JPS63231262A - カラム内の液組成変更方法およびカラム支持器 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、カラムを用いて物質を分離分析するクロマト
グラフィーに際して、カラム内の液組成を変更する方法
、およびその方法の実施に使用するカラム支持器に関す
る。

（従来の技術） 物質を分離分析するクロマトグラフィーでは。

送液から溶出液の分析までを行う高性能液体クロマトグ
ラフィー（ＨＰＬＣ）が、高性能であり、しかも再現性
に優れていることから、広範囲に利用されている。しか
しながら、該ＨＰＬＣは装置が高価であり、しかも高圧
下で行う必要があることから。

オープンカラムやミニカラムにより簡便に物質を分離す
る方法も多用されている。

オープンカラムは、充填剤層上に空気層が存在するタイ
プのカラムである。ミニカラムは該オープンカラムをさ
らに簡便化したものであり、使い捨てのディスポカラム
として一般的に使用されている。

オープンカラムやミニカラムでは、物質の分離に際して
、充填剤に精製すべき物質あるいは除去すべき物質を吸
着させた後に、カラム内の洗浄のために、あるいは物質
の溶出のために、洗浄液あるいは溶離液がカラム内に注
入される。しかし。

前述のようにオープンカラムでは、充填剤の上方に空気
層が存在するため、充填剤に洗浄液等を注入する際の圧
力調整が容易ではなく、充填剤層上に洗浄液等が溜まっ
て、しばしば液層が形成される。このように、洗浄液層
等が充填層上に形成さ胱ると、洗浄処理後に、カラム内
の液組成を変更すべく溶離液を注入すると、注入された
溶離液が充填剤上の洗浄液により希釈され、物質を再現
性よく効率的に分離することができない。

このため、充填剤上に形成される洗浄液等の液層は２例
えばカラムを密閉状態として、ポンプ等にてカラム内を
高圧にし、充填剤上の洗浄液等を充填剤内に押し込み、
充填剤上に洗浄液層が存在しない状態としてから、溶離
液を注入することが行われる。しかし、このような方法
では、カラム内が液切れ状態になると、空気が充填剤内
に侵入し、気泡を形成するおそれがある。充填剤内の気
泡は、充填剤内にてショートバスを形成し、カラムの分
離効率を著しく低下させる。このため、充填剤中に気泡
が存在すれば、充填剤中より気泡を除去しなければなら
ないが、気泡を除去すべくカラム内に液体を通流させて
も、気泡を完全に除去することは非常に困難である。従
って、充填剤に空気等が侵入しないようにしなければな
らないが５このためには、カラムが液切れしないように
、カラム内を常時監視して、カラム内を高圧にするため
のポンプを制御しなければならず、カラム内の監視のた
めの人手やセンサー、さらにはポンプの制御装置が必要
となり１Ｍ便な分離分析方法であるオープンカラムを用
いたクロマトグラフィーの特性を損なう。

（発明が解決しようとする問題点） 本発明は上記従来の問題点を解決するものであり、その
目的は、操作が簡便であり、しかもカラム内の充填剤中
に気体が侵入するおそれがなく。

従って、物質を再現性よく、高効率に分離し得るカラム
内の液組成変更方法を提供することにある。

本発明は、該カラム内の液組成変更方法に用いる好適な
カラム支持器を提供することにある。

（問題点を解決するための手段） 本発明の液組成変更方法は１分離すべき物質を充填剤に
吸着させる工程と、第１の溶液をカラム内に注入して、
充填剤に吸着された物質を該第１の溶液にて処理する工
程と、カラムを転倒状態として、カラム内の余剰の第１
溶液を除去する工程と、第２の溶液をカラム内に注入し
て、カラム内の液組成を第１溶液から第２溶液に変更し
、充填剤に吸着された物質を、該第２溶液にて処理する
工程とを包含し、そのことにより上記目的が達成される
。

この本発明方法の実施に使用される本発明のカラム支持
器は、カラムを垂直となった通常の状態に保持し得る固
定具と、該固定具に保持されたカラムを転倒状態とすべ
く、該固定具を１８０度にわたっての回動可能に支持す
る支持体とを具備してなり、そのことにより上記目的が
達成される。

