CN112125950A - 一种蛋白质分离纯化的规模化生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种蛋白质分离纯化的规模化生产方法,属于蛋白质生物工程技术领域。本发明解决现有硫酸铵沉淀方法分离纯化蛋白质无法实现产业化的问题。本发明采用中空纤维柱式超滤装置循环替代硫酸铵沉淀后的离心和沉淀复溶的操作步骤,使硫酸铵沉淀在生产中更容易被放大且提高其纯化效率,去除更多杂质蛋白,在满足高纯度蛋白质制备的同时,达到大量蛋白质的分离纯化目的。解决了在大规模化分离纯化蛋白质时存在的除硫酸铵沉淀法外其他粗纯方法很难将含有多种蛋白质的样品进行有效分离,对后续离子交换层析造成负担,进而导致后续纯化效率低或难以进行的问题,以及现有硫酸铵沉淀在大规模化生产中存在的较大成本投入以及后续维护成本高的问题。
Description
技术领域
本发明涉及一种蛋白质分离纯化的规模化生产方法,属于蛋白质生物工程技术领域。
背景技术
因圆环VLP病毒疫苗规程中对目的蛋白纯度要求较高,在进行工艺放大时,只有用离子交换层析的方法才能达到规程要求。现有技术离子交换层析中,基质是由配基和基架构成的,配基带有正电荷或负电荷,由于蛋白质也有等电点,当蛋白质处于不同的pH条件下,其带电状况也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质,被留在柱子上,然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施,将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来,结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来,获得纯化的蛋白质。但是基质吸附蛋白的量是有限的,当样品中的杂质蛋白较多,越难保证更多的目的蛋白被吸附,降低了纯化效率。
硫酸铵沉淀和其它去除杂质的方法相较,有更好的纯化效果,可以去除更多杂质蛋白,从而降低在下一步层析过程中杂质蛋白对目的蛋白纯化的干扰,当样品纯度相对较高,杂质较少时还可以增加层析基质的使用次数,延长使用寿命,进一步节约成本,提高效率。且硫酸铵沉淀可以把蛋白从混杂有蛋白酶和其他有害杂质的培养基及细胞裂解物中解脱出来,且成本低廉。因此,硫酸铵沉淀是大规模制备纯度要求较高的蛋白质粗提取步骤的首选。但是在实验室阶段,硫酸铵沉淀去除上清的方式通常是离心,因离心机承载样品能力有限,因此在大规模生产中需多台离心机同时运行,增加企业运行成本且后续机器维护成本较高,因此限制了硫酸铵沉淀在大规模生产中的应用。
发明内容
本发明为了解决现有硫酸铵沉淀法应用在规模化分离纯化蛋白质时不易被放大的问题,提供一种蛋白质分离纯化的规模化生产方法。发明是在前一发明“一种猪圆环病毒2b、2d型二价病毒样颗粒疫苗及其制备方法和应用”(专利申请号为202010780803.9)基础上的重要工艺改进。
本发明的技术方案:
蛋白质分离纯化的规模化生产方法,该方法的操作步骤如下:
步骤一,将病毒液离心后加入缓冲液,进行缓冲液置换;
步骤二,在步骤一进行缓冲液置换后的病毒液中加入饱和的硫酸铵溶液后,通过超滤装置对混合液进行浓缩,并使用缓冲液进行超滤,得到粗提蛋白质溶液;
步骤三,然后依次采用阴离子交换层析和疏水层析的方法对步骤二获得的粗提蛋白质溶液进行纯化处理,获得纯化后的蛋白质。
进一步限定,步骤一和步骤二的缓冲液中包含:PB缓冲液,PH值为6.5-7.0。
进一步限定,步骤二中超滤装置为中空纤维柱式超滤装置。
更进一步限定,中空纤维柱式超滤装置中超滤膜的孔径为0.45-0.65μm。
进一步限定,步骤二通过超滤装置对硫酸铵溶液和病毒液的混合液进行浓缩的具体操作过程为:将饱和的硫酸铵溶液和病毒液混合后共同置于中空纤维柱式超滤装置中,封闭透出端,使混合液充分混匀15-30min,打开透出端,调整流速为15-30L/M2/h,经中空纤维柱膜过滤浓缩至混合液体积为一定量后,关闭透出端。
更进一步限定,混合液经中空纤维柱式超滤装置过滤浓缩至混合液加入时体积的1/2后,关闭透出端。
进一步限定,步骤二中超滤的具体操作过程为:通过中空纤维柱式超滤装置对混合液完成浓缩,向中空纤维柱式超滤装置中加入缓冲液,关闭透出端,柱内循环15-30min,将中空纤维柱膜上的沉淀复溶,然后打开透出端,使用缓冲液对复溶液进行超滤,在收集透出端获得粗提蛋白质溶液。
更进一步限定,超滤过程中进口端压力小于5psi,透出端流速为15-30L/M2/h。
