CN117625562A - 一种提高疫苗纯度的方法、通过该方法得到的疫苗及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提高疫苗纯度的方法、通过该方法得到的疫苗及其应用，提高疫苗纯度的方法，将病毒液与层析色谱填料接触；填料含有N‑苄基‑N‑甲基‑乙醇胺配基，层析条件为10‑20cm的柱高，上样量2‑10倍柱体积，平衡缓冲液pH为7.0‑8.5，电导率为10‑50mS/cm；将该方法应用于疫苗生产中，将杂质与目标蛋白分离，降低宿主细胞蛋白质浓度，实现疫苗的高纯度要求。

Description

一种提高疫苗纯度的方法、通过该方法得到的疫苗及其应用

技术领域

本发明涉及一种提高疫苗纯度的方法、通过该方法得到的疫苗及其应用，属于疫苗技术领域。

背景技术

疫苗的纯化工艺从早期的直接收获病毒培养液澄清后灭活作为疫苗原液，到病毒培养液超滤浓缩后灭活作为疫苗原液，再发展到现在的病毒培养液经超滤浓缩、病毒灭活、DNA去除和分子筛柱层析纯化收集病毒峰作为疫苗原液。疫苗的效价和纯度已得到很大的提高，暴露后抗体产生及时且产生水平高，严重不良反应率大幅降低。

对于病毒颗粒较大，易被破坏，对环境条件的耐受范围比较窄的缺陷问题，目前世界上纯化病毒疫苗主要有密度梯度离心和分子筛柱层析这两种方法。用分子筛柱层析纯化疫苗的原理是利用病毒颗粒与杂质分子量大小的差异进行分离，这种方法条件温和、操作简单，可控性强、重复性好，能够最大程度的保持病毒的完整性，但是也存在一定的局限性：由于部分杂质分子量与病毒颗粒比较接近，尤其是宿主蛋白和宿主DNA，用分子筛的方式分离效果不佳，疫苗纯度难以进一步提高。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的第一个目的在于提供一种提高疫苗纯度的方法，将杂质与目标蛋白分离，降低宿主细胞蛋白质浓度，实现疫苗的高纯度要求。

本发明的第二个目的在于提供一种疫苗，通过上述方法得到。

本发明的第二个目的在于提供一种上述提高疫苗纯度的方法的应用。

实现本发明的第一个目的可以通过采取如下技术方案达到：一种提高疫苗纯度的方法，将病毒液过分子筛柱层析色谱，然后过层析色谱填料；填料含有N-苄基-N-甲基-乙醇胺配基，层析条件为10-20cm的柱高，上样量2-10倍柱体积，平衡缓冲液pH为7.0-8.5，电导率为10-50mS/cm。

进一步地，病毒液为将病毒接种于生物反应器培养的Vero细胞中，经培养、收获、浓缩、灭活后得到。

进一步地，过层析色谱填料的流速为150cm/h。

进一步地，过层析色谱填料上样量为4-8倍柱体积。

进一步地，pH为7.4-8.1。

进一步地，电导率为15-25mS/cm。

进一步地，病毒为狂犬病病毒。

进一步地，过层析色谱填料以流穿模式进行，把宿主细胞蛋白质与填料的配基结合，病毒流穿出来。

实现本发明的第二个目的可以通过采取如下技术方案达到：一种疫苗，通过如上所述的方法得到。

实现本发明的第三个目的可以通过采取如下技术方案达到：一种提高疫苗纯度的方法的应用，将如上所述的方法应用于疫苗生产中。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：

1、本发明提高疫苗纯度的方法纯化后收率高、杂质残留量低，能显著降低注射疫苗带来的过敏反应；

2、本发明提高疫苗纯度的方法可应用于疫苗生产中，将杂质与目标蛋白分离，降低宿主细胞蛋白质浓度，实现疫苗的高纯度要求。

附图说明

图1为实验组抗原收率DOE的响应曲面分析

图2为实验组HCP DOE的响应曲面分析图；

图3-5分别为对照组1-3的分子筛纯化图谱；

图6-8为分别为实验组1-3的层析色谱纯化图谱。

具体实施方式

下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述：

一种提高狂犬病病毒疫苗纯度的方法，

获得病毒液：将病毒接种于生物反应器培养的Vero细胞中，经培养、收获、浓缩、灭活后得到病毒液；

层析反应：将病毒液过分子筛柱层析色谱，然后过层析色谱填料；填料含有N-苄基-N-甲基-乙醇胺配基，层析条件为10-20cm的柱高，流速为150cm/h，上样量4-8倍柱体积，这一载量设置既能满足高浓缩倍数病毒液纯化过程中不易出现过载现象，又能最大限度地发挥填料的吸附能力，从而提高整体处理效率；平衡缓冲液pH为7.4-8.1，该pH值范围内，需要去除的宿主蛋白带负电荷，很容易和带正电荷的阴离子配基结合，而在该pH范围内带正电荷的目标蛋白则不会与填料结合，直接从层析柱流穿；电导率为15-25mS/cm，电导率内，可以有效减少填料对目标蛋白的非特异性吸附，同时不影响吸附宿主细胞蛋白的能力。层析以流穿模式进行，把宿主细胞蛋白质与填料的配基结合，病毒流穿出来。配基含有季铵基和疏水基团，可以实现阴离子交换、氢键结合和疏水作用。该配基与宿主细胞蛋白结合紧密，与狂犬病病毒不结合或弱结合，可以有效降低原液中的宿主细胞蛋白质浓度，杂质的残留率大幅下降提高了原液的纯度。