（実施例） 以下に本発明を実施例について説明する。

本発明方法には２例えば第１図に示すオープンカラムが
使用される。該オープンカラム１ｏは、その底部に、下
方へ突出する溶出液の流出口１４が配設されている。該
カラム１０の内部底面にはフィルタ１１が装着されてお
り、該フィルタ１１上に吸着剤等の充・填剤１２が充填
されている。そして、該充填剤１２の上面にもフィルタ
１３が装着されており、該フィルタ１３の上方に空気層
１５が形成されている。

流出口１４にはチューブ１７の一端が装着されており。

該チューブエフの他端は、溶出液取出し容器内に位置し
ている。

カラム１０の上端部には、カラム１０内を気密に密閉す
る蓋体１６が装着される。

該蓋体１６には、溶液供給チューブ４１および排液チュ
ーブ４２が挿通して、カラム１０内の空気層１５に連通
している。溶液供給チューブ４１は、一方の端部がカラ
ム１０内の上側フィルタ１３上方に形成される空気層１
５内に位置しており、他方の端部は、第２図に示すよう
に、送液ポンプ４３を介して、溶液切換バルブ４４に接
続されている。溶液切換バルブ４４は３各容器４６．４
６．・・・内に入れられた各溶液および大気に、それぞ
れチューブ４５．４５．・・・を介して連通している。

送液ポンプ４３は、各容器４６内の所定溶液を、送液供
給チューブ４１を介して、カラム１０内に送給する。

排液チューブ４２は、一端面が２Ｍ体１６におけるカラ
ム１０内の端面と而−となっており、他端が。

開閉バルブ４７を介して廃液容器４８に連通している。

カラム１０は、第２図に示す本発明のカラム支持器２０
にて支持される。該カラム支持器２０は、カラム１０を
垂直状態に保持する一対の保持具２１および２１と、各
保持具２１を一面に取付けた固定板２２と。

該固定板２２を中央部に取付けた回転軸２３と、該回転
軸２３の各端部を回転可能に支持する支持体２４とを有
する。

回転軸２３は略水平となって、各端部が回転し得るよう
に、支持体２４に架設されており、該回転軸２３の中央
部には、矩形状の固定板２２が取付けられている。回転
軸２３は、固定板２２が垂直状態となった二位置にて停
止し得る。該固定板２２は矩形状をしており、垂直状態
となった場合における上下方向の中央線に沿って１回転
軸２３の中央部が固着されている。そして、該固定板２
２の中央部に、該固定板２２が垂直状態になった場合に
、前記カラム１゜を垂直状態に保持し得る一対の固定具
２１および２１が配設されている。従って、各固定具２
１は、固定板２２および回転軸２３を介して、支持体２
４に回転可能に支持されており、各固定具２１に取付け
られるカラム１０は１装着された蓋体１６が上側に位置
する通常の垂直状態、および該通常状態から１８０度回
動され、蓋体１６が下側に位置した転倒状態とされる。

このような構成の装置を用いたカラムクロマトグラフィ
ーは９次のように行われる。

第１図に示すように、カラム１０の内部底面にフィルタ
１１を装着して該フィルタ１１上に所定の吸着剤を充填
剤１２として充填し、その充填剤１２上面にフィルタ１
３を装着する。次いで、蓋体１６をカラム１０の端部に
気密に装着する。そして、蓋体１６が装着されたカラム
１０をカラム支持器２０における固定具２１に装着し、
該カラム１０を蓋体１６が上側となった垂直状態に保持
する。

このような状態で、溶液切換バルブ４４を切換えて２精
製すべき物質を、送液ポンプ４３にて、所定の容器４６
から溶液供給チューブ４１を介してカラム１０内に送給
する。この場合、排液チューブ４２に介装された開閉バ
ルブ４７は閉状態となっている。これにより５第３図（
イ）に示すように、精製すべき物質が充填剤１２に吸着
される。