本发明具有以下有益效果:本申请采用中空纤维柱式超滤装置循环替代硫酸铵沉淀后的离心和沉淀复溶的操作步骤,使硫酸铵沉淀在生产中更容易被放大且提高其纯化效率,去除更多杂质蛋白满足高纯度蛋白质制备规程的同时,达到大量蛋白质的分离纯化目的。解决了在大规模化分离纯化蛋白质时存在的除硫酸铵沉淀法外其他粗纯方法很难将含有多种蛋白质的样品进行有效分离,对后续离子交换层析造成负担,进而导致后续纯化效率低或难以进行的问题,以及现有硫酸铵沉淀在大规模化生产中存在的投入成本以及后续维护成本高的问题。
附图说明
图1为实施例1制得的目的样品的蛋白电泳图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明均为常规方法。所用材料、试剂、方法和仪器,未经特殊说明,均为本领域常规材料、试剂、方法和仪器,本领域技术人员均可通过商业渠道获得。
具体实施方式1:
(1)菌液破碎
将大肠杆菌发酵液用低温均质机进行破碎,破碎压力500-1000bar反复破碎两次;
(2)硫酸铵沉淀、复溶与洗滤
将破碎后的大肠杆菌发酵液和饱和的硫酸铵溶液混合后共同置于0.65μm中空纤维柱式超滤装置中,封闭透出端,使混合液充分混匀15-30min,打开透出端,调整流速为15-30L/M2/h,经中空纤维柱膜过滤浓缩至混合液体积为1/2后,封闭透出端。加入缓冲液PB(pH为6.5-7.0)将沉淀复溶至原体积的2-6倍,打开透出端,调整流速为15-30L/M2/h,经中空纤维柱膜过滤浓缩至机器的最小运行体积,收集透出端液体。
用中空纤维柱式超滤装置对病毒液进行硫酸铵沉淀和澄清过滤时,进口端压力一直处于合理范围内,无变化,最终得到粗纯样品。
(3)离子交换层析
平衡柱子:用PB(PH=6.5-7.0)至少洗2倍柱体积;
上样:用AKTA PILOT蛋白纯化系统,上样流速100ml/分,连续加2倍体积PB缓冲液(PH=6.5-7.0)至吸光值和电导平稳;
洗脱:先用缓冲液PB(0.3-1M,PH=6.5-7.0)进行洗脱,收集目的波峰,当吸光值下降很低时,停止收集。
清洗与再生:用0.5-1M氢氧化钠冲洗2-4倍柱体积后,用2M NaCl 2-4倍柱体积,最后用去离子水冲洗到电导为0左右停机,最终收获目的样品。
收获的目的样品采用蛋白电泳对收获的目的样品进行检测,电泳图如图1所示。
利用中空纤维柱膜过滤系统对离子交换层析的重组蛋白溶液进行粗滤提纯后;选用含有一定盐浓度的缓冲液,平衡琼脂糖6FF凝胶过滤层析柱,载入初步提纯的蛋白溶液。收集在OD 280nm监测下第一个可吸收峰洗脱的样品,即精细纯化的目的蛋白。
Claims (8)
1.一种蛋白质分离纯化的规模化生产方法,其特征在于,该方法的操作步骤如下:
步骤一,将病毒液离心后加入缓冲液,进行缓冲液置换;
步骤二,在步骤一进行缓冲液置换后的病毒液中加入饱和的硫酸铵溶液,通过超滤装置对混合液进行浓缩,并使用缓冲液进行超滤,得到粗提蛋白质溶液;
步骤三,然后依次采用阴离子交换层析和疏水层析的方法对步骤二获得的粗提蛋白质溶液进行纯化处理,获得纯化后的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的一种蛋白质分离纯化的规模化生产方法,其特征在于,所述的步骤一的缓冲液和步骤二中包含:PB缓冲液,PH为6.5-7.0。
3.根据权利要求1所述的一种蛋白质分离纯化的规模化生产方法,其特征在于,所述的步骤二中超滤装置为中空纤维柱式超滤装置。
4.根据权利要求3所述的一种蛋白质分离纯化的规模化生产方法,其特征在于,所述的中空纤维柱式超滤装置中超滤膜的孔径为0.45-0.65μm。
5.根据权利要求3所述的一种蛋白质分离纯化的规模化生产方法,其特征在于,所述的步骤二通过超滤装置对硫酸铵溶液和病毒液的混合液进行浓缩的具体操作过程为:将饱和的硫酸铵溶液和病毒液混合后共同置于中空纤维柱式超滤装置中,封闭透出端,使混合液充分混匀15-30min,打开透出端,调整流速为15-30L/M2/h,经中空纤维柱膜过滤浓缩至混合液体积为一定量后,关闭透出端。
6.根据权利要求5所述的一种蛋白质分离纯化的规模化生产方法,其特征在于,所述的混合液经中空纤维柱式超滤装置过滤浓缩至混合液加入时体积的1/2后,关闭透出端。
7.根据权利要求3所述的一种蛋白质分离纯化的规模化生产方法,其特征在于,所述的步骤二中超滤的具体操作过程为:通过中空纤维柱式超滤装置对混合液完成浓缩,向中空纤维柱式超滤装置中加入缓冲液,关闭透出端,柱内循环15-30min,将中空纤维柱膜上的沉淀复溶,然后打开透出端,使用缓冲液对复溶液进行超滤,在收集透出端获得粗提蛋白质溶液。
8.根据权利要求7所述的一种蛋白质分离纯化的规模化生产方法,其特征在于,所述的超滤过程中进口端压力小于5psi,透出端流速为15-30L/M2/h。
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