CN110241093A

CN110241093A - 一种重组痘病毒的纯化方法

Info

Publication number: CN110241093A
Application number: CN201910519261.7A
Authority: CN
Inventors: 王巍
Original assignee: Shenzhen Yuanxing Gene Technology Co Ltd
Current assignee: Shenzhen Yuanxing Gene Technology Co Ltd
Priority date: 2019-06-17
Filing date: 2019-06-17
Publication date: 2019-09-17

Abstract

本发明公开了一种重组痘病毒的纯化方法，所述纯化方法包括如下步骤：步骤一、病毒培养；步骤二、病毒收获；步骤三、过滤；步骤四、切向流超滤或微滤浓缩；步骤五、酶切；步骤六、复合层析。本发明的痘病毒纯化方法操作简便，易于放大，提高了病毒回收效率，可大规模处理收获的病毒液，能满足溶瘤痘病毒的生产需求，具备良好的重复性和稳定性；经该方法纯化后的痘病毒在内毒素、宿主细胞蛋白残留、宿主DNA残留、纯度和滴度上均能达到肿瘤溶瘤治疗的临床要求。本发明的痘病毒纯化方法在保证了痘病毒活性的基础上，提高了痘病毒的回收率。

Description

一种重组痘病毒的纯化方法

技术领域

本发明涉及一种重组痘病毒的纯化方法，具体涉及一种采用capto core系列复合层析纯化制备符合临床级要求的重组痘病毒的方法。

背景技术

现已公开的痘病毒专利技术主要采用离子交换层析和/或分子筛层析技术，由于痘病毒包装时会利用细胞的膜蛋白形成自己的包膜，且痘病毒粒径较大，因此在采用常规的离子交换层析时很难在保证病毒回收率的前提下使得宿主蛋白残留降到符合质量标准要求，而较大的病毒粒径也使得常规的分子筛层析步骤会给痘病毒的纯化带来较大的额外损失。

肿瘤的病毒载体类基因治疗是近年来肿瘤治疗的研究热点，痘病毒因自身具有的诸多特性成为一种理想的治疗载体。目前，应用痘病毒治疗肿瘤的各项临床试验正在开展，基于Wyeth株的JX-549在I/II期临床试验中，已确定对各种实体瘤具有肿瘤选择性杀伤作用。溶瘤痘病毒的临床研究开发和制备，需要生产工艺、质量控制等相关药学研究的支持，制备出符合临床使用要求的溶瘤病毒，对开展后续的肿瘤基因治疗具有极其重要的意义。

用于基因治疗的病毒颗粒的上游工艺主要集中在病毒扩增和收获，而下游工艺集中在病毒纯化。值得注意的是，基因治疗病毒产品的下游纯化占整个生产工艺研究的绝大部分，并且常称为病毒生产工艺研发的瓶颈。

因为每种病毒具有不同的生物、化学和物理特性，所以病毒的纯化必须进行相应的调整。需要通过优化纯化工艺以保护并最大的恢复病毒感染性(与产品功效和典型的释放效率密切相关)。在确定纯化方法时应考虑病毒粒径和稳定性，pH值和相对颗粒稳定性等特征。

用于基因治疗的重组痘病毒在纯度和滴度方面要求较高，在小量制备痘病毒的方法中常采用高速离心等方式进行纯化，但这些方法处理量小，对病毒的滴度影响较大，且回收率低，难以满足临床试验的需求。

在痘病毒的整个生命周期中，根据其感染细胞的不同阶段，可以产生出4种不同的感染形式：胞内成熟病毒颗粒(IMV)、细胞内包膜病毒颗粒(IEV)、细胞结合包膜病毒颗粒(CEV)以及细胞外包膜病毒颗粒(EEV)，在这4种感染形式中，IMV和EEV是痘病毒在装配中最常见的形态。由于溶瘤痘病毒收获液中通常为这4种形态痘病毒的混合液，而其中三类形态的痘病毒的外膜会融合细胞质膜等宿主细胞膜类蛋白，因此常规的离子交换层析方法较难将痘病毒和HCP杂质分离，导致终产品原液或制剂中HCP蛋白含量超出质量标准和临床安全使用范围。在采用申请号200980113708.5的方法在进行痘病毒纯化时发现，采用常规的离子交换和凝胶过滤色谱方法进行纯化时，经离子交换层析处理后的样品HCP含量仍然较高，而当通过调整优化条件降低HCP含量时，纯化回收率会明显下降，这些处理后的样品经凝胶过滤色谱纯化时往往很难达到有效的病毒回收效果。同样的，在采用基于离子交换层析原理的膜层析纯化(申请号20108031647.0)中同样存在类似问题。