なお、精製すべき物質は９Ｍ体１６をカラム１０に装着
する前に、充填剤１２に送液ポンプ４２を用いることな
く、あらかじめ吸着させておき、その後に。

蓋体１６をカラム１０の端部に気密に装着するようにし
てもよい。

次いで、溶液切換バルブ４４を切換え、送液ポンプ４３
と洗浄液が投入された所定容器４６を連通状態とし、送
液ポンプ４３にて洗浄液を、容器４６から溶液供給チュ
ーブ４１を介してカラム１０内に送給する。

これにより、カラム１０内の充填剤１２内は洗浄され。

不純物が除去される。そして、洗浄液をしばらく送給す
ると、第３図（ロ）に示すように、カラム１０内には余
剰の洗浄液がフィルタ１３上方に溜まり。

洗浄液層が形成される。

洗浄液による洗浄が終了すると、カラム１０を１８０度
転倒すべく、カラム支持器２０における固定板２２を、
１８０度回動させる。そして、排液チューブ４２に介装
された開閉バルブ４７を開状態にすると共に。

溶液切換バルブ４４を切換えて、大気に連通ずるチュー
ブ４５を、送液ポンプ４３に連通させ、空気をカラム１
０内に送給する。これにより、第３図（ハ）に示すよう
に、カラム１０内の空気層１５は高圧になり、カラム１
０内の洗浄液は、排液チューブ４２から廃液容器４８に
流出する。この場合、カラム１０における流出口１４は
上方に位置しているため、カラム１０内を高圧にしても
、該流出口１４からは液が流出するおそれがない。

次いで、必要に応じて前記洗浄液とは異なる溶液にてカ
ラム１０内を洗浄する。この洗浄は、まず。

カラム支持器２０における固定板２２を１８０度回動さ
せ、カラム１０を１元の略鉛直状態とする。そして。

排液チューブ４２に介装された開閉バルブ４７を閉状態
として、溶液切換バルブ４４を切換え２例えば。

溶離液をカラム１０内に送給して、カラム１０内を該溶
離液にて満たした後に、カラム１０を１８０度回動させ
て転倒状態とし、開閉バルブ４７を開状態として、カラ
ム１０内の溶離液を廃棄する。この洗浄は。

必要に応じて複数回繰り返してもよく、また、必要でな
ければ省略してもよい。

洗浄操作が終了すると、カラム１０は元の垂直状態とさ
れ、開閉バルブ４７を閉状態として、切換バルブ４４を
切換え、送液ポンプ４３にて溶離液が送給される。これ
により、カラム１０からは、精製された所望の物質が溶
出される。

このように９本発明方法によれば、カラム１０の充填剤
１２内に気体が侵入することなく、カラム１０内の液組
成を容易に変更し得るため、物質を再現・性よくかつ高
効率にて分離し得る。

なお２本発明方法は、カラムクロマトグラフィーにおい
て、カラム１０内を洗浄液から洗浄液へ液組成を変更す
る場合、あるいは洗浄液から溶離液へ液組成を変更する
場合に限らず、その他の液組成変更の場合にも通用し得
る。また、液組成を変更する必要がある場合には、どの
ような段階であっても、かつ何回でも行い得る。その結
果、溶離液の組成を連続的に変えるステップワイズグラ
ジェント法による分離も１本発明方法により容易に実現
される。

複数のカラムを用いて、これらを同時に処理する場合に
本発明方法を適用し、各カラムの洗浄時間を若干過剰に
すれば、各カラムの溶離液による溶出条件が均一化され
るために、各カラム間の再現性のばらつきを極力抑制し
得る。

カラム１０の端部に装着される蓋体１６は、カラム１０
内の気密性を保持し得るものであればよいが。

カラム１０内に位置する端面ば、カラム１０内の空気層
１５内に溜まる液体を、カラム１０の転倒時にカラム１
０内から容易に除去し得るように、第４図に示すように
、凹状に窪ませてもよい。そして、該蓋体１６を挿通す
る排液チューブ４２は、蓋体１６の該端面における最も
富んだ部分にて１面一となっていることが、カラム１０
を転倒させて液体を排出する上で好ましい。蓋体１６を
挿通する他方の溶液供給チューブ４１は、カラム１０内
の溶液による汚染を防止するために、端部がカラム１０
の空気層１５内に位置していることが好ましい。

