können auch umgedreht sein. Der Einlass bzw. Auslass können eine oder mehrere Öffnungen mit Verbindung ins Innere des Gefäße umfassen.
Hintergrundpublikationen
Dichteunterschiede zwischen den bei den aufeinander folgenden Schritten verwendeten Flüssigkeiten sind vorher in Modellexperimenten zur Flüssigbettreinigung genutzt worden. Diese Experimente beinhalteten verschiedene Konzentrationen von Glycerol in der Waschlösung für Flüssigbettbehandlungen in kleinem Maßstab. Der Zweck bestand darin, die Viskosität und möglicherweise auch die Dichte der Waschlösung im Vergleich zur Lösung zu erhöhen, die für den Adsorptions-/Einfangschritt verwendet wurde. Siehe Draeger & Chase, Bioseparation 2(1991) 67–80; Chase et al., Sep. Sci. Techn. 27 (1992) 2021–2039; Chase et al. J. Chromatogr. 597 (1992) 129–145; Chase et al., 6. Europäischer-Kongress für Biotechnologie (ECB 6), Florenz, Italien, 13.–17. Juni 1999; Chase, TIBTECH 12 (1994) 296–303; Chang et al., Biotechn. Bioengin. 48 (1995) 355–366, und Chang et al., Biotechn. Bioengin. 49 (1998) 204–216). Die Artikel diskutieren, dass es bestimmte Nachteile beim nachfolgenden Elutions-(Abtrenn-)Schritt auf Grund der Viskosität gibt, die durch das hinzugefügte Glycerol erzeugt wird, und diese Nachteile dadurch vermieden werden können, dass der nachfolgende Abtrennschritt im Festbettmodus ausgeführt wird.
Bei der Flüssigbett-Chromatographie sind oft Flüssigkeiten mit erhöhten Dichtewerten verwendet worden, wenn man von einem Ausgleichsschritt zu einem Einfangschritt weitergeht (die Proben haben oft eine relativ hohe Dichte).
Vor kurzem wurde die Gradientenelution in der Flüssigbett-Chromatographie angewendet. Siehe Shiloach et al., Sep. Sci. Techn 34(1) (1999) 29–40.
Nachteile bisheriger Verfahren
Bei dem Abtrennschritt einer tatsächlichen oben definierten Folge enthält die verwendete Flüssigkeit ein Mittel, das eine eingefangene Verbindung von den Teilchen ablöst. Das bedeutet, dass die Dichte einer Flüssigkeit sich tendenziell während des Abtrennschritts erhöht. Falls das Bett durch eine Aufwärtsströmung fluidisiert wird, besteht die Tendenz, dass Flüssigkeit, die die abgelöste Verbindung enthält, abwärts transportiert wird, während gleichzeitig die Front der Ablöseflüssigkeit nach oben wandert. Das Ergebnis ist eine Verdünnung der abgelösten Verbindung und vielfach eine ungünstige Vergrößerung des Volumens der zu handhabenden Flüssigkeit bei der nachfolgenden Verarbeitung der abgetrennten Verbindung.
Waschflüssigkeiten können relativ leicht sein. Wenn eine Waschflüssigkeit eine niedrigere Dichte als die Flüssigkeit des vorhergehenden Schrittes besitzt, verursacht das Turbulenzen und verringert die Wirksamkeit des Waschschritts. Dies ist besonders ausgeprägt bei Waschschritten, die auf einen Einfangschritt folgen, weil die im Einfangschritt verwendete Flüssigkeit relativ mehrfach dichter ist.
Diese Nachteile können in Gefäßen ausgeprägter auftreten, die keinen beweglichen Auslassanschluss besitzen im Vergleich zu Gefäßen, die diese Art von Adapter besitzen.
Die Erfindung.
Die Erfindung wird in ihrer weitesten Form durch die Methode nach Anspruch 1 dargestellt. Bevorzugte Formen werden in den angehängten unselbständigen Ansprüchen beschrieben.
Die Erfindung ist eine Methode zur Verarbeitung einer flüssigen Probe, die eine oder mehrere Verbindungen enthält, welche durch Einfang mindestens einer derselben durch Teilchen entfernt werden sollen, die in Kontakt mit der Probe gebracht werden. Die Methode umfasst eine tatsächliche Folge wie oben definiert, die aus einer Teilfolge von mindestens zwei aufeinander folgenden Schritten (Schritt 1 und Schritt 2) besteht, bei der die Teilchen fluidisiert werden. Schritt 1 geht Schritt 2 voraus.
Man weiß jetzt vollkommen zu schätzen, dass die oben erwähnten Nachteile dieser Art von Teilfolgen minimiert werden können, wenn die Dichte der in einem Flüssigbett verwendeten Flüssigkeit geringer ist als die Dichte der im nachfolgenden Wirbel- bzw. Flüssigbettschritt verwendeten Flüssigkeit.