发明内容

为解决规模化制备收获的痘病毒培养液的纯化问题，本发明提供了一种重组痘病毒的纯化方法。该方法采用复合层析的方法对痘病毒收获液进行纯化，最终获得痘病毒原液。本发明的痘病毒纯化方法在保证了痘病毒活性的基础上，提高了痘病毒的回收率。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种重组痘病毒的纯化方法，包括如下步骤：

步骤一、病毒培养：

扩增培养溶瘤痘病毒，获得痘病毒培养物，其中：培养基为无血清或有血清培养基，培养方式为悬浮培养或贴壁培养，培养规模为培养瓶、细胞工厂或生物反应器；

步骤二、病毒收获：

4℃、2000～6000g离心分离20～60min，分离痘病毒培养物上清和沉淀，收集痘病毒培养物沉淀，用痘病毒保存液重悬后裂解处理细胞释放胞内病毒，裂解后用病毒保存液稀释2～8倍，4℃、2000～5000g离心10～30min，收获上清，其中：裂解方式为低渗裂解、反复冻融、超声破碎以及高压破碎等中的一种；

步骤三、过滤

将步骤二收取的上清病毒液经3～10μm过滤器过滤，过滤前采用痘病毒保存液润洗过滤器，设置流速，收集滤过液，其中：流速设置为100～1000ml/min；过滤器为平板过滤和囊式过滤中的一种；过滤方式采用切向流过滤和垂直过滤中的一种；

步骤四、切向流超滤或微滤浓缩

用痘病毒保存液润洗平衡超滤浓缩使用的中空纤维柱，设置流速，将步骤三收集的滤液经0.2μm以下孔径的中空纤维素柱进行切向流超滤或微滤浓缩，其中：超滤时滤膜孔径为300KDa～0.1μm；微滤时滤膜孔径为0.1～0.2μm；流速设置为100～1000ml/min；

步骤五、酶切

在步骤四浓缩后的样品中加入MgCl₂，使其终浓度为1～10mMMg²⁺，向上述样品中加入Benzonase核酸酶，使其终浓度为50～250U/ml，充分混匀进行酶切反应，酶切反应结束后，在酶切后的样品中加入NaCl，使其终浓度为0.3～1M，终止酶切反应；其中：酶切温度为37±1℃，酶切时间为20～90min；

步骤六、复合层析

(1)上样泵清洗及平衡：用1M NaOH冲洗上样泵并浸泡30～60min，再用注射用水清洗上样泵，检测pH为7.0后，用痘病毒保存液润洗平衡上样泵；

(2)柱清洗及平衡：以1.5～3倍CV的1M NaOH清洗层析柱并浸泡30～60min，再以1.5～3倍CV的1～4M NaCl清洗，最后用2～4倍CV的痘病毒保存液平衡色谱柱，至电导稳定；

(3)上样：设置流速为90～150cm/h，用经超滤浓缩后的样品上样，其中：上样样品体积为柱床体积的40％以内；

(4)洗脱及收样：设置流速为90～150cm/h，以痘病毒保存液洗脱色谱柱，观察UV260/UV280紫外吸收值，紫外吸收值第一次上升后，即可收集。

上述方法中，为提高工艺杂质的去除效果，步骤五、酶切结束后可按照步骤三、步骤四、步骤五的方法对上清进行过滤、切向流超滤或微滤浓缩、酶切中的一种或几种纯化处理后再进行复合层析处理。

本发明具有如下优点：

1、痘病毒制备工艺相关杂质主要包括宿主细胞蛋白残留(HCP)、宿主细胞DNA残留(HCD)，以及工艺中为去除核酸残留所加入的核酸酶，在本发明所述的痘病毒的纯化工艺中，其中HCP可经由离心、多步过滤和切向流浓缩洗滤去除部分外，再经复合层析法去除；HCD除前述方法去除外主要经由核酸酶酶切和复合层析法去除；而核酸酶主要经由复合层析法去除。