また、前記カラム支持器２０における回転軸２３をモー
タにて回転させる構成とし、該モータ、溶液切換バルブ
４４．開閉バルブ４７等を、マイクロコンピュータ等を
用いて自動制御するようにしてもよい。

スＪｌｆＬＬ （ｉ）　　プラスミツドｐＢＲ３２２を含有する大腸菌
Ｈ８１０１株を５−のＬＢ培地にて１晩培養して生育さ
せた。

次いで、この培養物１．５−を５００Ｏｒ、ｐ、ｍ、の
回転数にて５分間遠心分離し、菌体を沈澱させた。これ
に、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）　−１０
−ｍＭエチレンジアミン四酢酸（２ＸＴＥと称する）２
５０μβを加えて懸濁させた。さらに５０ｍＭ　）リス
塩酸緩衝液に溶解した１０■／艷のりゾチームを１０−
加え。

０℃にて１０分間溶菌した。次いで、これに、　０．５
ＭのＥＤＴＡを２０μｌ加え、０℃にて１０分間溶菌し
、さらに２％トリトンＸ１００を１０μｌ加えて、０℃
にて４５分間溶菌した。

（ｉｉ　）　　他方、内部底面にフィルタが装着され。

該フィルタ上に８Ｍ尿素−０，２４Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，０）にて平衡化されて、吸着剤としてヒドロキシ
アパタイトを用いた充填剤が充填され、さらに該充填剤
の上面にフィルタが装着された内容積４ｄのミニカラム
に、上述の溶菌された水溶液をチャージし、菌体成分を
充填剤に吸着させた。

（ｉｉｉ　）　　菌体成分が充填剤に吸着されたミニカ
ラムの上端部に、前記実施例における蓋体１６を装着し
、該ミニカラムを第２図に示すカラム支持器２０の各保
持具２１および２１に固定した。また、固定されたミニ
カラム１０の溶出液流出口１４に紫外線吸収モニター（
ＵＶモニター）を装着し、　　２６０ｎｍの吸光度を測
定した。そして、送液ポンプ４３により、　８Ｍ尿素−
０，２４Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）でなる第１洗浄
液を、　２Ｑｍ１／ｈｒ間の割合で１時間送液し、ミニ
カラム内を洗浄した。この洗浄により、紫外線吸収モニ
ターによる２６０ｎｍの吸光度（００２６゜）は。

第５図（イ）に示すように、はぼ０になり、菌体由来の
蛋白質、　ＲＮＡ、　糖類等の不純物が洗い出された。

他方、ミニカラム内の空気層には、約２ｍｌの洗浄液が
溜まった。

（１ｖ）　　次いで、カラム支持器２０における固定板
２２を１８０度回動させて、ミニカラムを転倒状態とし
た。そして、開閉バルブ４７を開状態とし、溶液切換バ
ルブ４４を切換えて、ミニカラム内に空気を１００１ｎ
１．／ｈｒ−の割合で２分間通流した。これにより。

ミニカラム内の余剰の洗浄液が開閉バルブ４７を介して
除去された。

（Ｖ）　　さらに、ミニカラムを転倒状態に保持して、
溶液切換バルブ４４を切換え、１０ｍＭ）リス塩酸−１
ｒＭエチレンジアミン四酢酸（ｐＨ８，０）のＴＥ緩衝
液でなる第２洗浄液をミニカラム内に通流し、カラム内
を洗浄した。

（ｖｉ　）　　その後、カラム支持器２０における固定
板２２を１８０度回動させ、ミニカラムを元の状態にし
た。そして、開閉バルブ４７を閉状態として、第２洗浄
液（ＴＥ緩衝液）を２Ｑｍｌ／ｈｒの割合で１時間通流
し、第１洗浄液の尿素成分およびリン酸緩衝液成分を洗
浄した。洗浄後、ミニカラム内の空気層内には、１．５
−の洗浄液が溜まった。

（ｖｉｉ）　　次いで、カラム支持器２０における固定
板２２を１８０度回動させて、ミニカラムを転倒状態と
し、開閉バルブ４７を開状態とし、送液ポンプ４３にて
空気を、　　Ｌｏｏｍ／ｈｒの割合で２分間通流して。