Das charakteristische Merkmal der Methode ist, dass die Dichte der in Schritt 2 verwendeten Flüssigkeit (Flüssigkeit 2) höher ist als die Dichte der in Schritt 1 verwendeten Flüssigkeit (Flüssigkeit 1). Das Bett wird während der zwei Schritte in fluidisiertem Zustand gehalten. Die Tatsache, dass Flüssigkeiten mit steigender Dichte für die beiden aufeinander folgenden Schritte verwendet werden, bedeutet, dass die Schritte im selben Gefäß ausgeführt werden, wobei Flüssigkeit 2 Flüssigkeit 1 ersetzt.
Mit dem Ausdruck „das Bett wird während der zwei Schritte in fluidisiertem Zustand gehalten" ist gemeint, dass bei Schritt 1 und 2 im wesentlichen Pfropfenströmung aufrecht erhalten werden soll. Das bedeutet, dass die Plattenzahl im wesentlichen während des ganzen Zeitabschnitts, der durch die zwei Schritte festgelegt ist, ≥5, vorzugsweise ≥10 oder ≥20 sein sollte. Die Plattenzahl kann entsprechend der Beschreibung im experimentellen Teil von WO 9717132 gemessen werden.
Die Dichte der in einem Schritt verwendeten Flüssigkeit ist die Dichte der Flüssigkeit, wie sie auf das fluidisierte Bett angewendet wird, d. h. ohne die Dichteänderung, die während eines Schritts auftreten kann.
Zusätzlich zu Schritt 1 und Schritt 2 können ein oder mehrere Schritte in der tatsächlichen verwendeten Folge vorliegen. Diese zusätzlichen Schritte können unter Ausgleichsschritten, Einfangschritten, Waschschritten, Trennschritten, Reinigungsschritten und Regenerationsschritten und beliebigen anderen verfügbaren Schritten ausgewählt werden. Ein oder mehrere bis alle zusätzlichen Schritte können im fluidisierten Modus liegen, der vorzugsweise im selben Gefäß wie die Teilfolge aus Schritt 1 und 2 ausgeführt wird. Bei Schritten, die nicht im fluidisierten Modus ausgeführt werden, wird angenommen, dass sie im Festbettmodus ausgeführt werden. Typische Schritte, die im Festbettmodus ausgeführt werden, sind Trennschritte und Regenerationsschritte und Ausgleichsschritte und kombinierte Regenerations-/Ausgleichsschritte. Schritte im Festbettmodus können entweder mit Aufwärts- oder Abwärtsströmung ausgeführt werden, wie allgemein für diese Art von Betten bekannt ist. Schritt 1 kann gemeinsam mit einem Flüssigbettschritt oder einer Folge von aufeinander folgenden Flüssigbettschritten aufeinander folgen, die zusammen mit Schritt 1 und Schritt 2 eine Folge bilden, welche Flüssigkeiten steigender Dichte verwendet. In ähnlicher Weise kann Schritt 2 einen unmittelbar nachfolgenden Flüssigbettschritt oder eine unmittelbar nachfolgende Folge von Flüssigbettschritten aufweisen, die zusammen mit Schritt 1 und 2 eine Folge bilden, welche Flüssigkeiten steigender Dichte nutzt.
Das erfindungsgemäße Konzept ist vorzugsweise anwendbar, wenn mindestens einer von Schritt 1 oder Schritt 2 ein funktioneller Schritt ist, der z. B. aus a–f oben ausgewählt wird. Beispiele für Teilfolgen, in denen sowohl Schritt 1 als auch Schritt 2 funktionelle schritte sind, sind folgende:
Die Tabelle setzt voraus, dass die Flüssigkeiten so ausgewählt, wurden, dass Schritt 2 eine höhere Dichte als Schritt 1 aufweist.
Dichte reduzierender Schritt: Die Eigenschaft, Flüssigbettschritte zu besitzen, bei denen eine dichtere Flüssigkeit vor einer leichteren Flüssigkeit kommt, kann Vorteile beim Umgang mit dichten viskosen Flüssigkeiten haben, z. B. Einfangflüssigkeiten. In diesen Fällen kann es schwierig sein, die Dichte weiter zu erhöhen. Dies wird dadurch überwunden, dass man eine Zone mit einer leichteren Flüssigkeit (Flüssigkeit 1, Schritt 1) hat, z. B. eine „Waschlösung", die das Bett durchlaufen soll, und dann im nächsten Schritt (Schritt 2) die Dichte der Flüssigkeit (Flüssigkeit 2) erhöht. Der Nachteil ist, dass sich die Gefahr von Bettturbulenzen erhöht, aber die Flüssigkeit, die das Bett verlässt, trotzdem leichter als die dichte Flüssigkeit sein wird, die vor Flüssigkeit 1 verwendet wurde. Flüssigkeit 2 kann zum Beispiel eine echte Waschflüssigkeit sein, mit einer relativ zur „Wasch"-Lösung erhöhten Dichte. Bezogen auf diesen Schritt, der Schritt 1 vorausgeht, ist dieses Prinzip auf jeden der Schritte a–f anwendbar, insbesondere aber auf Schritt 1, der ein Einfangschritt ist.