2、本发明复合层析法使用的层析系统为AKTA Pure，采用的层析纯化介质为GE公司生产的Capto Core系列，优选Capto Core 700或Capto Core400，更优选Capto Core700，这是一种专门设计用于病毒和其他大生物分子的中度纯化和精细纯化介质，该介质基质由激活的配基核心和惰性壳层组成，惰性壳层可排阻大分子，阻止其经壳层上的孔进入核心。这些大分子在流穿中被收集，同时杂质经壳层上的孔进入核心被吸附。由于痘病毒粒径很大，约为300～450nm×170～260nm，因此在本发明的方法中痘病毒不会进入介质核心，而较小的杂质经壳层孔洞进入核心后被吸附，从而达到分离纯化的目的。与现有专利相比，本发明的方法具有处理通量大、纯化时间短、纯化回收率更高等特点。

3、纯化是痘病毒规模化制备工艺中关键的下游工艺，不恰当的纯化方法常常会成为提高病毒产量和质量的瓶颈。研究经验以及文献资料表明，过多的处理步骤会加大病毒的损失，从而影响病毒整体的回收率，本发明中使用的复合层析方法能在同一步骤中实现离子交换和凝胶过滤的处理，减少了纯化步骤，大大的提高了纯化回收率。在工艺放大过程中，这种纯化回收率的提高对整个工艺成本的控制具有积极意义。

4、本发明的痘病毒纯化方法操作简便，易于放大，提高了病毒回收效率，可大规模处理收获的病毒液，能满足溶瘤痘病毒的生产需求，具备良好的重复性和稳定性；经该方法纯化后的痘病毒在内毒素、宿主细胞蛋白残留、宿主DNA残留、纯度和滴度上均能达到肿瘤溶瘤治疗的临床要求。

5、相较于传统的层析技术，本发明采用复合层析纯化痘病毒，与传统柱层析相比，复合层析技术具有以下诸多优点：流速高，比传统的离子交换和/分子筛层析提高10～30倍；传质扩散效应低；载量高；非特异性吸附低；缓冲液消耗更少，易于放大；在同等条件下通量更高，工艺时间更短；在工艺放大过程中更加灵活。

6、本发明的复合层析技术能够同时进行分子排阻和结合层析，较宽的pH和盐离子浓度耐受范围使得样品纯化前预处理要求相对宽松，同时由于样品上样体积依据为12mg蛋白每毫升介质，因此最大上样量是常规离子交换层析的3～4倍左右，在中试级别的痘病毒纯化规模中能大大的节省纯化时间，提高纯化效率，极大的降低工艺放大过程中对空间的需求。

附图说明

图1为不同介质和纯化方法的痘病毒纯化回收率比较；

图2为W1批次生产纯化过程HCD去除效果；

图3为W2批次生产纯化过程HCD去除效果；

图4为W3批次生产纯化过程HCD去除效果。

具体实施方式

下面结合对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。

本发明提供了一种重组痘病毒的纯化方法，所述方法包括如下步骤：

1、病毒培养：

采用相应的方法培养痘病毒，培养基可以是无血清或有血清培养基，培养方式可以是悬浮培养或贴壁培养，培养规模可以是培养瓶、细胞工厂或生物反应器。具体的，用于生产痘病毒的哺乳动物细胞是本领域已知的。本步骤中使用的细胞是本领域所公知的Hela细胞。复苏一支工作库Hela细胞，经传代后进行悬浮驯化，悬浮驯化后的细胞记为Hela-sus，将Hela-sus传代至稳定后建立悬浮细胞主细胞库，复苏一支悬浮细胞主细胞库细胞，传代两次后冻存，为悬浮细胞工作细胞库，对建立的悬浮两级细胞库进行检定，符合2015版《中华人民共和国药典》三部中“生物制品生产检定用动物细胞基质制备及检定规程”中相关要求后，用于后续研究和生产。

取一支悬浮细胞工作细胞库细胞，复苏后用无血清完全培养液在培养瓶中传代培养，细胞培养条件为：饱和湿度，37±1℃，5～9％CO₂。经过几个代次的传代培养后，将一部分方瓶中的细胞用于病毒感染，以制备病毒种子液。其他方瓶中的细胞继续传代培养，以获得足够量的细胞用于WAVE细胞袋接种。而用于制备病毒种子液的细胞，使用痘病毒工作种子批病毒以MOI＝0.02～1的比例染毒，在染毒后30～72h，收获细胞。经离心和裂解细胞后即为病毒种子液，用于感染WAVE细胞袋细胞。用于细胞袋接种的细胞用无血清完全培养液稀释至适宜接种的浓度后，将细胞种子液转入20L细胞袋中培养，设置好培养参数，开始细胞培养，当细胞密度达到合适浓度时，补加无血清培养基至最终培养体积为10L。当细胞密度再次达到适宜浓度时，用新鲜培养液逐步替换培养袋中的培养液，计算细胞袋中总的细胞数量，调整病毒种子液病毒浓度，以MOI＝0.1～1比例，使用病毒种子液感染细胞袋中的细胞。染毒后30～48h，停止培养，收获细胞培养物。