ミニカラム内の余剰の洗浄液を、開閉バルブ４７を介し
て除去した。

（ｖｉｉｉ　）　　その後、ミニカラムを転倒状態に保
持して、溶液切換バルブ４４を切換え、　　０．３Ｍ　
ＩＪン酸ナナトリウム緩衝液なる溶離液を、送液ポンプ
４３にてミニカラム内に通流し、ミニカラムを１８０度
回動させて２元の通常状態とした。

（ｉｘ　）　　このような状態で、開閉バルブ４７を閉
状態として、送液ポンプ４３により上述の溶離液を。

ＩＱｍｌ／ｈｒの割合でミニカラム内に５分間送液した
。

その後、溶液切換バルブ４４を切換えて、ミニカラム内
に空気を送給し、ミニカラム内の液をすべて流出させた
。この？容離に際し、ミニカラムの溶出液流出口１４に
装着された紫外線吸収モニタ（ｔｌＶモニタ）により２
６０ｎｍの吸光度を測定したところ。

第５図（イ）に示すように、ミニカラムから溶出される
？容出液において、当初からの溶出量が０．２〜１．２
ｍｌの範囲の溶出液にて９５％以上のＤＮＡが回収され
ていることが判明した。この範囲内の溶出液約１ｍｌを
回収した。

（ｘ）回収されたｌ　ｍｌの溶出液を透析した後に。

エタノール沈澱を行ったところ、純粋なプラスミツドＤ
ＮＡ（ｐＢＲ３２２ＤＮＡ）が３μｇ回収することがで
きた。このＤＮＡは制限酵素旧ｎｆＩにより完全に切断
され、純度的にも充分満足できるものであった。

尖験炎ｌ 実験例１における（　ｖｉｌ′ｉ　）および（ｉｘ　）
工程の溶離液を、　　０．３Ｍのリン酸ナトリウム緩衝
液に替えて、　　０．３Ｍのトリエチルアミン炭酸緩衝
液を用い。

それ以外は実験例１と同様にして、１ｍｌの溶出液を回
収した。回収された溶出液は、透析を行わず。

該溶出液に３Ｍの酢酸ナトリウムを０．１−加えて。

エタノール沈澱を行った。その結果、プラスミツドＤＮ
Ａ（ｐＢＲ３２２ｒｌＮＡ）が４μｇ回収された。

実験例１の場合と異なり、透析を行わなかった結果、収
量は実験例１よりも増加した。得られたプラスミツドＤ
ＮＡは、制限酵素により充分に切断されており、純度的
にも満足できるものであった。

裏族斑主 実験例１における（　ｖｉｉ　）および（ｉｘ）工程の
溶離液を、　　０．３Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液に替
えて、　　０．３Ｍのトリエチルアミン炭酸緩衝液を用
いた。それ以外は実験例１と同様にして、１ｍｌの溶出
液を回収した。回収された溶出液は、透析を行わずに、
真空凍結乾燥を行って、直接、プラスミツドＤＮＡを回
収したところ、プラスミツドＤＮＡが４μｇ得られた。

実験例１の場合と比較して、透析を行わなかった結果、
収量が増加した。得られたプラスミツドＤＮＡは制限酵
素により充分に切断されており、純度的にも満足できる
ものであった。

止較■土 実験例１における（ｉｖ）および（ｖｉ）工程の。

ミニカラムを転倒させて、洗浄液を除去することなく、
第２洗浄液および溶離液を通流した。該溶離液の通流量
がｌ　ｍｌであること以外は、実験例１と同様にしてＤ
ＮＡの回収を図ったが、　　ＤＮＡは全く得られなかっ
た。これは、ミニカラム内の空気層に溜まった約２−の
第２洗浄液にて溶離液が希釈されたため、該溶離液の溶
離能力が消失したためと考えられる。