Der Anstieg der Dichte beim Fortschreiten von Schritt 1 zu Schritt 2 schließt auch den Zusatz von Dichte erhöhenden Mitteln zur Flüssigkeit ein, die in Schritt 1 („Wasch"-Lösung) verwendet wird. Diese Mittel sollten nicht die Bindung der Verbindung an die Teilchen verringern. Typische Mittel sind ladungsfreie lösliche Verbindungen, wie z. B. ladungsfreie Verbindungen, die eine Kohlenhydratstruktur besitzen. Siehe unten.
Schritt 2 kann dazu verwendet werden, die im vorhergehenden Schritt (Schritt 1) und im nachfolgenden Schritt (Schritt 3) verwendete Flüssigkeit im verwendeten Gefäß physisch voneinander getrennt zu halten. Bei dieser Variante können Schritt 1 und 3 unter den Schritten a–f oben ausgewählt werden. Durch Anwendung der Prinzipien der vorliegenden Erfindung wird die in Schritt 2 verwendete Flüssigkeit eine Dichte besitzen, die zwischen den Dichten in Schritt 1 und Schritt 3 liegt. Diese Variante der Erfindung ist besonders nützlich, wenn Schritt 1 ein Trennschritt ist. Während eines Trennschritts erhöht sich die Dichte der verwendeten Flüssigkeit, was wiederum zu einer Verdünnung der Probe und zu einem erhöhten Volumen führt. Es kann daher vorteilhaft sein, mit einer dichteren Flüssigkeit unmittelbar nach dem Trennschritt zu eluieren, d. h. vor dem Reinigungsschritt oder bevor eine zweite Verbindung abgetrennt wird, möglicherweise mit einem anderen Trennmittel und/oder mit einer Flüssigkeit mit höherer Dichte, die dasselbe Trennmittel enthält. Die Flüssigkeit, die in Schritt 2 dieser Variante verwendet wird, kann dieselbe wie die in Schritt 1 verwendete sein, aber mit einer hinzugesetzten, die Dichte erhöhenden Substanz. Diese Substanz kann dieselbe sein wie das in Flüssigkeit 1 verwendete Trennmittel oder ein anderes. Andere Alternativen für Dichte erhöhende Mittel sind Glycerol, andere Kohlenhydrate, Salze usw.
Ein Schritt des Festbettmodus kann in die tatsächliche verwendete Folge eingefügt werden, wenn eine Notwendigkeit besteht, die Dichte der Flüssigkeit eines nachfolgenden Schrittes herabzusetzen. Zum Beispiel kann es nach einem bestimmten Schritt nicht machbar oder praktikabel sein, die Dichte weiter zu erhöhen. Diese Verwendung von Schritten des Festbettmodus liefert einen einfachen und praktischen Weg, einen Prozess entsprechend der Erfindung zyklisch zu machen. Die Flüssigkeit, die bei dieser Art von Schritten des Festbettmodus verwendet wird, hat vorzugsweise eine geringere Dichte als die zwei Flüssigkeiten, die bei den benachbarten Schritten verwendet werden. Sobald die Dichte der Flüssigkeit für einen Schritt verringert wurde, können Flüssigkeiten mit erhöhten Dichten in aufeinander folgenden Schritten verwendet werden. Grundsätzlich kann ein Schritt a–f oben im Festbettmodus ausgeführt werden, wie in diesem Abschnitt beschrieben. Sehen Sie wegen typischer Schritte im Festbettmodus oben nach.
Ein anderer Weg zur Realisierung zyklischer Prozesse besteht in der Verwendung von Teilfolge VI aus der Tabelle oben, vorausgesetzt, dass die Flüssigkeit in Schritt 1 eine ausreichend niedrige Dichte besitzt. In der Praxis bedeutet das, dass ein Wirbelbett bei diesem Schritt akzeptiert werden muss.
Große Vorteile entstehen, wenn Schritt 1 ein Wasch- oder Trennschritt ist.