2、病毒收获：

采用4℃、2000～6000g离心20～60min，分离培养物上清和沉淀，收集病毒培养物沉淀，用痘病毒保存液重悬后裂解处理细胞释放胞内病毒，裂解方式为超声破碎。超声参数为AMPL：40～80％；PULSE：3s，3s；TIME：1～2min。裂解后用病毒保存液稀释2～8倍，4℃、2000～5000g离心10～30min，收获上清。

3、一次过滤

将收取的上清经3μm或5μm滤器过滤，设置流速为100～1000ml/min，收集过滤后的样品。

4、切向流超滤或微滤浓缩

将前一步收集的滤液经0.2μm以下孔径的中空纤维素柱进行切向流超滤或微滤，其中：超滤时滤膜孔径为300KDa～0.1μm，微滤时滤膜孔径为0.1～0.2μm，设置流速100～1000ml/mim，收集浓缩后的样品。

5、一次酶切

在浓缩后的样品中加入MgCl₂，使其终浓度为1～10mM Mg²⁺，向上述样品中加入Benzonase核酸酶，使其终浓度为50～250U/ml，充分混匀，其中，酶切温度为37±1℃，酶切时间为20～90min。在酶切后的样品中加入NaCl，使其终浓度为0.3～1M，终止酶切反应。

6、二次过滤

设置流速100～1000ml/min，酶切后的样品经1.2μm或3μm的滤器进行第二次过滤。

7、二次超滤或微滤浓缩

设置流速100～1000ml/min，超滤二次过滤后的样品，将样品中NaCl浓度洗滤至低于0.15M。

8、二次酶切

在步骤七浓缩后的样品中加入MgCl₂，使其终浓度为1～10mMMg²⁺，向上述样品中加入Benzonase核酸酶，使其终浓度为50～250U/ml，充分混匀；其中：酶切温度为37±1℃，酶切时间为20～90min；优选的，核酸酶终浓度为100U/ml，酶切时间为30-60min。在酶切后的样品中加入NaCl，使其终浓度为0.3～1M，终止酶切反应。

9、复合层析

在复合层析过程中，优选的复合层析介质为美国GE公司的Capto Core 700和Capto Core400，更优选的复合层析介质为Capto Core 700。复合层析包括以下步骤：

(4)洗脱及收样：设置流速为90～150cm/h，以痘病毒保存液洗脱色谱柱，观察UV260/UV280紫外吸收值，紫外吸收值第一次上升后，即可收集。收集的样品即为原液，将原液置于-80℃保存以备检测。

实施例1：复合层析法和传统离子交换层析法对溶瘤痘病毒纯化效果的比较

HCD和HCP是评价临床级痘病毒制品质量的关键指标，本实施例以HCD和HCP的去除效果以及痘病毒的纯化回收率评价不同层析纯化方法对痘病毒纯化的适用性。采用步骤1所述方法进行痘病毒的扩增，收获病毒液。采用步骤2-8所述方法对病毒收获液进行层析纯化前处理。具体如下：

参照步骤1进行病毒扩增，参照步骤2-8进行病毒层析纯化前处理。本实施例在步骤9中按照纯化原理分A、B、C三大组，各组根据介质或处理条件不同继续分成若干小组，将处理后的病毒液按照所分组别平均分成若干份，使得各小组纯化前病毒总量相同，具体分组情况和操作分别按照下述内容进行：

A组-复合层析法：采用复合层析法对经步骤8处理的病毒液进行进一步的纯化。本实施例采用的复合层析介质为Capto Core 700。包括以下步骤：采用1.5～3倍CV的1M NaOH清洗层析柱并浸泡30-60min，再以1.5～3倍CV的1～4M NaCl清洗后用3～4倍CV的痘病毒保存液平衡色谱柱至电导稳定，平衡后上样，上样流速90～150cm/h，上样量为不高于40％CV。上样后用病毒保存液进行洗脱，流速为90～150cm/h。观察A260/A280紫外吸收值，当紫外吸收值第一次上升后即可收集样品，收集的样品即为原液，将原液置于-80℃保存以备检测。本实验按上述条件重复一次，分别设为A-1和A-2组。