此ｌｕ汁ｌ 実験例１における（ｉｖ）および（ｖｆｉ）工程の。

ミニカラムを転倒させて、洗浄液を除去することな（、
第２洗浄液および溶離液を通流した。該溶離液の通流量
が１０−であること以外は、実験例１と同様にして溶離
液を回収した。この場合のミニカラムの溶出液流出口に
装着された紫外線吸収モニタによる２６０ｎｍの吸光度
を第５図（ロ）に示す。

この図より明らかなように、当初からの溶出液量が２ｍ
ｌ〜６　ｍｌの範囲の溶出液にＤＮＡが含まれており、
この範囲の溶出液４　ｍｌを回収した。この場合。

溶出曲線は、第５図（ロ）に示すように、ブロードであ
り、第２洗浄液により溶離液がかなり希釈され、好まし
くない溶離挙動を示した。

回収された４　ｍｌの溶出液を透析後、エタノール沈澱
を行って、プラスミツドＤＮＡ（ｐＢＲ３２２ＤＮＡ）
を回収した。回収されたプラスミツドＤＮＡＩは１Ｍｇ
であった。得られたプラスミツドＤＮＡは、制限酵素旧
ｎｆｌにより、完全には分解されず３部分分解されてい
るだけであって、充分には精製されていなかった。

此ｌ■鉗１ 溶離液として０．３Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液に替え
て、　　０．３Ｍのトリエチルアミン炭Ｍ４Ｎ衝液を用
い、比較例２と同様にして、溶出液を回収した。溶出液
は、比較例２と同様、当初からの溶出量が２−〜６−の
範囲の溶出液にＤＮＡが含まれており、この範囲の４　
ｍｌの溶出液を回収した。この溶出液に、透析を行うこ
となく、３Ｍの酢酸ナトリウムを０　、４　ｍｌ加えて
エタノール沈澱を行い、プラスミツドＤＮＡを回収した
。回収量は１．５μｇであった。

ＤＮＡ回収量は比較例２よりも若干増加したが。

エタノール沈澱に際して、多量の沈澱が生じ、尿素等の
不純物が充分に除去されていないことが判明した。得ら
れたＤＮＡを透析により再び精製したが、透析後のＤＮ
Ａは、制限酵素により充分には切断されておらず、精製
が不充分であった。

（発明の効果） 本発明方法は、このようにカラム内の液組成の変更が確
実にかつ容易に行え、しかもカラム内の充填剤内に空気
等の気体が侵入するおそれがない。

その結果、物質を再現性よく、シかも高効率に分離し得
る。

本発明のカラム支持体は、カラムの転倒を容易に行なえ
るため２本発明方法を容易に実施し得る。

４、　ズ　　の　　゛なｉ′■ 第１図は１本発明方法に使用されるカラムの縦断面図、
第２図は本発明方法の実施状態を示す概略図、第３図（
イ）〜（ハ）は、それぞれ本発明方法の説明図１第４図
はカラムにおける蓋体の別の例を示す縦断面図、第５図
（イ）は本発明方法の紫外線吸光度を示すグラフ、第５
図（ロ）は比較例における紫外線吸光度を示すグラフで
ある。

１０・・・カラム、　１１．１３・・・フィルタ、１２
・・・充填剤。

１５・・・空気層、１６・・・蓋体、２０・・・カラム
支持器、２１・・・固定具、２２・・・固定板、２３・
・・回動軸、２４・・・支持体。

４１・・・溶液供給チューブ、４２・・・排液チューブ
、４３・・・送液ポンプ。

以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、分離すべき物質を充填剤に吸着させる工程と、 第１の溶液をカラム内に注入して、充填剤に吸着された
   物質を該第１の溶液にて処理する工程と、カラムを転倒
   状態として、カラム内の余剰の第１溶液を除去する工程
   と、 第２の溶液をカラム内に注入して、カラム内の液組成を
   第１溶液から第２溶液に変更し、充填剤に吸着された物
   質を、該第２溶液にて処理する工程と、 を包含するカラム内の液組成変更方法。 ２、カラムを垂直となった通常の状態に保持し得る固定
   具と、 該固定具に保持されたカラムを転倒状態とすべく、該固
   定具を１８０度にわたっての回動可能に支持する支持体
   と、 を具備するカラム支持器。