Ein Anstieg der Dichte kann durch Erhöhen der Konzentration einer Substanz erreicht werden, die in der verwendeten Flüssigkeit löslich ist und eine Dichte erhöhende Wirkung auf die Flüssigkeit besitzt. Typische Beispiele von Substanzen für wässerige Lösungen sind Salze, wie z. B. Halogenide (typischerweise Chloride), Phosphate, Sulfate usw., zum Beispiel deren lösliche Metall- und Ammoniumsalze, und ladungsfreie Substanzen, wie z. B. lösliche Kohlenhydrate, zum Beispiel Glycerol und andere Mono- oder Oligosaccharide. Was organische Verbindungen angeht, sollten sie in der Regel eine Dichte besitzen, die größer als die der Flüssigkeit ist, um beim Hinzufügen zur Flüssigkeit eine höhere Dichte zu erreichen. Im typischen Fall sollten sie ein großes Molekurlargewicht besitzen, was sich z. B. in der Zahl der Kohlenstoffatome von ≥3 widerspiegelt, wie z.B, in Kohlenhydraten mit ≥4 Kohlenstoffatomen.
Es ist wichtig, das die Dichte erhöhende Mittel so auszuwählen, dass die Bindung zwischen der Verbindung und den an dem Schritt beteiligten Teilchen nicht in einer unerwünschten Weise gestört wird. In Schritten, die einem Trennschritt vorausgehen, darf das Mittel nicht als Trennmittel zur Ablösung im Schritt oder in einem anderen nachfolgenden Trennschritt wirken. In Trennschritten darf das Mittel nicht in der Lage sein, der beabsichtigten Trennung entgegenzuwirken.
Der erforderliche relative Dichteunterschied zwischen zwei aufeinander folgenden Flüssigbettschritten hängt von verschiedenen Faktoren ab, zum Beispiel von der gewünschten Zahl theoretischer Platten. Diese Zahl wiederum hängt von der Säulenkonstruktion, einschließlich Verteilerkonstruktion, ab. Unsere bisherigen Ergebnisse deuten darauf hin, dass die relative Erhöhung der Dichte immerhin lediglich 1/10000 zwischen zwei aufeinander folgenden Flüssigbettschritten betragen kann, vorausgesetzt, das System ist für Pfropfenströmung entsprechend >35 theoretischen Platten im fluidisierten/erweiterten Bett optimiert. Der relative Zuwachs an Dichte für jeden aufeinander folgenden Flüssigbettschritt kann ≥1/10000, wie z. B. ≥1/1000 oder ≥1/100 oder ≥1/10, der Dichte der Flüssigkeit betragen, die in dem unmittelbar vorhergehenden Flüssigbettschritt (zum Beispiel ausgewählt aus den oben definierten Schritten a–f) verwendet wird. Je nach dem verwendeten System kann die Zahl der theoretischen Platten bis hinunter zu 5 betragen, vorausgesetzt, der relative Dichteunterschied für die Flüssigkeiten zwischen zwei aufeinander folgenden Flüssigbettschritten ist ausreichend groß. Daher können also Systeme, die z. B. ≥5, wie z. B. ≥15 und ≥35 theoretische Platten im Flüssigbett liefern, verwendet werden.
Ein Anstieg der Dichte wird oft von einem Anstieg der Viskosität begleitet. Einige Substanzen besitzen eine stärker ausgeprägte Fähigkeit, die Viskosität von anderen zu erhöhen. Das kann sich ungünstig in Flüssigbettsystem auswirken. Es kann daher vorteilhaft sein, von einer Substanz mit einem ausgeprägten zu einer mit einem weniger ausgeprägten die Viskosität erhöhenden Effekt überzugehen, wenn man die Dichte der fluidisierenden Flüssigkeit zwischen zwei Flüssigbettschritten erhöht.
In absoluten Zahlen sollte die Dichte der verwendeten Flüssigkeit höher als die der reinen Flüssigkeit ohne alle zugesetzten, die Dichte erhöhenden Mittel sein. Die obere Grenze wird durch die Dichte der Teilchen und/oder praktische Erwägungen, wie z. B. Kosten für Dichte erhöhende Materialien, bestimmt. Für wässerige Flüssigkeiten bedeutet das, dass die Dichte der Flüssigkeiten für aufeinander folgende Flüssigbettschritte sich innerhalb des Intervalls von 0,98 bis 1,20 oder bis 1,50 g/cm³ ändern kann, mit einer Bevorzugung für 1,00 bis 1,15 g/cm³. Die untere Grenze von 0,98 g/cm³ erklärt sich durch die Tatsache, dass die Dichte verringernde Mittel zugesetzt werden können, wie z. B. mit Wasser mischbare organische Lösungsmittel, z.B: Methanol, Ethanol usw. Durch die Verwendung von schwereren Teilchen, zum Beispiel mit Dichten von ≥1,20 g/cm³, kann die obere Grenze möglicherweise nach oben verschoben werden, und dementsprechend könnten Flüssigkeiten mit größerer Dichte verwendet werden. Das bedeutet, dass wässerige Flüssigkeiten, die in zwei aufeinander folgenden Flüssigbettschritten gemäß der Erfindung verwendet werden, einen Dichteunterschied im Bereich von gerade einmal etwas über 0 bis mindestens 0,52 g/cm³, mit der Bevorzugung von mindestens 0,22 g/cm³, haben können. Analoge Bereiche können aufgestellt werden, falls man sich entschließt, nichtwässerige Flüssigkeiten zu verwenden.