B组-亲和层析法：采用亲和层析法对经步骤7处理的病毒液进行进一步的纯化。本实施例采用的亲和层析介质为Cellufine Sulfate，在本实施例中，分别考察了在两种不同的缓冲液体系下的亲和层析效果，分别设为B1和B2组，流速为5ml/min，循环上样1次。其中B1组以pH7.2的100mM柠檬酸缓冲液为缓冲体系并洗脱，B2以pH7.2的含5％蔗糖的30mMTris缓冲液为缓冲体系并洗脱。收集洗脱液即为原液，将原液置于-80℃保存以备检测。以上两组实验分别进行一次重复实验，分别设为B1-1、B1-2以及B2-1、B2-2。

C组-离子交换层析：采用离子交换层析法对经步骤7处理的病毒液进行进一步的纯化。本组实验采用强阴离子交换层析(Cellufine MAX Q-r)，弱阴离子交换层析(ANXSepharose)和离子交换膜层析(Sartobind Q)，依次设为C1、C2、C3组，三组缓冲体系分别为A液50mM Tris-HCl/2mM MgCl₂(pH 8.0)，B液1M NaCl/50mM Tris-HCl/2mM MgCl₂(pH 8.0)，C1强阴离子交换组采用0～100％B液，10CV条件下梯度洗脱；C2弱阴离子交换组采用20～100％B液，10CV条件下梯度洗脱；C3离子交换膜层析组以11～80％B液梯度洗脱，三组分别收集洗脱液样品送检。以上三组实验分别进行一次重复实验，分别设为C1-1、C1-2、C2-1、C2-2以及C3-1、C3-2。

以痘病毒纯化前后的HCD、HCP残留以及各组的回收率作为评价指标，评价各纯化方法纯化痘病毒的效果，HCD及HCP残留检测情况见表1，纯化回收率结果见表2，各组纯化回收率比较结果见图1。

表1三种纯化方法所获样品HCD及HCP残留检测结果

表2三种纯化方法的痘病毒纯化回收率

由表1可知，本实施例中各组纯化方法均能有效去除样品中的HCD和HCP，除强阴离子交换层析组和弱阴离子交换层析组纯化后原液HCD残留量高于质量标准要求外，其余各组均符合溶瘤痘病毒制剂的HCD残留质量标准要求，其中B组亲和层析和C3组离子交换膜层析HCD残留最小，尤以B1组即以柠檬酸缓冲液进行洗脱组对样本HCD的去除效果最佳，A组经Capto Core 700纯化后的样本HCD含量＜10ng/剂量，符合质量标准要求；在HCP的去除中，亲和层析组和复合层析组去除效果较好。表2结果显示，在纯化预处理相同的情况下，A组经Capto Core 700纯化的痘病毒回收率显著高于其它四种层析方法，其余各组回收率较低，最高仅为36.4％。

层析纯化是痘病毒纯化工艺的关键步骤，该步骤的回收率太低将影响整个纯化工艺的病毒回收率，因此，在前处理过程中各步骤的病毒回收率得到保障的情况下，应在层析纯化步骤选择回收率较高的纯化方法和介质。综上所述，本实施例的纯化工艺采用CaptoCore 700纯化的痘病毒回收率显著高于其它各组，且HCD和HCP残留符合重组痘病毒制品质量要求。

实施例2：复合层析纯化工艺的杂质去除效果研究

在溶瘤痘病毒制备工艺中评价纯化工艺相关杂质的去除效果的指标除了HCD残留、HCP残留外，还包括在去除HCD过程中引入的核酸酶残留。本实施例以这三项工艺相关杂质为指标评价在中试级纯化过程中采用Capto Core 700进行纯化的杂质去除效果。

参照步骤1～8分别进行了三批中试生产和纯化，对纯化后收获的原液送检HCP、HCD以及核酸酶残留。三种杂质残留量均采用商用试剂盒进行检测，其中HCP检测采用Cygnus Hela HCP ELISA Kit(#F810)，HCD检测采用Roche DIG High Prime DNA Labelingand Detection Starter Kit I(#35668921)，核酸酶残留检测采用Merck BenzonaseELISA Kit II(#D50031A)。HCD、HCP、核酸酶残留去除效果样品检测结果见表3。各批次生产的纯化各关键步骤中样品HCD去除效果见图2～图4。由图2～4可知，三批中试纯化过程中各关键步骤HCD去除效果明显，经本发明所述纯化工艺处理后，HCD残留得到极大改善，结合表3结果可知，三批次中试生产原液各工艺杂质残留均符合溶瘤痘病毒制剂相关质量标准要求。