分子筛柱层析色谱是一种利用病毒颗粒与杂质分子量大小的差异进行分离的常见蛋白质分离纯化技术。在该方法中，小分子杂质通过扩散的作用进入填料孔道内部，通过速度较慢，而病毒大颗粒则被排阻在填料孔道外部，通过填料颗粒间隙流穿，最先流出柱床，其它杂质在后面流出柱床。通过改变分子筛的孔径大小和柱长，可以有效地将不同大小的蛋白质分离出来。

填料的纯化模式为缓冲液平衡、样品上样、缓冲冲洗、高盐溶液重生、清洁消毒溶液重生清洗；填料的清洁消毒溶液为高浓度氯化钠溶液、异丙醇溶液、乙酸溶液、水、高浓度氢氧化钠溶液中的一种或几种依次清洗。

实施例1：

原液的制备过程：

病毒液的制备过程：用狂犬病毒固定株接种Vero细胞，培养后收获病毒；取狂犬病病毒收获液，用0.65um的滤器澄清过滤后进行超滤浓缩，然后用β-丙内酯按终浓度1:4000进行灭活24小时，37度水解2小时制成。

把上述病毒液分为对照组与实验组，对照组为病毒液使用分子筛柱层析色谱纯化得到的原液；实验组为两步层析制备原液，第一步为病毒液过分子筛柱层析色谱，第二步为过层析色谱填料。

对照组：

病毒液进行分子筛柱层析色谱纯化，平衡后上样洗脱，收集柱层析色谱第一峰，当UV 280nm光吸收值超过0.10AU开始收集，下降至0.10AU时停止收集。

实验组：

对照组处理后的原液，再层析色谱填料，平衡溶液后收集柱层析色谱穿透峰，当UV280nm光吸收值超过0.10AU开始收集，下降至0.10AU时停止收集。

对实验组1做DOE的响应曲面分析，对抗原收率，如图1和表1所示，pH和电导的p值均小于0.05，影响都非常显著，且pH越高、电导越高，收率越大。如图2所示为HCP残留量，如表2所示，pH的影响更显著，而且呈中间高外周低的分布。

表1抗原收率影响因素的显著性分析

表2HCP影响因素的显著性分析

实验组1-3：

表3实验组1-3的层析参数

表4对照组和实验组的检测结果

表4为3组对照组和3组实验组的检测结果对比，图3-5分别为对照组1-3的纯化图谱，图6-8分别为实验组1-3的纯化图谱。以上结果均表明实验组相比对照组能有效降低原液中的宿主细胞蛋白质浓度，提高了原液的纯度。

对于本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及变形，而所有的这些改变以及变形都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种提高疫苗纯度的方法，其特征在于，将病毒液过分子筛柱层析色谱，然后过层析色谱填料；所述填料含有N-苄基-N-甲基-乙醇胺配基，层析条件为10-20cm的柱高，上样量2-10倍柱体积，平衡缓冲液pH为7.0-8.5，电导率为10-50mS/cm。

2.如权利要求1所述的提高疫苗纯度的方法，其特征在于，所述病毒液为将病毒接种于生物反应器培养的Vero细胞中，经培养、收获、浓缩、灭活后得到。

3.如权利要求1所述的提高疫苗纯度的方法，其特征在于，所述过层析色谱填料的流速为150cm/h。

4.如权利要求1所述的提高疫苗纯度的方法，其特征在于，所述过层析色谱填料上样量为4-8倍柱体积。

5.如权利要求1所述的提高疫苗纯度的方法，其特征在于，所述pH为7.4-8.1。

6.如权利要求1所述的提高疫苗纯度的方法，其特征在于，所述电导率为15-25mS/cm。

7.如权利要求1所述的提高疫苗纯度的方法，其特征在于，所述病毒为狂犬病病毒。

8.如权利要求1所述的提高疫苗纯度的方法，其特征在于，所述过层析色谱填料以流穿模式进行，把宿主细胞蛋白质与填料的配基结合，病毒流穿出来。

9.一种疫苗，其特征在于，通过如权利要求1所述的方法得到。

10.一种提高疫苗纯度的方法的应用，其特征在于，将如权利要求1所述的方法应用于疫苗生产中。