Die Dichte der Teilchen sollte ≥1,05 g/cm³, vorzugsweise ≥1,14 g/cm³ und sogar ≥1,20 g/cm³, wie z. B. ≥1,30 g/cm³ sein. Man kann sich einen oberen Grenzwert von 5–6 g/cm³ vorstellen. Geeignete Teilchen werden in WO 9218237 (Amersham Pharmacia Biotech AB); WO 9717132 9218237 (Amersham Pharmacia Biotech AB); WO 9893572 (Amersham Pharmacia Biotech AB) und WO 9200799 (Kem-En-Tek/Upfront Chromatography A/S) beschrieben. Geeignete Teilchen enthalten oft anorganisches Material als Dichte erhöhendes Material. Geeignete Teilchen können auch synthetische Polymere enthalten. Polymere können in rein synthetische Polymere, halbsynthetische Polymere und Biopolymere eingeteilt werden. Synthetische Polymere können monomerische Einheiten enthalten, die aus Acrylamiden, Methacrylamiden, Hydroxyalkylacrylaten, Hydroxyalkylmethacrylaten, Styrenen, Divinylbenzenen usw. ausgewählt werden. Halbsynthetische Polymere umfassen zum Beispiel vernetzte Biopolymere und deren Copolymerisate und Graftpolymere, die aus Biopolymeren stammende Strukturen zeigen. Biopolymere umfassen Polysaccharide, wie z. B. Dextran, Agarose, Zellulose, Stärke und Pullulan. Gut bekannte Teilchen, die für Flüssig- bettanwendungen eingesetzt wurden, werden unter dem Warenzeichen Streamline (Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Schweden) vertrieben und gehören zu einer Gruppe von Teilchen, die sowohl Dichte erhöhendes Material, oft anorganisch, wie auch hydrophiles organisches, im typischen Fall polymeres, Material umfassen.
Die Verfahrenstemperatur für verschiedene betroffene Schritte hängt unter anderem von der verwendeten Flüssigkeit und der einzufangenden Verbindung ab. Für wässerige Lösungen kann die Verfahrenstemperatur von 0°C bis z. B. 70–90°C betragen, obwohl die Temperatur aus praktischen Erwägungen oft im Intervall von 0 bis 50°C liegt. Für andere Flüssigkeiten können andere Bereiche zutreffen.
Die erfindungsgemäße Methode findet ihre größte Anwendung in Prozessen mit relativ großer Produktivität. Das bedeutet, dass die verwendeten Fließgeschwindigkeiten mindestens 70–3000 cm/h, vorzugsweise 80–90 cm/h und mehr betragen sollten. Das Gefäß sollte eine Querschnittsfläche haben, die typischerweise der Fläche eines Quadrates mit der Kantenlänge von mindestens 10 cm entspricht, wie z. B. mindestens 15 cm. Die genannte Querschnittsfläche steht senkrecht zur Flüssigkeitsströmung, die die Teilchen fluidisiert.
Wie oben angeführt, kann die tatsächliche Folge einen oder mehrere Schritte umfassen, die am besten im Festbettmodus ausgeführt werden, möglicherweise durch Umkehren der Strömung relativ zu den Teilchen. Beim Start mit einem Schritt im Flüssigmodus in einem herkömmlichen Gefäß kann man dies dadurch erreichen, dass man sich die Teilchen zu einem „Festbett" absetzen lässt und dann eine Aufwärts- oder Abwärtsströmung durch das Gefäß anwendet. Eine Alternative verwendet ein schrägstellbares Gefäß, das beim Wechsel des Bettmodus um 180° gekippt werden kann. Siehe Bild 7a–b unserer ebenfalls anhängigen Internationalen Patentanmeldung, die sich aus SE 9803813-8 und SE ableitet. Diese An der Änderung der Strömungsrichtung kann besonders nützlich sein, falls die Teilchen regeneriert werden sollen, zum Beispiel um in einem zweiten Durchlauf desselben Prozesses verwendet zu werden. Die Vorteile leiten sich aus der Tatsache ab, dass der Reinigungsschritt oft die Flüssigkeit mit der höchsten Dichte verwendet, während ein kombinierter Regenerations-/Ausgleichsschritt eine Flüssigkeit mit niedriger Dichte nutzt. Eine Alternative zu einem Schritt nach dem Festbettmodus, zum Beispiel durch Kippen, kann darin bestehen, eine reduzierte Plattenzahl während des Trennschritts zu akzeptieren und den Schritt unter Fluidisierungsbedingungen mit einer Flüssigkeit durchzuführen, die eine niedrigere Dichte als die im vorherigen Schritt verwendete besitzt. Siehe oben.