表3三批中试生产纯化过程中工艺相关杂质去除效果样品检测结果

实施例3：工艺稳定性

在溶瘤痘病毒的制备过程中除了应考虑关键纯化步骤-层析纯化处理-的回收率和杂质去除效果外，还应考察包括上游的痘病毒扩增工艺和收获液纯化前处理在内的整个痘病毒制备工艺的稳定性。参照步骤1～9进行连续三批次的痘病毒制备，三批次纯化后原液分别为S1、S2、S3，纯化后样品产量信息和质检结果分别见表4和表5。由表4可以看出，三批样品的总滴度在3.0～4.0E+11PFU之间，批次之间产量相对稳定。在层析纯化前，经多步处理后痘病毒的回收率为35％左右，纯化前后回收率达到了90％以上(数据未体现)，整个纯化工艺回收率在33％左右。说明本发明的纯化工艺具有良好的稳定性和可重复性。由表5可见，三批原液质量符合质量标准要求。

表4三批样品产量和收率统计表

表5三批原液质量检测统计表

Claims

1.一种重组痘病毒的纯化方法，其特征在于所述纯化方法包括如下步骤：

步骤一、病毒培养：

扩增培养溶瘤痘病毒，获得痘病毒培养物；

步骤二、病毒收获：

4℃、2000～6000g离心分离20～60min，分离痘病毒培养物上清和沉淀，收集痘病毒培养物沉淀，用痘病毒保存液重悬后裂解处理细胞释放胞内病毒，裂解后用病毒保存液稀释2～8倍，4℃、2000～5000g离心10～30min，收获上清；

步骤三、过滤

将步骤二收取的上清病毒液经3～10μm过滤器过滤，设置流速，收集滤过液；

步骤四、切向流超滤或微滤浓缩

用痘病毒保存液润洗平衡超滤浓缩使用的中空纤维柱，设置流速，将步骤三收集的滤液经0.2μm以下孔径的中空纤维素柱进行切向流超滤或微滤；

步骤五、酶切

在步骤四浓缩后的样品中加入MgCl₂，使其终浓度为1～10mM Mg²⁺，向上述样品中加入Benzonase核酸酶，使其终浓度为50～250U/ml，充分混匀，在酶切后的样品中加入NaCl，使其终浓度为0.3～1M，终止酶切反应；

步骤六、复合层析

(3)上样：设置流速为90～150cm/h，用经超滤浓缩后的样品上样；

2.根据权利要求1所述的重组痘病毒的纯化方法，其特征在于所述步骤一中，培养基为无血清或有血清培养基，培养方式为悬浮培养或贴壁培养，培养规模为培养瓶、细胞工厂或生物反应器。

3.根据权利要求1所述的重组痘病毒的纯化方法，其特征在于所述步骤二中，裂解方式为低渗裂解、反复冻融、超声破碎以及高压破碎中的一种。

4.根据权利要求1所述的重组痘病毒的纯化方法，其特征在于所述步骤三中，流速设置为100～1000ml/min；过滤器为平板过滤或囊式过滤；过滤方式采用切向流过滤或垂直过滤中的一种。

5.根据权利要求1所述的重组痘病毒的纯化方法，其特征在于所述步骤三中，过滤前采用痘病毒保存液润洗过滤器。

6.根据权利要求1所述的重组痘病毒的纯化方法，其特征在于所述步骤四中，超滤时滤膜孔径为300KDa～0.1μm；微滤时滤膜孔径为0.1～0.2μm；流速设置为100～1000ml/min。

7.根据权利要求1所述的重组痘病毒的纯化方法，其特征在于所述步骤五中，酶切温度为37±1℃，酶切时间为20～90min。

8.根据权利要求1所述的重组痘病毒的纯化方法，其特征在于所述步骤六中，上样样品体积为柱床体积的40％以内。

9.根据权利要求1所述的重组痘病毒的纯化方法，其特征在于所述步骤六中，复合层析法使用的层析系统为AKTA Pure，采用的层析纯化介质为GE公司生产的Capto Core系列。

10.根据权利要求1所述的重组痘病毒的纯化方法，其特征在于所述步骤五、酶切结束后按照步骤三、步骤四、步骤五的方法对上清进行过滤、切向流超滤或微滤浓缩、酶切中的一种或几种纯化处理后再进行复合层析处理。