Festbettschritte können mit Flüssigbettschritten in dafür vorgesehenen Geräten kombiniert werden. Siehe die. ebenfalls anhängige Internationale Patentanmeldung mit Vorrang von SE 9803813-6 und SE 9803737-7. Daher kann die vollständige tatsächliche Folge des erfindungsgemäßen Verfahrens in einem gemeinsamen Gerät durchgeführt werden, in dem der Kollektor während der aufeinander folgenden Flüssigbettschritte in einem festen Abstand vom Verteiler gehalten wird. Die bevorzugte An von Gefäßen kann also fest montierte Kollektor- und Verteileranordnungen besitzen. Das schließt nicht aus, dass die voll ständige Folge auch in einem Gefäß ausgeführt werden kann, das einen beweglichen Auslassadapter besitzt, wie z. B. in WO 9520427 (Amersham Pharmacia Biotech AB) und WO 9218237 (Amersham Pharmacia Biotech AB) beschrieben. Dies schließt auch nicht ein System von Gefäßen aus, in dem verschiedene Gefäße den Flüssigbettschritten bzw. Festbettschritten zugeordnet sind (siehe Bild 8–10 in der ebenfalls anhängigen Internationalen Patentanmeldung, die sich von SE 9803818-6 und SE 9803737-7 ableitet).
Die oben erwähnten Dichtebereiche für Flüssigkeiten beziehen sich auf Dichten, die bei der tatsächlichen Verfahrenstemperatur gemessen wurden. Bei Teilchen beziehen sich die Dichten auf Teilchen im Feuchtzustand, die mit der reinen verwendeten Flüssigkeit, z. B. Wasser, getränkt sind. Plattenzahlen beziehen sich auf diejenigen, die mit der in WO 9717132 beschriebenen Methode bestimmt wurden.
Anwendungen, bei denen die Erfindung eingesetzt werden kann.
Die Erfindung wird in erster Linie bei Flüssig-Chromatographieverfahren eingesetzt. Beispiele sind Ausschlusschromatographie (Gelpermeationschromatographie) und Adsorptionsverfahren und Verfahren, die die Bildung kovalenter Bindungen zwischen den Teilchen und der aus der Flüssigkeit zu entfernenden Verbindung beinhalten. Adsorptionsverfahren werden auch Affinitätschromatographie genannt. Die wichtigen Varianten sind Ionenaustauschchromatographie und Verfahren, die auf anderen Affinitätsprinzipien beruhen, wie z. B. Bioaffinität, hydrophobe Wechselwirkung (HIC), chelatbildende Wechselwirkung usw. Die Struktur auf den Teilchen, die Adsorption bewirkt, wird oft Affinitätsligand oder Affinitätsstruktur genannt.
Die auf den Teilchen einzufangenden Verbindungen können Ionen, zum Beispiel Metallionen, und anorganische und organische Verbindungen, wie z. B. Biomoleküle, beispielsweise Proteine, Kohlenhydrate, Fette, Aminosäuren, Hormone usw. sein. Im Fall der Proteine können diese in Wirtszellen (zum Beispiel Bakterien, Hefen, Säugetier-, Pflanzen- und Insektenzellen) neu kombiniert, durch in vitro-Proteinsynthese oder in transgenen Tieren, wie z. B. transgenen Säugetieren und transgenen Vögeln, z. B. Wellesittichen, gebildet worden sein. Insbesondere kann die Produktion von Humanproteinen in Kühen, Schafen, Ziegen, Pferden usw. genannt werden. Wichtige Proteine sind native oder rekombinante Formen von Plasmaproteinen, wie z. B. Blutgerinnungsfaktoren, Immunglobuline, ATIII, α₁-Antitrypsin, Serumalbumin usw., Milchserumproteine, wie z. B. Lactoferin und Lactoperoxidase; Enzyme; Peptide oder Proteinhormone, wie z. B. Wachstumshormone, Insulin usw.; Erythropoetin; Proteinantigene und ihre zu verwendenden Fragmente, zum Beispiel als Impfstoffe oder Mittel in der Hyposensibilisierungstherapie, und andere Proteine, die von therapeutischem Interesse sind. Bei den Blutgerinnungsfaktoren können FVIII, FVII, FIX usw. genannt werden. Unter den Immunglobulinen können verschiedene Formen von monoklonalen Antikörpern (IgA, IgD, IgE, IgG, IgM) einschließlich der Fragmente und fusionierte Formen derselben genannt werden. Industrielle Enzyme, wie z. B. diejenigen, die in Waschpulvern und in anderen, zum Reinigen bestimmten Zusammensetzungen verwendet werden, sind von potentieller Bedeutung.
Die Proben, die auf das Flüssigbett anzuwenden sind, sind Flüssigkeiten, die die Verbindung enthalten, welche im Einfangschritt an die Teilchen zu binden ist. Dazu gehören Fermentierungsbrühen und andere biologische Flüssigkeiten, die von Tieren, wie z. B. Säugetieren und anderen Wirbeltieren und Wirbellosen, gewonnen werden. Insbesondere schließt dies transgene Tiere ein, wie oben diskutiert. Besondere biologische Flüssigkeiten von Tieren sind Blut, Serum, Urin, Milch (einschließlich Milchserum) usw. und Proben, die andere oben angeführte Biomoleküle zusammen mit klebrigen und/oder partikelförmigen Komponenten enthalten.
Die ursprüngliche Probe kann eine Reihe von Vorbehandlungsschritten durchlaufen haben, bevor sie im Einfangschritt angewendet wird. Vorbehandlungsschritte können Verdünnung, Konzentration, Entsalzung, Entfernung spezifischer Komponenten, Zentrifugation, Filtration, Dialyse, Ultrafiltration, pH-Werteinstellungen usw. sein. Ein typisches Verfahren besteht darin, die Probe in einem Puffer zu verdünnen, was dieselben Bedingungen wie bei dem Puffer liefert, der im Ausgleichsschritt verwendet wird. Eine Alternative besteht darin, diese Teilchen ins Gleichgewicht mit den Bedingungen zu bringen, die von der Probe geliefert werden. Diese Verfahren werden im typischen Fall nach den geeigneten Vorbehandlungen einer ursprünglichen Probe ausgeführt.
Die Erfindung wird Anwendung in einer großen Vielfalt von technischen Bereichen finden, wie z. B. der Lebensmittelindustrie, Wasserreinigung and Wasserentionisierung, Medikamentenherstellung, dem Frischen von Metallen usw.
Ein besonders wichtiger Aspekt der Verwendung von Dichteunterschieden, wie hier beschrieben, ist der der Verarbeitung einer Verbindung aus einer Probe, die aus einer biologischen Flüssigkeit von einem Tier, insbesondere einem transgenen Tier, gewonnen wurde. Bei dieser Form umfasst der Prozess als solcher eine tatsächliche Folge von Schritten mit charakteristischen Merkmalen, wie oben definiert. Die betreffenden biologischen Flüssigkeiten und ihr Ursprung sind oben diskutiert worden. Die betreffenden biologischen Flüssigkeiten sind in erster Linie diejenigen, die partikelförmige und/oder klebrige Komponenten enthalten und/oder mehr oder weniger hochviskos sind, zum Beispiel Blut, Serum, Plasma, Milch, Milchserum usw. Die Verbindungen sind dieselben wie oben diskutiert.
Die bevorzugten Erscheinungsformen der Erfindung verwenden Gefäße und Systeme, wie in der ebenfalls anhängigen Internationalen Patentanmeldung beschrieben, die aus SE 9803613-6 und SE 9803737-7 abgeleitet ist.
Die Erfindung wird nun im experimentellen Teil erläutert. Die Erfindung wird weiter durch die angehängten Patentansprüche definiert.
EXPERIMENTELLER TEIL
Test zur Verwendung von Dichteuaterschieden bei der Vermeidung der Vermischung von nacheinander einströmenden Flüssigkeiten in einem Flüssigkeitsbett
Der Hintergrund dieses Tests besteht darin, dass man die Säule im erweiterten Modus betreiben können muss, ohne Leistung auf Grund von Instabilität des Bettes (Vermischung, Kanalbildung usw.) einzubüßen. Die Theorie besagte, dass die Dichte der Flüssigkeiten, und nicht die Viskosität der Flüssigkeiten, der Schlüsselfaktor ist, der entscheidet, ob zwei verschiedene Flüssigkeiten sich in einem Flüssigkett vermischen oder nicht. Das bedeutet, dass eine schwere Flüssigkeit, die in eine expandierte Bettsäule gepumpt wird (gleichmäßige Verteilung von Flüssigkeit), welche eine leichtere Flüssigkeit enthält, eine scharfe Grenze zwischen den zwei Flüssigkeiten erzeugt, und dass keine Vermischung auftritt, während andererseits eine leichte Flüssigkeit, die in eine schwere Flüssigkeit gepumpt wird, eine starke Vermischung hervorruft. Durch die Verwendung steigender Dichten von Flüssigkeit zu Flüssigkeit tritt keine Vermischung auf, und dadurch wird ein minimaler Verbrauch an Puffer erreicht.
Experiment
Es wurde eine herkömmliche Säule (200 mm Durchmesser und 1000 mm hoch) mit der vorhandenen Verteileranordnung verwendet (Lochplatte mit Maschengewebe; Streamline, Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Schweden). Bei diesem Experiment wurde Streamline-DEAE-Gel verwendet. Fünf verschiedene Flüssigkeiten wurden (mit 300 cm/h) in die Säule von unten nach oben in folgender Reihenfolge gepumpt:
Das Ergebnis waren scharfe Grenzen zwischen den verschiedenen Flüssigkeiten in Gegenwart eines Flüssigbettes und dadurch keine Vermischung der Flüssigkeiten.
Dieses Experiment bewies, dass die Flüssigkeitsdichte der entscheidende Faktor ist, wenn es um das stabile Verhalten bei der Nichtvermischung von verschiedenen Flüssigkeiten, auch in der Gegenwart eines Flüssigbettes, geht.

Claims

Flüssigchromatographieverfahren, das in einem Behälter durchgeführt wird, welcher Teilchen umfasst, die in der Lage sind durch einen den Behälter passierenden Flüssigkeitsstrom fluidisiert zu werden, und welches eine tatsächliche Reihenfolge von Schritten aufweist, umfassend: (a) mindestens einen Einfangschritt, bei dem eine oder mehrere Verbindungen in einer Probe an die Teilchen gebunden werden, und (b) zwei aufeinanderfolgende Schritte (Schritt 1 und Schritt 2), bei denen das Bett durch einen den Behälter stromaufwärts passierenden Flüssigkeitsstrom fluidisiert wird, dadurch gekennzeichnet, dass Schritt 1 ein Freisetzungsschritt ist und Schritt 2 ein Reinigungsschritt ist, und dass eine in Schritt 2 verwendete Flüssigkeit (Flüssigkeit 2) eine Dichte besitzt, welcher höher ist als die Dichte einer in Schritt 1 verwendeten Flüssigkeit (Flüssigkeit 1).
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Schritt 1 ein die Dichte verringernder Schritt ist, welchem ein Schritt vorangeht, bei dem eine Flüssigkeit eingesetzt wird, welche eine höhere Dichte als die in Schritt 1 verwendete aufweist.
Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Einfangschritt im Wirbelbettmodus erfolgt.
Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren zyklisch ist, wobei jeder Zyklus mit einem Regenerationsschritt endet, welcher der Gleichgewichtsschritt für einen nachfolgenden Zyklus ist.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Regenerations-/Gleichgewichtsschritt im Packbettmodus erfolgt.
Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Dichteunterschied zwischen Flüssigkeit 1 und 2 bewirkt wird durch eine Differenz in der Konzentration einer löslichen Substanz, beispielsweise ein Salz oder ein Saccharid, und/oder in der Art löslicher Substanzen.
Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass Flüssigkeit 1 ein Freisetzungsmittel enthält und eingesetzt wird zur Freisetzung einer eingefangenen Verbindung, und dass Flüssigkeit 2 eine erhöhte Dichte besitzt, verglichen mit Flüssigkeit 1, aufgrund des Vorliegens einer Substanz, welche von dem Freisetzungsmittel verschieden ist.
Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Behälter eine Querschnittsfläche besitzt, welche zur Fläche eines Quadrats mit einer Seite von mindestens 10 cm korrespondiert.
Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass (a) der Behälter ein Einlassende (Verteileranordnung) und ein Auslassende (Sammelanordnung = Auslassadapter) besitzt, und (b) der Abstand zwischen dem Einlassende und dem Auslassende während mindestens zwei aufeinanderfolgenden Wirbelbettschritten im wesentlichen konstant gehalten wird.
Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass (a) die Verteiler- und Sammelanordnungen des Behälters fest montiert sind, oder (b) der Auslassadapter bezüglich dem Einlassende bewegbar ist.
Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe eine oder mehrere Verbindungen enthält, welche von einem Tier und/oder kultivierten Säugerzellen abgeleitet sind.
Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass Schritt 2 ein unmittelbar nachfolgender Wirbelbettschritt oder eine unmittelbare Nachfolge von Wirbelbettschritten ist, welche zusammen mit Schritten 1 und 2 eine Reihenfolge bilden, bei der Flüssigkeiten mit zunehmender Dichte eingesetzt werden.